JPH083489B2 - 免疫学的検定法 - Google Patents

免疫学的検定法

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JPH083489B2
JPH083489B2 JP61011215A JP1121586A JPH083489B2 JP H083489 B2 JPH083489 B2 JP H083489B2 JP 61011215 A JP61011215 A JP 61011215A JP 1121586 A JP1121586 A JP 1121586A JP H083489 B2 JPH083489 B2 JP H083489B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原の免疫学的検定法、およびかかる方法を
実施するためのキツトに関する。特に、本発明は検定す
べき抗原を定量するために酵素標識された抗体を使用す
ることからなる免疫学的検定における改良に関する（以
下酵素免疫検定と称する）。
酵素免疫計量的検定は用いられる技法により種々の
型、例えば１−部位および２−部位検定に分類される。
慣用の１−部位酵素免疫検定では、検定すべき抗原（以
下「リガンド」と称する）は酵素標識された抗体に対し
リガンド類似体（すなわち、リガンドと同じ複合体形成
特性を有する試薬、「リガンド類似体」なる用語は検定
すべきリガンドの知られた量をその範囲内に包含する）
と競合し、複合体形成反応が完結したのち、結合された
標識された抗体を有するリガンド類似体が検定混合物か
ら分離される。標識された抗体を結合するリガンド類似
体の量は試料中に存在するリガンド量に反比例するので
あろう。普通、リガンド類似体は分離工程を促進するた
めに固形支持体上に固定される。複合体形成反応が起つ
たのち検定混合物からの固形支持体の分離（リガンド類
似体およびある割合の標識された構成分と共に）に続
き、リガンド類似体と複合体形成した標識された構成分
の割合を測定しそしてそれによりリガンド量を計算す
る。
ヨーロツパ特許出願第85306272.7号に開示された型の
改良された１−部位酵素免疫検定においては、リガンド
類似体は固形支持体上に直接結合されない。代りに、リ
ガンド類似体は試薬Ｘ例えばフルオレセインイソチオシ
アネート（以下FITCと略記する）のようなハプテンと接
合され、そして固相は試薬Ｘに対する特異的な結合相手
を接合して有する。かかる１−部位検定は以下間接結合
型の１−部位酵素免疫検定と称する。
１−部位法は１個またはそれ以上のエピトープ（すな
わち免疫学的結合部位）を有するリガンドの検定に使用
されうる。しかしながら、リガンドが１個以上のエピト
ープを有する場合は、かかる部位の１種類のみが検定に
用いられる。
普通サンドイツチ免疫検定と称される慣用の２−部位
酵素免疫検定においては、２種またはそれ以上のエピト
ープを有していなければならないリガンドは固相に接合
された標識されていない抗体との反応により不溶化され
そしてリガンドの（好ましくは空間的に間隔をおいた）
異なるエピトープに対する酵素標識された抗体と反応す
る。複合体形成反応ゆえに固定化される標識された抗体
の量が試料中に存在するリガンドの量に直接比例する。
間接結合型の２−部位酵素免疫検定は、ヨーロツパ特
許出願公告第105714号に記載の放射線免疫計量的検定法
と同様に、リガンドの異なるエピトープに対する２種類
の溶性抗体試薬を用いており、１種類の溶性抗体試薬は
酵素標識された抗体分子からなる。用いられる固相は標
識されてない抗体を特異的に非共有的に結合しうるもう
一つの試薬に接合される。これらの抗体は、例えば好都
合には試薬Ｘに接合されうる。次に分離工程は試薬Ｘに
対する特異的な結合相手に接合された固相を用いること
により達成される。
ここで使用される「抗原」なる用語は永久的に抗原性
である種類（例えばタンパク質、ペプチドホルモン、細
菌、細菌断片、細胞、細胞断片およびウイルス）および
適当な条件下に抗原性となされうるハプテン（例えば麻
酔剤、睡眠剤、鎮痛剤、心臓血管用薬物、ビタミン、非
ペプチドホルモンおよびその代謝産物、抗生物質、農薬
および砂糖を含む）の両方を包含することが理解されよ
う。
ここで使用される「抗体」なる用語はその範囲内に下
記のものを包含する、すなわち ａ）種々のクラスまたはサブクラスの免疫グロブリンの
いずれか、例えば慣用に用いられる任意の動物、例えば
羊、兎、ヤギまたはマウスに由来するIgG、IgM、 ｂ）モノクローナル抗体、および ｃ）抗体の結合領域を含有するモノクローナルまたはポ
リクローナル性抗体の断片、すなわちFc部分のない断片
（例えばFab、Fab′、Ｆ（ab′）2）または完全なる抗
体中のＨ鎖成分を連結しているジスルフイツド結合の還
元的開裂により得られるいわゆる「半分子」断片。
抗体の抗原結合断片の製法は当業上よく知られており
そしてここには記載しない。モノクローナル抗体を製造
するための技法もよく知られている（例えばGalfre G.
氏他の「Methods in Enzymology」73,1〜46（1981）参
照）。
特に、下記の抗原が前記した１−部位または２−部位
法により検定されうるすなわち、ペプチドホルモンを含
むホルモン（例えば甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体
形成ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ヒト
絨毛膜ゴナドトロピン（hCG）、インシュリンおよびプ
ロラクチン）、および非ペプチドホルモン（例えばステ
ロイドおよび甲状腺ホルモン）、タンパク質（例えば癌
胚抗原（CEA））、およびアルフアフエトプロテイン（A
FP））、薬物、砂糖、毒素およびビタミン。
しかしながらかかる検定法はそれらが実施される物理
的条件における変動、特に定められた検定操作からの逸
脱から生ずる変動に対して非常に影響を受け易い。免疫
検定における不正確さの主原因は誤つた試薬容量の添加
を来すまずいピペツト操作、いくつかの検定管が試薬と
の反応時間が異なりうることを意味するまずい時間選定
および分離段階が必要とされるところでのまずい管取扱
い（例えば遠心分離または磁気分離、続くデカンテーシ
ョンまたはアスピレーション）のような因子と関連して
いる。検定操作上の過誤は手動操作者においてより起り
そうであるが、免疫検定実施用の自動化された器具は絶
対確実ではなく、そして例えば時として不正確な試薬容
量を交付するかまたは反応時間の変動を生じうる。
今、無作為的なまたは系統的な操作者による過誤と関
連した変動が補償されうる、すなわち第２の酵素標識を
用いる結果として内部標準化が達成されうる改良された
酵素免疫検定が発明された。
一方が検定すべき抗原を定量するためそしてもう一方
が精度を高めるために２種類の標識（例えば２種類の螢
光標識）を用いる免疫検定は先に公告されたPCT出願WO
80/02076号に開示されている。しかしながら無作為的ま
たは系統的な操作者の過誤以外の免疫検定特に螢光免疫
検定における不正確さ（例えば固相を用いる２−部位ま
たは競合的検定において、検出される標識の量の結果と
しての変動ではなく標識の表示の性質における物理的変
動の結果としてのシグナル変動）の原因を克服すること
に関するこの公告された出願には２種類の酵素標識の使
用は開示されていない。事実、試料リガンドに免疫学的
に結合する受容体リガンドが品質管理のためまたは保温
培養に先立つ器具目盛定めのために接合された標識によ
り検出されるべき場合は、受容体リガンドに酵素を貼付
するのは実際的でなかなろうと記述されている。
しかしながら、事実免疫検定システムに２種類の酵素
標識を用いることが可能であることおよびこれがいずれ
も欠点のある放射性標識および／または螢光標識の使用
を回避するという長所を有することを見出した。放射性
標識は特殊な取扱い技術を必要としそして未熟練操作者
により使用されるには不適当でありうる。螢光標識は通
常紫外線照射を用いて作業しうる螢光計の使用を必要と
し、これらは定常的に使用するには比較的高価である。
一方酵素は比色計で検定されうる着色した溶液を生成す
る基質を用いて使用でき、これらははるかにより簡単で
一般に螢光計より高価でない。さらに、非常に低レベル
の螢光標識は評価困難であるのに、低レベルの酵素標識
は酵素１モルが多くのモル数の生成物を生成して高い得
量を生じそして発色反応を増巾しうるので単に検定の時
間を増大させることにより評価されうる。酵素システム
は螢光システムよりも背景の妨害に対してより影響を受
けにくく、螢光標識の使用は螢光化合物が光線中で不安
定である傾向があるという付加的な欠点を有する。
本発明はその局面の一つにおいて、液体試料中のリガ
ンドの免疫学的検定を行うにあたり、それぞれ第１酵素
標識および第２酵素標識である２種類の独立して測定し
得る酵素標識を使用して、第１酵素標識をリガンド類似
体と接合させ第２酵素標識をリガンドに対する抗体の集
団と接合させるか、あるいは第１酵素標識をリガンドに
対する抗体の集団と接合させ第２酵素標識をリガンドに
対する別の１種または２種以上の抗体集団と接合させ
て、第１酵素標識接合体および第２酵素接合体である接
合体をそれぞれ作成し、該接合体を液体試料と培養して
免疫反応により複合体を形成させ、複合体形成反応終了
後、実質的に全ての第１酵素標識接合体およびある割合
の第２酵素標識接合体を含有する成分を複合体を形成し
ていない第２酵素標識接合体から分離し、分離された第
２酵素標識の割合が試料中の前記リガンドの量に関連し
ておりそして第２酵素標識の前記した割合の測定により
検定が行われ、そしてその検定が分離された総第１酵素
標識の測定との比較により標準化されることからなる検
定法を提供するものである。
分離工程は、例えば、第１の標識に接合された構成分
（類）が固形支持体に直接にまたは間接的に結合される
ことにより達成されうる。固形支持体は例えば微細に分
割された不活性粒子またはビード（例えばラテツクス粒
子）の形態であることができそしてかかる粒子またはビ
ードは所望の場合は分離工程を促進するために磁気性で
あるかまたは磁化されうる。適当な磁気性または磁化さ
れうる固形支持体は「Immunoassays for Clinical Chem
istry」（Hunter氏他編、Churchill Livingstone出版、
（1983年））第147〜162頁に記載されており、例えばFe
3O4を含有するセルロース組成物の粒子が使用されう
る。
不正確さがピペツト操作、時間選定、温度等における
過誤から生じうる最終的な酵素反応段階を含む酵素免疫
検定のすべての段階の内部標準化のための第２の酵素標
識を使用するには、同時に検定されうる２種類の適当な
酵素を使用して、同じありうる変動および過誤が両方の
反応に適用されることが必要である。従つて酵素免疫検
定に必要な基準（酵素活性または免疫活性を失うことな
く、または少ししか失うことなく適切な構成分に酵素が
接合される能力、、および試料または検定条件による妨
害を受けないこと）を満たすのみならず、ある条件下に
免疫反応中に相互に反応せずそして別々の基質の変換を
同時に触媒して相互に独立して測定されうる生成物を生
成させうる２種類の適当な酵素−基質対を確認すること
が必要である。
本質的に両立でき従つて同時に検定されうる２種類の
酵素アルカリホスフアターゼおよびβ−ガラクトシダー
ゼによる、基質変換に対する要件を見出した。
本発明方法は例えば１−部位および２−部位酵素免疫
検定の両方に適用しうる。
従つて、本発明の態様の一つによれば、 （ａ）試料を第１酵素標識で標識されたリガンド類似体
および第２酵素標識で標識されたそのリガンドに対する
抗体とともに前記第１酵素標識が前記第２酵素標識と独
立して監視されうるようにして、逐次的にまたは同時に
培養して複合体を形成させ、 （ｂ）前記第１酵素標識を含有する複合体成分を、リガ
ンド類似体と複合体を形成してない前記第２酵素標識の
フラクションから分離し、そして （ｃ）工程（ｂ）で分離された前記第１酵素標識を含有
する複合体成分中の前記第２酵素標識の量を前記分離さ
れた複合体成分中に存在する前記第１酵素標識の測定に
関連して測定することによりリガンドの標準化された検
定を行う、 工程を包含する、液体試料中の１個またはそれ以上のエ
ピトープを有するリガンドの１−部位免疫学的検定を行
う方法が提供される。
本発明のこの特徴はすべての１−部位酵素免疫検定に
適用できる。しかしながら特に、これはヨーロツパ特許
出願第85306272.7号記載の間接結合型の１−部位酵素免
疫検定に適用してかかる検定の内部標準化変換を行いう
る。
従つて、本発明の好ましい特徴においては、第１の酵
素標識で標識されたリガンド類似体が試薬Ｘをも貼付さ
れており（この試薬は検定混合物中に遊離の試薬として
は存在していない）そして工程（ｂ）が試薬Ｘに対して
特異的な結合相手を担持する固相を用いて達成されるこ
とからなる本発明による１−部位免疫検定を実施する方
法が提供される。
試薬Ｘは好都合には例えば、フルオレセイン誘導体
（例えばフルオレセインイソチオシアネート（以下FITC
と略記する））、ローダミンイソチオシアネート、2,4
−ジニトロフルオロベンゼン、フエニルイソチオシアネ
ートおよびダンシルクロライドからなる群から選択され
るハプテンであることができ、そして試薬Ｘの特異的な
結合相手はこの場合それに対する抗原であろう。試薬Ｘ
として好ましいのはフルオレセインの誘導体特にFITCで
ある。試薬ＸがFITCである場合、それに対する固相上の
特異的な結合相手は固形支持体に共有結合された抗FITC
抗体でありうる。抗血清は常法により例えば羊をキーホ
ール・リンペツト（keyhole limpet）ヘモシアニンに接
合したFITCで免疫することにより調製されうる。固形支
持体への抗血清の結合は、例えば、Axen氏他の「Natur
e」214,1302〜1304（1967）記載の方法を用いて遂行さ
れうる。前記した試薬x/抗−試薬Ｘシステムに対する代
替の好都合な結合システムはアビジン／ビオチン結合シ
ステムである。
本発明の第２の態様によれば、 （ａ）前記リガンドに対する抗体の集団に接合した第１
酵素標識および該リガンドと同時に複合体を形成し得る
別の１種または２種以上の抗体集団に接合した第２酵素
標識であって、第１酵素標識は第２酵素標識とは独立し
て監視されるうるものの存在下で液体試料を培養して複
合体形成を平衡に達せしめ、 （ｂ）第１酵素標識を含有する成分を、複合体を形成し
ていない前記第２酵素標識を含有する成分から分離し、
そして （ｃ）工程（ｂ）で分離された前記第１酵素標識を含有
する複合体成分中の前記第２酵素標識の量を前記分離さ
れた成分中の前記第１酵素標識の測定に関連して測定す
ることによりリガンドの標準化された検定を行う、 工程を包含する、液体試料中における１個より多いエ
ピトープを有するリガンドの２−部位免疫学的検定を行
う方法が提供される。
複合体形成してない第２の酵素標識を含有する構成分
から工程（ｂ）により分離される第１の酵素標識を含有
する構成分が第２の酵素標識の複合体形成されたフラク
シヨンをも含有しようことは認識されよう。従つて、工
程（ｂ）は第２の酵素標識を担持する試薬の複合体形成
された相および複合体形成されてない相の分離をも同時
に行うものである。本発明のこの特徴はすべての２−部
位酵素免疫検定に適用できる。しかしながら特に、間接
結合型のサンドイツチ酵素免疫検定に適用されてかかる
検定の内部標準化変換をもたらしうる。
従つて、本発明の好ましい態様においては、 （ａ）液体試料、 （ｂ）第１酵素標識で標識されたリガンドに対する抗体
を包含する第１酵素標識接合体、 （ｃ）第２の独立して測定しうる酵素標識で標識された
リガンドに対する抗体を包含する第２酵素標識接合体、
および （ｄ）非共有結合により接合体（ｂ）に結合しうるが、
接合体（ａ）または接合体（ｃ）のいずれにも直接接合
できず、且つ固相支持体に結合された試薬、 からなる混合物を培養し、検定混合物から固相を分離し
そして分離された固相構成分中の前記第２酵素標識の量
を前記分離された構成分中に存在する前記第１酵素標識
の測定に関連して測定することによりリガンドの標準化
された検定を行うことからなる２−部位免疫検定を実施
する方法が提供される。
接合体（ｂ）が第１の酵素標識に加え試薬Ｘに接合し
た抗体からなりそして試薬（ｄ）が試薬Ｘにとつての特
異的な結合相手である（この試薬Ｘは検定混合物中に遊
離の試薬としては存在しない）ことが特に好ましい。適
当な試薬X/特異的な結合相手の対は１−部位酵素免疫検
定について前記したとおりである。
本発明による免疫検定法に用いられる２種類の酵素標
識が基質を独立して測定しうる生成物に同時に変換でき
そして、分離工程に続き、検定混合物からとり出された
２種類の標識の量が同時進行する酵素反応により測定さ
れるのが好ましい。２つの同時進行する酵素反応の生成
物が吸収測定により独立して測定しうることが望まし
い。
本発明による免疫検定法において、一緒に使用するの
に適する２種の酵素一基質の対はアルカリホスフアター
ゼ／フエノールフタレンモノホスヘートおよびβ−ガラ
クトシダーゼ/p−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（以下ｐ−NPBGと略記する）である。所望の場合は、
ｐ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドはｏ−ニト
ロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドにより置き代えられ
うる。アルカリホスフアターゼおよびβ−ガラクトシダ
ーゼは、主にそれらが活性を実質上損うことなく他のタ
ンパク質（例えば抗体）に容易に結合でき〔例えば、Is
hikawa氏他の「J.Immunoassay」4、209〜327（1983年）
および「Annals of Clinical Biochemistry」21、（198
4）P434〜443参照〕そして着色した生成物を生ずる反応
を触媒しうるゆえに慣用の酵素免疫検定における標識と
して使用するのに現在特に好ましい。
アルカリホスフアターゼによるフエノールフタレンモ
ノホスヘートの加水分解に最適のpHは9.8である。高濃
度（約0.025M〜1M）のジエタノールアミンの存在下では
pHは活性の損失を損うことなく8.6に減少されうること
が見出された。
β−ガラクトシダーゼはｐ−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトシド（ｐ−NPBG）に対し至適pH7.4を有する
が、通常の基質濃度（約5mMまで）を用いる単一の検定
形式においてはpHはわずかなるのみの活性損失（約20
％）しか伴わずに8.6に上昇されうる。しかしながら同
じ検定システムであるが但し約1Mのジエタノールアミン
を含有するシステムにおいては、β−ガラクトシダーゼ
の活性はほとんど全部破壊される。ジエタノールアミン
によるβ−ガラクトシダーゼ阻害力学は複雑であるが、
主なる作用は1Mジエタノールアミンの存在下におけるｐ
−NPBGに対するβ−ガラクトシダーゼのKmが66μＭから
21mMに変えられる競合である。pH8.6でｐ−NPBGの濃度
を約1Mのジエタノールアミンの存在下においてすらも増
大させることによりβ−ガラクトシダーゼの相当の活性
が得られることが見出された。
従つて、本発明による免疫検定法に対し選択された酵
素標識がアルカリホスフアターゼおよびβ−ガラクトシ
ダーゼである場合は、分離工程で検定混合物からとり出
される２種類の標識の量は例えば当初約0.25M〜1Mのジ
エタノールアミン、約10mMのフエノールフタレンモノホ
スヘートおよび約50mMのｐ−ニトロフエニル−β−Ｄ−
ガラクトシドを包含するpH8.6の基質緩衝溶液の存在下
に保温培養することにより測定されうる。アルカリホス
フアターゼ標識によるフエノールフタレンモノホスヘー
トのフエノールフタレンへの変換は好ましくは554nmで
の吸収を測定することにより監視され、一方β−ガラク
トシダーゼ標識によるｐ−NPBGのｐ−ニトロフエノール
への同時変換は好ましくは404nmでの吸収を測定するこ
とにより監視され、フエノールフタレンの低い吸収につ
いてはこの波長で補正がなされる。
本発明の免疫検定は複雑な器具使用を必要とすること
なく高い一貫した精度が達成されうるという長所を有す
る。放射性同位元素標識を用いる免疫検定の場合におけ
るような特殊の安全性注意は何ら必要でなく、また螢光
免疫検定におけるような背景の妨害も問題とはならな
い。
本発明のもう一つの特徴においては本発明による免疫
検定法を実施するための試薬キツトが提供される。かか
るキツトは、例えば、酵素標識で標識された第１の構成
分および異なる、区別しうる酵素標識で標識された第２
の構成分を包含しうる。従つて、本発明による１−部位
免疫検定用のキツトの場合、該第１の構成分は酵素標識
されたリガンド類似体を包含しそして該第２の構成分は
第２の酵素標識で標識されたリガンドに対する抗体を包
含するであろう。前記第１の構成分は固形支持体に接合
されうる。あるいはまた、間接結合型の本発明による１
−部位免疫検定用のキツトの場合は、前記第１の構成分
は酵素標識に加え、試薬Ｘに接合されようし、そしてそ
のキツトは試薬Ｘに対する特異的な結合相手に接合した
固形支持体をもさらに包含しうる。
本発明による２−部位免疫検定のための試薬のキツト
は酵素標識で標識されたリガンドに対する抗体の第１の
集団および異なる酵素標識で標識されたところのリガン
ドに対する抗体の第２の集団を包含することができ、か
かる抗体の集団は２種類の異なるエピトープに対するも
のである。前記した抗体の第１の集団は固形支持体に接
合されうるかまたはキツトは別の固形支持体をさらに包
含することができる。従つて、例えば、抗体の前記した
第１の集団は間接結合型の本発明による２−部位免疫検
定に使用するために酵素標識に加えて試薬Ｘと接合さ
れ、キツトは試薬Ｘに対する特異的な結合相手に接合し
た固形支持体をさらに包含しうる。
使用の便宜上、本発明によるキツトの２種またはそれ
以上の構成分は単一の試薬中に一緒にされうる。１種ま
たはそれ以上の構成分が凍結乾燥された形態で供給され
うる。
前記したように、本発明方法によれば内部的に標準化
された検定が実施されうる。理論的な考察に縛られるこ
とを欲しないが、固形支持体を用いる本発明による免疫
検定の場合、相を分離したのちの第１の標識からのシグ
ナルはリガンドの濃度からは独立していようがしかし固
相との結合反応（特に固相の容量および濃度、および保
温培養の時間および温度）、相分離の効率および標識が
監視される物理的条件における変動（例えば培養時間、
温度等）に従属しよう。一方分離した後の第２の標識か
らのシグナルは試料中のリガンドの濃度、固相とのカツ
プリング反応、相分離の効率および標識が監視される物
理的条件における変動に従属しよう。従つて標識２から
のシグナルを標識１からのそれを用いて標準化すること
により、検定に影響する多くのパラメーターにおける変
動の影響が制御できそして薬量応答関係が安定化されう
る。
下記の非限定的実施例により本発明を説明する。
実施例１ 黄体形成ホルモン（LH）の検定における基質培養容量と
培養時間の補正 出発物質の調製 1.抗−LH抗体の調製 Milstein氏他の「Nature」256、（1975）495〜497記
載の方法によりマウスの腹水液からモノクローナル抗体
を得た。それぞれのハイブリドーマ細胞系列から得られ
た抗体を調べて別々の抗原決定基に対する抗体を産生す
るハイブリドーマを確認した。LHに対し最大の親和性を
有するものを選択して検定に使用した。
2.アルカリホスフアターゼ／抗−LH接合体の調製 Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）（ジメ
チルホルムアミド中60mM）0.16mlをアルカリホスフアタ
ーゼ（50mMホウ酸ナトリウム、1mM塩化マグネシウム、
および0.1mM塩化亜鉛中2mg/ml、pH7.6）1.6ml中に加え
そして30℃で１時間保温培養した。pH7.0の0.1Mトリ
ス、1mM塩化マグネシウムおよび0.1mM塩化亜鉛中で平衡
となされたセフアデツクスＧ−25中等カラム（１×35c
m）に通すことにより酵素を分離した。精製された酵素
を必要時まで＋４℃で保存した。
Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（以下SPDPと略記する）（エタノール中25
mM）16.3μｌを抗−LHモノクローナル抗体（pH6.0の200
mMプロピオン酸ナトリウム中3mg/ml）1ml中に加えそし
て室温で30分間保温培養した。pH4.5の200mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液中で平衡となされた使い捨てセフアデツクス
Ｇ−25カラム（PD−10）に通すことにより抗体を分離し
た。この抗体にジチオトレイトール（1M）を加え（抗体
容量の1/20が添加された）そして室温で10分間放置し
た。pH6.0の200mMプロピオン酸ナトリウム中で平衡とな
されたセフアデツクスＧ−25中等カラム（１×35cm）を
用いて抗体を脱塩した。
前記のようにして調製された抗体およびアルカリホス
フアターゼを等モル比にて混合しそして４℃で24時間放
置して接合させた。得られる接合体をpH6.0の200mMプロ
ピオン酸ナトリウム、1mM塩化マグネシウムおよび0.1mM
塩化亜鉛中で平衡となされたTSK3000SWカラム上の高性
能液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製した。こ
の接合体を検定用緩衝液中に2.5μg/mlの濃度まで希釈
して検定に使用した。
3.β−ガラクトシダーゼおよびフルオレセインイソチオ
シアネート（FITC）に接合した抗−LHの調製 アルカリホスフアターゼに接合した抗体とは異なるLH
分子上のエピトープに特異的な抗−LH2.5mgを重炭酸塩
緩衝液（0.02M、pH9.1）中に溶解させそして0.5mg/mlの
FITC 500μｌと混合した。４℃で一夜培養したのち、接
合体をプロピオン酸ナトリウム緩衝液（0.2M、pH6.0）
で平衡となしたセフアデツクスＧ−25カラムに通すこと
により精製した。
SPDP（エタノール中25mM）150μｌを精製した接合体
に加えそして室温で30分間保温培養した。プロピオン酸
ナトリウム（0.2M、pH6.0）で平衡となしたTSK300 SW
カラム上のHPLCによりさらに精製した。次にこの接合体
をこれもプロピオン酸ナトリウム緩衝液（0.2M、pH6.
0）中の等モル濃度のβ−ガラクトシダーゼと混合しそ
して４℃で培養した。得られる接合体をプロピオン酸ナ
トリムウ緩衝液（0.2M、pH6.0）で平衡となされたTSK 4
000カラム上で精製した。この接合体を検定用緩衝液中
に7.7μg/mlの濃度まで希釈して使用した。
4.磁化しうる固相に共有結合された抗−FITC抗体の調製 抗−FITCはキーホール・リンペツトヘモシアニンに接
合したFITCを用いて羊を免疫することにより得られる慣
用のポリクローナル抗血清である。磁化しうるセルロー
ス粒子は平均粒子直径３ミクロンを有する約50％の黒色
酸化鉄(Fe3O4)を含有するセルロースの組成物である〔F
orrest氏他の「Immunoassays for Clinical Chemistr
y」第147〜162頁中の“Magnetic Particle Radioimmuno
assay"参照、Hunter氏他編、Churchill Livingstone出
版、（1983年）〕。抗−FITC抗血清はAxen氏他の「Natu
re」214、1302〜1304（1967）記載の操作に従いセルロ
ースの臭化シアン活性化に続き磁化しうるセルロースに
共有結合された。抗血清は磁化しうる固相1gに対し抗血
清2mlの割合で結合された。
この固相を0.1％のナトリウムアジド、0.5％の牛血清
アルブミン（以下BSAと略記する）、フラクシヨンＶ、
0.25％トウイーン20および0.5％のメトセルを含有するp
H8.0の50mMトリス/HCl緩衝液中に2.5mg/mlに希釈した。
5.LH標準溶液の調製 国際基準製剤（International Reference Preparatio
n）68/40に対して検度した凍結乾燥されたLHの製剤を牛
血清中で希釈して濃度０、１、２、10、25、50、100お
よび200mIU/mlとなした。
6.検定用緩衝液の調製 検定用緩衝液はpH8.0の0.1Mトリス/HCl中の0.5％BS
A、フラクシヨンＶ、0.2％羊血清、1mM塩化マグネシウ
ム、0.1mM塩化亜鉛、0.1M塩化ナトリウムおよび0.2％ナ
トリウムアジドからなる。
7.洗浄用緩衝液の調製 洗浄用緩衝液はpH8.6の0.01Mトリス/HCl中の0.9％塩
化ナトリウムからなる。
8.基質緩衝液の調製 基質緩衝液は0.9％塩化ナトリウムおよび1mMの塩化マ
グネシウムを含有するpH8.6のジエタノールアミン0.25M
溶液からなる。次にこの緩衝液にアルカリホスフアター
ゼ用の基質（10mMフエノールフタレンモノホスヘート）
およびβ−ガラクトシダーゼ用の基質（50mMp−ニトロ
フエノール−β−Ｄ−ガラクトシド）が溶解された。
9.ストツプ溶液の調製 ストツプ溶液は50mM炭酸ナトリウム、5mM燐酸ナトリ
ウムおよび50mM EDTAナトリウムからなる溶液をpH12に
調製しそして次に25mM NaOHを添加することにより調製
された。
検定方法 各標準物100μｌをポリスチレン製検定管中に２通り
ずつピペツトで移した。各抗体−酵素接合体50μｌおよ
び検定用緩衝液100μｌずつを各管に加えた。すべての
管を混合しそして37℃で20分間培養した。磁化しうる抗
−FITC固相200μｌを各管に加え続いて混合および37℃
で５分間培養した。固相を磁気により分離し、上澄みを
デカンテーシヨンしそして洗浄用緩衝液500μｌを各管
に加えた。混合したのち、再び固相を磁気的に分離し
た。この洗浄操作をさらに２回反復し、最後の洗浄後、
管を逆さにしそして５分間排液せしめた。
基質溶液300μｌを各管に加え、混合し、そして管を3
7℃で15分間培養した。ストツプ溶液1mlずつを各管に加
えそして検定物を磁気により分離した。上澄み液の404n
mおよび554nmにおける吸収をHewlett Packard（HP8451A
Diode Array）分光光度計で測定し、β−ガラクトシダ
ーゼ反応の生成物は404nmでそしてアルカリホスフアタ
ーゼ反応の生成物は554nmで吸収した。アルカリホスフ
アターゼ反応生成物は404nmでもわずかに吸収しそして
それゆえ404nmでの吸収はそれに合うように補正され
た。
アルカリホスフアターゼ活性はLHの濃度と正の相関を
有しており従つて554nmでの吸収値から標準曲線が構成
されうる。内部測定体であるβ−ガラクトシダーゼ活性
は標準曲線全体を通して一定に留まつていなければなら
ない。
10種の標準曲線を調製しそして554nmでの平均光学濃
度（O.D）が各標準物について計算された。全体にわた
る404nmでの平均O.D.も計算された。かくして標準物お
よび測定体に対する予期された吸収が定められた。
検定条件における変動は404nmおよび554nmでの観察さ
れた吸収に影響する。554nmでの吸収は下記式を用いて
標準化される。
554nmでの標準化された吸収はその標準物について予
期された平均の±15％以内に該当すべきである。
LH検定の内部標準化を試験するための実験 実験の第１シリーズには検定における酵素培養工程で
存在する基質容量の、減少（250μｌ）および増大（350
μｌ）の両方が包含される。その結果（第１表）では高
濃度のLHでは、基質容量の変化が予期された値の15％よ
り大きい過誤を示す検定を生ずることが示される。内部
標準化補正因子を適用することにより、LH値は再び予期
された値の±15％過誤以内となる。従つて、内部標準化
は基質容量における過誤を補正しうる。
基質培養期間の長さを次に変える、すわなち20分まで
増大させおよび10分まで減少させる。いずれの場合でも
観察されたデータに内部標準化操作を適用することによ
りLH濃度値が予期された値の±15％以内に補正された
（第２表）。このことは内部標準化操作により誤つた基
質培養時間が補正されうることを示している。
実施例２ チロキシン（T4）検定における基質培養容量および培養
時間の補正 出発物質の調製 1.抗−T4抗体の調製 実施例１における抗−LH抗体の調製と同じ方法が用い
られた。
2.アルカリホスフアターゼ/T4/FITC接合体の調製 Frik氏他の「Annals of Clinical Biochemistry」21,
（1984）p434〜443記載の方法によりアルカリホスフア
ターゼをチロキシンに結合させた。重炭酸塩緩衝液（0.
02M、pH9.1）3ml中の酵素37.5nモルをpH9.4の0.04Mバル
ビタール緩衝液12ml中に加えた。この溶液に0.01M水酸
化ナトリウム2.5ml中のチロキシン3.75μモル続いて水5
0μｌ中のグルタルアルデヒド2.5μモルを加えた。23℃
で2 1/2時間後、水200μｌ中のＬ−リジン塩酸塩20μモ
ルの溶液を加え１時間後に水中の水素化硼素ナトリウム
3.75μモルを添加しそしてさらに０℃で１時間培養し
た。生成物を＋４℃で48時間透析したのち、試料をAmic
on YM10膜での限外過により濃縮しそしてトリエタノ
ールアミン緩衝液（0.1M、pH7.0）を用いて平衡となし
たセフアデツクスＧ−25カラムで順次３回クロマトグラ
フイーした。次にこの物質を高性能液体クロマトグラフ
イーカラム（TSK 3000SW）上トリエタノールアミン緩衝
液（100mM、pH7.0）で溶離することにより精製した。溶
離した物質をPharmacia G−25 PD10カラムに通すことに
より重炭酸塩緩衝液（0.02M、pH9.0）中で平衡化させ、
そして４℃で一夜培養することにより接合体1ml当り0.0
83mgにてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）に
結合させた。得られるFITC/T4/アルカリホスフアターゼ
接合体をトリエタノールアミン緩衝液（0.1M、pH7.0）
中で平衡となしたPharmacia PD10 G−25カラムに通すこ
とにより精製した。
3.β−ガラクトシダーゼに接合した抗−T4抗体の調製 SPDP（エタノール中25mM）150μｌをpH6.0の0.2Mプロ
ピオン酸ナトリウム緩衝液中の100μg/mlの抗−T4抗体
9.4mlに加えそして室温で30分間培養した。生成する抗
体を次にプロピオン酸ナトリウム緩衝液（0.02M、pH6.
0）中で平衡化したHPLC TSK 3000 SWカラムに通すこと
により精製した。かくして得られた抗体を等モル濃度の
β−ガラクトシダーゼと混合しそして４℃で一夜培養し
次にプロピオン酸ナトリウム緩衝液（0.2M、pH6.0）中
で平衡化されたTSK 4000カラムで精製した。
4.磁化しうる固相に共有結合した抗−FITC抗体の調製 固相を7.5mg/mlの濃度まで希釈してT4検定に使用する
以外は実施例１と同じ方法でこの試薬を調製した。
5.T4の標準溶液の調製 Ｌ−チロキシンナトリウム塩〔Sigma Chemical社製
品、ロンドン〕を0.1M水酸化ナトリウム溶液中に溶解さ
せそして次にT4を除去したヒトの血清で希釈してT4 21.
23μg/mlの原液となした。次にこの原液をT4を除去した
ヒトの血清でさらに希釈してT4の最終濃度０、25.6、5
1.1、117、163、215および311ng/mlとした。T4ゼロ試料
はさらにアフイニテイ精製してヒト血清中に存在するす
べての甲状腺刺激ホルモン（TSH）を除去した。
6.検定用、洗浄用、基質用緩衝液およびストツプ溶液の
調製 これらすべての試薬は実施例１記載のものと同じであ
る。
検定法 実施例１においてLHについて記載されたものと同じで
あるが、以下の修正がなされた、すなわち 各酵素接合体100μｌが添加されそして当初培養時間
が30分間に延長された。
基質培養時間が60分に延長された。
計算 β−ガラクトシダーゼ活性はT4の濃度と負の相関を有
しており、従つて標準物は404nmでの吸収から構成され
る。アルカリホスフアターゼ活性は内部測定体として用
いられた。
６種の標準曲線が作られそして404nmでの平均O.D.が
各標準について計算された。
554nmでの全体にわたる平均O.D.も計算された。
554nmでの吸収は下記の式を用いて標準化される。
404nmでの標準化された吸収はその標準物について予
期された平均の±15％以内に該当すべきである。
T4検定の内部標準化を試験するための実験 実験の第１シリーズには検定の酵素培養工程中に存在
する基質容量の変化が包含され、より多い量（350μ
ｌ）およびより少ない量（250μｌ）の両方が用いられ
る。その結果（第３表）ではT4の低いレベルおよび高い
レベルのいずれにおいても、内部標準化操作を適用する
ことは検定における±15％より大きいすべての過誤を補
正するのみならず、その値が予期された値の±15％以内
に該当する試料についての過誤をも減少させようことが
示される。従つて、内部標準化操作は基質容量における
過誤を補正するであろう。
次に基質培養時間の長さを45分に減少させることによ
りおよび55分まで延長させることにより変動させた。こ
こでもまた、その結果（第４表）では、検定に内部標準
化操作を適用することにより、その過誤が予期された値
の±15％より大きい任意のデータポイントが補正されて
値が予期された値の過誤以内に該当しうることが示され
る。このことは内部標準化操作が誤まつた基質培養時間
を補正しうることを示している。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】液体試料中のリガンドの免疫学的検定を行
    うにあたり、それぞれ第１酵素標識および第２酵素標識
    である２種類の独立して測定し得る酵素標識を使用し
    て、第１酵素標識をリガンド類似体と接合させ第２酵素
    標識をリガンドに対する抗体の集団と接合させるか、あ
    るいは第１酵素標識をリガンドに対する抗体の集団と接
    合させ第２酵素標識をリガンドに対する別の１種または
    ２種以上の抗体集団と接合させて、第１酵素標識接合体
    および第２酵素接合体である接合体をそれぞれ作成し、
    該接合体を液体試料と培養して免疫反応により複合体を
    形成させ、複合体形成反応終了後、実質的に全ての第１
    酵素標識接合体およびある割合の第２酵素標識接合体を
    含有する成分を複合体を形成していない第２酵素標識接
    合体から分離し、分離された第２酵素標識の割合が試料
    中の前記リガンドの量に関連しておりそして第２酵素標
    識の前記した割合の測定により検定が行われ、そしてそ
    の検定が分離された総第１酵素標識の測定との比較によ
    り標準化されることからなる検定法。
  2. 【請求項２】（ａ）試料を第１酵素標識で標識されたリ
    ガンド類似体および第２酵素標識で標識されたそのリガ
    ンドに対する抗体とともに前記第１酵素標識が前記第２
    酵素標識と独立して監視されうるようにして、逐次的に
    または同時に培養して複合体を形成させ、 （ｂ）前記第１酵素標識を含有する複合体成分を、リガ
    ンド類似体と複合体を形成してない前記第２酵素標識の
    フラクションから分離し、そして （ｃ）工程（ｂ）で分離された前記第１酵素標識を含有
    する複合体成分中の前記第２酵素標識の量を前記分離さ
    れた複合体成分中に存在する前記第１酵素標識の測定に
    関連して測定することによりリガンドの標準化された検
    定を行う、 工程を包含する前記特許請求の範囲第１項記載の１−部
    位免疫学的検定を行う方法。
  3. 【請求項３】第１酵素標識で標識されるリガンド類似体
    が試薬Ｘをも貼付されており、そして工程（ｂ）が試薬
    Ｘに対する特異的な結合相手を担持する固相を用いて達
    成されることからなる前記特許請求の範囲第２項記載の
    方法。
  4. 【請求項４】（ａ）前記リガンドに対する抗体の集団に
    接合した第１酵素標識および該リガンドと同時に複合体
    を形成し得る別の１種または２種以上の抗体集団に接合
    した第２酵素標識であって第１酵素標識は第２酵素標識
    とは独立して監視されるうるものの存在下で液体試料を
    培養して複合体形成を平衡に達せしめ、 （ｂ）第１酵素標識を含有する成分を、複合体を形成し
    ていない前記第２酵素標識を含有する成分から分離し、
    そして （ｃ）工程（ｂ）で分離された前記第１酵素標識を含有
    する複合体成分中の前記第２酵素標識の量を前記分離さ
    れた成分中の前記第１酵素標識の測定に関連して測定す
    ることによりリガンドの標準化された検定を行う、 工程を包含する前記特許請求の範囲第１項記載の２−部
    位免疫学的検定を行う方法。
  5. 【請求項５】（ａ）液体試料、 （ｂ）第１酵素標識で標識されたリガンドに対する抗体
    を包含する第１酵素標識接合体、 （ｃ）第２の独立して測定しうる酵素標識で標識された
    リガンドに対する抗体を包含する第２酵素標識接合体、
    および （ｄ）非共有結合により接合体（ｂ）に結合しうるが、
    接合体（ａ）または接合体（ｃ）のいずれにも直接結合
    できず、且つ固相支持体に結合された試薬、 からなる混合物を培養し、検定混合物から固相を分離し
    そして分離された固相構成分中の前記第２酵素標識の量
    を前記分離された構成分中に存在する前記第１酵素標識
    の測定に関連して測定することによりリガンドの標準化
    された検定を行うことからなる前記特許請求の範囲第４
    項記載の方法。
  6. 【請求項６】接合体（ｂ）が第１酵素標識に加え試薬Ｘ
    に接合した抗体からなりそして試薬（ｄ）が試薬Ｘにと
    っての特異的な結合相手であることからなる前記特許請
    求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】試薬Ｘがフルオレセイン誘導体、ローダミ
    ンイソチオシアネート、2,4−ジニトロフルオロベンゼ
    ン、フェニルイソチオシアネートおよびダンシルクロラ
    イドからなる群から選択されるハプテンである前記特許
    請求の範囲第３または６項記載の方法。
  8. 【請求項８】使用される酵素と基質の対がアルカリホス
    ファターゼ／フェノールフタレンモノホスヘートおよび
    β−ガラクトシダーゼ/p−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
    ラクトシドまたはβ−ガラクトシダーゼ/o−ニトロフェ
    ニル−β−Ｄ−ガラクトシドである前記特許請求の範囲
    第１〜７項のいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】検定混合物から分離後の固相中の２種類の
    酵素標識の量が、この固相を当初約0.25M〜1Mのジエタ
    ノールアミン、約10mMのフェノールフタレンモノホスヘ
    ートおよび約50mMのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
    クトシドを包含するpH8.6の基質緩衝溶液の存在下に保
    温培養することにより測定されることからなる前記特許
    請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】液体試料中のリガンドの免疫学的検定を
    行うにあたり、それぞれ第１酵素標識および第２酵素標
    識である２種類の独立して測定し得る酵素標識を使用し
    て、第１酵素標識をリガンド類似体と接合させ第２酵素
    標識をリガンドに対する抗体の集団と接合させるか、あ
    るいは第１酵素標識をリガンドに対する抗体の集団と接
    合させ第２酵素標識をリガンドに対する別の１種または
    ２種以上の抗体集団と接合させて、第１酵素標識接合体
    および第２酵素接合体である接合体をそれぞれ作成し、
    該接合体を液体試料と培養して免疫反応により複合体を
    形成させ、複合体形成反応終了後、実質的に全ての第１
    酵素標識接合体およびある割合の第２酵素標識接合体を
    含有する成分を複合体を形成していない第２酵素標識接
    合体から分離し、分離された第２酵素標識の割合が試料
    中の前記リガンドの量に関連しておりそして第２酵素標
    識の前記した割合の測定により検定が行われ、そしてそ
    の検定が分離された総第１酵素標識の測定との比較によ
    り標準化されることからなる検定を実施するための試薬
    キットであって、該キットは前記第１酵素標識接合体で
    あって固定化されてなるものと、前記第２酵素標識接合
    体とからなるキット。
  11. 【請求項１１】第１酵素標識で標識され、固定化された
    リガンド類似体と、第２酵素標識で標識された被検定リ
    ガンドに対する抗体とからなる特許請求の範囲第10項記
    載のキット。
  12. 【請求項１２】前記酵素標識リガンド類似体が固相支持
    体に接合している特許請求の範囲第11項記載のキット。
  13. 【請求項１３】前記酵素標識リガンド類似体が試薬Ｘに
    接合し、試薬Ｘにとっての特異的な結合相手に接合した
    固形支持体からなる特許請求の範囲第11項記載のキッ
    ト。
  14. 【請求項１４】固定化された第１酵素標識接合体が被検
    定リガンドに対する抗体の第１酵素で標識された第１集
    団であり、第２酵素標識接合体が上記リガンドに対する
    抗体の第２酵素で標識された第２集団であり、そして上
    記２つの集団が異なったエピトープに向けられている特
    許請求の範囲第10項記載のキット。
  15. 【請求項１５】前記抗体の第１集団が固形支持体に接合
    した特許請求の範囲第14項記載のキット。
  16. 【請求項１６】前記抗体の第１集団が試薬Ｘに接合し、
    固形支持体が試薬Ｘにとっての特異的な結合相手に接合
    した特許請求の範囲第14項記載のキット。
  17. 【請求項１７】前記酵素標識の１つがアルカリホスファ
    ターゼであり、他のものがβ−ガラクトシダーゼである
    特許請求の範囲第10項なしい第16項のいずれかの項に記
    載のキット。
JP61011215A 1985-01-23 1986-01-23 免疫学的検定法 Expired - Lifetime JPH083489B2 (ja)

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