JPH0670629B2 - 免疫反応の反応成分を測定するための方法及び試薬 - Google Patents

免疫反応の反応成分を測定するための方法及び試薬

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、イムノアツセイの原理により免疫反応の反応
成分を測定する方法に関し、その際に測定すべき反応成
分を標識付けした特異的レセプターR1及び少なくとも１
種の未標識のレセプターR2と接触させると未標識のレセ
プターR2の１つが結合性物質R3を介して固相に結合して
いる。
従来の技術 免疫反応の反応成分（以下被分析物ともいう）の測定に
当り、しばしばサンドイツチ原理によるイムノアツセイ
が適用される。その際に反応成分を、公知方法で標識し
た、反応成分に対して特異的なレセプターと反応させ、
かつ反応成分と標識レセプターとからの複合体を、測定
すべき反応成分又は複合体に対して作用をしかつ固相に
固定している他のレセプターと反応させる。この原理に
ついては更に別法があり、この反応工程の順序を任意に
変えることができる。反応成分を、その都度測定すべき
反応成分（被分析物）に対して作用する可溶性の未標識
レセプター及び可溶性の標識レセプターと反応させ、こ
れら３成分からの複合体を未標識レセプターに対して作
用する不溶性レセプター、即ち固相に結合しているレセ
プターと反応させることができる。この３種類すべての
レセプターとの反応は同時に行なわれるかあるいは段階
的に行なわれる。このすべての方法で、固相に結合した
標識レセプター又は溶液中に存在する未結合の標識レセ
プターの量を好適な測定法を介して測定して、その測定
値から測定すべき反応成分の量を算出する。
標識として、例えば放射性物質、酵素、螢光物質又は着
色物質を使用する。標識レセプターの含量は螢光特性、
有色反応生成物の呈色又は固相と液相との間での放射性
物質の分配の変化を介して測定することができる。測定
シグナルと含量との間の関係について十分な理論的知識
がある場合には測定シグナルの変化から直接測定すべき
反応部分の含量を計算することができあるいは検量曲線
に基づいて測定シグナルから含量を測定する。両方法で
重要なのは測定シグナルのそれぞれの変化に反応成分の
含量が相関していることである。
しかしこのイムノアツセイ法では、固相への非特異的な
付加反応が起るという問題が生じる。この付加反応は試
料に特異的な作用によりもたらされかつマトリツクス効
果（Matrixeffekt）と呼ばれる。標識付けしたレセプタ
ーも非特異的に固相に付加されるので、測定シグナルの
誤差、それ故測定結果の誤差が生じる。この誤差を補正
するために、試料盲検値を測定しなければならない。し
かしながら従来は、確実に被分析物を含まない試料が得
られない場合又は試料中の被分析物の存在ないしは不存
在を確証するための絶対基準測定法が存在しない場合に
は前記の試料盲検値の測定は規則的に困難をもたらし
た。これらの場合には、試料の盲検値を正しく計測する
ためには、試料も標準も同一の挙動をすることが必要で
ある。しかしながら免疫測定法では、その都度同じ試験
物質を使用する場合にだけ確実に可能であるに過ぎな
い。それ故例えば血清中の被分析物の測定にあたり、標
準構造のために被分析物分を化学的、物理的又は免疫学
的方法で除去した血清プールを使用することが既に提案
された。しかしながらこの方法の欠点は、ゼロ試料の測
定値が存在しないので被分析物の除去が完全に行なわれ
ているかどうかを制御できない点にある。他方、被分析
物が完全に除去された場合でもそのことが、検量曲線の
ゼロ点及びその勾配に影響を与え得るようなマトリツク
スの変化を惹起し得るので、試料盲検値の変化を考慮し
なければならない。処理により場合によつては変化する
試料盲検値を知つていないと、被分析物含量を正確に測
定することもできない。更に、組成が著しく変動する試
料を使用する場合、例えば組織の均質物を使用する場合
に大きな盲検値変動を考慮しなければならない。
更に、緩衝溶液、牛血清アルブミン溶液のような人工的
物質を使用することが提案された。しかししばしばこの
ような溶液は検査すべき試料とは異なる挙動を示し、そ
れ故誤差をもたらす〔I.マルシユナー（Marschner）及
びその他共著“J.Chin.Chem.Clin.Biochem."、345〜351
頁（1976年）〕。
更に、例えば血清特異性の試料盲検値を種々のヒト血清
試料中で測定できる方法が従来知られていない。その結
果、すべての試料に関して共通の仮定盲検値が採用され
なければならない。それ故、シグナルが特異的な試料特
性により正確に惹起されているにもかかわらず、必然的
にこの盲検値に対する各シグナル差は被分析物含量によ
るものであるとされる。
従来、生理的由来の被分析物の測定のために被分析物を
含まないマトリツクスを標準の作成のために製造するこ
とが可能であり、しかもその際に検量曲線の勾配又は検
量曲線の生じ得るゼロ点の誤差を甘受する必要のない方
法もなかつた。
このことは、試験物質と同一であるマトリツクス物質を
使う場合にだけ正しい勾配を有する検量曲線が保障され
ることを表わす。しかし選択したマトリツクス物質自体
が未知の被分析物含量を有する場合、検量曲線のゼロ点
を決定することはできない。検量曲線のゼロ点の位置を
知らないと勾配は確定するが、検量曲線の経過は確定す
ることはできない。
発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の目的は、被分析物の測定にも使用する
同じマトリツクス中の試料盲検値を測定することのでき
る方法を開示することであつた。更に、本発明の目的
は、再現可能な検量曲線が得られかつそれによつて正確
な測定値が得られる方法を開示することであつた。
問題点を解決するための手段 この目的は、測定すべき反応成分を、標識付けした特異
的なレセプターR1及び未標識のレセプターR2と接触させ
かつその際に未標識のレセプターR2が結合性物質R3を介
して固相に結合する、免疫反応の反応成分をイムノアツ
セイ原理により測定する方法により達成され、その際に
試料盲検値の測定に当り、固相に固定しているレセプタ
ーにより結合する未標識のレセプターR2をR2の他方の反
応成分とは反応しない他の未標識のレセプターR2′に変
えることを包含する。
本発明方法では、試料盲検値の測定に当り、被分析物の
測定に使われているのと同じマトリツクス及びR3を含め
て同じ固相を使用することができる。存在する測定すべ
き反応成分を除去するためのマトリツクスの処理は必要
ではない。このようにして、選択した試験系において盲
検値及び分析が同様の挙動を示すことが保障される。
免疫学的反応の反応成分、即ち被分析物の測定に当り、
公知方法で試料を、反応成分に特異的な標識レセプター
R1及び未標識のレセプターR2と恒温保持して試料の被分
析物含量を測定する。R2は２つの反応成分、即ちR3と被
分析物自体か又は被分析物と結合性の他のレセプターR2
aとを有する。更に、試料盲検値の測定に当つては同じ
由来の試料をこの場合も同様にR1と恒温保持する。しか
しながらR2の代りに、R2の他方の反応成分（測定対象物
質）とは反応しないR2′を供給する。例えば、測定及び
試料盲検値測定は、初めにR2もしくはR2′を加え恒温保
持及び洗浄工程後に試料を加えかつ更に恒温保持しかつ
洗浄した後でR1を添加する。引続いて恒温保持し、場合
により洗浄しかつ液相又は固相中の標識の測定を行な
う。これらの反応工程は部分的に又は完全に同時にもし
くは逆の順序で実施することもできる。しかしその際
に、測定すべき反応成分が完全にR2を介してR3に結合す
るようにR3がR2に対して過剰量で存在するように注意し
なければならない。この方法で両方のバツチにおいてそ
の都度のマトリツクスに典型的な非特異的付加反応、特
に標識レセプターR1の固相への反応が惹起される。しか
し試料盲検値のバツチでは特異的反応は起らない。各バ
ツチで測定シグナルが得られ、その際に非特異的な、所
謂マトリツクス効果により生じるシグナルは両方のバツ
チで同一であるが、被分析物を測定するためのバツチの
シグナルは被分析物含量に相応する分だけ大きい。未知
の被分析物含量を含む試料をこの試料盲検値に対して測
定する場合、両方の測定シグナルの差が、固相に固定し
ている結合性物質R3により特異的に結合される標識レセ
プターR1の量に相当する。従つて、試料盲検値の測定と
被分析物測定が得られる測定シグナルを比較することに
より、非特異的付加による部分と実際に測定すべき反応
成分により生じる部分とを区別することができる。
本発明範囲においてレセプターとしては、殊に結合性の
完全抗体、抗体フラグメント、もしくは抗体又は抗体フ
ラグメントとハプテンとの接合体を使用する。
レセプターR1としては、被分析物に特異的な、即ち被分
析物とだけ結合する標識レセプターを使用する。既知量
で使用するレセプターR1は当業者に公知の方法で標識さ
れている。標識付けは酵素、螢光物質、化学的発光物質
又は放射性物質との結合により行なう。このようなレセ
プターを標識付けする方法は、例えば“クリニカ・キミ
カ・アクタ（Clin.Chim.Acta）”、81巻、１〜40頁（19
77年）から当業者に公知であり、ここでは更に詳説する
必要はない。
レセプターR2及びR2′は抗体、抗体フラグメント又はそ
の誘導体であつてよい。例えば、誘導体としては、相互
に結合性の物質対の結合成分に結合している抗体又はフ
ラグメントが好適である。この場合R3はこの物質対の他
方の成分である。好適な物質対としては、例えば抗原／
ハプテン‐抗体、蛋白質A-免疫グロブリンＧ、アビシン
‐ビオチン、コンカナバリンA-レクチン、DNA-DNA（ハ
イブリツド）を挙げることができる。
例えば、R2及びR2′としては、ハプテンに結合している
抗体又はフラグメントを使用する。この場合R3はハプテ
ンに対して作用する抗体である。その際、レセプターR2
及びR2′がほぼ同じように結合性物質R3に結合すること
が保障されるべきである。それ故、ハプテン化した抗体
又はフラグメントを使用する際に、R2及びR2′のハプテ
ン化度は比較可能かもしくは同一であるべきである。
試料盲検値の測定ではレセプターR2に代えて使用するレ
セプターR2′としては、被分析物と反応しないレセプタ
ーを使用する。このレセプターR2′は標識レセプターR1
の固相への非特異的結合に対して影響しないかもしくは
標識レセプターR1の非特異的結合では差異を生ぜしめな
い。測定される系に対するR2′の適性は、標識レセプタ
ーR1を、同じように標識したが該試験には特異的ではな
いレセプターR1′に代え、引続いて特異的レセプターR2
の不存在及び存在での測定シグナルないしはR2をR2′に
代えた後の測定シグナルを比較することにより検査する
ことができる。測定シグナルが誤差限界の範囲で同じで
ある場合、レセプターR2′は本発明方法に好適である。
レセプターR2もしくはレセプターR2′結合性物質R3を介
して固相に結合する。例えば、好適な結合性物質R3は抗
体又は抗体フラグメント並びに前記の物質対の結合成分
である。R2及びR2′がIgG群の抗体である場合、例えばR
3は蛋白質Ａ又は抗‐免疫グロブリン‐抗体であつてよ
い。R2及びR2′がハプテン化した抗体である場合、例え
ばR3はハプテンに対して作用する抗体であつてよい。R3
として抗‐免疫グロブリン‐抗体を使用する場合、R1が
R3に結合しないようにすべきである。例えば、これはR2
とR1が交叉反応しない異なる種のものであるか又はR3と
してR1とは別の抗体フラグメントを使用することにより
達成される。例えばその際R3は抗‐Fcy-抗体であり、R1
はFabFab′又はＦ（ab′）２のような抗体フラグメント
である。
R3として、レセプターR2もしくはR2′の一部とだけ結合
性である抗体を使用すると特に優れており、レセプター
R2もしくはR2′のFc部分と結合性であると優れている。
場合によりR3として、R2もしくはR2′のハプテン部分又
はFab部分ともしくは全レセプターR2あるいはR2′と特
異的に結合性である抗体も使用することができる。固相
に存在する結合性物質R3の不溶性担持物質への結合は、
生物活性と蛋白質を固体の担持物質に固定するための当
業者に公知の常法により行なうことができる。共有結合
も吸着結合も好適である。この際により高い収率が達成
されかつ操作法が簡単であるために例えば合成樹脂への
吸着結合が優れている。吸着により内面がR3で覆われて
いるポリスチレン及び類似の合成樹脂製の試験管が特に
好適であることが明らかになつた。更に、特にレセプタ
ー及び結合性物質R3の選択並びに測定法の実施に関して
はヨーロツパ特許第0098590号明細書の実施形が該当す
る。
使用するレセプターはポリクローナルでもモノクローナ
ルでもよい。試料盲検値測定で交換されるレセプターR2
がモノクローナルである場合、その代りに使われるレセ
プターR2′も同様にモノクローナルで同一の種のもので
あると優れている。それが同じサブクラスに属すると特
に優れている。レセプターR2がポリクローナルである場
合は、非特異的レセプターR2′も同様にポリクローナル
で、同じ種のものであると優れている。R2とR2′の全組
成がサブクラスに関して可能な限り類似していると特に
優れている。
本発明方法により、ゼロ点と勾配が正確に決定される、
測定すべき反応成分の検量曲線を作成することもでき
る。その際に未知量の被分析物を含む試料に既知量の被
分析物を添加する。被分析物の添加量を変えて測定シグ
ナルを測定する。同時に同じ系中で試料盲検値を測定す
る。得られた数値から、勾配がマトリツクス効果又は他
の効果による誤差を含むことのない検量曲線が得られ
る。このようにして、正確な再現可能な検量曲線が得ら
れる。この正確な検量曲線により、分析物試料に関して
得られる測定シグナルを介して被分析物の濃度も正確に
測定することができる。
本発明の他の目的は免疫反応の反応成分を測定するため
の試薬であり、これは試薬が固相に結合している結合性
物質R3、R3及び他の反応成分と結合性の未標識のレセプ
ターR2少なくとも１種及び標識付けした特異的レセプタ
ーR1を含有し、かつ物理的にそれとは別個に、固相に結
合している結合性物質R3、R2の他方の反応成分とは反応
しない未標識のレセプターR2′及び標識付けした特異的
レセプターR1を更に含有することを特徴とする。
試薬を２つの反応容器の形で存在させると優れており、
これらはそれぞれ同じ固相及びこの固相に結合している
レセプターR3を含有し、その際にレセプターR3は抗‐Ig
-抗体である。レセプターR3が既にR2もしくはR2′を担
持すると特に優れている。場合によつてはR1とR2もしく
はR2′は前混合されかつR3はそれとは別個に存在する。
すべてのレセプターR2及びR1は乾燥しているか、溶解し
ているかあるいは固体担体上に脱離し得るように施され
て存在していてよい。
レセプターR2もしくはR2′がハプテン化されている他の
優れている実施形では、両方のレセプターは、ハプテン
に対して作用する抗体R3を介して既に固相に結合してい
る。
本発明により、免疫反応の反応成分の測定に当りゼロ点
が正確でありかつ勾配が誤差を含まない検量曲線の作成
を可能にする方法及び試薬が得られる。本発明方法の他
の利点は、試料と試料盲検値を平行して測定する際に、
盲検値の測定により非特異的な付加反応が認識されるの
で、測定シグナルの差が測定すべき反応成分の含量に相
当し得るという点である。このようにして、極めて確実
で正確な測定を実施することが可能である。
実施例 次に本発明を実施例につき詳説する。
例１ ヒト血清中のテレオトロピン（TSH）の測定 1. 試薬溶液の製造 1.1 緩衝剤I: K2HPO4溶液50ミリモル／及びKH2PO4溶液50ミリモル／
をpH6.0が達成されるまで混合することにより製造し
たリン酸カリウム緩衝液、pH6.0、50ミリモル／ 1.2 緩衝液II: 緩衝液IIは、pH値を7.5に調節しかつ緩衝液が付加的に
牛血清アルブミン10g／及びNaCl150ミリモル／を含
有することを除いては緩衝液Ｉと同様に製造する。
1.3 レセプターR2溶液、TSHと結合性： レセプターR2としてサブクラスIgG1のモノクローナルの
マウス‐抗‐TSH-抗体を使用する。この抗体を含有する
腹水に硫酸アンモニウム合計1.8モルを加える。この調
製物をリン酸ナトリウム、pH7.0、15ミリモル及び塩化
ナトリウム50ミリモルからの緩衝液中に取る。このよう
にして得られた溶液をDEAEセルロース中を通過させる。
このようにして得られたTSH結合性抗体を含有する溶出
液を緩衝液IIで蛋白質濃度１μｇ／mlに稀釈する。
1.4 レセプターR2′、TSHとは非結合性： この溶液はTSHと結合性のレセプターR2溶液（1.3）と同
様に製造するが、但しここではサブクラスIgG1のモノク
ローナルのマウス‐抗‐CEA-抗体を使用する。
1.5 標識付けしたレセプターR1溶液： レセプターR1としては、R2とは別の抗原決定因子を認識
するモノクローナルのマウス‐抗‐TSH-抗体を使用す
る。この抗体を含有する腹水を1.3に記載したように精
製する。完全抗体を公知のようにR.R.ポータ（Porter）
著、“Biochom.J."、73巻、119頁（1959年）による方法
でFab-フラグメントに分解する。得られたFab-フラグメ
ントをイシカワ及びその他共著、“ジヤーナル・オブ・
イムノアツセイ（J.of Immunoassay）”、４巻、209〜3
27頁によりβ‐ガラクトシダーゼと結合させる。レセプ
ターR1溶液を緩衝液II中に濃度500mu／ml（37℃でo-ニ
トロフエニル‐β‐ガラクトシドで測定）に稀釈する。
1.6 レセプターR3溶液： 羊‐抗‐マウス‐Fcγ‐抗血清の硫酸アンモニウム全量
1.8モルを加える。この調製物をリン酸ナトリウム、pH
7.0、15モリモル及び塩化ナトリウム50ミリモルからの
緩衝液中に取る。このようにして得られた溶液をDEAEセ
ルロース中を通過させる。特異的抗体を含有する抽出液
を緩衝液Ｉ中で蛋白質濃度50μｇ／mlに稀釈する。
1.7 基質溶液： クロルフエノールレツド‐β‐ガラクトシド ５ミリモル／ （西ドイツ国特許第3345748号により製造） （3.05g／） HEPES 70ミリモル／ （16.7g／） NaCl 154ミリモル／ （98g／） 牛血清アルブミン 0.3％（3g／） ツイーン20 0.2％（2g／） pH（NaOHにより） 7.25 2. 実施（恒温保持はすべて室温で行う） ポリスチレン製の微量滴定板（MTP、板１つ当り96個の
凹部）を凹部１個当りレセプターR3溶液300μｌと１時
間恒温保持する。次いで、液体を廃棄する。残りの非特
異的結合部位を凹部１個当り緩衝液II300μｌを1/2時間
恒温保持することにより飽和する。次に、凹部１個当り
それぞれ200μｌを用いて、微量滴定板の半分をTSHと結
合性のレセプターR2溶液（1.3）と恒温保持し（MTPのＡ
部分）かつ微量滴定板の他の半分をTSHと非結合性のレ
セプターR2′溶液と１時間恒温保持する（MTPのＢ部
分） 次に18時間試料と恒温保持する際に、TSHと結合性の抗
体を含有する凹部（MTPのＡ部分）中にそれぞれ試料200
μｌをかつTSHと結合性ではない抗体を含有する凹部（M
TPのＢ部分）中に200μｌを加える。試料の恒温保持が
終結した後で、試料を廃棄しかつ凹部を緩衝液IIそれぞ
れ300μｌで３回洗浄する。
その後、全MTP凹部を標識レセプターR1溶液（1.5）それ
ぞれ200μｌと３時間恒温保持する。標識レセプターR1
溶液を廃棄しかつ緩衝液IIそれぞれ300μｌで３回洗浄
した後で基質溶液（1.7）250μｌを添加することにより
基質反応を開始する。約１時間の恒温保持後に、基質反
応により形成される色素を市販のMTP光度計を用いて570
nmで測定することにより検出する。
3. 評価： それぞれの試料に関して、MTPのＡ部分からの吸光度
（Ａ吸光度）及びMTPのＢ部分からの吸光度（Ｂ吸光
度）を測定する。それぞれ１試料に関する吸光度ＡとＢ
との差を評価する。このようにして得られたTSHに特異
的な測定シグナルが検量曲線によりTSH含量に相当す
る。
検量曲線の作成に当つては、それぞれのMTPに関して試
料に種々の既知TSH含量を加える（このためには可能な
限り、低いTSH出発含量の試料を使用すべきである）。
添加することにより得られた、それぞれの試料と添加し
たTSH濃縮液中のシグナルの増大から、線図のゼロ点に
より外挿される検量曲線が作成される。この検量曲線を
使つて、未知試料のTSH含量を試料特異性盲検値の考慮
下に確定することができる。
記載した方法による代表的な実験では次の結果が得られ
た： 例２ ヒト血清中のα‐フエト蛋白質（AFP）をモノクローナ
ル抗体により測定 本例は例１に相応するが、但し次の点が異なつている： ａ） AFPと結合性であるレセプターR2として、サブク
ラスIgG2aのモノクローナルのマウス‐抗‐AFP-抗体を
使用する。
ｂ） AFPと結合性でないレセプターR2′として、サブ
クラスIgG2aのモノクローナルのマウス‐抗‐フエリチ
ン‐抗体を使用する。
ｃ）R1として、R2とは別の抗原決定因子を認識するモノ
クローナルのマウス‐抗AFP-抗体を使用する。
ｄ） 試料は測定前に緩衝液IIで1:5に稀釈する。
ｅ） 稀釈した試料はMTP中で１時間恒温保持する。
ｆ） 標識付けしたレセプターR1溶液との恒温保持は１
時間継続する。
記載した方法による代表的な実験では次の結果が得られ
た： 例３ 人血清中のα‐フエト蛋白質（AFP）をポリクローナル
抗体により測定 本例は次の点を除いて例２に相応する： ａ） AFPと結合性のレセプターR2として、ポリクロー
ナルのウサギ‐抗‐AFP-抗血清を使用した。
ｂ） AFPと結合性ではないレセプターR2′として非特
異的なウサギ血清を使用する。
ｃ） レセプターR1としては、レセプターR3とは別の抗
原決定因子を認識するポリクローナルの羊‐抗‐AFP-抗
血清を使用する。標識付けしたレセプターR1溶液の調製
はモノクローナル抗体の処理（前記参照）と同様に行な
う。
ｄ） レセプターR3として、ポリクローナルの羊‐抗‐
ウサギ‐Fcr-抗血清を使用する。
記載の方法による代表的な実験では次の結果が得られ
る： 例４ TSHの測定 使用したレセプター及び基質溶液は例１からの試薬と同
じであり、DEAE-セルロースを通して通過させることを
含めてそれまでの精製工程及び標識付けしたレセプター
R1溶液の合成も同様である。記載したレセプターを使つ
て、試薬担体を製造する。
試薬担体の製造 １） 試薬担体１（TSHと結合性）:1当りリン酸ナト
リウム、pH7.3、100ミリモル、塩化マグネシウム２モリ
モル、塩化ナトリウム9g、牛血清アルブミン5g、マウス
からの抗‐TSH-モノクローナル抗体5ml（レセプター
R2）、抗‐TSH-抗体‐（マウス）‐Fab-フラグメント‐
β‐ガラクトシダーゼ‐接合体（レセプターR1溶液；活
性度は37℃でオルト‐ニトロフエニル‐β‐D-ガラクト
シドで測定）1000Uを含有する溶液40μｌを市販のポリ
エステル紙より成るフリース上に滴加する。引続いて、
室温で乾燥させる。このフリースは使用するまでは４℃
及び相対湿度20％で貯蔵する。
２） 試薬担体１′（TSHと非結合性）：抗‐TSH-抗体
（レセプターR2）の代りにマウムからの抗‐CEA-モノク
ローナル抗体（レセプターR2′）を使用することを除い
ては試薬担体１と同様に製造する。
３） 試薬担体2:ブロムシアン活性化法（西ドイツ国特
許公開第1768512号明細書）によりセルロースフリース
上に、マウス‐抗体のFcr.部に対する羊抗体（レセプタ
ーR3溶液）を固定させ、その際に繊維材料1g当り抗体10
μｇを固定に使用する。洗浄して未結合の抗体を除去し
かつフリースを注意深く室温で乾燥させる。このように
して得られたフリースの貯蔵は試薬担体１と同様に行な
う。
この両方の試薬担体１と２もしくは１′と２による測定
は西ドイツ国特許出願公開第3425008号明細書に記載さ
れている分析測定を実施するための装置（第１図）で行
なう。
これは、自動遠心分析装置用の回転子組込み部材を開示
しており、この部材は、それぞれが一定の試薬で含浸さ
れた吸収性担持物質を含有する多数の試薬フイールドと
連結している試料受容室、少なくとも１つの混合弁室及
び測定室を備えた成形体より構成されており、前記構成
部が一緒になつて、組込み部材が回転子上に固定されて
おり、かつ組込み部材が更に液体を収容するための他の
室少なくとも１つ及びこの室から測定部に案内しかつ試
料液体搬送路と少なくとも一部が同一である搬送路を備
えている場合には、軸方向で内側から外に向つて続いて
いる試料液体搬送路を構成する。その際に、試料液体搬
送路は試料受容室（Ｐ）から、吸収性材料が充填されか
つ緩衝液を含有する室（ａ）、室（ｃ）及び室（ａ）と
（ｃ）との間に配置されている第一弁室（VK1）を介し
て第二弁室（VK2）に、かつこの第二弁室から室（ｄ）
及び捕集室（AK）を介して測定室（ｋ）に設置されてい
る。他の液体を収容するためにポンプ室として構成され
ている基質室（PK）が設けられており、この室は配量室
（DK）と毛管（Kap）とより成る配量装置及びオーバー
フロー室（Ｋ）を介して第二弁室（VK2）と連結して
いる。第１図は使用される回転子組込み部材を略図で示
したものである。
吸光度Ａ（試料設検値を含む特異的な測定シグナル）の
測定により試薬担体１と試薬担体２を使い、吸光度Ｂ
（試料盲検値）の測定には試薬担体１′と２を使う。
試薬単体１もしくは１′は回転子組込み部材のフイール
ドｃに配置し、かつ試薬担体２はフイールドｄに配置す
る。その際に濃試料40μｌを上縁部の開口部を通して直
接フイールドａにピペツト装入する。基質溶液270μｌ
は室PK中にピペツト装入する。高い回転数と停止とが相
互に行なわれる好適な遠心分離プログラムにより、試料
と基質溶液は分離マトリツクスとキユベツトの方向に供
給される。
その際、プログラムの進行中にレセプターR1及びR2もし
くはR2′は試料液体を通してフイールドｃから溶離し、
かつ引続いて均質な混合物が反応する。フイールドｄ
で、形成された複合体がレセプターR3に結合する。試料
のフイールドｃからｄへの搬送は非常に短時間で行なわ
れる。
基質溶液は配量室DKにより少量ずつに分けられ、そのう
ちの初めのものは過剰の、複合しなかつた接合体の洗浄
に使われる。ｄ上での複合体形成を介して結合したβ‐
ガラクトシターゼ活性は試料に含まれるTSH量もしくは
試料盲検値に比例する。この活性度は他の基質分割分で
測定し、その際に基質は５分間の反応で着色生成物に変
換される。形成された色素及び液相中の発色／分はキユ
ベツト中576nmで測定する。
これらの条件下で次の結果が得られた： 例５ モノクローナル抗‐AFP-抗体の測定 本例は次の点を除いて例１に相応する。
1. レセプターR3溶液として羊‐ウサギ‐Fcr-抗血清を
使用する。
2. AFPと結合性であるレセプターR2としてウサギ‐抗
‐AFP-抗血清を使用する。抗体の精製はレセプターR3と
同様に行なう。
3. AFPと結合性ではないレセプターR2′としては非特
異的ウサギ血清を使う。抗体の精製はレセプターR3と同
様に行う。
4. レセプターR1としては、羊‐抗‐マウス‐IgG-抗体
を使用する。抗体はナカネ法〔M.B.ウイルソン（Wilso
n）、P.K.ナカネ共著、“Recent Developments in the
Pexiodate Method of Conjugating.Horseradish Peroxi
dase to Antibodies"（1978年）、Elsevier,North Holl
and Biomedical Press,“Immunofluorescemce and Rela
ted Staining Techniques"中の215〜224頁〕により西洋
ワサビからのペルオキシダーゼと結合させる。抗体‐酵
素‐接合体を緩衝液II中で濃度80U／（基質としてグ
アセコールとH2O2を用いて25℃で測定）に調節する。
5. 例１に相応してレセプターR2もしくはR2′を含む微
量滴定板の恒温保持及び洗浄後に、それぞれの凹部を緩
衝液II中のAFP12.5IU／mlの溶液200μｌと１時間恒温保
持する。引続いて緩衝液II300μｌで２回洗浄する。
6. 抗体含有試料溶液の恒温保持は１時間である。
7. 標識レセプターR1溶液との恒温保持は１時間であ
る。
8. 指示溶液として次のものを使う： ABTS（Ｒ）（2,2-アジノ‐ジ‐〔3-エチルベンゾチアゾ
リウムスルホネート（６）〕）1.8ミリモル ホスフエート／シトレート‐緩衝液、pH4.4、100ml中の
過ホウ素ナトリウム3.3ミリモル 恒温保持は１時間である。形成色素の測定は光度計を基
質盲検値に対して調製した後で405nmで行なう。
記載の方法による代表的な実験では、緩衝液II溶液に種
々の抗体を変化する濃度で加えた。次の結果が得られ
た：
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例４で使用する回転子組込み部材を示す
略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−23251（ＪＰ，Ａ) Ｒ，ＭＡＬＶＡＮＯ，“Ｉｍｍｕｎｏｅ ｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈ ｎｉｇｕｅｓ”，（1980）Ｍａｒｔｉｎｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ（Ｔｈｅ Ｈａｇｕｅ ／Ｂｏｓｔｏｎ／Ｌｏｎｄｏｎ），Ｐ. 107〜109

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】イムノアッセイの原理により免疫反応の反
    応成分を測定する際に、測定すべき反応成分を、標識付
    けした特異的レセプターR1及び測定対象物質に対して特
    異的な未標識のレセプターR2と接触させ、かつその際に
    未標識のレセプターR2が結合性物質R3を介して固相に結
    合しているその測定法において、試料盲検値の測定に当
    っては、固相に固定されているレセプターにより結合さ
    れる未標識のレセプターR2を、測定対象物質以外の物質
    に対して特異的か又は非特異的である未標識レセプター
    R2′により代えることを特徴とする、免疫反応の反応成
    分を測定するための方法。
  2. 【請求項２】未標識のレセプターR2は測定すべき反応成
    分か又はレセプターR1と測定すべき反応成分との複合体
    に対して作用する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】結合性物質R3としては、R1と結合しない抗
    −Ig−抗体を使用する特許請求の範囲第１項又は第２項
    記載の方法。
  4. 【請求項４】レセプターR2及びR2′は完全モノクローナ
    ル抗体又はモノクローナル抗体フラグメントでありかつ
    同じサブクラスに属する特許請求の範囲第１項から第３
    項までのいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】レセプターR2及びR2′としてはハプテン化
    した抗体を使いかつ結合性物質R3としてはハプテンに対
    して作用する抗体を使う特許請求の範囲第１項から第４
    項までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】固相に結合している結合性物質R3、R3及び
    測定対象物質と結合性の未標識のレセプターR2及び標識
    付けした、測定対象物質に対して特異的なレセプターR1
    を含有し、かつ物理的にそれとは別個に固相に結合して
    いる結合性物質R3、測定対象物質以外の物質に対して特
    異的か又は非特異的である未標識のレセプターR2′及び
    標識付けした、測定対象物質に対して特異的なレセプタ
    ーR1を更に含有することを特徴とする、免疫反応の反応
    成分を測定するための試薬。
  7. 【請求項７】レセプターR2もしくはR2′は抗−Ig−抗体
    を介して固相に結合して存在する特許請求の範囲第６項
    記載の試薬。
  8. 【請求項８】レセプターR2もしくはR2′はハプテン化さ
    れておりかつこのハプテンに対して作用する抗体を介し
    て固相に結合している特許請求の範囲第６項記載の試
    薬。
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