JPS63118655A - 免疫反応の反応成分を測定するための方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎ東上の利用分野 本発明は、イムノアッセイの原理により免疫反応の反応
成分を測定する方法に関し、その際に測定すべき反応成
分を標識付けした特異的レセプターＲ１及び少なくとも
１種の未標識のレセプターＲ２と接触させると未Ｓ繊の
レセプターＲ，の１つが結合性物質Ｒ３を介して固相に
結合している。

従来の技術 免疫反応の反応成分（以下被分析物ともいう）の測定に
当り、しはしばサンドイッチ原理によるイムノアッセイ
が適用される。その際に反応成分を、公知方法で標識し
た、反応成分に対して特異的なレセプターと反応させ、
かつ反応成分と標識レセプターとからの複合体を、測定
すべき反応成分又は複合体に対して作用をしかつ固相に
固定している他のレセプターと反応させる。この原理に
ついては更に別法があり、この反応工程の順序を任意に
変えることができる。

反応成分を、その都度測定すべき反応成分（被分析物）
に対して作用する可溶性の未標識レセプター及び可溶性
の標識レセプターと反応させ、これら３成分からの複合
体を未標識レセプターに対し工作用する不溶性レセゾタ
ー、即ち固相に結合しているレセプターと反応させるこ
とができる。この６棟類すべ℃のレセプターとの反応は
同時に行なわれるかあるいは段階的に行なわれる。この
すべての方法で、固相に結合した標識レセプター又は溶
液中に存在する未結合のａｍレセッターの量を好適な測
定法を介して測定して、その測定値から測定すべき反応
成分の量を算出する。

標識として、例えば放射性物質、酵素、螢光物質又は着
色物質を使用する。標識レセプターの含量は螢光特性、
有色反応生成物の呈色又は固相と液相との間での放射性
物質の分配の変化を介して測定することができる。測定
シグナルと含量との間の関係について十分な理論的知識
がある場合には測定シグナルの変化から直接測定すべき
反応成分の含＊’を計算することができあるいは検量曲
線に基づいて測定シグナルから含量を測定する。両方法
でｘ賢なのは測定シグナルのそれぞれの変化に反応成分
の含量が相関していることである。

しかしこのイムノアッセイ法では、固相への非特異的な
付加反応が起るという間趙が生じる。

この付加反応は試料に特異的な作用によりもたらされか
つマトリックス効果（Ｍａｚｒｉｘｅｆｆｅｋｚ）と呼
ばれる。標識付けしたレセプターも非特異的に固相に付
加されるので、測定シグナルの誤差、それ故測定結果の
誤差が生じる。この誤差を補正するために、試料盲検値
を測定しなければならない。しかしながら従来は、確実
に被分析物を含まない試料が得られない場合又は試料中
の被分析物の存在ないしは不存在を確証するための絶対
基準測定法が存在しない場合には前記の試料盲検値の測
定は規則的に困難金もたらした。これらの場合には、試
料の盲検値を正しく計測するためには、試料も標準も同
一の挙動をすることが必要である。しかしながら免疫測
定法では、その都度同じ試験物質を使用する場合にだけ
確実に可能であるに過ぎない。それ故例えば血清中の被
分析物の測定にあたり、標準失速のために被分析物分を
化学的、物理的又は免疫学的方法で除去した血清プール
を使用することが既に提案さｎた。しかしなか、らこの
方法の欠点は、ゼロ試料の測定値が存在しないので被分
析物の除去が完全Ｖζ行なわれているかどうかを制御で
きない点にある。他方、被分析物が完全に除去された場
合でもそのことが、検量曲線のゼロ点及びその勾配に影
響を与え得るようなマトリックスの変化を惹起し得るの
で、試料盲検値の変化を考慮しなければならない。処理
により場合によっては変化する試料盲検値を知っていな
いと、被分析物含量を正確に測定することもできない。

丈に、組成が著しく変動する試料を使用する場合、例え
ば組織の均質物を使用する場合に大きな盲検値変動を考
慮しなければならない。

更に、緩衝浴液、牛血清アルゾミン溶液のような人工的
物質を使用することが提案された。

しかししはしはこのような溶液は検査すべき試料とは異
なる挙動を示し、それ故誤差をもたらす［１，マルシュ
ナ−（Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ　）　　及びその他共著、”
　Ｊ、　Ｃｈｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　（’ｌｉｎ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　”、３４５〜３５１頁（１９７６年）〕
。

更に、例えは血清特異性の試料盲検値ｔｍ々のヒト血清
試料中で測定できる方法が従来知られていない。その結
果、すべての試料に関して共通の仮定盲検値が採用され
なければならない。

それ故、シグナルが特異的な試料特性により正確に惹起
されているにもかかわらず、必然的にこの盲検値に対す
る各シグナル差は被分析物含量によるものであるとされ
る。

従来、生理的市来の被分析物の測定のために被分析物を
含まないマトリックスを襟準の作成のために製造するこ
とが可能であり、しかもその際に検量曲線の勾配又は検
量曲線の生じ得るゼロ点の誤差を甘受する必要のない方
法もなかった。

このことは、試験物質と同一であるマトリックス物質を
使う場合にだけ正しい勾配を有する検量曲線が保障され
ることを表わす。しかし選択したマトリックス物質自体
が未知の被分析物含量を有する場合、検量曲縁のゼロ点
を決定することはできない。検量曲縁のゼロ点の位１ｉ
ｌｉｌ：を知らないと勾配は確定するが、検量曲線の経
過は確定することはできない。

発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の目的は、被分析物の測定にも使用する
同じマトリックス中の試料盲検値を測定することのでき
る方法を開示することであった。更に、本発明の目的は
、再現可能な検量曲線が得られかつそれによって正確な
測定値が得られる方法を開示することであった。

問題点を解決するための手段 この目的は、測定すべき反応成分を、標識付けした特異
的なレセプターＲ１及び少なくとも１筏の未標識レセプ
ターＲ２と接触させかつその際に未標識のレセプターＲ
２の１種が結合性物質Ｒ３を介して固相に結合する、免
疫反応の反応成分をイムノアッセイ原理により測定する
方法により達成され、その際に試料盲検値の測定に当り
、固相に固定しているレセプターにより結合する未標識
のレセプター２　ｔ−Ｒ２の他方の反応成分とは反応し
ない他の未標識のレセプターＲ２′に変えることを包含
する。

本発明方法では、試料盲検値の測定に当り、被分析物の
測定に使われているのと同じマトリックス及びＲ３を含
めて同じ固相を使用することとができる。存在する測定
すべき反応成分を除去するためのマトリックスの処理は
必要ではない。このようにして、選択した試験系におい
て盲検値及び分析が同様の挙動を示すことが保障される
。

免疫学的反応の反応成分、即ち被分析物の測定に当り、
公知方法で試料を、反応成分に特異的な標識レセプター
Ｒ１及び少なくとも１徨の未標識レセプターＲ２と恒温
保持して試料の被分析物含量を測定する。Ｒ２は２つの
反応成分、即ちＲ３と被分析物自体か又は被分析物と結
合性の他のレセプターＲ２ａとを有する。更に、試料盲
検値の測定に当っては同じ由来の試料をこの場合も同様
にＲ１と恒温保持する。しかしながらＲ２の代りに、Ｒ
２の他方の反応成分とは反応しないＲ２／を供給する。

例えは、測定及び試料盲検値測定は、初めにＲ２もしく
はＲ２／を加え恒温保持及び洗浄工程後に試料を加えか
つ更に恒温保持しかつ洗浄した後でＲ１を添加する。

引続いて恒温保持し、場合により洗浄しかつ液相又は固
相中の標識の測定を行なう。これらの反応工程は部分的
に又は完全に同時にもしくは逆の順序で実施することも
できる。しかしその際に、測定すべき反応成分が完全に
Ｒ２を介してＲ３に結合するようにＲ３がＲ２に対して
過剰量で存在するように注意しなければならない。

この方法で両方のバッチにおいてその都度のマトリック
スに典墓的な非特異的付加反応、特に標識レセプターＲ
１の固相への反応が惹起される。しかし試料盲検値のバ
ッチでは特異的反応は起らない。各バッチで測定シグナ
ルが得られ、その際に非特異的な、所−マトリックス効
果により生じるシグナルは両方のバッチで同一であるが
、被分析物を測定するためのバッチのシグナルは被分析
物含量に相志する分だけ大きい。

未知の被分析物含量を含む試料をこの試料盲検値に対し
て測定する場合、両方の測定シグナルの差が、固相に固
定している結合性物質Ｒ３により特異的に結合される標
識レセプターＲ１の量に相当する。従って、試料盲検値
の測定と被分析物測定が得られる測定シグナルを比較す
ることにより、非特異的付加による部分と実際に測定す
べき反応成分により生じる部分とを区別することができ
る。

本発明範囲においてレセプターとしては、殊に結合性の
完全抗体、抗体フラグメント、もしくは抗体又は抗体フ
ラグメントとハプテンとの接合体を使用する。

レセプターＲ１としては、被分析物に特異的な、即ち被
分析物とだけ結合する標識レセプターを使用する。既知
量で使用するレセプターＲ１は尚業者に公知の方法で標
識されている。

標識付けは＃素、螢光物質、化学的発光物質又は放射性
物質との結合により行なう。このようなレセプターを標
識付けする方法は、例えは１クリニカ・キミカψアクタ
（Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｎ。

Ａｃｚａ　）”、８１巻、１〜４０頁（１９７７年）か
ら当業者に公知であり、ここでは更に詳説する必要はな
い。

レセプターＲ２及びＲ２′並びに場合によりＲ２へは抗
体、抗体フラグメント又はその誘導体であってよい。Ｒ
２へは、被分析物が抗体である場合には結合成分であっ
てもよい。例えば、誘導体としては、相互に結合性の物
質対の結合成分に結合している抗体又はフラグメントが
好適である。この場合Ｒ３はこの物質対の他方の成分で
ある。好適な物質対としては、例えば抗原／ハプテン−
抗体、蛋白質Ａ−免疫グロブリンＧ１アビジン−ビオチ
ン、コンカナバリンＡ−レクチン、ＤＮＡ　−ＤＮＡ　
（ハイブリッド）を挙けることができる。

例えば、Ｒ２及びＲ２′としては、ハプテンに結合して
いる抗体又は７ラグメン）４使用する。

この場合Ｒ３はハプテンに対して作用する抗体である。

その際、レセプターＲ２及びＲ２′がほぼ同じように結
合性物質Ｒ３に結合することが保障されるべきである。

それ故、ハプテン化した抗体又はフラグメントを使用す
る際に、Ｒ２及びＲ２′のハプテン化度は比較可能かも
しくは同一であるべきである。

試料盲検値の測定ではレセプターＲ２に代えて使用する
レセプターＲ２′としては、被分析物と反応しないレセ
プターを使用する。このレセプターＲ２／は標識レセプ
ターＲ１の固相への非特異的結合に対して影響しないか
もしくは標識レセプターＲ１の非特異的結合では差異を
生せしめない。測定される系に対するＲ２′の適性は、
標識レセプターＲ１を、同じように標識したが該試験に
は特異的ではないレセプターＲｌ／に代え、引続いて特
異的レセプターＲ２の不存在及び存在での測定シグナル
ないしはＲ２をＲ２’　Ｋ代えた後の測定シグナルを比
較することにより検査することができる。測定シグナル
が誤差限界の範囲で同じである場合、レセプターＲ２／
は本発明方法に好適である。

レセプターＲ２もしくはレセプターＲ２′は結合性物’
ｆｉＲ３を介して固相に結合する。例えば、好適な結合
性物質Ｒ３は抗体又は抗体フラグメント並びに前記の物
質対の結合成分である。

Ｒ２及びＲ，／がＩｇＧ群の抗体である場合、例えばＲ
３は蛋白質Ａ又は抗−免疫グロブリン−抗体であってよ
い。Ｒ２及びＲ２／がハプテン化した抗体である場合、
例えばＲ３はへブテンに対して作用する抗体であってよ
い。Ｒ３として抗−免疫グロブリン−抗体を使用する場
合、Ｒ１がＲ３に結合しないようにすべきである。例え
ば、これはＲ２とＲ１が交叉反応しない異なる樵のもの
であるか又はＲ３としてＲ１とは別の抗体フラグメント
を使用することにより達成される。例えばその際Ｒ３は
抗−Ｆｃｙ−抗体であり、Ｒ１はＦａｂＦａｂ’又はＦ
（ａｂ’）２のような抗体７ラグメントである。

Ｒ３として、レセプターＲ２もしくはＲ２／の一部とだ
け結合性である抗体を使用すると特に優れており、レセ
プターＲ２もしくはＲ２′のＦｃ部分と結合性であると
優れている。場合によりＲ３として、Ｒ２もしくはＲ，
／のハプテン部分又はＦａｂ部分ともしくは全レセプタ
ーＲ２あるいはＲ２′と特異的に結合性である抗体も使
用することができる。固相に存在する結合性物質Ｒ３の
不溶性担持物質への結合は、生物活性の蛋白質を固体の
担持物質に固定するための尚業者に公知の常法により行
なうことができる。共有結合も吸着結合も好適である。

この際により高い収率が達成されかつ操作法が簡単であ
るために例えば合成樹脂への吸着結合が優れている。吸
着により内面がＲ３で扱われているポリスチレン及び類
似の合成樹脂製の試験管が特に好適であることが明らか
になった。東に、特にレセプΩ ター及び結合性物質Ｒ３選択並びに測定法の実施に関し
てはヨー田ツバ特許第００９８５９０号明細書の実施形
が該当する。

使用するレセプターはポリクロナールでもモノクロナー
ルでもよい。試料Ｎ検値測定で交換されるレセプターＲ
２がモノクロナールである場合、その代りに使われるレ
セプターＲ２／も同様にモノクロナールで同一の種のも
のであると優れている。それが同じサブクラスに属する
と特に優れている。レセプターＲ２がポリクロナールで
ある場合は、非特異的レセプターＲ２′も同様にポリク
ロナールで、同じ塊のものであると優れている。Ｒ２と
Ｒ２′の全組成がサブクラスに関して可能な限り類似し
ていると特に優れている。

本発明方法により、ゼロ点と勾配が正確に決定される、
測定すべき反応成分の検量−ａを作成することもできる
。その際に未知量の被分析物を含む試料に既知量の被分
析物を添加する。

被分析物の添加量を変えて測定シグナルを測定する。同
時に同じ系中で試料盲検値を測定する。

得られた数値から、勾配がマトリックス効果又は他の効
果による誤差を含むことのない検量曲線が得られる。こ
のようにして、正確な再現可能な検量曲線が得られる。

この正確な検量曲線により、分析物試料に関して得られ
る測定シグナルを介して被分析物のｆＩＲ度も正確に測
定することができる。

本発明の他の目的は免疫反応の反応成分を測定するため
の試薬であり、これは試薬が固相に結合している結合性
物質Ｒ３、Ｒ３及び他の反応成分と結合性の未標識のレ
セプターＲ２少なくとも１種及び標識付けした特異的レ
セプターＲ１を含有し、かつ物理的にそれとは別個に、
固相に結合している結合性物質’Ｒ３、Ｒ２の他方の反
応成分とは反応しない未標識のレセプターＲ２／及び標
識付けした特異的レセプターＲ１１＆：更に含有するこ
とを特徴とする。

試薬を２つの反応容器の形で存在させると優れており、
これらはそれぞれ同じ固相及びこの固相に結合している
レセプターＲ３を含有し、その際にレセプターＲ３は抗
−Ｉｇ−抗体である。

レセプターＲ３が既にＲ２もしくはＲ２／を担持すると
特に優れている。場合によってはＲ１とＲ２もしくはＲ
２／は前混合されかつＲ３はそれとは別個に存在する。

すべてのレセプターＲ２及びＲ１は乾燥しているか、皺
解しているかあるいは固体担体上に脱離し得るように施
されて存在していてよい。

レセプターＲ２もしくはＲ２１がハプテン化されている
他の優れている実施形では、両方のレセプターは、ハプ
テンに対して作用する抗体Ｒ３を介して既に固相に結合
している。

本発明により、免疫反応の反応成分の測定に当りゼロ点
が正確でありかつ勾配が誤差を含まない検量曲線の作成
を可能にする方法及び試薬が得られる。本発明方法の他
の利点は、試料と試料盲検値を平行して測定する際に、
盲検値の測定により非特異的な付加反応が認識されるの
で、測定シグナルの差が測定すべき反応成分の含量に相
当し得るという点である。このようにして、極めて確実
で正確な測定を実施することが可能である。

実施例 次に本発明を実施例につき詳説する。

例１ ヒト血清中のテレオトロピン（ＴＳＨ）の測定１、　試
薬浴液の製造 １．１　　緩衝剤Ｉ： に、ＨＰＯ，溶液５０ミリ％　ル／ｌ及びＫＨ２ＰＯ４
溶液５０ミリモル／ｌを−６，０が達成されるまで混合
することにより製造したリン酸カリウム緩衝液、−６，
０，５０ミリモル／１ １．２　　緩衝液■： 緩衝液■は、−値を７．５に調節しかつ緩衝液が付加的
に牛血清アルブミン１０１／ｌ及びＮａＣｊ　Ｉｇ０ミ
リモル／Ｊｊを含有することを除いては緩衝液Ｉと同様
に製造する◇ １．６　　レセプターＲ２溶液、ＴＳＨと結合性：レセ
プターＲ２としてサブクラスＩｇＧ１のモノクロナール
のマウス−抗−ＴＳＨ−抗体を使用する。この抗体を含
有する腹水に硫酸アンモニウム合計１．８モルを加える
。この調装物をリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，Ｉｇミ
リモル及び塩化ナトリウム５０ミリモルからの緩衝液中
に収る。

このようにして得られた溶液をＤＥＡＲセルロース中を
通過させる。このようにして得られたＴＳＨ結合性抗体
を含有する溶出液１に緩衝液■で蛋白質濃度１μｓ／継
に稀釈する。

１．４　　レセプターＲ２′、ＴＳＨとは非結合性：こ
の溶液はＴＳＨと結合性のレセプターＲ２浴液（１，３
’）と同様に製造するが、但しここではサブクラスＩｇ
Ｇ１のモノクロナールのマウス−抗−ＣＥＡ−抗体を使
用する。

１．５　　榛織付けしたレセプターＲ１浴液：レセプタ
ーＲ工としては、Ｒ２とは別の抗原決定因子を認識する
モノクロナールのマウス−抗−ＴＳＨ−抗体を使用する
。この抗体を含有する腹水を１．６に記載したように精
製する。完全抗体を公知のようにＲ，Ｒ，ボータ（Ｐｏ
ｒｚｅｒ　）著、”　ＢｉｏｃＪｍ、　Ｊ、　”、７３
巻、１１９頁（１９５９年）による方法でＦａｂ−フラ
グメントに分解する。得られたＦａｂ　−７２グメ／）
ｔイシカワ及びその他共着、１ジヤーナル・オシ・イム
ノアッセイ（Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）
　”　。

４巻、２０９〜６２７頁によりβ−がラクトシダーゼと
結合させる。レセプターＲ１浴ｉを緩衝液■中に濃度５
００　ｍＵ／Ｎ　（３７℃で０−二トロフェニル−β−
がラクトシトで測定）に稀釈する。

１、８　　レセプターＲ３＠液： 羊−抗一マウス−Ｆｃｙ−抗血清に硫激アンモニウム全
量１．８モルを加える。この調製物をリン酸ナトリウム
、ＰＨ７，０，Ｉｇミリモル及び塩化ナトリウム５０ミ
リモルからのｔ＆衝液中に取る。このようにして得られ
た浴液をＤＥＡＥセルロース中を通過させる。特異的抗
体を含有する浴出液を緩爾液Ｉ中で蛋白ＪＸ！Ｉ匿５０
μｍ１／ｌＬｔに稀釈する。

１．７　　基質溶液： クロルフェノールレッド−β−５ミＩＪ　モに／　１が
ラクトシト （西ドイツ国特許第３３４５７４８号　　　（３，０５
Ｖｌ）により製造） ＨＥＰＥ８　　　　　　　　　　　　　　　７０ミリモ
ル／！（１６，７ｇ／Ｊ） ＮａＣｊ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉｇ４ミリ
モル／ｌ（９ｇ／）） 牛血消アルブミン　　　　　　　　０．６％（”、９／
ｌ　）ツイーン２０　　　　　　　　　　　０．２％（
２ｇ／））ｐｉ（（ＮａＯＨにより）　　　　　　　　
７．２５２、実施（恒温保持はすべて室温で行う）ポリ
スチレン製の微量滴定板（ＭＴＰ　、板１つ当り９６個
の凹部）を凹部１個当りレセプターＲ３ｍ液６００μノ
と１時間恒温保持する。次いで、液体を廃棄する。残り
の非特異的結合部位を凹部１個当り緩衝液１３００μノ
を匈時間恒温保持することにより飽和する。次に、凹部
１個当りそれぞれ２００μノを用いて、微量滴定板の半
分ｔ−ＴＳＨと結合性のレセプターＲ２溶液（１，３）
と恒温保持しく　ＭＴＰのＡ部分）かつ微量滴定板の他
の半分をＴＳＨと非結合性のレセプターＲ２溶液と１時
間恒温保持する（　ＭＴＰのＢ部分）。

次に１８時間試料と恒温保持する際に、ＴＳＨと結合性
の抗体を含有する凹部（ＭＴＰのＡ部分）中にそれぞれ
試料２００μノをかつＴＳＨと結合性ではない抗体を富
有する凹部（Ｍ’Ｉ’ＰのＢｓ分）中に２００μノを加
える。試料の恒温保持が終結した後で、試料を廃棄しか
つ凹部を緩衝液■それぞれ３００μノで６回洗浄する。

その後、全ＭＴＰ凹部をｌＩＩ識レセしターＲ０＃液（
１，５）それぞれ２００μノと３時間恒温保持する。標
識レセプターＲ１溶液を廃棄しかつ緩衝液■それぞれ６
００μｌで６回洗浄した後で、に、基質反応により形成
される色素を市販のＭＴＰ光度計を用いて５７０　ｎｍ
で測定することにより検出する。

３、評価： それぞれの試料に関して、ＭＴＰのＡｌｌＳ分からの吸
光度（Ａ吸光度）及びＭＴＰのＢ部分からの吸光度（Ｂ
ａ光度）′ｔ−測定する。それぞれ１試料に関する吸光
度ＡとＢとの差を評価する。このようにして得られたＴ
ＳＨＫ特異的な測定シグナルが検量曲線によりＴ８Ｈ含
量に相当する。

検量曲線の作成に当っては、それぞれのＭＩ’ＰＫｒ！
Ｉａして試料に櫨々の既知ＴＳＨ官量を加える（このた
めには可能な限り、低いＴＳＨ出発含量の試料を使用す
べきである）。添加することＫより得られた、それぞれ
の試料と添加したＴＳＨ濃縮液中のシグナルの増大から
、線図のゼロ点により外挿される検量曲線が作成される
。この検量曲線を使って、未知試料のＴ８Ｈ含量を試料
特異性盲検値の考慮下に確定することができる。

記載した方法による代懺的な実験では次の結果が得られ
た： 例２ ビト血清中のα−フェト蛋白ｆｆ　（ＡＦＰ）　’ｅモ
ノクロナール抗体により測定 本例は例１に相応するが、但し次の点が異なっている： ａ）　　ＡＦＰと結合性であるレセ？ターＲ２として、
サブクラスＩｇ０２ａのモノクロナールのマウス−抗−
ＡＦＰ−抗体を使用する。

ｂ）　　ＡＦＰと結合性でないレセプターＲ２′として
、サブクラスＩｇ（）２ａのモノクロナールのマウス−
抗−７エリテン−抗体を使用する。

ｃ）Ｒ４として、Ｒ２とは別の抗原決定因子をｇ■する
モノクロナールのマウス−抗ＡＦＰ−抗体を使用する。

ｄ）試料は測定前に稜１■で１：５に稀釈する。

ｅ）朽釈した試料はＭＴＰ中で１時間恒漏保持する。

ｆ）標識付けしたレセプターＲ１陪欣との恒温保持は１
時間継続する。

記載した方法による代表的な実験では次の結果が得られ
た： 例６ 人血清中のα−フェト蛋白質（ＡＦＰ）をポリクナール
抗体により測定 本例は次の点を除いて例２に相応する＝ａ）　　ＡＦＰ
と結合性のレセプターＲ２として、ポリクロナールのウ
サギ−抗−ＡＦＰ−抗血清使用した。

ｋ：＋）　　ＡＦＰと結合性ではないレセプターＲ２／
して非特異的なウサギ血清を使用する。

Ｃ）レセプターＲ１としては、レセプターとは別の抗原
決定因子を認識するポリクロヅルの羊−抗−ＡＦＰ−抗
血清を使用する。振数けしたレセプターＲ１＃液の調製
はモノクロール抗体の処理（前記参照）と同様に行なτ
ｄ）レセプターＲ３として、ポリクロナーの羊−抗一り
サギーＦｃｒ−抗血清を使用す／記載の方法による代表
的な実験では矢の参が得られる： １）レセプターＲ２として、ＡＦＰと結合性の抗体を使
用した場合の吸光度 ２）レセプターＲ２′として、ＡＦＰと結合性ではない
抗体を使用した場合の吸光度 ６）試料６ａ及び６ｂ中にＡＦＰを添加した後（吸光度
Ａ−吸光度Ｂ）の増加、検量曲線の勾配は試料６ａと６
ｂのΔの平均値から算出した。

例４ ＴＳＨの測定 使用したレセプター及び基質温液は例１からの試薬と同
じであり、ＤＥＡＥ−セルロースを通して通過させるこ
とを含めてそれまでの絹製工程及び標疏付けしたレセプ
ターＲ１浴液の合成も同Ｌｒである。記載したレセプタ
ーを使って、試薬担体を製造する。

試薬担体の製造 １）試薬担体１（ＴＳＨと結合性）：１１当りリン酸ナ
トリウム、−７，３，１００ミリモル、塩化マグネシウ
ム２ミリモル、塩化ナトリウム９ｇ、牛血清アルブミン
５ｇ、マウスからの抗−ＴＳＨ−モノクロナール抗体５
ＩＩＬｔ（レセプターＲ２）、抗−ＴＩＩＩＩＨ−抗体
−（マウス）　−Ｆａｂ−フラグメント−β−がラクト
シダーゼー接合体（レセプターＲ１浴液；活性度は６７
℃でオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−がラクトシトテ
測定）１００ＯＵを含有する溶液４０μｌを市販のポリ
エステル紙より成るフリース上に温顔する。引続いて、
室温で乾燥させる。このフリースは使用するまでは４°
Ｃ及び相対湿度２０％で貯蔵する。

２）試薬担体１’　（ＴＳＨと非結合性）：抗−ＴＳＨ
−抗体（レセプターＲ２）の代りにマウムカラノ抗−〇
ＥＡ−モノクロナール抗体（レセ７’ターＲ２′〕を使
用することを除いては試薬担体１と同様に製造する。

６）試薬担体２ニブロムシアン活性化法（西ドイツ国特
許公開第１７６８５１２号明細Ｖ）によりセルロースフ
リース上に、マウス−抗体のＦａｒ　、部に対する羊抗
体（レセプターＲ５＃液）を固定させ、その際に繊維材
料１！Ｉａり抗体１０μｇを固定に使用する。洗浄して
未結合の抗体を除去しかつフリースを注意深く室温で乾
燥させる。このようにして得られたフリースの貯蔵は試
薬担体１と同様に行なう。

この両方の試薬担体１と２もしくは１′と２による測定
は西ドイツ画特許出願第３４２５００８．５号明細書に
記載されている分析測定を実施するための装置ｔ（第２
図）で行なう。

これは、自動遠心分析装置用の回転子組込み部材を開示
しており、この部材は、それぞれが一定の試薬で含浸さ
れた吸収性担持物質を含有する多数の試薬フィールドと
連結している試料受容室、少なくとも１つの混合弁室及
び測定室を備えた成形体より構成されており、前記構成
部が一緒になって、組込み部材が回転子上に固定されて
おり、かつ組込み部材が東に液体を収容するための他の
室少なくとも１つ及びこの室から測定部に案内しかつ試
料成体搬送路と少なくとも一部が同一である搬送路を備
えている場合には、軸方向で内側から外に向って続いて
いる試料液体搬送路を構成する。その際に、試料液体搬
送路は試料受容室（Ｐ）から、吸収性材料が充填されか
つ緩衝液を含有する室（ａ）、室（Ｃ）及び室（ａ）と
（Ｃ）との間に配置されている第一弁室（ＶＫｌ　）を
介して第二弁室（ＶＫ２）に、かつこの第二弁室から室
（ｄ）及び捕集室（ＡＸ）を介して測定室（ｋ）に設置
されている。他の液体を収容するためにポンプ室として
構成されている基３ｊ室（ＰＫ）が設けられており、こ
の室は配量室（ＤＫ）と毛管（Ｋａｐ）とより成る配量
装置及びオーバーフロー室（Ｕｘ）を介して第二弁室（
ＶＫ２）と連結している。第２図は使用される回転子組
込み部材を略図で示したものである。

吸光度Ａ（試料盲検値を含む特異的な測定シグナル）の
測定には試薬担体１と試薬担体２を使い、吸光度Ｂ（試
料１検値）の測定には試薬担体１′と２４−使う。

試薬担体１もしくは１′は回転子組込み部材のフィール
ドＣに配置し、かつ試薬担体２はフィールドｄに配置す
る。その際に濃試料４０μｌ金上縁部の開口部を通して
直接フィールドａにピペット装入する。基質溶液２７０
μｌは室ＰＫ中にぎペット装入する。高い回転数と停止
とが又互に行なわれる好適な遠心分離プログラムにより
、試料と基！Ｘ浴液は分離マトリックスとキュベツトの
方向に供給される。

その際、プログラムの進行中にレセプターＲ１及びＲ２
もしくはＲ２′は試料液体を通してフィールドＣから浴
離し、かつ引続いて均質な混合物が反応する。フィール
ドｄで、形成された複合体がレセプターＲ３に結合する
。試料のフィールドＣからｄへの搬送は非常に短時間で
行なわれる。

基質浴液は配量罠ＤＫにより少社ずつに分けられ、その
うちの初めのものは過剰の、複合しなかった接合体の洗
浄に使われる。ｄ上での被合体形成を介して結合したβ
−がラクトシダーゼ活性は試料に宮まれる’Ｉ’ＳＨ１
にもしくは試料璽検僅に比例する。この活性度は他の基
質分割分で測定し、その際に基質は５分間の反応で着色
生成物に変換される。形成された色素及び液相中の発色
７分はキュベツト中５７６　ｎｍで測定する。

これらの条件下で次の結果が得られた：測定はすべて５
７６　ｎｍ及び層厚０．６ｃｒｒＬで実施し、層厚ｄ＝
１ｃ＋ｒＬＫｐ算した。

１〕　試薬担体１（ＴＳＨと結合性〕を使った際の吸光
度 ２）＃に薬担体１’　（ＴＳＨとは結合性ではない）を
使った際の吸光度 ６）試料４の中にＴＳＨを添加した後（吸光度へ−吸光
度Ｂ）の増加 ＊　検波 例５ モノクロナール抗−ＡＦＰ−抗体の測定本例は矢の点を
除いて例１に相応する。

１、　レセプターＲ３浴液として手−抗−ウサギ−Ｆｃ
ｒ−抗血清を使用する。

２、　　ＡＦＰと結合性であるレセプターＲ２としてウ
サイー抗−ＡＦＰ−抗血消を使用する。抗体の精製はレ
セプターＲ３と同様に行なう。

３、　　ＡＦＰと結合性ではないレセプターＲ２／とじ
ては非特異的ウサギ血清を使う。抗体の鞘装はレセプタ
ーＲ３と同様に行う。

４、　レセプターＲ１としては、羊−抗−マウス−Ｉｇ
Ｇ−抗体を使用する。抗体はナカネ法［Ｍ、　Ｂ、ウィ
ルソン（Ｗｉｌｓｏｎ　）、Ｐ、　Ｋ、ナカネ共著、”
　Ｒｅｃｅｎｚ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｚｓ　ｉｎ　ｚ
ｈｅＰｅｘｉｏｄａｚｅ　Ｍｅｚｈｏｄ　ｏｆ　Ｃｏｎ
ｊｕｇａｚｉｎｇ　。

Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏ
　Ａｎｚｉｂｏｄｉｅｓ　’（１９７８年）、Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ＊　Ｎｏｒｔｈ　ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　”　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｍｃｅａｎｄ　ＲｅＬａｚｅｄ　Ｓｚａｉｎｉ
ｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”甲の２Ｉｇ〜２２４頁〕
により西洋ワサビからのペルオキシダーゼと結合させる
。抗体−酵素一接合体を緩衝ｇＢ中で濃度８０Ｕ／Ｊ（
基質としてグアセコールとＨ２Ｏ２を用いて２５℃で測
定）に幽節する。

５、例１に相応してレセプターＲ２もしくはＲ２′を含
む微量滴定板の恒温保持及び洗浄後に、それぞれの凹部
を緩衝液■中のＡＦＰ　１２．５　ＩＵ／ｒｌＬｔの浴
液２００μｌ　と１時間恒温保持する。

引続いてｎ　１７液１１３００μノで２回洗浄する。

３、抗体含有試料浴液の恒温保持は１時間である。

ｚ　Ｍ４識レセプターＲ１浴液との恒温保持は１時間で
ある。

８、　指示溶液として次のものを使う：ＡＢＴ８（Ｒ）
（２、２’−アゾノージー〔６−ニチルベンゾチアゾリ
ウムスルホネート（６）　）　）　１．８ミリモル ホスフエート／シトレート−緩衝液、−４，４，１００
Ｎ中の過ホウ素ナトリウム６．６ミリモル 恒温保持は１時間である。形成色素の測定は光度計を基
ＪＸ盲検僅に対して一製した後で４０５ｎｍで行なう。

記載の方法による代表的な実験では、緩伽液用済液に種
々の抗体を変化する６度で加えた。

次の結果が得られた：

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イムノアツセイの原理により免疫反応の反応成分を
   測定する際に、測定すべき反応成分を標識付けした特異
   的レセプターＲ＿１及び少なくとも１種の未標識のレセ
   プターＲ＿２と接触させ、かつその際に未標識のレセプ
   ター Ｒ＿２の１種が結合性物質Ｒ＿３を介して固相に結合し
   ているその測定法において、試料盲検値の測定に当つて
   は、固相に固定されているレセプターにより結合される
   未標識のレセプターＲ＿２を、Ｒ＿２の他方の反応成分
   と反応しない他の未標識レセプターＲ＿２′により代え
   ることを特徴とする、免疫反応の反応成分を測定するた
   めの方法。 ２、未標識のレセプターＲ＿２は測定すべき反応成分か
   又はレセプターＲ＿１とのその複合体に対して作用する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、結合性物質Ｒ＿３としては、Ｒ＿１と結合しない抗
   −Ｉｇ−抗体を使用する特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の方法。 ４、レセプターＲ＿２及びＲ＿２′はモノクロナールで
   ありかつ同じサブクラスに属する特許請求の範囲第１項
   から第３項までのいずれか１項記載の方法。 ５、レセプターＲ＿２及びＲ＿２′としてはハプテン化
   した抗体を使いかつ結合性物質Ｒ＿３としてはハプテン
   に対して作用する抗体を使う特許請求の範囲第１項から
   第４項までのいずれか１項記載の方法。 ６、固相に結合している結合性物質Ｒ＿３、Ｒ＿３及び
   他の反応成分と結合法の未標識のレセプターＲ＿２少な
   くとも１種及び標識付けした特異的なレセプターＲ＿１
   を含有し、かつ物理的にそれとは別個に固相に結合して
   いる結合性物質Ｒ＿３、Ｒ＿２の他方の反応成分とは反
   応しない未標識のレセプターＲ＿２′及び標識付けした
   特異的なレセプターＲ＿１を更に含有することを特徴と
   する、免疫反応の反応成分を測定するための試薬。 ７、レセプターＲ＿２もしくはＲ＿２′は抗−Ｉｇ−抗
   体を介して固相に結合して存在する特許請求の範囲第６
   項記載の試薬。 ８、レセプターＲ＿２もしくはＲ＿２′はハプテン化さ
   れておりかつこのハプテンに対して作用する抗体を介し
   て固相に結合している特許請求の範囲第６項記載の試薬
   。