JPH0627109A - 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット - Google Patents
免疫測定法及び免疫測定用試薬キットInfo
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- JPH0627109A JPH0627109A JP4084595A JP8459592A JPH0627109A JP H0627109 A JPH0627109 A JP H0627109A JP 4084595 A JP4084595 A JP 4084595A JP 8459592 A JP8459592 A JP 8459592A JP H0627109 A JPH0627109 A JP H0627109A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 より高感度で、正確な測定が可能な免疫測定
法を提供する。 【構成】 測定しようとする物質に、結合性物質を結合
した水不溶化担体、１重鎖の遺伝子を結合した結合性物
質、及び前記遺伝子に対して相補的な塩基配列を持つ１
重鎖の遺伝子と標識物質の複合体、を反応させて生成す
る免疫複合体中の標識量を測定する免疫測定法。
法を提供する。 【構成】 測定しようとする物質に、結合性物質を結合
した水不溶化担体、１重鎖の遺伝子を結合した結合性物
質、及び前記遺伝子に対して相補的な塩基配列を持つ１
重鎖の遺伝子と標識物質の複合体、を反応させて生成す
る免疫複合体中の標識量を測定する免疫測定法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法および免疫
測定用試薬に関する。更に詳しくは、ヘテロジニアスな
免疫測定法および免疫測定用試薬キットに関する。
測定用試薬に関する。更に詳しくは、ヘテロジニアスな
免疫測定法および免疫測定用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ヘテロジニアスなサンドイッチ免
疫測定法においては、測定しようとする物質（以下
「測定物質」という。）に、「測定物質」に対する抗体
もしくは抗原を水不溶性担体に結合した物、及び標識さ
れた、「測定物質」に対する抗体もしくは抗原を反応さ
せて免疫複合体を生成する方法を用いてきた。更に、
「測定物質」に、「測定物質」に対する抗体（動物種Ａ
が産生したもの）を水不溶性担体に結合した物、「測定
物質」に対する抗体（動物種Ｂが産生したもの）、及び
標識された、動物種Ｂの産生した抗体に対する抗体を反
応させて免疫複合体を生成する方法［例えば、WO 80/02
747，EP-119736など、及びシ゛ャーナル オフ゛ ヒストケムサイトケム,８
巻,1131頁,1979年発行（GUESDON,J.L.,TERNYNCK,T.,and
AVRAMEAS,S.:J.Histochem.Cytochem.,8:1131,1979）な
ど］；「標識物質」に、「測定物質」に対する抗体を
水不溶性担体に結合した物、ビオチンと「測定物質」に
対する抗体の結合体、及び標識されたアビジンを反応さ
せ免疫複合体を生成する方法などが知られている。ヘテ
ロジニアスな競合免疫測定法においても、標識される物
質を「測定物質」と同じ免疫反応特性を有する物質にす
ることで、サンドイッチ免疫測定法と同様な測定法が可
能である。
疫測定法においては、測定しようとする物質（以下
「測定物質」という。）に、「測定物質」に対する抗体
もしくは抗原を水不溶性担体に結合した物、及び標識さ
れた、「測定物質」に対する抗体もしくは抗原を反応さ
せて免疫複合体を生成する方法を用いてきた。更に、
「測定物質」に、「測定物質」に対する抗体（動物種Ａ
が産生したもの）を水不溶性担体に結合した物、「測定
物質」に対する抗体（動物種Ｂが産生したもの）、及び
標識された、動物種Ｂの産生した抗体に対する抗体を反
応させて免疫複合体を生成する方法［例えば、WO 80/02
747，EP-119736など、及びシ゛ャーナル オフ゛ ヒストケムサイトケム,８
巻,1131頁,1979年発行（GUESDON,J.L.,TERNYNCK,T.,and
AVRAMEAS,S.:J.Histochem.Cytochem.,8:1131,1979）な
ど］；「標識物質」に、「測定物質」に対する抗体を
水不溶性担体に結合した物、ビオチンと「測定物質」に
対する抗体の結合体、及び標識されたアビジンを反応さ
せ免疫複合体を生成する方法などが知られている。ヘテ
ロジニアスな競合免疫測定法においても、標識される物
質を「測定物質」と同じ免疫反応特性を有する物質にす
ることで、サンドイッチ免疫測定法と同様な測定法が可
能である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】近年、免疫測定法にお
いては、更に感度を向上させる要求が高まっているが、
上記の方法では、免疫複合体中の標識量を増すことは
難しいため、更に高感度な測定とすることは難しい。ま
た、上記の方法では、動物種間の交差反応の無い抗体
を使用する必要が有り、また、血清検体中に抗体に干渉
する物質が存在する場合、測定値が異常を示すことがあ
る。上記の方法は、免疫複合体中の標識量を増すこと
ができるが、非特異的な吸着も大きく、結果的に高感度
な測定とならない。
いては、更に感度を向上させる要求が高まっているが、
上記の方法では、免疫複合体中の標識量を増すことは
難しいため、更に高感度な測定とすることは難しい。ま
た、上記の方法では、動物種間の交差反応の無い抗体
を使用する必要が有り、また、血清検体中に抗体に干渉
する物質が存在する場合、測定値が異常を示すことがあ
る。上記の方法は、免疫複合体中の標識量を増すこと
ができるが、非特異的な吸着も大きく、結果的に高感度
な測定とならない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、塩基配列が相補的な関
係のある２種類の１重鎖核酸を用い、内１種類は標識さ
せる方法を利用した免疫測定法により更に感度が上昇す
ることを見いだし、本発明に到達した。すなわち本発明
は、下記の測定法およびの測定用試薬キットにより
構成される。 ：測定しようとする物質（以下「測定物質」とい
う。）に、下記「固定化物質」、下記「第１核酸結合
体」及び下記「標識第２核酸」を反応させて生成する免
疫複合体（Ａ）中あるいは未反応の「標識第２核酸」中
の標識量を測定することを特徴とする免疫測定法。 固定化物質：「測定物質」と特異的な結合性を有する物
質（以下「結合性物質」という。）と水不溶性担体との
結合体。 第１核酸結合体：「結合性物質」、あるいは「測定物
質」と同じ免疫反応特性を有する物質と、１重鎖のデオ
キシリボ核酸またはリボ核酸（以下「第１核酸」とい
う。）との結合体。 標識第２核酸：「第１核酸」と相補的な塩基配列を有す
る１重鎖のデオキシリボ核酸またはリボ核酸（以下「第
２核酸」という。）に、標識剤を結合させた物質。 ：上記記載の、「固定化物質」、「第１核酸結合
体」および「標識第２核酸」を構成品として含む免疫測
定用試薬キット。
解決するため鋭意検討した結果、塩基配列が相補的な関
係のある２種類の１重鎖核酸を用い、内１種類は標識さ
せる方法を利用した免疫測定法により更に感度が上昇す
ることを見いだし、本発明に到達した。すなわち本発明
は、下記の測定法およびの測定用試薬キットにより
構成される。 ：測定しようとする物質（以下「測定物質」とい
う。）に、下記「固定化物質」、下記「第１核酸結合
体」及び下記「標識第２核酸」を反応させて生成する免
疫複合体（Ａ）中あるいは未反応の「標識第２核酸」中
の標識量を測定することを特徴とする免疫測定法。 固定化物質：「測定物質」と特異的な結合性を有する物
質（以下「結合性物質」という。）と水不溶性担体との
結合体。 第１核酸結合体：「結合性物質」、あるいは「測定物
質」と同じ免疫反応特性を有する物質と、１重鎖のデオ
キシリボ核酸またはリボ核酸（以下「第１核酸」とい
う。）との結合体。 標識第２核酸：「第１核酸」と相補的な塩基配列を有す
る１重鎖のデオキシリボ核酸またはリボ核酸（以下「第
２核酸」という。）に、標識剤を結合させた物質。 ：上記記載の、「固定化物質」、「第１核酸結合
体」および「標識第２核酸」を構成品として含む免疫測
定用試薬キット。
【０００５】本発明において、「測定物質」としては、
免疫測定法が利用できる物であれば特に限定は無い。例
えば、ハプテン（ジゴキシン、サイロキシン、トリヨー
ドサイロニン、コルチゾールなど）、ホルモン（甲状腺
刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、インスリン、成長ホ
ルモンなど）、血清タンパク質（免疫グロブリン、Ｃ−
反応性蛋白など）、腫瘍関連抗原（α−フェトプロテイ
ン、癌胎児性抗原、胎児性フェリチンなど）、ウイルス
及びウイルス関連抗原（風疹ウイルス、ヘルペスウイル
ス、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原など）などがあげられる。
免疫測定法が利用できる物であれば特に限定は無い。例
えば、ハプテン（ジゴキシン、サイロキシン、トリヨー
ドサイロニン、コルチゾールなど）、ホルモン（甲状腺
刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、インスリン、成長ホ
ルモンなど）、血清タンパク質（免疫グロブリン、Ｃ−
反応性蛋白など）、腫瘍関連抗原（α−フェトプロテイ
ン、癌胎児性抗原、胎児性フェリチンなど）、ウイルス
及びウイルス関連抗原（風疹ウイルス、ヘルペスウイル
ス、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原など）などがあげられる。
【０００６】「固定化物質」における該水不溶性担体と
しては、例えば、ケイ酸無機担体（ガラス、シリカゲル
など）、および有機担体（プラスチック、ニトロセルロ
ース、デキストランなど）があげられる。表面にアミノ
基、チオール基、カルボキシル基、活性エステル基など
の官能基をもつものが、「結合性物質」と結合させ易い
ため好ましい。また、その形状は、粒子状、シート状、
チューブ状などいずれの形もとりうるが、より好ましい
例としては、粒径０．１〜５０μｍ程度の微粒子状であ
る。
しては、例えば、ケイ酸無機担体（ガラス、シリカゲル
など）、および有機担体（プラスチック、ニトロセルロ
ース、デキストランなど）があげられる。表面にアミノ
基、チオール基、カルボキシル基、活性エステル基など
の官能基をもつものが、「結合性物質」と結合させ易い
ため好ましい。また、その形状は、粒子状、シート状、
チューブ状などいずれの形もとりうるが、より好ましい
例としては、粒径０．１〜５０μｍ程度の微粒子状であ
る。
【０００７】本発明において用いられる「第１核酸」と
「第２核酸」は、共にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もし
くはリボ核酸（ＲＮＡ）から選ばれる、１重鎖の核酸で
あり、塩基配列が相補的な関係にある。従って、「第１
核酸」と「第２核酸」はハイブリダイズすることが可能
である。「第１核酸」と「第２核酸」は相補的な配列で
あればどの様な１重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡも用いるこ
とが可能であるが、分子内でループ構造の生じない塩基
配列が良い。好ましい例として、「第１核酸」を構成す
るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの
単位の種類が、１種類であるものがあげられる。この単
位としては、アデニル酸、ウリジル酸、グアニル酸、シ
チジル酸、デオキシチミジル酸、デオキシアデニル酸、
デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸があげられ、
従って、これらから１種類が選ばれたものが好ましい。
また、１種類のヌクレオチド単位から構成される「第１
核酸」に対して、「第２核酸」は、「第１核酸」の任意
の部分で対応結合できるメリットがある。なお、「第２
核酸」の塩基配列は、「第１核酸」の塩基配列に対応し
て相補的に決まる。
「第２核酸」は、共にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もし
くはリボ核酸（ＲＮＡ）から選ばれる、１重鎖の核酸で
あり、塩基配列が相補的な関係にある。従って、「第１
核酸」と「第２核酸」はハイブリダイズすることが可能
である。「第１核酸」と「第２核酸」は相補的な配列で
あればどの様な１重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡも用いるこ
とが可能であるが、分子内でループ構造の生じない塩基
配列が良い。好ましい例として、「第１核酸」を構成す
るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの
単位の種類が、１種類であるものがあげられる。この単
位としては、アデニル酸、ウリジル酸、グアニル酸、シ
チジル酸、デオキシチミジル酸、デオキシアデニル酸、
デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸があげられ、
従って、これらから１種類が選ばれたものが好ましい。
また、１種類のヌクレオチド単位から構成される「第１
核酸」に対して、「第２核酸」は、「第１核酸」の任意
の部分で対応結合できるメリットがある。なお、「第２
核酸」の塩基配列は、「第１核酸」の塩基配列に対応し
て相補的に決まる。
【０００８】「第１核酸」、「第２核酸」を構成するリ
ボヌクレオチド単位あるいはデオキシリボヌクレオチド
単位の個数は、１０から１,０００の範囲が良い。１０
より少ない場合、ハイブリダイズの結合力が低く、１,
０００を越える場合、分子量が大きすぎるため反応性が
低下し好ましくない。
ボヌクレオチド単位あるいはデオキシリボヌクレオチド
単位の個数は、１０から１,０００の範囲が良い。１０
より少ない場合、ハイブリダイズの結合力が低く、１,
０００を越える場合、分子量が大きすぎるため反応性が
低下し好ましくない。
【０００９】また、「第２核酸」は「第１核酸」の１部
分のみに対応する１重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡでも良
い、すなわち「第１核酸」より短い核酸を使用すること
ができる。従って１分子の「第１核酸」に複数の「第２
核酸」が結合することができる利点がある。特に好まし
くは、「第１核酸」が１種類のヌクレオチドから構成さ
れた核酸である場合であり、より短い「第２核酸」は、
「第１核酸」の任意の部分に結合できるため、効率的に
多くの分子が「第１核酸」に結合することができる。即
ち、「第１核酸結合体」上に「標識第２核酸」をより多
く結合した形で、該免疫複合体（Ａ）が生成されるた
め、測定感度を向上することになる。好ましい、「第２
核酸」の鎖長は、「第１核酸」の１／１００〜１／２の
範囲内にある鎖長である。
分のみに対応する１重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡでも良
い、すなわち「第１核酸」より短い核酸を使用すること
ができる。従って１分子の「第１核酸」に複数の「第２
核酸」が結合することができる利点がある。特に好まし
くは、「第１核酸」が１種類のヌクレオチドから構成さ
れた核酸である場合であり、より短い「第２核酸」は、
「第１核酸」の任意の部分に結合できるため、効率的に
多くの分子が「第１核酸」に結合することができる。即
ち、「第１核酸結合体」上に「標識第２核酸」をより多
く結合した形で、該免疫複合体（Ａ）が生成されるた
め、測定感度を向上することになる。好ましい、「第２
核酸」の鎖長は、「第１核酸」の１／１００〜１／２の
範囲内にある鎖長である。
【００１０】「第１核酸」及び「第２核酸」は、従来既
知の方法で合成あるいは生体より抽出して使用できる。
好ましいものは、合成法により作成された核酸で、その
末端にアミノ基などの官能基を導入されたものである。
導入された官能基は、「結合性物質」あるいは「測定物
質」と同じ免疫反応特性を有する物質、および標識剤と
の結合に便利である。
知の方法で合成あるいは生体より抽出して使用できる。
好ましいものは、合成法により作成された核酸で、その
末端にアミノ基などの官能基を導入されたものである。
導入された官能基は、「結合性物質」あるいは「測定物
質」と同じ免疫反応特性を有する物質、および標識剤と
の結合に便利である。
【００１１】「固定化物質」は、従来既知の方法で行う
ことができる。例えば、ポリスチレン担体にタンパク質
を物理吸着する方法、水不溶性担体の表面の官能基に
「結合性物質」のもつアミノ基などを共有結合する方法
がある。結合の後、担体の表面及び表面の未反応官能基
を適当なタンパク質、核酸、界面活性剤などでブロッキ
ングすることも通常行われる。
ことができる。例えば、ポリスチレン担体にタンパク質
を物理吸着する方法、水不溶性担体の表面の官能基に
「結合性物質」のもつアミノ基などを共有結合する方法
がある。結合の後、担体の表面及び表面の未反応官能基
を適当なタンパク質、核酸、界面活性剤などでブロッキ
ングすることも通常行われる。
【００１２】「結合性物質」としては、「測定物質」に
対し特異的な結合性を有するものであり、抗体、抗原、
レクチン、プロテインＡなどがあげられるが、「測定物
質」に対応できる範囲で自由に選択することが可能であ
る。さらに「固定化物質」と「第１核酸結合体」に用い
られる、「結合性物質」は、必ずしもおなじ物質である
必要はない。「結合性物質」の好ましい例としては、
「測定物質」に対するモノクローナル抗体があげられ
る。この場合、「固定化物質」と「第１核酸結合体」に
各々用いられモノクローナル抗体は、「測定物質」に対
する認識部位が各々異なる抗体であればさらに良い。
対し特異的な結合性を有するものであり、抗体、抗原、
レクチン、プロテインＡなどがあげられるが、「測定物
質」に対応できる範囲で自由に選択することが可能であ
る。さらに「固定化物質」と「第１核酸結合体」に用い
られる、「結合性物質」は、必ずしもおなじ物質である
必要はない。「結合性物質」の好ましい例としては、
「測定物質」に対するモノクローナル抗体があげられ
る。この場合、「固定化物質」と「第１核酸結合体」に
各々用いられモノクローナル抗体は、「測定物質」に対
する認識部位が各々異なる抗体であればさらに良い。
【００１３】「測定物質」と同じ免疫反応特性を有する
物質としては、「測定物質」と同一の物質、「測定物
質」の断片で、「測定物質」の免疫反応特性を有するも
の、「測定物質」と「結合性物質」との反応に関与しな
い物質と、「測定物質」との複合体などがあげられる。
物質としては、「測定物質」と同一の物質、「測定物
質」の断片で、「測定物質」の免疫反応特性を有するも
の、「測定物質」と「結合性物質」との反応に関与しな
い物質と、「測定物質」との複合体などがあげられる。
【００１４】「第１核酸結合体」である、「結合性物
質」、あるいは「測定物質」と同じ免疫反応特性を有す
る物質と「第１核酸」の結合体は、従来知られている蛋
白分子の架橋結合法を使用して作成できる。例えば、
「結合性物質」にチオール基を導入し、「第１核酸」に
導入されたアミノ基との間を２架橋性試薬で結合するこ
とにより「第１核酸結合体」ができる。
質」、あるいは「測定物質」と同じ免疫反応特性を有す
る物質と「第１核酸」の結合体は、従来知られている蛋
白分子の架橋結合法を使用して作成できる。例えば、
「結合性物質」にチオール基を導入し、「第１核酸」に
導入されたアミノ基との間を２架橋性試薬で結合するこ
とにより「第１核酸結合体」ができる。
【００１５】「第１核酸結合体」が、「結合性物質」と
「第１核酸」を結合させた物質である場合、本発明の方
法は、サンドイッチ免疫測定法の原理にもとづく方法で
ある。また、「第１核酸結合体」が、「測定物質」と同
じ免疫反応特性を有する物質と、「第１核酸」を結合さ
せた物質である場合、本発明の方法は、競合免疫測定に
もとづく方法である。
「第１核酸」を結合させた物質である場合、本発明の方
法は、サンドイッチ免疫測定法の原理にもとづく方法で
ある。また、「第１核酸結合体」が、「測定物質」と同
じ免疫反応特性を有する物質と、「第１核酸」を結合さ
せた物質である場合、本発明の方法は、競合免疫測定に
もとづく方法である。
【００１６】「標識第２核酸」に用いられる標識する物
質（標識剤）としては、例えば、アイソトープ、酵素、
蛍光体および発光体があげられる。これらはいずれも公
知のものを使用することができる。例えば、アイソトー
プとしては、125Ｉなど、酵素としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼなど、蛍光体としてはユーロピウム誘導体な
ど、発光体としては、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体な
どがあげられる。
質（標識剤）としては、例えば、アイソトープ、酵素、
蛍光体および発光体があげられる。これらはいずれも公
知のものを使用することができる。例えば、アイソトー
プとしては、125Ｉなど、酵素としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼなど、蛍光体としてはユーロピウム誘導体な
ど、発光体としては、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体な
どがあげられる。
【００１７】「標識第２核酸」の作成は、上記いずれの
タイプも、従来公知のタンパク質と標識剤の結合方法を
応用して行うことができる。例えば、酵素により標識す
る方法としては、ナカネ等、ジェー．ヒストケム．サイ
トケム．，２２；１０８４，１９７４に記載の方法など
があげられる。蛍光体により標識する方法としては、ア
イ．ヘミラ，エス．ダブク，エトール．；アナル．バイ
オケム．，１３７：３３５，１９８４記載の方法などが
あげられる。発光体により標識する方法としては、エ
イ．ウッドヘッド，アイ．ウイークス；クリン．ケ
ム．，２９：１４８０，１９８３記載の方法などがあげ
られる。
タイプも、従来公知のタンパク質と標識剤の結合方法を
応用して行うことができる。例えば、酵素により標識す
る方法としては、ナカネ等、ジェー．ヒストケム．サイ
トケム．，２２；１０８４，１９７４に記載の方法など
があげられる。蛍光体により標識する方法としては、ア
イ．ヘミラ，エス．ダブク，エトール．；アナル．バイ
オケム．，１３７：３３５，１９８４記載の方法などが
あげられる。発光体により標識する方法としては、エ
イ．ウッドヘッド，アイ．ウイークス；クリン．ケ
ム．，２９：１４８０，１９８３記載の方法などがあげ
られる。
【００１８】本発明における、反応の順序および条件に
ついて以下に述べる。反応の順序としては、種々の順が
とりうるが、好ましい例として、「測定物質」に「第
１核酸結合体」及び「固定化物質」を逐次あるいは同時
に反応させた後、更に「標識第２核酸」を反応させるこ
とにより該免疫複合体（Ａ）を得る；「測定物質」に
「固定化物質」を反応させた後、更に「第１核酸結合
体」および「標識第２核酸」を逐次あるいは同時に反応
させることにより該免疫複合体（Ａ）を得る；「測定
物質」に、「固定化物質」と「第１核酸結合体」および
「標識第２核酸」を同時に反応させることにより該免疫
複合体（Ａ）を得る；「測定物質」に「第１核酸結合
体」および「標識第２核酸」を逐次あるいは同時に反応
さた後、更に「固定化物質」を反応せる；などがある。
各反応における構成成分の投入順序、未反応物の除去な
どは、適宜行うことができる。
ついて以下に述べる。反応の順序としては、種々の順が
とりうるが、好ましい例として、「測定物質」に「第
１核酸結合体」及び「固定化物質」を逐次あるいは同時
に反応させた後、更に「標識第２核酸」を反応させるこ
とにより該免疫複合体（Ａ）を得る；「測定物質」に
「固定化物質」を反応させた後、更に「第１核酸結合
体」および「標識第２核酸」を逐次あるいは同時に反応
させることにより該免疫複合体（Ａ）を得る；「測定
物質」に、「固定化物質」と「第１核酸結合体」および
「標識第２核酸」を同時に反応させることにより該免疫
複合体（Ａ）を得る；「測定物質」に「第１核酸結合
体」および「標識第２核酸」を逐次あるいは同時に反応
さた後、更に「固定化物質」を反応せる；などがある。
各反応における構成成分の投入順序、未反応物の除去な
どは、適宜行うことができる。
【００１９】反応を行う温度、各反応を行う溶液の組
成、ｐＨなどは、通常免疫測定及びハイブリダイゼイシ
ョンアッセイで行われる条件で可能である。例えば、温
度としては、５〜６０℃、ｐＨとしては５〜９が好まし
く、反応を行う溶液は、適当な緩衝液に塩類、タンパク
質、界面活性剤などを必要により添加した物が好まし
い。
成、ｐＨなどは、通常免疫測定及びハイブリダイゼイシ
ョンアッセイで行われる条件で可能である。例えば、温
度としては、５〜６０℃、ｐＨとしては５〜９が好まし
く、反応を行う溶液は、適当な緩衝液に塩類、タンパク
質、界面活性剤などを必要により添加した物が好まし
い。
【００２０】反応の結果、生成する免疫複合体（Ａ）中
に、「測定物質」の量におうじて標識剤が存在すること
になる。未反応物を除去した後、標識剤の量を測定する
こと、または未反応物中の標識剤量を測定することで、
「測定物質」の量を決定することが可能である。標識剤
の量の測定は、標識剤の種類と共に種々の方法をとりう
るが、いずれも当業者により自由に選択できるものであ
る。測定された標識量を、既知量の「測定物質」を測定
した場合の標識量と比較することにより、検体中の測定
物質量を決定できる。
に、「測定物質」の量におうじて標識剤が存在すること
になる。未反応物を除去した後、標識剤の量を測定する
こと、または未反応物中の標識剤量を測定することで、
「測定物質」の量を決定することが可能である。標識剤
の量の測定は、標識剤の種類と共に種々の方法をとりう
るが、いずれも当業者により自由に選択できるものであ
る。測定された標識量を、既知量の「測定物質」を測定
した場合の標識量と比較することにより、検体中の測定
物質量を決定できる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。
が本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】実施例１ この実施例は、本発明によるα−フェトプロテイン（Ａ
ＦＰ）の測定を、長さの異なる合成ＤＮＡを用い行った
ものである。
ＦＰ）の測定を、長さの異なる合成ＤＮＡを用い行った
ものである。
【００２３】１）ポリデオキシアデニル酸、及びポリデ
オキシチミジル酸の合成 自動ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズジャパ
ン（株）製、モデル３９２）を用いて、装置添付の使用
法にもとずき、ヌクレオチド数１０、５０、１００のポ
リデオキシアデニル酸を各々合成し、更に５´末端にア
ミノヘキシルリンカー（アプライドバイオシステムズジ
ャパン（株）製、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ２）によりアミノ
基を導入した。合成した各々の鎖長のアミノ基導入ポリ
デオキシアデニル酸は、カラムで精製した後、蒸留水に
溶解し次の操作に用いた。同様にヌクレオチド数１０、
５０、１００のアミノ基導入ポリデオキシチミジル酸を
合成した。
オキシチミジル酸の合成 自動ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズジャパ
ン（株）製、モデル３９２）を用いて、装置添付の使用
法にもとずき、ヌクレオチド数１０、５０、１００のポ
リデオキシアデニル酸を各々合成し、更に５´末端にア
ミノヘキシルリンカー（アプライドバイオシステムズジ
ャパン（株）製、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ２）によりアミノ
基を導入した。合成した各々の鎖長のアミノ基導入ポリ
デオキシアデニル酸は、カラムで精製した後、蒸留水に
溶解し次の操作に用いた。同様にヌクレオチド数１０、
５０、１００のアミノ基導入ポリデオキシチミジル酸を
合成した。
【００２４】２）ポリデオキシアデニル酸結合抗体の作
成 抗ＡＦＰ抗体（ダコ社製）から、イー．イシカワ，エ
ム．イマガワ，エトール．，ジェー．イムノアッセイ，
４；２０９，１９８３記載の方法でＦａｂ´抗体を作成
した。１）で合成した各々の鎖長のアミノ基導入ポリデ
オキシアデニル酸溶液（核酸量１ｍｇ）とＦａｂ´抗体
（１０ｍｇ）をリン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．
０、１ｍＭのＥＤＴＡ含有）２ｍｌ中で混合融解し、１
０μｌのジメチルホルムアミドに溶解した２架橋性試薬
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド
（ＧＭＢＳ；同仁化学製）０．２ｍｇを添加し、３０℃
で２時間反応した。リン酸緩衝液で透析し、未反応ＧＭ
ＢＳを除去し、ポリデオキシアデニル酸結合抗ＡＦＰ抗
体とした。４℃で保存し、使用時、０．１％牛血清アル
ブミン含有リン酸緩衝液で希釈して用いた。
成 抗ＡＦＰ抗体（ダコ社製）から、イー．イシカワ，エ
ム．イマガワ，エトール．，ジェー．イムノアッセイ，
４；２０９，１９８３記載の方法でＦａｂ´抗体を作成
した。１）で合成した各々の鎖長のアミノ基導入ポリデ
オキシアデニル酸溶液（核酸量１ｍｇ）とＦａｂ´抗体
（１０ｍｇ）をリン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．
０、１ｍＭのＥＤＴＡ含有）２ｍｌ中で混合融解し、１
０μｌのジメチルホルムアミドに溶解した２架橋性試薬
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド
（ＧＭＢＳ；同仁化学製）０．２ｍｇを添加し、３０℃
で２時間反応した。リン酸緩衝液で透析し、未反応ＧＭ
ＢＳを除去し、ポリデオキシアデニル酸結合抗ＡＦＰ抗
体とした。４℃で保存し、使用時、０．１％牛血清アル
ブミン含有リン酸緩衝液で希釈して用いた。
【００２５】３）抗ＡＦＰ抗体結合微粒子の作成 表面に活性エステル基を有するコポリマー粒子（国産化
学（株）製、ＡＳＵコポリマー；平均粒子径１μｍ）１
０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（０．０２モル、ｐＨ
７．２）で２回洗浄遠心し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液
に懸濁した。抗ＡＦＰ抗体（ダコ社製）１ｍｇを微粒子
懸濁液に加え、室温で８時間反応した。０．１％牛血清
アルブミン含有リン酸緩衝液で２回洗浄したのち、０．
１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁
し、使用するまで４℃で保存した。
学（株）製、ＡＳＵコポリマー；平均粒子径１μｍ）１
０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（０．０２モル、ｐＨ
７．２）で２回洗浄遠心し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液
に懸濁した。抗ＡＦＰ抗体（ダコ社製）１ｍｇを微粒子
懸濁液に加え、室温で８時間反応した。０．１％牛血清
アルブミン含有リン酸緩衝液で２回洗浄したのち、０．
１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁
し、使用するまで４℃で保存した。
【００２６】４）ポリデオキシチミジル酸結合ペルオキ
シダーゼの作成 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製）１ｍｇをリ
ン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有）１ｍｌ中で融解し、０．１ｍｇの２−イミノチ
オラン塩酸塩を添加し３７℃、３０分反応した。反応液
をゲル濾過カラムにかけ未反応の２−イミノチオランを
除き、チオール基導入ペルオキシダーゼとした。
シダーゼの作成 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製）１ｍｇをリ
ン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有）１ｍｌ中で融解し、０．１ｍｇの２−イミノチ
オラン塩酸塩を添加し３７℃、３０分反応した。反応液
をゲル濾過カラムにかけ未反応の２−イミノチオランを
除き、チオール基導入ペルオキシダーゼとした。
【００２７】アミノ基導入ポリデオキシチミジル酸溶液
に、ジメチルホルムアミドに溶解した２架橋性試薬Ｎ−
（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（Ｇ
ＭＢＳ；同仁化学製）０．２ｍｇを添加し、３０℃で２
時間反応した。リン酸緩衝液で透析し、未反応ＧＭＢＳ
を除去した。チオール基導入ペルオキシダーゼ溶液を加
え、４℃、８時間反応し、ポリチミジル酸結合ペルオキ
シダーゼとした。４℃で保存し、使用時、０．１％牛血
清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈して用いた。
に、ジメチルホルムアミドに溶解した２架橋性試薬Ｎ−
（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（Ｇ
ＭＢＳ；同仁化学製）０．２ｍｇを添加し、３０℃で２
時間反応した。リン酸緩衝液で透析し、未反応ＧＭＢＳ
を除去した。チオール基導入ペルオキシダーゼ溶液を加
え、４℃、８時間反応し、ポリチミジル酸結合ペルオキ
シダーゼとした。４℃で保存し、使用時、０．１％牛血
清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈して用いた。
【００２８】５）測定操作 血清検体５０μｌと希釈したポリデオキシアデニル酸結
合抗ＡＦＰ抗体５０μｌ及び抗ＡＦＰ抗体結合微粒子懸
濁液５μｌを試験管中で３７℃、１５分反応した後、蒸
留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清をすて、
希釈したポリデオキシチミジル酸結合ペルオキシダーゼ
溶液１００μｌを加え、粒子を再懸濁し３７℃、１５分
反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心し
た。上清をすて、基質液（過酸化水素含有O−フェニレ
ンジアミン溶液）０．５ｍｌをくわえ粒子を再懸濁し３
７℃、１５分反応した。遠心し上清の吸光度を４９２ｎ
ｍで測定した。既知濃度のＡＦＰを含む標準溶液を同様
に測定し作成した検量線から、検体中のＡＦＰ濃度を読
み取った。標準溶液は市販ＡＦＰ測定キット「グラザイ
ムＡＦＰ−ＥＩＡ ＴＥＳＴ」（和光純薬より発売）の
ものを使用した。
合抗ＡＦＰ抗体５０μｌ及び抗ＡＦＰ抗体結合微粒子懸
濁液５μｌを試験管中で３７℃、１５分反応した後、蒸
留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清をすて、
希釈したポリデオキシチミジル酸結合ペルオキシダーゼ
溶液１００μｌを加え、粒子を再懸濁し３７℃、１５分
反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心し
た。上清をすて、基質液（過酸化水素含有O−フェニレ
ンジアミン溶液）０．５ｍｌをくわえ粒子を再懸濁し３
７℃、１５分反応した。遠心し上清の吸光度を４９２ｎ
ｍで測定した。既知濃度のＡＦＰを含む標準溶液を同様
に測定し作成した検量線から、検体中のＡＦＰ濃度を読
み取った。標準溶液は市販ＡＦＰ測定キット「グラザイ
ムＡＦＰ−ＥＩＡ ＴＥＳＴ」（和光純薬より発売）の
ものを使用した。
【００２９】６）測定結果 ヌクレオチド数の異なる、ポリデオキシアデニル酸結合
抗ＡＦＰ抗体とポリデオキシチミジル酸結合ペルオキシ
ダーゼを各々組み合わせて標準ＡＦＰを測定した結果を
表１に示した。抗体に結合した核酸の鎖長が短い場合、
やや感度が低いが、抗体に結合した核酸の鎖長に対し
て、標識の結合した核酸の短い場合、感度の向上が認め
られる。
抗ＡＦＰ抗体とポリデオキシチミジル酸結合ペルオキシ
ダーゼを各々組み合わせて標準ＡＦＰを測定した結果を
表１に示した。抗体に結合した核酸の鎖長が短い場合、
やや感度が低いが、抗体に結合した核酸の鎖長に対し
て、標識の結合した核酸の短い場合、感度の向上が認め
られる。
【００３０】
【表１】
【００３１】正常人及び肝癌患者の血清検体をヌクレオ
チド数１００と１０の組合せで測定した結果を表２に示
した。
チド数１００と１０の組合せで測定した結果を表２に示
した。
【００３２】
【表２】
【００３３】比較例１ この比較例は、従来行われている方法での測定を示した
ものである。
ものである。
【００３４】１）アビジン結合ペルオキシダーゼの作成 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製）１ｍｇをリ
ン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有）１ｍｌ中で融解し、０．１ｍｇの２−イミノチ
オラン塩酸塩を添加し３７℃、３０分反応した。反応液
をゲル濾過カラムにかけ未反応の２−イミノチオランを
除き、チオール基導入ペルオキシダーゼとした。卵白ア
ビジン（シグマ社製）１ｍｇを含むリン酸緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ６．０）１ｍｌに、ジメチルホルムアミドに
溶解した２架橋性試薬Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオ
キシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ；同仁化学製）０．２
ｍｇを添加し、３０℃で２時間反応した。リン酸緩衝液
で透析し、未反応ＧＭＢＳを除去した。チオール基導入
ペルオキシダーゼ溶液を加え、４℃、８時間反応した
後、ゲル濾過カラムを通し未反応物を除き、アビジン結
合ペルオキシダーゼとした。４℃で保存し、使用時、
０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈して
用いた。
ン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有）１ｍｌ中で融解し、０．１ｍｇの２−イミノチ
オラン塩酸塩を添加し３７℃、３０分反応した。反応液
をゲル濾過カラムにかけ未反応の２−イミノチオランを
除き、チオール基導入ペルオキシダーゼとした。卵白ア
ビジン（シグマ社製）１ｍｇを含むリン酸緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ６．０）１ｍｌに、ジメチルホルムアミドに
溶解した２架橋性試薬Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオ
キシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ；同仁化学製）０．２
ｍｇを添加し、３０℃で２時間反応した。リン酸緩衝液
で透析し、未反応ＧＭＢＳを除去した。チオール基導入
ペルオキシダーゼ溶液を加え、４℃、８時間反応した
後、ゲル濾過カラムを通し未反応物を除き、アビジン結
合ペルオキシダーゼとした。４℃で保存し、使用時、
０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈して
用いた。
【００３５】２）ビオチン化抗ＡＦＰ抗体の作成 抗ＡＦＰ抗体（ダコ社製）１ｍｇを含むリン酸緩衝液１
ｍｌに、ＮＨＳ−ビオチン（Ｎ−Ｈｙｄｏｒｏｘｙｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｏ−ｂｉｏｔｉｎ；ＰＩＥＲＣＥ社
製）０．５ｍｇを溶解したジメチルホルムアミド２０μ
ｌを添加し、３７℃、９０分反応した。ゲル濾過により
未反応物を除去し、抗体画分をえビオチン化抗体とし
た。１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液で希釈し用いた。
ｍｌに、ＮＨＳ−ビオチン（Ｎ−Ｈｙｄｏｒｏｘｙｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｏ−ｂｉｏｔｉｎ；ＰＩＥＲＣＥ社
製）０．５ｍｇを溶解したジメチルホルムアミド２０μ
ｌを添加し、３７℃、９０分反応した。ゲル濾過により
未反応物を除去し、抗体画分をえビオチン化抗体とし
た。１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液で希釈し用いた。
【００３６】３）測定操作 血清検体５０μｌと希釈したビオチン化抗ＡＦＰ抗体５
０μｌ及びアビジン結合微粒子懸濁液５μｌを試験管中
で３７℃、１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を
３回洗浄遠心した。上清をすて、希釈したペルオキシダ
ーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液１００μｌを加え、粒子を再
懸濁し３７℃、１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒
子を３回洗浄遠心した。上清をすて、基質液（過酸化水
素含有O−フェニレンジアミン溶液）０．５ｍｌをくわ
え粒子を再懸濁し３７℃、１５分反応した。遠心し上清
の吸光度を４９２ｎｍで測定した。既知濃度のＡＦＰを
含む標準溶液を同様に測定し作成した検量線から、検体
中のＡＦＰ濃度を読み取った。
０μｌ及びアビジン結合微粒子懸濁液５μｌを試験管中
で３７℃、１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を
３回洗浄遠心した。上清をすて、希釈したペルオキシダ
ーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液１００μｌを加え、粒子を再
懸濁し３７℃、１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒
子を３回洗浄遠心した。上清をすて、基質液（過酸化水
素含有O−フェニレンジアミン溶液）０．５ｍｌをくわ
え粒子を再懸濁し３７℃、１５分反応した。遠心し上清
の吸光度を４９２ｎｍで測定した。既知濃度のＡＦＰを
含む標準溶液を同様に測定し作成した検量線から、検体
中のＡＦＰ濃度を読み取った。
【００３７】４）測定結果 実施例１と同じ、標準溶液、正常人及び肝癌患者の血清
検体の測定結果を前記表２に示した。実施例１よりバッ
クグラウンド（標準０濃度の吸光度）が高く、測定吸光
度も低いため測定感度が劣ってる。従って、正常人血清
の測定値が不正確である。また、正常人血清であるにも
かかわらず異常に高値を示したり、患者血清でも低値を
示す検体があり臨床的に問題のある結果となった。
検体の測定結果を前記表２に示した。実施例１よりバッ
クグラウンド（標準０濃度の吸光度）が高く、測定吸光
度も低いため測定感度が劣ってる。従って、正常人血清
の測定値が不正確である。また、正常人血清であるにも
かかわらず異常に高値を示したり、患者血清でも低値を
示す検体があり臨床的に問題のある結果となった。
【００３８】実施例２ この実施例は生体より分離した遺伝子を利用した本発明
によるフェリチン測定の例である。
によるフェリチン測定の例である。
【００３９】１）ファージＤＮＡの精製 Ｍ１３クローニングキット（東洋紡社製）を用い、キッ
ト添付の説明書にしたがい、菌体からファ−ジ２重鎖Ｄ
ＮＡ、培養上清からファージ１重鎖ＤＮＡを精製した。
Ｍ１３ファ−ジは約７０００のヌクレオチド（７Ｋｂ）
より構成されている。
ト添付の説明書にしたがい、菌体からファ−ジ２重鎖Ｄ
ＮＡ、培養上清からファージ１重鎖ＤＮＡを精製した。
Ｍ１３ファ−ジは約７０００のヌクレオチド（７Ｋｂ）
より構成されている。
【００４０】 ２）１重鎖ＤＮＡ結合抗フェリチン抗体の作成 １）で精製した１重鎖ＤＮＡを機械的に攪拌した後、シ
ョ糖密度勾配遠心法により、１Ｋｂの長さの画分を得
た。この１重鎖ＤＮＡ１０μｇを１ｍｌのリン酸緩衝液
（０．１モル、ｐＨ６．０）に溶解した液に、５μｇの
２−イミノチオラン塩酸塩を添加し３７℃、３０分反応
し、チオール基を導入した。３倍量のエタノールを加え
ＤＮＡを沈澱して回収し、再度１ｍＭのＥＤＴＡ含有リ
ン酸緩衝液に溶解し、チオール基導入１重鎖ＤＮＡとし
た。
ョ糖密度勾配遠心法により、１Ｋｂの長さの画分を得
た。この１重鎖ＤＮＡ１０μｇを１ｍｌのリン酸緩衝液
（０．１モル、ｐＨ６．０）に溶解した液に、５μｇの
２−イミノチオラン塩酸塩を添加し３７℃、３０分反応
し、チオール基を導入した。３倍量のエタノールを加え
ＤＮＡを沈澱して回収し、再度１ｍＭのＥＤＴＡ含有リ
ン酸緩衝液に溶解し、チオール基導入１重鎖ＤＮＡとし
た。
【００４１】抗フェリチン抗体（ダコ社製）１ｍｇを含
むリン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０）１ｍｌに、
ジメチルホルムアミドで溶解したＧＭＢＳ０．５ｍｇを
添加し３０℃、９０分反応した。リン酸緩衝液に対して
透析し、未反応のＧＭＢＳを除去した後、チオール基導
入１重鎖ＤＮＡ溶液と混合し８時間反応した後、ゲルろ
過カラムにより未反応物を除去し、１重鎖ＤＮＡ結合抗
フェリチン抗体とした。
むリン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０）１ｍｌに、
ジメチルホルムアミドで溶解したＧＭＢＳ０．５ｍｇを
添加し３０℃、９０分反応した。リン酸緩衝液に対して
透析し、未反応のＧＭＢＳを除去した後、チオール基導
入１重鎖ＤＮＡ溶液と混合し８時間反応した後、ゲルろ
過カラムにより未反応物を除去し、１重鎖ＤＮＡ結合抗
フェリチン抗体とした。
【００４２】３）32Ｐ標識ＤＮＡの作成 １）で精製した２重鎖ＤＮＡ（ＲＦ−ＤＮＡ）に、テ
ー．マニアチス，エトール．，モレキュラークローニン
グ：１０９−１１２，コールドスプリングハーバーラボ
ラトリイ（１９８２）に記載のニックトランスレイショ
ン法を用いて、32Ｐを導入した。導入後、ＲＦ−ＤＮＡ
を超音波により破壊し、アガロースゲル電気泳動によ
り、鎖長５００〜３００ｂｐ、２００〜５０ｂｐ以下の
２つの画分を得た。使用時に、７０℃で加熱して32Ｐ標
識１重鎖ＤＮＡとして用いた。
ー．マニアチス，エトール．，モレキュラークローニン
グ：１０９−１１２，コールドスプリングハーバーラボ
ラトリイ（１９８２）に記載のニックトランスレイショ
ン法を用いて、32Ｐを導入した。導入後、ＲＦ−ＤＮＡ
を超音波により破壊し、アガロースゲル電気泳動によ
り、鎖長５００〜３００ｂｐ、２００〜５０ｂｐ以下の
２つの画分を得た。使用時に、７０℃で加熱して32Ｐ標
識１重鎖ＤＮＡとして用いた。
【００４３】４）抗フェリチン抗体結合微粒子の作成 表面に活性エステル基を有するコポリマー粒子（国産化
学（株）製、ＡＳＵコポリマー；平均粒子径１μｍ）１
０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（０．０２モル、ｐＨ
７．２）で２回洗浄遠心し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液
に懸濁した。抗フェリチン抗体（ダコ社製）１ｍｇを微
粒子懸濁液に加え、室温で８時間反応した。０．１％牛
血清アルブミン含有リン酸緩衝液で２回洗浄したのち、
０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液２ｍｌに懸
濁し、使用するまで４℃で保存した。
学（株）製、ＡＳＵコポリマー；平均粒子径１μｍ）１
０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（０．０２モル、ｐＨ
７．２）で２回洗浄遠心し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液
に懸濁した。抗フェリチン抗体（ダコ社製）１ｍｇを微
粒子懸濁液に加え、室温で８時間反応した。０．１％牛
血清アルブミン含有リン酸緩衝液で２回洗浄したのち、
０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液２ｍｌに懸
濁し、使用するまで４℃で保存した。
【００４４】５）測定操作 標準フェリチン溶液５０μｌと希釈した１重鎖ＤＮＡ結
合抗フェリチン抗体５０μｌ及び抗フェリチン抗体結合
微粒子懸濁液５μｌを試験管中で３７℃、１５分反応し
た後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清
をすて、希釈し加熱処理した32Ｐ標識ＤＮＡ溶液１００
μｌを加え、粒子を再懸濁し３７℃、３０分反応した
後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清を
すて、シンチレーションカウンターで32Ｐからのカウン
トを測定した。標準フェリチンは、市販フェリチン測定
キット「グラオザイム フェリチン」（和光純薬より発
売）のものを使用した。
合抗フェリチン抗体５０μｌ及び抗フェリチン抗体結合
微粒子懸濁液５μｌを試験管中で３７℃、１５分反応し
た後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清
をすて、希釈し加熱処理した32Ｐ標識ＤＮＡ溶液１００
μｌを加え、粒子を再懸濁し３７℃、３０分反応した
後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清を
すて、シンチレーションカウンターで32Ｐからのカウン
トを測定した。標準フェリチンは、市販フェリチン測定
キット「グラオザイム フェリチン」（和光純薬より発
売）のものを使用した。
【００４５】６）測定結果 本実施例での、フェリチンの検量線を図１、図２に示し
た。図１は、32Ｐ標識ＤＮＡの鎖長が５００〜３００ｂ
ｐの場合の結果である。図２は、32Ｐ標識ＤＮＡの鎖長
が２００〜５０ｂｐの場合の結果である。鎖長の短い方
が、測定感度がより高くなっている。
た。図１は、32Ｐ標識ＤＮＡの鎖長が５００〜３００ｂ
ｐの場合の結果である。図２は、32Ｐ標識ＤＮＡの鎖長
が２００〜５０ｂｐの場合の結果である。鎖長の短い方
が、測定感度がより高くなっている。
【００４６】実施例３ 本実施例は、本発明によるサイロキシン（Ｔ４）の競合
免疫測定の例である。
免疫測定の例である。
【００４７】 １）ポリデオキシアデニル酸結合サイロキシンの作成 Ｔ４（カルバイオケミストリー社製）１ｍｇにジメチル
ホルムアミド１ｍｌを加え、溶解した。この溶液１ｍｌ
に０．２ｍｇの２−イミノチオラン塩酸塩を加え、室温
で１時間反応した後、ゲルろ過により未反応の２−イミ
ノチオラン塩酸塩を除去し、チオール基導入Ｔ４とし
た。実施例１で作成したアミノ基導入ポリデオキシアデ
ニル酸（ヌクレオチド数１００）をリン酸緩衝液に溶解
し、ジメチルホルムアミドで溶解したＧＭＢＳ０．１ｍ
ｇを添加し、３７℃、９０分反応した後、ゲルろ過によ
り未反応ＧＭＢＳを除き、核酸画分を得た。核酸画分に
チオール基導入Ｔ４を添加し、３７℃、９０分反応した
のち、ゲルろ過により未反応物を除去し、ポリデオキシ
アデニル酸結合サイロキシンとした。
ホルムアミド１ｍｌを加え、溶解した。この溶液１ｍｌ
に０．２ｍｇの２−イミノチオラン塩酸塩を加え、室温
で１時間反応した後、ゲルろ過により未反応の２−イミ
ノチオラン塩酸塩を除去し、チオール基導入Ｔ４とし
た。実施例１で作成したアミノ基導入ポリデオキシアデ
ニル酸（ヌクレオチド数１００）をリン酸緩衝液に溶解
し、ジメチルホルムアミドで溶解したＧＭＢＳ０．１ｍ
ｇを添加し、３７℃、９０分反応した後、ゲルろ過によ
り未反応ＧＭＢＳを除き、核酸画分を得た。核酸画分に
チオール基導入Ｔ４を添加し、３７℃、９０分反応した
のち、ゲルろ過により未反応物を除去し、ポリデオキシ
アデニル酸結合サイロキシンとした。
【００４８】２）抗Ｔ４抗体結合微粒子の作成 表面に活性エステル基を有するコポリマー粒子（国産化
学（株）製、ＡＳＵコポリマー；平均粒子径１μｍ）１
０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（０．０２モル、ｐＨ
７．２）で２回洗浄遠心し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液
に懸濁した。抗Ｔ４抗体（ダコ社製）１ｍｇを微粒子懸
濁液に加え、室温で８時間反応した。０．１％牛血清ア
ルブミン含有リン酸緩衝液で２回洗浄したのち、０．１
％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、
使用するまで４℃で保存した。
学（株）製、ＡＳＵコポリマー；平均粒子径１μｍ）１
０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（０．０２モル、ｐＨ
７．２）で２回洗浄遠心し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液
に懸濁した。抗Ｔ４抗体（ダコ社製）１ｍｇを微粒子懸
濁液に加え、室温で８時間反応した。０．１％牛血清ア
ルブミン含有リン酸緩衝液で２回洗浄したのち、０．１
％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、
使用するまで４℃で保存した。
【００４９】３）測定方法 標準Ｔ４溶液（Ｔ４をＴ４フリー血清に溶解したもの）
５０μｌと抗Ｔ４抗体結合微粒子懸濁液５μｌおよび希
釈したポリアデニル酸結合サイロキシン溶液５０μｌを
３７℃、１５分反応した。反応後、蒸留水２ｍｌで微粒
子を２回洗浄遠心した。上清をすて、実施例１で作成し
たポリデオキシチミジル酸（ヌクレオチド数５０）結合
ペルオキシダーゼの希釈溶液２００μｌを加え、３７
℃、１５分反応した。反応後、蒸留水２ｍｌで微粒子を
２回洗浄遠心した。上清をすて、基質液（過酸化水素含
有O−フェニレンジアミン溶液）０．５ｍｌを加え粒子
を再懸濁し３７℃、１５分反応した。遠心し上清の吸光
度を４９２ｎｍで測定した。
５０μｌと抗Ｔ４抗体結合微粒子懸濁液５μｌおよび希
釈したポリアデニル酸結合サイロキシン溶液５０μｌを
３７℃、１５分反応した。反応後、蒸留水２ｍｌで微粒
子を２回洗浄遠心した。上清をすて、実施例１で作成し
たポリデオキシチミジル酸（ヌクレオチド数５０）結合
ペルオキシダーゼの希釈溶液２００μｌを加え、３７
℃、１５分反応した。反応後、蒸留水２ｍｌで微粒子を
２回洗浄遠心した。上清をすて、基質液（過酸化水素含
有O−フェニレンジアミン溶液）０．５ｍｌを加え粒子
を再懸濁し３７℃、１５分反応した。遠心し上清の吸光
度を４９２ｎｍで測定した。
【００５０】４）測定結果 本実施例での、Ｔ４測定の検量線を図３に示した。短時
間の測定条件で、充分な測定感度を示した。
間の測定条件で、充分な測定感度を示した。
【００５１】
【発明の効果】本発明は、相補的な塩基配列を有する２
本の１重鎖核酸が、ハイブリダイズすることを利用した
免疫測定法である。従来、免疫測定法では、高感度な測
定を行うために、種々の方法が行われてきたが、充分な
効果は獲られなかった。すなわち、免疫複合体中の標識
量を充分に増やし、かつ、バックグラウンドを下げるこ
とを同時に達成した方法は無かった。本発明は、核酸の
ハイブリダイズ形成を利用することにより、免疫複合体
中の標識量を増すことが可能である。特に、１重鎖核酸
とより短い１重鎖核酸を反応することで、結合する標識
量を著しく増し、測定感度を向上することが可能となっ
た。また、測定のバックグラウンドも低いため、低値の
正確性も向上している。さらに、検体中に存在する干渉
物質の影響を受け難く、臨床的に誤った測定値を示すこ
とが無い。以上のように、本発明は、高感度で正確な免
疫測定を可能とする方法および測定用試薬を提供するも
のである。
本の１重鎖核酸が、ハイブリダイズすることを利用した
免疫測定法である。従来、免疫測定法では、高感度な測
定を行うために、種々の方法が行われてきたが、充分な
効果は獲られなかった。すなわち、免疫複合体中の標識
量を充分に増やし、かつ、バックグラウンドを下げるこ
とを同時に達成した方法は無かった。本発明は、核酸の
ハイブリダイズ形成を利用することにより、免疫複合体
中の標識量を増すことが可能である。特に、１重鎖核酸
とより短い１重鎖核酸を反応することで、結合する標識
量を著しく増し、測定感度を向上することが可能となっ
た。また、測定のバックグラウンドも低いため、低値の
正確性も向上している。さらに、検体中に存在する干渉
物質の影響を受け難く、臨床的に誤った測定値を示すこ
とが無い。以上のように、本発明は、高感度で正確な免
疫測定を可能とする方法および測定用試薬を提供するも
のである。
【図１】実施例２において、鎖長５００〜３００ｂｐの
32Ｐ標識ＤＮＡを用いて、標準フェリチンを測定したと
きの検量線である。
32Ｐ標識ＤＮＡを用いて、標準フェリチンを測定したと
きの検量線である。
【図２】実施例２において、鎖長２００〜５０ｂｐの32
Ｐ標識ＤＮＡを用いて、標準フェリチンを測定したとき
の検量線である。
Ｐ標識ＤＮＡを用いて、標準フェリチンを測定したとき
の検量線である。
【図３】実施例３において、標準Ｔ４溶液を測定したと
きの検量線である。
きの検量線である。
Claims (6)
- 【請求項１】 測定しようとする物質（以下「測定物
質」という。）に、下記「固定化物質」、下記「第１核
酸結合体」及び下記「標識第２核酸」を反応させて生成
する免疫複合体（Ａ）中あるいは未反応の「標識第２核
酸」中の標識量を測定することを特徴とする免疫測定
法。 固定化物質：「測定物質」と特異的な結合性を有する物
質（以下「結合性物質」という。）と水不溶性担体との
結合体。 第１核酸結合体：「結合性物質」、あるいは「測定物
質」と同じ免疫反応特性を有する物質と、１重鎖のデオ
キシリボ核酸またはリボ核酸（以下「第１核酸」とい
う。）との結合体。 標識第２核酸：「第１核酸」と相補的な塩基配列を有す
る１重鎖のデオキシリボ核酸またはリボ核酸（以下「第
２核酸」という。）に、標識剤を結合させた物質。 - 【請求項２】 「第１核酸」を構成するリボヌクレオチ
ドもしくはデオキシリボヌクレオチドから選ばれる単位
の種類が、１種類である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 「結合性物質」が、「測定物質」に対す
る、抗体または抗原である請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項４】 「第１核酸」及び「第２核酸」を各々構
成するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ドから選ばれる単位の個数が、１０〜１,０００である
請求項１〜３のいずれか記載の方法。 - 【請求項５】 「第２核酸」を構成するリボヌクレオチ
ドまたはデオキシリボヌクレオチドから選ばれる単位の
個数が、「第１核酸」を構成する同様の単位の個数の１
／１００〜１／２である請求項１〜４のいずれか記載の
方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか記載の、「固定
化物質」、「第１核酸結合体」および「標識第２核酸」
を構成品として含む免疫測定用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4084595A JP2547149B2 (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4084595A JP2547149B2 (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0627109A true JPH0627109A (ja) | 1994-02-04 |
| JP2547149B2 JP2547149B2 (ja) | 1996-10-23 |
Family
ID=13835041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4084595A Expired - Fee Related JP2547149B2 (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2547149B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003508761A (ja) * | 1999-08-27 | 2003-03-04 | フィロス インク． | インビトロ翻訳タンパク質の符号化方法および選別方法 |
| WO2004010144A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe carrier and method of producing same |
| US7045363B2 (en) | 1996-05-01 | 2006-05-16 | Fujirebio Inc. | Nucleic acid-bound polypeptide method of producing nucleic acid-bound polypeptide and immunoassay using the polypeptide |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61277061A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-12-08 | ヘキスト・セラニ−ズ・コ−ポレイション | リガンドの測定方法 |
| JPS63118655A (ja) * | 1986-03-19 | 1988-05-23 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 免疫反応の反応成分を測定するための方法及び試薬 |
-
1992
- 1992-03-05 JP JP4084595A patent/JP2547149B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61277061A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-12-08 | ヘキスト・セラニ−ズ・コ−ポレイション | リガンドの測定方法 |
| JPS63118655A (ja) * | 1986-03-19 | 1988-05-23 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 免疫反応の反応成分を測定するための方法及び試薬 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7045363B2 (en) | 1996-05-01 | 2006-05-16 | Fujirebio Inc. | Nucleic acid-bound polypeptide method of producing nucleic acid-bound polypeptide and immunoassay using the polypeptide |
| JP2003508761A (ja) * | 1999-08-27 | 2003-03-04 | フィロス インク． | インビトロ翻訳タンパク質の符号化方法および選別方法 |
| JP4803933B2 (ja) * | 1999-08-27 | 2011-10-26 | ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー | インビトロ翻訳タンパク質の符号化方法および選別方法 |
| WO2004010144A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe carrier and method of producing same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2547149B2 (ja) | 1996-10-23 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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