JPS61277061A - リガンドの測定方法 - Google Patents

リガンドの測定方法

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JPS61277061A JP60269558A JP26955885A JPS61277061A JP S61277061 A JPS61277061 A JP S61277061A JP 60269558 A JP60269558 A JP 60269558A JP 26955885 A JP26955885 A JP 26955885A JP S61277061 A JPS61277061 A JP S61277061A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、リガンドの測定方法、そしてより詳細には、
共有結合的に結合したアビジン試薬で標識された当該リ
ガンドに対する特異結合物質およびビオチン標識酵素試
薬を用いる方法に関する。
従来の技術 米国特許第4.22a237号明細書は、酵素標識アビ
ジン試薬および当該リガンドに対するビオチン標識特異
結合物質を用いたリガンド測定方法に関し、後者の場合
は、その特異結合物質を酵素標識アビジンに結合させる
ためのビオチン・ブリッジ全供与するのに用いられる。
より高い特異酵素活性の複合体(コンプレックス)およ
び接合体(コンジュゲート)ヲ用いることは多くの場合
に有利であり、それ故に、この成果を達成するための方
法が望まれかつ必要とされている。
発明の概要 本発明は、リガンドの測定方法、そしてLり詳細には、
共有結合的に結合したアビジン試薬で標識され九当該リ
ガンドに対する特異結合物質およびビオチン標識酵素試
薬を用いる方法に関する。
この方法は、リガンドに対する特異結合物質を含有する
不溶相を提供す、ることよりなる。この不溶相は次の試
薬でインΦユベートされる。
すなわち、 (i)  リガンドを含有すると思われる媒質、(i+
)  (a’)アビジンと共有結合的に連結し九当該リ
ガンドに対する特異結合物質、(b′)ビオチン標識酵
素と複合し次試薬(a’) 、ま′fi:、は<c’>
アビジンに連結したリガンドを九は(aリビオチン標識
酵素と複合した試薬(c′)Lつなる群から選択される
試薬、おLび (i1D  試薬が(a′)ま九は(cつである場合に
はビオチン標識酵素。未反応試薬はインキュベーション
後に不溶相から分離され、次にその分離され迄未反応試
薬かまたは分離され九不溶相の酵素活性を測定してリガ
ンドを測定する。
詳細な説明 本発明のビオチン−アビジン系は任意の通常の不均質結
合法に利用しうるが、非拮抗的および拮抗的結合法が好
ましい。
一般に、特異結合反応の成分(リガンドに対する特異結
合物質と適宜の試薬を含有する不溶相)は、得られる酵
素活性を次の検出反応系で容易に測定しうるようにする
方法ま友は順序で一緒に添加することができる。
本発明により測定しりるリガンドは特異結合物質を用意
することのできる特異有機物である。
特異結合物質は、他の物質は排除して当該リガンドに附
子る特異結合親和性を有する任意の物質ないし物質群で
おる。非拮抗的方法を用いる場合は、本発明方法に使用
される不溶相に含まれる特異結合物質およびアビジン試
薬に結合した特異結合物質は同一であってもよいし、ま
几は異なってもよい。
リガンドという用語に包含される包括的物質群には、例
えば抗原、抗体およびハプテンならびに天然の受容体を
有するかまたは受容体を作ることのできる物質、例えば
DNAプローブなどが含まれる。
リガンドが抗原である場合には、抗原の検出に用いられ
る特異結合物質は通常、その抗原を背椎動物の血流に導
入した際に産生される対応する抗体である。本発明によ
り測定されうる抗原例としては、例えばポリペプチドお
工びタンノ9クホルモン、ヒトIgEおよびα1フエト
プロテイン、肝癌および胎児副腎癌患者の血清にも存在
する胎児抗原などが含まれる。逆にリガンドが抗体であ
る場合には、その誘発抗原を特異結合物質として用いる
ことができる。抗体力価の検定は、例えば梅毒、風疹の
ような感染症および溶血性連鎖球菌が原因する感染症な
どの診断に特に有用である。
リガンドがハプテン(すなわちそれ自体は抗体形成を誘
発しないタンパク不含物質)である場合、そのハプテン
の検出に用いられる特異結合物質は、そのハプテンを抗
原性担体に結合させてを椎動物の血流に導入した際に産
生される抗体である。本発明により測定しうるハプテン
例としては、ステロイド例えばエストロン、エストラジ
オール、テストステロン、グレグナンジオールおよびプ
ロゲステロンなど、ビタミン例えばB12お工びjl@
など、トリョードチロニン、チロキシン、ヒスタミン、
セロトニン、ジゴキシン、プロスタグランジン、アドレ
ナリン、ノルアドレナリン、モルフイン、植物ホルモン
および抗生物質例えばペニシリンなどが含まれる。
リガンドが天然の受容体、または作られ友受容体を有す
る物質である場合、その受容体’k IJガントに対し
特異的な形で単離することのできるときには、その受容
体をリガンドを測定するための特異結合物質として使用
することができる。天然の受容体を有するリガンド例と
しては例、tばチロキシン、多くのステロイド、ポリペ
プチドおよびニューロポリペプチド例えばイン−7ユI
J 7 、 カーX ) ’Jン、アンギオテンシン、
エンドルフィン、各種阿片剤、その他多数の例が挙げら
れる。このリガンド群に対する受容体は通常タンノぐり
である。
測定すべきリガンドを含んでいると思われる液状試料媒
質が選択される。測定すべきリガンドを含有するものと
推定される液状媒質は天然まtは合成の液体であっても
よい。多くの場合に、その液体は生物学的流体であろう
。本発明によりリガンドを検査することのできる生物学
的流体としては例えば全血、血清、血漿、尿、漿液およ
び脳を髄液などが挙げられる。
検体中のリガンドを曝露させそしてそれを結合させるべ
き特異結合物質を含む適当な不溶相を調製する。適当な
不溶相には生化学分析に用いられる任意の通常の不活性
支持体まfCk工担体が含まれる。本発明に用いられる
いくつかの典型的な固体担体ま几は支持体物質には不溶
性で有機もしくは一部無機のポリマー例えばセルロース
、ニトロセルロース、アガロース、ポリフロピレン、ポ
リスチレン、架橋デキストラン、ナイロンおよびガラス
誘導体が含まれ得る。かかる支持体の共通構造としては
例えばビーズ、メール、ペーパーディスク、チューブ、
微量力価検定プレート、フィルム、混合スチツク、お工
びスライドなどが挙げられる。
測定すべきリガンドに対する特異結合物質を含む不溶相
の調製は既矧方法により行うことができる。例えば、特
異結合物質は、架橋、共有結合まtは物理吸着により固
体担体に結合させることができる。例えば、測定すべき
リガンドが抗原である場合には、不溶相の調#!は、チ
ューブま几はプレートを適宜の抗体で単にコーティング
することに工って行うことができる。ナイロンビーズが
用いられる場合4Cは、適当な抗体f r FEBS 
Letters J、48.22<5(i974)に記
載され次Faulstich らの方法によりビーズに
共有結合することもできる。
不溶相に結合され次リガンドと反応させるべきものは、
アビジン試薬と共有結合したリガンドに対する特異結合
物質およびそれ自体ビオチン標識されている醪素試薬で
ある。特異結合物質に共有結合されるアビジン試薬には
、卵白から得られるアビジンま九は、ストレプトマイセ
ス・アビジ= (5trept、omyces avi
dinii )からのストレノ臂ビジン(5trepa
、vidin )が含まれる。
アビジン試薬は、外部の二価および多価結合試薬の添加
により、または場合によっては、当該技術分野において
よく知られた標準的条件下に存在する官能基を直接縮合
することにより、特異結合物質またはリガンドに共有結
合することができる。このような結合試薬には、ゲルタ
ールアルデヒド、カルメジイミド、ジイソシアネートお
よびヘテロ官能性架橋剤例えばN−γ−マレイミドブチ
リルオキシスクシンイミド(GMBS)(これによって
分裂不可能な結合が形成される)ま几はチオリンカ−例
、tばN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルチオ
)−プロピオネ−) (SPDP) (これは分裂可能
なタイプの結合の形成に用いることができる)などが含
まれる。
その他の結合試薬は式R1−8−8−A−Z C式中、
R1は2−ピリジル、5−ニトロ−2−ピリジルま九は
4−ピリジルであつ、Aは1〜10個の炭素原子、好ま
しくは1〜6個の炭素原子を有する炭化水素残基でおり
、セして2は基 nは2t7’cは6でらり、R1は前記のR1と同じ意
味を有しま念それに等しく、セしてR2はメチルま九は
エチルでおる)またはこれらの基の酸付加塩である〕で
示される。炭化水素残基Aは好ましくは脂肪族残基であ
るが芳香族残基であっても工い。この二う々結合剤およ
びそれらの  −製造は米国特許第4,149,003
号明細書に明らかにされており、それを言及により本明
細書の一部として含める。
分裂可能なブリッジによる特異結合物質とアビシン試薬
の共有結合は米国特許第4..231,999号明細書
(その記載を言及にエリ本明細書の一部として含める)
に明らかにされている方法により行うことができる。
広範囲にわたる様々な酵素がビオチン標識酵素試薬の調
製に用いられるが、ろる種の酵素が好ましい。例えば、
リガンドの定性測定では、酵素は好ましくは呈色反応に
よって検出されるべきでおる。
本発明に用いるのに適しt酵素には、国際生化学者連盟
(the International Union 
of Bio−chemiSts:略称1.U、B、 
)によるオキシドレダクターゼ、ハイドロラーゼおLび
リアーゼとして分類されているものが含まれる。オキシ
ドレダクターゼの中でも、供与体のCHO)1基、アル
デヒドもしくはケト基ま九はCHN112基に作用する
もの(それぞれ1.1.1.2および1.4)および受
容体として過酸化水素に作用するもの(i,11)が好
ましい。
特に好ましいオキシドレダクターゼには例えばクルコー
スオギシダーゼおよび西洋ワサビヘルオキシダーゼが含
まれる。ハイドロラーゼの中でも特に興味深いのは、エ
ステル結合(有機エステルお工び無機エステルの両方)
に作用するもの、およびグリコジル化合物特にグリコシ
ドハイドロラーゼに作用するもの(すなわちそれぞれ5
.1お工び五2)である。特に好ましいノ〜イドロラー
ゼには例えばアルカリ性ホスファターゼお工びβ−ガラ
クトシダーゼが含まれる。
ビオチン標識酵素試薬の調製は典型的には、遊離アミノ
基と反応してアミド結合金形成するビオチンN−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル(BHN8)!用いること
にLす、あるいは過沃素酸塩で酸化されたグリコタンノ
4りからのアルデヒド基と反応してヒrラゾン全形成す
るビオチンヒドラジドを用いて行いうる。
特に好ましい非拮抗的結合法は「サンドイッチ」法であ
り、その場合、結合反応の成分は、リガンドに対する特
異結合物質を含む不溶相と次の試薬とよりなる。すなわ
ち。
(:)  リガンドを含有すると思われる測定された量
の液体媒質、 (iD  IJガンPに対するアビジン標識特異結合物
質、および (i10ビオチン標識酵素。
別法として、試薬(ii)お工び(iiilの代わりに
アビジン標識特異結合物質とビオチン標識酵素との予め
形成された複合体を用いても工い。このような試薬は不
溶相に結合したリガンドとインキュベーションする前に
適量の試薬(i1)および(in ?単に混ぜ合わせる
だけで調製することができる。
非拮抗的結合法においては、不溶相を一定の条件の下に
前記試薬と相互の存在下にインキュベートしてもよく、
あるいは不溶相を正しい順序で個別に試薬とインキュイ
ードしてもよい。
後者の方法の方が一般には好ましい・ 不溶相を正しい順序で個別の試薬とインキュベートする
場合には、結合過程を多数回、例えば2または3回のイ
ンキュベーション時間にわけて行うことができる◎ 3段階インキュベーション法では、不溶相全まずリガン
ド試薬、すなわち、そのリガンドを含有すると思われる
測定された量の液体媒質と反応させる。次に未反応試薬
を除き、そしてそのリガンドに対するアビジン標識特異
結合物質を添加する。そのアビジン標識特異結合物質の
反応後、未反応アビジン標識試薬を除去しそしてビオチ
ン標識酵素を添加する。ビオチン標識酵素の反応後、未
反応試薬を不溶相から分離しそして不溶相かまたは分離
された未反応ビオチン標識酵素の酵素活性を適当な検出
反応により測定する。不溶相の酵素活性は液体媒質中の
リガンド量に直接関連付けられるのに対し、分離され九
未反応ピオチン標識酵素の酵素活性はリガンド量と反比
例関係にある。
アビジン標識特異結合物質をビオチン標識酵素と予め反
応させである場合には、結合過程は、個々のアビノン標
識お工びビオチン標識酵素試薬全ビオチン標識酵素に結
合し九アビジン標識試薬で置換することにより2段階で
行うことができる。
前述の非拮抗的結合法で定量的な結果金得るには、試薬
と混合される不溶相の量を、液体媒質中に存在すると推
定されるリガンドの総量と結合金形成しうる量工つも一
般的に多くする。
その量は実際上は、そのリガンドが液体中に可及的最高
濃度で存在するとの仮定に基づき前述の基準に合致する
よう選択される。非拮抗的方法と慣用のラジオイムノア
ッセイ(RIA)とは、前者では測定すべきリガンドが
過剰の標識結合物質との反応により直接検定されるのに
対し後者では測定すべきリガンPが限られた量の結合物
質に対して標識リガンドと拮抗する点で異なっている。
非拮抗的結合は、多重的結合部位を有する高分子量リガ
ンドの検出に特に適している。
拮抗的結合法?用いる場合、結合反応の成分は、当該リ
ガンドに対する特異結合物質を含有する不溶相および次
の試薬よりなる。
(i)  (A)リガンドを含むものと思われる測定さ
れた量の液体媒質お工び(E9既知量のアビジン標識リ
ガンド、および (i1)  ビオチン標識酵素。
別方式として、(B)はビオチン標識酵素に結合したア
ビジン標識リガンドであってもよく、そうすることによ
って試薬(i1)が不要となる。この複合体試薬は前述
の如く調製される。
試薬(i)および(It) =に用いる拮抗的結合検定
では、不溶相全試薬と相互の存在下にインキュベートし
てもよく、あるいは不溶相を特定の順序で個別的に試薬
とインギュペートしてもよい。後者の方式では、不溶相
金まず、(AJリガンドを含有すると思われる測定され
九愈の液体媒質および(刑既知量のアビジン標識リガン
ドよりなる試薬とインキュベートする。測定すべきリガ
ンドと不溶化特異結合物質の結合部位に対するアビジン
標識リガンドとの間に拮抗が成立する。平衡後、未反応
試薬を除去しそしてビオチン標識酵素試薬を添加する。
ビオチン標識酵素試薬の反応後、未反応試薬を不溶相か
ら分離し、そして不溶相かまたは分離され九未反応ビオ
チン標識酵素の酵素活性全適当な検出反応により測定す
る。不溶相の酵素活性は液体媒質中のリガンド量と反比
例関係にあるのに対し、分離された未反応ビオチン標識
酵素の酵素活性はリガンド量に直接関係付けられる。
アビジン標識リガンドをビオチン標識酵素と予め反応さ
せる場合、結合過程は、不溶相を、(A) リ、fンド
を含むも−のと思われる測定された量の液体媒質と(B
l既知量の、ビオチン標識酵素に結合したアビジン標識
リガンドとよりなる試薬と単にインキュベートすること
により1回のインキュベーション時間で行うことができ
る。
拮抗結合法で定量的結果を得るには、1検体あたりの不
溶相特異結合物質量は通常、液体中に存在すると推定さ
れるリガンドの総量t−M合しうる量よりも少くし、ま
友アビジン標識リガンドまtはビオチン標識酵素に結合
したアビジン標識リガンドの総量よりも少くする。実際
の応用にあたっては、この量は、液体媒質中に存在しう
るリガンドの総量が実際にそこにあるものとの仮定に基
づいて、前記基準に合致するように選択される。一般に
、液体媒質に接触させるアビジン標識リガンド、または
ビオチン標識酵素に結合したアビジン標識リガンドの量
は、液体媒質中の測定すべきリガンドの最低量を超えな
い。拮抗的結合法は結合部位をほとんど持たないリガン
ドの検出に特に適している。
非拮抗的結合法(すなわち「サンドインチ」法>を用い
て本発明により測定されるリガンドは、特異結合物質含
有不溶相およびアビジン標識特異結合物質の両者と結合
する几ワに少くとも2′)の結合部位を有する必要があ
る。拮抗的結合法を用いる場合は前述の基準は不要であ
る。
本発明における酵素活性の測定は、使用する特定の酵素
に適した検出反応系で行われる。異なる酵素の検定法間
のみならず、特定の酵素に対する種々の検定法において
さえも相違があるので検定法を一般的に記述することは
できない。
しかしながら、本発明に用いられる酵素に適した広範囲
にわたる様々な媒質、条件および基質は、Bergme
yerのr Methods of Enzymati
c Analysis JAcademic Pres
s 、 New York (i965)にみることが
できる。
特異結合物質と共有結合的に連結したアビジンの比は1
:1に限定する必要はなく、ま几各各のアビジンはビオ
チン4分子を結合しうろことから、今や、ビオチン標識
酵素−アビジン標識特異結合物質の使用にエリ従来から
認識されているよりも高い酵素−特異結合物質比を得る
ことが可能である。従って得られるリガンドの検定法は
、得られt複合体ま友は接合体がより高い酵素特異的な
活性を有している友めに、感度および正確度も一段と高
い。
具体的態様の記述 以下の実施例は当業者が本発明をより明瞭に理解しかつ
実施できるtめの具体的な記述であるが、本発明の範囲
を限定するものではない。
実施例 ■ 2本鎖DNAに対するヒト抗体(I gG)の測定手順
を「サンドインチ」法を用いて行った。
(a)  アビ・シンに共有結合的に連結された、ヒト
抗体(IgG)に対するアフイニテイ精裂ヤギ抗体(I
gG)の調製 N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルチオ)fロ
ピオネート(5PDP )によりアビジンに共有結合的
に連結されたヒト抗体(IgG)に対する精製ヤギ抗体
(IgG)を次のようにして調製した0 1.0−の105Mホスフェート緩衝液(pH7,4)
に溶解し次3.7■の卵白アビジンとエタノール中のQ
、2561J 8PDP 100mJ金合−した。得ら
れ次混合物を20℃で1時間攪拌し、そして未反応5P
DP f 5ephadex G −25カラムでのゲ
ル濾過により除去した。
1、Odの105Mホスフェート緩衝液(pH7,4)
に溶解した2、 1 mgのヤギ抗−ヒ) IgG (
アフイニテイ精裂物)とエタノール中のQ、256M 
5PDP100dを合一した。得られた混合物を20℃
で1時間攪拌しそして未反応5PDPを5ephade
xG−100カラムでのゲル濾過により除去した。
1257のQ、1M酢酸ナトリウム(pH4,5)を4
00J!I容量(pH5,0)中の1.25■の5PD
P−ヤギ抗−ヒトIgG&C溢加した。これに501の
[1,1Mジチオスレイトール(DTT) ’i添加し
た。得られた混合物を攪拌し、次いで20℃で15分間
インキュベートした。未反応DTTを5ephadex
 G−25カラムでのゲル濾過により除去した。
176■の5PDPヤギ抗−ヒトIgG (還元型)に
1.24■の5PDPアピソンを添加した。得られた混
合物を20℃で1.5時間ゆるやかに攪拌した。次に得
られ次接合体を4℃で貯蔵した。
(b)2本鎖DNAに対するヒト抗体(IgG)の測定
ヒト2本鎖DNAでコーティングした微量力価測定ポリ
スチレンウェル(250μを容量)に2本鎖DNAに対
する抗体(IgG) k含有する100μLのヒト血清
検体を添加した。次にウェルおよび検体を20℃で2〜
4時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で2回洗浄し
た。各ウェルに、前記((転)の、ヒ) IgGに対す
るヤギ抗体(IgG) −アビジン接合体試薬希釈物1
00μtを添加し、そして各ウェルを20℃で1時間イ
ンキュベートし文。過剰の試薬を吸引にLり除去し、そ
して各ウェルを洗浄緩衝液で2回洗浄し九〇次に各ウェ
ルに、商業的に入手しうるビオチン標識アルカリ性ホス
ファターゼ試薬100μLt−添加した。次に各ウェル
を20℃で30分間ビオチン標識アルカリ性ホスファタ
ーゼ試薬とインキュベートし、その後過剰のビオチン試
薬を吸引により除去しそして各ウェル全洗浄緩衝液で2
回洗浄し次。
各ウェルに100μtのp−ニトロフェニルホスフェー
ト基質試薬を添加しそして20℃で30分間インキュベ
ートしt後、100μtの2N H2SO4を添加した
。410nmでの光学密度(0,D、)t−読んで酵素
濃度を得九〇 実施例 ■ ヒト絨毛ゴナドトロピン(hco)の測定手順を次の方
法により行うことができ友。
(at  ストレプタピジンに共有結合的に連結された
、hCGに対するマウス・モノクローナル抗体(IgG
) (α−サブユニット特異的、Fab’断片)の調製 1Q、0Tq(cL166μモル)のストレプタヒジン
’i 1.0 dのホスフェート緩衝食塩水(pH7,
2)に溶解する。これにテトラヒrロフラン(THF)
中のN−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド
(GMB8 )の5 mM浴溶液6μLf滴加しそして
20℃で1.5時間ゆるやかに攪拌する。
α−hCGに対する精製マウス・モノクローナル抗体5
0■t2.sm7の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(p
H4,5)に溶解する。これにアセテート緩衝液中のペ
プシンの10■/酎溶液100μtを添加し、ゆるやか
に混合し、そして67℃で一夜(約16時間)消化した
。その混合物上500μtの2M)ロメタミン(Tri
s )で中和する。消化物1G−200カラム(i,5
xlcrFL)にかけ、そして0.01Tris緩衝食
塩水(pH7,3)で溶出スル。
2.5M画分ずつ集めそして280 nmで監視する。
第1主ピークはF(ab’)2である。ピーク画分をプ
ールしそして5ゴ(約6η声)まで濃縮する。
これに0.5mのI M Tris−HCL (PH7
,s )、50μtの0.2Mエチレンジニトリロ四酢
rR(EDTA)ジナトリウム塩およびI M Tri
S−HCL(pH7,5)中の0.1Mジチオスレイト
ール50μLtl−添加する。
ゆるやかに混合しそして20℃で1時間インキュベート
する。
混合物’i G−200カラムにかけそしてペプシン消
化物についてと同様に溶出する。Fab’断片を含む第
1主♂−り画分をプールする。直後に、プールされf 
Fab’ マウス抗CL −hCG浴液’i GMB8
処理ストレグタビジンと混合しそして20℃で3時間ゆ
るやかに攪拌する。過剰のマレイミド金50μtの10
mMメルカプトエタノールでクエンチする。5epha
dex G −200カラムでのゲル濾過により、接合
体を未反応成分から分離する。燐酸塩緩衝fi (PB
S)で溶出して280 nmで監視する。第1主ピーク
はマウス抗α−hCG Fab’−ストレグタビジン接
合体を含有する。
(b)  ヒト絨毛がナトトロピン(hC’G)の測定
hCGに対するアフイニテイ精製マウス・モノクローナ
ル抗体(IgG) (β−サツユニット特異的)でコー
ティングしたポリスチレン微量力価測定ウェルに、10
0μtの患者血清検体またはhCG標Sを添加する。ウ
ェルを20℃で3時間インキュベートした後、実施例■
に記載の吸引−洗浄手順を行う。各ウェルに作用濃度の
100μtの接合体を添加しそして20℃で1時間イン
キュベートする。次いで吸引を行い、そして100μt
のピオチン−アルカリ性ホスフェート接合体を添加して
洗浄する。インキュベーション後、実施例■に記載の酵
素基質反応を行う。
標準曲線を用いて検体のhco値全測定する。
実施例 ■ 膵臓小島細胞に対する自家抗体を検出する几めの手順全
欠のようにして行うことができる。
(eL)  アビジンに共有結合的に連結され友ヒト抗
体(IgG)に対するアフイニテイ精製ヤギ抗体(工g
())の調製 ストレプトマイセス・アビジニエりのアビジンを次の手
順によりヒトIgGに対するアフイニテイ精製ヤギ抗体
に接合する。
ヒトIgGに対するA411J9(0,023Mモル)
のアフイニテイ精製ヤギ抗体t−0,5mのα01M燐
駿塩燐酸塩(PBS)に溶解する。攪拌しながら、N、
N−ジメチルホルムアミド(DMF’)中の五〇μL(
α60μモル)のN−スクシンイミジル−8−アセチル
チオアセテート(5ATA ) 全添加し、そして反応
混合物を20℃で20分間インキュベートする。反応混
合物f 1 mM EDTA t”含む0.05− M
燐酸す) IJウム緩衝液(pH6,5)e用いて15
頭の5ephadex G −25カラムでのクロマト
グラフィにかける。α9岬のヤギ抗−ヒトrgG−8A
TAを含有する画分の−を−ス5に調節しそしてα4M
 NH20E・HClおよび0.02 M ED’rA
を含む100μLの105M燐酸ナトリウム緩衝液(p
H7,5)全添加する。混合物を室温で1.5時間攪拌
しそして4℃で貯蔵する。
1■(0,016Mモル)のストレグタビジンを1.0
IFl/(7)0.05M燐酸1−)IJウム緩衝fi
(pH15)に溶解し、そしてジメチルスルホキシド中
の2.4mM  N−スクシンイミジル−3−(2−ピ
リジルチオ)グロヒオネート(SPDP)27μt(c
L065μモル)を添加する。反応混合物t−20℃で
1時間攪拌し、そして105M−塩基性燐酸ナトリウム
(PH4,3)t−用いて15 CC5ephadex
 G −25カラムでのクロマトグラフィーにかける。
[L4119のヤギ抗−ヒトIgG−8ATA (α8
 q/ml )VCQ、481fIgノx ) vフタ
ヒシy−5PDP(l153W/mJ)を添加し、そし
て室温で1.5時間攪拌する。接合体を20℃で貯蔵す
る。
(b)  膵臓小島細胞に対するヒト自家抗体の検出患
者血清検体’to、05Mホスフェート緩衝食塩水(p
H14)中に希釈し九もの〔1:2.1:8)25μt
t、サル膵臓組織の4ミクロン厚情片を重層したスライ
ドの組織切片にのせる。スライドを1時間加湿室内でイ
ンキュベートする。次にスライド’i PBS中で2回
洗浄しそして組織切片上に塗被され九PBS中で希釈さ
れ次ストレプタビジン接合体と共に20℃で1時間イン
キュベートした。インキュベーション後、スライド1P
BS中で2回洗浄し、PBS中で希釈された1Nのビオ
チン標識グルコースオキシダーゼ(商業的に入手可能)
を添加し、そして20℃で更に1時間インキュベートす
る。スライドi PBSで2回洗浄し、プロットし、そ
してQ、I M NaE2PO4緩衝液(pH&9 )
中の0.0005チニトロプルーテトラゾリウム、0.
0075チグルコースおよび0.0002チフエナジン
メトサルフエート’i1.07d添加する。20℃で3
0分間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、そして
適当な固定媒質(mountingmedia )で固
定する。膵臓切片を光学顕微鏡を用いて評価する。ラン
ゲルハンス小島細胞の細胞質染色を観察することにより
陽性染色の測定を行う。各切片を染色強度に応じて0.
1+、2+、3+、4+などという工うに点数付けする
。結果は力価として報告される。
実施例 ■ 患者血清検体中のと) IgE測定の几めの拮抗的イム
ノアッセイ全欠のようにして行うことができる。
(a)  アフイニテイ精製ヒトIgEに対するストレ
ゾタビジンの接合 これは、実施例■におけるストレプタピジンへのと) 
IgGの接合についての記載と同様にして行われる。
(bl  患者血清検体中のヒ) IgEの測定ヒ) 
IgEに対する家兎抗体の個別量でコーティングしたウ
ェルにPBSに希釈した患者血清ま友は標準100μt
t−添加する。PBS中のIgE−ストレゾタビジン接
合体50μtを添加し、そしてその混合物を一夜(約1
6時間)20℃でインキュベートする。吸引しそしてウ
ェルt−PBSで十分洗浄してから100μLのビオチ
ン標識西洋ワサビペルオキシダーゼを添加する。20’
Cで1時間インキュベートする。吸引しそして前述の如
く洗浄し、そして、Q、3%o−フェニレンジアミン、
2 HClおよびα02チハイドロジエンペルオキシダ
ーゼ・シトレート−ホスフェート緩衝剤(pH5,2)
ffi含有する200μtの基質緩衝液を添加する。2
0℃で30分間インキュベートし、そして50μtの2
 N H2SO4k添加することにより反応を停止する
。IgE濃度は492nmにおける吸光度値に反比例す
ることになろう。
実施例 V DNAハイプリダイゼゼーションによるアデノウィルス
検出は次のようにして行うことができる。
(a)2種類の区別されるアデノウィルス由来1本鎖D
NA断片の形成 これはM、 Virtanenらのr Lancet 
j、Vol、 I、p、831(i983)に記載され
ている。
(b)  M13mp7フアーゾ由来1本鎖アデノウィ
ルスDNA断片のストレゾタビジンへの接合50tti
tDxトレプタヒゾyi 1. OmOO,(NM燐酸
塩緩衝R(PBS) (pH7,5)に俗解する。攪拌
しながらN、N−ツメチルホルムアミド(DMF )中
の[lLIM  N−スクシンイミジル−8−アセチル
チオアセテ−) (SATA) 10μtを添加し、そ
して20℃で20分間インキュベートする。混合物f 
IM Tris−HCl(pHao )を用いて5ep
haciex G−25カラムを通して溶出し、そして
タンパクピーク画分を約1.0gに濃縮する。
1HIのDNA ’i 100 litの2M NH2
NH2/ I M NaH3O3(pH6,3)に混合
しそして67℃で75分間インキュベートする。1.4
 rnlの0.1M燐酸ナトリウム緩衝液(p)17.
6)?添加し、そして2回にわ友つこの緩衝液(i,C
1)に対して24時間透析する。次いでQ、05 M 
NaCjに対して更に12時間透析する。誘導体化し;
I’(DNA ’i過剰エタノールで析出させそして洗
浄し、そして100μtの1MTrim−EC/、 (
plan)に再溶解する。
1.0ntノIM Tris−4(ct(pHaO)中
(7) 5ATA誘導体化ストレゾタビジン12η’!
r 4. OWのブロモピルビン酸で処理し、そして1
5分間インキュベートする。調製され友?リヌクレオチ
ド5■と混合しそして20℃で1時間放置する。ストレ
ゾタビジン標識グローブを(i015Mクエン酸ナトリ
ウムを含む0.15M NaCL(SSC) t”用い
て5ephadex G−100カラムで浴出する。
(c)  サンドイッチハイブリダイゼーションpBR
322プラスミドDNA f Q、 3 NaOH中1
0中上00℃間変性する。0℃に冷却し、そして等量の
2M酢酸アンモニウムと混合する◎6關ニトロセルロー
スフィルタ(i50nf/フイルタ)にかける。ハイブ
リダイゼーションする前にフィルタをα015Mクエン
酸ナトリウム含有0.15NaCt(ssc)、0.0
2%フィコールお工び(L25*SDSと予めインキュ
ベートする。試料のDNA i7 mM NaOH中で
5分間沸騰させることにより変性させる。冷却および中
和後、0.021フイコールおよびストレゾタピジン標
識グローブを含有するSSC中で1=4に希釈する。各
)・イブリダイゼーション反応系は、固定化されたDN
A ’に有するフィルタおよび400μtの試料/プロ
ーブ混合物を含有する。37℃で16時間インキュベー
トする。フィルタt−(LO2%フィコールおよびビオ
チン標識ペルオキシダーゼを含むSSC中、20℃で2
時間中分洗浄する。フィルタを[LO2%フィコール含
有SSCで十分洗浄し、そして10mMイミダゾール含
有Q、 I M Tris −HCL(pH7,4) 
10m、10μtの30チH2O2および2ゴエタノー
ル中の3,3′−ジアニシジン中で展開する。フィルタ
1&:Tris −HCL中ですすぎそして保存する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)リガンドを含有すると思われる媒質中のリガンドを
    測定する方法であつて、 (a)そのリガンドに対する特異結合物質を含有する不
    溶相を用意し、 (b)その不溶相を次の試薬、すなわち、 (i)リガンドを含有すると思われる媒質、(ii)(
    a′)アビジン試薬と共有結合的に連結した当該リガン
    ドに対する特異結合物質、 (b′)ビオチン標識酵素と複合した前記試薬(a′)
    、(c′)アビジンに連結したリガンド、または(d′
    )ビオチン標識酵素と複合した試薬(c′)よりなる群
    より選択される試薬、および (iii)前記試薬が(a′)または(c′)である場
    合にはビオチン標識酵素 とインキュベートし、 (c)インキュベーション後、未反応試薬を前記不溶相
    から分離し、そして (d)前記分離された未反応試薬または前記分離された
    不溶相の酵素活性を測定してリガンドを測定することよ
    りなる前記方法。 2)段階(b)において、前記不溶相を、ビオチン標識
    酵素に結合されたアビジン試薬に共有結合的に連結した
    前記特異結合物質とインキュベートする、特許請求の範
    囲第1項記載の方法。 3)段階(b)において、前記不溶相を、ビオチン標識
    酵素に結合されたアビジンに連結したリガンドとインキ
    ュベートする、特許請求の範囲第1項記載の方法。 4)段階(b)が前記不溶相を、試薬(i)、(ii)
    および場合により試薬(iii)と相互の存在下にイン
    キュベートすることよりなる特許請求の範囲第1〜3項
    のいずれか1項に記載の方法。 5)段階(b)が、前記不溶相を試薬(i)、(ii)
    および場合により試薬(iii)と示された順序でイン
    キュベートすることよりなる特許請求の範囲第1〜3項
    のいずれか1項に記載の方法。 6)更に、段階(c)において各インキュベーションの
    後、未反応試薬を前記不溶相から分離し、そして段階(
    d)が前記不溶相かまたは分離された未反応ビオチン標
    識酵素の酵素活性を測定することよりなる特許請求の範
    囲第5項記載の方法。 7)前記リガンドが、抗原、抗体、ハプテン、または生
    物中に受容体を有する他の物質よりなる群より選択され
    る特許請求の範囲第1〜3項のいずれか1項に記載の方
    法。 8)前記不溶相、前記試薬(ii)および場合により前
    記試薬(iii)が、インキュベーションの際それぞれ
    液体媒質中のリガンド総量に対し過剰に存在する特許請
    求の範囲第1〜6項のいずれか1項に記載の方法。 9)リガンドを含有すると思われる媒質中のリガンドを
    測定する方法であつて、 (a)そのリガンドに対する特異結合物質を含有する不
    溶相を用意し、 (b)その不溶相を次の試薬、すなわち、 (i)(A)前記リガンドを含有すると思われる液体媒
    質および(B)(a′)アビジン標識試薬と共有結合的
    に結合した、当該リガンド に対する特異結合物質、(b′)ビオチン標識酵素と連
    結した前記試薬(a′)、(c′)アビジンと標識され
    たリガンド、または(d′)ビオチン標識酵素と連結し
    た前記試薬(c′)よりなる群より選択される既知量の
    試薬、および場合により (ii)酵素標識アビジンとインキュベートし、 (c)インキュベーション後、未反応試薬を前記不溶相
    から分離し、そして (d)前記不溶相または分離された未反応試薬の酵素活
    性を測定しそれによつて前記活性を前記液体媒質中のリ
    ガンド量に関係づけることよりなる前記方法。 10)段階(b)において前記既知量の(B)が試薬(
    b′)よりなる特許請求の範囲第9項記載の方法。 11)段階(b)において前記既知量の(B)が試薬(
    d′)よりなる特許請求の範囲第9項記載の方法。 12)段階(b)が、前記不溶相を試薬(i)および場
    合により(ii)と相互の存在下にインキュベートする
    ことよりなる特許請求の範囲第9項記載の方法。 13)段階(b)が、前記不溶相を試薬(i)および場
    合により(ii)と示された順序でインキュベートする
    ことよりなり、段階(c)が未反応試薬を各インキュベ
    ーション後に前記不溶相から分離することよりなり、そ
    して段階(d)が前記不溶相かまたは分離された未反応
    ビオチン標識酵素の酵素活性を測定することよりなる特
    許請求の範囲第9項記載の方法。 14)前記リガンドが、抗原、抗体、ハプテン、または
    生物中に受容体を有する他の物質よりなる群より選択さ
    れる特許請求の範囲第8〜10項のいずれか1項に記載
    の方法。 15)前記測定すべきリガンド、前記試薬(a′)また
    は前記試薬(b′)および場合により試薬(ii)がイ
    ンキュベーションの際それぞれ前記不溶相に対し過剰に
    存在し、そして試薬(a′)または(b′)の量は、液
    体媒質中の測定すべきリガンドの最低量を超えない特許
    請求の範囲第9〜13項のいずれか1項に記載の方法。 16)(a)当該リガンドに対する特異結合物質、(b
    )結合剤と反応させることにより前記特異結合物質に共
    有結合されたアビジン標識基、および (c)前記共有結合されたアビジン標識基に結合したビ
    オチン標識酵素基よりなるリガンド測定用試薬。 17)結合試薬が式R^1−S−S−A−Z〔式中R^
    1は2−ピリジル、5−ニトロ−2−ピリジルまたは4
    −ピリジルであり、Aは1〜10個の炭素原子を有する
    炭化水素残基であり、そしてZは▲数式、化学式、表等
    があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼また
    は▲数式、化学式、表等があります▼ (式中nは2または3であり、R^1は前記R^1と同
    じ意味を有しまたそれに等しく、そしてR^2はメチル
    またはエチルである)から選択される基またはこれらの
    基の酸付加塩である〕で示される化合物である特許請求
    の範囲第16項記載の試薬。 18)前記結合試薬がN−スクシンイミジル−3−(2
    −ピリジルチオ)プロピオネートである特許請求の範囲
    第16項記載の試薬。
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