JPS59142466A - 抗原決定基具有物質の測定方法 - Google Patents
抗原決定基具有物質の測定方法Info
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- JPS59142466A JPS59142466A JP1543583A JP1543583A JPS59142466A JP S59142466 A JPS59142466 A JP S59142466A JP 1543583 A JP1543583 A JP 1543583A JP 1543583 A JP1543583 A JP 1543583A JP S59142466 A JPS59142466 A JP S59142466A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関する
ものである。
ものである。
患者に投与されている薬物、例えばジゴキシン、テオフ
ィリンなどの血中濃度を測定することは適正な治療を進
めるうえで重要であシ、また、癌など各種の疾患に由来
する成分を検診者の血液から検出することは当該疾患の
早期発見を行なう点で極めて有効である。
ィリンなどの血中濃度を測定することは適正な治療を進
めるうえで重要であシ、また、癌など各種の疾患に由来
する成分を検診者の血液から検出することは当該疾患の
早期発見を行なう点で極めて有効である。
そこで、血液のこれらの微量成分を検出する方法が種々
開発されているが、感度、特異性、大量検体の短時間処
理などの点にすぐれる酵素免疫測定法が賞月されている
。しかしながら、従来の酵素免疫測定法の場合には、未
だ感度が充分とはいえず、また洗浄操作が繁雑であった
り、チーーゾの移しかえが必要であったりして正確な濃
度を求めることが容易でなかった。
開発されているが、感度、特異性、大量検体の短時間処
理などの点にすぐれる酵素免疫測定法が賞月されている
。しかしながら、従来の酵素免疫測定法の場合には、未
だ感度が充分とはいえず、また洗浄操作が繁雑であった
り、チーーゾの移しかえが必要であったりして正確な濃
度を求めることが容易でなかった。
そこで本発明者らは、さらに感度を高めかつ繁雑な操作
を少ない分析方法を開発するべく検討を進め、ビオチン
ーアビソン系の反応を利用した酵素免疫測定方法を案出
するに至った。そして、この方法を用いれば血中の微量
成分を極めて高感度で測定できしかも操作もより簡便に
なることを見出して、本発明を完成した。
を少ない分析方法を開発するべく検討を進め、ビオチン
ーアビソン系の反応を利用した酵素免疫測定方法を案出
するに至った。そして、この方法を用いれば血中の微量
成分を極めて高感度で測定できしかも操作もより簡便に
なることを見出して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、検体に含１れる抗原決定基具有物質
（１）と、この抗原決定基具有物質（１）と少なくとも
−の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有物質（２）
とビオチン又はその誘導体であってアビジンもしくはス
トレプトアビジンと結合しうるものとの結合物とを、溶
液中で前記の共通の抗原決定基と反応する抗体と接触せ
しめて反応させ、この反応物を、ビオチン酵素と、アビ
ジン、ストレプトアビジン又はこれらの誘導体であって
ビオチンと結合しうるものとに、接触せしめ、その後ビ
オチン酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定
基具有物質の測定方法に関するものである。
（１）と、この抗原決定基具有物質（１）と少なくとも
−の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有物質（２）
とビオチン又はその誘導体であってアビジンもしくはス
トレプトアビジンと結合しうるものとの結合物とを、溶
液中で前記の共通の抗原決定基と反応する抗体と接触せ
しめて反応させ、この反応物を、ビオチン酵素と、アビ
ジン、ストレプトアビジン又はこれらの誘導体であって
ビオチンと結合しうるものとに、接触せしめ、その後ビ
オチン酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定
基具有物質の測定方法に関するものである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる抗原決定
基具有物質（１）である。検体の種類は限定されないが
、例えば血清、尿などである。血清、尿などの場合は、
通常は特別な前処理を必要とせず、その′＝１ま測定を
行カうことができる。
基具有物質（１）である。検体の種類は限定されないが
、例えば血清、尿などである。血清、尿などの場合は、
通常は特別な前処理を必要とせず、その′＝１ま測定を
行カうことができる。
抗原決定基具有物質（１）はリガンドとも呼ばれており
、例えば、ジゴキシン、テオフィリン、フェニトインな
どの合成医薬品、被ニジリン、アミカシン、ゲンタマイ
シンなどの抗生物質、インンーリン、ＴＳＨＸ Ｔ４、
ゾロスタグランソン、ＩｇＧ。
、例えば、ジゴキシン、テオフィリン、フェニトインな
どの合成医薬品、被ニジリン、アミカシン、ゲンタマイ
シンなどの抗生物質、インンーリン、ＴＳＨＸ Ｔ４、
ゾロスタグランソン、ＩｇＧ。
２−フェトプロティン、グリコリピッド類、ＨＢｓ抗原
、ガン抗原などを含む。抗原決定基具有物質（１）に含
まれる抗原決定基の数はひとつであってもよく、二以上
であってもよい。
、ガン抗原などを含む。抗原決定基具有物質（１）に含
まれる抗原決定基の数はひとつであってもよく、二以上
であってもよい。
この抗原決定基具有物質（１）とともに後述する抗体に
対して反応させるものは、抗原決定基具有物質（１）と
少なくとも−の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有
物質（２）とビオチン又はその誘導体であってアビジン
もしくはストレフ０トアビノンと結合しうるものとの結
合物である。抗原決定基具有物質（２）も抗原決定基を
−又は二重上具有している。
対して反応させるものは、抗原決定基具有物質（１）と
少なくとも−の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有
物質（２）とビオチン又はその誘導体であってアビジン
もしくはストレフ０トアビノンと結合しうるものとの結
合物である。抗原決定基具有物質（２）も抗原決定基を
−又は二重上具有している。
そして、抗原決定基具有物質（２）は抗原決定基具有物
質（１）とともに共通の抗体に対して抗原抗体反応させ
るところから、両者は少なくとも−の抗原決定基が共通
しており、抗体はこの共通の抗原決定基に対するもので
なければならない。抗原決定基具有物質（２）の抗原決
定基は一以上が共通であればよく、全てが共通であって
もよい。従って、抗原決定基具有物質（２）は抗原決定
基具有物質（１）と同一であってもよい。
質（１）とともに共通の抗体に対して抗原抗体反応させ
るところから、両者は少なくとも−の抗原決定基が共通
しており、抗体はこの共通の抗原決定基に対するもので
なければならない。抗原決定基具有物質（２）の抗原決
定基は一以上が共通であればよく、全てが共通であって
もよい。従って、抗原決定基具有物質（２）は抗原決定
基具有物質（１）と同一であってもよい。
ビオチン誘導体はアビジンもしくはストレプトアビジン
と結合しうるものでアシ、例えばビオシチン、ｄ−デス
チオビオチン、ｄｌ−デスチオビオチン、２′−チオビ
オチン、ｄｌ−デスチオビオチノール、ビスノルビオチ
ン、ビスノルデスビオチンなどである。
と結合しうるものでアシ、例えばビオシチン、ｄ−デス
チオビオチン、ｄｌ−デスチオビオチン、２′−チオビ
オチン、ｄｌ−デスチオビオチノール、ビスノルビオチ
ン、ビスノルデスビオチンなどである。
抗原決定基具有物質（２）とビオチンあるいはその誘導
体との結合方法は、抗原決定基具有物質（２）とビオチ
ンの双方の官能基を考慮して決定すればよい。ビオチン
は通常はカルボキシル基を利用するのが好ましい。一方
抗原決定基具有物質（２）のほうはアミン基、水酸基、
チオール基、イミダゾール基、フェニル基などを利用す
ればよい。例えば、ビオチンのカルボキシル基をサクシ
ンイミドエステル化する。これは活性化エステルであり
、抗原決定基具有物質（２）が蛋白質である場合には、
アミン基と反応して安定なベゾチド結合を形成するＯこ
の方法は抗原決定基具有物質（２］がアミノ基を有する
ものであれば蛋白質に限らず適用できることはいうまで
もない。
体との結合方法は、抗原決定基具有物質（２）とビオチ
ンの双方の官能基を考慮して決定すればよい。ビオチン
は通常はカルボキシル基を利用するのが好ましい。一方
抗原決定基具有物質（２）のほうはアミン基、水酸基、
チオール基、イミダゾール基、フェニル基などを利用す
ればよい。例えば、ビオチンのカルボキシル基をサクシ
ンイミドエステル化する。これは活性化エステルであり
、抗原決定基具有物質（２）が蛋白質である場合には、
アミン基と反応して安定なベゾチド結合を形成するＯこ
の方法は抗原決定基具有物質（２］がアミノ基を有する
ものであれば蛋白質に限らず適用できることはいうまで
もない。
抗原決定基具有物質（２）がチオール基を有している場
合には、上記のビオチン活性化エステルにシスティンを
反応させてチオール基を導入した後、チオール基反応性
二価架橋試薬を用いて結合物を得ることができる。
合には、上記のビオチン活性化エステルにシスティンを
反応させてチオール基を導入した後、チオール基反応性
二価架橋試薬を用いて結合物を得ることができる。
ビオチン活性化エステルにジアミンを反応させればアミ
ノ化ビオチンが合成される。このアミン基と抗原決定基
具有物質（２）のアミン基とを架橋させる方法は、ソイ
フシアネート法、一段階グルタルアルデヒド法、ジフル
オロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知られている
。また、このアミノ化ビオチンと抗原決定基具有物質（
２）のカルボキシル基を結合する架橋法もカルボジイミ
ド法、ウッドワード試薬法等が知られている。さらに、
アミン基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（ＮＢｋａ
ｎｅ法）もある。フェニル基を利用する方法としてはジ
アゾ化法、アルキル化法などがある。
ノ化ビオチンが合成される。このアミン基と抗原決定基
具有物質（２）のアミン基とを架橋させる方法は、ソイ
フシアネート法、一段階グルタルアルデヒド法、ジフル
オロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知られている
。また、このアミノ化ビオチンと抗原決定基具有物質（
２）のカルボキシル基を結合する架橋法もカルボジイミ
ド法、ウッドワード試薬法等が知られている。さらに、
アミン基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（ＮＢｋａ
ｎｅ法）もある。フェニル基を利用する方法としてはジ
アゾ化法、アルキル化法などがある。
本発明の方法に用いる結合物はこれらの方法によって合
成することができる。
成することができる。
反応後はケ゛ル濾過、カチオン交換樹脂、アニオン交換
樹脂などを用いたイオン交換クロマトグラフィー、シリ
カケ８ル、ポーラスポリマー々どを用いた吸着剤処理、
薄層クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製を
打力い、必要により凍結乾燥等で乾燥する。
樹脂などを用いたイオン交換クロマトグラフィー、シリ
カケ８ル、ポーラスポリマー々どを用いた吸着剤処理、
薄層クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製を
打力い、必要により凍結乾燥等で乾燥する。
抗原決定基具有物質（１）及び抗原決定基具有物質（２
）に共通の抗原決定基と反応する抗体は抗原決定基具有
物質（１）、抗原決定基具有物質（２）もしくは前記の
結合物又はこれらのいずれかと蛋白との結合物を兎、山
羊、馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に体重Ｉ
Ｋｇあたり０３〜２ ｍｇを１〜数回背中皮下、フッ
ト・ぐラド、大腿筋等にアノ−バントとともに注射して
当該動物の体内に形成させる。
）に共通の抗原決定基と反応する抗体は抗原決定基具有
物質（１）、抗原決定基具有物質（２）もしくは前記の
結合物又はこれらのいずれかと蛋白との結合物を兎、山
羊、馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に体重Ｉ
Ｋｇあたり０３〜２ ｍｇを１〜数回背中皮下、フッ
ト・ぐラド、大腿筋等にアノ−バントとともに注射して
当該動物の体内に形成させる。
この抗体は血清をその一！ま用いてもよく、血清から抗
体すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法によっ
て精製してから用いてもよい。
体すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法によっ
て精製してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジ−パントとともに数回腹腔等に注射し、牌臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジ−パントとともに数回腹腔等に注射し、牌臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
検体に含まれる抗原決定基具有物質（１）と、前記の結
合物とを溶液中でこの抗体に接触させる。接触時の結合
物の量は検体中に予想される抗原決定基具有物質（１）
の最大量と同量程度がよく、抗体は結合物との結合定数
等によって異なるが例えば結合物に対し１〜５倍モル程
度がよい。抗原決定基具有物質の量は、例えば０．０
Ｉ ｎ９〜］、 ｍ９程度が適当であシ、その場合、結
合物は１ ｎｇ〜ｌ ｍｇ程度、そして抗体は１μｇ〜
１０ｍ？程度が通常適当である。
合物とを溶液中でこの抗体に接触させる。接触時の結合
物の量は検体中に予想される抗原決定基具有物質（１）
の最大量と同量程度がよく、抗体は結合物との結合定数
等によって異なるが例えば結合物に対し１〜５倍モル程
度がよい。抗原決定基具有物質の量は、例えば０．０
Ｉ ｎ９〜］、 ｍ９程度が適当であシ、その場合、結
合物は１ ｎｇ〜ｌ ｍｇ程度、そして抗体は１μｇ〜
１０ｍ？程度が通常適当である。
溶液のＰＨは４〜８５程度にするのがよく、そのために
必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を
用いてもよい。温度は抗原決定基具有物質（１）、結合
物及び抗体のいずれもが失活しなければよいわけである
が、２０〜４５℃程度にすればよい。抗原決定基具有物
質（１）と抗体及び結合物と抗体との接触時間はいずれ
も、通常は抗体が検体由来の抗原決定基具有物質（１）
あるいは結合物中の抗原決定基具有物質（２）部分と充
分に反応しうる程度がよく、例えば３７℃の場合には２
０〜６０分間程度が適当である。抗体に対する抗原決定
基具有物質（１）及び結合物の接触順序は問うところで
はなく、いずれが先であってもあるいは同時であっても
よい。
必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を
用いてもよい。温度は抗原決定基具有物質（１）、結合
物及び抗体のいずれもが失活しなければよいわけである
が、２０〜４５℃程度にすればよい。抗原決定基具有物
質（１）と抗体及び結合物と抗体との接触時間はいずれ
も、通常は抗体が検体由来の抗原決定基具有物質（１）
あるいは結合物中の抗原決定基具有物質（２）部分と充
分に反応しうる程度がよく、例えば３７℃の場合には２
０〜６０分間程度が適当である。抗体に対する抗原決定
基具有物質（１）及び結合物の接触順序は問うところで
はなく、いずれが先であってもあるいは同時であっても
よい。
抗体と検体中の抗原決定基具有物質（１）及び結合物中
の抗原決定基具有物質（２）部分とは溶液中で接触させ
れば反応する。
の抗原決定基具有物質（２）部分とは溶液中で接触させ
れば反応する。
次にこの反応物、すなわち抗体と抗原決定基具有物質（
１）との反応物及び抗体と結合物との反応物を含むもの
をビオチン酵素と、アビジン、ストレプトアビジン又は
これらの誘導体であってビオチンと結合しうるものとに
接触せしめる。ビオチン酵素は活性中心にビオチン基を
もっているものであって、グロビオニルＣｏＡカルボキ
シラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン
酸カルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡカルボキシ
ラーゼ、メチルマロニルＣｏＡトランスカルボキシ）−
ゼ、メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ等種々の
ものが知られているが、そのいずれであっても用いるこ
とができる。ビオチン酵素は純品であってもよく、本発
明の方法を阻害しない範囲で不純物を含んでいてもよい
。ビオチン酵素の量は結合物のアビジン又はストレプト
アビジンに対する結合定数等によって異なるが結合物に
対するモル比で例えば０．２〜２．５程度が適当である
。ビオチン酵素は要は反応物と接触させることができれ
ばよく、その添加時期は問わない。すなわち、抗原決定
基具有物質（１）及び結合物と抗体を反応させる以前か
ら溶液に添加しておいてもよく、また、反応物をアビノ
ン等と接触させたのちに添加してもよい。
１）との反応物及び抗体と結合物との反応物を含むもの
をビオチン酵素と、アビジン、ストレプトアビジン又は
これらの誘導体であってビオチンと結合しうるものとに
接触せしめる。ビオチン酵素は活性中心にビオチン基を
もっているものであって、グロビオニルＣｏＡカルボキ
シラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン
酸カルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡカルボキシ
ラーゼ、メチルマロニルＣｏＡトランスカルボキシ）−
ゼ、メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ等種々の
ものが知られているが、そのいずれであっても用いるこ
とができる。ビオチン酵素は純品であってもよく、本発
明の方法を阻害しない範囲で不純物を含んでいてもよい
。ビオチン酵素の量は結合物のアビジン又はストレプト
アビジンに対する結合定数等によって異なるが結合物に
対するモル比で例えば０．２〜２．５程度が適当である
。ビオチン酵素は要は反応物と接触させることができれ
ばよく、その添加時期は問わない。すなわち、抗原決定
基具有物質（１）及び結合物と抗体を反応させる以前か
ら溶液に添加しておいてもよく、また、反応物をアビノ
ン等と接触させたのちに添加してもよい。
アビジン及びストレプトアビジンはビオチンと結合しう
ろことはいうまでもないが、これらの誘導体もビオチン
と結合しうるものであれば用いることができる。誘導体
の例としてはアビジンあるいはストレプトアビジンを無
水酢酸などでアセチル化したものなど、一般の化学修飾
剤で処理したものを挙げることができる。誘導体はビオ
チンとの結合定数の小さいもののほうが本発明に好適で
ある。アビノン、ストレプトアビジン及びこれらの誘導
体はいずれも純品であってもよく、本発明の方法を阻害
しない範囲で不純物を含んでいてもよい。これらは通常
は単一で使用するが、併用してもよい。添加量は結合物
に対するモル比で０．２〜２倍程度が適当である。
ろことはいうまでもないが、これらの誘導体もビオチン
と結合しうるものであれば用いることができる。誘導体
の例としてはアビジンあるいはストレプトアビジンを無
水酢酸などでアセチル化したものなど、一般の化学修飾
剤で処理したものを挙げることができる。誘導体はビオ
チンとの結合定数の小さいもののほうが本発明に好適で
ある。アビノン、ストレプトアビジン及びこれらの誘導
体はいずれも純品であってもよく、本発明の方法を阻害
しない範囲で不純物を含んでいてもよい。これらは通常
は単一で使用するが、併用してもよい。添加量は結合物
に対するモル比で０．２〜２倍程度が適当である。
抗原決定基具有物質（１）及び結合物と抗体との反応物
をビオチン酵素及びアビジン等と接触させる際のＰＨ及
び温度はアビジン等とビオチン酵素及び結合物中のビオ
チンが反応しやすい範囲がよく、ＰＨは４〜８．５程度
、そして、温度は２０〜４５℃程度が適当である。また
、接触時間はビオチン酵素及び結合物中のビオチンとア
ビジン等との反応が充分に行なわれる程度がよく、例え
ば３７℃の場合には１０〜６ｏ分間程度が適当である。
をビオチン酵素及びアビジン等と接触させる際のＰＨ及
び温度はアビジン等とビオチン酵素及び結合物中のビオ
チンが反応しやすい範囲がよく、ＰＨは４〜８．５程度
、そして、温度は２０〜４５℃程度が適当である。また
、接触時間はビオチン酵素及び結合物中のビオチンとア
ビジン等との反応が充分に行なわれる程度がよく、例え
ば３７℃の場合には１０〜６ｏ分間程度が適当である。
これらの接触を行なわせたのちには、ビオチン酵素の活
性を測定してアビジン等と反応しなかったビオチン酵素
の量を求める。酵素活性の測定方法は公知の方法に従っ
て行なえばよく、例えばプロピオニルＣｏＡカル？キシ
ラーゼの場合には反応系で生じるＡＤＰをピルビン酸キ
ナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼによ多共役させ、その際
のＮＡＤＨの減少として活性を測定できる。
性を測定してアビジン等と反応しなかったビオチン酵素
の量を求める。酵素活性の測定方法は公知の方法に従っ
て行なえばよく、例えばプロピオニルＣｏＡカル？キシ
ラーゼの場合には反応系で生じるＡＤＰをピルビン酸キ
ナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼによ多共役させ、その際
のＮＡＤＨの減少として活性を測定できる。
メチルマロニルＣｏＡ ）ランスカルボキシラーゼの場
合には生成したオキザロ酢酸をリンゴ酸デヒドロゲナー
ゼの共役によってリンゴ酸に変え、その際のＮＡＤＨの
減少量を測定することによって活性値を求めることがで
きる。
合には生成したオキザロ酢酸をリンゴ酸デヒドロゲナー
ゼの共役によってリンゴ酸に変え、その際のＮＡＤＨの
減少量を測定することによって活性値を求めることがで
きる。
また、プロピオニルＣｏＡ力ルポキシラーゼヲ用いた場
合には、逆反応によってＡＴＰを生成させて、これをル
シフェラーゼ及びルシフェリンの共存下で反応させると
生物発光する。そこで、これをフォトンカウンターで測
定することによって１ｏ −１５Ｍ以下のＡＴＰを定量
できる。この方法を用いればさらに極微量の抗原決定基
具有物質（１）を定量することが可能である。
合には、逆反応によってＡＴＰを生成させて、これをル
シフェラーゼ及びルシフェリンの共存下で反応させると
生物発光する。そこで、これをフォトンカウンターで測
定することによって１ｏ −１５Ｍ以下のＡＴＰを定量
できる。この方法を用いればさらに極微量の抗原決定基
具有物質（１）を定量することが可能である。
本発明の方法は抗原決定基具有物質（１）を極めて高感
度で測定できる。例えばビオチンそのものとアビジンそ
のものを用いた場合には１０−１１グラムの抗原決定基
具有物質（１）を定量することが可能である。本発明の
方法は、そのほか操作が簡便であり安価かつ容易に抗原
決定基具有物質（１）を定量することが可能である。
度で測定できる。例えばビオチンそのものとアビジンそ
のものを用いた場合には１０−１１グラムの抗原決定基
具有物質（１）を定量することが可能である。本発明の
方法は、そのほか操作が簡便であり安価かつ容易に抗原
決定基具有物質（１）を定量することが可能である。
以下、実施例を示す。
実施例１ ヒトＩｇＧの測定
ｉ）ヒトＩｇＧ−ビオチン結合物の調製ビオチン５０■
をジメチルスルホキシド５ｍ１に懸濁し、Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミド２５１ｎｇを加えて４℃に冷却した。
をジメチルスルホキシド５ｍ１に懸濁し、Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミド２５１ｎｇを加えて４℃に冷却した。
この混合物にジシクロへキシルカルボジイミド５０■を
攪拌しつつ加工、２時間攪拌後４℃で一夜放置した。沈
澱物を沢別し、ｐ液から溶媒を減圧下で留去した。残渣
に少量のニーデルを加え、結晶化物をグラスフィルター
で集めてエーテルで洗浄した。これによりビオチンサク
シンイミドエステル３０ｍ９を得だ。
攪拌しつつ加工、２時間攪拌後４℃で一夜放置した。沈
澱物を沢別し、ｐ液から溶媒を減圧下で留去した。残渣
に少量のニーデルを加え、結晶化物をグラスフィルター
で集めてエーテルで洗浄した。これによりビオチンサク
シンイミドエステル３０ｍ９を得だ。
一方、ヒトＩｇＧ ２０．ｍ９を０．１Ｍ炭酸緩衝液（
ｐＨ８，０）４ｍ／に溶かし、上記のビオチンサクシン
イミドエステルのジメチルスルホキシド溶液２．０ｍ９
／′ｍｌを２００μを加えて室温で２時間攪拌して反応
させた。反応液を予めｐＨ’７．０の２０ ｍＭ ’）
ン酸緩衝生理食塩溶液で平衡化しておいたセファデック
スＧ−２５のカラムに流し、流出液の波長２８０ｎｍに
おける吸光度を測定して流出してくる最初のピーク区分
を集めて凍結乾燥し、ヒ） ＩｇＧ−ビオチン結合物を
得た。
ｐＨ８，０）４ｍ／に溶かし、上記のビオチンサクシン
イミドエステルのジメチルスルホキシド溶液２．０ｍ９
／′ｍｌを２００μを加えて室温で２時間攪拌して反応
させた。反応液を予めｐＨ’７．０の２０ ｍＭ ’）
ン酸緩衝生理食塩溶液で平衡化しておいたセファデック
スＧ−２５のカラムに流し、流出液の波長２８０ｎｍに
おける吸光度を測定して流出してくる最初のピーク区分
を集めて凍結乾燥し、ヒ） ＩｇＧ−ビオチン結合物を
得た。
＋＋ ＞ ヒトＩｇＧの定量
ヒトＩｇＧノ濃度がｏｍｙ／ｍｅ、０．２ ｍｙ／ｍｌ
、 ０．４ｍ９ ／ ” ％ （１８ｍ９ ／ ” ％
２．０ ｍ９７ ｍｌ 、及び４．０ｍｇ／ｍｅの各
５０μｔの溶液にそれぞれヒトＩｇＧ−ビオチン結合物
０、５ ｍ９ ／ ｍｌ Ｘ７’ ｏビオ＝ ／ｌ／
ＣｏＡカイレがキシラーゼ８０μｇ／ｍｌ及び抗ヒ）Ｉ
ｇＧヤギ血清の１／２ｏ希釈液を含む溶液５０μｔを加
え、３７℃で３０分間加温した。各々に３０μｇ／ｍｌ
のアビジン溶液を１００μｔづつ加えて３７℃で１５分
間放置した。次に、４ ｍＭ ＭｇＣｌ２．２ ｍＭグ
ルタチオン（還元型）、２ ｍＭ ＡＴＰ ％ ０．
１ Ｍ ＫＣｌ１１５０ ｒｎｈｌ炭酸水素カリウム
、１ ｍＭホスホエノールピルビン酸、２５００ Ｕ／
ｌピルビン酸キナーゼ、３５ｏｏＵ／ｌ乳酸デヒドロゲ
ナーゼ、０．１５ ｍＭ ＮＡＤＨ、及び２ ｍＭグロ
ビオニルＣｏＡを含む基質溶液Ａ ｆ：１．２ ｍＡづ
つ加え、３７℃で波長３４０ ｎｍにおける吸光度を測
定し、ヒトＩｇＧの濃度とグロピオニルＣｏＡ力ルデキ
シラーゼの活性との関係を求めた。
、 ０．４ｍ９ ／ ” ％ （１８ｍ９ ／ ” ％
２．０ ｍ９７ ｍｌ 、及び４．０ｍｇ／ｍｅの各
５０μｔの溶液にそれぞれヒトＩｇＧ−ビオチン結合物
０、５ ｍ９ ／ ｍｌ Ｘ７’ ｏビオ＝ ／ｌ／
ＣｏＡカイレがキシラーゼ８０μｇ／ｍｌ及び抗ヒ）Ｉ
ｇＧヤギ血清の１／２ｏ希釈液を含む溶液５０μｔを加
え、３７℃で３０分間加温した。各々に３０μｇ／ｍｌ
のアビジン溶液を１００μｔづつ加えて３７℃で１５分
間放置した。次に、４ ｍＭ ＭｇＣｌ２．２ ｍＭグ
ルタチオン（還元型）、２ ｍＭ ＡＴＰ ％ ０．
１ Ｍ ＫＣｌ１１５０ ｒｎｈｌ炭酸水素カリウム
、１ ｍＭホスホエノールピルビン酸、２５００ Ｕ／
ｌピルビン酸キナーゼ、３５ｏｏＵ／ｌ乳酸デヒドロゲ
ナーゼ、０．１５ ｍＭ ＮＡＤＨ、及び２ ｍＭグロ
ビオニルＣｏＡを含む基質溶液Ａ ｆ：１．２ ｍＡづ
つ加え、３７℃で波長３４０ ｎｍにおける吸光度を測
定し、ヒトＩｇＧの濃度とグロピオニルＣｏＡ力ルデキ
シラーゼの活性との関係を求めた。
得られた結果を第１図に示す。
次に、各種のヒト血清をいずれも２０倍に希釈し、その
５０μｌづつを用いて上記と同様に測定を行ない、第１
図を検量線としてＩｇＧの濃度を測定した。一方、これ
に並行して従来法である５ＲＩＤ法を用いて同じヒト血
清のＩｇＧ濃度を測定した。
５０μｌづつを用いて上記と同様に測定を行ない、第１
図を検量線としてＩｇＧの濃度を測定した。一方、これ
に並行して従来法である５ＲＩＤ法を用いて同じヒト血
清のＩｇＧ濃度を測定した。
得られた結果を下表に示す。
ＩｇＧ濃度
血清 本発明法 ５ＲＩＤ法Ａ
Ｉ ５．１陥部１４．２ ｍＱＡｎｉＢ １
６．７ １６．３Ｃ１１，６１２，０ Ｄ Ｉ８，１ １８．５Ｅ
１６．２ １６．４実施例２ ジゴキシン
の測定 ジゴキシンを０〜４ ｎｇ／ｆｎｌ含有する既知濃度の
各種溶液者５０μｌに１．５μｇ／ｆａｇのジゴキシン
−ビオチン結合物溶液２５μｌ及び抗ジゴキシンウサギ
血清２５μ４を加え、３７℃で２０分間加温後１２０μ
ｇＡｌのアビジン溶液２５μｌを加え、３７℃で１０分
間加温した。次いで、１５０μｇ／ｆｎｌのプロピオニ
ルＣｏＡカルボキシラーゼ溶液２５μｌを加えて３７℃
で３０分間加温した。それから、実施例１と同じ基質溶
液Ａを１．２ ｍＡ加え、３７℃に保って３４０ ｎｍ
における吸光度を測定し、ジゴキシン濃度トグロビオニ
ルＣｏＡカルボキシラーゼの活性との関係を求めた。
Ｉ ５．１陥部１４．２ ｍＱＡｎｉＢ １
６．７ １６．３Ｃ１１，６１２，０ Ｄ Ｉ８，１ １８．５Ｅ
１６．２ １６．４実施例２ ジゴキシン
の測定 ジゴキシンを０〜４ ｎｇ／ｆｎｌ含有する既知濃度の
各種溶液者５０μｌに１．５μｇ／ｆａｇのジゴキシン
−ビオチン結合物溶液２５μｌ及び抗ジゴキシンウサギ
血清２５μ４を加え、３７℃で２０分間加温後１２０μ
ｇＡｌのアビジン溶液２５μｌを加え、３７℃で１０分
間加温した。次いで、１５０μｇ／ｆｎｌのプロピオニ
ルＣｏＡカルボキシラーゼ溶液２５μｌを加えて３７℃
で３０分間加温した。それから、実施例１と同じ基質溶
液Ａを１．２ ｍＡ加え、３７℃に保って３４０ ｎｍ
における吸光度を測定し、ジゴキシン濃度トグロビオニ
ルＣｏＡカルボキシラーゼの活性との関係を求めた。
得られた結果を第２図に示す。
次にジゴキシンの投与を受けている患者の血清を中心と
して各種のヒト血清各５０μｌを用い、上記と同様にし
て測定し、第２図を検量線としてジゴキシンの濃度を測
定した。得られた結果を下表に示す。従来法であるＲＩ
Ａ法で測定して得られた結果も併せて同表に示す。
して各種のヒト血清各５０μｌを用い、上記と同様にし
て測定し、第２図を検量線としてジゴキシンの濃度を測
定した。得られた結果を下表に示す。従来法であるＲＩ
Ａ法で測定して得られた結果も併せて同表に示す。
ジゴキシン濃度
血清 本発明法 ＲＩＡ法１
０、Ｏｎｇ／Ｍ Ｏ，Ｏｎｇ７ｆｎｌ１２
１．１ ０．９３ １．８
１．６４ ０．９
１．０５ ０．３１ ０．２８
６ １、８ １．７７
０．２１ ０
．１９実施例３ インシーリンの測定 １）インシーリン−ビスノルビオチン結合物の調製 インシュリン５■をｐＨ８，０の０．１Ｍ炭酸緩衝液に
溶解し、ビスノルビオチンのサクシンイミドエステル２
００μｇをジオキサン１００μｌに溶かした溶液を加え
た。３７℃にて１時間攪拌後セファデックスＧ−２５を
用いてダル濾過し、未反応のビスノルビオチンを除去し
た。ボイドに溶出されたインシ二すンービスノルビオチ
ン結合物を凍結乾燥した。
０、Ｏｎｇ／Ｍ Ｏ，Ｏｎｇ７ｆｎｌ１２
１．１ ０．９３ １．８
１．６４ ０．９
１．０５ ０．３１ ０．２８
６ １、８ １．７７
０．２１ ０
．１９実施例３ インシーリンの測定 １）インシーリン−ビスノルビオチン結合物の調製 インシュリン５■をｐＨ８，０の０．１Ｍ炭酸緩衝液に
溶解し、ビスノルビオチンのサクシンイミドエステル２
００μｇをジオキサン１００μｌに溶かした溶液を加え
た。３７℃にて１時間攪拌後セファデックスＧ−２５を
用いてダル濾過し、未反応のビスノルビオチンを除去し
た。ボイドに溶出されたインシ二すンービスノルビオチ
ン結合物を凍結乾燥した。
肋 インシーリンの定量
インシーリンの濃度が０μＵ／ｆｎｉ 、Ｉ ＱμＵ／
ｆｎｌ 。
ｆｎｌ 。
２０ ｐＵ７ｆｎｌ、 ４０ ｔｉＵ、Ａｎ１４．８０
ｔｔＵ７ｆｎｉ、１６０１ｔＵ／ｆｎｉ及び３２０μ
ＩＪ７ｆｎｉの溶液を各５０μｌ宛試験管にとりこれに
各々２０μｇのインシーリン−ビスノルビオチン結合、
物を含む５０μｌの溶液を加えた。３７℃で３０分間加
温後、各々に１５μｇのストレグトアビ・シンを含有す
る１００μｌの溶液を加え、１ｏ分後に各々に４０μｇ
のメチルマロニルＣｏＡ ）ランスカルボキシラーゼを
含む５０μｌの溶液を加えて３７℃で１０分間加温した
。各々にピルビン酸５ｍＭ、 リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼ２０００ Ｕ／／及びＮＡＤＨ０，２５ｍＭを含むｐ
）＋ ７．２の５０ｍＭ）リスー塩酸緩衝溶ｇ１． Ｏ
ｍｌ！宛加えて波長３４０ ｎｍにおける吸光度を測定
して、インシーリンの濃度とメチルマ０ニルＣｏＡ）ラ
ンスカルボキシラーセ活性、！： ノ関係を求めた。
ｔｔＵ７ｆｎｉ、１６０１ｔＵ／ｆｎｉ及び３２０μ
ＩＪ７ｆｎｉの溶液を各５０μｌ宛試験管にとりこれに
各々２０μｇのインシーリン−ビスノルビオチン結合、
物を含む５０μｌの溶液を加えた。３７℃で３０分間加
温後、各々に１５μｇのストレグトアビ・シンを含有す
る１００μｌの溶液を加え、１ｏ分後に各々に４０μｇ
のメチルマロニルＣｏＡ ）ランスカルボキシラーゼを
含む５０μｌの溶液を加えて３７℃で１０分間加温した
。各々にピルビン酸５ｍＭ、 リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼ２０００ Ｕ／／及びＮＡＤＨ０，２５ｍＭを含むｐ
）＋ ７．２の５０ｍＭ）リスー塩酸緩衝溶ｇ１． Ｏ
ｍｌ！宛加えて波長３４０ ｎｍにおける吸光度を測定
して、インシーリンの濃度とメチルマ０ニルＣｏＡ）ラ
ンスカルボキシラーセ活性、！： ノ関係を求めた。
得られた結果を第３図に示す。
各種ヒト血清について上記と同様に測定を行ない、第３
図を検量線としてインシーリンの濃度を測定した結果を
下表に示す。従来法であるＲＩＡ法で測定した結果も併
せて同表に示す。
図を検量線としてインシーリンの濃度を測定した結果を
下表に示す。従来法であるＲＩＡ法で測定した結果も併
せて同表に示す。
インシュリン濃度
血清 本発明法 ＲＩＡ法１ １
０ ｔｔＵ７ｆｎｌｊ ９． ＯｔｔＵ７ｆｎ
１４２ ３０
２６３ １０５
１０７４ ２８
２２ ５ 、 ２１０ ２３０
０ ｔｔＵ７ｆｎｌｊ ９． ＯｔｔＵ７ｆｎ
１４２ ３０
２６３ １０５
１０７４ ２８
２２ ５ 、 ２１０ ２３０
第１図はヒ） ＩｇＧについて、第２図はノボキシンに
ついて、そして第３図はインシーリンについて、いずれ
も濃度とビオチン酵素の活性との関係を測定した結果を
示すものである。 特許出願人 富士臓器製薬株式会社 代理人弁理士田中政浩 第１図 ＬＡＧ ｍｅＪ／ｍｌ 第２図 ｎ９／ｍｌ −第３図 、−（九／ｍ亀
ついて、そして第３図はインシーリンについて、いずれ
も濃度とビオチン酵素の活性との関係を測定した結果を
示すものである。 特許出願人 富士臓器製薬株式会社 代理人弁理士田中政浩 第１図 ＬＡＧ ｍｅＪ／ｍｌ 第２図 ｎ９／ｍｌ −第３図 、−（九／ｍ亀
Claims (1)
- 検体に含まれる抗原決定基具有物質（１）と、この抗原
決定基具有物質（１）と少なくとも−の抗原決定基を共
通にする抗原決定基具有物質（２）とビオチン又はその
誘導体であってアビジンもしくはストレプトアビジンと
結合しうるものとの結合物とを、溶液中で前記の共通の
抗原決定基と反応する抗体と接触せしめて反応させ、こ
の反応物を、ビオチン酵素と、アビジン、ストレプトア
ビジン又はこれらの誘導体であってビオチンと結合しう
るものとに、接触せしめ、その後ビオチン酵素の活性を
測定すること、を特徴とする抗原決定基具有物質の測定
方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1543583A JPS59142466A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | 抗原決定基具有物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1543583A JPS59142466A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | 抗原決定基具有物質の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59142466A true JPS59142466A (ja) | 1984-08-15 |
Family
ID=11888716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1543583A Pending JPS59142466A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | 抗原決定基具有物質の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59142466A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61277061A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-12-08 | ヘキスト・セラニ−ズ・コ−ポレイション | リガンドの測定方法 |
| EP0289219A2 (en) * | 1987-04-27 | 1988-11-02 | FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. | Method of measuring biotin |
| WO2000028326A1 (fr) * | 1998-11-06 | 2000-05-18 | Iatron Laboratories, Inc. | Nouveaux complexes contenant de l'avidine reticulee, procede analytique dans lequel on utilise de l'avidine reticulee, reactifs et kits d'analyse |
-
1983
- 1983-02-03 JP JP1543583A patent/JPS59142466A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61277061A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-12-08 | ヘキスト・セラニ−ズ・コ−ポレイション | リガンドの測定方法 |
| EP0289219A2 (en) * | 1987-04-27 | 1988-11-02 | FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. | Method of measuring biotin |
| WO2000028326A1 (fr) * | 1998-11-06 | 2000-05-18 | Iatron Laboratories, Inc. | Nouveaux complexes contenant de l'avidine reticulee, procede analytique dans lequel on utilise de l'avidine reticulee, reactifs et kits d'analyse |
| US6787325B1 (en) | 1998-11-06 | 2004-09-07 | Iatron Laboratories, Inc. | Complexes containing crosslinked avidin, analytical method with the use of crosslinked avidin and analytical reagents and kits |
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