JPH03146864A - 尿中δ―アミノレブリン酸の免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、尿等の体液中のδ−アミノレブリン酸（以下
、ＡＬＡと略称す）の測定法に関するものである。更に
詳しくは、被検体中に含まれるＡＬＡをピロール誘導体
に変換後、該ピロール誘導体を免疫学的に定量すること
により、間接的にＡＬＡを測定する方法である。

ＡＬＡは、生体内ではサクシニルＣｏＡとグリシンとか
らＡＬＡシンセターゼの作用により生成し、ボルフォビ
リノーゲンの前駆体として存在しており、通常は血中に
極微量存在するが、鉛中毒罹患に際しては、尿中に過量
に排泄される。

尿からの２４時間あたりのＡＬＡ排泄量は、健常者で０
．５〜５　ｍｇ　、鉛中毒者で５〜７５　ｍｇに達する
。従って、尿中のＡＬＡを測定することは、鉛中毒罹患
の有無や程度を知る上で、重要な臨床的意義を有してい
る。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］従来の
測定法としては、比色法、ガスクロマトグラフ法、高速
液体クロマトグラフ法が報告されているが免疫学的な測
定法は開示されていない。

１９５６年、Ｄ、　Ｍａｕｚｅｒａｌｌ及びＳ、　Ｇｒ
ａｎｉｃｋによって報告された比色法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、　２１９．４３５．１９５６１は、ＡＬＡに
アセチルアセトンを作用させて、ピロール化合物を生成
させ、次に該ピロールをｐ−ジメチルアミノベンツアル
デヒドを含むエーリッヒ試薬を用いて発色させている。

該比色法は、エーリッヒ試薬が非常に不安定であり、か
つ呈色色調も不安定で感度が低い等の難点があった。

ガスクロマトグラフ法（Ｊ、ＭａｃＧｅｅ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、Ｍｅｄ、１７，３１，１９７７
：　Ａ、Ｇｏｒｃｈｅｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。

２１９．８８３．１９８３＋　、高速液体クロマトグラ
フ法（Ｃ。

Ｋ、Ｌｉｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
、１８５，６０５．１９７９１　は、感度は優れている
が、制定に機器が必要であったり、測定操作が複雑、測
定に長時間を要する等の問題を有し、特に多数の検体を
処理する場合には実際的な測定法ではなかった。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、上記従来の測定法における欠点を克服すべ
く、尿中δ−アミノレブリン酸の高感度で簡便な測定法
を見出すことを目的とし、鋭意研究した結果、δ−アミ
ノレブリン酸とアセチルアセトンとのＫｎｏｒｒ型縮合
物型心合物−メチル−３−アセチル−４−ピロピオン酸
ピロールとウシ血清アルブミンの結合物が、ハブテン抗
原になり得ることを見出し、該ピロールを免疫学的に測
定することにより、間接的に尿中δ−アミノレブリン酸
を高感度、簡便、迅速に測定できることを知見し、本発
明を完成するに至った。

本発明によれば、多数の検体を再現性よく測定すること
ができるので、鉛取扱作業者の健康管理に役立たせるこ
とが可能となる。

本発明においては、まず第一段階として、δ−アミルブ
リン酸をピロール誘導体に変換することが必要であるが
、δ−アミノレブリン酸にアセチルアセトンを作用させ
てピロール誘導体を生成させる工程は、比色定量法にお
いて既に用いられている操作による。

本発明は、δ−アミノレブリン酸とアセチルアセトンと
の縮合物を、免疫学的な方法、なかんずく酵素免疫測定
法（ＥＩＡ法）で測定するものであり、ピロール誘導体
の免疫学的方法による測定は、現在まで開示されていな
い新規な測定法を提供するものである。

酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は、−殻内には酵素標識抗原
、及びそれに対応する抗体、並びに被検体（非標識抗原
）を混合して、競合的抗原抗体反応を行わせしめた後、
当該抗体と結合した酵素標識抗原（Ｂ）と、当該抗体に
結合しなかった遊離の酵素標識抗原（Ｆ）とを分離し、
ＦまたはＢ中の酵素活性を測定し、予め作成しておいた
検量線から被検体中の抗原を定量することによって行わ
れる。

本発明のＥＩＡにあっては、被検体はピロール誘導体で
あり、かかる化合物は対応する抗体と特異的に結合する
が、それ自身を動物に非経口的に投与しても、対応する
抗体の生産を惹起させないちのであり、ハブテンと言わ
れるものである。

また、酵素標識抗原は、構造式（１）で表されるピロー
ル誘導体のピロール環の窒素原子にスペーサーを介し官
能基を導入し、該官能基に酵素を共有結合せしめて得ら
れた酵素標識抗原であり、抗体は、構造式（Ｉ）のピロ
ール誘導体のピロル環の窒素原子にスペーサーを介し官
能基を導入し、該官能基に高分子化合物を共有結合せし
めて得られるハブテン抗原を動物に非経口的に投与して
誘発せしめることにより得られた抗ハプテン抗体である
。

また、抗体と結合した酵素標識抗原（Ｂ）と、当該抗体
に結合しなかった遊離の酵素標識抗原（Ｆ）との分離に
おいては、二抗体法によって行われる。

ＥＩＡにおける測定感度や再現性は、被検物質と抗ハプ
テン抗体とが特異的結合能力を有しているか否か、ある
いは抗ハプテン抗体が酵素標識抗原と非標識抗原とに対
し、はぼ同等な結合能力を有するか否かに依存している
。

酵素標識抗原を得る際に、ピロール誘導体とスペーサー
を介して共有結合せしめる酵素としては構造式（Ｉ）の
ピロール誘導体にスペーサーを介して官能基を共有結合
させた後においても、基質特異性が高く、高感度であり
、かつ簡単にその活性が測定でき、しかも安定であり、
加えてその酵素の基質もしくはその酵素活性を阻害する
物質が検体中に存在しない酵素を選択する必要がある。

かかる要求を満足するものとしては、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられ、これらの中で
も特にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが好ましい。

構造式（１）のピロール類と酵素とは、ピロール環の窒
素原子にスペーサーを介して、共有結合を形成し、酵素
標識抗原となる。該スペーサーとしては、炭素数５以上
の鎖状分子が好ましい。

本発明で用いる抗ハプテン抗体は前記の如く、構造式（
Ｉ）にスペーサーを介して高分子化合物を共有結合せし
めて得られるハブテン抗原を動物に非経口的に投与して
誘発せしめたものである。

ここで高分子化合物としては、ヒト血清アルブミン、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、エデスチン等が好ましい
ものとして挙げられる。

かかる高分子化合物と構造式（Ｉ）のピロール類とをス
ペーサーを介して共有結合せしめたハブテン抗原は、前
記酵素標識抗原の調製法と、はぼ同様の方法によって得
ることができる。

このハブテン抗原をアジュバントと共にウサギまたはヤ
ギの皮肉、または皮下に注射し、対応する抗ハプテン抗
体を生産せしめる。その後、採血し、硫安分画あるいは
ゲル濾過等を行って、ＩｇＧ分画を分取することによっ
て、調製された抗ハプテン抗体を得ることができる。

かくして酵素標識抗原、抗ハプテン抗体が得られ、この
酵素標識抗原、抗ハプテン抗体ならびに被検尿を前処理
した被検体（すなわち非標識抗原）を混合し、競合的抗
原抗体反応を行わせしめた後、該抗体と結合した酵素標
識抗原（Ｂ）と結合しなかった酵素標識抗原（Ｆ）とを
分離し、ＦまたはＢ中、好ましくはＢ中の酵素活性を測
定し、あらかじめ作成しておいた検量線から、被検体中
の抗原を定量することによってピロール誘導体が定量さ
れ、間接的にδ−アミノレブリン酸量が測定されること
になる。

ＦとＢの分離は、本発明にあっては、二抗体法によって
行われ、用いられる第二抗体は、前記抗ハブテン抗体を
調製する時に用いた高分子化合物を動物に非経口的に投
与し、誘発せしめられた抗体を、更に異種の動物に非経
口的に投与して得られる抗体を用いる。

通常、第二の抗体の作成は、第一の抗体を作った動物が
ウサギであるならば、ヤギを用いて作るのが好ましい。

この第二抗体を用いてＦとＢを分離するには、第二抗体
を適当な担体に物理的に吸着させておいて、Ｂを該担体
に吸着せしめられた第二抗体と結合せしめて、不溶化す
る二抗体同相法が好適である。ここで用いる担体として
は、例えばポリスチレンボール、ポリスチレンプレート
、ポリスチレンチューブ等が挙げられる。

本発明によるＥＩＡ用のキットとしては、酵素標識抗原
、抗ハブテン抗体の他に、緩衝化剤、δ−アミノレブリ
ン酸積標準溶液酵素定量用試薬等が付加され、構成され
る。

酵素定量用試薬としては、例えば酵素活性測定用基質、
発色剤、反応停止剤等が構成要素となる。

［実施例］ 以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明するが、こ
れにより本発明の範囲が限定されるものではない。

実施例１゜ ２−メチル−３−アセチル−４−プロピオン　ピエニ生
立直羞 δ−アミノレブリン酸塩酸塩　１６．５　ｇとアセチル
アセトン１（ｌ　ｇをｐ）１４．４の緩衝液５０ｍ１中
で１００℃、１５分間加温する。冷後、メタノール７０
ｍ１を加え、析出物を含水メタノールから再結晶すると
　ｍ、ｐ、　１９５℃の２−メチル−３−アセチル−４
−プロピオン酸ピロールの結晶が２０．５　ｇ得られた
。

実施例２゜ ２−メチル−３−アセチル−４−プロピオン酸ピロール
９．７５　ｇ　、メチルプロモバレレ−１−０，９８ｇ
を５０℃で、３時間加温後、０．４Ｎ水酸化ナトリウム
・メタノール溶液１２．５　ｍｌを加え、更に２時間加
熱撹拌する。反応終了後、反応混合物を精製水約１００
　ｍｌ中に滴下すると白濁を生じ、沈殿してくるオイル
部分を少量のアセトンに溶解し、低温に放置すると、結
晶が析出する。これを吸弓濾過して白色結晶性物質を８
．８ｇ得た。

次に、該物質２．０ｇを０．５Ｎ塩酸ｌＯ％含水ジオキ
サン２０　ｍｌを３時間還流後、生成した油状物を酢酸
エチルから再結晶することにより、１−バレリアン酸−
２−メチルー３−アセチル−４−プロピオン酸ピロール
を　１．７ｇ得た。

実施例３゜ ピロール　導　−ＢＳＡの ウシ血清アルブミン３６　ｇを、水／ジオキサン（１：
１）２５０ｍＬ中に溶解し、ＩＮ水酸化ナトリウム５．
６　ｍｌを加え溶解後、４℃に冷却する。

この溶液にジオキサン６０　ｍｌ及びジメチルフォルム
アミド３　ｍｌ中の１−バレリアン酸−２−メチルー３
−アセチル−４−プロピオン酸ピロール１．７　ｇ、ト
リブチルアミン１．７　ｍｌ及びクロロ蟻酸イソブチル
エステル０．９５　ｍｌの溶液を滴加する。このバッチ
を４℃で２４時間撹拌し、その後流動する脱塩水に対し
て、透析し、透析された溶液を凍結乾燥し、ピロール誘
導体−ＢＳＡの凍乾品３１　ｇを得た。

実施例４゜ 抗ハブテン　　の“法 １ 実施例３で得たピロール誘導体−ＢＳＡｏ、５ｍｇをフ
ロイントコンプレートアジュバントと共に家兎背部皮肉
に注射し、初回免疫を行う。

その後、２週間間隔で　０２〜０．５　ｍｇの蛋白で免
疫し、免疫開始後、３〜５力月に酵素免疫測定法に使用
可能な抗血清が得られた。

実施例５゜ ０．２　ｍｌの０．０１　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５（
０，１Ｍ塩化ナトリウム、　１１１１Ｍ塩化マグネシウ
ムを含む）に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ　０．０５ｍ
ｇ（４８０Ｕ　／ｍｇｌを混合した溶液に、ジオキサン
６０　ｍｌ及びジメチルフォルムアミド　３　ｍｌ中の
１−バレリアン酸−２−メチルー３−アセチル−４−プ
ロピオン酸ピロール　１．７ｇ、トリブチルアミン　１
．７１Ｉｌｌ及びクロロ蟻酸イソブチルエステル０．９
５　ｍｌの各溶液を滴加する。このバッチを４℃で２４
時間撹拌後、流動する脱塩水に対して透析する。その後
、これをピロール誘導体−β−Ｄ−ガラクト２ シダーゼの原液として冷暗保存した。

実施例６゜ 第二　　を　　せしめた担　の　造 ウサギＴｇＧに対するヤギ抗体を（１，０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，５）で５０倍希釈し、その中にポリスチ
レンボール（ｈインチ）を４℃で、−夜浸積する。０．
０１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，６１で３回洗浄後、同
一の緩衝液中で冷暗保存した。

実施例７゜ ±Ｚ１亙旦１１ ２本の共栓試験管Ａ、Ｂを用意し、Ａに被検尿１．０　
ｍｌ　、　ＢにＡＬＡ標準液（５ｍｇ／ｌ　１１．０　
ｍｌをとる。次に、各試験管に０．５Ｍ酢酸緩衝液１．
０ｍｌを加え、更にアセチルアセトン０．２　ｍｌを加
え混和後、沸騰水中で１０分間加熱後、冷却し、その上
清をサンプルとした。

数足五羞 ２本の試験管のそれぞれに、ＡＬＡ標準液（５ｍｇ／ｌ
　ｌ　Ｏ，１ｍｌ、サンプル０．１ｍｌをとり、これに
５％ＢＳＡを含む０．０５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７５
）で８．０００倍に希釈したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
液０．０５　ｍｌを加える。更に、５％ＢＳＡを含む０
．０１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，６）で４０．０００
倍に希釈した抗血清０．０５　ｍｌを加え、よく混合し
４℃で一夜放置した。

これに０．０１　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６，６１０，
２ｍｌを混合し、そこに第二抗体を被覆したポリスチレ
ンボールを入れ、５時間室温に放置した。次に該ボール
を００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄後、
該ボールを新しい試験管に移す。

これに０．０５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５１０，２
ｍｌ　、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質である４−Ｍ
ＵＧ　（４−メチルウンベリフェリールグルコシド）溶
液０．２　ｍｌ　　（１ｍｇ／ｌｏｍｌ水）を加え、混
和後、　３７℃、　３０分間インキュベートする。

酵素反応は、０．１．Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０，３
を２．５　ｍｌ加えて停止させた。

次いで、励起波長３６０　ｎｍ蛍光波長４５０　ｎｍで
の蛍光強度を測定した。

［発明の効果］ 　５ 上述の如く、本発明に基づく尿中のδ−アミノレブリン
酸の免疫学的測定法は、特異性が高く、多数検体の分析
に適している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）尿中に含まれるδ−アミノレブリン酸を、ピロール
   誘導体に変換後、該ピロールを免疫学的に定量すること
   を特徴とする尿中δ−アミノレブリン酸の免疫学的測定
   法 ２）δ−アミノレブリン酸とアセチルアセトンとの縮合
   反応で生成される次の構造式、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表されるピロール誘導体の１位の窒素原子にスペーサ
   ーと官能基を導入した後、該官能基に酵素を共有結合せ
   しめて得られる酵素標識抗原を用いることを特徴とする
   請求項第１項記載の尿中δ−アミノレブリン酸の免疫学
   的測定法３）構造式（ I ）で表されるピロール誘導体
   の１位の窒素原子にスペーサーと官能基を導入した後、
   該官能基に高分子化合物を共有結合せしめて得られるハ
   プテン抗原を動物に非経口的に投与して誘発せしめるこ
   とにより得られる抗ハプテン抗体を用いることを特徴と
   する請求項第１項記載の尿中δ−アミノレブリン酸の免
   疫学的測定法