NL8302708A - Immunologische meetmethode en reagens. - Google Patents

Description

V

r <t * VO 5003

Immunologische meetmethode en reagens.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het gelijktijdig meten van de totale hoeveelheid van twee of meer verschillende stoffen aanwezig in één monster alsmede een reagens daarvoor.

Dank zij recente vooruitgangen in klinisch onderzoek is een 5 nauwkeurige diagnose en behandeling van diverse ziekten mogelijk geworden door het meten van een aantal klinische punten en een juiste beoordeling van de resultaten daarvan. Bij de tegenwoordige immuno-chemische metingen neemt een proef omtrent een enkel punt echter veelal ±1-4 dagen in beslag, terwijl een groot aantal dagen nodig is voor het 10 beproeven van een aantal punten, zodat soms benodigde punten worden weggelaten uit vrees dat een benodigde medische behandeling van de patiënt te laat zou komen .Onder deze omstandigheden bestaat de moge-' lijkheid, dat de behandeling van de patiënt niet altijd optimaal is.

Bij kanker neemt men bijvoorbeeld aan, dat een meting van diverse 15 tumormerkmiddelen bruikbaar zijn voor een vroege diagnose, begrip omtrent de mate van de ziekte en beoordeling van het therapeutische effect, beoordeling omtrent een terugkeer van de ziekte enz. In een dergelijk geval is het effectiever en nauwkeuriger een aantal tumor-merkstoffen te meten en uit de resultaten daarvan een oordeel te vor-20 men, dan te oordelen op grond van een meting van een enkele tumor-merkstof. Het neemt echter vele dagen in beslag om een aantal tumor-merkstoffen te meten. Voorts wordt daarbij de benodigde hoeveelheid van een monster (hoofdzakelijk serum, plasma, enz.) noodzakelijkerwijze verhoogd, hetgeen voor de patiënt ongunstig is.

25 De uitvinding betreft nu een werkwijze voor het tegelijkertijd meten van de totale hoeveelheid van twee of meer stoffen aanwezig in één monster door één enkele meetbehandeling. Tevens betreft de uitvinding een reagens voor het gelijktijdig meten van de hoeveelheid van twee of meer stoffen aanwezig in één monster door één enkele meet-30 behandeling.

De uitvinding betreft dus een immunologische meetmethode en een meetreagens voor het gelijktijdig meten van de totale hoeveelheid van twee of meer te meten stoffen, waarbij men een monster met te meten stoffen laat reageren met een onoplosbaar gemaakt antilichaam of anti-35 geen dat twee of meer verschillende antilichamen of antigenen bevat, 8302708 t * -2- en de te meten stoffen op basis van de waargenomen immunologische reactie bepaalt.

Aangezien volgens de uitvinding twee of meer te meten stoffen gelijktijdig kunnen worden gemeten, kan de meettijd aanmerkelijk wor-5 den verminderd evenals de hoeveelheid benodigd monster,vergeleken met gebruikelijke methoden, waarbij een aantal te meten stoffen achtereenvolgens werd gemeten. De uitvinding wordt toegelicht door de tekening. Daarin zijn: fig. 1 t/m fig. 4 grafieken van de standaardkrommen volgens 10 voorbeeld VI; fig. 5 - fig. 8 grafieken omtrent de standaardkrommen volgens voorbeeld X; fig. 9 is een. grafiek omtrent de standaardkrommen in voorbeeld XII; en 15 fig. 10 is een grafiek omtrent de verdunningskrommen volgens voorbeeld XIII.

Gevonden werd dat voor een vroege diagnose van kanker door meting van tumormerkstoffen, hoewel liefst afzonderlijke metingen worden uitgevoerd naar de aard van de aanwezige tumormerkstof f en en hun hoeveelheden 20 het in de praktijk mogelijk is,de diagnose te baseren op de totale hoeveelheid tumormerkstoffen als blijkt uit de onderstaande voorbeelden II, IV, VI en XI. Gebaseerd op deze ontdekking is verder gewerkt aan een methode die het mogelijk maakt de hoeveelheid van twee of meer stoffen in één te meten monster gelijktijdig in de vorm van een totale 25 hoeveelheid te meten met één enkele meetbehandeling. Als resultaat werd gevonden, dat de totale hoeveelheid van twee of meer te meten stoffen door één enkele meetbehandeling kan worden gemeten, die gebaseerd is op een immunologisch meetprincipe, waarbij de meting wordt uitgevoerd door binding van twee of meer verschillende antilichamen, correspon-30 derend met twee of meer te meten antigenen, aan dezelfde onoplosbare drager, of door mengen en toepassen van twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen, verkregen door het binden van antilichamen, corresponderend met twee of meer verschillende te meten antigenen, aan afzonderlijke onoptoshare dragers, zonder dat enige verandering in de reacti-35 viteit tussen elk antigeen en corresponderend antilichaam wordt veroorzaakt. Dit vormt de uitvinding.

8302708 t t -3-

De immunologische meetmethoden die de basis vormen voor de onderhavige meetmethode, worden algemeen toegepast als methoden voor het meten van fysiologisch actieve stoffen aanwezig in extreem kleine hoeveelheden in monsters als serum, urine, enz., bijvoorbeeld de con-5 centraties aan peptidehormonen, sterolden, eiwitten, enz., de concentraties van toegediende geneesmiddelen enz. Van deze reacties worden liefst de hemagglutinatiereactie en de latexagglutinatiereactie toe-gepast omdat ze gemakkelijk en in een kortere tijd uitvoerbaar zijn, terwijl ook enzymimmunoproeven, radioimmunoproeven en fluorescentie-10 immunoproeven gunstig zijn gebleken vanwege hun gevoeligheid en kwantitatieve resultaten.

De principes omtrent de meetmethoden zijn hieronder kort weergegeven: (1) Agglutinatiereactie: Wanneer een onbekende hoeveelheid te 15 meten antigeen reageert met een corresponderend antilichaam gebonden aan een deeltjesvormige drager (hieronder aangeduid als vaste fase), zoals rode bloedcellen en een polymeerlatex, bindt zich het antigeen aan het antilichaam op de vaste fase in verhouding tot de aanwezige hoeveelheid, waardoor de vaste fase agglutineert. De mate van deze 20 agglutinatie wordt gemeten en de te meten hoeveelheid antigeen bepaald door een vergelijking met de mate van agglutinatie bereikt bij meting van dezelfde stof in een bekende concentratie.

(2) Sandwich-methode; Wanneer een onbekende hoeveelheid van een ongemerkt antigeen (te meten antigeen) wordt omgezet met een correspon- 25 derend antilichaam gebonden aan een vaste fase (eerste reactie)9bindt zich dit antigeen aan het antilichaam waardoor een antigeen/antllichaam-complex wordt gevormd. Wanneer een gegeven hoeveelheid van eenzelfde antilichaam, gemerkt met een merkmiddel, met dit antigeen/antilichaam-complex wordt omgezet (tweede reactie), wordt het gemerkte antilichaam 30 aan het genoemde complex gebonden,maar een deel van het gemerkte antilichaam dat in overmaat was vergeleken met de bindingscapaciteit van het complex, bindt zich daaraan niet en blijft dus in vrije vorm.

Vervolgens wordt de vaste fase gescheiden van de vloeistoffase, de activiteit van het merkmiddel in de vaste fase of in de vloeistoffase 35 gemeten en de hoeveelheid ongemerkt, te meten antigeen bepaald op grond van een standaardkromme verkregen door gelijke handelingen met ongemerkt antigeen in bekende concentraties.

8302708 \ t -4- (3) Competitieve reactiemethode: Wanneer een onbekende hoeveelheid van een ongemerkt antigeen (te meten antigeen) en een gegeven hoeveelheid van een gemerkt antigeen competitief worden omgezet met een overeenkomstig antilichaam gebonden op een vaste fase, dan binden on- 5 gemerkt antigeen en gemerkt antigeen respectievelijk aan dit antilichaam evenredig met hun respectievelijke hoeveelheden, zodat de hoeveelheid gemerkt antigeen, dat zich aan het antilichaam bindt^omgekeerd evenredig is met de hoeveelheid ongemerkt antigeen. Vervolgens wordt de vaste fase van de vloeistoffase gescheiden en de activiteit van het 10 merkmiddel in de vaste fase of in de vloeistoffase gemeten en de hoeveelheid antigeen bepaald op grond van een standaardkromme verkregen door gelijke handelingen uit te voeren met ongemerkte stoffen in bekende concentraties.

(4) Immunometrische methode: Wanneer een onbekende hoeveelheid 15 van een ongemerkt antigeen (te meten antigeen) wordt omgezet met een gegeven hoeveelheid van een overeenkomstig, gemerkt antilichaam en vervolgens hetzelfde antigeen gebonden aan een vaste fase wordt toegevoegd ter omzetting met onomgezet,gemerkt antilichaam, zal het gemerkte antilichaam zich binden aan het antigeen op de vaste fase en wel omge-20 keerd evenredig met de hoeveelheid aanwezig ongemerkt antigeen. Vervolgens wordt de vaste fase gescheiden van de vloeistoffase en de activiteit van het merkmiddel in de vaste fase of in de vloeistoffase gemeten en de hoeveelheid ongemerkt antigeen bepaald op grond van een standaardkromme verkregen door gelijke handelingen uit te voeren met de onge-25 merkte stof in bekende concentraties.

De uitvinding betreft dus een methode en een reagens voor het gelijktijdig meten van de totale hoeveelheid van twee of meer te meten stoffen aanwezig in één monster door toepassing van de bovenbeschreven principes van de immunologische meetmethoden.

30 De onderhavige meetmethode kan worden toegepast op elk van de gebruikelijke immunologische meetmethoden waarbij een antilichaam of antigeen op een onoplosbare-drager is gebonden, bijvoorbeeld de hemagglutinatiereactie, de agglutinatieremmingsreactie, de competitieve reactiemethode, de sandwichmethode, de immunometrische methode, enz.

35 De onderhavige methode wordt nu schematisch beschreven aan de hand van de agglutinatiereactie en de sandwichmethode.

8302708 *- i -5- (1) Agglutinatiereactie: Wanneer een monster dat naar verwachting de vier stoffen A, B, C en D bevat, moet worden gemeten^worden vier verschillende antilichamen, corresponderend met de te meten stoffen nl. anti-A antilichaam, anti-B antilichaam, anti-C antilichaam en 5 anti-D antilichaam op dezelfde onoplosbare deeltjesvormige drager gebonden, of zij worden afzonderlijk gebonden op afzonderlijke onoplosbare deeltjesvormige dragers ter bereiding van een suspensie van vier verschillende suspensies van onoplosbare deeltjesvormige dragers met daarop deze vier antilichamen. wanneer het monster met deze sus-10 pensies wordt omgezet binden de te meten stoffen A, B, C en O zich respectievelijk met de overeenkomstige antilichamen op de dragers, waarbij een agglutinatie van de deeltjesvormige dragers optreedt.

Door meting van de mate van agglutinatie kan de totale hoeveelheid van " de twee of meer te meten stoffen in één monster worden gemeten.

15 (2.) Sandwichmethode r Wanneer een monster dat naar men aanneemt vier stoffen A, B, C en D bevat moet worden gemeten^worden vier verschillende antilichamen corresponderend met de te meten stoffen, nl. anti-A antilichaam, anti-B antilichaam, anti-C antilichaam en anti-D antilichaam op dezelfde onoplosbare drager gebonden of afzonderlijk 20 gebonden op afzonderlijke onoplosbare dragers waarna een onoplosbare drager wordt verkregen of vier verschillende onoplosbare dragers met daarop deze vier antilichamen. Wanneer het monster met deze onoplosbare dragers in contact komt^ zullen de respectievelijk te meten stoffen A, B, C en D zich binden aan de overeenkomstige antilichamen op de 25 dragers. Na scheiding van de vaste fase, indien nodig, worden gemerkte antilichamen^verkregen door binding van een merkmiddel aan respectievelijk anti-A antilichaam, anti-B antilichaam, anti-C antilichaam en anti-D antilichaam^met de vaste fase omgezet, waarbij de respectievelijke gemerkte antilichamen zich met de respectievelijk te meten stoffen 30 verbinden. Hierna wordt de vaste fase afgescheiden en de totale activiteit van het merkmiddel gebonden aan de vaste fase gemeten. Aldus kan de totale hoeveelheid van twee of meer te meten stoffen in een monster gelijktijdig worden gemeten.

De onoplosbare deeltjesvormige drager bij de onderhavige agglu-35 tinatiamethode kan elke gebruikelijke stof zijn. Dat wil zeggen cellen van b..v. bacteriën, rode bloedcellen enz., organische polymeer- 8302708 % i.

-6- latices, zoals een polystyreenlatex, een polystyreenlatex met carboxyl-groepen, een styreen-divinylbenzeencopolymeerlatex, een styreen-divinylbenzeenpolymeerlatex met hydroxyl- of carboxylgroepen, een poly-vinylalcohollatex, een polyacrylaatlatex, een vinylacetaat-acrylcopoly-5 meerlatex enz., voorts een anorganisch materiaal, zoals silica, roet, alumina enz., hetzij op zichzelf of in één of andere combinatie.

Als materiaal voor de onoplosbare drager bij de sandwichmethode, de competitieve methode en de immunometrische methode volgens de uitvinding, kan elk hiervoor gebruikelijk materiaal worden toegepast, 10 bijvoorbeeld polystyreen, polyetheen, polyacryl, teflon, papier, glas, agarose,e*z^.elkop zichzelf of in iedere gewenste combinatie. Voorts kan iedere gewenste vorm worden toegepast, bijvoorbeeld bolletjes, staafjes, schijfjes of een houder, bijvoorbeeld een optische cel, een reageerbuis enz., hoewel ook iedere andere vorm kan worden toegepast.

15 De antilichamen die bij de uitvinding worden gebruikt kunnen de gewone multi-cloon-antilichamen zijn hoewel een toepassing van monoclonale antilichamen toch betere resultaten oplévert. Monoclonale antilichamen resulteren bijvoorbeeld in een verbetering van de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van de meting, verlaging van de reactieduur, 20 verbetering van de specificiteit, vereenvoudiging van de metingsbehan-delingen, uitsluiting van niet-specifieke reacties, uitsluiting van remming op de reactie door lichaamscomponenten in het monster^ bijvoorbeeld serum, urine enz., en dergelijke. Wanneer monoclonale antilichamen worden toegepast bij de agglutinatiereactie is het nodig in combi-25 natie twee of meer monoclonale antilichamen corresponderend met verschillende antigeenplaatsen van één te meten stof toe te passen om agglutinatie te bereiken.

Als methode voor hèt binden van één of meer antilichamen of antigenen aan een onoplosbare drager kan de methode van Clinica 30 Chimica Acta, 48 : 15 (1973), Journal of Immunology, 116 : 1554 (1976) of Science, 158 : 1570 (1967) worden toegepast. Wanneer twee of meer verschillende antilichamen aan één enkele onoplosbare drager moeten worden gebonden kan een antilichaamoplossing door mengen van de te binden antilichamen in een vaste verhouding, bijvoorbeeld 35 een oplossing met 0,5 mg/cm^ anti-APP antilichaam, 0,1 mg/cm^ anti-HCG antilichaam en 0,25 mg/cm^ anti-CEA antilichaam in 0,05 M met fosfaat 8302 7 Ö8 > * -7- gebufferde fysiologische zoutoplossing met pH 6,4 tevoren worden bereid, vervolgens de gemengde antilichaamoplossing in contact worden gebracht met de onoplosbare dragers en de reactie in 2-3 uren bij 30-56°C worden uitgevoerd. Na deze reactie worden de dragers gewassen met een 5 fysiologische zoutoplossing waardoor aan drager gebonden antilichaam wordt verkregen.

Wanneer anti-AFP antilichaam, anti-HCG antilichaam en anti-CEA

antilichaam afzonderlijk worden gebonden aan afzonderlijke onoplosbare

dragers, worden anti-AFP antilichaam, anti-HCG antilichaam en anti-CEA

10 antilichaam^afzonderlijk opgelost in een 0,05 M fosfaatbuffer-houdende fysiologische zoutoplossing met pH 6,4 in concentraties van 0,5 mg/cm^, 3 3 0,1 mg/cm en 0,25 mg/cm^ respectievelijk in contact gebracht met afzonderlijke onoplosbare dragers en elk mengsel 2-3 uren bij 30-56°C omgezet. Na de reactie worden de onoplosbare dragers met een fysiolo-15 gische zoutoplossing gewassen en aldus de respectievelijke antilichaam-houdende dragers verkregen. De mengverhouding van de aldus verkregen onoplosbare antilichamen wordt bij voorkeur gekozen binnen het traject 1-10 : 1-10 : 1-10, hoewel dit kan variëren afhankelijk van de verwachte hoeveelheid te binden antilichaam en de titer van elk anti-20 lichaam.

De hoeveelheid van elk te binden antilichaam aan de onoplosbare drager is bij voorkeur 10-0,05 mg/cm^, liefst 5-0,1 mg/cm^, hoewel ook dit varieert naarmate van de te meten stof, de hoeveelheid van elke te meten stof in het monster en de titer van elk antilichaam. Wanneer de 25 meting wordt uitgevoerd worden de optimale voorwaarden voor het experiment nade: "Bepaald, aangezien de hoeveelheid toe te passen monster, de hoeveelheid van elk gemerkt antilichaam of gemerkt antigeen en de voorwaarden, 'zoals de reactieduur, temperatuur enz. variëren afhankelijk van de aard van elke te meten stof, de titer van elk gebruikt antilichaam en de 30 aard van de merkmiddelen.

De produktie van het gemerkte antilichaam of gemerkte antigeen kan volgens een gebruikelijk procédé verlopen.

Indien de werkwijze volgens de uitvinding wordt uitgevoerd op grond van de competitieve reactie, is het toe te passen gemerkte anti-35 geen datgene, dat zich competitief met de te meten stof bindt aan het onopgeloS» antilichaam, zodat over het algemeen dezelfde stof als de 8302708 1 * -8- te meten stof als antigeen wordt gebruikt. De fysiologisch actieve stoffen aanwezig in het menselijk lichaam kunnen echter gebonden aan andere lichaamscomponenten optreden of een gedeeltelijk metabolisme ondergaan waardoor ze soms enigszins verschillen van de vorm, waarin.

5 ze aanwezig zijn buiten het menselijk lichaam. In een dergelijk geval kan ook een stof, die nagenoeg dezelfde reactiviteit heef't van immunologisch standpunt bezien worden gebruikt als identieke stof met de te meten stof.

Hoewel de uitvinding de meting van twee of meer stoffen gelijk-10 tijdig beoogt, is het ook mogelijk een enkele stof te meten onder toepassing van slechts één gemerkt antilichaam, zelfs wanneer twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen worden toegepast, tenzij de te meten stoffen elkander storen.

Als nterkmiddelen kunnen enzymen (bijvoorbeeld peroxydase, 15 β-galactosidase, alkalische fosfatase, glucose-oxydase enz.), radio- 125 3 actieve isotopen, zoals J, H enz., fluorescerende stoffen, zoals fluoresceine-isothiocyanaat, tetramethylrodamine-isothiocyanaat enz. worden toegepast.

Bij de agglutinatiereactie kan door toepassing van een drager 20 met twee of meer antilichamen de totale hoeveelheid van twee of meer te meten stoffen· gelijktijdig worden gemeten. Bij de sandwichmethode en de competitieve reactiemethode kan door toepassing van twee of meer gemerkte antigenen of gemerkte antilichamen corresponderend met twee of meer antilichamen gehecht op de onoplosbare dragers, de totale 25 hoeveelheid van de twee of meer te meten stoffen gelijktijdig worden gemeten. Voorts kan bij de sandwichmethode en de competitieve reactiemethode door toepassing van een enkel gemerkt antigeen of gemerkt antilichaam ook één enkele stof worden gemeten. Bijvoorbeeld wordt een monster, verdund tot een passende concentratie toegevoegd 30 aan een reageerbuis waaraan een antilichaam is gebonden, waarna de antigeen-antilichaamreactie wordt uitgevoerd. Na afloop van deze reactie wordt de reageerbuis met gedestilleerd water gewassen, een gemerkt antilichaam toegevoegd en wederom een reactie uitgevoerd.

Daarna wordt na wassen met gedestilleerd water de activiteit van het 35 merkmiddel in de vaste fase (reageerbuis) op een passende wijze gemeten. Uit de verkregen gemeten waarden kan de hoeveelheid stof aan- 8302708 -9- y * wezig in het monster worden berekend, gebaseerd op een standaardkromme verkregen door gelijke handelingen met de standaarstof in bekende concentraties. De standaardstof in dit geval kan ofwel een enkel anti-geen zijn danwel een mengsel van een reeks antigenen.

5 De meetmethode volgens de uitvinding kan elke stof meten die ook volgens gebruikelijke immunologische meetmethode kan worden gemeten. Van speciaal belang zijn als te meten stoffen bijvoorbeeld tumor-merkstoffen die een groot belang hebben bij een vroege diagnose van tumoren, de beoordeling van een theurapeutisch effect enz.

10 Voorbeelden hiervan omvatten carcino-embryo-antigeen (CEA), α-fetoprotelne (AFP), menselijk choriongonadotropine (HCG), 8^-micro— globuline (S^), basisch fetoproteïne (BFP), alkalische fosfatase (ALP) , γ-glutamyltranspeptidase (γ-GTP), zwangerschaps Sj-glyco-protelne (SP^), zwangerschaps -glycopro t elne (SP^), immunosuppressief- 15 zuurproteine (IAP), immunosuppressief a^-macroglobuline, zuur iso-ferritine, fibrinogeen, haptoglobine, calcitonine, steroïdehormonen, polyaminen, DNA-bindende proteïnen, α^-antitrypsine, pancreasoncofe-taal antigeen, galactosyltransferase (GT-IT), enz.; alsmede diverse stoffen, die thans nog worden bekeken. Voorts oók stoffen met een 20 belang bij de diagnose en profilaxe van hepatitis door een infectie met hepatitisvirus na een bloedtransfusie? dit zijn hepatitis B-virusanti-genen (HBs, HCc, HBe) en non-A, non-B hepatitisvirusantigenen.

Voorbeelden van combinaties van twee of meer verschillende te meten stoffen omvatten (1) AFP, CEA, HCG, (2) SP^, fibrinogeen, 25 (3) AFP, CEA, HCG, SP^, fibrinogeen, (4) fibrinogeen, haptoglobine, ferritine, (5) haptoglobine, 8immunosuppressief a2-macroglobuline, α^-antitrypsine, (6) ALP, γ-GTP, GT-II, (7) polyaminen, steroïdehormonen, (8) HBs, HBc, HBe en dergelijke.

De uitvinding maakt het mogelijk de meettijd te verkorten omdat 30 anders bij meting van een aantal antigenen volgens een gebruikelijke methode afzonderlijk te meten antigenen afzonderlijk moesten worden gemeten en daarvoor meer tijd nodig was. Voorts kan de hoeveelheid monster die benodigd is aanmerkelijk worden verminderd.

De uitvinding wordt toegelicht door de volgens voorbeelden.

35 8302708 V l·' -10-

Voorbeeld I

Meting van de totale hoeveelheid fibrinogeen, haptoglobine en ferritine a) Bereiding van een latexreagens met gebonden antilichaam.

Anti-fibrinogeen antilichaam (DAKO Co.), anti-haptoglobine 5 antilichaam (DAKO Co.) en anti-ferritine antilichaam (DAKO Co.) werden verdund en in een met 0,05 M fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing met pH 6,4 (PBS) gemengd tot concentraties van respectieve- 3 3 3 3 lijk 5 mg/cm , 1,8 mg/em en 0,7 mg/cm . 0,5 cm 10%'s polystyreen- latexsuspensie (uniforme latexdeeltjes van Dow Chemical Co.) werd toe-3 10 gevoegd aan 2 cm van de bovengenoemde gemengde antilichaamoplossing en onder roeren 2 uren bij 37°C omgezet. Na afloop van de reactie werd het reactiemengsel met ijs gekoeld, gecentrifugeerd, met PBS gewassen en in PBS met 1% runderserumalbumine (BSA) gesuspendeerd tot een gebonden antilichaam bevattend latexreagens.

15 b) Bereiding van standaardoplossingen.

Fibrinogeen (Sigma Co.), haptoglobine (Sigma Co.) en ferritine (Sigma Co.) werden afzonderlijk opgelost in PBS met daarin 1% BSA tot concentraties van respectievelijk 120, 60, 30, 15 en 0 mg/1, 12, 6, 3, 1,5 en 0 mg/1 en 0,8, 0,4, 0,2, 0,1 en 0 mg/1.

20 c) Meting van fibrinogeen, haptoglobine en ferritine.

3 20 mm van elk van de oplossingen van fibrinogeen, haptoglobine en ferritine met de concentraties volgens b) werden op een 3 3 glaasje gebracht, vervolgens 50 mm PBS met daarin 1% BSA en 20 mm aan antilichaam-hoüdend latexreagens volgens a) toegevoegd. Het meng-25 sel werd in 3 minuten onder roeren omgezet en de mate van agglutinatie microscopisch waargenomen. De reactie zonder agglutinatie werd als negatief (-) aangeduid en die met agglutinatie aangeduid als positief (+, ++ of +++ naarmate de sterkte) waardoor vier tekens werden verkregen. De gevoeligheid van het reagens jegens fibrinogeen, hapto-30 globine en ferritine bedroeg 15 mg/1, 1,5 mg/1 en 0,1 mg/1 respectievelijk.

Voorbeeld II

Metingen bij serummonsters van patiënten

Toegepast werden serummonsters verkregen van 18 leverkanker-35 patiënten, 20 maagkankerpatiënten, 20 patiënten met kanker aan de dikke darm en 8 longkankerpatiënten, 25 patiënten met diverse goed- 8302708 -11- aardige ziekten en 20 gezonde mensen, waarbij de metingen werden uitgevoerd volgens de uitvinding. De procedure bij deze metingen was gelijk aan die volgens voorbeeld Ic. De resultaten zijn weergegeven in tabel A.

5 TABEL· A

Aantal Beoordeling

Ziekte patiënten - + ++ +++ % Positief leverkanker 18 1 2 9 6 94 maagkanker 20 3 4 8 5 85 10 dikke-darmkanker 20 2 3 7 8 90 longkanker 8 0242 100 goedaardige ziekten 25 19 5 1 0 24 gezonde mensen 20 18200 10

Uit deze tabel A blijkt, dat een boog percentage kankerpatiënten 15 positief werd beoordeeld, hetgeen de bruikbaarheid van de onderhavige methode voor het screenen van kankerpatiënten aantoont.

Voorbeeld III-

Meting van de totale hoeveelheid aan fibrinogeen, haptoglobine en ferritine 20 a) Produktie van anti-fibrinogeen antilichaam-houdende latex.

Anti-fibrinogeen antilichaam (DAKQ Go.) werd verdund met PBS

3 3 tot een concentratie van 5 mg/cm . Aan 2 cm van deze verdunde oplossing werd 0,5 cm^ van een 10%'s polystyreenlatexsuspensie (gemiddelde deeltjesdiameter 0,48 ji, Dow Chemical), toegevoegd en het mengsel 25 2 uren onder roeren bij 37eC omgezet. Na afloop van de reactie werd het reactiemengsel met ijs gekoeld, gecentrifugeerd, met PBS gewassen en daarna in PBS met 1% BSA gesuspendeerd tot eerr gebonden anti-fibrinogeen antilichaaia-houdende latex.

b) Produktie van anti-haptoglobine antilichaam op latexdeeltjes.

30 Anti-haptoglobine antilichaam werd met PBS verdund tot een concentratie van 1,8 mg/cm^ en deze oplossing met een 10%'s polystyreenlatexsuspensie overeenkomstig a) omgezet in een latex met daarop anti-haptoglobine antilichaam.

8302708 I ) -12- c) Produktie van anti-ferritine antilichaam op latex.

Anti-ferritine antilichaam (DAKO Co.) werd met PBS verdund tot 1,2 mg/cm^ en deze oplossing met een suspensie van 10%'s poly-styreenlatex met carboxylgroepen (gemiddelde deeltjesdiameter 0,25 jx, 5 Dow Chemical) overeenkomstig a) omgezet in een latex met daarop anti-ferritine antilichamen.

d) Produktie van antilichaam op latexreagentia.

De latex met anti-fibrinogeen antilichaam, de latex met anti-haptoglobine antilichaam en de latex met anti-ferritine antichamen 10 werden in een verhouding 2:5:1 gemengd tot een latexreagens met antilichamen.

e) Meting van fibrinogeen, haptoglobine en ferritine.

3 20 mm van elk van de standaardoplossingen van fibrinogeen, haptoglobine' en ferritine geproduceerd volgens voorbeeld X b) werden 3 15 aangebracht op een glaasje, daarna 50 mm PBS met daarin 1% BSA en 3

2Q mm van het latexreagens volgens d) hierboven aan de standaardoplossing op het glazen plaatje toegevoegd. Dit mengsel liet men onder roeren 3 minuten reageren, waarna de mate van agglutinatie onder een microscoop werd bekeken. Een reactie zonder agglutinatie werd aange-20 duid als negatief (—), een reactie met een agglutinatie werd als positief aangeduid (+, ++ of +++ naargelang van de mate van agglutinatie). De gevoeligheid van dit reagens jegens fibrinogeen, haptoglobine en ferritine bedroeg 15 mg/1, 1,5 mg/1 en 0,1 mg/1 respectievelijk. Voorbeeld IV

25 Metingen bij serummonsters van patiënten

Serummonsters verkregen van 15 leverkankerpatiënten, 20 maag-kankerpatiënten, 17 patiënten met kanker aan de dikke darm, 12 long-kankerpatiënten, 25 patiënten met diverse goedaardige ziekten en 20 gezonde mensen werden gemeten onder toepassing van het reagens volgens 30 voorbeeld III. De resultaten zijn weergegeven in tabel B.

8302 70S

-13-TABEl· B

Aantal Beoordeling (%)

Ziekten patiënten + ++ +++ positief leverkanker 15 1275 93 maagkanker 20 3485 85 dikke-darmkanker 17 2267 88 longkanker 12 1263 92 goedaardige ziekten 25 20 4 1 0 20 gezonde mensen 20 19100 5

Zoals blijkt uit tabel B waren kankerpatiënten in hoge mate positief, hetgeen erop duidt, dat de onderhavige meetmethode bijzonder geschikt is voor het screenen van kankerpatiënten.

Voorbeeld V

5 Produktie van gezuiverd AFP en anti-AFP antillchamen

a) Produktie van gezuiverd AFP

16,2 g onzuiver AFP-extract werd verkregen uit 5 liter ascites van leverkankerpatiënten door uitzouten met ammoniumsulf aat. Het onzuivere extract werd gezuiverd door affiniteitschromatografie onder 3 10 toepassing van 50 cm konijnen anti-AFP antilichamen gebonden aan 3 sefarose 4B (1 mg antilichaam/cm sefarose) waarbij 924 mg gezuiverd AFP werd verkregen.

b) Produktie van monoclonale anti-AFP antilichamen 50 jig van het gezuiverde AFP werd subcutaan toegediend tezamen 15 met Freund's compleet adjuvants (FCA) aan vrouwelijke BALB/c muizen.

De toedieningen werden viermaal herhaald met intervallen van een week en vier dagen na de laatste toediening de mild geïsoleerd en deze mild-cellen verzameld. De mildcellen werden met Dulbecco gemodificeerd g MEM-medium (hieronder D-MEM) gewassen, 1 x 10 cellen werden geteld 20 en gemengd met 1 x 10^ cellen aan muizemyeloomcellen (P3-NSI/l-Ag 4-1).

3

Dit geheel werd onderworpen aan een celfusie in 1 cm D-MEM met daarin 42,5% polyethyleenglycol 1540 en 7,5% dimethylsulfoxide en wel gedurende 1 minuut bij 37°C. Aan deze cellen werd HAT-medium (RPMI-1640 met 8302708 -14- daarin hypoxantine, aminopterine, tymidine en 10% runder foetus serum) toecpvoegd 3 tot een volume van 20 cm , waarna het celmengsel in hoeveelheden van 3 0,2 cm elk op een microplaat werd aangebracht met 96 kommetjes en 2 weken werd gekweekt. Hierna werd de antilichaamactiviteit in de 5 bovenstaande vloeistof van de cultuur in de kommetjes gemeten. Hierna werden de cellen in de kommetjes met activiteit verzameld en toege-3

voegd aan 40 cm RPMI-1640 medium met daarin 10% runderfoetusserum en tymuscellen uit BALB/c muizen. Deze celsuspensie werd wederom verdeeld over twee microplaten met 96 kommetjes en 1 week gekweekt tot 9 clonen 10 anti-AFP antilichaam producerende hybridomen. Deze werden overgebracht ·. naar culturen op. technische schaal en 1 liter van elke verkregen bovenstaande cultuurvloeistof onderworpen aan een affiniteitschromato-grafie onder toepassing van 50 cm^ gezuiverde AFP-houdende sefarose 4B

3 (0,5 mg AFP/cm sefarose) waarna 4,2-11,6 mg monoclonale antilichamen 15 respectievelijk werden verkregen. De respectievelijke antilichamen werden aangeduid als charges 1-9.

c) Identificatie van antigeen-herkenningsplaatsen £) Produktie van anti-AFP antilichamen-houdende reageerbuizen Porties van 1 cm^ PBS met daarin 0,5 mg van monoclonaal anti-20 AFP antilichaam van de ' : charges 1-9 werden toegevoegd aan af zonderlijke polystyreenreageerbuizen die met PBS waren gewassen, waarna elke reageerbuis 3 uren bij 37°C werd geincubeerd om het antilichaam aan de binnenwand van de reageerbuis te hechten. Na de reactie werden de reageerbuizen met PBS gewassen en daarbij monoclonale anti-25 lichamen-houdende reageerbuizen verkregen.

ii) Produktie van met enzym gemerkt anti-AFP antilichaam 5 mg. mierikswortelperoxydase (Behringer Manheim Co.), kwali- 3 teit I, hieronder aangeduid als HRPO> werd opgelost in 1,0 cm van een 3 0,3 M natriumbicarbonaatbuffer en aan deze oplossing 0,1 cm 1% 1-fluor-30 2,4-dinitrobenzeen in ethanol toegevoegd, waarna het mengsel 1 uur 3 werd omgezet. Verder werd 1,0 cm van een 0,06 M natriumperjodaatoplos-sing toegevoegd aan dit mengsel, waarna men de reactie 30 minuten liet verlopen, vervolgens werd nog 1,0 cm^ van een 0,16 M ethyleen-glycoloplossing toegevoegd en de reactie 1 uur voortgezet. Het reactie-35 mengsel werd hierna tegen 0,01 M natriumcarbonaatoplossing met pH 9,5 gedialiseerd. Aan de gedialyseerde oplossing werd 5 mg van elk van de 8302708 -15- negen charges anti-AFP antilichaam volgens b) toegevoegd en elk mengsel 3 uren bij kamertemperatuur gelncubeerd. Vervolgens werd 5 mg natriumboorhydride toegevoegd en de reactie nog een nacht voortgezet. De reactiemengsels werden respectievelijk gedialyseerd tegen 0,01 M 5 PBS met pH 7,2 waarna een aantal met HRPO-gemerkte anti-AFP antilicha-men werden verkregen.

iii) Identificatie van antigeen-herkenningsplaatsen

Aan elk van de reageerbuizen met daarin anti-AFP antilichamen, 3 verkregen volgens i) werd 0,1 cm van de standaardoplossing toegevoegd, 10 verdund met PBS tot 100 ng/cm3 AFP volgens a) en 0,4 cm3 van een 100-voudige verdunning van elk met HRPO-gemerkt anti-AFP antilichaam volgens ii), waarna elke reactie 30 minuten werd uitgevoerd. Na afloop van de reactie werd elke reageerbuis gewassen met een wasoplossing, 3 0,5 cm van een enzymsubstraatoplossing met daarin 20 mg/dl asm 15 O-fenyleendiamine en 6 mM waterstofperoxyde toegevoegd, en deze reactie eveneens 30 minuten uitgevoerd. 2 cm3 1 N zoutzuur werd toegevoegd om de enzymreactie te stoppen en de absorptie van het reactiemengsel bij 492 nm gemeten. De resultaten zijn weergegeven in tabel C waarbij + de combinaties aanduidt met een kleurreactie en - de combinaties 20 zonder kleurreactie.

TABEL· C

Met HRPO-gemerkt antilichaam I 123456789 3 ül— -- + — + — + +

•H

•h2 — — — + — + — + +

+J

25 <3 3— — — + — + — + + $4+ + + - + + + --

Rj S5--- + - + - + + <u S?6+ + + + + — + + + <e

Ja7--- + - + - + + ca 30 °8 + + + - + + + -- 0« §9+ + + - + + + -- o

Aan de hand van de verschillen in de antigeen-herkenningsplaatsen werden de negen charges monoclonale anti-AFP antilichamen in drie groepen geclassificeerd te weten een eerste groep van de charges 1, 2, 35 3, 5 en 7, een tweede groep uit charge 6 en een derde groep uit de 83027C8 -16- charges 4, 8 en 9. Deze groepen werden aangeduid met: anti-AFP anti-lichamen (A), (B) en (C). Van deze zal (A) worden gebruikt als gelnso-lubiliseerd antilichaam en (C) als gemerkt antilichaam bij dê volgende voorbeelden.

5 Voorbeeld VI

Produktie van gezuiverdeCEA en anti-CEA. antilichamen

a) Produktie van gezuiverd CEA

40 g kankerweefsel van de dikke darm werd fijngesneden en na 3 een toevoeging van 100 cm gedestilleerd water in een homogenisator 10 gehomogeniseerd. Aan deze suspensie werd een gelijk volume 1,2 M per-chloorzuur toegevoegd en dit mengsel onder roeren 30 minuten geëxtraheerd. De gecentrifugeerde bovenstaande vloeistof werd gedialyseerd tegen gedestilleerd water en daarbij onzuiver CEA-extract verkregen.

* 3

Dit onzuivere extract werd tot 10 cm geconcentreerd en ge- 15 gelfiltreerd met sefarose 4B, geëquilibreerd met een fysiologische zoutoplossing^en de eerste proteinefractie opgevangen. Daarna werd deze fractie opnieuw gegelfiltreerd onder toepassing van sefadex G-200, overeenkomstig geëquilibreerd^en een twee proteinefractie opgevangen, die vervolgens werd geconcentreerd tot 2 cm^ waarbij 135 jig gezuiverd 20 CEA werd verkregen.

b) Produktie van monoclonale anti-CEA antilichamen

Acht clonen anti-CEA antilichamen-producerende hybridomen werden verkregen uit het gezuiverde CEA volgens a) door een procedure overeenkomstig voorbeeld Vb. Voor de immunisatie van de muizen werd voor 25 elke toediening 30 jig gezuiverd CEA gebruikt.

1 x 106 hybridooracellen werden intraperitoneaal geinoculeerd in een vrouwelijke BALB/c muis die intraperitoneaal 0,5 cm^ pristan (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecaan van Wako Pure Chemicals, Co., Ltd.) had toegediend gekregen. Twee weken later werd de ascites verzameld.

30 Elke ascites werd gechromatografeerd over DEAE-cellulose, geëquili- breerd met een 0,01 M fosfaatbuffer met pH 7,0, en aldus een monoclonaal anti-CEA antilichaam in de niet-geabsorbeerde fractie .verkregen.Als resultaat van de identificatieproef op de antigeen-herkenningsplaatsen volgens voorbeeld Vc werden de respectievelijke antilichamen geclassificeerd 35 in drie groepen van elk 5 charges, 2 charges en 1 charge, welke werden aangeduid als anti-CEA antilichaam (A), (B) en (C). Van deze zal 8302708 -17- anti-CEA antilichaam (A) worden gebruikt als geinsolubiliseerd · antilichaam en anti-CEA antilichaam (B) als gemerkt antilichaam bij de volgende voorbeelden.

Voorbeeld VII

5 Bereiding van HCG-8 en anti-HCG-6 antilichamen a) Produktie van HCG-8 subeenheden 1 g HCG (2000 IE/mg) werd opgelost in 2 cm^ 0,025 M fosfaat-buffer met pH 5,6 en gechromatografeerd over 3 g DEAE-sefadex A-50, geëquilibreerd met dezelfde buffer. De fractie die werd geëlueerd 10 met 0,05 M fosfaatbuffer met pH 5,6 werd opgevangen en gedialyseerd tegen gedestilleerd water tot 308 mg gezuiverd HCG was verkregen, dat vervolgens werd gelyofiliseerd. 300 mg van dit gezuiverde HCG werd opgelost in 10 cm^ 10 M ureumoplossing met pH 4,5 en een reactie van s 1 uur bij 40°C daarmee uitgevoerd, gevolgd door een chromatografie 15 over 2 g DEAE-sefadex A-50, geëquilibreerd met een oplossing met daarin 0,03 M glycine en 10 M ureum. De fractie, geëlueerd met een oplossing met daarin 0,2 M glycine, 1 M NaCl en 8 M ureum,werd gedialyseerd tegen een fysiologische zoutoplossing en daarbij 147 mg HCG-6 subeenheden verkregen.

20 b) Produktie van anti-HCG-S antilichamen

Elf charges anti-HCG-6 antilichamen-producerende bybridomen werden verkregen uit de HCG-8 eenheden geproduceerd onder a) door een overeenkomstige procedure als beschreven in voorbeeld Vb. Bij de antilichamen verkregen uit deze charges werd de identificatie van de 25 antigeen-herkenningsplaatsen uitgevoerd overeenkomstig voorbeeld Vc en de produkten verdeeld in twee groepen één van 8 charges en één van 2 charges die respectievelijk werden aangeduid als anti-HCG-B antilichamen (A) en (B). Het anti-HCG-8 antilichaam (A) zal worden gebruikt als geinsolubiliseerd antilichaam en (B) als gemerkt antilichaam bij 30 de volgende voorbeelden. Wanneer deze antilichamen werden onderzocht op hun kruisreactie met luteni2erend hormoon (LH) onder toepassing van de boven weergegeven combinatie, dan bleek de reactiviteit minder dan 1% te bedragen, wanneer de reactiviteit op HCG op 100% werd gesteld.

8302708 -18-

Voorbeeld VIII

Meting van de totale hoeveelheid aan &ΓΡ, CEA en HCG

a) Produktie van antilichaam op reageerbuisreagens

Aan polystyreen reageerbuizen werd 1 cm3 van een oplossing met 3 3 5 daarin 1 mg/cm monoclonaal anti-APP antilichaam/ 0,5 mg/cm mono- 3 clonaal anti-CEA antilichamen en 0,25 mg/cm monoclonale anti-HCG antilichamen (zie de voorbeelden V, VI en Vlij toegevoegd en daarna elke reageerbuis 3 uren bij 37°C geincubeerd. Na afloop hiervan werd elke reageerbuis gewassen met PBS waardoor reagens-houdende reageer-10 buizen werden verkregen.

b) Bereiding van standaardoplossingen

Het APP volgens voorbeeld Va,, het CEA volgens voorbeeld Vla en HCG werden verdund met PBS met daarin 1% BSA waarbij oplossingen van 3 3 80, 40, 20, 10, 5 en 0 ng/cm , 80, 40, 20, 10, 5 en 0 ng/cm en 80, 15 40, 20, 10, 5 en 0 miu/cm3 respectievelijk werden verkregen.

c) Meting van APP, CEA en HCG

Aan de reagentia-houdende reageerbuizen met antilichaam verkregen volgens a) werden 0,1 cm3 porties van APP, CEA en HCG standaardoplossingen van de respectieve concentraties toegevoegd, gevolgd door 3 20 een toevoeging van 0,4 cm porties PBS met daarin 1% BSA waarna telkens de reactie 2 uren bij kamertemperatuur werd uitgevoerd. Na afloop van de reactie werden de reageerbuizen met gedestilleerd water gewassen. Afzonderlijk werden met enzym gemerkte antilichamen,verkregen volgens voorbeelden V, VI en VI1^ verdund en met PBS met daarin 1% BSA gemengd 25 tot oplossingen met daarin een 2000-voudige verdunning aan met enzym gemerkt anti- APP antilichamen eer 800-voudige verdunning van met enzym gemerkt anti-CEA antilichaam en een 500-voudige verdunning van met enzym gemerkt anti-HCG antilichaam. 0,5 cm3 hoeveelheden van dit mengsel werden aan de boven weergegeven reageerbuizen toegevoegd en de 30 reactie telkens 2 uren bij kamertemperatuur uitgevoerd. Na afloop van de reactie werden de reageerbuizen met gedestilleerd water gewassen, 3 0,5 cm porties van een substraatoplossing (6 mM/1 waterstofperoxyde en 20 mM/1 o-fenyleendiamine in PBS) toegevoegd, en de reactie onder uitsluiting van licht telkens 30 minuten uitgevoerd. Hierna werd aan 35 elke buis 2 cm3 1 N zoutzuur toegevoegd om de reactie af te breken en de absorptie van het reactiemengsel bij 492 nm gemeten. Ter vergelij- 8302708 -19- king werden tevens metingen uitgevoerd voor de gevallen waarin de gemerkte antilichamen niet waren gemengd maar afzonderlijk reageerden. De resultaten zijn opgesomd in de figuren 1 t/m 4. De combinaties van de gefnsolubiliseerde antilichamen en de gemerkte antilichamen die bij 5 de respectievelijke figuren zijn gebruikt, zijn weergegeven in tabel D.

TABEL D

Geinsolubiliseerd Gemerkt antilichaam antilichaam anti-AFP antilichaam, anti-CEA antilichaam en figuur 1 anti-HCG antilichaam ^. __ . ... . in het mengsel _ anti-AFP antilichaam __ anti-CEA antilichaam en . . __ . . .

anti-AFP antilichaam anti-HCG antilichaam alleen in het mengsel figuur 3 anti-CEA antilichaam alleen figuur 4 anti-HCG antilichaam alleen ----

Uit de resultaten blijkt, dat aangezien AFP, CEA en HCG geen kruisreacties aangaan zij· individueel kunnen worden gemeten door toepassing van de respectievelijk gemerkte antilichamen, zelfs indien deze stoffen in het mengsel aanwezig zijn}en dat zelfs wanneer de gemerkte 10 antilichamen in het mengsel worden gebruikt, slechts de respectievelijke corresponderende antigenen en antilichamen met elkander reageren en deze reactiviteit niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van andere stoffen.

Voorbeeld IX

15 Metingen bij s^rirnmnnsters van patiënten

Respectievelijke serummonsters van 10 leverkankerpatiënten, 10 maagkankerpatiênten, 10 dikke-darmkankerpatiënten, 10 patiënten met goedaardige ziekten en 10 gezonde mensen werden gemeten op hun totale hoeveelheid AFP, CEA en HCG. Elke meting werd verricht met 0,1 cm^ 20 van ofwel de standaardoplossing of het te onderzoeken serum volgens de procedure overeenkomstig voorbeeld VIIIc. De resultaten zijn uit- 8302708

- % X

-20- gedrukt door de direkte absorptiewaarde bij 492 nm en eveneens door de CEA-conversiewaarde verkregen door toepassing van deze absorptiewaarde in de CEA-standaardkromme. Ter vergelijking werden AFP, CEA en HCG ook afzonderlijk gemeten in dezelfde monsters. De resultaten zijn 5 weergegeven in tabel E.

8302708 -2t-

TABEL E

Uitvinding Vergelijking

Ziekte Absorptie CEA-omge-

bij zette AFP CEA HCG

•492 nm waard^ ng/απ ng/cm miu/ca ng/cm 0,570 20,0 20,1 2,1 2,0 0,392 10,7 10,5 5,3 1,8 1,608 85,2 101,8 1,1 3,1 0,231 4,0 2»3 2»2 2»°

Lever- 3,205 147,5 158,7 0,8 2,0 kanker 0<261 5,3 0,2 0,3 4,4 1,785 99,7 60,1 51,1 3,5 0,431 10,2 12,3 ^·}2 2*7 0,818 32,0 33,9 0,8 1,3 0,211 57,1 63,2 0,5 1,5 0,473 15,0 - 4,0 8,8 4,1 0,915 27,5 1,7 0,7 30,1 0,731 28,8 1,5 1,3 30,8 0,321 7,1 3,1 4,1 0,9

Maag- 0,492 19,8 1,1 1,7 21,1 kanker 0j501 16,8 1,0 17,2 0,8 0 ,481 18,1 16,3 0,3 4 ,1 0,336 8,1 4,4 1,1 3,1 j i 0,270 5,1 1,0 2,2 3,7 j i f i 0,260 4,7 2,0 1,0 4,0 j 8302708

Uitvinding Vergelijking

TABEL S

(vervolg)

V

-22-

Ziekte Absorptie CEA-omge-

bij zette AFP CEA HCG

•492 nm waard^ ng/cm ng/cin miu/cm ng/am 0,788 4,4 3,2 0,8 2,1 3,109 138,5 1,5 152,1 2,1 1,121 50,3 4,0 50,5 3,3 ' . 0,228 3,8 1,0 2,8 0,9 dikke- . darmkanker °’388 10’Χ l 0,8 0,470 14,8 1,2 13,0 3,2 0,323 6,9 8,8 0,7 1,4 0,450 13,9 10,3 6,1 1,5 2,712 119,3 138,1 1,5 1,8 0,620 20,9 . 2,5 21,8 2,0 0,231 · 4,.0 ' 1,3 0,-3 3,0 0,219 3,8 | 1,3 0,2 1,9 0,320 6,9 | 3,1 3,2 2,2 0,301 6,0 | 2,1 3,1 2,5 goedaardige. 0,371 9,8 j 2,2 6,1 1,1 ziekten ! 0,333- 8,5 j 2,5 1,8 3,5 0,261 4,9 | 0,8 2,1 3,3 i 0,321 7,1 ! 2,9 2,2 2,2 0,271 5,1 0,8 3,1 2,8 0,270 5,1 4,1 0,9 1,0 8302708

TABEL E

(vervolg)

Uitvinding Vergelijking -23-

Ziekte Absorptie GEA-omge- bij zette AFP ^ CEA ECG ^ •492 nm waard| ng/cm ng/cm mln/cm ng/cm f 0,230 4,0 1,1 1,2 2,2 0,241 4,2 1,2 1,3 2,2 0,281 5,3 3,1 1,5 3,2 gezonde 0,267 4,8 0,7 1,5 3,8 mensen _ _ 0,259 4,7 0,7 2,8 3,3 0,268' 4,8 2,0 2,1 2,0 0,221 3,7 1,1 1,5 1,8 0,260 4,7 0,8 3,1 1,7 0,253 4,5 0,7 2,1 2,1 0,231 4,0 0,7 0,9 2,1

Onderstaande tabel F geeft het percentage positieven bij de patiënten van elke ziekte,verkregen met de afzonderlijke metingen weer, vooropgesteld, dat de diagnostische standaardwaarden voor de verdachte gevallen van kanker 10 ng/cm3 op hoger voor AFP, 5 ng/cm3 of hoger 5 voor CEA en 5 miu/cm3 of hoger voor HCG bedragen. Tabel F omvat tevens de percentages positieven bij de patiënten voor elke ziekte bij de metingen van tabel E, waarbij bij meting van de totale hoeveelheid van de drie stoffen volgens de uitvinding een absorptie bij 492 nm van 0,350 of hoger of zijn omgezette CEA-waarde van 8,5 ng/cm3 of hoger 10 als positief wordt beschouwd.

8302708 r

-24-TABEL F

Ziekte Uitvinding AFP CEA HCG Eén oJ ™?er merkstoffen leverkanker 80% 80% 20% 0% 80% maagkanker 60 10 20 30 60 v 60 10 60 0 60 darmkanker goedaardige 10 0 10 0 10 ziekten gezonde q 0 0 0 0 mensen

Wanneer voorts de percentages positief bij de patiënten van elke ziekte worden berekend, aangenomen dat een patiënt kankerpositief is, indien ten minste één van de drie tumormerkstoffen afzonderlijk de standaardwaarde overschreed, waren deze percentages positief^die 5 eveneens in de rechter kolom van tabel F zijn opgenomen^ dezelfde als de percentages kankerpositief in het geval waarbij de drie tumormerkstoffen werden gemeten in hun totale hoeveelheid (de tweede kolom van tabel F). Dit toont aan dat bij een diagnose omtrent kanker het niet nodig is de tumormerkstoffen individueel te meten maar dat in de 10 praktijk een diagnose mogelijk is uit een gemeten waarde omtrent de totale hoeveelheid tezamen.

Voorbeeld X

Meting van de totale hoeveelheid AFP, CEA en HCG a) Produktie van polystyreenkorrels met daarop antilichamen 15 Monoclonale anti-AFP antilichamen, anti-CEA antilichamen en anti-HCG antilichamen bereid volgens de voorbeelden V, VI en VII werden 3 verdund tot concentraties van 1,0, 0,8 en 0,5 mg/cm . Polystyreenkorrels met een diameter van 2,5 mm werden in elke oplossing gedoopt en elk mengsel 3 uren bij 37eC weggezet. Na afloop van de reactie werden de 20 korrels met PBS gewassen waardoor antilichaam-houdende polystyreenkorrels werden verkregen waarna een reagens werd opgebouwd door telkens één korrel van elke charge tot een drietal samen te voegen.

8302708 -25-

b) Meting van AFP, CEA en HCG

Aan reageerbuizen met een binnendiameter van 10 mm en een lengte van 60 mm werden 0,1 cm^ porties van AFP-, CEA-en HCG-standaard-oplossingen met de concentraties volgens voorbeeld VUIb toegevoegd, 5 en 0,4 cm^ porties van een PBS-oplossing met daarin 1% BSA en een drietal verschillende antilichamen-boudende polystyreenkorrels daaraan toegevoegd. Na roeren liet men de reactie 2 uren bij kamertemperatuur duren. Na afloop van de reactie werden de polystyreenkorrels met gedestilleerd water gewassen. Afzonderlijk werden de met enzym gemerkte 10 antilichamen volgens de voorbeelden 5, 6 en 7 verdund en gemengd in een PBS met daarin 1% BSA tot oplossingen met een 2500-voudige verdunning van met enzym gemerkt anti-AFP antilichamen, een 1000-voudige verdunning van met enzym gemerkt anti-CEA antilichaam en een 650-voudige 3 verdunning van met enzym gemerkt anti-HCG antilichaam. 0,5 cm porties 15 van elk mengsel werden aan deze korrels toegevoegd en de reactie telkens 2 uren bij kamertemperatuur uitgevoerd. Na afloop van de reactie 3 werden de polystyreenkorrels met gedestilleerd water gewassen, 0,5 cm porties van een substraatoplossing faan 6 mM/1 waterstofperoxyde en 20 mM/1 o-fenyleendiamine in PBS) toegevoegd en elk mengsel 30 minuten 20 bij kamertemperatuur^beschut tegen het licht, omgezet. Hierna werd telkens 2 cm^ 1 N zoutzuur toegevoegd om de reactie af te breken.

De absorptie werd bij 492 nm gemeten. Ter vergelijking werden metingen verricht voor de gevallen, waarbij de gemerkte antilichamen niet waren gemengd maar afzonderlijk reageerden. De resultaten zijn opgesomd in 25 de figuren 5-8. De combinaties van de gelnsolubiliseerde antilichamen en de gebruikte gemerkte antilichamen bij de respectievelijke figuren zijn weergegeven in tabel G.

8302708 -26-

TABEL G

Geïnsolubiliseerd Gemerkt antilichaam antilichaam anti-AFP antilichaam, _ anti-CEA antilichaam en iguur anti-HCG antilichaam

Mengsel van 3 korrels in het mengsel (anti-AFP antilichaam^ . . , , , I anti-AFP antilichaam op korrel ƒ anti-CEA antilichaam > ' a een_ op korrel en 'anti-HCG antilichaam anti-CEA antilichaam op korrel J alleen fiomir s anti-HCG antilichaam . ^ alleen

Uit bovenstaande resultaten blijkt evenals uit voorbeeld VIII, dat AFP, CEA en HCG geen enkële kruisreactie vertonen, en afzonderlijk kunnen worden gemeten door toepassing van de respectievelijke gemerkte antilichamen, zelfs indien deze stoffen in een mengsel aanwezig zijn, 5 en dat zelfs indien de gemerkte antilichamen in een mengsel aanwezig zijn, slechts de respectievelijke corresponderende antigenen en antilichamen reageren en deze reactiviteit niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van andere stoffen.

Voorbeeld XI

10 Metingen bij' serummonsters van patiënten

Respectievelijke serummonster genomen van 10 leverkankerpatiënten, 10 maagkankerpatiënten, 10 dikke-darmkankerpatiënten, 10 patiënten met goedaardige ziekten en gezonde mensen,werden gemeten op hun totale hoeveelheid aan AFP, CEA en HCG. Elke meting werd verricht onder toepas-15 sing van 0,1 cm^ van ofwel een standaardoplossing of het te onderzoeken serum volgens methoden overeenkomstig voorbeeld VIIIc. De resultaten zijn uitgedrukt via de direkte absorptiewaarde bij 492 nm en tevens door de CEA-omzettingswaarde^verkregen door toepassing van deze absorptiewaarde op de CEA-standaardkromme. Ter vergelijking werden AFP, CEA 20 en HCG ook afzonderlijk gemeten in dezelfde monsters. De resultaten zijn weergegeven in tabel H.

8302708 -27- TABEL· Η

Uitvinding Vergelijking

Ziekte Absorptie CEA-omge- . bij zette AFP ^ CEA 2 ®-G 3 492 nm waard^ ng/cm ng/cm miu/cm ng/cm 1,55< 80< 320,5 9,6 1,2 t 1,55< 80< j173,6 3,0 1,4

0,221 5,6 j 4,0 0,6 1,4 I

1,186 58,1 I 57,3 0,3 3,0 lever- 0,518 21,6 13,8 7,2 1,6 kanker 0,197 4,3 1,4 0,3 2,3 1,547 79,8 ! 82,1 1,1 1,2 0,374 13,9 j 11,8 0,3 2,6 0,473 19,2 20,5 0,5 1,5

1,368 68,8 73,0 2,3 1,2 I

__i \

0,175 3,1 1,6 0,3 1,6 I

0,582 25,0 4,9 0,6 20,3 0,207 4,8 2,7 1,4 1,2 0,313 10,6 3,3 7,2 1,8 maag- 0,481 19,6 5,2 0,3 ^5,9 kanker 0,475 19,3 17,1 0,7 2,2 0,238 6,5 1,1 2,4 1,3 0,207 4,8 2,3 1,1 1,6 0,322 11,1 4,9 5,2 1,5 : 0,339 12,0 3,5 0,2 8,1 8302708 -28- TABEL Η (vervolg)

Uitvinding Vergelijking

Ziekte Absorptie CEA-omge-

bij zette AFP CEA HCG

•492 nm waard| ng/αη ng/am miu/cm ng/cm • 0,582 25,0 13,0 12,2 1,4 j 0,245 6,9 4,5 0,6 1,6 j 0,864 40,2 8,0 32,2 3,0 j 0,785 35,9 1,6 35,0 1,1 | dikke- ‘ 0,516 21,5 4,6 17,7 1,2 ! darmkanker " 0,249 7,1 1,2 4,0 2,0 0,192 4,0 1,5 1,3 1,7 0,269 8,2 7,0 0,4 1,1 0 j 239 12,0 μ 2,6 5,9 4,2 53,8 j' 3,3 54,1 1,6 » » * i * T"*1 " ï ' [ 0,232 6,2 | 5,2 0,2 1,0 i 0,265 8,0 7,3 0,4 1,1 ί 0,230 6,1 2,3 0,8 3,0 ; 0,2« 7,1 ! 3,4 1,4 2,5 $ goedaardige i 0,177 3,2 1,7 0,3 1,9 ziekten 0,247 7,0 1,9 4,0 1,2 0,484 19,8 4,2 12,4 3,8 0,245 6,9 2,2 0,7 4,0 0,216 5,3 3,8 1,4 1,1 0,203 4,6 2,8 1,8 1,2 8302708

Uitvinding Vergelijking -29- ΤΑΒΕΧ Η (vervolg)

Ziekte Absorptie CEA-omge- bij zette AFP CEA 3 HCG 3 492 nm waarde ng/cmJ ng/cm miu/cni ng/cm^ 0/155 2,0 1,2 0,2 1,0 0,165 2,5 2,0 0,2 1,0 0,168 2,7 1,8 0,3 1,2

Gezonde °'157 X'4 °'5 °'7 0,161 2,3 1,0 0,3 1,0 mensen 0,192 4,0 2,1 0,2 2,0 0,181 3,4 1,0 1,6 1,3 0,155 2,0 0,8 0,3 1,0 * 0,157 2,1 0,8 0,4 1,4 0,155 2,0 0,6 0,3 1,4

Tabel I geeft de percentages positieven aan bij de patiënten van elke ziekte, verkregen met de afzonderlijke metingen, aangenomen dat de diagnostische standaardwaarden voor een verwacht optreden van kanker 10 ng/cm3 of hoger voor AFP, 5 ng/cm3 of hoger voor CEA en 3 5 5 miu/cm of hoger voor HCG bedragen. Tabel I omvat tevens de percen tages positief bij de patiënten van elke ziekte bij de metingen in tabel H, waarbij, bij meting van de totale hoeveelheid van deze drie stoffen volgens de methode van de uitvinding}een absorptie bij 492 nm van 0,350 of hoger of een CEA-omzettingswaarde van 8,5 ng/cm3 of hoger 10 als kanker-positief wordt beschouwd.

8302708 -30-

TABEL I

Eén of meer

Ziekte Uitvinding AFP CEA HCG , Γ ZÏ * merkstoffen 80% 80% 20% 0% 80% leverkanker maagkanker 60 10 20 30 60 60 10 60 0 60 darmkanker goedaardige 1Q 0 10 0 10 ziekten gezonde 0 0 0 0 0 mensen

Wanneer voorts de percentages positieven bij de patiënten van elke ziekte werden berekend aangenomen dat een patiënt kankerpositief is indien ten minste één van drie tumormerkstoffen, individueel gemeten, de standaardwaarden overschreed,.*zijn deze percentages positief 5 eveneens in tabel I opgenomen; deze bleken dezelfde als de percentages kankerpositief in het geval wanneer de drie tumormerkstoffen als totaal werden gemeten. Dit toont aan, dat bij een diagnose van kanker het niet nodig is de tumormerkstoffen afzonderlijk te meten., maar in de praktijk een diagnose mogelijk is uit de gemeten waarde omtrent de 10 totale hoeveelheid.

Voorbeeld XXI

Meting van de totale hoeveelheid aan fibrinogeen en SP,, a) Produktie van antilichamen op sefarose 4B als reagens

Anti-fibrinogeen antilichamen (DAKO Co.) en anti-SP^ antilichamen 15 (DAKO Co.) werden respectievelijk verdund met 0,1 M natriumbicarbonaat-buffer met pH 8,3 tot concentraties van respectievelijk 5 en 3 mg/cm^.

3

Aan porties van 5 cm van de respectievelijke verdunningen werden 5 cm^ porties met CNBr-geactiveerde sefarose 4B (Pharmacia Co.) toegevoegd en elke reactie gedurende 2 uren bij kamertemperatuur uitgevoerd. 20 Na afloop van de reactie werd het reactiemengsel gewassen met 0,1 M acetaatbuffer met daarin 0,5 M natriumchloride en daarna met PBS, waarbij anti-fibrinogeen antilichamen op sefarose 4B en anti-SP^ antilichamen op sefarose 4B werden verkregen. Deze werden gemengd in een verhouding van 1 : 1 tot een reagens bestaande uit verschillende 25 antilichamen op sefarose 4B.

8302708 -31- b) Bereiding· van fibrinogeen-standaardoplossingen

Fibrinogeen van Sigma Co. werd met PBS met daarin 1% BSA verdund tot standaardoplossingen van respectievelijk 80, 40, 20, 10, 5 en 0 .

5 c) Bereiding van SP^-standaardoplossingen

Volgens de methode van Hans Bohn et al. (Bint' deel 33 : 377-378, 1976) werd 5 kg placenta geëxtraheerd met een fysiologische zoutoplossing en gefractioneerd met Rivanol en ammoniumsulfaat en ge- 3 zuiverd door een affiniteitschromatografie met 50 cm anti-SP anti- 3 10 lichamen op sefarose 4B (1 mg antilichaam/cm sefarose) tot 3,7 mg gezuiverd SP^. Dit gezuiverde SP^ werd met PBS met daarin 1% BSA verdund tot standaardoplossingen van respectievelijk 80, 40, 20, 10, 5 en 0 jig/ca?.

d) Produktie van met enzym gemerkte anti-fibrinogeen antilichamen 15 en met enzym gemerkte anti-SP^ antilichamen

De met enzym gemerkte anti-fibrinogeen antilichamen en met enzym gemerkte anti-SP^ antilichamen werden geproduceerd uit anti-fibrinogeen antilichaam en anti-SP^ antilichaam volgens de procedures van voorbeeld Vc ii.

20 e) Meting van fibrinogeen en SP

* 3

Aan afzonderlijke reageerbuizen werden 0,1 cm porties fibrinogeen en SP,-standaardoplossingen met de respectievelijke concentraties 3 3 volgens b) en cl toegevoegd, gevolgd door een toevoeging van 0,4 cm porties van een PBS-oplossing met daarin 1% BSA en 0,2 cm^ porties van 25 het reagens bestaande uit antilichamen-houdende sefarose 4B verkregen volgens a) in deze volgorde, waarna de reactie telkens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur werd uitgevoerd. Na afloop van de reactie werd de inhoud van elke reageerbuis gecentrifugeerd en met gedestilleerd water gewassen. Afzonderlijk werden met enzym gemerkte anti-fibrino- 30 geen antilichamen en met enzym gemerkte anti-SP^ antilichamen volgens d) gemengd en verdund tot een 1500-voudige verdunning van de met enzym gemerkte anti-fibrinogeen antilichamen en 1000-voudige verdunning van de met enzym gemerkte anti-SP^ antilichamen. Porties van 0,5 cm^ van het mengsel werden toegevoegd aan de reageerbuizen en het mengsel in 35 elke reageerbuis 1 uur bij kamertemperatuur omgezet. Na afloop van de reactie werden de inhouden van de reageerbuizen gecentrifugeerd en met 8302708 -32- gedestilleerd water gewassen, waarna 0,5 cm^ porties van een substraat-oplossing (6 mM/1 waterstofperoxyde en 20 mM/1 o-fenyleendiamine in PBS) werden toegevoegd en elk mengsel 30 minuten onder uitsluiting 3 van licht omgezet. Vervolgens werd 2 cm IN zoutzuur aan elke 5 reageerbuis toegevoegd om de reactie af te breken en de absorptie van de verkregen oplossing bij een golflengte van 492 nm gemeten. De resultaten zijn opgesomd in fig. 9.

Voorbeeld XIII

Meting van de totale hoeveelheid AFP, CEA en HCG

10 a) Bereiding van de standaardoplossingen AFP bereid volgens voorbeeld Va, CEA, bereid volgens voorbeeld

Vla en HCG werden met PBS met daarin 1% BSA verdund tot oplossingen 3 3 3 van respectievelijk 80 ng/cm , 80 ng/cm en 80 miu/cm en deze oplossingen in de-verhoudingen volgens tabel K gemengd tot vijf verschil-15 lende gemengde oplossingen.

TABEE K

Mengoplossing AFP CEP HCG

1 111 2 5 11 20 3 1 5 1 4 115 5 3 2. 1

Elk van deze vijf mengoplossingen werd 2-voudig, 4-voudig en 8-voudig met PBS met daarin 1% BSA verdund tot standaardoplossingen.

25 b) Meting van AFP, CEA en HCG

Onder toepassing van 0,1 cm^ porties van de volgens a) verkregen standaardoplossingen en de mengsels van drie verschillende gemerkte antilichamen werd de meting uitgevoerd overeenkomstig voorbeeld VIIIc. De respectievelijke standaardkrommen zijn weergegeven in fig. 10.

30 Zelfs indien de standaardoplossingen met AFP, CEA en HCG in een mengsel werden toegepast, werden standaardkrommen overeenkomstig fig. 1 verkregen. Dit toont aan, dat zelfs indien AFP, CEA en HCG in een mengsel aanwezig zijn, ze afzonderlijk kunnen worden gemeten en dus de gemeten waarde als totaal hoeveelheid volgens de methode van de uitvinding kan 35 worden verkregen.

8302708

Claims (47)

1. Immunologische meetmethode waarbij een monster met twee of meer te meten stoffen gelijktijdig met twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen of antigenen wordt omgezet en deze stoffen worden gemeten op basis van een immunologische reactie tussen deze stoffen 5 en de twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen of antigenen.

2. Meetmethode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen of antigenen tezamen aan een onoplosbare drager zijn gebonden.

3. Meetmethode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat twee of 10 meer onoplosbaar gemaakts antilichamen of antigenen aan afzonderlijke onoplosbare dragers zijn gebonden.

» 4. Meetmethode volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de on oplosbare drager wordt gevormd door rode bloedcellen, een polymeer-latex, roetzwart of het inwendige oppervlak van een reactiehouder.

5. Meetmethode volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de on oplosbare dragers worden gevormd door rode bloedcellen, een polymeer-latex en roetzwart.

6. Meetmethode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de immunologische reactie een agglutinatiereactie of een agglutinatieremanings- 20 reactie is.

7. Meetmethode volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de immunologische reactie een agglutinatiereactie of een agglutinatieremmings-reactie is.

8. Meetmethode volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de immuno-25 logische reactie een agglutinatiereactie of een agglutinatieremmings- reactie is.

9. Meetmethode volgens conclusie 1, met hét kenmerk, dat de immunologische meetmethode een enzym-immunoproef, een radio-immunoproef of fluorescentie-immunoproef is.

10. Meetmethode volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de immunologische meetmethode een enzym-immunoproef, een radio-immunoproef of een fluorescentie-immunoproef is. 8302708 r -34-

11. Meetmethode volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de immunologische meetmethode een enzym-immunoproef, een radio-immuno-proef of een fluorescentie-immunoproef is.

12. Meetmethode volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de 5 immunologische meetmethode wordt gevormd door een sandwioh-methode, een competitieve reactiemethode of een immunometrische methode.

13. Meetmethode volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de immunologische meetmethode wordt gevormd door een sandwich-methode, een competitieve reactiemethode en een immunometrische methode.

14. Meetmethode volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de immunologische meetmethode wordt gevormd door een sandwich-methode, een competitieve reactiemethode of een immunometrische methode.

15. Meetmethode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de antilichamen antilichamen jegens tumormerkstoffen zijn.

16. Meetmethode volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de antilichamen antilichamen jegens tumormerkstoffen zijn.

17. Meetmethode volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de antilichamen antilichamen jegens tumormerkstoffen zijn.

18. Meetmethode volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de 20 antilichamen antilichamen jegens tumormerkstoffen zijn.

19. Meetmethode volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de antilichamen antilichamen zijn tegen tumormerkstoffen.

20. Meetmethode volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de antilichamen antilichamen zijn tegen tumormerkstoffen.

21. Meetmethode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

22. Meetmethode volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

23. Meetmethode volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de 30 antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

24. -Meetmethode volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

25. Meetmethode volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

26. Meetmethode volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de antilichamen monoclonale antilichamen zijn. 8302 7 Ü8 -35-

27. Meetmethode volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat de antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

28. Immunologisch metingsreagens, geschikt voor een reactie met een monster met daarin twee of meer te meten stoffen, welk reagens een S mengsel omvat van twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen of antigenen.

29. Metingsreagens volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat de twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen of antigenen tezamen gebonden zijn aan één onoplosbare drager.

30. Metingsreagens volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat de twee of meer onoplosbaar gemaakte antilichamen of antigenen aan afzonderlijke onoplosbare dragers zijn gebonden.

31. Metingsreagens volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat de onoplosbare drager wordt gevormd door rode bloedcellenzen latex met 15 hoog molecuulgewicht, roetzwart of een inwendig oppervlak van een reactiehouder.

32. Metingsreagens volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat de onoplosbare drager wordt gevormd door rode bloedcellen, een polymeer-latex of roetzwart.

33. Metingsreagens volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat het reagens geschikt is voor een agglutinatiereactie of een agglutinatie-remmingsreactie.

34. Metingsreagens volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat het reagens geschikt is voor een agglutinatiereactie of een agglutinatie- 25 remmingsreactie. %

35. Metingsreagens volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat het reagens geschikt is voor een agglutinatiereactie of een agglutinatie-remmingsreactie.

36. Metingsreagens volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat het 30 reagens geschikt is voor toepassing bij een immunologische meetmethode in de vorm van een enzym-immunoproef, een radio-immunoproef of een fluorescentie-immunoproef.

37. Metingsreagens volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat dit reagens geschikt is voor toepassing bij een enzym-immunoproef, een 35 radio-immunoproef of een f luorescentie-immunoproef. 8302708 r -36- Ί

38. Metingsreagens volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat het reagens geschikt is voor toepassing bij een enzym-immunoproef, een radio-immunoproef of een fluorescentie-immunoproef.

39. Metingsreagens volgens conclusie 36, met het kenmerk, dat dit 5 geschikt is voor toepassing bij een meetmethode volgens de sandwich- methode, een competitieve reactiemethode of een iimnunometrische methode.

40. Reagens volgens conclusie 37, met het kenmerk, dat dit geschikt is voor een sandwich-methode, een competitieve reactiemethode of een 10 iimnunometrische methode.

41. Metingsreagens volgens conclusie 38, met het kenmerk, dat dit geschikt is voor een sandwich-methode, een competitieve reactiemethode of een immunometrische methode.

42. Metingsreagens volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat zijn 15 antilichamen antilichamen zijn tegen tumormerkstoffen.

43. Metingsreagens volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat zijn antilichamen antilichamen zijn tegen tumormerkstoffen.

44. Metingsreagens volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat zijn antilichamen antilichamen zijn tegen tumormerkstoffen.

45. Metingsreagens volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat zijn antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

46. Metingsreagens volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat zijn antilichamen monoclonale antilichamen zijn.

47. Metingsreagens volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat zijn 25 antilichamen monoclonale antilichamen zijn. 8302708