KR940002521B1

KR940002521B1 - 인체 프로릴 4-히드록시라아제의 정량 방법

Info

Publication number: KR940002521B1
Application number: KR1019860001590A
Authority: KR
Inventors: 신이찌 요시다; 에이지 이시가와; 아끼라 오오지마; 야스오 바이; 야스데루 무라가끼; 가즈요시 이나다; 가즈시 이와다; 캔이찌 오바다; 야스오 나가이
Original assignee: 후지야꾸힝 고오교오 가부시끼가이샤; 다께다 고오이찌로오
Priority date: 1985-03-06
Filing date: 1986-03-06
Publication date: 1994-03-25
Also published as: ES552695A0; DE3686068T2; ES8802545A1; AU590746B2; EP0193935B1; KR860007545A; AU5425386A; EP0193935A3; EP0193935A2; DE3686068D1

Abstract

내용 없음.

Description

인체 프로릴 4-히드록시라아제의 정량 방법

제1도 및 제2도는, 각각 인체 PH(인체 플로릴 4-히드록시라아제의 검량선을 나타낸 도면.

제3도는 건강한 정상인 자의 혈청중의 인체 PH량을 나타낸 그래프.

제4도는 인체 PH의 검량선을 나타낸 도면.

제5도는 인체 혈청의 겔 여과 용출도 및 인체 PH량을 나타낸 그래프.

제6도는 인체 PH화분의 전기영동후, 니트로셀룰로스지에 전사하였을때의 패턴을 나타낸 도면.

제7도는 실시예 6의 측정시에 사용한 인체 PH 표준곡선을 나타낸 그래프로서, 고상담체 부착항체로서, 마우스항인체 PH모노클로오널 항체를 부착시킨 폴리스티렌 보올을 표지항체로 하여[¹²⁵I]표지토끼항 인체 PH 폴리클로오널 항체 IgG를 사용하여 행한 샌드위치법으로서 얻은 인체 PH 표준곡선을 나타낸 것이다.

본 발명은, 간장질환을 간단히 진단하는데 유용한 인체 프로릴 4-히드록시라아제(human prolyl 4-hydroxylase) 정량방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 인체프로릴 4-히드록시라아제에 대한 모노 클로오널항체 및/또는 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 폴리클로오널 항체를 이용하여, 샌드위치법에 의한 방사선면역학적 측정법 또는 효소면역학적 측정법에 의하여 인체 프로릴 4-히드록시라아제를 정량하는 방법으로서, 고상담체에 부착시키는 항체로서, 인체프로릴 4-히드록시라아제에 대한 모노클로오널 항체, 또는 인체프로릴 4-히드록시라아제에 대한 폴리 클로오널 항테를 사용하고, 한편, 효소 또는 방사선원소를 표지로서 부여하는 항체로하고, 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 모노클로오널 항체 또는 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 폴리 클로오널항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 인체프로릴 4-히드록시라아제의 정량방법을 제공하는 것이다.

종래에, 인체 혈액중의 인체 프로릴 4-히드록시라아제(이하 인체 PH라 약칭한다)의 활성을 측정하는 방법으로서는, 프로토콜라아겐의 4-L-프롤린을³H 표지한 것을 기질로하여, 생성한³H표지수를 진공증류로서 포촉을 하여, 그 방사능을 측정하는 방법이 알려져 있다(Hutton등, Anal. Biochem., 16, 384-394, 1966).

또한,¹⁴C 프롤린표지의 프로토콜라아겐을 기질로 하여 생성한 4-수산화¹⁴C프롤린의 방사능을 측정하는 방법이나(Juva등, Anal. Biochem., 15, 77-83, 1966), (pro-pro-Gly)₅, 혹은 (pro-pro-Gly)₁₀을 기질로하여 2-옥소(1-¹⁴C)-글루타르산으로부터 유리하는¹⁴CO₂을 포촉하여 측정하는 방법이 있다(Berg등, J. Biol, Chem. 248, 1175-1182, 1973).

그러나, 상기한 방법은 어느것이나 복잡한 조작을 필요로 하며, 또한 측정이 시간이 걸린다는 결점이 있다.

또한 혈중의 인체 PH의 거의 대부분은 효소학적으로는 불활성화 된 상태에 있으므로, 단지, 혈중의 인체 PH활성을 측정하여서는, 그 측정은 참된 인체 PH의 량을 측정한 것이되지 못한다.

면역학적 측정법으로서는, Eur. J. Biochem., 60, 399-405, 1975에 기재된 Tuderman등의 방사선 면역학적 측정법이 있지만, 거기에서는 표지 항원을 사용하여 항체에 대한 비표지항원과 표지항원과의 사이에서 일어나느 경합현상을 응용하여, 거기에 제2항체를 반응시켜서, 인체 PH의 정량을 행하고 있다.

이 경합현상엥 사용된 항체는 인체 PH에 대한 집토끼의 항 혈청인 것이며, 항체의 특이성이 낮고, 감도는 인체 PH로서 표시하여 5∼10ng이며, 또한, 항원·항체 결합물과 미결합의 항원과의 분리에는 원심조작을 필요로하는 등 간편하지 못하여, 실용상으로는 만족할만한 방법이라고는 할 수 없다.

본 발명인들은, 간편한 방법으로서 인체 PH를 특이적으로 정량하는 방법을 여러가지로 연구한 결과, 인체 PH에 대한 폴리 클로오널 항체 및 모노 클로오너항체를 사용하여, 샌드위치법에 의거하여 효소면역학적 정량법(EIA) 혹은 방사선 면역학적 정량법(RIA)을 행함으로서 소량의 시료로서, 정밀도가 높으며, 신속하게 측정하는 방법을 개발하였다.

즉, 본 발명은, 고상담체에 인체 PH에 대한 모노클로오널 항체 또는 인체 PH에 대한 폴리클로오널 항체를 부착시켜서 불용화 고체로 하고, 한편, 인체 PH에 대한 클로오널 항체 또는 인체 PH에 대한 모노 클로오널 항체에, 효소 또는 방사선원소를 결합시켜서 표지항체롤 하고, 이들을 사용하여 효소면역학적 정량법(EIA) 또는 방사선 면역학적 정량법(RIA)에 의하여, 인체 PH를 정량하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법은, 다수의 검체를 단시간에 정밀도가 높게 측정할 수 있게 하는 것이며, 만성 간염, 간경변 및 알코올 간장해등, 간장질환에서 일어나는 간선유화의 판정에 효과가 있다.

본 발명의 방법에 의하여, 인체 PH를 정량하는 데에는, 인체 PH의표준액 및 검체를 사용하여, 각각, 항체를 부착시킨 고상담체에 반응을 시켜, 이어서 미반응물을 제거한 후, 세정을 하고, 이어서 여기에 효소표지 또는 방사선원소 표지를 부여한 항 인체 PH항체를 가하여서 반응하게 한다.

반응이 되지 아니한 미반응의 표지항체를 제거한 후, 인체 PH를 통하여 결합한 표지항체의 방사능 또는 효소 활성을 측정한다. 측정법 그 자체는, 통상의 방사선면역학적 측정법 또는 효소면역학적 측정법에 의하는 것으로서, 표준액에서 얻어진 수치로부터 표준곡선을 작성하여, 이것에 의거하여 검체중의 인체 PH의 양을 산출한다.

고상담체로서는 통상, 면역학적 측정에서 사용되는 고상담체, 예를들면, 폴리스티렌 보올, 유리구슬, 구멍을 뚫어 놓은 폴리염화 비닐판등이 사용이 된다.

이것들은, 측정의 정밀도를 확보하기 위하여, 그 보올의 싸이즈 또는 구멍의 싸이즈는, 극도로 엄격한 정확성이 요구된다.

본 발명에 있어서, 효소 표지 혹은 방사선원소표지를 부여하는 항체로서는, 항체함유물을 황산암모니아 분화(盆畵) 혹은 황산나트륨 분화한 후, DEAT-셀룰로오스 칼럼 정제한 IgG 화분(畵分)이 사용된다.

폴리클로오널 항체의 경우에는, 여기에 더하여 세파로우즈 4B 어피니티 칼럼으로 정제한 것을 사용하면 특이성이 증대하여 바람직하다.

또한, 펩신소화로서 얻어지는 F(ab')₂혹은 그 환원물(Fab')을 사용할 수도 있다.

본 발명 방법에서 사용하는 모노 클로오널 항체, 폴리 클로오널 항체로서는, 이들항체에 있어서의 특이적 결합부분 F(ab')₂혹은 Fab'의 것을 사용하는 형태의 것도 포함된다.

항체에 대한 방사선 원소의 표지부여는, 단백질 표지에 관하여 알려지고 있는 방법을 사용하여 행할 수 있다.

방사성 핵 종류로서는 [¹²⁵I]를 사용하는 것이 바람직하며, 이 방사성 핵 종류를 사용하는 표지부여의 방법으로서는, 페록시다아제에 의한 옥소화법이 적합합며, Immunochemistry 1, 203-206(1974)의 Thorell들의 방법이 바람직하다.

최근의 면역검사에 있어서는, 만성 간염, 간경변, 및 알코올 간장애등의 간장질환에서 생기는 간선유화에 수반하여, 조직 및 혈액중엥 인체 PH량의 현저한 증가가 인정되고 있다.

뒤에 계기될 제5a표 및 제5b표에 볼수 있듯이, 본 발명의 방법으로 측정한 간경변 환자 혈청중의 인체 PH량 측정치는, 건강하고 정상인사람의 혈청중의 그것보다 의미가 있는 높은 수치인 것이 인정되고 있으며, 본 발명에의한 방법에 의하면, 혈청중의 인체 PG량을 측정하는 것에 의하여, 환자에 부담이 되는 바이옵시를 하는 일없이 간질환 특히 간선유화를 예지할 수 있게 된다.

종래에 간 기능판정법으로서 사용되고 있는 GOT(글루타민옥살로초산트랜스 아미나제, glutamate-oxaloacetate transaminase), GPT(글루타민피르빈산트랜스아니나제, glutamate-pyruvate transaminase), 및 LDH(락테이트 디히드로게나제, Lactate dehydrogenase) 및 γ-GTP(γ-글루타밀 트랜스펩티다제, γ-glutamyltrans peptidase)등의 활성측정으로서는, 간기능의 선유화를 판정할수는 없으며, 이러한 사실은 본 발명인들에 의하여 확인되고 있다.

따라서 혈중의 인체 PH량을 특정하는 것에 의하여, 이런 종류의 질환을 조기에 발견하는 것이 기대되고, 본 발명의 방법에 의하여, 인체 PH량 측정에 의거한 간장 조직 선유화의 진단을 행할 수 있게 되므로, 본 발명은 대단히 유용성이 높은 것이다.

다음에 실시예를 따라서, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

항 인체 PH로모 클로오널 항체의 제작

(a) 항원 인체 PH(Ec.1. 14. 11. 2)의 조제인체의 태반을 재료로 하여, Eur. J. Biochem., 52, 9-16(1975)에 기재된 Tuderman등이 발표한 방법을 따라서 polyL-proline을 SePHarose 4B에 CNBr로서 카플링시킨 어피니티 크로마토그래피로서 인체 PH를 포촉하고, 또한 Bio-Gel A-1.5m(Bio-Rad) 칼럼으로 정제하여 순화하였다.

여기에서 얻어진 인체 PH 표준품을 J. Virol., 10, 211-219(1972)에 기재된 Baum등이 발표한 방법을 따라 도데실 황산나트퓸 폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SPS-PAGE)으로 조사 하였던바, 그 순도는 약 90%이었다.

(b) 항체생산 세포의 조제

연령이 8주된 BALB/C 암쥐 3마리를 먼저 프로인드 완전 보조액 속에서, 상기 (a)로서 정제한 인체 PH로서 최초 1회의 면역을 한다.

위에 50㎍의 인체 PH를, 0.5㎖의 용액으로 복강내에 투여를 한다.

또한 30일째, 60일째에 생리식염수에 용해한 동일량의 인체 PH를 추가면역한다.

최종의 면역으로서 90일째에 정맥내 투여(50㎍/100㎕ 생리식엄수)에 의하여 보존면역을 하여, 3일후에 쥐의 비장을 꺼집어 내어, 비장세포를 조제한다.

(c) 세포융합

다음의 재료와 방법을 사용한다.

RPMI 1640배지 : RPMI No. 1640(Difco Laboratories)에 중탄산나트륨(12mM), 피르빈산 나트륨(1mM), L글루타민(2mM), 페니실린 G칼륨(50μ/㎖), 황산트랩토마이신(50μ/㎖) 및 황산아미카신(100㎍/㎖)을 가하여, 드라이 아이스로서 pH를 7.2로 하고, 0.2㎛의 Toyo의 멤브레인 필터로서 제균 여과한다.

NS-1배지 : 상기의 RPMI 1640배지에 제균여과한 송아지의 태아혈청(Granite Diagnostic, Inc,)을 15%(v/v)의 농도에 가한다.

HAT배지 : 상기의 NS-1배지에, 다시 히포크산틴(10μM), 아미노프테린(0.4μM), 및 티미딘(16μM)을 가한다.

HT배지 : 아미노프테린을 제거한 이외에는, 상기 HAT배지와 동일한 조성의 것이다.

PEG 4,000용액 : RPMI 1640배지의 폴리에티렌 글리코올 4,000(PEG 4,000, Merck & Co., Inc.) 50%(w/w) 무혈청용액을 조제한다.

8-아자구아닌 내성 미엘로마(8-azaguanine resistant myeloma)세포 NS-1(P3-NS 1-1)과의 융합은 Selected Method in Cellular Immunology(ed. B. B. Mishell and S. M. Shiigi), W. H. Freeman and Company(1980), 351-372에 기재된 Oi등의 방법을 약간 개량변경하여 행하였다.

상기 (b)에서 조제한 1.5×10⁸개의 유핵비장세포(생세포률 95%)를, 2.8×10⁷개의 NS-1미엘로마세포(생세포률 95%)와 융합한다.

비장세포와 미엘로마세포와를 별도로 상기의 RPMI 1640배지에서 세척한다.

다음에 같은 배지에서 현탁하고, 융합을 시키기 위하여 상기의 비율로 혼합을 한다.

용량 50㎖의 원추형상의 스티렌 수지제의 시험관(Corning Glass Works)를 사용하여, 40㎖의 RPMI 1640배지중에 400×g, 10분간 원심을 하여, 상기의 혈청을 완전히 빨아낸다.

침전세포에 37℃로 가온된 PEG 4,000용액 1㎖를 조용히 교반하면서 1분동안 적하를 하여, 다시 1분간 교반하여 세포를 재현탁하여 분산시킨다.

다음에 37℃로 가온된 RPMI 1640배지 1㎖를 1분동안에 적하한다.

이 조작을 다시 1회 반복한 후, 동 배지 7㎖를 2∼3분 동안 계속하여 교반하면서 적하하여 세포를 분산시킨다.

이것을 400×g, 10분간 원심분리하여, 상청을 완전히 흡인하여 제거한다.

다음에 이 침전세포에 37℃로 가온된 NS-1배지 10㎖를 재빨리 빠른속도로 가하여, 세포의 큰 덩어리를 10㎖의 피펫을 사용하여 피펫팅하여 분산시킨다.

그리고 또 동 배지 20㎖를 가하여 희석하고, 폴리스티렌제 96-구멍짜리 마이크로웰(Croaing Glass Works)에 웰당 5.9×10⁵개/0.1㎖ 세포를 빨아 드린다.

또한, 이때에 사용한 96-구멍짜리 마이크로웰의 사전처리로서 0.2㎖의 NS-1배지를 가하여, 탄산가스 배양기중(37℃)에서, 하루방 동안 보온하여, 사용할때에 배지를 흡인하여 제거한다.

세포융합이 완료한 마이크로웰을 7% 탄산가스/93% 공기중에서 온도 37℃, 습도 100% 이하로 인큐베이트 한다.

(d) 선택배지에 의한 하이브리도우미의 선택적 증식 배양한 1일째되는 날에 파스퇴르 피펫으로 HAT배지 2방울(약 0.1㎖)를 가한다.

2일, 3일, 5일, 8일, 11일째에 배지의 절반분(0.1m)을 새로운 HAT로 갈아끼운다.

14일재에는 HT배지로 바꾸어서, 그 이후 3∼4일마다 동일한 조작을 되풀이 한다.

통상은 2∼3주간으로서 충분한 하이브리도우마의 생육이 관찰된다(융합률 83%)

하이브리도우마 생육전웰에 대하여, 다음 항(e)에 기재된 고상-항체 결합테스트법(ELISA)으로서 양성웰을 체크한다.

20개/288웰이 양성으로서 검출되엇다.

다음에 피이터로서 10⁷개의 쥐 흉선세포를 함유한 HT배지 1㎖를 폴리스티렌제 24구멍 셀 웰(Corning Glass Works)에 가한것을 사용하여, 상기에서 검출된 각 양성 하이브리도우마 20개의 전체 내용물을 옮긴다.

이것을 상기 (d)에 있어서와 똑같이 7% 탄산가스 존재하에, 37℃에서 약 1중리동안 이큐베이트한다.

그 동안, 1∼2의 각 웰의 상청 0.5㎖를 새로운 HT배지 0.5㎖와 교환한다.

하이브리도우마가 충분히 생육한 시점에서 ELISA에 의하여 양성임을 재확인하고, 각각에 대하여 다음의 항(f)에 기재된 한계희석법에 의한 클로오닝을 행한다.

또한 클로오님에 사용한 후의 잔류액을 폴리스티렌제 25㎠ 조직배양 플라스크(Corning Glass Works)에 옮겨, 동결 보존용 시료를 조재한다.

(e) 고상-항체부착 테스트(ELISA)에 의한 항 인체 PH 항체 산생 하이브리도우마의 검색 Anal. Biochem. 104, 205-214(1980)에 기재된 Rennard등이 발표한 방법을 약간 개량변경한 방법을 사용한다.

이 방법은 하이브리도우마 항체의 검출에 적합하다. 96구멍용 마이크로 타이트레이션 플레이트(Flow Labaratories, Inc.)를 0.5∼1.0㎍의 인체 PH로서 코우트하고, 또한 기타를 1%의 소의 혈청 알부민(BSA)으로 블로크한다.

겨이에 하이브리도우마 생육 웰의 상철의 일부를 가하여 실내온도에서 약 1시간동안 인큐베이트한다.

2차항체로서 서양 고사리 페록시다아제 표지 염소항 쥐 IgG(TAGO, Inc.)를 가하고, 또한 실내온도에서 약 1시간동안 인큐베이트한다.

다음에 고산화수소와 기질로 쓰이는 0-페닐렌디아민을 가하여 생성한 갈색의 정도를 육안으로 안성적으로 판정하던가, 혹은 코로나 2파장 마이크로플레이트 광도계(MTP-22,코로나 전기사제)를 사용하여 500㎚의 흡광도를 측정한다.

(f) 클로오닝

각 웰 중에는, 2종류이상의 하이브리도우마가 생육되고 있을 가능성이 있으므로, 한계 희석법에 의하여 클로오닝을 행하여, 모노 클로오널 항체산생 하이브르도우마를 취득한다.

NS-1배지 ㎖당 피이더로서 10⁷개의 쥐 흉선세포를 함유한 클로오닝배지를 조제하여, 96구멍 마이크로 웰의 36웰, 36웰 및 24웰에 웰당 5개, 1개 및 0.5개의 하이브리도우마를 가한다.

5일째, 12일재에 각각 약 0.1㎖의 NS-1배지를 추가한다.

클로오닝 개시후, 14∼15일에 충분한 하이브리도우마의 생육을 확인될 수 있고, 콜로니 형성 웰이 50%이상인 그룹에 대하여 ELISA를 행한다.

테스트한 전체 웰이 양성이 아닌 경우, 항체 양성웰중의 콜로니수를 확인하고, 웰중에 1콜로니의 웰을 4∼6개 선정하야 다시 클로오닝한다.

그리하여 최종적으로 8주(株)의 클로닝을 얻었다.

(g) 모노클로오널 항체의 인 비트로(invitro) 증식 및 인 비조(in vivo) 증식 모노클로어널 항체는, 헝더진 클로운(clone)을 NS-1배지 등과 같은 적당한 배양액으로 배양(인 비트로 증식)을 하여, 그 배양한 상층 혈청으로부터 얻을 수가 있다(모노 클로오널 항체 단백농도는 10∼100㎍/㎖이다).

한편 대량으로 항체를 얻기 위하여는, 비장세포와 미엘로마셀포의 유래동물과 동일계열의 동물(BALB/C,쥐)에, 종양형성 촉진제 프리스탄(Pristane)(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸, Aldrich Chemical사)을 쥐1마리당 0.5㎖ 복강내에 투여한다.

1∼3주 후에 하이브리도우마 1×10⁷개를 같은 방법으로 투여하는 것에 의하여 인 비보로 1∼2주 후에 모노 클로오널 항체 단백질 농도 4∼7㎎/㎖의 복수를 얻을 수가 있다.

(h) 모노클로오널 항체의 중쇄, 경쇄의 이소타입 얻어진 각각의 복수를 우선, 인체 PH를 코우트한 마이크로 타이트레이션 플레이트에, 상술한 ELISA 법을 따라 결합시킨다.

세척한 후, 이소타입 큭이성토끼 항쥐 Ig 항체(Zymde Laboratories)를 가한다.

세척후, 서양 고사리 페록시다아제 표지의 염소항 토끼 IgG(H+L) 항체를 가하여, 기질로서 2,2'-아지노-디(3-에틸벤조티아졸린황산-6) 및 과산화수소를 사용하여 검출하였다. 그 결과를 정리하여 제1표에 나타내었다.

또한, 얻어진 각 모노클로오널 항체의 인체 PH의 서브 유니트와의 교차반응성을 prec. Natl. Acad. Sci. U S A, 76, 4350-4354(1979)에 기재된 Towbin등이 발표한 웨스턴 블로팅법에 의하여 조사를 하였다.

얻어진 8개의 모노 클로오널 항체 중에서, 4개는 분자량 64KD α체인에, 나머지 4개는 60KD의 β체인에 반응을 하였다(제1표, 서브 유니트에 대하여서는, Chen-Kiang 등 proc. Nattl., Acad. Sci. U S A, 74, 4420-4424, 1977 참조).

(i) 모노 클로오널 항체의 정제

상기한 (g)에서 얻어진 각 복수를 황산암모니아 분화(40% 포화) 후, IgG 클라스트는 식염 0.06M를 함유하는 400㎜ 인산완충액과 pH 8.0으로 평형화한 DEAE-Sephacel(pharmacia 사)의 비흡착화분을 분취하여, 이 IgG 화분을 다시 0.42M 식염을 함유한 50㎜ 인산완충액과 pH 7,4로 평형화한 Sephacryl S-300 Superfine(pharmacia 사)칼럼으로 겔 여과하여, 배지중에 있는 송아지의 태아 혈청 및 위 유래의 단백질을 분리하여 제거하였다.

IgA 및 IgM 클라스의 정제에 있어서는 DEAE-Sephacel 칼럼 크로마토그래피에 있어서 식염 0.06M로부터 1.0M까지의 그래디언트(gradient)로서 각각 양 화분을 용출하였다.

기타는 IgG 클라스의 경우와 동일한 조건으로 정제하였다.

[실시예 2]

항혈청, 인체 PH 폴리 클로오널의 제작

(a) 면역

실시예 1(a)의 경우와 동일하게 인체태반응로 정제로 인체 PH를 프로인드 완전 보조액과 같이 토끼(

)에 최초 1회의 면역을 한다.

200㎍의 인체 PH를 1㎖의 보조액과의 혼합액으로 하여, 등 부분 15개소에 피하에 투여하고, 다시 4개월간 2주마다 등부분 피하에 프로인드 완전 보조액중, 200㎍을 추가 면역하였다.

각 추가면역 후, 혈액을 채취하여 얻어진 그 항혈청의 인체 PH 활성의 조해정도는 Anal. Biochem. 16, 384-394(1966)에 기재된 Hutton 등이 발표한 방법을 따라 조사하였던바, 4㎕에서 56%의 활성조해를 나타내었다.

이 항혈청은 outhterlony 면역확산법 및 면역전기 영동법에서 1개의 침강선을 만든 것으로 보아서 인체 PH에 특이적인 것이라고 판정되었다.

(b)항혈청의 정제

상기 (a)으로 얻어진 토끼 항혈청을 황산나트륨 뷴화(18% 포화)후, 17.5㎜ 인산 완충액과 pH 6.3으로 평형화한 DEAE-세룰로스(ED 52, Whatman 사)) 칼럼의 비흡착화분을 분취하여, 인체 PH 폴리 클로오널 항체(정제 IgG 프랙션)를 얻었ㄷ가.

[실시예 3]

샌드위치법에 따른 인체 PH 효소면역측정법

(a) 토끼 항 인체 IgG-POD 조제법

J. 1mmunoassay 4, 209-327, 1983에 기재된 이시까와가 발표한 방법을 따라서 토끼 항인체 PH IgG-POD 를 조제하였다.

상기 실시예 2(B)에서 얻어진 토끼 항 인체 PH IgG를, 0.1M 인산완충액과 pH6.5에 부절하여, 그 토끼항 인체 PH IgG 0.3∼0.5㎖에 대하여 100배몰의 디메필포름아미드에 용해한 S-아세틸메르캅톨 무수호박산을 가하여 30℃에서 30분간 인큐베이트한다.

다음에, 0.1, 트리스염산 완충액과 pH 7.0 100㎕, 0.1M EDTA 용액, pH 6.0 10㎕, 1M 히드록실 아민 용액, pH 7.0 100㎕을 가하여 30℃로서 5분간 방치한후, 5㎜ EDTA를 함유한 0.1M 인산완충액, pH 6.0으로 평형화한 세파댁스 G-25로서 겔 여과한다.

이 조작에 의하여 SH기 표지 토끼 항 인체 PH IgG가 얻을 수 있게 된다.

상기의 조작과는 별도로, 서양고사리 유래의 페옥시다아제(POD)에 말레이미드를 표지한다. 즉, 6㎖의 POD를 0.1M 인산완충액 pH 7.0에 용해시켜, 이에 대하여 25배 몰의 디메틸포름아미드 용해 N-(ε-말레이미도카플로일록시) 호박사 이미드를 가하여 30℃로서 30분간 인큐베이트한다.

이것을 0.1M 인산완충액 pH 6.0으로 평형화한 세파덱스 G-25로서 겔 여과하여 말레이미드 표지의 POD 화분을 채취한다.

다음에 위체서 조제한 SH기 표지 IgG 1몰에 대하여 동일한 방법으로 위에서 조제한 말레이미드 표지 POC 약5몰을 가하여 4℃로 20시간동안 방치한다.

이 혼합액을 0.1M 인산 완충액 pH 6.5로서 평형화한 올트로겔 AcA 44(LKB 사)칼럼으로 겔 여과하여, 토끼 항 인체 PH IgG-POD 복합체 화분을 분취한다. 보호제로서 BSA 및 티메로잘(thimerosal)을 각각 0.1% 및 0.005%가 되게끔 첨가하여 사용시까지 4℃로 보존한다.

또한, 쥐 항 인체 PH 모노 클로오닐 항체의 경우도 상기와 동일한 처리를 행하여 모노 클로오널 항체 Ig-POD 복합체(표지부여 항체)를 조제한다.

(b) 토끼 항 인체 PH Fab'-POD의 조제법

상기 실시예 2(b)에서 얻어진 토끼 항 인체 PH IgG를 0.1M 식염함유 0.1M 초산완충액과 pH4.5에 투절하고, 그 항 인체 PH IgG에 대하여 2%(w/w) 펩신을 가하여 37℃로서 24시간 소화하였다.

2M 트리스-염산완충액, pH 8.0으로서 반응을 멈추고, .01M 인산완충액, pH 7.0으로서 평형화한 울트로겔 AcA 44 칼럼으로 겔여과하여 F(ab')₂화분을 분취한다.

다음에 이 F(ab')₂화분을 0.1M 인산완충액, pH 6.0에 투절하여 0.5∼5㎎/450㎕ 용액을 조제한다.

여기에 5㎜ EDTA를 함유한 0.1M 인산완충액과 pH 6.0에 용해된 0.1M 메르캅톨에틸아민 50㎕를 가하여 37℃로 90분간 인큐베이트한다.

다음에, 5㎜ EDTA 함유한 0.1M 인산완충액 pH 6.0으로 평형화 울트로겔 AcA 44 칼럼으로 겔여과하여 Fab' 화분을 분취한다.

이와같이 하여 조제한 Fab'는 불안정 등 한것이어서 24시간내에 상기 (a)와 동일하게 하여 조제한 말레이미드 표시 POD를 Fab'에 대하여 동일량 몰을 가하여, 또한 각각의 최종농도가 50∼100μM이 될 수있도록 5㎜ EDTA를 함유한 0.1M 인산완충액, pH 6.0으로 조정한다.

이 혼합액을 4℃로서 20시간, 혹은 30℃로서 1시간동안 방치후, Fab'의 10배 몰량의 N-에틸말레이미드로서 미반응의 SH 기를 블로크 한다.

이것을 0.1M 인산완충액, pH 6.5로서 평형화 울트로겔 AcA 44 칼럼을 겔여과하여, 토끼 항인체 PH Fab'-POD 복합체 화분을 분취한다.

또한 쥐 항 인체 PH 모노 클로오널 항체의 경우도 상기와 똑같은 처리를 하여 모노 클로오널 항체 Fab'-POD를 조제하였다.

(c) 특이결합비의 측정법

상기 (a) 및 (b)로서 조제한 POD 표지항체는 통상 그대로를 사용할 수 있지만, 특이결합비의 1% 이하(통상 7∼8%)의 것일대에는, 다시 뒤에 기술하게 될 특이정제에 의하여 높은 순도화하는 것이 좋다.

우선 토끼 항 인체 PH IgG-POD 혹은 토끼 항 인체 PH Fab'-POD 100ng를 0.1M 식염 및 0.1% BSA 함유 10㎜ 인산완충액, pH 7.0 100㎕에 용해시켜, 인체 PH 결합 Sepharose 4B 어피니티 칼럼(100㎕ 겔)에 충전한다.

다음에 0.1M 식염 및 0.1% BSA 함유 10mm 인산완충액, pH 7.0, 3㎖로서 칼럼을 세척한다.

동일한 조작을 BSA 결합 Sepharose 4B 칼럼에 대하여서도 행하고, 양 세척액 각각 10㎕ 50㎜ 초산완충액, pH 5.0용해 0.5% P-히드록시페닐초선(PHPA) 250㎕, 및 0.01% 과산화 수소수 50㎕를 가하여, 30℃로서 10분간 인큐베이트한다.

0.1M 굴리신-수산화나트륨 완충액, pH 10.3, 2.5㎖를 가하여 반응을 정지시켜, 퀴닌(1㎍/㎖ 0.1N 황산)을 대조로하여 상대 형광강도를 측정한다.

BSA 및 인체 PH 결합 Sepharose 4B 칼럼 세척액의 전 POD 활성의 차로부터 특이결합비를 구한다.

(d) 특이정제법

항 인체 PH IgG-POD 혹은 항인체 PH Fab'-POD를 0.1M 식염 및 0.1% BSA 함유 10㎜ 인산완충액, pH 7.0으로 평형화 인체 PH 결합 Sepharose 4B 칼럼(200㎕ 겔)에 흡착시켜, 5㎖의 상기 완충액으로 비특이항체를 씻어낸다.

다음에 500㎕의 0.1M 글리신-염산온충액, pH 2.5로서 특이항체를 0.1% BSA 함유 0.5M 트리스-염산 완충액, pH 8.0, 1.0㎖가 들은 받침접시에 용출하게 한다.

이 용출액을 0.1∼0.3㎖로 농축하고, 0.1% BSA 함유 0.1M 인산완충액, pH 6.4로서 평형화 울트로겔 AcA 44 칼럼으로 겔여과하여, POD 표시항체화분을 분취한다.

티메로잘을 0.001%가 되게끔 첨가하여 사용시까지 4℃로 보존한다.

또한,모노 클로오널 항체에 있어서는 특이결합비가 높았고, 특이정제의 필요성은 없었다.

(e) 고상담체에 부착시킨 항체의 조제법

실시예 1(i) 및 실시예 2(b)에서 얻어진 쥐 항인체 PH 모노 클로오널 항체, 및 토끼 항인체 PH 폴리 클로오널 항체를, 각각 0.1% 아지드화 나트륨 함유 0.1M 인산완충액, pH 7.5에 용해시켜, 각각의 농도를 0.1㎎/㎖로 조정한다.

이들 항체 용액에 폴리스티렌 보올(Precision Plastic Ball 사)을 4℃로서 24시간 침지하여, 폴리스티렌 보올에 항체를 코오트한다.

다음에 항체 침지액을 회수하여 폴리스티렌 보올을 완충액 A(0.1% BSA, 0.1% 식염 및 0.1% 아지드화 나트륨 함유 10㎜ 인산 완충액, pH 7.0)로 5회 세척하여 사용한다.

4℃로서 1주간동안 이상 방치한 것에 있어서는 사용시, 다시 완충액 A로서 3회 세척하여 사용한다.

(f) 측정법

상기 (e)에서 조제한 폴리스티렌 보올에 있어 형과법(직경 3.2㎜ 보올을 사용) 및 발색법(직경 6.5㎜ 보올을 사용)으로 측정하였다.

1) 형광법-검량선용 시험관(내경 8㎜, 길이 75㎜)을 10개×2조 준비하여, 각각에 실시예 1(a)에서 정제한 인체 PH 표준품(0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100ng/150㎕)을 150㎕ 가한다.

검체용 시험관에는 인체 혈청 10㎕를 가하여, 다시 면역반응용 완충액(0.1% BSA, 0.1M 식염 및 0.1% 아지드화 나트륨 함유 10㎜ 인산 완충액, pH 7.0) 140㎕를 가하여 잘 혼합한다.

다음에 실시예 3(e)에서 조제한 항체결합 보올을 핀셋으로 가볍게 끼워잡고 부착액을 여과지로 흡수하여 각 시험관에 1개씩 넣는다.

각 시험관을 37℃로서 1∼4시간 흔들어서 가온한 후(제1반응, 이 반응은, 또한 그후 4℃로서 1일 밤낮을 정치하여도 좋다). 각 시험관 내의 반응액 흡인제거하여 세척액(0.1M 식염함유 10㎜ 인산 완충액, PH 7.0) 2∼3㎖를 가하여 2회 세척하여, 세척액을 흡입 제거한다.

또한 미리 다른 시험관에 상기 실시예 3(a) 및 (b)에서 조제한 효소표지항체를 0.1% BSA 및 0.1M 식염 함유 1.0㎜ 인산완충액, pH 7.0으로 희석하여, 100㎎/150㎕으로 조정한 각 시험관에 상기에서 세척이 끝단 폴리스티렐 보올을 바꾸어 옮긴다.

또한 상기 실시예 3(d)로서 특이정제한 효소표지항체에 있어서는 10ng/150㎕로 조정한다.

이들의 각 시험관을 20℃로서 3∼4시간동안 흔들어서 가온(제2반응)하여, 각 시험관 내의 미반응의 효소표지 항체액을 흡인제거하여, 세척액 2∼3㎖로서 2회 세척한다.

다음에 미리 다른 시험관에 0.1M 인산완충액, pH 7.0에 용해된 POD 기질과 0.6% 3-(P-히드록시페닐)프로피온산(HPPA) 100μ를 가한것을 준비하여, 그것들을 세척이 끝난 폴리스티렌 보올을 바꾸어 옮긴다.

또한 이 반응스텝으로부터 블라인드 테스트용으로서 POD 기질, HPPA 만으로된 시허모간 2개를 준비하여, 그 다음의 조작을 행한다.

상기 기질을 첨가한 각 시험관에 0.015% 괏나화수소수 50μL를 가하여 30℃에서, 1시간 흔들어 가온(효소 반응) 후, 0.1M 글리신-수산화나트륨 완충액, pH 10.3, 2.5㎖에서 반응을 정지시키고, 퀴닌(1㎍/㎖ 0.1N 황산)을 대조하여 히다찌 형광 광도계(204형)를 사용하여 상대 형광강도를 측정한다.

각각의 상대 형광 강도로부터 브라인드 테스트 치를 차감하여 양 대수좌표용지의 가로축에는 표준품 인체 PH(ng)를, 그리고 세포축에는 상대형광강도를 취하여, 각각의 측정치를 블로트하여 검량선을 그려간다.

검체의 10㎕의 상대강도에 상당하는 인체 PH 량 (ng)을 검량선으로부터 읽어서, 그 값을 100배한 것을 검체 1m 당 인체 PH 량으로 한다.

2 : 발색법-검량선을 시험관(내경 9.5㎜, 길이 105㎜)을 10개×2조 준비하여, 각각에 실시예 1(a)에서 정제한 인체 ph 표준품(01, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100ng/300㎕)을 300㎕가한다.

검체용 시험관에는 인체혈청 10㎕를 가하여 또한, 면역반응을 완충액 290㎕를 가하여 잘 혼합한다.

다음에 시시예 3(e)에서 조제한 항체결합 보올을 핀셋으로 가볍게 끼어잡아 부착액을 여과지로 흡수하여 각 시험관에 1개씩 넣는다.

각 시험관을 37℃로서 1∼4시간(또는 30℃로서 1∼2시간) 흔들어서 가온한 후(제1반응)하여, 각 시험관 내의 반응액을 흡인제거한 세척액 2∼3㎖를 가하여 2회 세척한다.

또한 미리 다른 시험관에 상기 실시예 3의 (a) 및 (b)에서 조제한 효소표지장체액 300㎕(10 또는 100ng)을 함유하는 각 시험관에 상기 세척이 끝난 폴리스티렌 보올을 바꾸어 옮긴다.

이들의 각 시험관을 20℃로서 3∼4시간(또는 30℃, 1∼2시간) 흔들어서 가온한 후(제2반응)하여, 각 시험관내의 미반응 효소표지항체액을 흡입하여 제거하고, 세척액 2∼3㎖로서 2회 세척한다.

다음에 미리, 다른 시험관에 0.1M 초산완충액, pH 5.5로 용해한 POD 기질, 0.0134% 3, 3', 5, 5'-테트라 메틸벤젠(TMBZ), 300㎕를 가한 것을 준비하여, 그들에게 세척이 끝난 폴리스티렌 보올을 바꾸어 옮긴다.

또한 이 반응 스텝으로부터 블라인드 테스트용으로서 POD 기질, TMBZ 만의 시험관 2개를 준비하여, 그 다음의 조작을 행한다.

상기의 기질 첨가 시험관 각각에 0.01% 과산화수소 100㎕를 가하여 30℃로서 45분간 흔들어서가온(효소반응) 한후, 1.33N 황산 600㎕로서 반응을 정지시킨다.

반응정지후, 물을 대조로하여 시마즈 다블 비임 분광 광도계(UV-150-02형)의 파장 450㎚로 흡광도를 측정하고, 블라인드 검사와 시료의 흡광도 차를 구한다.

검체 1㎖당의 인체 PH량을 구하는 방법은, 상기 1) 형광법의 경우와 동일하다.

(g) 고상부착용 및 복합체용에 가장 적합한 항체의 검색 상기의 샌드위치법을 사용하여 인체 PH량을 측정하는 경우, 고상부착용 항체와, 효소표지용 항체의 짝맞춤을 결정하기 위하여 다음의 검색 시험을 행한다.

실시예 1 및 2에서 얻어진 8종류의 모노 클로오널 항체 및 토끼 항 인체 PH 폴리 프로오널 항체를 사용하여, 실시예 1(a)에서 정제한 PH를 사용하여 가장 적합한 짝맞춤을 조사한 결과를 제2표에 나타내었다.

우선 면역 그로불린 (Ig)-POD 복합체(효소표지항체)의 경우, 고상(불용화항체) : 복합체(표지부여 항체)로서 2-5 G8 : 3-2 B12, 2-1 C2 : 3-2 B12, 2-6 G9 : 3-2 B12 및 2-1 C2 : 토끼 항 인체 PH IgG가 비특이흡착(N)에 대한 특이적 결합(S) 비(S/N)의 높은 값을 얻게 되었다.

한편, Fab'-POD형 복합체의 경우는, 상기의 짝맞춤 이외에, 3-2 B12 : 토끼항 인체 PH IgG에서 높은 S/N 값을 얻었다.

이들의 결과를 바탕으로 고상-복합체의 작압춤으로 2-5 G8 : 모노 클로오널 항체 IgG(3-2 B12) 및 3-2 B12 : 토끼 항 인체 PH Fab', 및 토끼 항 인체 PH IgG : 토끼 항 인체 PH Fab'에 있어서 검량선을 작성하였다(제1도 및 제2도 참조).

제1도는 제1반응 37℃, 1시간-제2반응 20℃, 3시간-제3반응 30℃, 1시간동안 흔들어 가온하였을 때의 형광법에 의한 인체 PH 검량선을 나타낸 것이다.

도면중, (-●-)은 고상-토끼 항 인체 PH IgG의 경우이고, (-○-)은 고상-모노 클로오널 항체, 3-2 B12의 경우인 것이다.

복합체에는 양쪽이 모두 토끼 항 인체 PH Fab'-POD가 사용되었다. (-△-)은 고상-모노 클로오널 항체, 2-5 G8, 복합체 모노 클로오널 항체(IgG) 3-2 B 12-POD가 사용된 경우이다.

제2도는 제1반응 37℃, 1시간-제2반응 20℃, 제3반응 3시간-제3반응 30℃, 45분간 흔들어서 가온하였을때의 발색법에 의한 인체 PH 검량선을 나타낸 것이다.

도면중, (-●-)은 고상-토끼 항 인체 PH IgG의 경우이며, (-○-)은 고상-모노 클로오널 항체, 3-2 B12의 경우이다.

복합체에는 양쪽에 모두 토끼 항 인체 PH Fab'-POD가 사용되었다. 형광법 및 발색법의 어느것이나, 시험관 당 0.1∼100ng 인체 PH로서 직선사을 나타내었고, 감도는 0.1ng이었다.

또한, 고상부착용 항체, 효소표지용 항체의 어느것에 있어서도 토끼 항 인체 PH 폴리 클로오널 항체의 짝맞춤이, 모노 클로오널 항체 : 폴리 클로오널 항체의 짝맞춤 및 모노 클로오널 항체 : 모노 클로오널 항체의 짝맞춤 보다는 감도가 약간 양호하였다.

다음에 건강하고 정상인자의 혈청 10㎕를 시료로 하여 고상용 및 복합체용의 가장 적합한 모노 클로오널 항체를 검색하였다.(제3표).

이 표로서 분명한 바와 같이 어떠한 짝맞춤에 있어서도, 특이적 결합이 현저하게 낮았었다.

또한 건강하고 정상인자의 혈청 10㎕를 시료로 사용하여 고상 및 복합체가 모두 토끼 항 인체 PH IgG를 사용한 경우, 제3도에 나타내는 바와 같이 혈청량에 상응하여 형광강도는 증가하였다.

즉, 제3도는 제1반응 37℃, 1시간-제2반응 20℃, 4시간-제3반응 30℃, 1시간 흔들어 가온하여 형광법에 의한 건강하고 정상인자의 혈청 0∼50㎕중의 인체 PH량을 나타낸 것이다.

도면중 (-)은 고상-토끼 항 인체 PH IgG, 복합체-토끼 항 인체 PH IgG-POD의 경우이며, (……)은 고상-모노 클로오널 항체, 2-5 G8, 복합체-모노 클로오널 항체(IgG) 3-2 B12-POD의 경우이다.

한편, 고상에 모노 클로오널 항체, 2-5 G8를, 복합체에는 모노 클로오널 항체 3-2 B12 (IgG)-POD를 사용하는 경우, 특이적인 결합은 볼 수 없었다.

따라서, 이들의 결과로부터는 모노 클로오널 항체만으로의 짝맞춤에 있어서는 인체 PH은 정량이 되지 않았다.

다음에 고상에 각 모노 클로오널 항체 및 토끼 항 인체 PH 항체를, 복합체에 토끼 항 인체 PH IgG 또는 Fab'-POD를 사용하는 경우의 결과를 제4표에 나타내었다.

비특이흡착(N)에 대한 특이적 결합(S) 비(S/N)는, 복합체가 토끼 항 인체 PH IgG의 경우, 고상에 3-2 B12, 3-6 H5, 2-6 G9, 2-7 F8 및 토끼 항 인체 PH IgG에 있어서 양호한 결과를 얻을 수 있었다.

또한 복합체가, 토끼 항 인체 PH Fab'-POD를 사용하는 편이 IgG-POD를 사용하는 것보다 비특이성흡착이 적다는 것을 알 수 있었다.

(h) 혈청중의 인체 PH량의 측정

상기 (g)에서 고상용 및 복합체용의 가장 적합한 항체를 검색하였지만, 고상에 모노 클로오널 항체 IgG(3-2 B12) 혹은 토끼 항 인체 PH IgG를, 복합체에는 토끼 항 인체 PH Fab'-POD를 사용하여 건강하고 정상인자, 및 간견병환자 혈청중의 인체 PH량을 측정하였다(제5표).

고상-복합체의 짝맞춤에 있어서는 3-2 B12 : 토끼 항 인체 PH Fab'-POD의 경우, 건강한 정상인자 및 간견병환자 혈청중 인체 PH량은, 각각 95.3 및 151.5ng/㎖로서 위험률 0.1%이고 양자 사이에는 뜻있는 차를 볼 수 있었다.

또한 토끼 항 인체 PH IgG : 토끼 항 인체 PH Fab'-POD의 경우, 각각 92.5 및 142.9㎎/㎖로서 위험률이 5%이고, 양자 사이에는 뜻있는 차이를 볼 수 있었다.

[실시예 4]

고상 담체에 폴리 염화비닐제의 마이크로 웰을 사용하였을 때의 인체 PH의 완 스텝측정. 폴리 염화비닐제 96구멍용 마이크로 플레이트(Costar 사제)에 100㎍/㎖의 농도의 모노 클로오널 항체, 3-2 B12를 웰당 200㎕ 가하여 4℃로 방치하고 항체를 웰에 코오트한다.

측정시에 희석용 완충액(0.1% BSA 및 0.1M 식염 함유 10mM 인산완충액, pH 7.0)으로 5회 세척하여, 실시예 1(a)에서 정제한 인체 PH 표준품(0,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 및 12.8 각 ng/㎕) 20㎕ 혹은 혈청 20㎕ 및 상기 희석용 완충액으로 조제한 복합체, 100ng/150㎕ 농도의 토끼 항 인체 PH Fab'-POD, 150㎕를 동시에 가하여 37℃로서, 2시간 조용힌 방치한다(제1반응).

이것을 0.1M 식염함유 10mM 인산완충액, pH 7.0 220㎕으로 3회 세척하여, 0.1M 초산완충액, pH 5.5용해 0.0134% TMBZ 150㎕ 및 0.01%의 과산화수소수 50㎕를 가하여 37℃로서, 45분간 가온(효소반응)후, 각 반응액 180㎕를 1.33N 황산 270㎕를 함유하는 시험관에 분취하여 반응을 정지한다.

반응정지후에 물을 대조로 하여 시마즈 더블 비임분광 광도체의 파장 450㎚으로 흡광도를 측정한다.

한쪽 대수좌표용지의 가로축에 표준품 인체 PH(ng)을, 세로축에는 흡광도를 취하여 각각의 측정치를 플로트하여 검량선을 그린다.

검체 20㎕의 흡광도에 상당하는 인체 PH량(ng)을 검량선으로부터 읽어내어, 그 값을 50배한 것을 검체 1㎖당의 인체 PH량으로 한다.

첨부된 제4도에는 96 구멍용 폴리 염화비닐제 플레이트에 모너 클로오널 항체, 3-2 B12를 코우트하여, 복합체에는 토끼 항 인체 PH Fab'-POD를 사용하였을 때의 인체 PH 검출량이 나타내어져 있다.

제4도에 나타내어져 있는 바와 같이 0∼12.8ng의 범위에서는 곡선을 그리고 정량한계는 약 0.1ng이었다.

이 검량선에 의하여 건강하고 정상인자 3인의 혈청중의 혈청중의 인체 PH량을 측정하였더니, 혈청 1㎖당 49, 32 및 18ng이었다.

이 윈 스텝 특정법은, 실시예 3 (f)에 기재된 고상 담체에 폴리스티렌 보올을 사용한 투 스텝 측정법 보다 정밀도는 약간 떨어지지만, 다수의 검체처리가 필요할 때의 정량 또는 정성에 적합되어 있다.

[실시예 5]

[항원의 식별]

샌드위치법에 바탕을 둔 효소면역법에 의하여 포촉된, 항원이 실시예 1 (a)에서 태반으로부터 정제한 인체 PH와 동일한 것인지 아닌지는, 다음과 같이 하여 확인하였다.

우선, 간장해 인체 혈청 1㎖(인체 PH, 298ng/㎖)을 0.1M 인산완충액, pH7.0으로 평형화한 울트로겔 AcA 34칼럼(1.5×45㎝)으로 겔 여과하였다.

첨부된 제5도에는 인체 혈청의 울트로겔 AcA 34에 의한 겔 여과 용출도가 제시되어 있다.

도면중,(-)은 280㎚의 흡광도이며, (-○-)은 고상-모노 클로오널 항체, 3-2 B12, 복합체-토끼 항 인체 PH Fab'-POD를 사용하였을 때의 인체 PH이다.

제5도에 제시되어 있는 바와 같이 고상에 3-2 B12, 복합체에 토끼 항 인체 PH Fab'-POD를 사용하여, 각 프랙션의 인체 PH를 측정하였더니, Ve/Vo 1.38 및 1.96에 2개의 피이크를 볼 수 있었다.

이 인체 PH량이 많은 프랙션을 푸울하여, 이 겔 여과 조작을 다시 2회 반복한 후, 혈청 3㎖에 상당하는 인체 PH량이 많은 2개의 프랙션을 모아, 한계여과법으로서 농축하였다.

다음에 상기의 농축시료를 모노 클로오널 항체, 3-2 B12 결합 Sepharose 4B(0.35×10㎝, 62.4ng 항체/40㎕ 겔)에 의한 어피니의 크로마토그래피로서 각 프랙션 중의 인체 PH를 정제하였다.

즉, 0.1M 인산완충액, pH 7.0으로 평형화한 상기 어피니티 칼럼에 농축시료를 흡착시켜, 우선 평형화 완충액 6㎖로서 세척하였다.

다음에, 2M 트리스-염산완충액, pH 8.0, 300㎕를 함유하는 받침접시에 칼럼 흡착물을 0.1M 글리신-염산완충액, pH2.5, 300㎕로 용출하였다.

이와 같이 하여 얻은 2개의 프랙션의 용출액을 0.1M 인산완충액, pH 7.0으로 투절, 농축한 후, 실시예 (a)의 Baum 등이 발표한 방법을 따라 SDS-PAGE를 행하였다.

또한 실시예 1 (h)에 기재된 Towbin 등의 워스터 플로팅법에 의하여 영동물질중의 단백질을 아크릴아미드 겔로부터 니트로셀룰로스지)(Trans-Blot(등록상표), 0.45㎛, Bio-Rad 사제)에 전사시켰다.

이 니트로실룰로스지를 모노 클로오널 항체(3-2 B12) IgG-POD, 3,3'-디아미노벤지딘 및 과산화수소수로서 처리하였다.

첨부된 제6도에 제5도의 2개의 인체 PH 화분을 각각 모노 클로오널 항체, 3-2 B12 결합 Sepharose 4B 어피니티 칼럼으로 정제하여, 다음에 SDS-PAGE를 행한 후, 니트로실룰로스지에 전사하였을 때의 패턴을 나타내었다.

도면중, (a)는 정제 인체 PH, (b)는 제5도의 F 27-41 화분, (c)는 제5도의 F 45-59 화분이다.

또한 이 경우의 표준분자량에 있어서는 미오신 H 체인(200,000), 포스포릴라아제 b(92,500), BSA(68,500), 오발부민(43,000), α-키모트리프시노겐(25,700), β-락토글로불린(18,400) 및 치토크롬(12,300)을 함유한 BRL 사제의 키트를 사용하였다.

제6도에 나타내는 바와 같이 인체태반 유래의 인체 PH는, β-서브 유니트에 상당하는 분자량 60KD의 메인과 분자량 170-190KD의 2개의 밴드를 볼 수 있었다(제6a도 참조).

한편, 제5도의 F 27-41 및 F 45-59의 2개의 프랙션에 있어서는 분자량 60KD에 상당하는 밴드와 그보다 높은 분자영역에서 수개의 밴드를 볼 수 있었다(제6c도 참조).

조직중, 인체 PH는, α(64KD) 및 β(60KD) 서브 유니트로서 이루어지는 분자량 240,000의 테트라마(α₂,β₂)라고 불려지고 있다.

그러나 제5도로서 명백한 바와 같이 혈액중에는 일부가 분해를 받고 있으며, 서브 유니트 구조는 명백하지는 않지만, 제6도의 전기영동 패턴에 의하여, 여기서 고상으로 사용이 된 모노 클로오널 항체, 3-2 B12가 인텍트(intact) 한 인체 PH, 혹은 그 일부 분해된 것을 포촉하고 있다고 할 수 있다.

[실시예 6]

샌드위치법에 바탕을 둔 인체 PH 방사성 면역학적 측정법

(a) 방사성원소 표지항체의 조제법

상기 실시예 2(b)에서 얻은 토끼 항 인체 PH IgG, 10㎍을 1mCi의 Na[¹²⁵I]를 사용하여 락토페록시다아제법으로서 표지를 한다.

미결합[¹²⁵I^-]은, Sephadex G-50(ψ 1.0×15㎝)칼럼을 사용하여 제거한다.

인산완충액(pH 7.0)을 사용하여 칼럼으로부터 용출시킨 표지항체는, 1% BSA 함유 인산완충액(pH 7.0)으로 희석하여 보존한다(방사활성 2.4μ Ci/㎍).

(b) 고상담체에 부착시킨 항체의 조제법

쥐 항인체 PH 모노 클로오널 항체를, 0.1% 아지드화 나트륨 함유 0.1M 인산완충액(pH 7.5)에 용해시키고, 각각의 농도를 0.1㎎/㎖로 조정한다.

이 용액에 폴리스티렌 보올(ψ 6.5㎜)을 4℃로서, 24시간 침지한 폴리스티렌 보올에 항체를 코우트한다.

항체 침지액을 제거한 후, 2% BSA를 함유하는 인산 완충액(pH 7.0)10mM를 가하여, 30℃로서 2시간동안 흔들어 준다.

다음에, 그 폴리스티렌 보울을 완충액 A(0.1% BSA, 0.1M 식염 및 0.1% 아지드화 나트륨 함유 10mM 인산 완충액 pH 7.0)으로 세척하여, 완충액 A에 담구어서 4℃로 보존한다.

(c) 측정법

고상담체 부착항체로서, 예를들면 상기 (b)에서 조제한 클로운 번호 3-2 B 12로부터 얻은 모노 클로오널 항체 부착의 폴리스티렌 보올을 사용한 예 : 시험관(ψ 8×75㎜, 8개×2조)의 각각에, 정제 인체 PH 표준품(농도 0,0.2,0.4,…6.4,12.8 각 ng/150㎕), 또는 인체 혈청 10㎕르 하여, 도한 면역반응용 완충액(0.1% BSA, 0.1M 식염 및 0.1% 아지드화나트륨 함유 10mM 인산완충액 pH 7.0)을 가하여, 어느 거이나 모두 전량을 300㎕이되게 하여 잘 혼합한다.

여기에, 상기(b)에서 조제한 항체 부착 보올을 1개씩을 가하여, 30℃로서 1∼4시간동안 흔들어서 가온한다.

반응후, 각 시험관내의 반응액을 흡인하여 제거하여, 세척액(0.1M 식염함유, 10mM 인산완충액 pH 7.0) 2∼3㎖로서 2회 세정하여, 세정액을 흡인제거한다.

다른 시험관에 보올을 옮기고, 각 시험관에 [¹²⁵I]-인체 PH 항체액, 300㎕(500,000cpm)을 가하여 4℃로서 하루밤동안 방치한다.

방사성표지 항체용액을 흡인제거하여, 또한 세정액 2㎖로서 2회 세정한 후, 보올에 부착된 방사능량을 γ-카운터로서 측정한다.(5분간).

표준곡선을 작성(제7도 참조)하여, 혈청중의 PH량을 표준곡선으로부터 읽어낸다.

(d) 혈청중 인체 PH량

제7도의 인체 PH 표준곡선을 사용하여, 건강하고 정상인자 및 생검에 의하여 간경변으로 진단이 된 환자의 혈청에 있어서, 인체 PH량을 측정한 결과를 제5b표에 제시하였다.

건강한 정상인 자에 있어서, 30, 68, 34각 ng/㎖ 간경변환자에 있어서는, 165, 210, 940 각 ng/㎖의 수치를 얻었다.

또한 인체 PH 결합 Sepharose 4B 어피니티 칼럼으로서 정제한 표지 폴리 콜로오널 항체, 또는 그 F(ab')₂를 사용한 경우에는, 분석정밀도는 더욱 증대된다.

[표 1]

[표 2]

인체 PH표준품(시험관 당 2.4ng), 직경 3.2㎜ 폴리스티렌 보올을 사용하여, 제1반응 37℃, 4시간, 제2반응 20℃, 4시간, 제3반응 30℃, 1시간 흔들어 가온하였다.

[표 3]

건강하고 정상인자, 형청 10㎕, 직경 3.2㎜ 폴리스티렌 보올을 사용하여, 제1반응 37℃, 1시간-제2반응 20℃, 3시간, -제3반응 30℃, 1시간 흔들어서 가온하였다.

[표 4]

건강하고 정상인 자 형청 ㎕, 직경 3.2㎜ 폴리스티렌 보올을 사용하였으며, 제1반응 37℃, 1시간-제2반응 20, 3시간-제3반응 30℃, 1시간 흔들어서 가온하였다.

[표 5a]

혈청중 인체 PH량

[표 5b]

혈청중 인체 PH량

Claims

인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 모노 클로오널 항체 및 또는 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 콜리 클로오널 항체를 사용하여, 샌드위치법에 따른 방사성면역학적 측정법 또는 효소면역학적 측정법에 의하여 인체 프로릴 4-히드록시라아제를 정량하는 방법으로서, 고상담체에 부착시키는 항체로서, 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 모노 클로오널 항체 또는 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 폴리 클로오널 항체를 사용하며, 한편, 효소 또는 방사선원소를 표지로서 부여하는 항체로서, 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 모노 클로오널 항체 또는 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 폴리 클로오널 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 인체 프로릴 4-히드록시라아제의 정량 방법.
제1항에 있어서, 상기의 고상담체에 부착시키는 항체 및 효소 또는 방사성 원소를 표지로서 부여하는 항체의 적어도 한쪽에, 인체 프로릴 4-히드록시라아제에 대한 모노 클로오널 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 인체 프로릴 4-히드록시라아제의 정량 방법.