JPH0672893B2 - ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの放射性免疫学的測定法による定量法 - Google Patents
ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの放射性免疫学的測定法による定量法Info
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- JPH0672893B2 JPH0672893B2 JP60179357A JP17935785A JPH0672893B2 JP H0672893 B2 JPH0672893 B2 JP H0672893B2 JP 60179357 A JP60179357 A JP 60179357A JP 17935785 A JP17935785 A JP 17935785A JP H0672893 B2 JPH0672893 B2 JP H0672893B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、肝臓疾患を簡易に診断するのに有用なヒトプ
ロリルヒドロキシラーゼの定量法に関するものである。
ロリルヒドロキシラーゼの定量法に関するものである。
さらに詳しくは、本発明はヒトプロリルヒドロキシラー
ゼに対するモノクローナル抗体及びヒトプロリルヒドロ
キシラーゼに対するポリクローナル抗体を用いたサンド
イツチ法に基づく放射性免疫学的測定法によるヒトプロ
リルヒドロキシラーゼの定量法であつて、固相担体に結
合させる抗体として、ヒトプロリルヒドロキシラーゼの
β−サブユニツトを認識する抗ヒトプロリルヒドロキシ
ラーゼモノクローナル抗体を用い、放射性元素標識を付
与する抗体としてヒトプロリルヒドロキシラーゼに対す
るポリクローナル抗体を用いることを特徴とするヒトプ
ロリルヒドロキシラーゼの定量法に関するものである。
ゼに対するモノクローナル抗体及びヒトプロリルヒドロ
キシラーゼに対するポリクローナル抗体を用いたサンド
イツチ法に基づく放射性免疫学的測定法によるヒトプロ
リルヒドロキシラーゼの定量法であつて、固相担体に結
合させる抗体として、ヒトプロリルヒドロキシラーゼの
β−サブユニツトを認識する抗ヒトプロリルヒドロキシ
ラーゼモノクローナル抗体を用い、放射性元素標識を付
与する抗体としてヒトプロリルヒドロキシラーゼに対す
るポリクローナル抗体を用いることを特徴とするヒトプ
ロリルヒドロキシラーゼの定量法に関するものである。
従来、ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼ（以下
ヒトPHと略記する）の活性を測定する方法としては、プ
ロトコラーゲンの４−Ｌ−プロリンを3H標識したものを
基質にして、生成した3H標識水を真空蒸留で捕捉し、そ
の放射能を測定する方法が知られている（Huttonら、An
al.Biochem.,16,384−394,1966）。また、14Cプロリン
標識プロトコラーゲンを基質にして生成した４−水酸化
14Cプロリンの放射能を測定する方法や（Juvaら、Anal.
Biochem.,15,77−83,1966）、（pro−pro−gly）５、あ
るいは（pro−pro−gly）10を基質にして、２−オキソ
（１−14C）−グルタール酸より遊離する14CO2を捕捉
し、測定する方法も知られている（Bergら、J.Biol.Che
m.,248,1175−1182,1973）。しかしながら、上記した方
法は、いずれも繁離な操作を必要とし、また、測定に時
間がかかるという欠点がある。血中のヒトPHのほとんど
は酵素学的に不活性化された状態にあるので、単に、血
中のヒトPHの活性を測定してもその測定は真のヒトPHの
量を測定したことにはならない。
ヒトPHと略記する）の活性を測定する方法としては、プ
ロトコラーゲンの４−Ｌ−プロリンを3H標識したものを
基質にして、生成した3H標識水を真空蒸留で捕捉し、そ
の放射能を測定する方法が知られている（Huttonら、An
al.Biochem.,16,384−394,1966）。また、14Cプロリン
標識プロトコラーゲンを基質にして生成した４−水酸化
14Cプロリンの放射能を測定する方法や（Juvaら、Anal.
Biochem.,15,77−83,1966）、（pro−pro−gly）５、あ
るいは（pro−pro−gly）10を基質にして、２−オキソ
（１−14C）−グルタール酸より遊離する14CO2を捕捉
し、測定する方法も知られている（Bergら、J.Biol.Che
m.,248,1175−1182,1973）。しかしながら、上記した方
法は、いずれも繁離な操作を必要とし、また、測定に時
間がかかるという欠点がある。血中のヒトPHのほとんど
は酵素学的に不活性化された状態にあるので、単に、血
中のヒトPHの活性を測定してもその測定は真のヒトPHの
量を測定したことにはならない。
免疫学的測定法としては、Eur.J.Biochem.,60,399−40
5,1975に記載のTudermanらの放射性免疫学的測定法があ
るが、そこでは、標識抗原を用いて、抗体に対する非標
識抗原と標識抗原との間に起こる競合現象を応用し、そ
こへ第２抗体を反応させて、ヒトPHの定量を行つてい
る。この競合現象に用いられた抗体は、ヒトPHに対する
家兎の抗血清であつて、ヒトPHポリクローナル抗体であ
るため、抗体の特異性は低く、感度はヒトPHで５〜10ng
であり、また、抗原・抗体結合物と未結合の抗原との分
離に遠沈操作を必要とするなど簡便ではないので、実用
上満足すべき方法とは言えない。
5,1975に記載のTudermanらの放射性免疫学的測定法があ
るが、そこでは、標識抗原を用いて、抗体に対する非標
識抗原と標識抗原との間に起こる競合現象を応用し、そ
こへ第２抗体を反応させて、ヒトPHの定量を行つてい
る。この競合現象に用いられた抗体は、ヒトPHに対する
家兎の抗血清であつて、ヒトPHポリクローナル抗体であ
るため、抗体の特異性は低く、感度はヒトPHで５〜10ng
であり、また、抗原・抗体結合物と未結合の抗原との分
離に遠沈操作を必要とするなど簡便ではないので、実用
上満足すべき方法とは言えない。
本発明者らは、簡便な方法でヒトPHを特異的に定量する
方法を種々研究した結果、ヒトPHに対するモノロクーナ
ル抗体を用い、サンドイツチ法に基づく放射性免疫学的
定量法（RIA）を行うことにより少量の試料で精度よ
く、迅速に測定する方法を開発した。
方法を種々研究した結果、ヒトPHに対するモノロクーナ
ル抗体を用い、サンドイツチ法に基づく放射性免疫学的
定量法（RIA）を行うことにより少量の試料で精度よ
く、迅速に測定する方法を開発した。
すなわち、本発明は、固相担体に結合させる抗体とし
て、ヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−サブユニツト
を認識する抗ヒトプロリルヒドロキシラーゼモノクロー
ナル抗体を用い、放射性元素標識を付与する抗体として
ヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するポリクローナル
抗体を用い、放射性免疫学的定量法によりヒトPHを定量
する方法を提供するものである。
て、ヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−サブユニツト
を認識する抗ヒトプロリルヒドロキシラーゼモノクロー
ナル抗体を用い、放射性元素標識を付与する抗体として
ヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するポリクローナル
抗体を用い、放射性免疫学的定量法によりヒトPHを定量
する方法を提供するものである。
本発明方法において、放射性元素標識を付与する抗体と
しては、抗体含有物を硫安分画した後、DEAE−セルロー
スカラム精製したIgG画分が用いられる。ポリクローナ
ル抗体の場合には更にヒトPH結合Sepharose4Bアフイニ
テイカラムで精製したものを用いると特異性が増大する
ので好ましい。更には、ペプシン消化により得られるＦ
（ab′）２を用いることもできる。本発明方法で使用す
るモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体としては、
それら抗体における特異的結合部分Ｆ（ab′）２そのも
のを使用する態様も含まれるものである。
しては、抗体含有物を硫安分画した後、DEAE−セルロー
スカラム精製したIgG画分が用いられる。ポリクローナ
ル抗体の場合には更にヒトPH結合Sepharose4Bアフイニ
テイカラムで精製したものを用いると特異性が増大する
ので好ましい。更には、ペプシン消化により得られるＦ
（ab′）２を用いることもできる。本発明方法で使用す
るモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体としては、
それら抗体における特異的結合部分Ｆ（ab′）２そのも
のを使用する態様も含まれるものである。
抗体に対する放射性元素標識の付与は、タンパク質の標
識に関して知られている方法を用いて行うことができ
る。放射性核種としては、〔125I〕を使用するのが好ま
しく、この放射性核種を用いる標識付与の方法として
は、ペルオキシダーゼによるヨウ素化法が適しており、
イミユノケミストリ（Immunochemistry）11,203−206
（1974）のThorellらの方法が好ましい。
識に関して知られている方法を用いて行うことができ
る。放射性核種としては、〔125I〕を使用するのが好ま
しく、この放射性核種を用いる標識付与の方法として
は、ペルオキシダーゼによるヨウ素化法が適しており、
イミユノケミストリ（Immunochemistry）11,203−206
（1974）のThorellらの方法が好ましい。
本発明の方法によりヒトPHを定量するには、ヒトPHの標
準液および検体を使用して、それぞれについて、抗体を
結合させた固相担体に反応させ、次いで未反応物を除去
した後、洗浄し、次に、これに放射性元素標識を付与し
た抗ヒトPH抗体を加えて反応させる。
準液および検体を使用して、それぞれについて、抗体を
結合させた固相担体に反応させ、次いで未反応物を除去
した後、洗浄し、次に、これに放射性元素標識を付与し
た抗ヒトPH抗体を加えて反応させる。
反応しなかつた未反応の放射性元素標識抗体を除去した
後、ヒトPHを介して結合した標識抗体の放射能を測定す
る。測定法それ自体は、通常の放射性免疫学的測定法に
よるものであり、標準液について得られた数値より標準
曲線を作成し、これに基ずき検体中のヒトPHの量を算出
する。
後、ヒトPHを介して結合した標識抗体の放射能を測定す
る。測定法それ自体は、通常の放射性免疫学的測定法に
よるものであり、標準液について得られた数値より標準
曲線を作成し、これに基ずき検体中のヒトPHの量を算出
する。
以上の如く、本発明は、固相担体に結合させる抗体とし
て、ヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−サブユニツト
を認識する抗ヒトプロリルヒドロキシラーゼモノクロー
ナル抗体を用い、放射性元素標識を付与する抗体として
ヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するポリクローナル
抗体を用いることを特徴とする固相法放射性免疫学的定
量法によりヒトPHを定量する方法を提供するものであ
る。
て、ヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−サブユニツト
を認識する抗ヒトプロリルヒドロキシラーゼモノクロー
ナル抗体を用い、放射性元素標識を付与する抗体として
ヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するポリクローナル
抗体を用いることを特徴とする固相法放射性免疫学的定
量法によりヒトPHを定量する方法を提供するものであ
る。
最近の免疫検査においては、慢性肝炎、肝硬変およびア
ルコール肝障害などの肝臓疾患においておこる肝線維化
に伴い、組織および血中にヒトPH量の顕著な増加が認め
られている。
ルコール肝障害などの肝臓疾患においておこる肝線維化
に伴い、組織および血中にヒトPH量の顕著な増加が認め
られている。
したがつて、血中のヒトPH量を測定することにより、こ
の種の疾患を早期発見することが期待され、未発明方法
により、ヒトPH量測定に基づく肝組織線維化の診断を行
うことができるので、本発明は非常に有用性が高いもの
である。
の種の疾患を早期発見することが期待され、未発明方法
により、ヒトPH量測定に基づく肝組織線維化の診断を行
うことができるので、本発明は非常に有用性が高いもの
である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 抗ヒトPHモノクローナル抗体の作製 （ａ） 抗原−ヒトPH（EC 1.14.11.2）の調製 ヒト胎盤を材料としてEur.J.Biochem.,52,9−15（197
5）に記載のTudermanらの方法に従いpoly（Ｌ−prolin
e）をSepharore 4BにCNBrでカツプリングさせたアフイ
ニテイクロマトグラフイーでヒトPHを捕捉し、さらにBi
o−Gel A−1.5m（Bio−Rad）カラムで精製、純化した。
得られたヒトPH標品をJ.Virol.,10,211−219（1972）記
載のBaumらの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で調べたと
ころその純度は約90％であつた。
5）に記載のTudermanらの方法に従いpoly（Ｌ−prolin
e）をSepharore 4BにCNBrでカツプリングさせたアフイ
ニテイクロマトグラフイーでヒトPHを捕捉し、さらにBi
o−Gel A−1.5m（Bio−Rad）カラムで精製、純化した。
得られたヒトPH標品をJ.Virol.,10,211−219（1972）記
載のBaumらの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で調べたと
ころその純度は約90％であつた。
（ｂ） 抗体産生細胞の調製 ８週令のBALB/C雌マウス３匹をまずフロインド完全アジ
ユバント中で、前記（ａ）で精製したヒトPHで初回免疫
する。マウスにそれぞれ50μｇのヒトPHを0.5mlの溶液
として腹腔内投与する。さらに30日目、60日目に生理食
塩水に溶解した同量のヒトPHを追加免疫する。最終免疫
として90日目に静脈内投与（50μg/100μ生理食塩
水）により補助免疫し、３日後にマウス脾臓を取り出
し、脾細胞を調製する。
ユバント中で、前記（ａ）で精製したヒトPHで初回免疫
する。マウスにそれぞれ50μｇのヒトPHを0.5mlの溶液
として腹腔内投与する。さらに30日目、60日目に生理食
塩水に溶解した同量のヒトPHを追加免疫する。最終免疫
として90日目に静脈内投与（50μg/100μ生理食塩
水）により補助免疫し、３日後にマウス脾臓を取り出
し、脾細胞を調製する。
（ｃ） 細胞融合 以下の材料および方法を用いる。
RPMI1640培地:RPMI No.1640（Difco Laboratories）に
重炭酸ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム（1m
M）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウム
（50u/ml）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）、お
よび硫酸アミカシン（100μg/ml）を加え、ドライアイ
スでpHを7.2にし、0.2μm Toyo.メンブレンフイルター
で除菌過する。
重炭酸ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム（1m
M）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウム
（50u/ml）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）、お
よび硫酸アミカシン（100μg/ml）を加え、ドライアイ
スでpHを7.2にし、0.2μm Toyo.メンブレンフイルター
で除菌過する。
NS−１培地：上記RPMI1640培地に除菌過した仔牛胎児
血清（Granite Diagnostic,Inc.）を15％（v/v）の濃度
に加える。
血清（Granite Diagnostic,Inc.）を15％（v/v）の濃度
に加える。
HAT培地：上記のNS−１培地にさらにヒポキサンチン（1
00μＭ）、アミノプテリン（0.4μＭ）、およびチミジ
ン（16μＭ）を加える。
00μＭ）、アミノプテリン（0.4μＭ）、およびチミジ
ン（16μＭ）を加える。
HT培地：アミノプテリンを除去した以外は上記HAT培地
と同一組成のものである。
と同一組成のものである。
PEG4,000溶液:RPMI1640培地のポリエチレングリコール
4,000（PEG4,000、Merck＆co.,Inc.）50％（w/w）無血
清溶液を調製する。
4,000（PEG4,000、Merck＆co.,Inc.）50％（w/w）無血
清溶液を調製する。
８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS−１（P3−NS1
−１）との融合はSelected Method in Celluler Immuno
logy（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freeman
and Company（1980）、351−372に記載のOiらの方法を
若干改変して行つた。前記（ｂ）で調製した1.5×108個
の有核脾臓細胞（生細胞率95％）を2.8×107個のNS−１
ミエローマ細胞（生細胞率95％）と融合する。脾臓細胞
とミエローマ細胞とを別に前記のRPMI1640培地で洗滌す
る。次に同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割
合で混合する。容量50mlの円錐形スチロール樹脂製試験
管（Corning Glass Works）を用い、40mlのRPMI1640培
地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全に吸出する。
沈殿細胞に37℃加温PEG4,000溶液1mlを穏やかに撹拌し
ながら１分間で滴下し、さらに１分間撹拌し細胞を再け
ん濁、分散させる。次に37℃加温RPMI1640培地1mlを１
分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返した後、同
培地7mlを２−３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞を
分散させる。これを400×ｇ、10分間遠心分離し、上清
を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細胞に37℃加温NS
−１培地10mlをすみやかに加え、細胞の大きい塊りを10
mlのピペツトを用いて注意深くピペツテイングして分散
する。さらに同培地20mlを加えて希釈し、ポリスチレン
製96穴マイクロウエル（Corning Glass Works）にウエ
ル当り5.9×105個/0.1mlの細胞をまき込む。なおこの時
使用した96穴マイクロウエルの前処理として0.2mlのNS
−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（37℃）で１晩保温
し、使用時に培地を吸引除去する。細胞融合完了したマ
イクロウエルを７％炭酸ガス/93％空気中で温度37℃、
湿度100％下にインキユベートする。
−１）との融合はSelected Method in Celluler Immuno
logy（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freeman
and Company（1980）、351−372に記載のOiらの方法を
若干改変して行つた。前記（ｂ）で調製した1.5×108個
の有核脾臓細胞（生細胞率95％）を2.8×107個のNS−１
ミエローマ細胞（生細胞率95％）と融合する。脾臓細胞
とミエローマ細胞とを別に前記のRPMI1640培地で洗滌す
る。次に同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割
合で混合する。容量50mlの円錐形スチロール樹脂製試験
管（Corning Glass Works）を用い、40mlのRPMI1640培
地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全に吸出する。
沈殿細胞に37℃加温PEG4,000溶液1mlを穏やかに撹拌し
ながら１分間で滴下し、さらに１分間撹拌し細胞を再け
ん濁、分散させる。次に37℃加温RPMI1640培地1mlを１
分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返した後、同
培地7mlを２−３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞を
分散させる。これを400×ｇ、10分間遠心分離し、上清
を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細胞に37℃加温NS
−１培地10mlをすみやかに加え、細胞の大きい塊りを10
mlのピペツトを用いて注意深くピペツテイングして分散
する。さらに同培地20mlを加えて希釈し、ポリスチレン
製96穴マイクロウエル（Corning Glass Works）にウエ
ル当り5.9×105個/0.1mlの細胞をまき込む。なおこの時
使用した96穴マイクロウエルの前処理として0.2mlのNS
−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（37℃）で１晩保温
し、使用時に培地を吸引除去する。細胞融合完了したマ
イクロウエルを７％炭酸ガス/93％空気中で温度37℃、
湿度100％下にインキユベートする。
（ｄ） 選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 培養１日目にパスツールピペツトでHAT培地２滴（約0.1
ml）を加える。２、３、５、８、11日目に培地の半分
（0.1ml）を新しいHAT培地で置き換える。14日目にHT培
地に切換え以降３−４日毎に同操作を繰り返す。通常２
−３週間で充分なハイブリドーマの生育が観察される
（融合率83％）。ハイブリドーマ生育全ウエルについて
次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ELISA）に
より陽性ウエルをチエツクする。20個/288ウエルが陽性
として検出された。次にフイーダーとして107個のマウ
ス胸腺細胞を含むHT培地1mlをポリスチレン製24穴セル
ウエル（Corning Glass Works）に加えたものを用い、
上記で検出された各陽性ハイブリドーマ20個の全内容物
を移す。これを前記（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガ
ス存在下、37℃で約１週間インキユベートする。その間
１−２回各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5mlと交
換する。ハイブリドーマの充分生育した時点でELISAに
より陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｆ）記載
の限界希釈法によるクローニングを行う。なお、クロー
ニングに使用後の残液をポリスチレン製25cm2組織培養
フラスコ（Corning Glass Works）に移し、凍結保存用
試料を調製する。
ml）を加える。２、３、５、８、11日目に培地の半分
（0.1ml）を新しいHAT培地で置き換える。14日目にHT培
地に切換え以降３−４日毎に同操作を繰り返す。通常２
−３週間で充分なハイブリドーマの生育が観察される
（融合率83％）。ハイブリドーマ生育全ウエルについて
次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ELISA）に
より陽性ウエルをチエツクする。20個/288ウエルが陽性
として検出された。次にフイーダーとして107個のマウ
ス胸腺細胞を含むHT培地1mlをポリスチレン製24穴セル
ウエル（Corning Glass Works）に加えたものを用い、
上記で検出された各陽性ハイブリドーマ20個の全内容物
を移す。これを前記（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガ
ス存在下、37℃で約１週間インキユベートする。その間
１−２回各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5mlと交
換する。ハイブリドーマの充分生育した時点でELISAに
より陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｆ）記載
の限界希釈法によるクローニングを行う。なお、クロー
ニングに使用後の残液をポリスチレン製25cm2組織培養
フラスコ（Corning Glass Works）に移し、凍結保存用
試料を調製する。
（ｅ） 固相−抗体結合テスト（ELISA）による抗ヒトP
H抗体産生ハイブリドーマの検索 Anal.Biochem.104,205−214（1980）に記載のRennardら
の方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、ハイ
ブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイト
レーシヨンプレート（Flow Labaratories,Inc.）を0.5
〜1.0μｇのヒトPHでコートし、さらにその他を１％牛
血清アルブミン（BSA）でブロツクする。これにハイブ
リドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で約１時
間インキユベートする。２次抗体として西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG（TAGO,Inc.）を加え
さらに室温で約１時間インキユベートする。次に過酸化
水素と基質であるｏ−フエニレンジアミンを加え生成し
た褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコ
ロナ２波長マイクロプレート光度計（MTP−22、コロナ
電気社）を用いて500nmの吸光度を測定する。
H抗体産生ハイブリドーマの検索 Anal.Biochem.104,205−214（1980）に記載のRennardら
の方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、ハイ
ブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイト
レーシヨンプレート（Flow Labaratories,Inc.）を0.5
〜1.0μｇのヒトPHでコートし、さらにその他を１％牛
血清アルブミン（BSA）でブロツクする。これにハイブ
リドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で約１時
間インキユベートする。２次抗体として西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG（TAGO,Inc.）を加え
さらに室温で約１時間インキユベートする。次に過酸化
水素と基質であるｏ−フエニレンジアミンを加え生成し
た褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコ
ロナ２波長マイクロプレート光度計（MTP−22、コロナ
電気社）を用いて500nmの吸光度を測定する。
（ｆ） クローニング 各ウエル中には２種以上のハイブリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。NS−１培地ml当りフイーダーとして107個のマウス
胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し96穴マイクロ
ウエルの36ウエル、36ウエルおよび24ウエルにウエル当
り５個、１個および0.5個のハイブリドーマを加える。
５日目、12日目に各約0.1mlのNS−１培地を追加する。
クローニング開始後14−15日で充分なハイブリドーマの
生育が認められ、コロニー形成陰性ウエルが50％以上で
ある群についてELISAを行う、テストした全ウエルが陽
性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が認識
し、ウエル中に１コロニーのウエルを４−６個選び再ク
ローニングする。最終的に８株のクローンを得た。
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。NS−１培地ml当りフイーダーとして107個のマウス
胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し96穴マイクロ
ウエルの36ウエル、36ウエルおよび24ウエルにウエル当
り５個、１個および0.5個のハイブリドーマを加える。
５日目、12日目に各約0.1mlのNS−１培地を追加する。
クローニング開始後14−15日で充分なハイブリドーマの
生育が認められ、コロニー形成陰性ウエルが50％以上で
ある群についてELISAを行う、テストした全ウエルが陽
性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が認識
し、ウエル中に１コロニーのウエルを４−６個選び再ク
ローニングする。最終的に８株のクローンを得た。
（ｇ） モノクローナル抗体のインビトロ増殖およびイ
ンビボ増殖 モノクローナル抗体は、得られたクローンをNS−１培地
などの適当な培養液で培養（インビトロ増殖）し、その
培養上清から得ることができる（モノクローナル抗体た
ん白濃度は10−100μg/mlである）。一方、大量に抗体
を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来動物と同
系の動物（BALB/C、マウス）に腫瘍形成促進剤プリスタ
ン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich C
hemical社）をマウス一匹当り0.5ml腹腔内投与する。１
−３週間後にハイブリドーマ１×107個を同じく腹腔内
投与することによりインビボで１−２週間後にモノクロ
ーナル抗体たん白質濃度４−7mg/mlの腹水を得ることが
できる。
ンビボ増殖 モノクローナル抗体は、得られたクローンをNS−１培地
などの適当な培養液で培養（インビトロ増殖）し、その
培養上清から得ることができる（モノクローナル抗体た
ん白濃度は10−100μg/mlである）。一方、大量に抗体
を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来動物と同
系の動物（BALB/C、マウス）に腫瘍形成促進剤プリスタ
ン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich C
hemical社）をマウス一匹当り0.5ml腹腔内投与する。１
−３週間後にハイブリドーマ１×107個を同じく腹腔内
投与することによりインビボで１−２週間後にモノクロ
ーナル抗体たん白質濃度４−7mg/mlの腹水を得ることが
できる。
（ｈ） モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖のアイソタイ
プ 得られた各々の腹水を先ずヒトPHをコートしたミクロタ
イトレーシヨンプレートに前述したELISA法に従つて結
合させる。洗滌後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウス
Ig抗体（Zymed Laboratories）を加える。洗滌後、西洋
わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（Ｈ＋
Ｌ）抗体を加え、基質として2,2′−アジノージ（３−
エチルベンゾチアゾリン硫酸−６）および過酸化水素を
用いて検出した。その結果をまとめて第１表に示した。
調べた抗体の内４個は免疫グロブリン鎖γ1/κを、１個
がγ2b/κ、２個がα／κを、そして１個がμ/gκを有
していた。なお得られた各モノクローナル抗体のヒトPH
のサブユニツトとの交差反応性をproc.Natl.Acad.Sci.U
SA,76,4350−4354（1979）に記載のTowbinらのウエスタ
ンブロツテイング法により調べた。得られた８個のモノ
クローナル抗体の内４個は分子量64KDのα鎖に、残り４
個は60KDのβ鎖に反応した（第１表、サブユニツトにつ
いてはChen−Kiangら、proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,442
0−4424,1977参照）。
プ 得られた各々の腹水を先ずヒトPHをコートしたミクロタ
イトレーシヨンプレートに前述したELISA法に従つて結
合させる。洗滌後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウス
Ig抗体（Zymed Laboratories）を加える。洗滌後、西洋
わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（Ｈ＋
Ｌ）抗体を加え、基質として2,2′−アジノージ（３−
エチルベンゾチアゾリン硫酸−６）および過酸化水素を
用いて検出した。その結果をまとめて第１表に示した。
調べた抗体の内４個は免疫グロブリン鎖γ1/κを、１個
がγ2b/κ、２個がα／κを、そして１個がμ/gκを有
していた。なお得られた各モノクローナル抗体のヒトPH
のサブユニツトとの交差反応性をproc.Natl.Acad.Sci.U
SA,76,4350−4354（1979）に記載のTowbinらのウエスタ
ンブロツテイング法により調べた。得られた８個のモノ
クローナル抗体の内４個は分子量64KDのα鎖に、残り４
個は60KDのβ鎖に反応した（第１表、サブユニツトにつ
いてはChen−Kiangら、proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,442
0−4424,1977参照）。
（ｉ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（40％胞和）
後、IgGクラスは食塩0.06Mを含む40mMリン酸緩衝液、pH
8.0で平衡化したDEAE−Sepha−cel（pharmacia社）の非
吸着画分を分取し、このIgG画分を更に0.42M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液、pH7.4で平衡化したSephacryl S−30
0Superfine（pharmacia社）カラムでゲル過し、培地
中の仔牛胎児血清およびマウス由来のたん白質を分離、
除去した。IgAおよびIgMクラスの精製についてはDEAE−
Sephacelカラムクロマトグラフイーにおいて食塩0.06M
から1.0Mまでのグラデイエントでそれぞれ両画分を溶出
した。その他はIgGクラスの場合と同様の条件で精製し
た。
後、IgGクラスは食塩0.06Mを含む40mMリン酸緩衝液、pH
8.0で平衡化したDEAE−Sepha−cel（pharmacia社）の非
吸着画分を分取し、このIgG画分を更に0.42M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液、pH7.4で平衡化したSephacryl S−30
0Superfine（pharmacia社）カラムでゲル過し、培地
中の仔牛胎児血清およびマウス由来のたん白質を分離、
除去した。IgAおよびIgMクラスの精製についてはDEAE−
Sephacelカラムクロマトグラフイーにおいて食塩0.06M
から1.0Mまでのグラデイエントでそれぞれ両画分を溶出
した。その他はIgGクラスの場合と同様の条件で精製し
た。
実施例２ 抗血清、ヒトPHポリクローナル抗体の作製 （ａ） 免疫 実施例１（ａ）の場合と同様にヒト胎盤より精製したヒ
トPHをフロインド完全アジユバンドと共にウサギ（♀）
に初回免疫する。200μｇのヒトPHを1mlのアジユバンド
との混合液として背部15ケ所に皮下投与し、さらに４ケ
月間、２週間ごとに背部皮下にフロインド完全アジユバ
ンド中200μｇを追加免疫した。各追加免疫後、血液を
採取し、得られたその抗血清とヒトPH活性の阻害をAna
l.Biochem.16,384−394（1966）に記載のHuttonらの方
法に従つて調べたところ、４μで56％の活性阻害を示
した。この抗血清はOuchterlony免疫拡散法および免疫
電気泳動法で１本の沈降線を生じたことからヒトPHに特
異的なものであると判定された。
トPHをフロインド完全アジユバンドと共にウサギ（♀）
に初回免疫する。200μｇのヒトPHを1mlのアジユバンド
との混合液として背部15ケ所に皮下投与し、さらに４ケ
月間、２週間ごとに背部皮下にフロインド完全アジユバ
ンド中200μｇを追加免疫した。各追加免疫後、血液を
採取し、得られたその抗血清とヒトPH活性の阻害をAna
l.Biochem.16,384−394（1966）に記載のHuttonらの方
法に従つて調べたところ、４μで56％の活性阻害を示
した。この抗血清はOuchterlony免疫拡散法および免疫
電気泳動法で１本の沈降線を生じたことからヒトPHに特
異的なものであると判定された。
（ｂ） 抗血清の精製 上記（ａ）で得られたウサギ抗血清を硫酸ナトリウム分
画（18％飽和）後、17.5mMリン酸緩衝液、pH6.3で平衡
化したDEAE−セルロース（DE52、Whatman社）カラムの
非吸着画分を分取し、ヒトPHポリクローナル抗体（精製
IgGフラクシヨン）を得た。
画（18％飽和）後、17.5mMリン酸緩衝液、pH6.3で平衡
化したDEAE−セルロース（DE52、Whatman社）カラムの
非吸着画分を分取し、ヒトPHポリクローナル抗体（精製
IgGフラクシヨン）を得た。
実施例３ サンドイツチ法に基ずくヒトPH放射性免疫学的測定法 （ａ） 放射性元素標識抗体の調製法 前記実施例２（ｂ）で得られたウサギ抗ヒトPH IgG、10
0μｇを1mCiのNa〔125I〕を用いラクトペルオキシダー
ゼ法により標識する。
0μｇを1mCiのNa〔125I〕を用いラクトペルオキシダー
ゼ法により標識する。
未結合〔125I-〕は、Sephadex G−50（φ1.0×15cm）カ
ラムを用いて除去する。リン酸緩衝液（pH7.0）を用い
てカラムから溶出させた、標識抗体は、１％BSA含有リ
ン酸緩衝液（pH7.0）で希釈した保存する（放射活性2.4
μCi/μｇ）。
ラムを用いて除去する。リン酸緩衝液（pH7.0）を用い
てカラムから溶出させた、標識抗体は、１％BSA含有リ
ン酸緩衝液（pH7.0）で希釈した保存する（放射活性2.4
μCi/μｇ）。
（ｂ） 固相担体に結合させる抗体の調製法 マウス抗ヒトPHモノクローナル抗体を、0.1％アジ化ナ
トリウム含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に溶解し、各
々の濃度を0.1mg/mlに調整する。この溶液にポリスチレ
ンボール（φ6.5mm）を４℃、24時間浸漬しポリスチレ
ンボールに抗体をコートする。抗体浸漬液を除去した
後、２％BSAを含むリン酸緩衝液（pH7.0）を加え、30℃
で２時間振とうする。次に、そのポリスチレンボールを
緩衝液Ａ（0.1％BSA、0.1M食塩および0.1％アジ化ナト
リウム含有10mMリン酸緩衝液pH7.0）で洗浄し、緩衝液
Ａに浸し４℃で保存する。
トリウム含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に溶解し、各
々の濃度を0.1mg/mlに調整する。この溶液にポリスチレ
ンボール（φ6.5mm）を４℃、24時間浸漬しポリスチレ
ンボールに抗体をコートする。抗体浸漬液を除去した
後、２％BSAを含むリン酸緩衝液（pH7.0）を加え、30℃
で２時間振とうする。次に、そのポリスチレンボールを
緩衝液Ａ（0.1％BSA、0.1M食塩および0.1％アジ化ナト
リウム含有10mMリン酸緩衝液pH7.0）で洗浄し、緩衝液
Ａに浸し４℃で保存する。
（ｃ） 測定法 固相担体結合抗体として、例えば上記（ｂ）で調製した
クローン番号３−2B12から得られたモノクローナル抗体
結合ポリスチレンボールを用いた例：試験管（φ８×75
mm、８本×２組）のそれぞれに、精製ヒトPH標準品（濃
度０、0.2、0.4、……6.4、12.8各ng/150μ）、また
はヒト血清10μを加え、更に免疫反応用緩衝液（0.1
％BSA、0.1M食塩および0.1％アジ化ナトリウム含有10mM
リン酸緩衝液pH7.0）を加え、いずれも、全量を300μ
とし、よく混合する。
クローン番号３−2B12から得られたモノクローナル抗体
結合ポリスチレンボールを用いた例：試験管（φ８×75
mm、８本×２組）のそれぞれに、精製ヒトPH標準品（濃
度０、0.2、0.4、……6.4、12.8各ng/150μ）、また
はヒト血清10μを加え、更に免疫反応用緩衝液（0.1
％BSA、0.1M食塩および0.1％アジ化ナトリウム含有10mM
リン酸緩衝液pH7.0）を加え、いずれも、全量を300μ
とし、よく混合する。
これに、前記（ｂ）で調製した抗体結合ボールを１個宛
加え、30℃で１〜４時間振とう加温する。反応後、各試
験管内の反応液を吸引、除去し、洗浄液（0.1M食塩含
有、10mMリン酸緩衝液pH7.0）２〜3mlで２回洗浄し、洗
浄液を吸引除去する。
加え、30℃で１〜４時間振とう加温する。反応後、各試
験管内の反応液を吸引、除去し、洗浄液（0.1M食塩含
有、10mMリン酸緩衝液pH7.0）２〜3mlで２回洗浄し、洗
浄液を吸引除去する。
別の試験管にボールを移し、各試験管に〔125I〕−ヒト
PH抗体液、300μ（500,000cpm）を加え、４℃で一夜
放置する。
PH抗体液、300μ（500,000cpm）を加え、４℃で一夜
放置する。
放射性標識抗体溶液を吸引除去し、更に洗浄液2mlで２
回洗浄後、ボールに結合した放射能量をγ−カウンター
で測定する（５分間）。
回洗浄後、ボールに結合した放射能量をγ−カウンター
で測定する（５分間）。
標準曲線を作成し（第１図参照）、血清中のPH量を標準
曲線より読み取る。
曲線より読み取る。
（ｄ） 血清中ヒトPH量 第１図のヒトPH標準曲線を用いて、健常者ならびに生検
により肝硬変と診断された患者の血清について、ヒトPH
量を測定した結果を第２表に示した。
により肝硬変と診断された患者の血清について、ヒトPH
量を測定した結果を第２表に示した。
健常者について、30、68、34各ng/ml、肝硬変患者で
は、165、210、940各ng/mlの数値が得られた。
は、165、210、940各ng/mlの数値が得られた。
なお、ヒトPH結合Sepharose4bアフイニテイカラムによ
り精製した標識ポリクローナル抗体、またはそのＦ（a
b′）２を用いた場合には、分析精度は更に増す。
り精製した標識ポリクローナル抗体、またはそのＦ（a
b′）２を用いた場合には、分析精度は更に増す。
第１図は、実施例３の測定の際に使用したヒトPH標準曲
線を示すグラフであつて、固相担体結合抗体として、マ
ウス抗ヒトPHモノクローナル抗体を結合させたポリスチ
レンボールを、標識抗体として〔125I〕標識ウサギ抗ヒ
トPHポリクローナル抗体IgGを用いて行つたサンドイツ
チ法により得られたヒトPH標準曲線を示したものであ
る。
線を示すグラフであつて、固相担体結合抗体として、マ
ウス抗ヒトPHモノクローナル抗体を結合させたポリスチ
レンボールを、標識抗体として〔125I〕標識ウサギ抗ヒ
トPHポリクローナル抗体IgGを用いて行つたサンドイツ
チ法により得られたヒトPH標準曲線を示したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−125667（ＪＰ，Ａ) ・Ｅｖｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，57 Ｐ．181−188（1975) ・日本病理学会第73回総会講演要旨集 （昭和59年３月５日領布）Ｐ．73
Claims (1)
- 【請求項１】ヒトプロピルヒドロキシラーゼに対するモ
ノクローナル抗体及びヒトプロピルヒドロキシラーゼに
対すポリクローナル抗体を用いたサンドイツチ法に基づ
く放射性免疫学的測定法によるヒト血中のヒトプロリル
ヒドロキシラーゼの定量法であつて、固相担体に結合さ
せる抗体として、ヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−
サブユニットを認識する抗ヒトプロリルヒドロキシラー
ゼモノクローナル抗体を用い、放射性元素標識を付与す
る抗体としてヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するポ
リクローナル抗体を用いることを特徴とするヒトプロリ
ルヒドロキシラーゼの定量法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60179357A JPH0672893B2 (ja) | 1985-08-16 | 1985-08-16 | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの放射性免疫学的測定法による定量法 |
| AU54253/86A AU590746B2 (en) | 1985-03-06 | 1986-03-04 | Method for determining human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay |
| AT86102858T ATE78600T1 (de) | 1985-03-06 | 1986-03-05 | Verfahren zur bestimmung von menschlicher prolyl- 4-hydroxylase durch immunotest. |
| DE8686102858T DE3686068T2 (de) | 1985-03-06 | 1986-03-05 | Verfahren zur bestimmung von menschlicher prolyl-4-hydroxylase durch immunotest. |
| ES552695A ES8802545A1 (es) | 1985-03-06 | 1986-03-05 | Un metodo para determinar prolil 4-hidroxilasa humana por inmunoensayo enzimatico o radioinmunoensayo |
| EP86102858A EP0193935B1 (en) | 1985-03-06 | 1986-03-05 | Method for determining human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay |
| KR1019860001590A KR940002521B1 (ko) | 1985-03-06 | 1986-03-06 | 인체 프로릴 4-히드록시라아제의 정량 방법 |
| CA000516075A CA1276104C (en) | 1985-08-16 | 1986-08-15 | Method for determining human prolyl hydroxylase by radioimmunoassay |
| US07/458,435 US5130233A (en) | 1985-08-16 | 1989-12-28 | Method for determining the β-subunit of human prolyl hydroxylase by radioimmunoassay to detect hepatic disease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60179357A JPH0672893B2 (ja) | 1985-08-16 | 1985-08-16 | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの放射性免疫学的測定法による定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6239772A JPS6239772A (ja) | 1987-02-20 |
| JPH0672893B2 true JPH0672893B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=16064430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60179357A Expired - Lifetime JPH0672893B2 (ja) | 1985-03-06 | 1985-08-16 | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの放射性免疫学的測定法による定量法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5130233A (ja) |
| JP (1) | JPH0672893B2 (ja) |
| CA (1) | CA1276104C (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0750115B2 (ja) * | 1988-02-01 | 1995-05-31 | 帝人株式会社 | ヒト酸性グルタチオンｓ―トランスフェラーゼの測定方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56125667A (en) * | 1980-03-07 | 1981-10-02 | Eisai Co Ltd | Reagent for measurement and measuring method for human muscle type aldolase |
| US4361647A (en) * | 1980-05-22 | 1982-11-30 | Palo Alto Medical Research Foundation | Sandwich immunoassay and compositions for use therein |
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| JPS5754151A (en) * | 1980-09-18 | 1982-03-31 | Takeda Chem Ind Ltd | Physiologically active substance b-52653 and its preparation |
| EP0064063B1 (en) * | 1980-11-07 | 1985-09-11 | Celltech Limited | Assay for interferon |
| US4623621A (en) * | 1982-06-24 | 1986-11-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunoassay for peptide and protein oligomers |
| US4634666A (en) * | 1984-01-06 | 1987-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Human-murine hybridoma fusion partner |
| AU590746B2 (en) * | 1985-03-06 | 1989-11-16 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for determining human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay |
| JPH01145199A (ja) * | 1987-12-01 | 1989-06-07 | Nec Corp | 辞書付き筆記用具 |
-
1985
- 1985-08-16 JP JP60179357A patent/JPH0672893B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-08-15 CA CA000516075A patent/CA1276104C/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-12-28 US US07/458,435 patent/US5130233A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ・Ｅｖｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，５７Ｐ．１８１−１８８（１９７５） |
| ・日本病理学会第７３回総会講演要旨集（昭和５９年３月５日領布）Ｐ．７３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1276104C (en) | 1990-11-13 |
| JPS6239772A (ja) | 1987-02-20 |
| US5130233A (en) | 1992-07-14 |
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