JP2520249B2

JP2520249B2 - ヒトプロリルヒドロキシラ−ゼの免疫学的測定法による定量法

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Publication number: JP2520249B2
Application number: JP62047472A
Authority: JP
Inventors: 昇藤本; 栄治石川; 章大島; 安夫唄; 泰光村垣; 真一吉田; 和義稲田; 賢一小幡; 康雄永井; 潔水木; 和士岩田
Original assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Current assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Priority date: 1986-03-04
Filing date: 1987-03-04
Publication date: 1996-07-31
Anticipated expiration: 2011-07-31
Also published as: JPS62282268A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、肝臓疾患を簡易に診断するのに有用なヒト
血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの定量法に関する
ものである。

従来、ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼ（以
下ヒトPHと略記する）の活性を測定する方法としては、
プロトコラーゲンの４−Ｌ−プロリンを³H標識したもの
を基質にして、生成した³H標識水を真空蒸留で捕捉し、
その放射能を測定する方法が知られている（Huttonら、
Anal.Biochem.,16,384−394,1966）。また、¹⁴Cプロリ
ン標識プロトコラーゲンを基質にして生成した４−水酸
化¹⁴Cプロリンの放射能を測定する方法や（Juvaら、Ana
l.Biochem.,15,77−83,1966）、（pro−pro−gly）_５、
あるいは（pro−pro−gly）₁₀を基質にして、２−オキ
ソ（１−¹⁴C）−グルタール酸より遊離する¹⁴CO₂を捕捉
し、測定する方法も知られている（Bergら、J.Biol.Che
m.,248,1175−1182,1973）。しかしながら、上記した方
法は、いずれも繁雑な操作を必要とし、また、測定に時
間がかかるという欠点がある。血中のヒトPHのほとんど
は酵素学的に不活性化された状態にあるので、精確なヒ
トPHの測定は、容易に行うことはできず、従来法では、
血中のヒトPHの活性を測定したといってもその測定値は
真のヒトPHの量を測定したことを意味しない。

本発明者らは、先に、ヒトプロリルヒドロキシラーゼ
に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を
組合せて用いて、ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラ
ーゼの定量を酵素免疫学的に行った実験例を報告したが
（特開昭60−204726号公報）、更に簡便な方法でヒト血
中のヒトPHを特異的に精確に定量する方法を種々研究し
た結果、少量の試料で精度よく、迅速に測定する方法を
提供することに成功した。

すなわち、本発明は、下記のヒト血中のヒトPHを定量
する方法を提供するものである。

「ヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するモノクローナ
ル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく免疫学的測定法
によるヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの定量
法であって、固相担体に結合させる抗体および酵素標識
あるいは放射性元素標識を付与する抗体としてヒト血中
のヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−サブユニット部
位のみを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とするヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラ
ーゼの定量法。」本発明方法の実施態様において、酵素標識あるいは放
射性元素標識を付与する抗体としては、抗体含有物を硫
安分画あるいは硫酸ナトリウム分画した後、DEAE−セル
ロースカラム精製したIgG画分が用いられる。更には、
ペプシン消化により得られるＦ（ab′）_２あるいはそれ
の還元物Fab′を用いることもできる。したがって、本
発明方法で使用するモノクローナル抗体としては、それ
ら抗体における特異的結合部分Ｆ（ab′）_２あるいはFa
b′そのものを使用する態様も含まれているものであ
る。

抗体に対する放射性元素標識の付与は、タンパク質の
標識に関して知られている方法を用いて行うことができ
る。放射性核種としては、〔¹²⁵I〕を使用するのが好ま
しく、この放射性核種を用いる標識付与の方法として
は、ペルオキシダーゼによるヨウ素化法が適しており、
Immuno chemistry11,203−206（1974）のThorellらの方
法が好ましい。

以上の如く、本発明は、固相担体に結合させる抗体お
よび酵素標識あるいは放射性元素標識を付与する抗体と
してヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−サ
ブユニット部位のみを認識するモノクローナル抗体を用
いることを特徴とする固相法酵素免疫学的あるいは放射
性免疫学的定量法によりヒト血中のヒトPHを定量する方
法を提供するものである。

最近の免疫検査においては、慢性肝炎、肝硬変および
アルコール肝障害などの肝臓疾患においておこる肝線維
化に伴い、組織および血中にヒトPH量の顕著な増加が認
められている。

後掲の第５表及び第９図にみられるように本発明の方
法で測定した肝硬変疾患のヒト血清免疫反応性プロリル
ヒドロキシラーゼ（以下SIRPHと略記する）の測定値
は、健常者血清中のそれよりも有意に高いことが認めら
れ、本発明の方法によれば、SIRPH量測定により、患者
に負担のかかるバイオプシーをすることなく肝疾患、特
に肝線維化を予知することができる。従来の肝機能判定
法として使用されているGOT（グルタミンオギザロ酢酸
トランスアミナーゼ）、GPT（グルタミンピルビン酸ト
ランスアミナーゼ）、LDH（ラクテートデヒドロゲナー
ゼ）、およびγ−GTP（γ−グルタミルトランスペプチ
ターゼ）らの活性測定では、肝組織の線維化を判定する
ことはできず、このことは本発明者らによつて確認され
ている。したがつて、SIRPH量を測定することにより、
この種の疾患を早期発見することが期待され、本発明方
法により、SIRPH量測定に基づく肝組織線維化の診断を
行うことができるので、本発明は非常に有用性が高いも
のである。

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただ
し本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１抗ヒトPHモノクローナル抗体の作製（ａ）抗原−ヒトPH（EC1.14.11.2）の調製ヒト胎盤を材料としてEur.J.Biochem.,57,181−188
（1975）に記載のKuuttiらの方法に従いポリ−Ｌ−プロ
リンをSepharore4BにCNBrでカツプリングさせたアフイ
ニテイクロマトグラフイーでヒトPHを捕捉し、さらにBi
o−Gel A−1.5m（Bio−Rad）カラムで精製、純化した。
得られたヒトPH標品をJ.Virol.,10,211−219（1972）記
載のBaumらの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で調べたと
ころその純度は約90％であつた。

（ｂ）抗体産生細胞の調製８週令のBALB/C雌マウス３匹をまずフロインド完全ア
ジユバント中で、前記（ａ）で精製したヒトPHで初回免
疫する。マウスにそれぞれ50μｇのヒトPHを0.5mlの溶
液として腹腔内投与する。さらに30日目、60日目に生理
食塩水に溶解した同量のヒトPHを追加免疫する。最終免
疫として90日目に静脈内投与（50μg/100μ生理食塩
水）により補助免疫し、３日後にマウス脾臓を取り出
し、脾細胞を調製する。

（ｃ）細胞融合以下の材料および方法を用いる。

RPMI1640培地:RPMI No.1640（Difco Lab.）に重炭酸
ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、
Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウム（50μ/
ml）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）、および硫
酸アミカシン（100μ/ml）を加え、ドライアイスでpHを
7.2にし、0.2μm Toyo.メンブレンフイルターで除菌
過する。

NS−１培地：上記RPMI1640培地に除菌過した仔牛胎
児血清（Granite Diagnostic）を15％（v/v）の濃度に
加える。

HAT培地：上記のNS−１培地にさらにヒポキサンチン（1
0μＭ）、アミノプテリン（0.4μＭ）、およびチミジン
（16μＭ）を加える。

HT培地：アミノプテリンを除去した以外は上記HAT培地
と同一組成のものである。

PEG4,000溶液:RPMI1640培地のポリエチレングリコール
4,000（PEG4,000、Merck Co.）50％（w/w）無血清溶液
を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS−１（P3−NS
1−１）との融合はSelected Method in Cellular Immun
ology（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freema
n and Company（1980）、351−372に記載のOiらの方法
を若干改変して行つた。前記（ｂ）で調製した7.1×10⁸
個の有核脾臓細胞（生細胞率95％）を1.4×10⁸個のNS−
１ミエローマ細胞（生細胞率95％）と融合する。脾臓細
胞とミエローマ細胞とを別に前記のRPMI1640培地で洗滌
する。次に同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の
割合で混合する。容量50mlの円錐形スチロール樹脂製試
験管（Corning Glass Works）を用い、40mlのRPMI1640
培地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全に吸出す
る。沈殿細胞に37℃加温PEG4,000溶液4.8mlを穏やかに
撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間撹拌し細胞
を再けん濁、分散させる。次に37℃加温RPMI1640培地4.
8mlを１分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返し
た後、同培地3mlを２−３分間で常に撹拌しながら滴下
し細胞を分散させる。これを400×ｇ、10分間遠心分離
し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細胞に37
℃加温NS−１培地48mlをすみやかに加え、細胞の大きい
塊りを10mlのピペツトを用いて注意深くピペツテイング
して分散する。さらに同培地96mlを加えて希釈し、ポリ
スチレン製96穴マイクロウエル（Corning Glass Work
s）にウエル当り5.9×10⁵個/0.1mlの細胞をまき込む。
なおこの時使用した96穴マイクロウエルの前処理として
0.2mlのNS−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（37℃）
で１晩保温し、使用時に培地を吸引除去する。細胞融合
完了したマイクロウエルを７％炭酸ガス/93％空気中で
温度37℃、湿度100％下にインキユベートする。

（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖培養１日目にパスツールピペツトでHAT培地２滴（約
0.1ml）を加える。２、３、５、８、11日目に培地の半
分（0.1ml）を新しいHAT培地で置き換える。14日目にHT
培地に切換え以降３−４日毎に同操作を繰り返す。通常
２−３週間で充分なハイブリドーマの生育が観察される
（融合率83％）。ハイブリドーマ生育全ウエルについて
次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ELISA）に
より陽性ウエルをチエツクする。107個/1239ウエルが陽
性として検出された。次にフイーダーとして10⁷個のマ
ウス胸線細胞を含むHT培地1mlをポリスチレン製24穴セ
ルウエル（Corning Glass Works）に加えたものを用
い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマ107個の全
内容物を移す。これを前記（ｃ）におけると同様に７％
炭酸ガス存在下、37℃で約１週間インキユベートする。
その間１−２回各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5
mlと交換する。ハイブリドーマの充分生育した時点でEL
ISAにより陽性を再確認し、それぞれについて次項
（ｆ）記載の限界希釈法によるクローニングを行う。な
お、クローニングに使用後の残液をポリスチレン製25cm
²組織培養フラスコ（Corning Glass Works）に移し、凍
結保存用試料を調製する。

（ｅ）固相−抗体結合テスト（ELISA）による抗ヒトP
H抗体産生ハイブリドーマの検索 Anal.Biochem.104,205−214（1980）に記載のRennard
らの方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、ハ
イブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイ
トレーシヨンプレート（Flow Lab.）を0.5〜1.0μｇの
ヒトPHでコートし、さらにその他を１％牛血清アルブミ
ン（BSA）でブロツクする。これにハイブリドーマ生育
ウエルの上清の一部を加えて室温で約１時間インキユベ
ートする。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウスIgG（TAGO）を加えさらに室温で約１
時間インキユベートする。次に過酸化水素と基質である
ｏ−フエニレンジアミンを加え生成した褐色の程度を肉
眼で定性的に判定するか、あるいはコロナ２波長マイク
ロプレート光度計（MTP−22、コロナ電気社）を用いて5
00nmの吸光度を測定する。

（ｆ）クローニング各ウエル中には２種以上のハイブリドーマが生育して
いる可能性があるので、限界希釈法によりクローニング
を行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得
する。NS−１培地1ml/当りフイーダーとして10⁷個のマ
ウス胸線細胞を含むクローニング培地を調製し96穴マイ
クロウエルの36ウエル、36ウエルおよび24ウエルにウエ
ル当り５個、１個および0.5個のハイブリドーマを加え
る。５日目、12日目に各約0.1mlのNS−１培地を追加す
る。クローニング開始後14−15日で充分なハイブリドー
マの生育が認められ、コロニー形成陰性ウエルが50％以
上である群についてELISAを行う。テストした全ウエル
が陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を確
認し、ウエル中に１コロニーのウエルを４−６個選びク
ローニングする。最終的に38株のクローンを得た。

（ｇ）モノクローナル抗体のインビトロ増殖およびイ
ンビボ増殖モノクローナル抗体は、得られたクローンをNS−１培
地などの適当な培養液で培養（インビトロ増殖）し、そ
の培養上清から得ることができる（モノクローナル抗体
たん白濃度は10−100μg/mlである）。一方、大量に抗
体を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来動物と
同系の動物（BALB/C、マウス）に腫瘍形成促進剤プリス
タン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich
Chemical）をマウス一匹当り0.5ml腹腔内投与する。１
−３週間後にハイブリドーマ１×10⁷個を同じく腹腔内
投与することによりインビボで１−２週間後にモノクロ
ーナル抗体たん白質濃度４−7mg/mlの腹水を得ることが
できる。

（ｈ）モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖のアイソタイ
プ得られた各々の腹水を先ずヒトPHをコートしたミクロ
タイトレーシヨンプレートに前述したELISA法に従つて
結合させる。洗滌後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウ
スIg抗体（Zymed Lab.）を加える。洗滌後、西洋わさび
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体
を加え、基質として2,2′−アジノージ（３−エチルエ
ンゾチアゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検
出した。その結果をまとめて第１表に示した。

調べた抗体の内29個は免疫グロブリン鎖γ1/κを、５
個がγ2a/κ、１個がγ2b/κ、２個がα／κを、そして
１個がμ／κを有していた。なお得られた各モノクロー
ナル抗体のヒトPHのサブユニツトとの反応性をproc.Nat
l.Acad Sci.USA,76,4350−4354（1979）に記載のTowbin
らのウエスタンブロツテイング法により調べた。得られ
た38個のモノクローナル抗体の内、10個は分子量64KDの
α鎖に、27個は60KDのβ鎖にそして、１個は、α鎖とβ
鎖の両方に反応した（第１表、サブユニツトについては
Chen−Kiangら、proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,4420−442
4,1977参照）。

（ｉ）モノクローナル抗体の精製前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（40％飽和）
後、IgGクラスは食塩0.06Mを含む40mMリン酸緩衝液（pH
8.0）で平衡化したDEAE−Sephacel（pharmacia）の非吸
着画分を分取し、このIgG画分を更に0.42M食塩を含む50
mMリン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したSephacryl S−30
0Superfine（pharmacia）カラムでゲル過し、培地中
の仔牛胎児血清およびマウス由来のたん白質を分離、除
去した。IgAおよびIgMクラスの精製についてはDEAE−Se
phacelカラムクロマトラフイーにおいて食塩0.06Mから
1.0Mまでのグラデイエントでそれぞれ両画分を溶出し
た。その他はIgGクラスの場合と同様の条件で精製し
た。

実施例２抗血清、ヒトPHポリクローナル抗体の作製（ａ）免疫実施例１（ａ）の場合と同様にヒト胎盤より精製した
ヒトPHフロインド完全アジユバンドと共にウサギ（♀）
に初回免疫する。200μｇのヒトPHを1mlのアジユバンド
との混合液として背部15ケ所に皮下投与し、さらに４ケ
月間、２週間ごとに背部皮下にフロインド完全アジユバ
ンド中200μｇを追加免疫した。各追加免疫後、血液を
採取し、得られたその抗血清のヒトPH活性の阻害をAna
l.Biochem.16,384−394（1966）に記載のHuttonらの方
法に従つて調べたところ、４μで56％の活性阻害を示
した。この抗血清はOuchterlony免疫拡散法および免疫
電気泳動法で１本の沈降線を生じたことからヒトPHに特
異的なものであると判定された。

（ｂ）抗血清の精製上記（ａ）で得られたウサギ抗血清を硫酸ナトリウム
分画（18％飽和）後、17.5mMリン酸緩衝液（pH6.3）で
平衡化したDEAE−セルロース（DE52、Whatman）カラム
の非吸着画分を分取し、ヒトPHポリクローナル抗体（精
製IgGフラクシヨン）を得た。

実施例３ツーステツプサンドイツチ法に基ずくSIRPH酵素免疫測
定法（ａ）ウサギ抗ヒトPH IgG−POD調製 J.Immunoassay4,209−327,1983に記載の石川らの方法
に従つてウサギ抗ヒトPH IgG−PODを調製した。前記実
施例２（ｂ）で得られたウサギ抗ヒトPH IgGを0.1Mリン
酸緩衝液（pH6.5）に透析し、そのウサギ抗ヒトPH IgG
0.3〜0.5mlに対して100倍モルのジメチルホルムアミド
に溶解したＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸を加え
30℃、30分間インキユベートする。次に0.1Mトリス−塩
酸緩衝液（pH7.0）100μ、0.1M EDTA溶液（pH6.0）10
μ、1Mヒドロキシルアミン溶液（pH7.0）100μを加
え30℃、５分間放置後5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）で平衡化したセフアデツクスＧ−25でゲル
過する。この操作によりSH基標識ウサギ抗ヒトPH IgGが
得られる。

上記の操作と別に、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ
（POD）にマレイミドを標識する。すなわち、6mgのPOD
を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、それに対して2
5倍モルのジメチルホルムアミド溶解Ｎ−（ε−マレイ
ミドカプロイルオキシ）コハク酸イミドを加え30℃、30
分間インキユベートする。これを0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.0）で平衡化したセフアデツクスＧ−25でゲル過し
マレイミド標識POD画分を採取する。

次に上記で調製したSH基標識IgG1モルに対して同じく
上記で調製したマレイミド標識POD約５モルを加え４
℃、20時間放置する。この混合液を0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.5）で平衡化したウルトロゲルAcA44（LKB）カラ
ムでゲル過し、ウサギ抗ヒトPH IgG−POD複合体画分
を分取する。保護剤としてBSAおよびチメロサールをそ
れぞれ0.1％および0.005％になるように添加し使用時ま
で４℃に保存する。なお、マウス抗ヒトPHモノクローナ
ル抗体の場合も上記と同様な処理を施しモノクローナル
抗体Ig−POD複合体を調製する。

（ｂ）ウサギ抗ヒトPH Fab′−PDOの調製前記実施例２（ｂ）で得られたウサギ抗ヒトPH IgGを
0.1M塩化ナトリウム含有0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）に透
析しその抗ヒトPH IgGに対して２％（w/w）ペプシンを
加え37℃、24時間消化した。2Mトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）で反応を止め、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡
化したウルトロゲルAcA44カラムでゲル過しＦ（a
b′）_２画分を分取する。次にこのＦ（ab′）_２画分を
0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）に透析し、0.5−5mg/450μ
溶液を調製する。これに5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩
衝液（pH6.0）に溶解した0.1Mメルカプトエチルアミン5
0μを加え37℃、90分間インキユベートする。次に5mM
EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化ウルトロ
ゲルAcA44カラムでゲル過しFab′画分を分取する。こ
のように調製したFab′は不安定なので24時間以内に前
記（ａ）と同様に調製したマレイミド標識PODをFab′に
対して等モル加え、更に各々の終濃度が50−100μＭに
なる様に5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）で
調整する。この混合液を４℃、20時間あるいは30℃、１
時間放置後、Fab′の10倍モル量のＮ−エチルマレイミ
ドで未反応のSH基をブロツクする。これを0.1Mリン酸緩
衝液、pH6.5で平衡化ウルトロゲルAcA44カラムでゲル
過し、ウサギ抗ヒトPH Fab′−POD複合体画分を分取す
る。なお、マウス抗ヒトPHモノクローナル抗体の場合も
上記と同様な処理を施しモノクローナル抗体Fab′−POD
複合体を調製した。

なお、前記（ａ）及びここではマレイミド法で複合体
を調製したが、過ヨウ素酸法、ピリジルジスルフイド法
あるいはグルタルアルデヒド法を用いて複合体を調製す
ることもできる。

（ｃ）特異結合比の測定法上記（ａ）および（ｂ）で調製したPOD標識抗体は通
常そのままで使用することができるが、特異結合比の１
％以下（通常７−８％）のものについては更に後述する
特異精製により高純度化する方がよい。

まずウサギ抗ヒトPH IgG−PODあるいはウサギ抗ヒトP
H Fab′−POD100ngを0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％BS
A含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）100μに溶解し、ヒ
トPH結合Sepharose4Bアフイニイテイカラム（100μゲ
ル）に充填する。次に0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％B
SA含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）3mlでカラムを洗滌す
る。同様な操作をBSA結合Sepharose4Bカラムについても
行い、両洗滌液各々10μに50mM酢酸緩衝液（pH5.0）
溶解0.5％Ｐ−ヒドロキシフエニル酢酸（PHPA）250μ
、および0.01％過酸化水素水50μを加え30℃、10分
間インキユベートする。0.1Mグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（p10.3）2.5mlを加え反応を停止させキニーネ
（１μg/ml0.1N硫酸）を対照に相対螢光強度を測定す
る。BSAおよびヒトPH結合Sepharose4Bカラム洗滌液の全
POD活性の差より特異結合比を求める。

（ｄ）特異精製法抗ヒトPH IgG−PODあるいは抗ヒトPH Fab′−PODを0.
1M塩化ナトリウムおよび0.1％BSA含有10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）で平衡化ヒトPH結合Sepharose4Bカラム（200
μゲル）に吸着させ、5mlの上記緩衝液で非特異抗体
を洗い流す。次に500μの0.1Mグリシン−塩酸緩衝液
（pH2.5）で特異抗体を0.1％BSA含有0.5Mトリス−塩酸
緩衝液（pH8.0）0.5mlの入つた受器に溶出させる。この
溶出液を0.1〜0.3mlに濃縮し、0.1％BSA含有0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.5）で平衡化ウルトロゲルAcA44カラムでゲ
ル過し、POD標識抗体画分を分取する。チメロサール
を0.001％になるように添加し使用時まで４℃に保存す
る。なお、モノクローナル抗体については特異結合比が
高く特異精製の必要はなかつた。

（ｅ）不溶化抗体の調製実施例１（ｉ）および実施例２（ｂ）で得られたマウ
ス抗ヒトPHモノクローナル抗体、およびウサギ抗ヒトPH
ポリクローナル抗体を、それぞれ0.1％アジ化ナトリウ
ム含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に溶解し、各々の濃
度を0.1mg/mlに調整する。これらの抗体溶液にポリスチ
レンボール（Precision Plastic Ball）を４℃、24時間
浸漬しポリスチレンボールに抗体をコートする。次に抗
体浸漬液を回収しポリスチレンボールを緩衝液Ａ（0.1
％BSA、0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％アジ化ナトリウ
ム含有10mMリン酸緩衝液、pH7.0）で５回洗滌し使用す
る。４℃で１週間以上放置したものについては使用時再
度緩衝液Ａで３回洗滌し使用する。

（ｆ）測定法上記（ｅ）で調整したポリスチレンボールにつき螢光
法（径3.2mmボール使用）および発色法（径6.5mmボール
使用）により測定した。

１）螢光法−検量線用試験管（内径8mm、長さ75mm）を1
0本×２組用意し、各々に実施例１（ａ）で精製したヒ
トPH標準品（０、0.01、0.03、0.1、0.3、１、３、10、
30、100ng/150μ）を150μ加える。検体用試験管に
はヒト血清10μを加え、さらに緩衝液A140μを加え
よく混合する。次に実施例３（ｅ）で調製した抗体結合
ボールをピンセツトで軽く挾み付着液を紙で吸い取り
各試験管に１個宛入れる。各試験管を37℃で１〜４時間
振とう加温後（第１反応、この反応は、更にその後４℃
で一昼夜静置してもよい）、各試験管内の反応液を吸引
除去し洗滌液（0.1M塩化ナトリウム含有10mMリン酸緩衝
液、pH7.0）２〜3mlを加え２回洗滌し、洗滌液を吸引除
去する。また、あらかじめ別の試験管に前記実施例３
（ａ）および（ｂ）で調製した酵素標識抗体を0.1％BSA
および0.1M塩化ナトリウム含有10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で希釈し100ng/150μに調整した各試験管に前記洗
滌済みポリスチレンボールを移し変える。なお、前記実
施例３（ｄ）で特異精製した酵素標識抗体においては10
ng/150μに調整する。それら各試験管を20℃、３−４
時間振とう加温（第２反応）し、各試験管内の未反応の
酵素標識抗体液を吸引除去し、洗滌液２−3mlで２回洗
滌する。次にあらかじめ別の試験管に0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.0）に溶解POD基質、0.6％ｐ−ヒドロキシフエニ
ルプロピオン酸（HPPA）100μを加えたものを準備
し、それらに洗滌済みポリスチレンボールを移し変え
る。またこの反応ステツプから盲検用としてPOD基質、H
PPAのみの試験管２本を準備し、その後の操作を行う。
上記基質添加各試験管に0.015％過酸化水素水50μを
加え30℃で、１時間振とう加温（酵素反応）後、0.1Mグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.3）2.5mlで反
応を停止せしめ、キニーネ（１μg/ml0.1N硫酸）を対照
に日立螢光光度計（204型）を用い相対螢光強度を測定
する。各々の相対螢光強度から盲検値を差引き両対数座
標用紙の横軸に標準品ヒトPH（ng）、縦軸に相対螢光強
度をとり各々の測定値をプロツトし検量線を描く。検体
の10μの相対強度に相当するヒトPH量（ng）を検量線
から読み取り、その値を100倍したものを検体1ml当りSI
RPH量とする。

２）発色法−検量線用試験管（内径9.5mm、長さ105mm）
を10本×２組用意し、各々に実施例１（ａ）で精製した
ヒトPH標準品（０、0.01、0.03、0.1、0.3、１、３、1
0、30、100ng/300μ）を300μ加える。検体用試験
管にはヒト血清10μを加え、さらに緩衝液A290μを
加えよく混合する。次に実施例３（ｅ）で調製した抗体
結合ボールをピンセツトで軽く挾み付着液を紙で吸い
取り各試験管に１個毎入れる。各試験管を37℃で１−４
時間（または30℃で１−２時間）振とう加温後（第１反
応）、各試験管内の反応液を吸引除去し洗滌液２〜3ml
を加えて２回洗滌する。また、あらかじめ別の試験管に
前記実施例３の（ａ）および（ｂ）で調製した酵素標識
抗体液300μ（10ngまたは100ng）を含む各試験管に前
記洗滌済みポリスチレンボールを移し変える。これら各
試験管を20℃、３〜４時間（または30℃、１〜２時間）
振とう加温（第２反応）し、各試験管内の未反応の酵素
標識抗体液を吸引除去し、洗滌液２〜3mlで２回洗滌す
る。次に、あらかじめ、別の試験管に0.1M酢酸緩衝液
（pH5.5）に溶解したPOD基質、0.0134％テトラメチルベ
ンジジン（TMBZ）、300μを加えたものを準備し、そ
れらに洗滌済みポリスチレンボールを移し変える。ま
た、この反応ステツプから盲検用としてPOD基質、TMBZ
のみの試験管２本を準備し、その後の操作を行う。上記
の基質添加試験管それぞれに0.01％過酸化水素水100μ
を加え30℃で、45分間振とう加温（第３反応）した
後、1.33N硫酸600μで反応を停止させる。反応停止
後、水を対照として島津ダブルビーム分光光度計（UV−
150−02型）の波長450nmで吸光度を測定し、盲検と試料
の吸光度差を求める。検対1ml当りのSIRPH量の求め方は
前記１）螢光法の場合と同様である。

（ｇ）固相および複合体用最適抗体の検索上記のサンドイツチ法を用いてSIRPH量を測定する場
合、不溶化抗体用抗体と、酵素標識用抗体の組み合わせ
を決めるために次の検索試験を行う。実施例１および実
施例２で得られた38種類のモノクローナル抗体およびウ
サギ抗ヒトPHポリクローナル抗体を用い、実施例１
（ａ）で精製した標準PHを用いて最適組合わせを調べた
結果を第２表に示した。

まず、イムノグロブリン（Ig）−POD複合体（酵素標
識抗体）の場合、固相（不溶化抗体）：複合体として２
−5G8:3−2B12、２−1C2:3−2B12、２−6G9:3−2B12お
よび２−1C2:ウサギ抗ヒトPH IgGが非特異吸着（Ｎ）に
対する特異的結合（Ｓ）比（S/N）の高い値が得られ
た。一方、Fab′−POD型複合体の場合は、上記組合わせ
の他に３−2B12:ウサギ抗ヒトPH IgGで高いS/N値が得ら
れた。これらの結果を基に固相−複合体の組合わせて２
−5G8:モノクローナル抗体IgG（３−2B12）および３−2
B12:ウサギ抗ヒトPH Fab′、およびウサギ抗ヒトPH Ig
G:ウサギ抗ヒトPH Fab′において検量線を作成した（第
１図および第２図参照）。第１図は第１反応37℃、１時
間−第２反応20℃、３時間−第３反応30℃、１時間振と
う加温した時の螢光法によるヒトPH検量線を示したもの
である。図中、は固相−ウサギ抗ヒトPH IgGの場合であり、（−○−）
は固相−モノクローナル抗体、３−2B12の場合である。
複合体には両方ともにウサギ抗ヒトPH Fab′−PODが用
いられた。（−△−）は固相−モノクローナル抗体、２
−5G8、複合体モノクローナル抗体（IgG）３−2B12−PO
Dが用いられた場合である。

第２図は第１反応37℃、１時間−第２反応20℃、３時
間−第３反応30℃、45分間振とう加温した時の発色法に
よるヒトPH検量線を示したものである。図中、は固相−ウサギ抗ヒトPH IgGの場合であり、（−○−）
は固相−モノクローナル抗体、３−2B12の場合である。
複合体には両方ともにウサギ抗ヒトPH Fab′−PODが用
いられた。螢光法および発色法のいずれも、試験管当り
0.1〜100ngヒトPHで直線性を示し、感度は0.1ngであつ
た。なお、不溶変抗体用抗体、酵素標識用抗体のいずれ
においてもウサギ抗ヒトPHポリクローナル抗体の組合わ
せがモノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の組合わ
せおよびモノクローナル抗体：モノクローナル抗体の組
合わせより感度が若干良好であつた。

次に健常者血清10μを試料として固相用および複合
体用の最適モノクローナル抗体を検索した（第３表参
照）。

表で明らかなようにいずれの組合わせにおいても特異
的結合が著しく低くかつた。同じく健常者血清を試料と
して用い固相および複合体ともにウサギ抗ヒトPH IgGを
用いた場合、第３図に示されるように血清量に相応して
螢光強度は増加した。すなわち、第３図は第１反応37
℃、１時間−第２反応20℃、４時間−第３反応30℃、１
時間振とう加温し螢光法による健常者血清０〜50μ中
のSIRPH量を示したものである。図中、（−）は固相−
ウサギ抗ヒトPH IgG、複合体−ウサギ抗ヒトPH IgG−PO
Dの場合であり、（……）は固相−モノクローナル抗
体、２−5G8、複合体−モノクローナル抗体（IgG）３−
2B12−PODの場合である。固相にモノクローナル抗体、
２−5G8を、複合体にモノクローナル抗体３−2B12（Ig
G）−PODを用いた場合、特異的結合は認められなかつ
た。次に固相に各モノクローナル抗体およびウサギ抗ヒ
トPH抗体を、複合体にウサギ抗ヒトPH IgGまたはFab′
−PODを用いた場合の結果を第４表に示した。

非特異吸着（Ｎ）に対する特異的結合（Ｓ）比（S/
N）は、複合体がウサギ抗ヒトPH IgGの場合、固相に３
−2B12、３−6H5、２−6G9、２−7F8およびウサギ抗ヒ
トPH IgGにおいて良好な結果が得られた。また、複合体
が、ウサギ抗ヒトPH Fab′−PODの場合は固相に３−2B1
2、３−4H2およびウサギ抗ヒトPH IgGにおいても良好な
結果が得られた。なお、複合体にFab′−PODを用いる方
がIgG−PODを用いるよりも非特異吸着が少ないことが判
つた。

（ｈ） SIRPH量の測定上記（ｇ）で固相用および複合体用最適抗体を検索し
たが、固相にモノクローナル抗体IgG（３−2B12）ある
いはウサギ抗ヒトPH抗体IgGを、複合体にウサギ抗ヒトP
H Fab′−PODを用いて健常者、および肝硬変患者のSIRP
H量を測定した（第５表参照）。

固相−複合体の組合わせにおいて３−2B12:ウサギ抗
ヒトPH Fab′−PODの場合、健常者および肝硬変患者のS
IRPH量はそれぞれ95.3および151.5ng/mlで危険率0.1％
で両者の間に有意差が認められた。また、ウサギ抗ヒト
PH IgG:ウサギ抗ヒトPH Fab′−PODの場合、それぞれ9
2.5および142.9ng/mlで危険率５％で両者の間に有意差
が認められた。

（ｉ）競合法によるモノクローナル抗体の分類 96穴ポリスチレン製プレート（Flow Lab.）に20mM炭
酸緩衝液（pH9.6）に溶解したヒトPH200μ（0.5μ
ｇ）を加え、４℃、16時間静置する。次にヒトPHを除去
し１％BSA含有TBS（0.14M塩化ナトリウム含有20mMトリ
ス−塩酸緩衝液、pH8.0）300μを加え、プレートをブ
ロツキングする。更にクローン３−2B12のモノクローナ
ル抗体より前記（ｂ）に記載の方法に従い調製した450n
g/ml TTBS（0.1％Tween20含有TBS）の濃度のFab′−POD
複合体100μおよびTTBSで所定の濃度に希釈した各モ
ノクローナル抗体溶液100μの混合液を加え、室温
で、１時間静置する。反応完了後各ウエルをTTBSで洗浄
し、続いてTBSでTween−20を除いた後、0.0134％TMBZ15
0μと0.01％過酸化水素水50μの混合液を加え、室
温で、15分間発色させる。次にウエル中の各反応液180
μを、あらかじめ1.33N硫酸270μ加えた試験管に加
えることにより反応を停止させる吸光度（A₄₅₀）を測定
する。

なお、上記のモノクローナル抗体としては、血清中の
ヒトPHの状態が殆んどβ−サブユニツトより構成されて
いることにより（後載第７図参照）、β−サブユニツト
認識抗体をここでは、使用した。第４図Ａにクローン３
−2B12（−●−）、９−71E10（−○−）及び対照（−
△−）の抗体を、第４図Ｂ〜４図Ｊにそれぞれクローン
９−5A11、９−11G11、９−20H8、９−31H6、９−66H
6、９−72G12、９−76D6、９−81F2および９−87H9の抗
体とFab′（３−2B12）のPOD複合体との競合パターンを
示した。この競合試験において、クローン３−2B12の
抗体が認識する抗原の部位と同一の部位を認識する抗体
群（グループ１）とクローン３−2B12の抗体が認識す
る抗原の部位と異なる部位を認識する抗体群（グループ
２）に分けることができた（第６表参照）。

クローン３−2B12の抗体と競合するものをグループ１
に、競合しないものをグループ２とした。

（ｊ）固相に結合させるモノクローナル抗体の選択抗原との親和性の高いクローン３−2B12の抗体より調
製した複合体、Fab′−PODを用い、第６表に示したグル
ープ２の抗体群から固相に使用する抗体を選定した。抗
原としてヒトPHを０および12.8ng/チユーブ、複合体量
を０、2.44、24.4および244ng/チユーブとして実施例３
（ｆ）に記載の方法に準じてツーステツプ測定法を行つ
た（第７表参照）。

固相用抗体としてA₄₅₀値の高い順にクローン９−5A1
1、９−20H8、９−31H6、９−66H6および９−81F2の５
種類を選んだ。更に抗原にヒトPH、クローン３−2B12の
抗体より調製したFab′−POD（100ng/チユーブ）を複合
体に、ここで選んだクローン９−5A11（−○−）、９−
20H8（−▲−）、９−31H6（−△−）、９−66H6（−□
−）及び９−81F2（−▽−）の５種類のモノクローナル
抗体を固相に、また、Fab′（ウサギ）−POD（10ng/チ
ユーブ）を複合体に、クローン３−2B12（−●−）のモ
ノクローナル抗体を固相としてツーステツプ測定法でSI
RPHを測定するための検量線を作成した（第５図参
照）。第５図の検量線から健常者血清（No.466、No.46
8）および肝疾患患者血清（No.4559）中のSIRPH値を求
めた（第８表参照）。

クローン９−20H8の抗体を固相に用いた系では検量線
は得られたが、SIRPHの検出はできなかつた。その他の
４種の抗体それぞれとクローン３−2B12の抗体より調製
した複合体の各組み合わせの系ではいずれも健常者と肝
疾患患者のSIRPH値に有意な差が認められ、それらの差
は、クローン３−2B12の抗体を固相に用い、複合体とし
てウサギ抗ヒトPH Fab′−PODを用いる組み合わせの系
の場合に比し、顕著に認められた。また、抗原として後
記の方法でコラゲナーゼ処理により調製したヒトPHβ
−サブユニツトを用い、クローン９−5A11（−○−）、
９−31H6（−△−）、９−66H6（−□−）、あるいは９
−81F2（−▽−）の抗体を固相に、クローン３−2B12の
抗体より調製したFab′−POD（100ng/チユーブ）を複合
体としてツーステツプ測定法を行つた（第６図参照）。
第６図に示した検量線から健常者（No.468）および肝疾
患患者（No.3732）のSIRPH値を測定した（第９図参
照）。

固相に使用した上記４種類のいずれの抗体を用いて
も、前記の抗原にヒトPHを用いた場合におけると同様に
健常者と肝疾患患者のSIRPH値に顕著な差が認められ
た。

ヒトPHβ−サブユニツトの調製実施例１（ａ）で調製したヒトPH50μ（100μｇ）
を96mM塩化ナトリウム、6mM塩化カルシウムおよび2.4mM
P−アミノフエニール酢酸第二水銀含有96mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.6）に溶解した細菌クロストリジウム属
由来粗コラゲナーゼ（比活性200μ/mg、和光純薬）250
μ（5mg）に加え37℃、２時間消化し、0.1M EDTA（pH
6.0）溶液250μを加えて反応を停止した。次にクロー
ン２−6G9のモノクローナル抗体結合Sepharose4Bカラム
（35μgIgA/500μベツド容量）に上記で得られた消化
生成物をロードし、非吸着画分および洗浄（ベツド容量
の５倍量）画分を得た。その両画分をクローン３−2B12
のモノクローナル抗体結合セフアロース4Bカラム（488
μgIgG1/400μベツド容量）にロードし、樹脂ベツド
容量の各５倍量の0.1M塩化ナトリウム含有10mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.4）および0.1M酢酸緩衝液（pH5.5）で
洗浄した。次に樹脂ベツド容量の５倍量の3Mロダンカリ
および0.1M塩化ナトリウム含有0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.4）でカラム吸着物質を溶出し、直ちにPD−10カ
ラム（Pharmacia）でロダンカリを除去し、コロジオン
バツグ（分画分子量12KD）で濃縮した。

（ｋ）ヒト血清たん白質と固相用抗体との反応性前項（ｊ）で選定したクローン９−5A11（レーン２、
７）、９−31H6（レーン３、８）、９−66H6（レーン
４、９）、あるいは９−81F2（レーン５、10）の抗体を
各々Sepharose4Bに結合させたカラム（各々600μｇ、57
0μｇ、515μｇおよび600μg/500μベツド容積、サイ
ズ0.5×2.6cm）を調製し、0.85％塩化ナトリウム含有10
mMリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化した。次に健常者血
清6mlを各カラムに充填し、上記平衡化緩衝液5ml、続い
て0.1M酢酸緩衝液（pH5.5）5mlで各カラムを洗浄した
後、カラム吸着物を3Mロダンカリ2mlで溶出した。溶出
画分をセントリコン10（Amicon）で濃縮し、固相用抗体
とヒト血清たん白質との反応性を調べた（第７図参
照）。すなわち、上記濃縮カラム溶出画分をSDS−PAGE
およびウエスタンブロツテングにかけた後、ヒトPHβ−
サブユニツト認識複合体としてIgG1（９−71E10）−POD
（レーン１〜５）、ヒトPHα−サブユニツト認識複合体
としてIgG1（９−79F12）−POD（レーン６〜10）各５μ
g/mlを用いて免疫染色した。対照として、ヒトPH0.5μ
ｇ（レーン１および６）を上記と同様の操作をして免疫
染色した。第７図で明らかな如く、いずれの固相用抗体
も主に血清中ヒトPHと反応しており、他の血清たん白質
との交差反応は殆んど認められなかつた。また、アフイ
ニテイカラムで得られたSIRPHはヒトPHβ−サブユニツ
トのみが検出され、ヒトPHα−サブユニツト認識抗体と
免疫反応を示さなかつた。

実施例４ワンステツプサンドイツチ法に基ずくSIRPH酵素免疫測
定法（ａ）測定法標準抗原として実施例３（ｊ）ので調製したヒトPH
β−サブユニツトを用いた。標識抗体としてクローン９
−71E10の抗体を用いて実施例３（ａ）で調製したIgG−
POD（20ng/チユーブ）を用いた。固相用抗体として実施
例３（ｊ）で選択したクローン９−5A11（−○−）、９
−31H6（−△−）、９−66H6（−□−）及び９−81F2
（−▽−）の４種類を用いた。これら標準抗原、標識抗
体および固相抗体の３者を混合し、30℃、１時間反応
後、ポリスチレンボールを洗浄し、新しい試験管に入れ
換え、実施例３（ｆ）に記載の方法に準じて30℃、15分
間加温、発色させた。第８図に示した如く、いずれの固
相用抗体を用いても０点が低く良好な検量線が得られ
た。

（ｂ）固相用抗体の選定前記（ａ）で用いた４種類の固相用抗体の内から最適
抗体を選定するために、健常社血清48例及び肝癌患者血
清49例のSIRPH値を前記（ａ）に記載の条件で測定し
た。その結果を第10表に示す。

第10表に示した如く各固相抗体により平均SIRPH値に
差が認められたが、健常者血清と肝癌患者血清中のSIRP
H値の比から複合体IgG（９−71E10）−PODに対する固相
用抗体としてクローン９−81F2の抗体を選定した。

（ｃ） SIRPHの測定前記（ｂ）で選定したクローン９−81F2の抗体を固相
に用い、IgG（９−71E−10）−PODを複合体として用い
る組合せで抗原に実施例３（ｊ）ので調製したヒトPH
β−サブユニツトを用いて健常者血清100例及び肝癌患
者血清49例のSIRPH値を前記（ａ）に記載の条件で測定
した（第９図参照）。それぞれの平均値（図中横線）
は、24.9及び97.4ng/mlで危険率0.1％で両者の間に有意
差が認められた。

実施例５固相担体にビニール製又はポリスチレン製のマイクロウ
エルを用いた時のSIRPHのワンステツプ測定（ａ）モノクローナル抗体−ポリクローナル抗体系塩化ビニール製96穴マイクロプレート（Costar）に10
0μg/mlの濃度のモノクローナル抗体、３−2B12をウエ
ル当り200μ加え４℃に放置し抗体をウエルにコート
する。測定時に0.1％BSAおよび0.1M食塩含有10mMリン酸
緩衝液（pH7.0）で５回洗滌し、実施例１（ａ）で精製
したヒトPH標準品（０、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4
および12.8各ng/20μ）20μあるいは血清20μお
よび上記希釈用緩衝液で調製した複合体、100ng/150μ
の濃度のウサギ抗ヒトPH Fab′−POD、150μを同時
に加え37℃、２時間静置する（第１反応）。これを前述
の洗滌液220μで３回洗滌し、0.1M酢酸緩衝液、pH5.5
溶解0.0134％TMBZ150μおよび0.01％の過酸化水素水5
0μを加え37℃、45分間加温（酵素反応）後、各反応
液180μを1.33N硫酸270μを含む試験管に分取し反
応を停止する。反応停止後水を対照として島津ダブルビ
ーム分光光度計（UV−150−02型）の波長450nmで吸光度
を測定する。片対数座標用紙の横軸に標準品ヒトPH（n
g）、縦軸に吸光度をとり各々の測定値をプロツトし検
量線を描く。検体20μの吸光度に相当するヒトPH量
（ng）を検量線から読み取り、その値を50倍したものを
検体1ml当りのSIRPH量とする。添付第10図には96穴ビニ
ール製プレートにモノクローナル抗体、３−2B12をコー
トし、複合体にウサギ抗ヒトPH Fab′−PODを用いた時
のヒトPH検量線が示してある。第10図に示されているよ
うに０−12.8ngの範囲では曲線を描き定量限界は約0.1n
gであつた。この検量線より健常者３人のSIRPH量を測定
したところ血清1ml当り49、32および18ngであつた。

このワンステツプ測定法は実施例３（ｆ）に記載した
固相担体にポリスチレンボールを用いたツーステツプ測
定法より精度は若干落ちるが、多数の検体処理が必要な
際の定量もしくは定性に適している。

（ｂ）モノクローナル抗体−モノクローナル抗体系クローン９−81F2の抗体を前記（ａ）の記載の方法に
従つてコートした96穴ポリスチレン製マイクロプレート
（Flow Lab.）に抗原としてヒトPHβ−サブユニツト、
複合体（20ng/チユーブ）としてIgG（９−71E10）−POD
（−△−）あるいはIgG（３−2B12）−POD（−○−）を
用い実施例４（ａ）項に記載したワンステツプサンドイ
ツチ法の条件で検量線を作成した（第11図参照）。ま
た、それらの検量線から求めた健常者SIRPH値を第11表
に示した。

実施例６抗原の同定サンドイツチ法に基づく酵素免疫法によつて捕捉され
ている抗原が実施例１（ａ）で胎盤より精製したヒトPH
と同一のものであるか否かを次のようにして確認した。
まず、肝障害ヒト血清1ml（SIRPH、298ng/ml）を0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したウルトロゲルAcA34カ
ラム（1.5×45cm）でゲル過した。第12図にはヒト血
清のウルトロゲルAcA34カラムによるゲル過溶出図が
示してある。図中、（−）は280nmの吸光度であり、
（−○−）は固相−モノクローナル抗体、３−2B12、複
合体−ウサギ抗ヒトPH Fab′−PODを用いた時のSIRPH量
である。第12図に示されているように固相に３−2B12、
複合体にウサギ抗ヒトPH Fab′−PODを用い各フラクシ
ヨンのSIRPHを測定したところVe/Vo1.38および1.96に２
つのピークが認められた。このSIRPH量の多いフラクシ
ヨンをプールし、このゲル過操作を更に２回繰り返し
た後、血清3mlに相当するSIRPH量の多い２つのフラクシ
ヨンを集め限外過法により濃縮した。

次に上記の濃縮試料をモノクローナル抗体、３−2B12
結合Sepharose4B（0.35×10cm、62.4ng抗体/40μゲ
ル）によるアフイニテイクロマトグラフイーで各フラク
シヨン中のSIRPHを精製した。すなわち、0.1Mリン酸緩
衝液（pH7.0）で平衡化した上記アフイニテイカラムに
濃縮試料を吸着させ、まず平衡化緩衝液6mlで洗滌し
た。次に2Mトリス−塩酸緩衝液、pH8.0、300μを含む
受器にカラム吸着物を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（pH2.
5）300μで溶出した。このようにして得られた２つの
フラクシヨンの溶出液を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析、濃縮後、実施例１（ａ）のBaumらの方法に従いSD
S−PAGEを行つた。更に実施例１（ｈ）に記載したTowbi
nらのウエスタンブロツテイング法により泳動物質をア
クリルアミドゲルからニトロセルロース紙（Trans−Blo
t^TM、0.45μｍ、Bio−Rad）に転写させた。このニトロ
セルロース紙をモノクローナル抗体（３−2B12）IgG−P
OD、3,3′−ジアミノベンジンおよび過酸化水素水で処
理した。第13図に第12図の２つのSIRPH画分を各各モノ
クローナル抗体、３−2B12結合Sepharose4Bアフイニテ
イカラムで精製し、次にSDS−PAGEを行つた後、ニトロ
セルロース紙に転写した時のパターンを示した。図中、
（ａ）は精製ヒトPH、（ｂ）は第12図のF27−41画分、
（ｃ）は第12図のF45−59画分である。なお、この場合
の標準分子量についてはミオシンＨ鎖（200,000）、ホ
スホリラーゼｂ（92,500）、BSA（68,500）、オバルミ
ン（43,000）、α−キモトリプシノーゲン（25,700）、
β−ラクトグロブリン（18,400）およびチトクロームＣ
（12,300）を含むキツト（BRL）を用いた。第13図に示
したようにヒト胎盤由来ヒトPHはβ−サブユニツトに相
当する分子量60KDのメインと分子量170−190KDの２つの
バンドが認められた。（第13図−ａ参照）。一方、第12
図のF27−41およびF45−59の２つのフラクシヨンについ
ては分子量60KDに相当するバンドとそれより高分子域に
数個のバンドが認められた（第13図−ｃ参照）。

また、健常者と肝疾患患者血清を0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.0）で平衡化したウルトロゲルAcA34カラム（1.5
×90cm）でゲル過し、それらの溶出SIRPHのパターン
と実施例１（ａ）で胎盤より調製したヒトPHのパターン
についてその分子サイズを比較した。まず健常者血清2.
5ml（SIRPH、50ng/ml）及び肝疾患患者血清0.1ml（SIRP
H、1200ng/ml）をそれぞれゲル過し、固相にクローン
９−31H6の抗体を、複合体にIgG（９−71E10）−POD
（ヒトPHβ−サブユニツト認識）を用いSIRPHのパター
ンを調べたところ、両者ともに分子量150KD付近に一つ
のピークとして検出されたが、健常者血清中のSIRPHの
分子量が若干大きかつた（第14図Ａ及びＣ参照）。な
お、健常者血清をクローン９−31H6の抗体（ヒトPHβ−
サブユニツト認識）結合Sepharose4Bに流し、その非吸
着画分のゲル過においては、SIRPHが認められなかつ
た（第14図Ｂ）。一方、BSA含有ヒトPH（サブユニツト
α、サブユニツトβより成る分子量240KDのテトラマ
ー、α_２β_２）の溶出位置は上記の血清のそれらとは異
なり、より高分子側にシフトれていた（第14図Ｄ）。以
上の結果と実施例３（ｋ）項のウエスタン・ブロツテン
グの結果より、SIRPHはヒトPHβ−サブユニツトの２−
３量体と考えられる。

実施例７ SIRPHの放射性免疫学的測定（ａ）放射性元素標識抗体の調製前記実施例２（ｂ）で得られたウサギ抗ヒトPH IgG、
100μｇを1mCiのNa〔¹²⁵I〕を用いラクトペルオキシダ
ーゼ法により標識する。

未結合〔¹²⁵I^-〕は、Sephadex G−50（φ1.0×15cm）
カラムを用いて除去する。0.1M塩化ナトリウム含有50mM
リン酸緩衝液（pH7.4）を用いてカラムから溶出させ
た、標識抗体は、１％BSA含有10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で希釈して保存する（放射活性2.4μCi/μｇ）。

（ｂ）固相担体に結合させる抗体の調製実施例１（ｉ）で得られたモノクローナル抗体を、0.
1％アジ化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に
溶解し、各々の濃度を0.1mg/mlに調整する。この溶液に
ポリスチレンボール（φ6.5mm）を４℃、24時間浸漬し
ポリスチレンボールに抗体をコートする。抗体浸漬液を
除去した後、２％BSAを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
を加え、30℃で２時間振とうする。次に、そのポリスチ
レンボールを緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａに浸し４℃で
保存する。

（ｃ）測定法固相担体結合抗体として、上記（ｂ）で調製したクロ
ーン３−2B12のモノクローナル抗体結合ポリスチレンボ
ールを用いた。試験管（φ８×75mm、８本×２組）のそ
れぞれに、精製ヒトPH標準品（濃度０、0.2、0.4、……
6.4、12.8各ng/150μ）、またはヒト血清10μを加
え、更に緩衝液Ａを加え、いずれも、全量を300μと
し、よく混合する。

これに、前記（ｂ）で調製した抗体結合ボールを１個
宛加え、30℃で１〜４時間振とう加温する。反応後、各
試験管内の反応液を吸引、除去し、前述の洗浄液２〜3m
lで２回洗浄し、洗浄液を吸引除去する。

別の試験管にボールを移し、各試験管に〔¹²⁵I〕−ヒ
トPH抗体液、300μ（500,000cpm）を加え、４℃で一
夜放置する。

放射性標識抗体溶液を吸引除去し、更に洗浄液2mlで
２回洗浄後、ボールに結合した放射能量をγ−カウンタ
ーで測定する（５分間）。

検量線を作成し（第15図参照）、SIRPH量を検量線よ
り読み取る。

（ｄ） SIRPH量の測定第15図のヒトPH検量線を用いて、健常者ならびに生検
により肝硬変と診断された患者各３例の血清について、
SIRPH量を測定した。

健常者について、30、68、34各ng/ml、肝硬変患者で
は、165、210、940各ng/mlの数値が得られた。

なお、ヒトPH結合Sepharose4Bアフイニテイカラムに
より精製した標識ポリクローナル抗体、またはそのＦ
（ab′）_２を用いた場合には、分析精度は更に増す。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明の定量法により作成した、
ヒトPHの検量線の例を示した図であり、第３図は本発明
の定量法により健常者のSIRPH量を測定した結果を示す
図であり、第４図はクローン３−2B12のモノクローナル
抗体と他のモノクローナル抗体との競合パターンを示す
図であり、第５図および第６図はそれれ、本発明の定量
法により作成したヒトPHおよびヒトPHβ−サブユニツト
の検量線の例を示した図であり、第７図は、ヒト血清た
ん白質と固相用モノクローナル抗体との反応性を電気泳
動とウエスタン・ブロツテイング法により調べた図面に
代る写真であり、第８図は本発明の定量法によつてワン
ステツプ測定法により作成したヒトPHβ−サブユニツト
の検量線の１例を示した図であり、第９図は本発明の定
量法により、健常者および肝癌患者のSIRPH値を測定し
た結果を示す図であり、第10図は本発明の定量法により
作成したビニール製マイクロプレートを用いてのヒトPH
の検量線の１例を示した図であり、第11図は本発明の定
量法により作成したポリスチレン製マイクロプレートを
用いてのヒトPHβ−サブユニツトの検量線の１例を示し
た図であり、第12図はヒト血清のゲル過たん白質及び
SIRPHパターンを示す図であり、第13図は、SIRPH画分の
電気泳動後、ニトロセルロース紙に転写した時のウエス
タン・ブロツテイングパターンを示す図であり、第14図
は健常者、肝疾患患者血清及び胎盤より調製したヒトPH
のゲル過たん白質及びSIRPH溶出パターンを示す図で
あり、第15図は本発明の定量法によつて放射性免疫学的
測定法により作成してヒトPHの検量線の１例を示した図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者村垣泰光和歌山市鷹匠町３−７−５ (72)発明者吉田真一富山市中島４丁目13番地16号 (72)発明者稲田和義富山県射水郡小杉町三ケ45番地 (72)発明者小幡賢一礪波市本町７番13号 (72)発明者永井康雄富山市水落92番地６号 (72)発明者水木潔礪波市林1018番６号 (72)発明者岩田和士高岡市五十里東町190番地 (56)参考文献特開昭60−204726（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するモ
ノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく免疫
学的測定法によるヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラ
ーゼの定量法であって、固相担体に結合させる抗体およ
び酵素標識あるいは放射性元素標識を付与する抗体とし
てヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼのβ−サブ
ユニット部位のみを特異的に認識するモノクローナル抗
体を用いることを特徴とするヒト血中のヒトプロリルヒ
ドロキシラーゼの定量法。