JP2968538B2 - ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 - Google Patents
ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、肝臓疾患の診断等に、あるいは、その他医
学的生理学的分野の用途に有用なヒトラミニンのモノク
ローナル抗体、ならびにその利用に関する。
学的生理学的分野の用途に有用なヒトラミニンのモノク
ローナル抗体、ならびにその利用に関する。
さらに詳しく言えば、本発明は、ヒトラミニンの光原
決定基に対し、特異的に結合するモノクローナル抗体な
らびにそれを用いて行うヒトラミニンの定量法に関す
る。
決定基に対し、特異的に結合するモノクローナル抗体な
らびにそれを用いて行うヒトラミニンの定量法に関す
る。
［背景技術］ 従来、ヒト血中のヒトラミニンを測定する方法として
は、ウサギポリクローナル抗体を使用して、放射性同位
元素、蛍光色素、酵素あるいは染料等により標識を付与
した抗原と被検試料中の未知量の抗原との競争反応に基
づき免疫学的測定を行う方法が知られている（特公平１
−22904号公報参照）。
は、ウサギポリクローナル抗体を使用して、放射性同位
元素、蛍光色素、酵素あるいは染料等により標識を付与
した抗原と被検試料中の未知量の抗原との競争反応に基
づき免疫学的測定を行う方法が知られている（特公平１
−22904号公報参照）。
本発明は、肝臓疾患の簡易診断に有用なヒトラミニン
の定量に関するものである。更に詳しくは、本発明は、
固相担体に結合させる抗体および酵素を付与する抗体と
してヒトラミニンの異なる抗原決定基に対し、特異的に
結合する２種類のヒトラミニンに対するモノクローナル
抗体を用いて、サンドイツチ法に基づいてヒトラミニン
を定量する方法に関するものである。
の定量に関するものである。更に詳しくは、本発明は、
固相担体に結合させる抗体および酵素を付与する抗体と
してヒトラミニンの異なる抗原決定基に対し、特異的に
結合する２種類のヒトラミニンに対するモノクローナル
抗体を用いて、サンドイツチ法に基づいてヒトラミニン
を定量する方法に関するものである。
すなわち、上記公報記載の実施例に見られるように、
この方法では、被検試料にラミニンポリクローナル抗体
を混和し16時間以上反応させた後、標識ラミニンを加え
６〜７時間反応させ、その後、沈澱剤を加え16時間以上
反応させ遠心により結合ラミニンおよび遊離ラミニンを
分離し、抗原量を算出している。ところで、このような
方法では、まず、反応時間が長いこと、更には、精度が
著しく低いことなどの欠点が存在する。
この方法では、被検試料にラミニンポリクローナル抗体
を混和し16時間以上反応させた後、標識ラミニンを加え
６〜７時間反応させ、その後、沈澱剤を加え16時間以上
反応させ遠心により結合ラミニンおよび遊離ラミニンを
分離し、抗原量を算出している。ところで、このような
方法では、まず、反応時間が長いこと、更には、精度が
著しく低いことなどの欠点が存在する。
［発明の目的］ 本発明の目的は、ヒトラミニンの抗原決定基に対し、
特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、このモ
ノクローナル抗体を用いて微量の被検試料から、精度良
く、簡便かつ迅速にその試料中のヒトラミニンを定量す
る方法を提供することにある。
特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、このモ
ノクローナル抗体を用いて微量の被検試料から、精度良
く、簡便かつ迅速にその試料中のヒトラミニンを定量す
る方法を提供することにある。
［発明の開示］ 本発明により、前記のモノクローナル抗体を用いて、
サンドイツチ法による酵素免疫学的測定法（EIA）によ
りヒトラミニンを定量する方法が提供されるが、その
際、固相担体に結合させる抗体ならびに酵素標識を付与
する抗体として、分子量200KDのヒトラミニンP1フラグ
メントに対するモノクローナル抗体であって、分子量約
200KDのラミニンP1フラグメントおよび分子量約70KDの
ラミニンP1フラグメントと反応し、かつ分子量900KDの
ラミニンと反応しない抗ヒトラミニンモノクローナル抗
体を使用することを特徴とするものである。
サンドイツチ法による酵素免疫学的測定法（EIA）によ
りヒトラミニンを定量する方法が提供されるが、その
際、固相担体に結合させる抗体ならびに酵素標識を付与
する抗体として、分子量200KDのヒトラミニンP1フラグ
メントに対するモノクローナル抗体であって、分子量約
200KDのラミニンP1フラグメントおよび分子量約70KDの
ラミニンP1フラグメントと反応し、かつ分子量900KDの
ラミニンと反応しない抗ヒトラミニンモノクローナル抗
体を使用することを特徴とするものである。
本発明により提供されるモノクローナル抗体に関して
は、後に詳述するが、本発明に係るヒトラミニンの定量
法について説明すると、本発明の定量方法においては、
酵素免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体
としては、抗原や抗体を良く吸着するポリスチレン製、
ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビ
ニル製のボール、マイクロプレート、ステイツクあるい
は試験管などの種々の材料および使用形態を任意に選択
し、使用することができる。一方、酵素標識を付与する
抗体としては、抗体含有物を硫安分画した後、DEAE−Se
phacelの如き陰イオン交換ゲルおよびIgGを特異的に吸
着させるProteinAにより精製したIgG画分、更には、ペ
プシン消化後還元して得られる特異的結合部分Fab′を
用いることができる。
は、後に詳述するが、本発明に係るヒトラミニンの定量
法について説明すると、本発明の定量方法においては、
酵素免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体
としては、抗原や抗体を良く吸着するポリスチレン製、
ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビ
ニル製のボール、マイクロプレート、ステイツクあるい
は試験管などの種々の材料および使用形態を任意に選択
し、使用することができる。一方、酵素標識を付与する
抗体としては、抗体含有物を硫安分画した後、DEAE−Se
phacelの如き陰イオン交換ゲルおよびIgGを特異的に吸
着させるProteinAにより精製したIgG画分、更には、ペ
プシン消化後還元して得られる特異的結合部分Fab′を
用いることができる。
本発明の方法は、被検試料中のヒトラミニンの定量を
短時間に行うことができること、精度よく測定し得るこ
とを特徴的利点とするものであり、この定量法は、慢性
肝炎、急性肝炎、肝硬変、アルコール性肝障害、原発性
肝癌および原発性胆汁性肝硬変などの肝臓疾患において
起こる肝の線維化を診断し得るので極めて有用なもので
ある。後に詳述するが、本発明の方法により測定した肝
臓疾患患者血清中ヒトラミニン量の測定値は、健常者血
清中のそれよりも有意に高いことが認められ、更に、本
発明の方法により、血中ヒトラミニン量を測定すること
によって、患者に負担のかかるバイオプシーを行うこと
なく肝臓疾患、特に線維化を診断することができる。す
なわち、本発明の定量法によるヒトラミニン量の測定
は、肝組織の線維化診断において、非常に有用なもので
ある。
短時間に行うことができること、精度よく測定し得るこ
とを特徴的利点とするものであり、この定量法は、慢性
肝炎、急性肝炎、肝硬変、アルコール性肝障害、原発性
肝癌および原発性胆汁性肝硬変などの肝臓疾患において
起こる肝の線維化を診断し得るので極めて有用なもので
ある。後に詳述するが、本発明の方法により測定した肝
臓疾患患者血清中ヒトラミニン量の測定値は、健常者血
清中のそれよりも有意に高いことが認められ、更に、本
発明の方法により、血中ヒトラミニン量を測定すること
によって、患者に負担のかかるバイオプシーを行うこと
なく肝臓疾患、特に線維化を診断することができる。す
なわち、本発明の定量法によるヒトラミニン量の測定
は、肝組織の線維化診断において、非常に有用なもので
ある。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発
明は、これら実施例により限定されるものではない。
明は、これら実施例により限定されるものではない。
実施例 １ 抗ヒトラミニンモノクローナル抗体の作製 （ａ）抗原（ヒトラミニン）の調整 J.Biochem.,193,749−755（1981）に記載のRisteliら
の方法に従い、ヒト胎盤をペプシン消化し、DEAE−Seph
acelカラム（Pharmacia製）の溶出画分に、ラミニンP1
およびPa画分を得た。次にその溶出画分をコラゲナーゼ
処理し、Sepharose CL−4Bカラム（Phrarmacia製）で精
製し、ヒトラミニンP1画分を得た。精製ヒトラミニン
は、J.Mol.Biol.,80,579−599（1973）に記載のLaemmli
らの方法に0.5％アガロースを加えたドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミド（3.5％）電気泳動（SDS−
PAGE）でその純度を調べた。その結果、分子量約200Kダ
ルトン（200KD）の単一バンドを示した。
の方法に従い、ヒト胎盤をペプシン消化し、DEAE−Seph
acelカラム（Pharmacia製）の溶出画分に、ラミニンP1
およびPa画分を得た。次にその溶出画分をコラゲナーゼ
処理し、Sepharose CL−4Bカラム（Phrarmacia製）で精
製し、ヒトラミニンP1画分を得た。精製ヒトラミニン
は、J.Mol.Biol.,80,579−599（1973）に記載のLaemmli
らの方法に0.5％アガロースを加えたドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミド（3.5％）電気泳動（SDS−
PAGE）でその純度を調べた。その結果、分子量約200Kダ
ルトン（200KD）の単一バンドを示した。
（ｂ）抗体産生細胞の調製 精製ヒトラミニン60μｇを完全フロインドアジュバン
ドと共に８週令のBALB/C雌マウス２匹に初回腹腔内投与
した。更に16日目に0.15M塩化ナトリウム含有50mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.4）に溶解させた抗原60μｇを追
加免疫した。最終免疫として50日目に抗原65μｇを静脈
内投与し、その３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製し
た。
ドと共に８週令のBALB/C雌マウス２匹に初回腹腔内投与
した。更に16日目に0.15M塩化ナトリウム含有50mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.4）に溶解させた抗原60μｇを追
加免疫した。最終免疫として50日目に抗原65μｇを静脈
内投与し、その３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製し
た。
（ｃ）細胞融合 以下の材料および方法を用いる。
RPMI 1640培地:RPMI 1640（Difco Lab.製）に重炭酸
ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、
Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウム（50U/m
l）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）および硫酸
アミカシン（100μg/ml）を加え、ドライアイスでpHを
7.2にし、0.2μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌過
する。
ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、
Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウム（50U/m
l）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）および硫酸
アミカシン（100μg/ml）を加え、ドライアイスでpHを
7.2にし、0.2μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌過
する。
NS−１培地：上記RPMI 1640培地に除菌過した仔牛
胎児血清（M.A.Bioproducts製）を15％（v/v）の濃度に
加える。
胎児血清（M.A.Bioproducts製）を15％（v/v）の濃度に
加える。
PEG 4,000溶液:RPMI 1640培地のポリエチレングリコ
ール4,000（PEG 4,000、Merck ＆ Co.,Inc.製）50％（w
/w）無血清溶液を調製する。
ール4,000（PEG 4,000、Merck ＆ Co.,Inc.製）50％（w
/w）無血清溶液を調製する。
８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS−１（P3−NS
1−１）との融合は、Selected Methodin Cellular Immu
nology（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freem
an and Campany（1980）、351−372に記載のOiらの方法
を若干改変して行った。
1−１）との融合は、Selected Methodin Cellular Immu
nology（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freem
an and Campany（1980）、351−372に記載のOiらの方法
を若干改変して行った。
前記（ｂ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率100
％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）とを5:1の割合
で融合する。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記の
RPMI 1640培地で洗浄し、次に同じ培地にけん濁し、融
合させるため上記の割合で混合する。容量50mlの円錐形
スチロール樹脂製試験管（岩城ガラス製）を用い、40ml
のRPMI 1640培地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全
に吸引除去する。沈澱細胞に37℃加温PEG4,000溶液1.3m
lを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、更に１分間
撹拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に37℃加温RPMI
1640培地1.3mlを１分間で滴下する。この操作をさらに
１回繰り返した後、同培地9mlを２〜３分間撹拌しなが
ら滴下し細胞を分散させる。これを400×ｇ、10分間遠
心分離し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈澱細
胞に37℃加温NS−１培地12.9mlをすみやかに加え、細胞
の大きい塊りを10mlのピペツトを用いて注意深くピペツ
テイングして分散させる。更に同培地26mlを加え、ポリ
スチレン製96穴マイクロウエル（岩城ガラス製）にウエ
ル当り6.0×105個/0.1mlの細胞を加える。なお、この時
使用する96穴マイクロウエルは、前処理とし0.2mlのNS
−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（37℃）で一晩保温
し、使用時に培地を吸引除去しておいたものを使用す
る。細胞を加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸ガス
/93％空気中（37℃）湿度100％下で培養する。
％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）とを5:1の割合
で融合する。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記の
RPMI 1640培地で洗浄し、次に同じ培地にけん濁し、融
合させるため上記の割合で混合する。容量50mlの円錐形
スチロール樹脂製試験管（岩城ガラス製）を用い、40ml
のRPMI 1640培地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全
に吸引除去する。沈澱細胞に37℃加温PEG4,000溶液1.3m
lを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、更に１分間
撹拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に37℃加温RPMI
1640培地1.3mlを１分間で滴下する。この操作をさらに
１回繰り返した後、同培地9mlを２〜３分間撹拌しなが
ら滴下し細胞を分散させる。これを400×ｇ、10分間遠
心分離し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈澱細
胞に37℃加温NS−１培地12.9mlをすみやかに加え、細胞
の大きい塊りを10mlのピペツトを用いて注意深くピペツ
テイングして分散させる。更に同培地26mlを加え、ポリ
スチレン製96穴マイクロウエル（岩城ガラス製）にウエ
ル当り6.0×105個/0.1mlの細胞を加える。なお、この時
使用する96穴マイクロウエルは、前処理とし0.2mlのNS
−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（37℃）で一晩保温
し、使用時に培地を吸引除去しておいたものを使用す
る。細胞を加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸ガス
/93％空気中（37℃）湿度100％下で培養する。
（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 使用する培地は以下のとおりである。
HAT培地：前記（ｃ）で述べたNS−１培地にさらにヒポ
キサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μＭ）お
よびチミジン（16μＭ）を加える。
キサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μＭ）お
よびチミジン（16μＭ）を加える。
HT培地：アミノプテリンを除去した以外は上記HAT培地
と同一組成のものである。
と同一組成のものである。
前記（ｃ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパス
ツールピペツトでHAT培地２滴（約0.1ml）を加える。
２、３、５、８、11日目に培地の半分（0.1ml）を新し
いHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を新しいHT
培地で置き換える。以降３日毎に培地の半分を新しいHT
培地で置き換える。通常２〜３週間で充分なハイブリド
ーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生育全ウエル
について次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（EL
ISA）により陽性ウエルをチエツクする。次にフイーダ
ーとして107個のマウス胸腺細胞を含むHT培地1mlをポリ
スチレン製24穴ウエル（岩城ガラス製）に加えたもの
に、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内容物
を移す。これを前記（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガ
ス存在下、37℃で約１週間培養する。その間、１〜２回
各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5mlと交換する。
ハイブリドーマの充分生育した時点でELISA法により陽
性を再確認し、それぞれについで次項（ｆ）記載の限界
希釈によるクローニングを行う。なお、クローニングに
使用後の残液をポリスチレン製25cm2組織培養フラスコ
（岩城ガラス製）に移し、凍結保存用試料を調製する。
ツールピペツトでHAT培地２滴（約0.1ml）を加える。
２、３、５、８、11日目に培地の半分（0.1ml）を新し
いHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を新しいHT
培地で置き換える。以降３日毎に培地の半分を新しいHT
培地で置き換える。通常２〜３週間で充分なハイブリド
ーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生育全ウエル
について次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（EL
ISA）により陽性ウエルをチエツクする。次にフイーダ
ーとして107個のマウス胸腺細胞を含むHT培地1mlをポリ
スチレン製24穴ウエル（岩城ガラス製）に加えたもの
に、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内容物
を移す。これを前記（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガ
ス存在下、37℃で約１週間培養する。その間、１〜２回
各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5mlと交換する。
ハイブリドーマの充分生育した時点でELISA法により陽
性を再確認し、それぞれについで次項（ｆ）記載の限界
希釈によるクローニングを行う。なお、クローニングに
使用後の残液をポリスチレン製25cm2組織培養フラスコ
（岩城ガラス製）に移し、凍結保存用試料を調製する。
（ｅ）固相−抗体結合テスト（ELISA）による抗ヒトラ
ミニン抗体産生ハイブリドーマの検索 Anal.Biochem.,104,205−214（1980）に記載のRennar
dらの方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、
ハイブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタ
イトレーシヨンプレート（Flow Lab.Inc.製）を0.5μｇ
ヒトラミニンでコートし、次に、未コート部分を１％牛
血清アルブミン（BSA）でブロツクする。これに前記
（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一
部を加えて室温で約１時間インキユベーシヨンする。２
次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスイムノグロブリン（Cappel Lab.製）を加え、更
に室温で約１時間インキユベーシヨンする。次に、基質
である過酸化水素とｏ−フエニレンジアミンとを加え、
生成した褐色の程度をマイクロプレートリーダー（東洋
ソーダ、MPR−A4型）を用いて492nmの吸光度を測定す
る。
ミニン抗体産生ハイブリドーマの検索 Anal.Biochem.,104,205−214（1980）に記載のRennar
dらの方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、
ハイブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタ
イトレーシヨンプレート（Flow Lab.Inc.製）を0.5μｇ
ヒトラミニンでコートし、次に、未コート部分を１％牛
血清アルブミン（BSA）でブロツクする。これに前記
（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一
部を加えて室温で約１時間インキユベーシヨンする。２
次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスイムノグロブリン（Cappel Lab.製）を加え、更
に室温で約１時間インキユベーシヨンする。次に、基質
である過酸化水素とｏ−フエニレンジアミンとを加え、
生成した褐色の程度をマイクロプレートリーダー（東洋
ソーダ、MPR−A4型）を用いて492nmの吸光度を測定す
る。
（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。NS−１培地ml当り、フイー
ダーとして107個のマウス胸腺細胞を含むクローニング
培地を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエ
ルおよび24ウエルにそれぞれ、ウエル当り５個、１個お
よび0.5個のハイブリドーマを加える。５日目、12日目
に全ウエルに約1mlのNS−１培地を追加する。クローニ
ング開始後、14〜15日で充分なハイブリドーマの生育が
認められ、コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群
についてELISAを行う。テストした全ウエルが陽性でな
い場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエ
ル中に１コロニーが確認されたウエルを４〜６個選び再
クローニングする。最終的にヒトラミニンに対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ16株が得られた。
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。NS−１培地ml当り、フイー
ダーとして107個のマウス胸腺細胞を含むクローニング
培地を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエ
ルおよび24ウエルにそれぞれ、ウエル当り５個、１個お
よび0.5個のハイブリドーマを加える。５日目、12日目
に全ウエルに約1mlのNS−１培地を追加する。クローニ
ング開始後、14〜15日で充分なハイブリドーマの生育が
認められ、コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群
についてELISAを行う。テストした全ウエルが陽性でな
い場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエ
ル中に１コロニーが確認されたウエルを４〜６個選び再
クローニングする。最終的にヒトラミニンに対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ16株が得られた。
（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、
モノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをNS
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白質濃度は10〜100μg/mlである）。一方、大量
に抗体を得るためには、脾細胞とミエローマ細胞の由来
動物と同系の動物（Balb/cマウス）に腫瘍形成促進剤プ
リスタン（２、６、10、14−テトラメチルペンタデカ
ン、Aldrich Chem.製）をマウス一匹当り、0.5ml腹腔内
投与し、１〜３週間後、各ハイブリドーマ１×107個を
同じく腹腔内投与することにより生体内で、更に１〜２
週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜7mg/mlの
腹水を得ることができる。
モノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをNS
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白質濃度は10〜100μg/mlである）。一方、大量
に抗体を得るためには、脾細胞とミエローマ細胞の由来
動物と同系の動物（Balb/cマウス）に腫瘍形成促進剤プ
リスタン（２、６、10、14−テトラメチルペンタデカ
ン、Aldrich Chem.製）をマウス一匹当り、0.5ml腹腔内
投与し、１〜３週間後、各ハイブリドーマ１×107個を
同じく腹腔内投与することにより生体内で、更に１〜２
週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜7mg/mlの
腹水を得ることができる。
（ｈ）モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖およびアイソタ
イプ 前記（ｇ）で得られたそれぞれの腹水を、まず、ヒト
ラミニンをコートしたミクロタイトレーシヨンプレート
に前述したELISA法に従って結合させる。0.9％塩化ナト
リウム含有20mMリン酸緩衝液（pH7.1）（PBS）による洗
浄後、次にアイソタイプ特異性ウサギ抗マウスIgG抗体
（Zymed Labo.製）を加える。PBSによる洗浄後、西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）
抗体を加え、2,2′−アジノージ（３−エチルベンゾチ
アゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて陽性ウエ
ルを検出し、その結果を第１表に示した。得られたヒト
ラミニンに対するモノクローナル抗体のうち、15個が免
疫グロブリン鎖γ1/κを、１個がγ2a/κを有してい
た。
イプ 前記（ｇ）で得られたそれぞれの腹水を、まず、ヒト
ラミニンをコートしたミクロタイトレーシヨンプレート
に前述したELISA法に従って結合させる。0.9％塩化ナト
リウム含有20mMリン酸緩衝液（pH7.1）（PBS）による洗
浄後、次にアイソタイプ特異性ウサギ抗マウスIgG抗体
（Zymed Labo.製）を加える。PBSによる洗浄後、西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）
抗体を加え、2,2′−アジノージ（３−エチルベンゾチ
アゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて陽性ウエ
ルを検出し、その結果を第１表に示した。得られたヒト
ラミニンに対するモノクローナル抗体のうち、15個が免
疫グロブリン鎖γ1/κを、１個がγ2a/κを有してい
た。
（ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（40％飽和）
後、0.06M塩化ナトリウムを含む40mMリン酸緩衝液（pH
8.0）で平衡化したDEAE−Sephacel（Pharmacia製）の非
吸着画分を分取し、このIgG画分を更に0.42M塩化ナトリ
ウムを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したSep
hacyl S−300 Superfine（Pharmacia製）カラムでゲル
過し、培地中の仔牛胎児血清およびマウス由来のたん
白質を分離、除去した。
後、0.06M塩化ナトリウムを含む40mMリン酸緩衝液（pH
8.0）で平衡化したDEAE−Sephacel（Pharmacia製）の非
吸着画分を分取し、このIgG画分を更に0.42M塩化ナトリ
ウムを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したSep
hacyl S−300 Superfine（Pharmacia製）カラムでゲル
過し、培地中の仔牛胎児血清およびマウス由来のたん
白質を分離、除去した。
実施例 ２ イムノブロツテイング 実施例１（ａ）で精製したヒトラミニンをSDS−PAGE
に供した後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン（Cappel Lab.製）を用いて、細胞工学１＆
２、1061−1068（1983）に記載の田部の方法に従ってウ
エスタンブトツテイングを行い、免疫染色を行った（第
１図）。図中レーン１〜16は、それぞれクローンHL2D1
2、HL4H3、HL5A10、22−1E1、22−2A1、22−3B10、22−
5C9、22−6B4、22−7C5、22−8E9、22−9G7、22−10H
1、22−24D5、22−25B7、22−26E10および22−27E7から
の抗体で免疫染色した結果であるが、レーン１のクロー
ンHL2D12およびレーン３のクローンHL5A10からの抗体で
は、バンドが検出されなかった。クローン22−27E7（レ
ーン16）からの抗体では、分子量200KDより高分子側に
１本のバンドが検出され、その他のクローンの抗体で
は、分子量200KDの位置に１本のバンドが検出された。
に供した後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン（Cappel Lab.製）を用いて、細胞工学１＆
２、1061−1068（1983）に記載の田部の方法に従ってウ
エスタンブトツテイングを行い、免疫染色を行った（第
１図）。図中レーン１〜16は、それぞれクローンHL2D1
2、HL4H3、HL5A10、22−1E1、22−2A1、22−3B10、22−
5C9、22−6B4、22−7C5、22−8E9、22−9G7、22−10H
1、22−24D5、22−25B7、22−26E10および22−27E7から
の抗体で免疫染色した結果であるが、レーン１のクロー
ンHL2D12およびレーン３のクローンHL5A10からの抗体で
は、バンドが検出されなかった。クローン22−27E7（レ
ーン16）からの抗体では、分子量200KDより高分子側に
１本のバンドが検出され、その他のクローンの抗体で
は、分子量200KDの位置に１本のバンドが検出された。
実施例 ３ 標識抗体の調製法 （ａ）IgG−POD複合体の調製法 １） SH基標識IgGの調製 J.Immunoassay 4,209〜327,1983に記載のIshikawaら
の方法に従って、マウス抗ヒトラミニンIgG−POD複合体
を調製した。前記実施例１（ｉ）項で得られたマウス抗
ヒトラミニンIgGを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）に透析
し、その溶液に含有するIgGに対して100倍モルのＳ−ア
セチルメルカプト無水コハク酸をジメチルホルムアミド
として加え、30℃、30分間インキユベーシヨンした。次
に、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）100μ、0.1M E
DTA溶液（pH6.0）10μ、1Mヒドロキシルアミン溶液
（pH7.0）100μを加え、30℃、５分間静置後、5mM ED
TA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したSephade
x G−25でゲル過した。この操作によりSH基標識マウ
ス抗ヒトラミニンIgGが得られる。
の方法に従って、マウス抗ヒトラミニンIgG−POD複合体
を調製した。前記実施例１（ｉ）項で得られたマウス抗
ヒトラミニンIgGを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）に透析
し、その溶液に含有するIgGに対して100倍モルのＳ−ア
セチルメルカプト無水コハク酸をジメチルホルムアミド
として加え、30℃、30分間インキユベーシヨンした。次
に、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）100μ、0.1M E
DTA溶液（pH6.0）10μ、1Mヒドロキシルアミン溶液
（pH7.0）100μを加え、30℃、５分間静置後、5mM ED
TA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したSephade
x G−25でゲル過した。この操作によりSH基標識マウ
ス抗ヒトラミニンIgGが得られる。
２） マレイミド標識ペルオキシダーゼ（POD）の調
製 PODを10mg/mlの濃度になるように0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.0）に溶解し、そのPOD量に対して25倍モル量のＮ
−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド
（EMCS）をジメチルホルムアミド溶液として加え、30
℃、30分間反応させた。この反応液を0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）で平衡化したSephadex G−25カラムでゲル
過し、マレイミド標識POD画分を分取した。
製 PODを10mg/mlの濃度になるように0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.0）に溶解し、そのPOD量に対して25倍モル量のＮ
−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド
（EMCS）をジメチルホルムアミド溶液として加え、30
℃、30分間反応させた。この反応液を0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）で平衡化したSephadex G−25カラムでゲル
過し、マレイミド標識POD画分を分取した。
３） IgG−POD複合体の調製 上記１）で調製したSH基標識IgG1モルに上記２）で得
られたマレイミド標識POD約５モルを加え、４℃、20時
間静置する。この混合液を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）
で平衡化したUltrogel AcA 34カラムでゲル過し、マ
ウス抗ヒトラミニンIgG−POD複合体画分を分取した。更
に、BSAおよびチメロサールをそれぞれ0.1％および0.00
5％になるように添加し、４℃で保存した。
られたマレイミド標識POD約５モルを加え、４℃、20時
間静置する。この混合液を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）
で平衡化したUltrogel AcA 34カラムでゲル過し、マ
ウス抗ヒトラミニンIgG−POD複合体画分を分取した。更
に、BSAおよびチメロサールをそれぞれ0.1％および0.00
5％になるように添加し、４℃で保存した。
（ｂ）Fab′−POD複合体の調製 １） Fab′の調製 実施例１（ｉ）項で得られたマウス抗ヒトラミニンIg
Gを0.1M塩化ナトリウム含有0.1M酢酸緩衝液、pH4.5で透
析し、そのIgG量に対し１％（w/w）ペプシンを加え、37
℃、８時間消化した。更に、その消化液に2Mトリス溶液
を加えてpHを7.0に調整することにより、消化反応を停
止させ、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したUltro
gel AcA 44カラムでゲル過することによりＦ（ab′）
２画分を分取した。次に、Ｆ（ab′）２画分をエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.
0）で透析し、それに終濃度10μＭとなるようにアミノ
エタンチオール（MEA）を加え、37℃、1.5時間還元し
た。その後、5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）
で平衡化したUltrogel AcA 44カラムでゲル過し、Fa
b′画分を分取した。
Gを0.1M塩化ナトリウム含有0.1M酢酸緩衝液、pH4.5で透
析し、そのIgG量に対し１％（w/w）ペプシンを加え、37
℃、８時間消化した。更に、その消化液に2Mトリス溶液
を加えてpHを7.0に調整することにより、消化反応を停
止させ、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したUltro
gel AcA 44カラムでゲル過することによりＦ（ab′）
２画分を分取した。次に、Ｆ（ab′）２画分をエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.
0）で透析し、それに終濃度10μＭとなるようにアミノ
エタンチオール（MEA）を加え、37℃、1.5時間還元し
た。その後、5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）
で平衡化したUltrogel AcA 44カラムでゲル過し、Fa
b′画分を分取した。
２） Fab′−POD複合体の調整 上記１）で調製したFab′に対して前記（ａ）−２）
項記載の方法に従って調製したマレイミド標識PODを等
モル加え、更にFab′およびマレイミド標識PODの終濃度
が100μＭとなるように5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）で希釈した。この混合液を４℃、20時間静置
後、Fab′に対して10倍モル量のＮ−エチルマレイミド
で未反応チオール基をブロツクした。これを0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.5）で平衡化したUltrogel AcA 44カラムで
ゲル過し、Fab′−POD複合体画分を分取後、BSAおよ
びチメロサールを各0.1％および0.005％になるように添
加し、４℃で保存した。
項記載の方法に従って調製したマレイミド標識PODを等
モル加え、更にFab′およびマレイミド標識PODの終濃度
が100μＭとなるように5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）で希釈した。この混合液を４℃、20時間静置
後、Fab′に対して10倍モル量のＮ−エチルマレイミド
で未反応チオール基をブロツクした。これを0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.5）で平衡化したUltrogel AcA 44カラムで
ゲル過し、Fab′−POD複合体画分を分取後、BSAおよ
びチメロサールを各0.1％および0.005％になるように添
加し、４℃で保存した。
実施例 ４ モノクローナル抗体のグループ分け （ａ）抗原結合マイクロプレートの調製法 実施例１（ａ）項で得られたヒトラミニンを0.1％ア
ジ化ナトリウム含有リン酸緩衝液、pH7.5に溶解し、そ
れを500ng/mlの濃度に調整した後、この抗原溶液を96穴
マイクロウエルプレート（Nunc製）にウエル当り100μ
ずつ加え２時間静置した。次に、抗原溶液を除去し、
生理食塩水で２回洗浄した後、0.1％BSA、0.1％塩化ナ
トリウム含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を300μウエ
ルに加え、４℃で保存した。
ジ化ナトリウム含有リン酸緩衝液、pH7.5に溶解し、そ
れを500ng/mlの濃度に調整した後、この抗原溶液を96穴
マイクロウエルプレート（Nunc製）にウエル当り100μ
ずつ加え２時間静置した。次に、抗原溶液を除去し、
生理食塩水で２回洗浄した後、0.1％BSA、0.1％塩化ナ
トリウム含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を300μウエ
ルに加え、４℃で保存した。
（ｂ）競合反応によるモノクローナル抗体のグループ分
け 実施例１（ｉ）項で得られた16種類のモノクローナル
抗体（IgG）を１％BSA、0.1％塩化ナトリウムおよび10m
M EDTA含有30mMリン酸緩衝液（pH7.0）（以下緩衝液Ａ
と略記する）に溶解し、各モノクローナル抗体溶液をそ
れぞれ25、５、１、0.2、0.04μg/mlの濃度に希釈し
た。次に、実施例３（ａ）項で調製したIgG−PODを緩衝
液Ａに溶解し、これを400ng/mlの濃度に調整後、先の５
種類の濃度に希釈したモノクローナル抗体溶液と等量に
混合した。次に、この混合溶液を上記（ａ）項で調製し
た抗原結合マイクロウエルに100μずつ分注し、１時
間室温に静置した。反応終了後、混合液を除去した後、
生理食塩水で２回洗浄した。次に、0.02％過酸化水素含
有0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液（pH4.5）に溶解した1mg
/ml o−フエニレンジアミンをウエルあたり100μ加
え、室温で15分間静置した後、2N硫酸100μを添加し
て反応を停止した。その反応混液のA492をマイクロプレ
ートリーダーを用いて測定した。
け 実施例１（ｉ）項で得られた16種類のモノクローナル
抗体（IgG）を１％BSA、0.1％塩化ナトリウムおよび10m
M EDTA含有30mMリン酸緩衝液（pH7.0）（以下緩衝液Ａ
と略記する）に溶解し、各モノクローナル抗体溶液をそ
れぞれ25、５、１、0.2、0.04μg/mlの濃度に希釈し
た。次に、実施例３（ａ）項で調製したIgG−PODを緩衝
液Ａに溶解し、これを400ng/mlの濃度に調整後、先の５
種類の濃度に希釈したモノクローナル抗体溶液と等量に
混合した。次に、この混合溶液を上記（ａ）項で調製し
た抗原結合マイクロウエルに100μずつ分注し、１時
間室温に静置した。反応終了後、混合液を除去した後、
生理食塩水で２回洗浄した。次に、0.02％過酸化水素含
有0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液（pH4.5）に溶解した1mg
/ml o−フエニレンジアミンをウエルあたり100μ加
え、室温で15分間静置した後、2N硫酸100μを添加し
て反応を停止した。その反応混液のA492をマイクロプレ
ートリーダーを用いて測定した。
IgG−POD複合体に用いられているモノクローナル抗体
と同じ抗原認識部位と競合するモノクローナル抗体に関
しては、その濃度が高くなるに従って、A492値が低下
し、また、複合体に用いられているモノクローナル抗体
と異なる抗原認識部位を認識する抗体においてはA492値
が低下しないことに基づき、実施例１で得られた16種類
のモノクローナル抗体を、第２表で示すように分類し
た。
と同じ抗原認識部位と競合するモノクローナル抗体に関
しては、その濃度が高くなるに従って、A492値が低下
し、また、複合体に用いられているモノクローナル抗体
と異なる抗原認識部位を認識する抗体においてはA492値
が低下しないことに基づき、実施例１で得られた16種類
のモノクローナル抗体を、第２表で示すように分類し
た。
実施例 ５ サンドイツチEIA法 （ａ）モノクローナル抗体結合マイクロプレートの調製
法 J.Immunoassay ４,209−327（1983）に記載のIshikaw
aらの方法に従って実施例１（ｉ）項で得られたモノク
ローナル抗体を0.1％アジ化ナトリウム含有0.1Mリン酸
緩衝液（pH7.5）に溶解し、100μg/ml（A280＝1.5）の
濃度に調整した。そのモノクローナル抗体溶液を96穴マ
イクロプレートにウエル当り100μずつ加え、４℃に2
4時間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を除去
し、生理食塩水で２回洗浄後、0.1％BSA、0.1％塩化ナ
トリウム含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浸漬し、４
℃で保存した。
法 J.Immunoassay ４,209−327（1983）に記載のIshikaw
aらの方法に従って実施例１（ｉ）項で得られたモノク
ローナル抗体を0.1％アジ化ナトリウム含有0.1Mリン酸
緩衝液（pH7.5）に溶解し、100μg/ml（A280＝1.5）の
濃度に調整した。そのモノクローナル抗体溶液を96穴マ
イクロプレートにウエル当り100μずつ加え、４℃に2
4時間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を除去
し、生理食塩水で２回洗浄後、0.1％BSA、0.1％塩化ナ
トリウム含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浸漬し、４
℃で保存した。
（ｂ）１ステツプサンドイツチEIA法 緩衝液Ａで希釈した精製ヒトラミニン溶液あるいはヒ
トラミニンを含む検体を96穴ビニルプレート（Falcon
製）にウエル当り200μずつ加えた。次に実施例３
（ａ）および同（ｂ）項で調製したIgG−PODおよびFa
b′−POD複合体１μg/mlとなるように緩衝液Ａで希釈
し、上記ビニルプレートにウエル当り100μずつ加え
混合した。この混合溶液を前記（ａ）項で調製した抗体
結合プレートに100μ加え、室温で１時間反応させ、
生理食塩水で２回洗浄した。次に、0.02％過酸化水素水
含有0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液（pH4.5）に溶解した
0.5mg/ml o−フエニレンジアミンをウエル当り100μ
加え、室温で15分間静置後、2N硫酸100μを添加し、
反応を停止させた。この反応混液のA492をマイクロプレ
ートリーダーを用いて測定し、標準直線より検体中のラ
ミニン量を求めた（第３表参照）。
トラミニンを含む検体を96穴ビニルプレート（Falcon
製）にウエル当り200μずつ加えた。次に実施例３
（ａ）および同（ｂ）項で調製したIgG−PODおよびFa
b′−POD複合体１μg/mlとなるように緩衝液Ａで希釈
し、上記ビニルプレートにウエル当り100μずつ加え
混合した。この混合溶液を前記（ａ）項で調製した抗体
結合プレートに100μ加え、室温で１時間反応させ、
生理食塩水で２回洗浄した。次に、0.02％過酸化水素水
含有0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液（pH4.5）に溶解した
0.5mg/ml o−フエニレンジアミンをウエル当り100μ
加え、室温で15分間静置後、2N硫酸100μを添加し、
反応を停止させた。この反応混液のA492をマイクロプレ
ートリーダーを用いて測定し、標準直線より検体中のラ
ミニン量を求めた（第３表参照）。
（ｃ）サンドイツチEIA最適モノクローナル抗体の選択 ヒトラミニンを定量することが可能な最適モノクロー
ナル抗体の組合せを探す目的で、実施例１（ｉ）項記載
の方法で精製したクローンHL4H3、22−3B10、22−7C5、
22−26E10および22−27E7からの各モノクローナル抗体
から、実施例３（ａ）項記載の方法でIgG−POD複合体を
調製した。一方、上記と同一クローンのモノクローナル
抗体を固相とし、1.3μg/mlの精製ヒトラミニンを抗原
にして、上記５（ｂ）項記載のサンドイツチEIA法によ
りラミニンを定量した。その結果を第４表に示す。
ナル抗体の組合せを探す目的で、実施例１（ｉ）項記載
の方法で精製したクローンHL4H3、22−3B10、22−7C5、
22−26E10および22−27E7からの各モノクローナル抗体
から、実施例３（ａ）項記載の方法でIgG−POD複合体を
調製した。一方、上記と同一クローンのモノクローナル
抗体を固相とし、1.3μg/mlの精製ヒトラミニンを抗原
にして、上記５（ｂ）項記載のサンドイツチEIA法によ
りラミニンを定量した。その結果を第４表に示す。
クローン22−27E7からのモノクローナル抗体を固相お
よびペルオキシダーゼ標識複合体に用いた場合、A492値
が低かった。しかし、クローン22−27E7からの抗体を除
く他の４種類のクローンからの抗体、すなわち16通りの
組合せにおいてA492値は高く、それぞれの組合せについ
てヒトラミニンの添加量を変化させ、サンドイツチEIA
法によりラミニンを定量した。クローン22−3B10からの
抗体を固相に、クローンHL4H3からの抗体を複合体（IgG
−POD）とした場合に得られた標準直線を第２図に示し
た。第２図で明らかなようにヒトラミニン0.01〜22ngの
範囲で直線性が認められ、その定量感度はウエル当り約
10pg（0.5amol）であった。実施例３（ｂ）項記載の方
法で調製したFab′−POD複合体を用いた場合においても
同様の結果が得られた。なお、上記クローン22−3B10お
よびクローンHL4H3からの抗体以外の14通りの組合せに
ついても直線性が認められ、そのいずれの組合せについ
てもサンドイツチEIA法によるラミニンの定量が可能で
あることが判明した。
よびペルオキシダーゼ標識複合体に用いた場合、A492値
が低かった。しかし、クローン22−27E7からの抗体を除
く他の４種類のクローンからの抗体、すなわち16通りの
組合せにおいてA492値は高く、それぞれの組合せについ
てヒトラミニンの添加量を変化させ、サンドイツチEIA
法によりラミニンを定量した。クローン22−3B10からの
抗体を固相に、クローンHL4H3からの抗体を複合体（IgG
−POD）とした場合に得られた標準直線を第２図に示し
た。第２図で明らかなようにヒトラミニン0.01〜22ngの
範囲で直線性が認められ、その定量感度はウエル当り約
10pg（0.5amol）であった。実施例３（ｂ）項記載の方
法で調製したFab′−POD複合体を用いた場合においても
同様の結果が得られた。なお、上記クローン22−3B10お
よびクローンHL4H3からの抗体以外の14通りの組合せに
ついても直線性が認められ、そのいずれの組合せについ
てもサンドイツチEIA法によるラミニンの定量が可能で
あることが判明した。
次に、ヒト血清中ラミニンを定量し、かつ健常者と肝
疾患患者との差を示すモノクローナル抗体の組合せを探
す目的で、クローン22−27E7を除くクローンHL4H3、22
−26E10、22−7C5および22−3B10からのモノクローナル
抗体を固相およびIgG−POD複合体として、健常者および
肝疾患患者血清中ラミニンを実施例５（ｂ）項記載のサ
ンドイツチEIA法により定量した（第５表）。
疾患患者との差を示すモノクローナル抗体の組合せを探
す目的で、クローン22−27E7を除くクローンHL4H3、22
−26E10、22−7C5および22−3B10からのモノクローナル
抗体を固相およびIgG−POD複合体として、健常者および
肝疾患患者血清中ラミニンを実施例５（ｂ）項記載のサ
ンドイツチEIA法により定量した（第５表）。
第５表で明らかなように16通りの組合せにより、固相
抗体としてクローン22−3B10からの抗体、ペルオキシダ
ーゼ標識複合体としてクローンHL4H3からの抗体（IgG−
POD）を用いた場合に最も良い結果が得られることが判
明した。なお、複合体にFab′−PODを用いた場合、また
固相抗体に第２表に示したクローン22−3B10と同じグル
ープのクローン22−5C9、22−6B4、22−8E9あるいは22
−10H1からの抗体を用いても同様の結果が得られた。
抗体としてクローン22−3B10からの抗体、ペルオキシダ
ーゼ標識複合体としてクローンHL4H3からの抗体（IgG−
POD）を用いた場合に最も良い結果が得られることが判
明した。なお、複合体にFab′−PODを用いた場合、また
固相抗体に第２表に示したクローン22−3B10と同じグル
ープのクローン22−5C9、22−6B4、22−8E9あるいは22
−10H1からの抗体を用いても同様の結果が得られた。
実施例 ６ 抗原の同定 サンドイツチEIA法によって認識されている抗原が実
施例１（ａ）項で胎盤より精製したヒトラミニンと同一
のものかを調べるために、健常者（Nor）血清2mlと肝硬
変患者（LC）血清0.5mlおよび精製ヒトラミニン２μｇ
を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で2mlに調整し、予め上記
緩衝液で平衡化したUltrogel AcA 34カラム（1.5×45c
m）でゲル過した。実施例５（ｂ）項記載のサンドイ
ツチEIA法を若干改変した方法で、これらの溶出画分のA
492を測定した。すなわち、各溶出画分60μをとり、
1.7μg/mlに希釈したIgG−POD複合体60μと混合し、
この混合液100μを抗体結合マイクロプレートに分注
した。また、固相抗体としてクローン22−3B10からのモ
ノクローナル抗体、IgG−POD複合体としてクローンHL4H
3からのモノクローナル抗体を用いた。サンドイツチEIA
法で得られたA492値を第３図に示した。LC患者血清 では、精製ヒトラミニン と同じ位置（約200KD）に１つのピークが認められた。
一方、Nor血清 では、分子量約200KD以外に約70KDにピークが認められ
た。
施例１（ａ）項で胎盤より精製したヒトラミニンと同一
のものかを調べるために、健常者（Nor）血清2mlと肝硬
変患者（LC）血清0.5mlおよび精製ヒトラミニン２μｇ
を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で2mlに調整し、予め上記
緩衝液で平衡化したUltrogel AcA 34カラム（1.5×45c
m）でゲル過した。実施例５（ｂ）項記載のサンドイ
ツチEIA法を若干改変した方法で、これらの溶出画分のA
492を測定した。すなわち、各溶出画分60μをとり、
1.7μg/mlに希釈したIgG−POD複合体60μと混合し、
この混合液100μを抗体結合マイクロプレートに分注
した。また、固相抗体としてクローン22−3B10からのモ
ノクローナル抗体、IgG−POD複合体としてクローンHL4H
3からのモノクローナル抗体を用いた。サンドイツチEIA
法で得られたA492値を第３図に示した。LC患者血清 では、精製ヒトラミニン と同じ位置（約200KD）に１つのピークが認められた。
一方、Nor血清 では、分子量約200KD以外に約70KDにピークが認められ
た。
実施例 ７ サンドイツチEIA法による健常者および肝疾患患者血清
中ラミニンの定量 クローン22−3B10からのモノクローナル抗体を固相抗
体およびクローンHL4H3からの抗体をIgG−POD複合体と
して、健常者血清29検体、原発性肝癌（HCC）患者血清2
5検体、慢性肝炎（CH）患者血清６検体、肝硬変（LC）
患者血清８検体および原発性胆汁性肝硬変（PBC）患者
血清13検体中のラミニンを実施例５（ｂ）項記載のサン
ドイツチEIA法により定量したその結果は、第４図に示
すとおりである。第４図に示されているように健常者血
清ラミニン濃度が平均102±16.9ng/mlに対し、HCC患者
血清では、平均305±136ng/ml、CH患者血清では、平均2
24±95.4ng/ml、LC患者血清では、平均236±68.4ng/ml
およびPBC患者血清では、平均244±97.7ng/mlであっ
た。いずれの肝疾患患者血清ラミニン値も健常者のそれ
と比較して有意な差（Ｐ＜0.001）が認められた。な
お、健常者の平均＋（標準偏差×２）（Ｍ＋2SD）をカ
ツトオフ値とした時、HCC、CH、LCおよびPBC各患者の陽
性率は、それぞれ100％、100％、88％および69％であっ
た。
中ラミニンの定量 クローン22−3B10からのモノクローナル抗体を固相抗
体およびクローンHL4H3からの抗体をIgG−POD複合体と
して、健常者血清29検体、原発性肝癌（HCC）患者血清2
5検体、慢性肝炎（CH）患者血清６検体、肝硬変（LC）
患者血清８検体および原発性胆汁性肝硬変（PBC）患者
血清13検体中のラミニンを実施例５（ｂ）項記載のサン
ドイツチEIA法により定量したその結果は、第４図に示
すとおりである。第４図に示されているように健常者血
清ラミニン濃度が平均102±16.9ng/mlに対し、HCC患者
血清では、平均305±136ng/ml、CH患者血清では、平均2
24±95.4ng/ml、LC患者血清では、平均236±68.4ng/ml
およびPBC患者血清では、平均244±97.7ng/mlであっ
た。いずれの肝疾患患者血清ラミニン値も健常者のそれ
と比較して有意な差（Ｐ＜0.001）が認められた。な
お、健常者の平均＋（標準偏差×２）（Ｍ＋2SD）をカ
ツトオフ値とした時、HCC、CH、LCおよびPBC各患者の陽
性率は、それぞれ100％、100％、88％および69％であっ
た。
第１図はヒトラミニンをSDS−PAGEに供した後、種々の
モノクローナル抗体を用いた時のウエスタンブロツテイ
ングパターンを示す図であり、第２図は、22−3B10固相
抗体、HL4H3 IgG−POD複合体の測定系でのヒトラミニン
の標準直線を示す図であり、第３図は、Nor、LC患者血
清および精製ヒトラミニンをゲル過し、その溶出画分
を22−3B10固相抗体、HL4H3 IgG−POD複合体の測定系で
ラミニンを定量した時のA492値を示した図である。第４
図は、22−3B10固相抗体、HL4H3 IgG−POD測定系での健
常者、HCC、CH、LCおよびPBC各患者血清中ラミニン濃度
を示す図である。図中縦棒はＭ±SDを、点線は、健常者
のＭ＋2SDを、（ ）内数値は、検体数を示す。
モノクローナル抗体を用いた時のウエスタンブロツテイ
ングパターンを示す図であり、第２図は、22−3B10固相
抗体、HL4H3 IgG−POD複合体の測定系でのヒトラミニン
の標準直線を示す図であり、第３図は、Nor、LC患者血
清および精製ヒトラミニンをゲル過し、その溶出画分
を22−3B10固相抗体、HL4H3 IgG−POD複合体の測定系で
ラミニンを定量した時のA492値を示した図である。第４
図は、22−3B10固相抗体、HL4H3 IgG−POD測定系での健
常者、HCC、CH、LCおよびPBC各患者血清中ラミニン濃度
を示す図である。図中縦棒はＭ±SDを、点線は、健常者
のＭ＋2SDを、（ ）内数値は、検体数を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 藤本 昇 富山県射水郡大門町二口2418番地 雇用 促進住宅二口宿舎１号棟５―５号 (72)発明者 京谷 美佐子 富山県高岡市姫野１丁目４番地10号 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市五十里東町190番地 (56)参考文献 特開 昭62−83665（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−98968（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃ ｈｅｍ．，Ｖｏｌ．34，Ｎｏ．４，Ｐ 483−489（1986) Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 103，Ｎｏ．６，Ｐｔ．１．Ｐ．2457− 2465（1986)
Claims (2)
- 【請求項１】分子量約200KDのヒトラミニンP1フラグメ
ントに対するモノクローナル抗体であって、分子量約20
0KDのラミニンP1フラグメントおよび分子量約70KDのラ
ミニンP1フラグメントと反応し、かつ分子量900KDのラ
ミニンと反応しない抗ヒトラミニンモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】分子量約200KDのヒトラミニンP1フラグメ
ントに対するモノクローナル抗体であって、分子量約20
0KDのラミニンP1フラグメントおよび分子量約70KDのラ
ミニンP1フラグメントと反応し、かつ分子量900KDのラ
ミニンと反応しない抗ヒトラミニンモノクローナル抗体
を用いることを特徴とし、それらを固相担体に結合させ
る抗体および酵素を付与する抗体として使用し、サンド
イッチ法により酵素免疫学的な測定を行うことによるヒ
ト血清中ラミニンP1フラグメントの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1159484A JP2968538B2 (ja) | 1989-06-23 | 1989-06-23 | ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1159484A JP2968538B2 (ja) | 1989-06-23 | 1989-06-23 | ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0327296A JPH0327296A (ja) | 1991-02-05 |
| JP2968538B2 true JP2968538B2 (ja) | 1999-10-25 |
Family
ID=15694779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1159484A Expired - Fee Related JP2968538B2 (ja) | 1989-06-23 | 1989-06-23 | ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2968538B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60029302T2 (de) * | 2000-04-28 | 2007-08-09 | Bayer Ag | Diagnose von Leberfibrose mit Hilfe von Serummarkeralgorithmen |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61213670A (ja) * | 1985-03-20 | 1986-09-22 | Teijin Ltd | ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−の測定方法 |
| JPH083490B2 (ja) * | 1985-10-09 | 1996-01-17 | 武田薬品工業株式会社 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
| JPH0198968A (ja) * | 1987-10-12 | 1989-04-17 | Tosoh Corp | ヒス・インスリンの測定方法 |
-
1989
- 1989-06-23 JP JP1159484A patent/JP2968538B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．６，Ｐｔ．１．Ｐ．２４５７−２４６５（１９８６） |
| Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４，Ｐ４８３−４８９（１９８６） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0327296A (ja) | 1991-02-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |