JPS6363971A - ヒトコラ−ゲンペプチドの酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、肝臓疾患な聞易に診断するのに有用なヒトｍ
、■および■型コ２−ゲンベプチドの定量法に関するも
のである。

さらて詳しくは、本発明はヒ１ｌｌＩ、■あるいは■型
コラーゲンペプチドに対するモノクローナル抗体および
ヒ）ＩＩＩ、Ｆ／６るいは■型コラーゲンペプチドに対
するポリクローナル抗体を用いたサンドイツチ法に基づ
く酵素免疫学的測定法によるヒトＩＩＩ、ＩＶおよびＶ
Ｉ型コラーケ゛ンベプチドの定量法であって、固相担体
に結合させる抗体および酵素標識を付与する抗体として
、それらの少なくとも一方に、ヒト■、■およヒトコラ
ーゲンペプチドに対するモノクローナル抗体を用いるこ
とを特徴とするヒトＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩ型コラーゲ
ンペプチドの定食法に関するものである。

従来、血中ヒ）ＩＩＩ型プロコラーゲンＮ末端にプチド
のポリクローナル抗体を用いての放射性免疫学的測定法
はすでに報告されている（Ｒｏｈｄｓら、Ｅａｒ　−Ｊ
　−Ｃ１１ｎ　−Ｉ　ｎｖｅ　ｓ　ｔ　−ｔ　９　＋　
４５１〜４５９＋　１９７９　）。

しかし、血中のＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩ型コラーゲンそ
のものの測定法は壕だ報告されていない。すなわち、コ
ラーゲン構造が動物種間であまり差がなく測定に使う抗
体が他の動物で極めてできてくいばかりか、血中での溶
解度が小さく、血中濃度を測定することは困難であるこ
とが主な原因である。

本発明者らは、簡便な方法でヒ）ＩＩＩ、■および■型
コラーゲンペヲチドを特異的に定量する方法を種々研究
した結果、それらヒ）ｌ、■あるいは■型コラーゲンペ
プチドに対するモノクで精度よく、迅速に測定する方法
を開発した。

すなわち、本発明は、固相担体に結合させる抗体、およ
び酵素標識を付与する抗体として、それらの一方又は両
方に、ヒ）ＩＩＩ、■あるいは■型コラーゲンペプチド
に対するモノクローナル抗体を用い、酵素免疫学的定量
法てよりヒトｍ１■および■型コラーゲンペプチドを定
量する方法を提供するものである。

本発明方法において、酵素標識を付与する抗体としては
、抗体含有物を硫安分画後、ＤＥＡＥ　−８ｅｐｈａｃ
ｅｌカラムにより精製したＩｇＧ画分が用いられる。ポ
リクローナル抗体の場合には各々ヒト徂、■あるいは■
型コラーゲンをカップルした５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４β
アフイニテイーカラムで精製したものを用いると特異性
が増大するので好ましい。本発明方法で使用するモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体としては、それら抗
体における特異的結合部分Ｆ（ａｂ’）２　、あるいは
Ｆａｂ’そのものを使用する態様も含まれるものである
。

以上の如く、本発明は、固相担体に結合させる抗体、お
よび酵素標識を付与する抗体として、それらの少なくと
も一方に、ヒトＩＩＩ、ＩＶあるいはＶＩ型コラーゲン
ペプチドに対するモノクローナル抗体を用いることを特
徴とする固相法酵素免疫学的測定法を提供するものであ
る。

添付の第２図、第３図および第４図にみられるように本
発明の方法で測定した肝疾患患者血清中のヒトＩＩＩ、
■および■型コラーゲンペプチド濃度の測定値は、健常
人血清中のそれよりも有意に高いことが認められ、本発
明の方法によれば、血中ヒ）ＩＩＩ、■および〜１型コ
ラーゲン６プチド濃度測定により、患者に負担のかかる
バイオプシーなすることなく、肝疾患、特に肝線維化な
予知することができる。従来の肝機能判定法として使用
されているＺＴＴ　（硫酸亜鉛混濁反応）、ＧＯＴ　（
グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ）、ＧＰＴ　
（グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ）、ＡＬＰ
　（アルカリ性フォスファターゼ）、ＬＤＨ（乳酸脱水
素酵素）およびγ−ＧＴＰ　（γ−グルタミルトランス
はブチダーゼ）などの測定では、肝組織の線維化を判定
することはできず、このことは本発明者らによって確認
されている。したがって、本発明者らが先に報告した血
中ヒトプロリン水酸化酵素濃度の測定（特開昭６０−２
０４７２６公報参照）と合わせて本発明方法により血中
のヒ）ＩＩＩ、■および■型コラーゲンペプチド濃度を
測定することにより、この種の疾患を早期発見すること
が期待され、本発明方法により、ヒトコラーゲンペプチ
ド濃度測定に基づく肝組織線維化の診断を行うことがで
きるので、本発明は著しい有用性を有する。以下、実施
例により本発明を具体的に説明する。ただし本発明はこ
れらに限定されるものではない。

実施例　１ 抗ヒトコラーゲンペプチドモノクローナル抗体の作製 （ａ）　　抗原−ヒトＩｌｌ、　ＩＶおよび■型コラー
ゲンの調製 ヒト胎盤を材料としてＡｒｔｅｒ７７．２６２〜２８０
（１９８０）に記載のＭａｙｎｅらの方法に従い０．５
Ｎ酢酸でホモゲナイズし、ペプシン消化（１１１９／ｄ
　）でコラーゲンを可溶化後、最終濃度２Ｍとなるよう
に塩化ナトリウムを加えコラーゲンを析出させた。これ
を０．５　Ｎ酢酸に溶解し０．７Ｍ塩化ナトリウム含有
０．５　Ｎ酢酸溶液で透析することにより■、■型コラ
ーゲンを析出させ、その上清を１．２Ｍ塩化ナトリウム
含有０．５Ｎ酢酸溶液で透析し、■、■型コラーゲンを
析出させた。

更にその上清を１．８Ｍ塩化す）ＩＪウム含有０．５　
Ｎ酢酸溶液に対して透析し〜１型コラーゲンを析出させ
た。次に上記で得たＩ、■型コラーゲン画分を０．５Ｍ
塩化ナトリウム含有５０　ｍＭ　）−１）スー塩酸緩衝
液、ｐＨ７，４に溶解させ、１．７Ｍ塩化ナトリウム含
有５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，４および２．
７Ｍ塩化ナトリウム含有トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，
４で順次透析することにより各々Ｉ型、および■型コラ
ーゲンを析出させ■型コラーゲンをＩ型コラーゲンから
分別した。■、■型コラーゲン画分についてはＩ、■型
コラーケ゛ン画分と同様に０．５　Ｍ塩化ナトリウム含
有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，４に溶解させ
、２．２Ｍ塩化ナトリウム含有５０ＩＩＩＭトリス−塩
酸緩衝液、ｐＨ７，４で■型コラーゲンを析出させ、■
型コラーゲンと分別した。得られたＩＩＩ、ＩＶおよび
ＶＩ型の純度をＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、　７２＋　１４７２〜１４８０　（１
９７６）記載の５ｙｈｅｓらの方法に従いドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ　）で調べたところ約９５％であった。

（１））　　抗体産生細胞の調製 ヒ）Ｉ、■および■型コラーゲン各に１００μ２を完全
フロインドアジュバントと共に８週令のＢＡＬＢ　／ｃ
雌マウス２匹に初回腹腔内投与した。

２回目以降は０．５　Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，４に溶解させた抗原各々１
００μ２を２〜４週間毎に、２〜４回ＢＡＬＢ／Ｃ雄マ
ウスに追加免疫した。最終免疫として膵臓摘出５日前に
静脈内投与し牌細胞を調製した。

（Ｃ）　　細胞融合 以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ａ　１６４０　
（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）に重炭酸
ナトリウム（１２ｍＭ　）、ピルビン酸ナトリウム（１
ｍＭ　）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカ
リウム（５０ｕ／ｄ）　、硫酸ストレプトマイシン（５
０μｔ／ｒｄ）、および硫酸アミカシン（１００μｔ７
ｍｔ）を加え、ドライアイスで−をＺ２にし、０．２μ
ｍ　Ｔｏｙｏメンブレンフィルターで除菌濾過する。

Ｎ５−１培地二上記ＲＰＭＩ　１６４０培地に除菌濾過
した仔牛脂児血清（Ｍ、　Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ　）を１５％（Ｖ／’Ｖ）の濃度に加える。

ＨＡＴ培地：上記のＮ５−１培地にさらにヒポキサンチ
ン（１００μＭ）、アミノプテリン（０，４μＭ）、お
よびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

ＰＥＧ　４，０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４，０００　（ＰＥ（）４，０
００　、　Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、。

Ｉｎｃ、）　５０％（ｗ７ｗ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細１Ｎｓ−１（Ｐ３−
ＮＳ１−１）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｓｔｈｏ
ｄ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（
ｅｄ、　Ｂ、Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｒ１ｄＳ＋Ｍ、
　Ｓｈｉｉｇｉ）、　Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎ
ｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、　３５．１〜６７２
に記載の０１らの方法を若干改変して行った。前記軸）
で調製した有核肺臓細胞（生細胞率９５％）とミエロー
マ細胞（生細胞率９５％）とを５〜６：１の割合で融合
する。

膵臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記のＲＰＭ１１６
４０培地で洗滌する。次に同じ培地にけん濁し、融合さ
せるため上記の割合で混合する。容量５０ゴの円錐形ス
チロール樹脂製試験管（工ｗａｋｉ　（）ｌａｓｓ　）
を用い、４０ゴのＲＰＭ工１６４０培地中４００Ｘｆ、
１０分間遠心し、上清を完全に吸出する。沈殿細胞に６
７℃加温ＰＥＧ４，０００溶液１−を穏やかに攪拌しな
がら１分間で滴下し、さらに１分間攪拌し細胞を再けん
濁、分散させる。次に３７℃加温ＲＰＭＩ　１６４０培
地１−を１分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返
した後、同培地７−を２〜３分間で常に攪拌しながら滴
下し細胞を分散させる。これを４００×？、１０分間遠
心分離し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細
胞に３７℃加温Ｎ５−１培地１０−をすみやかに加え、
細胞の大きい塊りを１０−のピはットを用いて注意深く
ピプッティングして分散する。さらに同培地２０−を加
えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロワエル（Ｉ
ｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ　）にウェル渦り５．９Ｘ１０５
個１０．１−の細胞をまき込む。なおこの時使用した９
６穴マイクロウエルの前処理として０．２−のＮ５−ｉ
培地を加え、炭酸ガス培養器中（６７℃）で−晩保温し
、使用時に培地を吸引除去する。

細胞融合完了したマイクロウェルな７％炭酸ガス／９６
チ空気中で温度６７℃、湿度１００％下にインキュベー
トする。

（ｄ）　　選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 培養１日目にバスツールビはットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１　ｍ／　）を加える。２．３．５．８．１１日目
に培地の半分（０，１ｍ）を新しいＨＡＴ培地で置き換
える。１４日目にＨＴ培地に切換え以降３〜４日毎に同
操作を繰り返す。通常２〜３週間で充分なハイブリドー
マの生育が観察される。

ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項（ｅ）記載の
固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウェ
ルなチェックする。次にフィーダーとして１０７個のマ
ウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１−をホリスチレン製２４
穴セルウェル（Ｉｗａｋｉ　Ｃ）ｌａｓｓ　）に加えた
ものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの
全内容物を移す。これを前記（Ｃ）におけると同様に７
％炭酸ガス存在下、３７℃で約１週間インキュベートす
る。その間１〜２回各ウェルの上清０．５　ｒｎｔを新
しいＨＴ培地０．５−と交換する。ハイブリドーマの充
分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性な再確認し、
それぞれについて次項（ｆ）記載の限界希釈法によるク
ローニングを行う。なお、クローニングに使用後の残液
をポリスチレン製２５ｃｙＲ２組織培養フラスコ（Ｉｗ
ａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）に移し、凍結保存用試料を調製す
る。

（ｅ）　　固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）による
抗ヒトコラーゲンペプチド抗体産生ノ・イブリドーマの
検索 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４．２０５〜２１
４　（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若
干改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ
抗体の検出に適している。９６穴ミクロタイトレージヨ
ンプレー）　（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ−）を０．５〜ｔＯμｔのヒト１、■あるいは
■型コラーゲンで各々コートし、さらにその他を１％牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。これにハイ
ブリドーマ生育ウェルの上清の一部を加えて室温で約１
時間インキュベートする。２次抗体として西洋わさびペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（Ｃ
ａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）を加えさらに室温で約１時間イ
ンキュベートする。次に過酸化水素と基質であるＯ−フ
二二レンジアミンを加え生成した褐色の程度を肉眼で女
性的に判定するか、あるいはコロナ２波長マイクロプレ
ート光度計（ＭＴＰ−２２，コロナ電気社）を用いて５
００　ｎｍの吸光度を測定する。

（ｆ）　　クローニング 各ウェル中には２種以上のハイブリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。Ｎ５−１培地−描すフィーダーとして１０７個のマ
ウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し９６穴マ
イクロウエルの５６ウエル、３６ウエルおよび２４ウエ
ルにウェル当り５個、１個および０．５個のハイブリド
ーマをカロえる。５日目、１２日目に各約０．１−のＮ
５−１培地を追加する。クローニング開始後１４〜１５
日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロニー
形成陰性ウェルが５０係以上である群についてＥＬＩＳ
Ａを行う。テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体
陽性ウェル中のコロニー数ヲ確認シ、ウェル中に１コロ
ニーのウェルな４〜６個選び再クローニングする。最終
的Ｋｍ、■および■コラーゲンに対して各々５．２２お
よび５株のクローンを得た。

（ｇ）モノクローナル抗体のインビトロ増殖およびイン
ビボ増殖 モノクローナル抗体は、得られたクローンをＭＳ−１培
地などの適当な培養液で培養（インビトロ増殖）し、そ
の培養上清から得ることができる（モノクローナル抗体
たん白濃度は１０〜１００μｆ／ａｔである）。一方、
大量に抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細胞の由
来動物と同系の動物（ＢＡＬＢ／Ｃ、マウス）に腫瘍形
成促進剤ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチ
ルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｓｍｉｃａ１社
）をマウス−匹当リ０．５７！腹腔内投与する。１〜５
週間後１ｃ　／％イブリドーマｌＸ１０７個を同じく腹
腔内投与することによりインビボで１〜２週間後にモノ
クローナル抗体たん白質濃度４〜７＊ｙ／ａｔの腹水を
得ることができる。

の Ｃｈ）モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖←÷←アインタ
イプ 得られた各々の腹水を先ずヒ）Ｉ［Ｉ、■または■型コ
ラーゲンを各々コートしたミクロタイトレージョンプレ
ートに前述したＥＬＩＳＡ法に従って結合させる。洗滌
後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙ
ｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加える。洗滌後
、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ　）抗体を加え、基質として２，２′−アジノ
ージ（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸−６）および過
酸化水素を用いて検出した。その結果をまとめて後掲の
第１表、第２表、および第６表に示した。得られたヒト
■型コラーゲンに対するモノクローナル抗体の内４個は
免疫グロブリン鎖γ１／にを、１個がγ２ａ／にを（第
１表参照）、ヒト■型コラーゲンに対する抗体の内１６
個がγ１／にを、２個が１２ｂ／′にを、１個がα／に
および６個がμ／にを有していた（第２表参照）。なお
、ヒト■型コラーゲンに対する抗体の内１個がγ１／に
、１個が１２ａ／におよび５個がγ２ｂ／にを有してい
た（第３表参照）。

（１）モノクローナル抗体の精製 前記（ロ）で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽和）
後、ＩｇＧクラスは食塩０．０６Ｍを含む４０ｍＭ９ン
酸緩衝液、ｐＨｓ、　０で平衡化したＤＥＡＥ　−３ｅ
ｐｈａｃｅｌ　（ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の非吸着画分
を分取し、このＩｇＧ画分を更に０．４２Ｍ食塩を含む
５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化したＳｅμ
５ｄｒｙｌＳ−３００５ｕｐｅｒｆｉｎｅ　（ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）カラムでゲル濾過し、培地中の仔牛脂児
血清およびマウス由来のたん白質を分離、除去した。Ｉ
ｇＡおよびＩｇＭクラスの精製についてはＤＥＡＥ−３
ｅｐｈａｃｅｌカラムクロマトグラフイーにおいて食塩
０．０６ＭからｔＯＭまでのグラディエンドでそれぞれ
両画弁を溶出した。その他はＩｇＧクラスの場合と同様
の条件で精製した。

実施例　２ 抗血清、ヒ）Ｉｌｌ、■および■型コラーゲンポリクロ
ーナル抗体の作製 実施例１（ａ）の場合と同様にヒト胎盤より精製したヒ
トＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩ型コラーゲン各々１１９を等
量の完全フロインドアジュバントと共に家兎の皮下に２
週間毎に４〜６回免疫した。最終的に得られた抗血清は
各凰コラーゲンをカップルさせたアフイニテイクロマト
グラフイーにより精製しくｅ）記載のＥＬＩＳＡ法によ
り精製型別コラーゲンを用いて抗体価および特異性を調
べたところ、それらポリクローナル抗体はそれぞれヒト
ＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩ型コラーゲンとのみ交叉した。

実施例　３ モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体併用によ
る血清ＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩ型コラーゲンペプチドの
定量 第２版酵素免疫測定法（石川栄治、河合忠、宮井潔編集
）医学書院（１９８２）、３０〜４９に記載のサンドイ
ッチ法を用いヒト血清中のＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩ型コ
ラーゲン量を測定した。

ホリスチレン製９６穴ミクロタイトレージョンプレート
（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）
を実施例１（１）で得られたヒトＩＩＩ、ＩＶあるいは
ＶＩ型コラーゲンに対する精製モノクローナル抗体でコ
ートし、さらにその他を１．０％ＢＳＡでブロックする
。一方、標準品として実施例１（ａ）で得られた精製ヒ
）ＩＩＩ、■あるいは■型コラーゲンおよび血清試料と
して健常人、生検による組織学的検索で診断の確定した
慢性活動性肝炎および肝硬変患者のもの各１０μｔを用
いた。これら試料溶液をモノクローナル抗体処理ミクロ
タイトレージョンプレートに添加し室温°で約１時間イ
ンキュベートする。

さらに実施例２で得られたウサギポリクローナル抗体、
および２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ　（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ　Ｌｔｄ、）を加え
、さらに室温で約１時間インキュベートする。次に過酸
化水素と基質であるＯ−フエニレンジアミンを加え生成
した赤褐色をコロナ２波長マイクロプレート光度計（Ｍ
ＴＰ−２２）で定量した。第１図にヒ）Ｉ［Ｉ、■およ
び■型コラーゲンの検量線を示したが、その定量感度は
いずれも約５ｎｒであった。またこのサンドイツチ法に
より血中コラーゲンペプチドが定量でき、ヒト肝疾患に
伴う血中コラーゲンペプチド濃度の増加が認められた（
第２図、３図および４図）。特て、■および■型コラー
ゲンはゾチドが慢性活動性肝炎、および肝硬変患者血中
で増大した。

なお、本発明では固相にモノクローナル抗体、複合体に
ポリクローナル抗体および２次抗体としてペルオキシダ
ーゼ標識抗ウサギＩｇＧを用いたサンドイツチ法によっ
たが、免疫実験操作法Ｘ、３４９７〜３５１９（１９８
２）に記載の古式らの酵素標識ヒ）Ｉｌｌ、■および■
型コラーゲンペプチドに対するマウスモノクローナル抗
体、あるいはウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ、およ
びＦａｂ’）を用いるサンドイッチイムノアッセイ法、
およびアイソトープ標識抗体（モノおよびポリクローン
）を用いるラジオイムノアッセイ法（特開昭６ｌ−Ｐ７
４７、Ｐ７７６）血中コラーケ゛ンベプチド定量に応用
できる。

実施例　４ モノクローナル抗体による血清■型コラーゲンペプチド
の定量 Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４　、２０９〜３２
７．１９８３に記載の石川らの方法に従い固相および複
合体共にモノクローナル抗体を用いて定量した。まず、
実施例１（１）で得られたヒ）ＩＩＩ型コラーゲンに対
する精製モノクローナル抗体ＩｇＧ　１　（クローン＆
１２）を０．１係アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸
緩衝液、ｐＨ７，５Ｋ溶解し、その濃度を０．１肩９／
−に調整する。この抗体溶液て固相担体としてのポリス
チレンボール（径６．５　ｙＩｌ！Ｉ％Ｐｒｅｃ１ｓ１
ツｎＰｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１１社）を浸漬し、ポリスチ
レンボールに抗体をコートする。次に抗体浸漬液を回収
しポリスチレンボールを０．１％ＢＳＡ、　０．１　Ｍ
塩化ナトリウムおよび０．１％アジ化ナトリウム含有１
０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液、ｐＨ７，０で洗滌し使用する。

一方、標準試料として実施例１（ａ）で得られた精製ヒ
）ＩＩＩ型コラーゲンおよび血清試料として健常人、生
検による組織学的検索で診断の確定した慢性活動性肝炎
および肝硬変患者のもの各１０μｔを用いた。これら試
料溶液をモノクローナル抗体処理ポリスチレンボールに
添加し３０℃１時間インキュベートする（第１反応）。

更に固相に用いたモノクローナル抗体とは異なるクロー
ンからのモノクローナル抗体ＩｇＧ又はＦａｂ’　（ク
ローンＡ３３）−’ルオキシダーゼ複合体を加え、５０
℃、１時間インキュベートする（第２反応）。次に過酸
化水素と基質である３　、　３’、　５　、５’−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ　）を加え３０℃で６０
分間反応させた後（第３反応）１．３３　Ｎ硫酸で反応
を停止させる。反応停止後、水を対照として島津マイク
ロフロー紫外可視分光光度計（ＵＶ−７３０）の波長４
５０　ｎｍで吸光度を測定し、盲検と試料の吸光度差を
求める。別に標準試料より作成した検量線より、検体１
ｏμｔの吸光度て相邑するｍ型コラーゲンペプチド量を
読みとり、その値を１００倍することにより検体１−当
りの■型コラーゲン量を求めた。

実施例　５ モノクローナル抗体による血清■型コラーゲンペプチド
の定量 固相にモノクローナル抗体ＩｇＧ１（り０−ン、４Ｈ１
２）を、複合体にペルオキシダーゼ標識モノクローナル
抗体Ｉｇ（）又はＦａｂ’　（クローン、１Ｄ３）を用
いた以外の他の測定条件は実施例４の血清ｍ型コラーゲ
ンペプチドの定量の場合と同様に健常人、慢性活動性肝
炎および肝硬変患者の血清■型コラーゲンペプチドを定
量した。

第　　１　　表 Ａ１１　　　ＩｇＧ２ａ　　ｒ２ａ７に黒１２　　　Ｉ
ｇＧ１　　γ１／に Ａ３３　　　Ｉｇｏｌ　　γ１／に Ａ４１　　　ＩｇＧ１　　γ１／に 黒５３　　　Ｉｇ（）１　　γ１／ｌ 第　　２　　表 ４Ｃ１工ｇＭ　　　μ／に ７Ａ１１　　　ＩｇＭ　　　μ／に ＩＤ３　　　工ｇＧ１　　γ１／に ＩＤ６　　　工ｇＧ１　　γ１／に Ｉ　Ｅ　１０　　　Ｉｇ（）１　　γ１／に２Ａ７　　
　ＩｇＭ　　　μ／に ２　Ｄ　５　　　ＩｇＧ１　　γ１／に２ＨＩ　　　Ｉ
ｇＡ　　　α／に ３Ａ９　　　ＩｇＧ１　　γ１／に ４　Ｂ　Ｉ　　　ＩｇＧ１　　γ１／に４Ｈ１２ＩｇＧ
１　　γ１／に ５Ｄ１０　　　工ｇＧ１　　γ１／に ５　Ｆ　６　　　ＩｇＧ１　　γ１／に６Ｂ５　　　Ｉ
ｇＧ１　　γ１／に ６Ｃ１１ＩｇＧ１　　γ１／に ６　Ｇ　５　　　ＩｇＧ２ｂ　　γ２ｂ／に７　Ｃ８Ｉ
ｇＧ１　　γ１／に ７　Ｈ２ＩｇＧ１　　γ１／に ８　Ｂ４　　　Ｉｇ（）１　　γ１／に８Ｇ１２　　　
ＩｇＧ１　１１／１ ９Ａ３　　　ＩｇＧ２ｂ　　ｒ２ｂ／’９Ｃ７工ｇＧ１
　　γ１／に 第　　３　　表 煮１４　　　ＩｇＧ２ｂ　　γ２ｂ／にＡ１７　　　Ｉ
ｇＧ２ｂ　　γ２ｂ／にＡ２６　　　ＩｇＧ１　　γ１
／に Ａ２９　　　ＩｇＧ２ｂ　　ｒ２ｂ／’＆３８　　　Ｉ
ｇＧ２ａ　　ｒ２ａ／’

【図面の簡単な説明】

第１図は精製マウス抗ヒトコラーゲンペプチドモノクロ
ーナル抗体（ＩｇＧタイプ）と精製ウサギ抗ヒトコラー
ゲンペプチドボリクローナル抗体を用いてのサンドイッ
チ法によるヒトコラーゲンペプチドの標準曲線である。 （−〇−）ヒト■型コラーゲン、（−・−）ヒト■型コ
ラーゲン、（−ム一）ヒト■型コラーゲン。 第２図は健常人、慢性活動性肝炎患者および肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンペプチド濃度。図中横
棒は平均値を、（り印は肝疾患患者血清中ｍ型コラーゲ
ンはプテド濃度の健常人のそれと比較しての有意差（Ｐ
（０，０１）を（）内数値は試料数を、陰影部は健常人
平均値（Ｍ）の±２８Ｄを示す。 第３図は健常人、慢性活動性肝炎患者および肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンメプチド濃度。（１１
り印は肝疾患患者血清中■型コラーケ゛ンベプチド濃度
の健常人のそれと比較しての有意差（Ｐ＜０．００１）
を示す。 第４図は健常人、慢性活動性肝炎患者およＣ肝硬変患者
血清中免疫反応性■型コラーゲンープチド濃度。（り印
は肝疾患患者血清中■型ラーゲンベプチド濃度の健常人
のそれと比較しての有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。 特許出願人　富士薬品工業株式会社 第一図 健常人　　　　慢性活動性肝炎　　肝硬変第３図 健常人　　　慢性活動性肝炎　　肝硬変第９図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒトIII、IVあるいはVI型コラーゲンペプチドに対する
   モノクローナル抗体およびヒトIII、IVあるいはVI型コ
   ラーゲンペプチドに対するポリクローナル抗体を用いた
   サンドイッチ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒト
   III、IVおよびVI型コラーゲンペプチドの定量法であつ
   て、固相担体に結合させる抗体および酵素標識を付与す
   る抗体として、それらの少なくとも一方に、ヒトIII、
   IVあるいはVI型コラーゲンに対するモノクローナル抗体
   を用いることを特徴とするヒトIII、IVおよびVI型コラ
   ーゲンペプチド定量法。