JPS63258898A - ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法 - Google Patents

ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法

Info

Publication number
JPS63258898A
JPS63258898A JP62093586A JP9358687A JPS63258898A JP S63258898 A JPS63258898 A JP S63258898A JP 62093586 A JP62093586 A JP 62093586A JP 9358687 A JP9358687 A JP 9358687A JP S63258898 A JPS63258898 A JP S63258898A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
monoclonal antibody
hybridoma
human pancreatic
phospholipase
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP62093586A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0717680B2 (ja
Inventor
Atsushi Misaki
三崎　敦司
Masao Kono
河野　昌雄
Michio Ogawa
道雄 小川
Mitsuhiro Okamoto
光弘 岡本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi and Co Ltd filed Critical Shionogi and Co Ltd
Priority to JP62093586A priority Critical patent/JPH0717680B2/ja
Priority to CA000562407A priority patent/CA1321763C/en
Priority to US07/173,536 priority patent/US4978609A/en
Priority to DE3850993T priority patent/DE3850993T2/de
Priority to AT88303435T priority patent/ATE109834T1/de
Priority to ES88303435T priority patent/ES2056919T3/es
Priority to KR1019880004309A priority patent/KR950008573B1/ko
Priority to EP88303435A priority patent/EP0287397B1/en
Publication of JPS63258898A publication Critical patent/JPS63258898A/ja
Publication of JPH0717680B2 publication Critical patent/JPH0717680B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 厳呈上五Ｍ月遣１ 本発明は、抗ヒト膵ホスホリパーゼＡ、モノクローナル
抗体、その製造方法、該モノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマおよび該モノクローナル抗体を利用した
ヒト膵ホスホリパーゼＡ。
の測定方法に関する。
良米五韮オ ホスホリパーゼＡｔ（以下Ｐ　Ｌ　Ａ　＊と略記）はジ
アシルグリセロホスホリピドの２位のエステル結合を加
水分解する酵素である。ＰＬｌ＊には太きく分けて細胞
内あるいは膜結合型Ｐ　Ｌ　Ａ　１と膵臓から分泌され
る消化酵素としてのＰＬＡ、とがあるとされている、こ
のうち消化酵素としてのｆｌＦＰＬＡ、は膵腺房細胞で
プロホスホリパーゼＡ、として産生きれ膵管中に分泌さ
れ、十二指腸内で主としてトリプシンによりアミノ酸７
つのペプチド鎖がアミン末端より除かれて活性型のＰ　
ＬＡＩとなる。現在までに、ヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　ｔの、
膵臓および膵液からの精製が報告されている（　Ｍａｇ
ｅｅ、　Ｗ、　Ｌ。
らＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　８３：　１７−２５．１
９６２、Ｇｒａｔａｒｏｌｉ、　Ｒら　Ｂｉｏｃｈｉｍ
ｉｅ、　　６３：　６７７−６８４．　１９８１、Ｎｉ
Ｎ１５ｈｉｊｉ、　ＪらＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９
４：　１３７−１４７．　１９８３など）。
急性膵炎の患者においては、この膵Ｐ　Ｌ　Ａ　＊の血
清中濃度が上昇するとされている。従って、膵ＰＬＡ、
を測定することは、急性膵炎を含む急性腹症の診断に役
立つと考えられる。
従来、血清中の膵ＰＬＡ＊は酵素化学的に測定されてき
た。しかし、血清中の膵ＰＬＡ、の酵素活性は低く、そ
の測定のためには長時間にわたる煩雑な操作を要し、急
性腹症の診断のために臨床応用することは不可能であっ
た。
また、膵ＰＬＡ、の免疫学的測定法としては、ＮｉＮ１
５ｈｉｊｉらのラジオイムノアッセイ法（Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、　９４：　１３７−１４７．１９８３）とＥ
ｓｋｏｌａらのフルオロイムノアッセイ法（Ｃ１ｉｎ、
　Ｃｈｅｍ、、　２９：　１７７７、１９８３）の報告
がある。いずれも、急性膵炎患者における血清中膵ＰＬ
Ａ、の測定値は、正常人に比へて高値を示し、免疫学的
測定法が急性膵炎を含む急性腹症の診断に利用され得る
ことを示している。
明が　決しようとする− 上記の様に、ヒト膵ＰＬＡ、は免疫学的に測定されうる
ようになりつつあるが、上記の報告で使用されている抗
体は、いずれもポリクローナル抗体（ウサギ抗血清）で
あり、診断薬として用いるには、特異性、均一性、安定
した供給などの点から、モノクローナル抗体の方が望ま
しい、また、親和性の高いモノクローナル抗体を得るこ
とができれば、それを用いて、ヒト＃ＰＬＡｔのより迅
速な測定方法を開発することが可能になる。
間　、を解決するための手段 本発明は、ヒト膵ＰＬＡ、に特異的でかつ親和性の高い
モノクローナル抗体を得、もって急性膵炎などの診断に
有効に用いることができる測定方法を提供する。
本発明者らは、上記の状況を鑑み、鋭意研究を進め、ヒ
ト膵ＰＬＡ、に特異的でかつ親和性の高いモノクローナ
ル抗体を得た。
すなわち、本発明の抗ヒト膵ＰＬＡ、モノクローナル抗
体は、ヒト膵ＰＬＡＩで免疫したマウスリンパ球とミエ
ローマ細胞との融合によって得たハイブリドーマが産生
じたものであることを特徴とする。
本発明のモノクローナル抗体を得るために、ま　　、ず
、免疫原としてヒト膵ＰＬＡ、を精製することが必要で
ある。ヒト膵ＰＬＡ、の精製は上記の通りいくつかの報
告があり、該方法によって精製することができる。
得られた精製ヒト膵ＰＬＡ、を免疫原として、実験動物
例えばマウスを免疫する。免疫方法は定法に従えばよく
、例えば生理食塩水に溶かした抗原をフロイントの完全
アジュバントと混合し、乳濁液としたものを投与する。
このようにして免疫された動物からＢリンパ球を得、こ
れを永久骨髄腫細胞系と融合させる。この融合はＫａｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの公知方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ　２５６．４９５−４９７．１９７５）に準じて行な
えばよい、これによって得られたハイブリドーマの中か
ら抗ヒト膵ＰＬＡａ抗体を産生じているものを選択する
。
この選択は、培養上清中の抗ヒト膵ＰＬＡ、抗体の有無
を適当な方法、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
やラジオイムノアッセイで調べて行なう、上清中に抗ヒ
ト膵ＰＬＡ、抗体活性が確認されたウェルのハイブリド
ーマを培地１０ｍ！程度まで増殖させてから凍結保存す
る。その際採取した培養上清を用いて各ハイブリドーマ
の産生する抗体の性質を調べ、目的にあった性質の抗体
を産生ずるハイブリドーマを選び出す０選び出されたハ
イブリドーマを常法、例えば限界希釈法でモノクローン
化し、細胞株を確立する。確立されたハイブリドーマ細
胞株を、免疫に使用した動物の腹腔内に移植し、抗体濃
度の高い腹水を得−ることかできるし、培地に培養しそ
の培養液から該抗体を得ることもできる。
このようにして得られた抗体は、必要に応じて精製して
使用することができる６例えば、硫安分画、イオン交換
クロマトグラフィー、プロティンＡカラム等の常法を用
いることによって精製することができる。
本発明においては、以上のようにして、抗ヒト膵ＰＬＡ
ｔ抗体産生マウスハイブリドーマ細胞株１００Ｂ−１及
び１０８５−２とそれぞれの産生ずるモノクローナル抗
体１００８−１及び１０８５−２を得た。
得られたハイブリドーマ細胞株は、１９８７年４月８日
から、英国ＰＨＬＳ　ＣＡＭＲ，Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗ
ｎ。
５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　ＳＦ３０ＪＧ、のＥｕｒｏｐｅ
ａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ
１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　（ＥＣＡＣＣ）に下記の受託
番号の下に、ブダペスト条約に基づいて寄託されている
。
１００８−１　：　８７０４０８０３ １０８５−２：８７０４０８０２ モノクローナル抗体１００８−１及び１０８５−２は以
下のような性質を有している。
（１）　　イムノグロブリンクラス、サブクラスは、い
ずれもＩＩＣＧＩでＬ鎖はに型である。
（２）結合定数は、１００Ｂ−１は４Ｘ１０”ｔ’、１
０８５−２はｌＸｌ０’１Ｍ−’であり、いずれも非常
に親和性が高い抗体である。
（３）いずれもブタ膵ＰＬＡ＊及びインドコブラ蛇毒（
Ｎａｊａ　ｎａｊａ　ｖｅｎｏｍ）のＰＬＡ、と全く交
叉せず、ヒト膵ＰＬＡｆｉに特異的な抗体である。
このように、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト膵Ｐ
　Ｌ　Ａ　＊に特異的でかつ親和性が非常に高く、ヒト
膵−ＰＬＡ、の免疫学的測定法に用いる抗体として非常
に優れた性質を有するものである。
また、腹水１００Ｂ−ＩＡ及び１０８５−２Ａを用いた
ヒト膵ＰＬｉのラジオイムノアッセイによって、ヒト血
清中のＰＬＡＪ度を測定したところ、１００８−ＩＡの
アッセイでは健常人が２．６±０　、７　ｎｇ／　ｍｌ
に対して急性膵炎患者が４４１±３４．　Ｏｎｇ／ｍｌ
　、また１０８５−２Ａのアッセイでは健常人が０．８
±０　、２　ｎｇ／ｍｌに対して急性膵炎患者が２３．
８±１４　、７　ｎｇ／　ｍｌといずれのモノクローナ
ル抗体を用いたラジオイムノアッセイにおいても、急性
膵炎患者血清が健常人血清に比べて明らかに高い値を示
した。
この結果は、本発明のモノクローナル抗体を用いたラジ
オイムノアッセイや酵素免疫測定法などの免疫測定法が
急性膵炎の診断に非常に有用であることを示している。
きらに、本発明のモノクローナル抗体のもつ非常に高い
親和性を利用することによって、さらに迅速簡便なヒト
膵ＰＬＡ、の免疫学的測定法を開発し、急性膵炎の診断
に役立てることができる。
また、上記と同様の方法によって、本発明のハイブリド
ーマ１００Ｂ−１および１０８５−２と同等の性質を有
するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を得るこ
とは当業者にとっては容易なことであり、同等の性質を
有するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体も本発
明の範囲内である。
Ｘ及忽 実施例１　抗ヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　ｓモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマの作成と抗体 の産生 （１）抗原の調整 抗原として用いたヒト膵Ｐ　ＬＡｆｆｉはヒト膵液から
Ｎ１５ｈｉ　ｊｉｍａらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｍ
ｉｓｔｒｙ　９４．１３７−１４７．１９８３）に従っ
て精製した。
■　免疫 ヒト膵ＰＬＡｓの生理食塩水溶液（ＰＬＡ＊濃度０　、
５　ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを当
量ずつ混合して乳濁液とし、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス
（雌、５週令）の背部皮下に０　、１　ｍｌずつ３３Ｉ
！ｉ間隔で３回注射した。マウス１匹当りＰＬ　Ａ　ｔ
の投与量は２５μｇである。きらに、３回目免疫の５週
間後にブースター免疫として、ヒト膵ＰＬＡ、５０μｇ
を溶解した生理食塩水２００μｍを腹腔内に投与した。
（３）　　細胞融合 ブースター免疫から４日後にマウスの肺臓を摘出し、そ
の細胞を０．１７Ｍ塩化アンモニウム溶液中に水冷下５
分装置いて赤血球を破壊した。
残った細胞をＲＰＭ１１６４０培地に懸濁して、細胞融
合に用いる牌リンパ球とした０次に、同じ＜ＲＰＭ１１
６４０培地に懸濁した８−アザグアニン耐性ミエローマ
細胞（Ｎ５−１）　７　Ｘ　１０　’個と牌リンパ球１
．４Ｘ１０’個を混合し、遠心（１，００Ｏｒｐｍ、１
０分）後上清を除去した。細胞沈澱物に、ＲＰＭ１１６
４０培地に溶かした５０％ポリエチレングリフール（分
子量４．０００、メルク）０．８ｍｌを１分間かけてピ
ペットの先で攪拌しながら加え、さらに１．５分間攪拌
した。その後２ｍｌのＲＰＭ１１６４０を２分間かけて
、次に同じ＜２ｍｌを１分間かけて攪拌しながら加えた
。きらに、１８ｍｌのＲＰＭ１１６４０を緩やかに攪拌
しながら徐々に滴加した。遠心（１，ＯＯＯｒｐｍ、　
１０分）後、上清を除去し、沈殿した細胞をＨＡＴ培地
（１×１０−’Ｍ　Ｌホキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍア
ミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミジンを含む２０
％ＦＣ３−ＲＰＭ１１６４０培地）７０ｍｌに懸濁し、
９６ウエル細胞培養プレート（ツースター社）７枚の各
ウェルに０　、１　ｍｌずつ分注した。細胞培養プレー
トにはまえもって栄養細胞としてマウス肺臓細胞のＨＡ
Ｔ培地懸濁液をＩ×１０″個１０．１ｍｌ／ウェルずつ
入れておいた。以後２〜３日に一度ずつＨＡＴ培地を半
量ずつ新しいものと入れ変えた。約１０日後にはハイブ
リドーマの増殖が認められた。ハイブリドーマが増殖し
てきたウェルは全部で５０８ウエル（７５％）であった
。
（４）　　ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの増殖してきたウェルについて、培養上
清を用いて、抗ヒト膵ＰＬＡ、抗体産生の有無をＥＬＩ
ＳＡで検定した。９６ウエル平底ＥＬＩＳＡプレート（
ヌンク社）の各ウェルにヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　＊溶液（１
０ｎｇ７５０　μｍ０．０５　Ｍ炭醜水素ナトリウム緩
衝液、ｐＨ８，５＞を５０μｍずつ加え、４℃−晩装置
し、ヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　＊をプレートに固相化した。上
清除去後、０．２％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを
１００μｌずつ加え、室温で１時間静置した。各ウェル
を洗浄液（０，１％ツイーン８０を含むＰＢＳ）で２回
洗浄し、ハイブリドーマの増殖してきたウェルの培養上
清を約５０Ｉｌｌずつ加えて３７℃で３０分間静置した
０次に、これらのウェルを２回洗浄後、ビオチン化した
抗マウスイムノグロブリン抗体溶液（ベクタスティンＡ
ＢＣキット、フナフシ薬品株式会社）を５０μｌずつ加
えて室温で１５分間静置し、次いで２回洗浄後、アビジ
ンとビオチン化した西洋ワサビペルオキシダーゼの複合
体溶液（ベクタスティンＡＢＣキット、フナコシ薬品株
式会社）を５０μｌずつ加えて室温で１５分間静置した
。これらのウェルを５回洗浄後、基質溶液（０，０２％
ＡＢＴＳおよび０１０３％過酸化水素水を溶解した０、
０５Ｍクエン酸−リンｒ１１緩衝液、ｐＨ５，３）を１
００μｌずつ加えて室温で２０分間静置した。最後に２
ｍＭアジ化ナトリウム水溶液を１００μｍずつ加えて攪
拌し、プレートリーダー（コロナ寛気株式会社製ＭＴＰ
−２２型）で４１５ｎｍの吸光度を測定した。
（５）　　ハイブリドーマの凍結保存 上記のＥＬＩＳＡで抗ヒト膵ＰＬＡ、抗体活性陽性と認
められるウェルのハイブリドーマをＨＴ培地（上記ＨＡ
Ｔ培地からアミノプテリンを除いたもの）中で培地的１
０ｍ１まで増殖させ、凍結用培地（１０％ＤＭＳＯを含
むウシ胎児血清）１ｍｌに懸濁して一８０℃に凍結保存
した。各培養上清は、産生抗体の性質を調べるために採
取保存した０合計８５種類のハイブリドーマを凍結保存
した。
（６）　　培養上清の置換試験 上記のハイブリドーマ凍結保存時に採取した培養上清の
段階的希釈液１００μｌと１１（標識ヒト膵ＰＬＡ！　
（実施例５　（１）に記載）１００μ！および２％ウシ
ガンマグロブリンを含むアッセイ用緩衝液（実施例５　
（１）に記載）１００μ！を混合し、室温で一晩インキ
ユベートした０次に、２７％ポリエチレングリコール６
０００水溶液２５０μｌを加えて直ちに攪拌し、遠心（
３，００Ｏｒｐｍ、２０分）後、上清を吸引除去して沈
殿の放射能を測定し、抗体に結合した目ＪＰＪ識ヒト膵
ＰＬＡ、の割合を求めた。同時に、２％ウシガンマグロ
ブリンを含むアッセイ用緩衝液の代わりに、ヒト膵Ｐ　
ＬＡ＊　５ｎｇ／ｌ　００μｌおよび２％ウシガンマグ
ロブリンを含むアッセイ用緩衝液１００μｌを加えて同
様の操作を行ない、ＩＩＪＭｓ識ヒト膵ＰＬＡ、の放射
能の沈殿からの減少、すなわち添加したヒト膵ＰＬＡ＊
によってＩＩＪ標識ヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　＊がどの程度抗
体から置換されたかを調べた。この置換の割合が大きな
培養上清か親和性の高い抗体を含んでいるものとした。
（７）　　モノクローン化 上記の置換試験の結果、親和性の高い抗体を産生じてい
ると考えられるハイブリドーマを凍結から起こし、限界
希釈法でクローニングした。９６ウェル細胞培養プレー
トにハイブリドーマを１個／２００μｍ／ウェルの濃度
で培養し、ハイブリドーマが単一コロニーで増殖してき
たウェルの培養上清について上記ＥＬＩＳＡを行ない、
抗ヒト膵ＰＬＡ、抗体陽性のウェルのハイブリドーマを
培養拡大した。このようにして抗ヒト膵ＰＬＡ＊抗体産
生ハイブリドーマ細胞株１００Ｂ−１と１０８５−２を
確立した。
（８）　　腹水抗体液の作製 確立したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、抗体
濃度の高い腹水を作成した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌
、１０日前にブリスタンを０．５ｍｌｍ脇腹投与）にＲ
ＰＭ１１６４０に懸濁したハイブリドーマ約ｌＸｌ０’
個を腹腔内に投与した。１〜３週目に適宜腹水を採取し
、細胞を遠心分離した後、上清にアジ化ナトリウム０．
１％を加えて、凍結保存した。この方法でハイブリドー
マ１００８−１および１０８５−２の産生ずるモノクロ
ーナル抗体を高濃度に含む腹水１００Ｂ−ＩＡおよび・
１０８５−２Ａを得た。
（９）　　モノクローナル抗体の精製 アフィゲルプロティンＡ　　ＭＡＰＳ−Ｉキット（バイ
オランド社）を用いて、腹水１００８−ＩＡおよび１０
８５−２Ａより抗体を精製した。ゲル２ｍｌを用いて、
腹水それぞれ１ｍｌをキットの操作手順に従って精製し
たところ、１００８−ＩＡから約２ｍｇ、１０８５−２
Ａから約５ｍｇの抗体を得ることができた。抗体の純度
の確認には、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を用
いた。精製した抗体画分を２−メルカプトエタノールで
還元した後、１２．５％ＳＤＳゲルで泳動を行なった。
その結果、分子量約５２．０００前後にＨｇ４、約２８
．０００前後にＬ鎖の２つのバンドが認められた。
実施例２　モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの
決定 ハイブリドーマが産生じた免疫グロブリンのクラス・サ
ブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス・
サブクラスに特異的なウサギ抗体およびペルオキシダー
ゼ標識したヤギ抗ウサギ抗体（ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ　Ｅ
ＩＡ　Ｋｉｔ、　Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　）を用いて、上記のＥＬＩＳＡに準じて行なった。
その結果、腹水１００Ｂ−ＩＡ、１０８５−２Ａとも、
抗７１抗体および抗に抗体を用いたときに発色が認めら
れた。
実施例３　モノクローナル抗体の親和性（結合定数）の
測定 実施例５〈２）に準じてヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　＊の標準曲
線作成の操作を行ない、ヒト膵ＰＬＡ、各濃度について
スカッチ〜−ド法に基づいて縦軸に沈殿の放射能／上清
の放射能、横軸に抗体に結合した抗原の濃度をプロット
し、得られた直線の傾きから、抗体の結合定数を測定し
た。
実施例４　モノクローナル抗体の特異性実施例５　（２
）のヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　＊のラジオイムノアッセイにお
ける試料としてブタ膵ｐＬＡ＊（ベーリンガー・マンハ
イム社製）およびインドコブラ蛇毒ＰＬＡＮ（シグマ社
製）を用いて１１８１標識ヒト膵ＰＬＡ、の置換を調べ
た。その結果、１００８−ＩＡ、１０８５−２Ａとも、
上記の２種類のＰＬＡ、をヒト膵ＰＬＡ、での５０％阻
害量の１０００倍加えても、■″Ｉ標識ヒト膵ＰＬＡ。
の置換は全く認められなかった。
実施例５　モノクローナル抗体を用いたラジオイムノア
ッセイ （１）　　”’！標識ヒト膵ＰＬＡ、の作製ヒト膵ＰＬ
Ａ＊の■６！による標識を、ＨｕｎｔｅｒおよびＧｒｅ
ｅｎｗｏｏｄの公知方法（Ｎａｔｕｒｅ　１９４．４９
５−４９６１９６２）に準じてクロラミンＴ法によって
行なった。
・試薬 ヒト膵Ｐ　ＬＡ、　０．５ｍｇ／ｍｌ　０．５Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ７，５ ヨウ化ナトリウム（Ｎａ”’Ｉ）　　１ｍＣ１／１０１
ｔ１（Ａ１０１ｔ１（Ａ社製） クロラミンＴ　　２ｍｇ／ｍｌ　０．５Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７，５ ピロ亜硫酸ナトリウム　２　、５　ｍｇ／ｍｌ　０　、
　Ｉ　Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，４ ウシ血清アルブミン　１０ｍｇ／ｍｌ　０．１　Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ７，４ ヨウ化カリウム　１００　ｍｇ／ｍｌ蒸留水・アッセイ
用緩衝液 ０．２％ウシ血清アルブミン、５ｍＭエチレンジアミン
四酢酸、０．０１％アジ化ナトリウムおよび０９％塩化
ナトリウムを含む０．Ｏ１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，４ ・凍結乾燥用緩衝液 アッセイ用緩衝液の５倍濃度のもの ・方法 チューブに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２５μ
ｌ、ヒト膵ＰＬＡヨ１０μｍ　　（５μｇ）およびＮａ
”’Ｉ５μｍ　　（５００μＣｉ）を入れ、攪拌後クロ
ラミンＴ５μｌ　（１０μｇ）を加えて４５秒間攪拌し
てからピロ亜硫酸ナトリウム２５μ＋　　（６２，５μ
ｇ）を加えて攪拌した。
さらに、ウシ血清アルブミン５μｌ　（５０μｇ）とヨ
ウ化カリウム５μｍ（５００μｇ）を加えて攪拌し、反
応液をセファデックスＧ−２５カラム（直径１ｃｍＸ長
き２５ｃｍ）にかけて１１８　Ｉ標識ヒト＃ＰＬＡ、と
１μｍ　１−イオンとを分離した。１ｆｆｌ　■標識ヒ
ト膵ＰＬＡ、の画分を凍結乾燥用緩衝液で２．５μＣｉ
　／　２　ｍ　ｌになる゛ように希釈して、バイアル当
り２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥して４°Ｃで保存した。
使用時にはバイアル当り１０ｍ１の蒸留水に溶解して使
用した。
（２）　　ヒト＃ＰＬＡ、のラジオイムノアッセイ・試
薬 腹水希釈液　１００Ｂ−ＩＡ　（アッセイ用緩衝液で３
６万倍希釈したもの）また は１０８５−２Ａ　（アッセイ用緩 衝液で８０万倍希釈したもの） ヒト膵ＰＬＡ、標準液 アッセイ用緩衝液中にヒト膵ＰＬ Ａ、を０．１〜２５ｎｇ／ｍｌの範 囲で２倍きざみの濃度で含むもの １２６■標識ヒト膵ＰＬＡ、（１）に記載アッセイ用緩
衝液　（１）に記載 イムノビーズ　ウサギ抗マウスイムノグロブリン（バイ
オラッド社製）アッセ イ用緩衝液で１　ｍｇ／ｍｌに希釈し て使用 ・方法 チューブにヒト膵ＰＬＡｘ標準液または試料１００μｍ
をとり、アッセイ用緩衝液２００μｍ、”’１ｍ識ヒト
膵ＰＬＡｔｌ　Ｑ　０μｍおよび腹水希釈液（１００８
１−Ａまたは１０８５−２Ａ）１００μｌを加えて混和
した後、室温で一晩インキユベートした０次いで、イム
ノビーズ１００μｌを加えて、室温で２時間放置後、３
、０ＯＯｒｐｒｎで１０分間遠心した。上清を吸引除去
後、沈殿の放射能をガンマカウンター（アロ力、ＡＲＣ
−６００型）で測定した。ヒト膵ＰＬＡ、標準液による
標準曲線から 試料中のヒト膵ＰＬＡ、濃度を求めた。
・標準曲線 ラジオイムノアッセイの標準曲線を第１図に示す、感度
（９０％阻害濃度）は１００Ｂ−ＩＡが０　、４　ｎｇ
／ｍｌ、１０８５−２Ａが０　、３　ｎｇ／ｍｌであり
、いずれも非常に高感度の標準曲線が得られた。
・ヒト血清の測定 ラジオイムノアッセイで健常人、急性膵炎患者および膵
全摘者の血清をそのまままたはアッセイ用緩衝液で適宜
希釈して測定した。その結果を表１に示す。
（以下余白） １００Ｂ−ＩＡを用いたラジオイムノアッセイおよび１
０８５−２Ａを用いたラジオイムノアッセイともに、急
性膵炎患者血清が健常人血清より明らかに高い値を示し
、これら２種類のモノクローナル抗体は、急性膵炎の診
断に有用であることが確認された。
また、膵全摘者血清では感度以下の低値を示したことか
らこれらのモノクローナル抗体はヒト膵ＰＬＡ、に特異
性の高いものであることが示された。
参考例　ウサギ抗血清を用いたラジオイムノアッセイ 実施例５と同様にして、ウサギ抗血清を用いて標準曲線
を作成した。ただし、 ・腹水希釈液→抗血清希釈液：アッセイ用緩衝液で４万
倍希釈したもの ・ヒト膵ＰＬＡ、標準液： アッセイ用緩衝液中にヒト膵ＰＬＡ、を０．３９〜１１
００ｎ／ｍ＋の範囲で２倍きざみの濃度で含む ・イムノビーズ： ヤギ抗ウサギイムノグロブリン（バイオランド社製）　
アッセイ用緩衝液で１　ｍｇ／ｍ　！に希釈して使用　
　　゛ とした。
その結果を、第１図に示す、ウサギ抗血清による標準曲
線の９０％阻害濃度は１．０ｎｇ／ｍｌであり、１００
Ｂ−ＩＡ（０，４ｎｇ／ｍｌ）、１０８５−２Ａ（０，
３ｎｇ／ｍｌ）のほうが、高感度である。
え里二羞り 本発明の、抗ヒト膵Ｐ　Ｌ　Ａ　＊モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマは、完全にクローン化された
細胞株であり、これらを培養することによって上記のモ
ノクローナル抗体を効率良く製造できる。また、そのよ
うにして製造されたモノクローナル抗体は、ラジオイム
ノアッセイ等の免疫測定法に用いることによって、急性
膵炎を含む急性腹症の迅速な診断を行なうことができる
。
【図面の簡単な説明】
第１図はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
を用いたラジオイムノアッセイにおける膵ホスホリパー
ゼＡ、の標準曲線を示す。

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ヒト膵ホスホリパーゼＡ＿２に対して特異性を有
    するモノクローナル抗体。
  2. （２）サブクラスがＩｇＧ＿１である特許請求の範囲第
    １項に記載のモノクローナル抗体。
  3. （３）Ｌ鎖がκ型である特許請求の範囲第１項に記載の
    モノクローナル抗体。
  4. （４）結合定数が１０＾１＾Ｍ＾−＾１以上である特許
    請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
  5. （５）ブタ膵ホスホリパーゼＡ＿２およびインドコブラ
    蛇毒ホスホリパーゼＡ＿２に対して特異性を有さない特
    許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
  6. （６）ハイブリドーマ１００８−１によって産生される
    モノクローナル抗体１００８−１またはハイブリドーマ
    １０８５−２によって産生されるモノクローナル抗体１
    ０８５−２である特許請求の範囲第１項に記載のモノク
    ローナル抗体。
  7. （７）ヒト膵ホスホリパーゼＡ＿２に対して特異性を有
    するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  8. （８）該モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧ＿１
    である特許請求の範囲第７項に記載のハイブリドーマ。
  9. （９）該モノクローナル抗体のＬ鎖がκ型である特許請
    求の範囲第７項に記載のハイブリドーマ。
  10. （１０）該モノクローナル抗体の結合定数が１０＾１＾
    １Ｍ＾−＾１以上である特許請求の範囲第７項に記載の
    ハイブリドーマ。
  11. （１１）該モノクローナル抗体がブタ膵ホスホリパーゼ
    Ａ＿２およびインドコブラ蛇毒ホスホリパーゼＡ＿２に
    対して特異性を有さないことを特徴とする特許請求の範
    囲第７項に記載のハイブリドーマ。
  12. （１２）ハイブリドーマ１００８−１またはハイブリド
    ーマ１０８５−２である特許請求の範囲第７項に記載の
    ハイブリドーマ。
  13. （１３）抗ヒト膵ホスホリパーゼＡ＿２抗体を産生する
    Ｂリンパ球と骨髄腫細胞を融合させて得られる抗ヒト膵
    ホスホリパーゼＡ＿２モノクローナル抗体産生ハイブリ
    ドーマを培養し、培養物中に抗ヒト膵ホスホリパーゼＡ
    ＿２モノクローナル抗体を得ることを特徴とする抗ヒト
    膵ホスホリパーゼＡ＿２モノクローナル抗体の製造方法
    。
  14. （１４）該モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧ＿
    １である特許請求の範囲第１３項に記載の製造方法。
  15. （１５）該モノクローナル抗体のＬ鎖がκ型である特許
    請求の範囲第１３項に記載の製造方法。
  16. （１６）該モノクローナル抗体の結合定数が１０＾１＾
    １Ｍ＾−＾１以上である特許請求の範囲第１３項に記載
    の製造方法。
  17. （１７）該モノクローナル抗体がブタ膵ホスホリパーゼ
    Ａ＿２およびインドコブラ蛇毒ホスホリパーゼＡ＿２に
    対して特異性を有さないことを特徴とする特許請求の範
    囲第１３項に記載の製造方法。
  18. （１８）該ハイブリドーマがハイブリドーマ１００８−
    １またはハイブリドーマ１０８５−２である特許請求の
    範囲第１３項に記載の製造方法。
  19. （１９）該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体１
    ００８−１またはモノクローナル抗体１０８５−２であ
    る特許請求の範囲第１３項に記載の製造方法。
  20. （２０）抗ヒト膵ホスホリパーゼＡ＿２モノクローナル
    抗体を使用することを特徴とするヒト膵ホスホリパーゼ
    Ａ＿２の免疫測定方法。
  21. （２１）該モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧ＿
    １である特許請求の範囲第２０項に記載の測定方法。
  22. （２２）該モノクローナル抗体のＬ鎖がκ型である特許
    請求の範囲第２０項に記載の測定方法。
  23. （２３）該モノクローナル抗体の結合定数が１０＾１＾
    １Ｍ＾−＾１以上である特許請求の範囲第２０項に記載
    の測定方法。
  24. （２４）該モノクローナル抗体がブタ膵ホスホリパーゼ
    Ａ＿２およびインドコブラ蛇毒ホスホリパーゼＡ＿２に
    対して特異性を有さないことを特徴とする特許請求の範
    囲第２０項に記載の測定方法。
  25. （２５）該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体１
    ００８−１またはモノクローナル抗体１０８５−２であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第２０項に記載の測
    定方法。
  26. （２６）ラジオイムノアッセイであることを特徴とする
    特許請求の範囲第２０項に記載の測定方法。
JP62093586A 1987-04-15 1987-04-15 ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法 Expired - Lifetime JPH0717680B2 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP62093586A JPH0717680B2 (ja) 1987-04-15 1987-04-15 ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法
CA000562407A CA1321763C (en) 1987-04-15 1988-03-24 Monoclonal antibody specific to human pancreatic phospholipase a
US07/173,536 US4978609A (en) 1987-04-15 1988-03-25 Monoclonal antibody specific to human pancreatic phospholipase A2
DE3850993T DE3850993T2 (de) 1987-04-15 1988-04-15 Monoklonaler Antikörper spezifisch gegen humane Pankreas-Phospholipase-A2.
AT88303435T ATE109834T1 (de) 1987-04-15 1988-04-15 Monoklonaler antikörper spezifisch gegen humane pankreas-phospholipase-a2.
ES88303435T ES2056919T3 (es) 1987-04-15 1988-04-15 Anticuerpo monoclonal especifico para la fosfolipasa a2 pancreatica humana.
KR1019880004309A KR950008573B1 (ko) 1987-04-15 1988-04-15 인간 췌장 포스포리파제 a₂에 대해 특이성을 갖는 단클론성 항체
EP88303435A EP0287397B1 (en) 1987-04-15 1988-04-15 Monoclonal antibody specific to human pancreatic phospholipase A2

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP62093586A JPH0717680B2 (ja) 1987-04-15 1987-04-15 ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS63258898A true JPS63258898A (ja) 1988-10-26
JPH0717680B2 JPH0717680B2 (ja) 1995-03-01

Family

ID=14086388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62093586A Expired - Lifetime JPH0717680B2 (ja) 1987-04-15 1987-04-15 ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4978609A (ja)
EP (1) EP0287397B1 (ja)
JP (1) JPH0717680B2 (ja)
KR (1) KR950008573B1 (ja)
AT (1) ATE109834T1 (ja)
CA (1) CA1321763C (ja)
DE (1) DE3850993T2 (ja)
ES (1) ES2056919T3 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996020959A1 (fr) * 1994-12-29 1996-07-11 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvel anticorps monoclonal ayant un effet inhibiteur sur la phospholipase a2 de type ii, et proteine contenant une partie de cet anticorps

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3023147B2 (ja) * 1990-07-05 2000-03-21 塩野義製薬株式会社 ヒト膵臓プロホスホリパーゼａ▲下２▼を認識するモノクローナル抗体
DE4142552A1 (de) * 1991-12-21 1993-06-24 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikoerper gegen die typ i phospholipase a(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) als entzuendungshemmendes therapeutikum
US5767249A (en) * 1994-06-20 1998-06-16 Boehringer Mannheim Gmbh Monoclonal antibodies against type I phospholipase A2 as a diagnostic and anti-inflammatory therapeutic agent
WO2003101177A2 (en) * 2002-06-04 2003-12-11 Sequenom, Inc. Diagnosing predisposition to fat deposition and therapeutic methods for reducing fat deposition and treatment of associated conditions
EP1581095A4 (en) * 2002-06-27 2006-10-18 Harkness Pharmaceuticals Inc THERAPEUTIC METHODS FOR REDUCING FAT DEPOSIT AND TREATING THE DISEASES THEREOF
WO2004002295A2 (en) * 2002-06-27 2004-01-08 Sequenom, Inc. Diagnosing predisposition to fat deposition and associated condition
CN103383392A (zh) * 2012-05-02 2013-11-06 上海方恩医疗用品有限公司 一种新型碘溶液及制备方法在人体鳞状上皮细胞粘膜及其癌前病变染色诊断中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ICSU SHORT REPORTS=1986 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996020959A1 (fr) * 1994-12-29 1996-07-11 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvel anticorps monoclonal ayant un effet inhibiteur sur la phospholipase a2 de type ii, et proteine contenant une partie de cet anticorps

Also Published As

Publication number Publication date
US4978609A (en) 1990-12-18
KR880012766A (ko) 1988-11-29
DE3850993D1 (de) 1994-09-15
KR950008573B1 (ko) 1995-08-03
DE3850993T2 (de) 1994-12-01
EP0287397A2 (en) 1988-10-19
JPH0717680B2 (ja) 1995-03-01
EP0287397A3 (en) 1990-11-22
EP0287397B1 (en) 1994-08-10
ES2056919T3 (es) 1994-10-16
CA1321763C (en) 1993-08-31
ATE109834T1 (de) 1994-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH05184384A (ja) ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体
WO1994004563A1 (en) PEPTIDES CONTAINING RESPECTIVE AMINO ACID SEQUENCES SELECTED FROM AMONG THOSE OF LIPOPROTEIN(a) AND APOLIPOPROTEIN(a), ANTIBODIES RESPECTIVELY RECOGNIZING THESE AMINO ACID SEQUENCES, AND METHOD OF ASSAYING WITH THESE ANTIBODIES
JPH06504842A (ja) 血小板凝集疾患の特徴付け
JP4431798B2 (ja) 尿中のアネキシンｖの分析方法及びその利用
JP2673929B2 (ja) ヒト間質型コラゲナーゼと阻害剤との複合体の免疫学的定量法および臨床診断への応用
JPH04503006A (ja) 血液凝固ＸＩＩａ因子βモノクローナル抗体およびイムノアッセイ
JPS63258898A (ja) ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法
US5425942A (en) Polyfunctinal protease
JP3098640B2 (ja) ヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼの免疫学的定量法
JP3307422B2 (ja) ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉの免疫学的測定方法
JPH09176199A (ja) 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用
JP3076640B2 (ja) ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの免疫学的定量法
JPH05304953A (ja) 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
WO2020077532A1 (zh) 一种基于胎盘样硫酸软骨素a的癌症筛查和早期诊断的试剂方法
JPH02276591A (ja) Ａｎｐのｃ端側を認識するモノクローナル抗体
JP3713585B2 (ja) 変性又は修飾リポタンパク質（ａ）に結合する抗体及びこの抗体を用いる測定法
JP2779193B2 (ja) 抗ヒト組織因子モノクローナル抗体
JP2742886B2 (ja) 好中球コラゲナーゼの免疫学的定量法
JPH0677017B2 (ja) ヒト▲ｉｖ▼型コラーゲンのサンドイツチ酵素免疫学的定量法
JPH0638081B2 (ja) ヒトコラーゲンペプチドの酵素免疫測定法
JP4028925B2 (ja) モノクローナル抗体
JPH0453516B2 (ja)
JP2006117537A (ja) 抗ａｄａｍｔｓ１３モノクローナル抗体
JP2610808B2 (ja) 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬
JP2518602B2 (ja) ヒトプロテインｓに対するモノクロ―ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット

Legal Events

Date Code Title Description
EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080301

Year of fee payment: 13