JPH05304953A - 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマInfo
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- JPH05304953A JPH05304953A JP4216068A JP21606892A JPH05304953A JP H05304953 A JPH05304953 A JP H05304953A JP 4216068 A JP4216068 A JP 4216068A JP 21606892 A JP21606892 A JP 21606892A JP H05304953 A JPH05304953 A JP H05304953A
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Abstract
(57)【要約】
【構成】 次の性質（ａ）〜（ｆ）を有する抗トロンビ
ン結合性物質（ＴＭ）モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマＴＭ−Ｈ６０。（ａ）分子量；１８０，０
００±８，０００、（ｂ）ＩｇＧサブクラス；Ｉｇ
Ｇ 1 、（ｃ）等電点；pH７．９−９．２、（ｄ）トロン
ビン結合性物質のトロンビンとの結合部位を認識しな
い、（ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識しない、（ｆ）トロンビン結合性物
質の酵素による分子量変化を認識する。 【効果】 ＴＭの特定の部位を認識するモノクローナル
抗体を安定に製造できる。
ン結合性物質（ＴＭ）モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマＴＭ−Ｈ６０。（ａ）分子量；１８０，０
００±８，０００、（ｂ）ＩｇＧサブクラス；Ｉｇ
Ｇ 1 、（ｃ）等電点；pH７．９−９．２、（ｄ）トロン
ビン結合性物質のトロンビンとの結合部位を認識しな
い、（ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識しない、（ｆ）トロンビン結合性物
質の酵素による分子量変化を認識する。 【効果】 ＴＭの特定の部位を認識するモノクローナル
抗体を安定に製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト由来のトロンビン
結合性物質に結合するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマに関する。
結合性物質に結合するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞融合技術は、ケーラーとミルスタイ
ンの報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９７頁，１９７５
年）以来急速に発展した。すなわち、哺乳動物の脾細胞
と骨髄腫細胞とを融合させた雑種細胞（ハイブリドー
マ）は、用いた脾細胞の性質に応じて種々の抗体を生産
することが知られている。そしてこのハイブリドーマの
性質を利用し、これをクローニングすることにより種々
の蛋白質、ホルモン等の生体物質に対するモノクローナ
ル抗体を産生する融合細胞を作製すること、並びにモノ
クローナル抗体を生産する試みがなされている（Ｅ．Ｄ
ａｌｅ Ｓｅｒｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１１，
１９７９〜１８０６，１９８１）。
ンの報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９７頁，１９７５
年）以来急速に発展した。すなわち、哺乳動物の脾細胞
と骨髄腫細胞とを融合させた雑種細胞（ハイブリドー
マ）は、用いた脾細胞の性質に応じて種々の抗体を生産
することが知られている。そしてこのハイブリドーマの
性質を利用し、これをクローニングすることにより種々
の蛋白質、ホルモン等の生体物質に対するモノクローナ
ル抗体を産生する融合細胞を作製すること、並びにモノ
クローナル抗体を生産する試みがなされている（Ｅ．Ｄ
ａｌｅ Ｓｅｒｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１１，
１９７９〜１８０６，１９８１）。
【０００３】一方、本出願人は先にトロンビンと結合し
てプロテインＣの活性化を特異的に増強するトロンビン
結合性物質（以下、ＴＭと称する）をヒトの胎盤から分
離、精製することに成功した（特開昭６０−１９９８１
９号公報）。このＴＭは下記の性質を有し、医薬として
有用な物質である。
てプロテインＣの活性化を特異的に増強するトロンビン
結合性物質（以下、ＴＭと称する）をヒトの胎盤から分
離、精製することに成功した（特開昭６０−１９９８１
９号公報）。このＴＭは下記の性質を有し、医薬として
有用な物質である。
【０００４】 （１）分子量；還元状態で８８，０００±１０，０００ 非還元状態で７１，０００±１０，０００ （２）等電点；pH４．２±０．５ （３）親和性；トロンビンに対して強い親和性を有す
る。 （４）活 性；（ａ）トロンビンと結合してプロテイン
Ｃを活性化する。 （ｂ）血液の凝固時間を延長する。 （５）安定性；pH２〜１０で安定。 変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、尿素）及びペプシン
処理に対して安定。
る。 （４）活 性；（ａ）トロンビンと結合してプロテイン
Ｃを活性化する。 （ｂ）血液の凝固時間を延長する。 （５）安定性；pH２〜１０で安定。 変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、尿素）及びペプシン
処理に対して安定。
【０００５】更に、ヒト由来のＴＭについてはその後、
以下の論文、特許公報等に報告されている。 胎盤由来のもの；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９ １
２２４６−１２２５１（１９８４） Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７ ３５
３−３６４（１９８５） ＥＰ１８２９２９Ａ 肺由来のもの；ＷＯ ８７／００５０ 血漿、尿由来のもの；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７
６ ２１７８〜２１８１（１９８５） 血管内皮細胞、肺癌細胞由来のもの；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６０ １５４３２−１５４３８（１９８５）
以下の論文、特許公報等に報告されている。 胎盤由来のもの；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９ １
２２４６−１２２５１（１９８４） Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７ ３５
３−３６４（１９８５） ＥＰ１８２９２９Ａ 肺由来のもの；ＷＯ ８７／００５０ 血漿、尿由来のもの；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７
６ ２１７８〜２１８１（１９８５） 血管内皮細胞、肺癌細胞由来のもの；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６０ １５４３２−１５４３８（１９８５）
【０００６】
【発明が解決しようとする問題点】しかし、胎盤中のＴ
Ｍは微量であり、また、通常使用される各種クロマトグ
ラフィーでは、ＴＭとの特異的結合が充分ではなく、高
純度のＴＭを取得することは困難であり、加えて工程が
長く回収率も満足のいくものではなかった。従って、高
純度のＴＭを簡便に高収率で取得する特異的精製法の開
発が望まれている。また、ＴＭの作用メカニズムの解
明、血中濃度の測定等の手段としてＴＭの高感度検出法
の開発も望まれている。
Ｍは微量であり、また、通常使用される各種クロマトグ
ラフィーでは、ＴＭとの特異的結合が充分ではなく、高
純度のＴＭを取得することは困難であり、加えて工程が
長く回収率も満足のいくものではなかった。従って、高
純度のＴＭを簡便に高収率で取得する特異的精製法の開
発が望まれている。また、ＴＭの作用メカニズムの解
明、血中濃度の測定等の手段としてＴＭの高感度検出法
の開発も望まれている。
【０００７】すでにＩ．マルヤマら〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６０ １５４３２〜１５４３８（１９８
５）〕はヒト胎盤由来のＴＭを用いて抗ＴＭモノクロー
ナル抗体を作成し、このものの血管内皮細胞及び肺癌細
胞由来のＴＭがトロンビンと結合してプロテインＣを活
性化することを阻害するか否かを検討している。しかし
ながら、この報文の検討では、このモノクローナル抗体
がＴＭのトロンビンとの結合部位を認識するという性質
を有することのみしか証明しておらず、このモノクロー
ナル抗体のその他の生物学的性質及び物理化学的性質に
ついては何も示していない。
ｈｅｍ．２６０ １５４３２〜１５４３８（１９８
５）〕はヒト胎盤由来のＴＭを用いて抗ＴＭモノクロー
ナル抗体を作成し、このものの血管内皮細胞及び肺癌細
胞由来のＴＭがトロンビンと結合してプロテインＣを活
性化することを阻害するか否かを検討している。しかし
ながら、この報文の検討では、このモノクローナル抗体
がＴＭのトロンビンとの結合部位を認識するという性質
を有することのみしか証明しておらず、このモノクロー
ナル抗体のその他の生物学的性質及び物理化学的性質に
ついては何も示していない。
【０００８】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、更に有
用な抗ＴＭモノクローナル抗体を得るため、鋭意研究を
重ねた結果、常法に従ってＴＭで免疫した動物の抗体産
生細胞と骨髄腫細胞とを融合して得たハイブリドーマの
産生するモノクローナル抗体について、それらの有する
特性、すなわち、ＴＭのトロンビンとの結合部位を認識
するか、ＴＭのカルシウムイオンによる構造変化を認識
するか、ＴＭの酵素処理による分子量変化を認識するか
を検定し、選択すれば特異な性質を有する新しいモノク
ローナル抗体が得られることを見出した。更にこのモノ
クローナル抗体を利用することにより、ＴＭの高純度精
製及び免疫学的測定ができることを見出し、本発明を完
成した。
用な抗ＴＭモノクローナル抗体を得るため、鋭意研究を
重ねた結果、常法に従ってＴＭで免疫した動物の抗体産
生細胞と骨髄腫細胞とを融合して得たハイブリドーマの
産生するモノクローナル抗体について、それらの有する
特性、すなわち、ＴＭのトロンビンとの結合部位を認識
するか、ＴＭのカルシウムイオンによる構造変化を認識
するか、ＴＭの酵素処理による分子量変化を認識するか
を検定し、選択すれば特異な性質を有する新しいモノク
ローナル抗体が得られることを見出した。更にこのモノ
クローナル抗体を利用することにより、ＴＭの高純度精
製及び免疫学的測定ができることを見出し、本発明を完
成した。
【０００９】すなわち本発明は、ＴＭの特定の部位を認
識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
提供するものである。
識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
提供するものである。
【００１０】ＴＭの特定の部位を認識するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば次の如くし
て製造される。すなわち、（１）抗原としてＴＭを用い
て免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、（２）別に
骨髄腫細胞を調製し、（３）これらの細胞を融合させ、
（４）得られたハイブリドーマを選択的に増殖させ、
（５）このハイブリドーマから抗体産生ハイブリドーマ
を検索し、（６）抗体産生ハイブリドーマの培養液を用
い、培養液中のモノクローナル抗体が１）ＴＭのトロン
ビンとの結合性部位を認識するか、２）ＴＭのカルシウ
ムイオンによる構造変化を認識するか、３）ＴＭの酵素
処理による分子量変化を認識するかを検討し、（７）目
的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
をクローニングすることにより得られる。
ル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば次の如くし
て製造される。すなわち、（１）抗原としてＴＭを用い
て免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、（２）別に
骨髄腫細胞を調製し、（３）これらの細胞を融合させ、
（４）得られたハイブリドーマを選択的に増殖させ、
（５）このハイブリドーマから抗体産生ハイブリドーマ
を検索し、（６）抗体産生ハイブリドーマの培養液を用
い、培養液中のモノクローナル抗体が１）ＴＭのトロン
ビンとの結合性部位を認識するか、２）ＴＭのカルシウ
ムイオンによる構造変化を認識するか、３）ＴＭの酵素
処理による分子量変化を認識するかを検討し、（７）目
的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
をクローニングすることにより得られる。
【００１１】次に上記各工程について説明する。 （１）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗原
であるＴＭで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞を
取得すればよい。このとき用いる動物としては、マウ
ス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示さ
れ、採取する抗体産生細胞としては、脾臓、リンパ節、
末梢血液等から分離した細胞などが挙げられる。免疫方
法としては、ＴＭを例えばフロイントのコンプリートア
ジュバントに乳濁させて、例えばマウスを用いる場合に
は、これを皮下又は腹腔内に投与し、１〜５週間の間隔
で１〜２０ケ月投与を続けて免疫を完成させる方法の採
用が好ましい。
であるＴＭで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞を
取得すればよい。このとき用いる動物としては、マウ
ス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示さ
れ、採取する抗体産生細胞としては、脾臓、リンパ節、
末梢血液等から分離した細胞などが挙げられる。免疫方
法としては、ＴＭを例えばフロイントのコンプリートア
ジュバントに乳濁させて、例えばマウスを用いる場合に
は、これを皮下又は腹腔内に投与し、１〜５週間の間隔
で１〜２０ケ月投与を続けて免疫を完成させる方法の採
用が好ましい。
【００１２】（２）骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄腫細胞には特に限定はなく、多
くの哺乳動物の細胞株を利用できるが、抗体産生細胞の
調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが
好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合の
骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマだ
けが増殖できるようにすることによって、未融合細胞と
融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗性
を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗
性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有する
ため、好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細
胞株Ｐ３−Ａｇ８−γ、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、ＮＳＩ−Ａｇ４／１、Ｘ６３−
Ａｇ８・６．５．３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＭＰＣ１
１−４５．６ＴＧ１．７、ＦＯ、Ｓ１９４／５ＸＸＯ．
ＢＵ．１等が用いられる。
くの哺乳動物の細胞株を利用できるが、抗体産生細胞の
調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが
好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合の
骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマだ
けが増殖できるようにすることによって、未融合細胞と
融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗性
を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗
性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有する
ため、好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細
胞株Ｐ３−Ａｇ８−γ、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、ＮＳＩ−Ａｇ４／１、Ｘ６３−
Ａｇ８・６．５．３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＭＰＣ１
１−４５．６ＴＧ１．７、ＦＯ、Ｓ１９４／５ＸＸＯ．
ＢＵ．１等が用いられる。
【００１３】（３）細胞融合 細胞融合は、通常ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、
ＩＭＤＭ培地等の培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞を
１０：１〜１：１の混合比で混合することにより行われ
る。このとき融合促進剤として、平均分子量１，０００
〜６，０００のポリエチレングリコールを使用すること
が好ましい。ポリエチレングリコールの使用濃度は通常
３０〜５０％である。
ＩＭＤＭ培地等の培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞を
１０：１〜１：１の混合比で混合することにより行われ
る。このとき融合促進剤として、平均分子量１，０００
〜６，０００のポリエチレングリコールを使用すること
が好ましい。ポリエチレングリコールの使用濃度は通常
３０〜５０％である。
【００１４】（４）ハイブリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、例えばウシ胎仔血清を含有す
るＩＭＤＭ培地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈
渣を選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）に浮遊させ、９６
ウェルのマイクロプレートに分注し、培養を行いハイブ
リドーマのみを生育させる。
るＩＭＤＭ培地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈
渣を選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）に浮遊させ、９６
ウェルのマイクロプレートに分注し、培養を行いハイブ
リドーマのみを生育させる。
【００１５】（５）抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は、常法に従って行えば
よい。例えば、ハイブリドーマの増殖した培養液を採取
し、ＴＭと反応させたのち、酵素、ケイ光物質、発光物
質などでラベルした第２抗体との反応により検索でき
る。
よい。例えば、ハイブリドーマの増殖した培養液を採取
し、ＴＭと反応させたのち、酵素、ケイ光物質、発光物
質などでラベルした第２抗体との反応により検索でき
る。
【００１６】（６）１）ＴＭのトロンビンとの結合部位
の認識；前記（５）で得られる抗原抗体反応物とトロン
ビンとの反応性を検討すればよく、後記の実験１．に従
いＴＭがトロンビンと結合してプロテインＣの活性化を
阻害するか否かによって判定できる。すなわち、活性化
を阻害する場合はモノクローナル抗体がＴＭのトロンビ
ン結合性部位を認識していることを示し、阻害しない場
合は認識していないことを示す。
の認識；前記（５）で得られる抗原抗体反応物とトロン
ビンとの反応性を検討すればよく、後記の実験１．に従
いＴＭがトロンビンと結合してプロテインＣの活性化を
阻害するか否かによって判定できる。すなわち、活性化
を阻害する場合はモノクローナル抗体がＴＭのトロンビ
ン結合性部位を認識していることを示し、阻害しない場
合は認識していないことを示す。
【００１７】２）ＴＭのカルシウムイオンによる構造変
化の認識；後記実験２．に従い、培養液（カルシウムイ
オンが存在している）にＥＤＴＡを加えて、前記（５）
の反応性を検討すればよい。すなわち、抗原抗体反応を
行う場合には構造変化を認識していないことを、反応を
行わないときは認識していることを示す。
化の認識；後記実験２．に従い、培養液（カルシウムイ
オンが存在している）にＥＤＴＡを加えて、前記（５）
の反応性を検討すればよい。すなわち、抗原抗体反応を
行う場合には構造変化を認識していないことを、反応を
行わないときは認識していることを示す。
【００１８】３）ＴＭの酵素処理による分子量変化の認
識；後記実験３．に従い、ＴＭを蛋白分解酵素で処理し
たのち、前記（５）の反応性を検討すればよい。すなわ
ち、抗原抗体反応を行う場合には分子量変化を認識して
いないことを、反応を行わないときは認識していること
を示す。
識；後記実験３．に従い、ＴＭを蛋白分解酵素で処理し
たのち、前記（５）の反応性を検討すればよい。すなわ
ち、抗原抗体反応を行う場合には分子量変化を認識して
いないことを、反応を行わないときは認識していること
を示す。
【００１９】（７）クローニング 抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウェ
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行
い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。以
上の操作によってＴＭに結合する本発明のモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行
い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。以
上の操作によってＴＭに結合する本発明のモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００２０】本発明者は、後記実施例に記載の方法でＴ
Ｍ−Ｈ５４、ＴＭ−Ｈ５９、ＴＭ−Ｈ６０、ＴＭ−Ｈ６
５、ＴＭ−Ｈ７３、ＴＭ−Ｈ９１と名付けたハイブリド
ーマを得た。これらのハイブリドーマはそれぞれＴＭの
特定の部位を認識するモノクローナル抗体を産生する新
規な細胞であるので、これらの細胞について工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託すべく手続を行ったが、６
２微寄文第１１４０号として拒否された。
Ｍ−Ｈ５４、ＴＭ−Ｈ５９、ＴＭ−Ｈ６０、ＴＭ−Ｈ６
５、ＴＭ−Ｈ７３、ＴＭ−Ｈ９１と名付けたハイブリド
ーマを得た。これらのハイブリドーマはそれぞれＴＭの
特定の部位を認識するモノクローナル抗体を産生する新
規な細胞であるので、これらの細胞について工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託すべく手続を行ったが、６
２微寄文第１１４０号として拒否された。
【００２１】叙上の如くして得られたハイブリドーマか
らＴＭの特定の部位を認識するモノクローナル抗体を得
るには、次の如くすれば良い。すなわち、抗体産生ハイ
ブリドーマを適当な培地中で培養し、その培養上清を採
取することにより本発明のモノクローナル抗体を得るこ
とができる。また、モノクローナル抗体を大量に製造す
るのには、用いた骨髄腫細胞の由来動物と同種の動物に
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）などの鉱物油を腹腔内に投与したのち、抗体産
生ハイブリドーマを接種してインビボで抗体産生ハイブ
リドーマを大量に増殖させる方法が用いられる。この方
法によれば、接種した動物の血清及び腹水中に高濃度の
モノクローナル抗体が生ずる。モノクローナル抗体の分
離精製は、通常の血清からの抗体の精製に使用されてい
る方法に従って実施できる。
らＴＭの特定の部位を認識するモノクローナル抗体を得
るには、次の如くすれば良い。すなわち、抗体産生ハイ
ブリドーマを適当な培地中で培養し、その培養上清を採
取することにより本発明のモノクローナル抗体を得るこ
とができる。また、モノクローナル抗体を大量に製造す
るのには、用いた骨髄腫細胞の由来動物と同種の動物に
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）などの鉱物油を腹腔内に投与したのち、抗体産
生ハイブリドーマを接種してインビボで抗体産生ハイブ
リドーマを大量に増殖させる方法が用いられる。この方
法によれば、接種した動物の血清及び腹水中に高濃度の
モノクローナル抗体が生ずる。モノクローナル抗体の分
離精製は、通常の血清からの抗体の精製に使用されてい
る方法に従って実施できる。
【００２２】以上のようにしてＴＭの特定の部位を認識
するモノクローナル抗体が得られるが、該モノクローナ
ル抗体の性質は、使用するハイブリドーマの種類により
若干異なる。これは、同一のＴＭであっても抗体産生細
胞が認識し得る部位が異なるためと解される。
するモノクローナル抗体が得られるが、該モノクローナ
ル抗体の性質は、使用するハイブリドーマの種類により
若干異なる。これは、同一のＴＭであっても抗体産生細
胞が認識し得る部位が異なるためと解される。
【００２３】以下に本発明者が前記ハイブリドーマから
調製したモノクローナル抗体ＴＭ−Ａ５４、ＴＭ−Ａ５
９、ＴＭ−Ａ６０、ＴＭ−Ａ６５、ＴＭ−Ａ７３、及び
ＴＭ−Ａ９１の有する性質を示す。なお、分子量はＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、等電点
は等電点電気泳動法（ＬＫＢ−等電点電気泳動装置）に
より、免疫グロブリンサブクラスはオクタローニの二重
免疫拡散法〔ウサギポリクローナル抗体（マイルズ社
製）使用〕により測定した。
調製したモノクローナル抗体ＴＭ−Ａ５４、ＴＭ−Ａ５
９、ＴＭ−Ａ６０、ＴＭ−Ａ６５、ＴＭ−Ａ７３、及び
ＴＭ−Ａ９１の有する性質を示す。なお、分子量はＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、等電点
は等電点電気泳動法（ＬＫＢ−等電点電気泳動装置）に
より、免疫グロブリンサブクラスはオクタローニの二重
免疫拡散法〔ウサギポリクローナル抗体（マイルズ社
製）使用〕により測定した。
【００２４】ＴＭ−Ａ５４ （ａ）分子量；１７５，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ1 （ｃ）等電点；pH７．２−７．７ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識する。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 ＴＭはＣａ2+イオンと結合する事が知られているが、Ｔ
Ｍ−Ａ５４はＣａ2+イオンによるＴＭの構造の変化を認
識するので、この抗体を用いることにより、例えば先天
性遺伝子病、その他の病態によりＣａ2+イオンとの結合
部位が傷害を受けた様なＴＭを正常なＴＭと区別する事
ができる。
を認識する。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 ＴＭはＣａ2+イオンと結合する事が知られているが、Ｔ
Ｍ−Ａ５４はＣａ2+イオンによるＴＭの構造の変化を認
識するので、この抗体を用いることにより、例えば先天
性遺伝子病、その他の病態によりＣａ2+イオンとの結合
部位が傷害を受けた様なＴＭを正常なＴＭと区別する事
ができる。
【００２５】ＴＭ−Ａ５９ （ａ）分子量；１９０，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ1 （ｃ）等電点；pH７．１−７．６ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 ＴＭのＣａ2+イオン結合による変化に全く影響を受け
ず、かつエラスターゼ等の酵素処理ＴＭにも反応するこ
とから、例えば遺伝子病等により、ＴＭとしての活性を
持たないもの、あるいは、血中プロテアーゼ活性が異常
に亢進し、ＴＭが分解を受けたものについても本抗体に
より認識する事ができる。
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 ＴＭのＣａ2+イオン結合による変化に全く影響を受け
ず、かつエラスターゼ等の酵素処理ＴＭにも反応するこ
とから、例えば遺伝子病等により、ＴＭとしての活性を
持たないもの、あるいは、血中プロテアーゼ活性が異常
に亢進し、ＴＭが分解を受けたものについても本抗体に
より認識する事ができる。
【００２６】ＴＭ−Ａ６０ （ａ）分子量；１８０，０００±８，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ1 （ｃ）等電点；pH７．９−９．２ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識する。 本抗体は、酵素処理により、低分子化したＴＭとは反応
しないことから、例えば、内皮細胞の損傷を供う疾患で
ある播種性血管内凝固症（ＤＩＣ）、肺がん等の患者に
存在し、正常人には存在しない高分子ＴＭのみを検出す
ることができる。
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識する。 本抗体は、酵素処理により、低分子化したＴＭとは反応
しないことから、例えば、内皮細胞の損傷を供う疾患で
ある播種性血管内凝固症（ＤＩＣ）、肺がん等の患者に
存在し、正常人には存在しない高分子ＴＭのみを検出す
ることができる。
【００２７】ＴＭ−Ａ６５ （ａ）分子量；１９０，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ1 （ｃ）等電点；pH７．０−７．５ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 この抗体は、ＴＭ−Ａ５９とほぼ同じように用いること
ができる。
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 この抗体は、ＴＭ−Ａ５９とほぼ同じように用いること
ができる。
【００２８】ＴＭ−Ａ７３ （ａ）分子量；２００，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ1 （ｃ）等電点；pH７．０−７．５ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識する。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 この抗体は、ＴＭ−Ａ５４とほぼ同様に用いることがで
きる。
を認識する。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 この抗体は、ＴＭ−Ａ５４とほぼ同様に用いることがで
きる。
【００２９】ＴＭ−Ａ９１ （ａ）分子量；１９５，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ1 （ｃ）等電点；pH７．０−７．４ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 本抗体は、ＴＭのＣａ2+イオンとの結合による変化を認
識するので、例えば遺伝子疾患、又は酵素等により、Ｃ
ａ2+と結合する部位が失われたＴＭを正常なものと区別
する事ができる。
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。 本抗体は、ＴＭのＣａ2+イオンとの結合による変化を認
識するので、例えば遺伝子疾患、又は酵素等により、Ｃ
ａ2+と結合する部位が失われたＴＭを正常なものと区別
する事ができる。
【００３０】本発明モノクローナル抗体を免疫吸着剤と
して利用することによって、ＴＭを精製する方法は、例
えば本発明モノクローナル抗体をデキストランゲル、ア
ガロースゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合さ
せ、該モノクローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として
用い、カラムクロマトグラフィーに付すことにより実施
される。不溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、
ブロムシアン法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、若
しくはホルミル基等を介して結合させることができる。
このモノクローナル抗体結合不溶性担体からなるカラム
に粗ＴＭを添加し、カラムに吸着したＴＭを溶出させる
ことにより高純度のＴＭが得られる。
して利用することによって、ＴＭを精製する方法は、例
えば本発明モノクローナル抗体をデキストランゲル、ア
ガロースゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合さ
せ、該モノクローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として
用い、カラムクロマトグラフィーに付すことにより実施
される。不溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、
ブロムシアン法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、若
しくはホルミル基等を介して結合させることができる。
このモノクローナル抗体結合不溶性担体からなるカラム
に粗ＴＭを添加し、カラムに吸着したＴＭを溶出させる
ことにより高純度のＴＭが得られる。
【００３１】本発明モノクローナル抗体の標識体を利用
するＴＭの免疫測定法は、例えば本発明モノクローナル
抗体を酵素、各種のアイソトープ、蛍光物質等の標識剤
で標識し、これにＴＭを含む試料を加え、ＴＭと標識体
との免疫反応生成物の標識量を測定することによって実
施される。また一般的な方法としてＥＬＩＳＡ法を用い
ることもできる。
するＴＭの免疫測定法は、例えば本発明モノクローナル
抗体を酵素、各種のアイソトープ、蛍光物質等の標識剤
で標識し、これにＴＭを含む試料を加え、ＴＭと標識体
との免疫反応生成物の標識量を測定することによって実
施される。また一般的な方法としてＥＬＩＳＡ法を用い
ることもできる。
【００３２】
【発明の効果】本発明のハイブリドーマは、ＴＭの特定
の部位を認識するモノクローナル抗体を産生する。そし
てこのモノクローナル抗体は前記のヒト胎盤由来のＴＭ
の他、ヒト尿由来のＴＭ、ヒト血漿由来のＴＭ、ヒト肺
由来のＴＭ等とも特異的に結合するので、これを用いれ
ば、各種ＴＭの分離精製工程を短縮でき、極めて高純度
のＴＭを高回収率で得ることができる。更に、モノクロ
ーナル抗体と結合させた不溶性担体は、洗浄すれば再使
用可能であり、精製工程の短縮だけでなく経済的である
ことから工業的に極めて有用である。また、本発明の抗
ＴＭモノクローナル抗体は、血液の凝固線溶系の異常疾
患の治療におけるＴＭの免疫定量に使用できる。
の部位を認識するモノクローナル抗体を産生する。そし
てこのモノクローナル抗体は前記のヒト胎盤由来のＴＭ
の他、ヒト尿由来のＴＭ、ヒト血漿由来のＴＭ、ヒト肺
由来のＴＭ等とも特異的に結合するので、これを用いれ
ば、各種ＴＭの分離精製工程を短縮でき、極めて高純度
のＴＭを高回収率で得ることができる。更に、モノクロ
ーナル抗体と結合させた不溶性担体は、洗浄すれば再使
用可能であり、精製工程の短縮だけでなく経済的である
ことから工業的に極めて有用である。また、本発明の抗
ＴＭモノクローナル抗体は、血液の凝固線溶系の異常疾
患の治療におけるＴＭの免疫定量に使用できる。
【００３３】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明
する。
する。
【００３４】実施例１ 抗ＴＭモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造： （１）免疫脾細胞の調製 ヒトの胎盤より抽出、精製したＴＭ（分子量７１，００
０）２０μg をフロイント・コンプリート・アジュバン
トに乳濁化させ、雄性のＢＡＬＢ／ｃ系マウスの皮下内
に投与した。以後２〜４週間の間隔で１０ケ月間２０〜
１００μg のＴＭを腹腔内に投与し、最後に１００μg
を静脈内に投与した。
０）２０μg をフロイント・コンプリート・アジュバン
トに乳濁化させ、雄性のＢＡＬＢ／ｃ系マウスの皮下内
に投与した。以後２〜４週間の間隔で１０ケ月間２０〜
１００μg のＴＭを腹腔内に投与し、最後に１００μg
を静脈内に投与した。
【００３５】３日後にマウスから脾臓を取り出し、ＩＭ
ＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）中で脾臓細胞をほぐし、
１００メッシュの網を通過した単細胞を得、これに低張
液（１５５mM塩化アンモニウム）を加えて赤血球を溶血
したのちＩＭＤＭで細胞を３回洗浄した。
ＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）中で脾臓細胞をほぐし、
１００メッシュの網を通過した単細胞を得、これに低張
液（１５５mM塩化アンモニウム）を加えて赤血球を溶血
したのちＩＭＤＭで細胞を３回洗浄した。
【００３６】（２）骨髄腫細胞の調製 マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−Ａｇ８−γ）の細胞をＩＭＤ
Ｍにウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を１０％加えた培地中で培
養した。３日間隔の継代培養を行い、融合の前日に新鮮
な培地に交換して生存率が９０％以上の細胞をＩＭＤＭ
で３回洗浄した。
Ｍにウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を１０％加えた培地中で培
養した。３日間隔の継代培養を行い、融合の前日に新鮮
な培地に交換して生存率が９０％以上の細胞をＩＭＤＭ
で３回洗浄した。
【００３７】（３）細胞融合 （１）及び（２）で調製された両細胞数を計測し、脾細
胞と骨髄腫細胞を３：１の割合に混合して遠心した。上
清を捨て、細胞沈渣を充分解きほぐしたのち、５０％ポ
リエチレングリコール１５００を１ml滴下して融合を行
った。室温で３０秒間放置したのち、ＩＭＤＭ１mlを１
分間かけて滴下し、次いで１０mlを５分間かけて滴下し
ながら緩やかに混合した。最終５０mlにして、１，００
０rpm で８分間遠心した。
胞と骨髄腫細胞を３：１の割合に混合して遠心した。上
清を捨て、細胞沈渣を充分解きほぐしたのち、５０％ポ
リエチレングリコール１５００を１ml滴下して融合を行
った。室温で３０秒間放置したのち、ＩＭＤＭ１mlを１
分間かけて滴下し、次いで１０mlを５分間かけて滴下し
ながら緩やかに混合した。最終５０mlにして、１，００
０rpm で８分間遠心した。
【００３８】（４）ハイブリドーマの選択的増殖 上記の沈渣を１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭに浮遊させ、再
度遠心し、上清液を捨てたのち、ＨＡＴ含有１０％ＦＣ
Ｓ添加ＩＭＤＭに細胞を３×１０5 ／ml浮遊させて９６
ウェルのマイクロプレートに１００μl ずつ分注した。
３〜４日ごとに培地を５０μl 追加し、この培地の選択
によりハイブリドーマのみを増殖させた。
度遠心し、上清液を捨てたのち、ＨＡＴ含有１０％ＦＣ
Ｓ添加ＩＭＤＭに細胞を３×１０5 ／ml浮遊させて９６
ウェルのマイクロプレートに１００μl ずつ分注した。
３〜４日ごとに培地を５０μl 追加し、この培地の選択
によりハイブリドーマのみを増殖させた。
【００３９】（５）抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウェルの培養液を採取し、酵
素免疫法によりＴＭに対する抗体を産生しているウェル
を検索した。すなわち、９６ウェルのマイクロプレート
にＴＭを０．５μg ／１００μl ／well分注し、４℃で
１８時間静置して吸着させた。次いで検体である培養液
を１００μl ／well分注し、２５℃で２時間反応させ
た。０．０５％ツィーン(Tween) ２０を含むリン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ−Tween ）で３回洗浄後、西洋ワサビ−
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧを
１００μl ／well加え、２時間後ＰＢＳ−Tween で３回
洗浄した。これに、過酸化水素０．００１％及びオルト
フェニレンジアミン０．４mg／mlを含有する０．１Ｍク
エン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH４．０）を加え、
２５℃で３０分間反応させた後、４．５Ｍ硫酸５０μl
／wellを加え、波長４９２nmの吸光度を測定した。
素免疫法によりＴＭに対する抗体を産生しているウェル
を検索した。すなわち、９６ウェルのマイクロプレート
にＴＭを０．５μg ／１００μl ／well分注し、４℃で
１８時間静置して吸着させた。次いで検体である培養液
を１００μl ／well分注し、２５℃で２時間反応させ
た。０．０５％ツィーン(Tween) ２０を含むリン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ−Tween ）で３回洗浄後、西洋ワサビ−
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧを
１００μl ／well加え、２時間後ＰＢＳ−Tween で３回
洗浄した。これに、過酸化水素０．００１％及びオルト
フェニレンジアミン０．４mg／mlを含有する０．１Ｍク
エン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH４．０）を加え、
２５℃で３０分間反応させた後、４．５Ｍ硫酸５０μl
／wellを加え、波長４９２nmの吸光度を測定した。
【００４０】（６）目的モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマの選択 発色したウェルの培養液を用い、以下の実験１、２及び
３を行った。
リドーマの選択 発色したウェルの培養液を用い、以下の実験１、２及び
３を行った。
【００４１】実験１． プロテインＣの活性化能阻害作用：ヒト−胎盤由来のＴ
Ｍを０．１Ｍ塩化ナトリウム及び０．１％ルブロールを
含有する０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６）に
溶解（２００μg ／ml）し、その１０μl 及びハイブリ
ドーマの培養液１０μl とを合し、３７℃で１時間イン
キュベートした。上記の反応液にヒト−プロテインＣの
０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び５mM塩化カルシウムを含
有する０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液溶液（pH７．５）
３０μl及びウシ−トロンビンの上記緩衝液溶液（５Ｕ
／ml）５０μl を加え、３７℃で３０分間インキュベー
トしたのち、ヒト−アンチトロンビンIII の０．１５Ｍ
塩化ナトリウムを含有する０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝
液溶液（２Ｕ／ml）１００μl を加えて３７℃で１０分
間インキュベートし、次いで上と同じ緩衝液に溶解
（０．２mM）したＭＣＡ基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇのメチルクマリンアミド）２００μl
を加えて３７℃で１０分間インキュベートした。これに
２０％酢酸６００μl を加え、生じたＡＭＣ（７−アミ
ノ−４−メチルクマリン）の濃度を蛍光光度計で測定し
た。対照として市販正常マウスＩｇＧを用い、その測定
値との差のあるものは阻害作用のあるもの（すなわちト
ロンビンとの結合部位を認識）とした。
Ｍを０．１Ｍ塩化ナトリウム及び０．１％ルブロールを
含有する０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６）に
溶解（２００μg ／ml）し、その１０μl 及びハイブリ
ドーマの培養液１０μl とを合し、３７℃で１時間イン
キュベートした。上記の反応液にヒト−プロテインＣの
０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び５mM塩化カルシウムを含
有する０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液溶液（pH７．５）
３０μl及びウシ−トロンビンの上記緩衝液溶液（５Ｕ
／ml）５０μl を加え、３７℃で３０分間インキュベー
トしたのち、ヒト−アンチトロンビンIII の０．１５Ｍ
塩化ナトリウムを含有する０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝
液溶液（２Ｕ／ml）１００μl を加えて３７℃で１０分
間インキュベートし、次いで上と同じ緩衝液に溶解
（０．２mM）したＭＣＡ基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇのメチルクマリンアミド）２００μl
を加えて３７℃で１０分間インキュベートした。これに
２０％酢酸６００μl を加え、生じたＡＭＣ（７−アミ
ノ−４−メチルクマリン）の濃度を蛍光光度計で測定し
た。対照として市販正常マウスＩｇＧを用い、その測定
値との差のあるものは阻害作用のあるもの（すなわちト
ロンビンとの結合部位を認識）とした。
【００４２】実験２． Ｃａ2+イオンの影響：９６ウェル平底マイクロプレート
にヒト−胎盤由来のＴＭ（１０００倍希釈）をコーティ
ングし、ハイブリドーマの培養液を１０mM ＥＤＴＡを
含有するＰＢＳ−Tween と１：１に混合したもの１００
μl を加え、２５℃で２時間インキュベートした。これ
をＰＢＳ−Tween で洗浄したのち、ＨＲＰで標識した羊
−抗マウスＩｇＧのＰＢＳ−Tween 溶液を加え、２５℃
で２時間インキュベートした。これをＰＢＳ−Tween で
洗浄したのち、基質溶液（オルトフェニレンジアミン
０．４mg／ml及び０．０１％過酸化水素の０．１Ｍクエ
ン酸緩衝液、pH５．０）を１００μl加え、２５℃で３
０分間インキュベートした。これに４．５Ｍ硫酸５０μ
l を加え反応を停止させたのち、４９２nmにおける吸光
度を測定した。この値と前記実施例１（５）で求めた値
とに差があるものはカルシウムイオンの影響を受けるも
の（すなわち、カルシウムイオンによる構造変化認識）
とした。
にヒト−胎盤由来のＴＭ（１０００倍希釈）をコーティ
ングし、ハイブリドーマの培養液を１０mM ＥＤＴＡを
含有するＰＢＳ−Tween と１：１に混合したもの１００
μl を加え、２５℃で２時間インキュベートした。これ
をＰＢＳ−Tween で洗浄したのち、ＨＲＰで標識した羊
−抗マウスＩｇＧのＰＢＳ−Tween 溶液を加え、２５℃
で２時間インキュベートした。これをＰＢＳ−Tween で
洗浄したのち、基質溶液（オルトフェニレンジアミン
０．４mg／ml及び０．０１％過酸化水素の０．１Ｍクエ
ン酸緩衝液、pH５．０）を１００μl加え、２５℃で３
０分間インキュベートした。これに４．５Ｍ硫酸５０μ
l を加え反応を停止させたのち、４９２nmにおける吸光
度を測定した。この値と前記実施例１（５）で求めた値
とに差があるものはカルシウムイオンの影響を受けるも
の（すなわち、カルシウムイオンによる構造変化認識）
とした。
【００４３】実験３． 酵素処理したＴＭとの反応：ヒト胎盤由来のＴＭのトリ
ス塩酸緩衝食塩水（以下「ＴＢＳ」とする）溶液（１mg
／ml）１０μl とトリプシン（シグマ社製TypeXIII）の
ＴＢＳ溶液（１００μg ／ml）又はエラスターゼ（ブタ
由来；シグマ社製）のＴＢＳ溶液（２mg／ml）１０μl
とを３７℃で３０分間反応させた。これをレムリー法に
よりＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド濃度：１０％）
を行い、次いでウェスタンブロッティングを行った。ニ
トロセルロース膜とハイブリドーマの培養液を０．０５
％Tween ２０を含むトリス緩衝食塩水（pH７．６；以下
「ＴＢＳ−Tween 」とする。）で１０倍希釈した溶液と
を２５℃で３時間反応させた。これをＴＢＳ−Tween で
洗浄したのち、ＨＲＰで標識した羊−抗マウスＩｇＧの
ＴＢＳ−Tween 溶液を加え、２５℃で３時間反応させ
た。これをＴＢＳ−Tween で洗浄したのち、３０mgの４
−クロロ−１−ナフトールを含むメタノール１０ml及び
３０％過酸化水素３０μl のＴＢＳ５０ml溶液中で発色
させた。発色したものは酵素処理したＴＭと反応した
（分子量変化を認識しない）ものとした。
ス塩酸緩衝食塩水（以下「ＴＢＳ」とする）溶液（１mg
／ml）１０μl とトリプシン（シグマ社製TypeXIII）の
ＴＢＳ溶液（１００μg ／ml）又はエラスターゼ（ブタ
由来；シグマ社製）のＴＢＳ溶液（２mg／ml）１０μl
とを３７℃で３０分間反応させた。これをレムリー法に
よりＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド濃度：１０％）
を行い、次いでウェスタンブロッティングを行った。ニ
トロセルロース膜とハイブリドーマの培養液を０．０５
％Tween ２０を含むトリス緩衝食塩水（pH７．６；以下
「ＴＢＳ−Tween 」とする。）で１０倍希釈した溶液と
を２５℃で３時間反応させた。これをＴＢＳ−Tween で
洗浄したのち、ＨＲＰで標識した羊−抗マウスＩｇＧの
ＴＢＳ−Tween 溶液を加え、２５℃で３時間反応させ
た。これをＴＢＳ−Tween で洗浄したのち、３０mgの４
−クロロ−１−ナフトールを含むメタノール１０ml及び
３０％過酸化水素３０μl のＴＢＳ５０ml溶液中で発色
させた。発色したものは酵素処理したＴＭと反応した
（分子量変化を認識しない）ものとした。
【００４４】以上の実験結果により、下記の６種のハイ
ブリドーマを選択した。 ＴＭ−Ｈ５４ 実験１：阻害作用あり。 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ５９ 実験１：阻害作用なし。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６９７） 実験２：影響を受けない。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ６０ 実験１：阻害作用なし。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６９８） 実験２：影響を受けない。 実験３：反応しない。 ＴＭ−Ｈ６５ 実験１：阻害作用なし。 実験２：影響を受けない。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ７３ 実験１：阻害作用あり。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６９９） 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ９１ 実験１：阻害作用なし。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１７００） 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。
ブリドーマを選択した。 ＴＭ−Ｈ５４ 実験１：阻害作用あり。 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ５９ 実験１：阻害作用なし。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６９７） 実験２：影響を受けない。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ６０ 実験１：阻害作用なし。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６９８） 実験２：影響を受けない。 実験３：反応しない。 ＴＭ−Ｈ６５ 実験１：阻害作用なし。 実験２：影響を受けない。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ７３ 実験１：阻害作用あり。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６９９） 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。 ＴＭ−Ｈ９１ 実験１：阻害作用なし。 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１７００） 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。
【００４５】（７）モノクローナル抗体産生細胞のクロ
ーニング：正常マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取
した腹腔細胞をフィーダー細胞として使用した。この腹
腔細胞を１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭに浮遊させ（１×１
０ 5 個／ml）、９６ウェルのマイクロプレートに５０μ
l ずつ分注した。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個
／mlに調製し、各ウェルに１００μl ずつ分注した。３
日ごとに培地を追加又は交換して、細胞が増殖したウェ
ルから順に培養上清を採取し、上記と同一の方法で抗体
の産生を確認した。陽性のウェルは再度クローニングし
て抗ＴＭモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得
た。
ーニング：正常マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取
した腹腔細胞をフィーダー細胞として使用した。この腹
腔細胞を１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭに浮遊させ（１×１
０ 5 個／ml）、９６ウェルのマイクロプレートに５０μ
l ずつ分注した。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個
／mlに調製し、各ウェルに１００μl ずつ分注した。３
日ごとに培地を追加又は交換して、細胞が増殖したウェ
ルから順に培養上清を採取し、上記と同一の方法で抗体
の産生を確認した。陽性のウェルは再度クローニングし
て抗ＴＭモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得
た。
【００４６】実施例２ 抗ＴＭモノクローナル抗体の製造：７週令以上のＢＡＬ
Ｂ／ｃ系マウスにプリスタン０．５mlを腹腔内投与し、
約１週間後、上記で得たハイブリドーマ１×１０6 個／
マウスを腹腔内に接種した。約１０日後、マウスの腹水
を採取し、３，０００rpm で１０分間遠心し、上清を分
取した。この上清液４．８mlに等量の３Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する１．５Ｍグリシン緩衝液（pH８．９）を加
え、この緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロース
ＣＬ−４Ｂ ５mlのカラムに付し、この緩衝液で充分洗
浄したのち、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH４．０）で溶出
した。溶出液は１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）１
mlを入れた試験管内に３mlずつ分取した。Ａ280 を測定
して蛋白分画を集め、これを水に対して透析したのち凍
結乾燥して抗ＴＭモノクローナル抗体を得た。ハイブリ
ドーマとしてＴＭ−Ｈ５４を用いた場合は、ＴＭ−Ａ５
４が３０mg、ＴＭ−Ｈ５９を用いた場合は、ＴＭ−Ａ５
９が６０mg、ＴＭ−Ｈ６０を用いた場合はＴＭ−Ａ６０
が３０mg、ＴＭ−Ｈ６５を用いた場合はＴＭ−Ａ６５が
３０mg、ＴＭ−Ｈ７３を用いた場合はＴＭ−Ａ７３が１
８mg、ＴＭ−Ｈ９１を用いた場合はＴＭ−Ａ９１が６mg
得られた。これらの抗ＴＭモノクローナル抗体は前記の
性質を示した。
Ｂ／ｃ系マウスにプリスタン０．５mlを腹腔内投与し、
約１週間後、上記で得たハイブリドーマ１×１０6 個／
マウスを腹腔内に接種した。約１０日後、マウスの腹水
を採取し、３，０００rpm で１０分間遠心し、上清を分
取した。この上清液４．８mlに等量の３Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する１．５Ｍグリシン緩衝液（pH８．９）を加
え、この緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロース
ＣＬ−４Ｂ ５mlのカラムに付し、この緩衝液で充分洗
浄したのち、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH４．０）で溶出
した。溶出液は１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）１
mlを入れた試験管内に３mlずつ分取した。Ａ280 を測定
して蛋白分画を集め、これを水に対して透析したのち凍
結乾燥して抗ＴＭモノクローナル抗体を得た。ハイブリ
ドーマとしてＴＭ−Ｈ５４を用いた場合は、ＴＭ−Ａ５
４が３０mg、ＴＭ−Ｈ５９を用いた場合は、ＴＭ−Ａ５
９が６０mg、ＴＭ−Ｈ６０を用いた場合はＴＭ−Ａ６０
が３０mg、ＴＭ−Ｈ６５を用いた場合はＴＭ−Ａ６５が
３０mg、ＴＭ−Ｈ７３を用いた場合はＴＭ−Ａ７３が１
８mg、ＴＭ−Ｈ９１を用いた場合はＴＭ−Ａ９１が６mg
得られた。これらの抗ＴＭモノクローナル抗体は前記の
性質を示した。
【００４７】実施例３ 免疫吸着クロマトグラフィーによるＴＭの精製 （１）抗体カラムの製造 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ ３ｇを１mM塩酸
及び０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（pH８．３）で順次洗浄したのち、この
緩衝液の８ml溶液とした。これに実施例２で得られるモ
ノクローナル抗体ＴＭ−Ａ５９を２０mg加え、室温で２
時間振盪して、グラスフィルターで脱水した。更に、１
Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）４０mlを加えて２時
間振盪したのちグラスフィルターで脱水後、０．１Ｍ酢
酸緩衝液（pH４．０）４０mlを加え、グラスフィルター
で脱水した。得られた抗体結合セファロースを０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍ塩酸緩衝液（pH８．
３）及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍ酢
酸緩衝液（pH４．０）で交互に３回洗浄し、１Ｍ塩化ナ
トリウム及び０．０５％ルブロールを含有する０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ＴＢＳルブロール；pH７．６）で
平衡化して抗体カラムＮｏ．５９を得た。同様にＴＭ−
Ａ６０及びＴＭ−Ａ６５を用いて抗体カラムＮｏ．６０
及び抗体カラムＮｏ．６５を製造した。
及び０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（pH８．３）で順次洗浄したのち、この
緩衝液の８ml溶液とした。これに実施例２で得られるモ
ノクローナル抗体ＴＭ−Ａ５９を２０mg加え、室温で２
時間振盪して、グラスフィルターで脱水した。更に、１
Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）４０mlを加えて２時
間振盪したのちグラスフィルターで脱水後、０．１Ｍ酢
酸緩衝液（pH４．０）４０mlを加え、グラスフィルター
で脱水した。得られた抗体結合セファロースを０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍ塩酸緩衝液（pH８．
３）及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍ酢
酸緩衝液（pH４．０）で交互に３回洗浄し、１Ｍ塩化ナ
トリウム及び０．０５％ルブロールを含有する０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ＴＢＳルブロール；pH７．６）で
平衡化して抗体カラムＮｏ．５９を得た。同様にＴＭ−
Ａ６０及びＴＭ−Ａ６５を用いて抗体カラムＮｏ．６０
及び抗体カラムＮｏ．６５を製造した。
【００４８】（２）抗体カラムによるＴＭの精製 上記で製造した抗体カラムに、ヒト−胎盤より抽出した
ＴＭ１０μg を含むＴＢＳルブロール５００μl をか
け、平衡化に用いたＴＢＳルブロール緩衝液４mlで洗浄
した。これを１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ルブロール
及び２Ｍチオシアン酸カリウムを含有する０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（pH７．６）４mlで溶出した。抗体カ
ラムＮｏ．５９、Ｎｏ．６０及びＮｏ．６５を用いたと
きのＴＭの回収量を実施例４に記載の方法で測定した結
果は表１に示すとおりである。
ＴＭ１０μg を含むＴＢＳルブロール５００μl をか
け、平衡化に用いたＴＢＳルブロール緩衝液４mlで洗浄
した。これを１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ルブロール
及び２Ｍチオシアン酸カリウムを含有する０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（pH７．６）４mlで溶出した。抗体カ
ラムＮｏ．５９、Ｎｏ．６０及びＮｏ．６５を用いたと
きのＴＭの回収量を実施例４に記載の方法で測定した結
果は表１に示すとおりである。
【００４９】
【表１】
【００５０】実施例４ 抗ＴＭモノクローナル抗体を用いるＴＭの測定：Ｓ．ヨ
シタケらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２ １４１３
〜１４２４（１９８２）〕に準じてＨＲＰを抗ＴＭモノ
クローナル抗体に結合させた。このＨＲＰ標識抗ＴＭモ
ノクローナル抗体を用いて、以下の如くＥＬＩＳＡ法に
よりＴＭの測定を行った。
シタケらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２ １４１３
〜１４２４（１９８２）〕に準じてＨＲＰを抗ＴＭモノ
クローナル抗体に結合させた。このＨＲＰ標識抗ＴＭモ
ノクローナル抗体を用いて、以下の如くＥＬＩＳＡ法に
よりＴＭの測定を行った。
【００５１】０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH９．
６）にコーティング用モノクローナル抗体を４０μg ／
ml溶解し、これを９６ウェル平底マイクロプレートに１
００μl ずつ注入し、２５℃で２時間コーティングし
た。０．０５％Tween ２０を含むトリス−塩酸緩衝食塩
水で洗浄後、試料を５mM塩化カルシウムを含むＴＢＳ−
Tween に溶解して１００μl ずつ加え、２５℃で１８時
間反応させた。ＴＢＳ−Tween で洗浄後、ＨＲＰ標識モ
ノクローナル抗体を５mM塩化カルシウムを含むＴＢＳ−
Tween で希釈して１００μl ずつ加え、２５℃で４時間
反応させた。ＴＢＳ−Tween で洗浄後、基質溶液（オル
トフェニレンジアミン０．４mg／ml及び０．０１％過酸
化水素の０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、pH５．０）を
１００μl添加し、２５℃で６０分間反応させた。４．
５Ｍ硫酸５０μl を加えて反応を停止させた後、４９２
nmにおける吸光度を測定した。
６）にコーティング用モノクローナル抗体を４０μg ／
ml溶解し、これを９６ウェル平底マイクロプレートに１
００μl ずつ注入し、２５℃で２時間コーティングし
た。０．０５％Tween ２０を含むトリス−塩酸緩衝食塩
水で洗浄後、試料を５mM塩化カルシウムを含むＴＢＳ−
Tween に溶解して１００μl ずつ加え、２５℃で１８時
間反応させた。ＴＢＳ−Tween で洗浄後、ＨＲＰ標識モ
ノクローナル抗体を５mM塩化カルシウムを含むＴＢＳ−
Tween で希釈して１００μl ずつ加え、２５℃で４時間
反応させた。ＴＢＳ−Tween で洗浄後、基質溶液（オル
トフェニレンジアミン０．４mg／ml及び０．０１％過酸
化水素の０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、pH５．０）を
１００μl添加し、２５℃で６０分間反応させた。４．
５Ｍ硫酸５０μl を加えて反応を停止させた後、４９２
nmにおける吸光度を測定した。
【００５２】コーティング用モノクローナル抗体として
ＴＭ−Ａ５９を用い、標識用モノクローナル抗体として
ＴＭ−Ａ７３を用いた場合の検量線を図１に、コーティ
ング用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ６０を用い、
標識用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ７３を用いた
場合の検量線を図２に、コーティング用モノクローナル
抗体としてＴＭ−Ａ５９を用い、標識用モノクローナル
抗体としてＴＭ−Ａ９１を用いた場合の検量線を図３に
コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ５９
を用い、標識用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ６０
を用いた場合の検量線を図４に示した。これらは何れも
極めて感度が高く、しかも良好な直線性を示しており、
０．８〜５０ng／mlの範囲のＴＭを検出することがわか
る。
ＴＭ−Ａ５９を用い、標識用モノクローナル抗体として
ＴＭ−Ａ７３を用いた場合の検量線を図１に、コーティ
ング用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ６０を用い、
標識用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ７３を用いた
場合の検量線を図２に、コーティング用モノクローナル
抗体としてＴＭ−Ａ５９を用い、標識用モノクローナル
抗体としてＴＭ−Ａ９１を用いた場合の検量線を図３に
コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ５９
を用い、標識用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ６０
を用いた場合の検量線を図４に示した。これらは何れも
極めて感度が高く、しかも良好な直線性を示しており、
０．８〜５０ng／mlの範囲のＴＭを検出することがわか
る。
【００５３】ＤＩＣ患者血清及び正常人血清を用いて上
記方法によって血清中のＴＭ量を測定したところ、上記
の何れの測定系を用いても、ＤＩＣ患者の血清中に、正
常人の血清中の約１．５倍のＴＭが認められた。
記方法によって血清中のＴＭ量を測定したところ、上記
の何れの測定系を用いても、ＤＩＣ患者の血清中に、正
常人の血清中の約１．５倍のＴＭが認められた。
【図１】コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ５９を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ７３を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
−Ａ５９を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ７３を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
【図２】コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ６０を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ７３を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
−Ａ６０を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ７３を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
【図３】コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ５９を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ９１を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
−Ａ５９を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ９１を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
【図４】コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ５９を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ６０を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
−Ａ５９を使用し、標識用モノクローナル抗体としてＴ
Ｍ−Ａ６０を使用した場合のＴＭ濃度と吸光度との関係
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 トロンビンと結合してプロテインＣの活
性化を特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物
質で免疫したマウスの脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞と
を融合することにより得られる、トロンビン結合性物質
に結合し、次の性質（ａ）〜（ｆ）を有するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマＴＭ−Ｈ６０。 （ａ）分子量；１８０，０００±８，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ1 （ｃ）等電点；pH７．９−９．２ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識する。 - 【請求項２】 トロンビンと結合してプロテインＣの活
性化を特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物
質で免疫したマウスの脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞と
を融合し、得られるハイブリドーマを選択的に増殖さ
せ、その培養液をトロンビン結合性物質と反応させ、抗
原抗体反応を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、次いで上記抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、
ＥＤＴＡの存在下における上記抗原抗体反応及び予め蛋
白分解酵素で処理したトロンビン結合性物質との抗原抗
体反応をそれぞれ行い、抗原抗体反応物がトロンビンと
結合し、ＥＤＴＡの存在下で抗原抗体反応を示し、酵素
処理したトロンビン結合性物質と反応しない抗体を産生
するものとして選択されるものである特許請求の範囲第
１項記載のハイブリドーマＴＭ−Ｈ６０。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62202517A JPS6445398A (en) | 1987-08-13 | 1987-08-13 | Antithrombin-binding substance monoclonal antibody, hybridoma producing said antibody and method for purifying and measuring thrombin-binding substance utilizing said monoclonal antibody |
| KR1019880008803A KR960002740B1 (ko) | 1987-08-13 | 1988-07-15 | 안티-트롬빈-결합물질 모노클로날 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 이용한 트롬빈-결합물질의 정제법 및 측정법 |
| CA000572523A CA1335180C (en) | 1987-08-13 | 1988-07-20 | Anti-thrombin-binding substance monoclonal antibodies, hybridomas producing same, as well as purification process and assay of thrombin-binding substance making use of said monoclonal antibodies |
| DE3888604T DE3888604T2 (de) | 1987-08-13 | 1988-07-26 | Monoklonale Antikörper gegen Antithrombinbindende Substanz und seine Verwendungen. |
| EP88112047A EP0306680B1 (en) | 1987-08-13 | 1988-07-26 | Monoclonal antibodies to anti-thrombin binding substance, and their uses |
| ES88112047T ES2053637T3 (es) | 1987-08-13 | 1988-07-26 | Anticuerpos monoclonales de sustancia que enlaza antitrombina y sus usos. |
| US07/560,275 US5098829A (en) | 1987-08-13 | 1990-07-30 | Anti-thrombin-binding substance monoclonal antibodies, hybridomas producing same, as well as purification process and assay of thrombin-binding substance making use of said monoclonal antibodies |
| JP4216068A JPH05304953A (ja) | 1987-08-13 | 1992-08-13 | 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62202517A JPS6445398A (en) | 1987-08-13 | 1987-08-13 | Antithrombin-binding substance monoclonal antibody, hybridoma producing said antibody and method for purifying and measuring thrombin-binding substance utilizing said monoclonal antibody |
| JP4216068A JPH05304953A (ja) | 1987-08-13 | 1992-08-13 | 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62202517A Division JPS6445398A (en) | 1987-08-13 | 1987-08-13 | Antithrombin-binding substance monoclonal antibody, hybridoma producing said antibody and method for purifying and measuring thrombin-binding substance utilizing said monoclonal antibody |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05304953A true JPH05304953A (ja) | 1993-11-19 |
Family
ID=26513431
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62202517A Granted JPS6445398A (en) | 1987-08-13 | 1987-08-13 | Antithrombin-binding substance monoclonal antibody, hybridoma producing said antibody and method for purifying and measuring thrombin-binding substance utilizing said monoclonal antibody |
| JP4216068A Pending JPH05304953A (ja) | 1987-08-13 | 1992-08-13 | 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62202517A Granted JPS6445398A (en) | 1987-08-13 | 1987-08-13 | Antithrombin-binding substance monoclonal antibody, hybridoma producing said antibody and method for purifying and measuring thrombin-binding substance utilizing said monoclonal antibody |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5098829A (ja) |
| EP (1) | EP0306680B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6445398A (ja) |
| KR (1) | KR960002740B1 (ja) |
| CA (1) | CA1335180C (ja) |
| DE (1) | DE3888604T2 (ja) |
| ES (1) | ES2053637T3 (ja) |
Families Citing this family (8)
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|---|---|---|---|---|
| AU635355B2 (en) * | 1989-11-02 | 1993-03-18 | Teijin Limited | Immunoassay of human thrombomodulin, and reagent and kit therefor |
| JPH0736019B2 (ja) * | 1989-12-27 | 1995-04-19 | 富士薬品工業株式会社 | 新規な抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体によるヒトトロンボモジュリンおよびその分解産物の定量方法 |
| JP2697289B2 (ja) * | 1990-11-10 | 1998-01-14 | ブラザー工業株式会社 | ミシンのための駆動装置 |
| US7240940B2 (en) * | 2004-09-23 | 2007-07-10 | 89908, Inc. | Vehicle cargo bed extender |
| US8772239B2 (en) | 2011-11-15 | 2014-07-08 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Medicament for therapeutic treatment and/or improvement of sepsis |
| US10709767B2 (en) | 2012-05-31 | 2020-07-14 | Kinki University | Agent for prophylactic and/or therapeutic treatment of peripheral neuropathic pain caused by anticancer agent |
| BR112021001716A2 (pt) | 2018-09-28 | 2021-04-27 | Asahi Kasei Pharma Corporation | medicamento para aliviar enfermidades e/ou suprimir o início de uma neuropatia periférica |
| US20230165941A1 (en) | 2018-10-22 | 2023-06-01 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Medicament for therapeutic treatment and/or improvement of sepsis accompanied by coagulopathy |
Citations (1)
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| JPS6447391A (en) * | 1987-04-01 | 1989-02-21 | Mitsubishi Gas Chemical Co | Monoclonal antibody and use thereof |
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|---|---|---|---|---|
| US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
| ATE113062T1 (de) * | 1986-07-15 | 1994-11-15 | Kowa Co | Throminbindende substanz und verfahren zu ihrer herstellung. |
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1987
- 1987-08-13 JP JP62202517A patent/JPS6445398A/ja active Granted
-
1988
- 1988-07-15 KR KR1019880008803A patent/KR960002740B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-07-20 CA CA000572523A patent/CA1335180C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-26 DE DE3888604T patent/DE3888604T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1988-07-26 EP EP88112047A patent/EP0306680B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-07-30 US US07/560,275 patent/US5098829A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-08-13 JP JP4216068A patent/JPH05304953A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
| JPS6447391A (en) * | 1987-04-01 | 1989-02-21 | Mitsubishi Gas Chemical Co | Monoclonal antibody and use thereof |
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|---|---|
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| CA1335180C (en) | 1995-04-11 |
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| JPH058679B2 (ja) | 1993-02-02 |
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