JPH058679B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、ヒト由来のトロンビン結合性物質に
結合するモノクローナル抗体及びその利用に関す
る。 （従来の技術） 細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報
告（Nature、495〜497頁、1975年）以来急速に
発展した。すなわち、哺乳動物の脾細胞と骨髄腫
細胞とを融合させた雑種細胞（ハイブリドーマ）
は、用いた脾細胞性質に応じて種々の抗体を生産
することが知られている。そしてこのハイブリド
ーマ性質を利用し、これをクローニングすること
により種々の蛋白質、ホルモン等生体物質に対す
るモノクローナル抗体を産生する融合細胞を作製
すること、並びにモノクローナル抗体を生産する
試みがなされている（E.Dale Servier et al.
Clinical Chemistry、Vol.27、No.11、1979〜
1806、1981）。 一方、本出願人は先にトロンビンと結合してプ
ロテインＣの活性化を特異的に増強するトロンビ
ン結合性物質（以下、TMと称する）をヒトの胎
盤から分離、精製することに成功した（特開昭60
−199819）。このTMは下記の性質を有し、医薬
として有用な物質である。 分子量；還元状態で88000±10000 非還元状態で71000±10000 等電点；PH4.2±0.5 親和性；トロンビンに対して強い親和性を有
する。 活性；(a)トロンビンと結合してプロテインＣ
を活性化する。 (b) 血液の凝固時間を延長する。 安定性；PH２〜10で安定。 変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、尿素）及
びペプシン処理に対して安定。 更に、ヒト由来のTMについてはその後、以下
の論文、特許公報等に報告されている。 胎盤由来のもの； J.Biol.Chem.259 12249−12251（1984） Thrombosis Research 37 353−364（1985） EP182929A 肺由来のもの；WO 87／0050 血漿、尿由来のもの； J.Clin.Invest.76 2178〜2181（1985） 血管内皮細胞、肺癌細胞由来のもの； J.Biol.Chem.260 15432−15438（1985） （発明が解決しようとする問題点） しかし、胎盤中のTMは微量であり、また、通
常使用される各種クロマトグラフイーでは、TM
との特異的結合が充分ではなく、高純度のTMを
取得することは困難であり、加えて工程が長く回
収率も満足のいくものではなかつた。 従つて、高純度のTMを簡便に高収率で取得す
る特異的精製法の開発が望まれている。 また、TMの作用メカニズムの解明、血中濃度
の測定等の手段としてTMの高感度検出法の開発
も望まれている。 すでにI.マルヤマら〔J.Biol.Chem.26015432〜
15438（1985）〕はヒト胎盤由来のTMを用いて抗
TMモノクローナル抗体を作成し、このものの血
管内皮細胞及び肺癌細胞由来のTMがトロンビン
と結合してプロテインＣを活性化することを阻害
するか否かを検討している。しかしながら、この
報文の検討では、このモノクローナル抗体がTM
のトロンビンとの結合部位を認識するという性質
を有することのみしか証明しておらず、このモノ
クローナル抗体のその他の生物学的性質及び物理
学的性質については何も示していない。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、更に有用な抗TMモノクローナ
ル抗体を得るため、鋭意研究を重ねた結果、常法
に従つてTMで免疫した動物の抗体産生細胞と骨
髄腫細胞とを融合して得たハイブリドーマの産生
するモノクローナル抗体について、それらの有す
る特性、すなわち、TMのトロンビンとの結合部
位を認識するか、TMのカルシウムイオンによる
構造変化を認識するか、TMの酵素処理による分
子量変化を認識するかを検定し、選択すれば特異
な性質を有する新しいモノクローナル抗体が得ら
れることを見出した。更にこのモノクローナル抗
体を利用することにより、TMの高純度精製及び
免疫学的測定ができることを見出し、本発明を完
成した。 すなわち本発明は、TMの特定の部位を認識す
るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
免疫吸着剤として使用するTMの精製法及び該モ
ノクローナル抗体の標識体を使用する免疫学的測
定法を提供するものである。 TMの特定の部位を認識するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマは、例えば次の如く
して製造される。すなわち、(1)抗原としてTMを
用いて免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、
(2)別に骨髄腫細胞を調製し、(3)これらの細胞を融
合させ、(4)得られたハイブリドーマを選択的に増
殖させ、(5)このハイブリドーマから抗体産生ハイ
ブリドーマを検索し、(6)抗体産生ハイブリドーマ
の培養液を用い、培養液中のモノクローナル抗体
がTMのトロンビンとの結合性部位を認識する
か、TMのカルシウムイオンによる構造変化を
認識するか、TMの酵素処理による分子量変化
を認識するかを検討し、(7)目的とするモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニン
グすることにより得られる。 次に上記各工程について説明する。 (1) 抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えば
よく、抗原であるTMで動物を免疫し、その動
物の抗体産生細胞を取すればよい。このとき用
いる動物としては、マウス、ラツト、ウサギ、
モルモツト、ヒツジなどが例示され、採取する
抗体産生細胞としては、脾臓、リンパ節、末梢
血液等から分離した細胞などが挙げられる。免
液方法としては、TMを例えばフロイントのコ
ンプリートアジユバントに乳濁させて、例えば
マウスを用いる場合には、これを皮下又は腹腔
内に投与し、１〜５週間の間隔で１〜20ケ月投
与を続けて免疫を完成させる方法の採用が好ま
しい。 (2) 骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄腫細胞には限定はな
く、多くの哺乳動物の細胞株を利用できるが、
抗体産生細胞の調製に用いた動物と同種の動物
の細胞株を使用するのが好ましい。用いる細胞
株は、細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞が
選択培地で生存できず、ハイブリドーマだけが
増殖できるようにすることによつて、未融合細
胞と融合細胞とを分けることを考慮して、特定
の薬剤低抗性を有するものが好ましい。例えば
８−アザグアニン抵抗性の細胞は、HAT培地
中で生育できない性質を有するため、好んで用
いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株
P3−Ag8−γ、P3−X63−Ag8、P3−X63−
Ag8−U1、NSI−Ag4／１、X63−Ag8・
6.5.3、SP2／０−Ag14、MPC11−45.6TG1.7、
F0、S194／5XXO.BU.1等が用いられる。 (3) 細胞融合 細胞融合は、通常MEM培地、RPMI1640培
地、IMDM培地等の培地中で抗体産生細胞と
骨髄腫細胞を10：１〜１：１の混合比で混合す
ることにより行われる。このとき融合促進剤と
して、平均分子量1000〜6000のポリエチレング
リコールを使用することが好ましい。ポリエチ
レングリコールの使用濃度は通常30〜50％であ
る。 (4) ハイブリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、例えばウシ胎仔血
清を含有するIMDM培地などで適当に希釈し、
遠心分離する。沈渣を選択培地（例えば、
HAT培地）に浮遊させ、96ウエルのマイクロ
プレートに分注し、培養を行いハイブリドーマ
のみを生育させる。 (5) 抗体産性ハイブリドーマの検索 抗体産性ハイブリドーマの検索は、常法に従
つて行えばよい。例えば、ハイブリドーマの増
殖した培養液を採取し、TMと反応させたの
ち、酵素、ケイ光物質、発光物質などでラベル
した第２抗体との反応により検索できる。 (6) TAのトロンビンとの結合部位の認識； 前記(5)で得られる抗原抗体反応物とトロン
ビンとの反応性を検討すればよく、後記の実
験１に従いTMがトロンビンが結合してプロ
テインＣの活性化を阻害するか否かによつて
判定できる。すなわち、活性化を阻害する場
合はモノクローナル抗体がTMのトロンビン
結合性部位を認識していることを示し、阻害
しない場合は認識していないことを示す。 TMのカルシウムイオンによる構造変化の
認識； 後記実験２に従い、培養液（カルシウムイ
オンが存在している）にEDTAを加えて、
前記(5)の反応性を検討すればよい。すなわ
ち、抗原抗体反応を行う場合には構造変化を
認識していないことを、反応を行わないとき
は認識していることを示す。 TMの酵素処理による分子量変化の認識； 後記実験３に従い、TMを蛋白分解酵素で
処理したのち、前記(5)の反応性を検討すれば
よい。すなわち、抗原抗体反応を行う場合に
は分子量変化を認識していないことを、反応
を行わないときは認識していることを示す。 (7) クローニング 抗体産性ハイブリドーマを含むことを確認し
た培養ウエル中の細胞を限界希釈法などにより
クローニングを行い、モノクローナル抗体産性
ハイブリドーマを得る。 以上の操作によつてTMに結合する本発明の
モノクローナル抗体産性ハイブリドーマを得る
ことができる。 本発明者は、後記実施例に記載の方法でTM−
H54、TM−H59、TM−H60、TM−H65、TM
−H73、TM−H91と名付けたハイブリドーマを
得た。これらのハイブリドーマはそれぞれTMの
定の部位を認識するモノクローナル抗体を産生す
る新規な細胞であるので、これらの細胞について
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託すべく手
続を行つたが、62微寄文第1140号として拒否され
た。 叙上の如くして得られたハイブリドーマから
TMに結するモノクローナル抗体を得るには、次
の如くすれば良い。すなわち、抗体産性ハイブリ
ドーマを適当な培地中で培養し、その培養上清を
採取することにより本発明のモノクローナル抗体
を得ることができる。また、モノクローナル抗体
を大量に製造するのには、用いた骨髄腫細胞の由
来動物と同種の動物にプリスタン（２，６，10，
14−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を
腹腔内に投与したのち、抗体産生ハイブリドーマ
を接種してインビボで抗体産生ハイブリドーマを
大量に増殖させる方法が用いられる。この方法に
よれば、接種した動物の血清及び腹水中に高濃度
のモノクローナル抗体が生ずる。モノクローナル
抗体の分離精製は、通常の血清からの抗体の精製
に使用されている方法に従つて実施できる。 以上のようにしてTMに結合するモノクローナ
ル抗体がられるが、該モノクローナル抗体の性質
は、使用するハイブリドーマの種類により若干異
なる。これは、同一のTMであつても抗体産生細
胞が認識し得る部位が異なるためと解される。 以下に本発明者が前記ハイブリドーマから調製
したモノクローナル抗体TM−A54、TM−A59、
TM−A60、TM−A65、TM−A73、及びTM−
A91の有する性質を示す。なお、分子量はSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、等電
点は等電点電気泳動法（LKB−等電点電気泳動
装置）により、免疫グロブリンサブクラスはオク
タローニの二重免疫拡散法〔ウサギポリクローナ
ル抗体（マイルズ社製）使用〕により測定した。 TM−A54 (a) 分子量；175000±5000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.2−7.7 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
部位を認識する。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識する。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
化を認識しない。 TMはCa²⁺イオンと結合する事が知られている
が、TM−A54はCa²⁺イオンによるTMの構造の
変化を認識するので、この抗体を用いることによ
り、例えば先天性遺伝子病、その他の病態により
Ca²⁺イオンとの結合部位が傷害を受けた様なTM
を正常なTMと区別する事ができる。 TM−A59 (a) 分子量；190000±5000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.1−7.6 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
部位を認識しない。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識しない。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
化を認識しない。 TMのCa²⁺イオン結合による変化に全く影響を
受けず、かつエラスターゼ等の酵素処理TMにも
反応することから、例えば遺伝子病等により、
TMとしての活性を持たないもの、あるいは、血
中プロテアーゼ活性が異常に亢進し、TMが分解
を受けたものについても本抗体により認識する事
ができる。 TM−A60 (a) 分子量；180000±8000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.9−9.2 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
部位を認識しない。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識しない。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
化を認識する。 本抗体は、酵素処理により、低分子化したTM
とは反応しないことから、例えば、内皮細胞の損
傷を供う疾患である播種性血管内凝固症（DIC）、
肺がん等の患者に存在し、正常人には存在しない
高分子TMのみを検出することができる。 TM−A65 (a) 分子量；190000±5000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.0−7.5 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
部位を認識しない。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識しない。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
化を認識しない。 この抗体は、TM−A59とほぼ同じように用い
ることができる。 TM−A73 (a) 分子量；200000±5000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.0−7.5 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
部位を認識する。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識する。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
化を認識しない。 この抗体は、TM−A54とほぼ同様に用いるこ
とできる。 TM−A91 (a) 分子量；195000±5000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.0−7.4 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
部位を認識しない。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる構造変化を認識する。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
化を認識しない。 本抗体は、TMのCa²⁺イオンとの結合による変
化を認識するので、例えば遺伝子疾患、又は酵素
等により、Ca²⁺と結合する部位が失われたTMを
正常なものと区別する事ができる。 本発明モノクローナル抗体を免疫吸着剤として
利用することによつて、TMを精製する方法は、
例えば本発明モノクローナル抗体をデキストラン
ゲル、アガロースゲル、ポリビニルゲル等の不溶
性担体に結合させ、該モノクローナル抗体結合担
体を免疫吸着剤として用い、カラムクロマトグラ
フイーに付すことにより実施される。不溶性担体
とモノクローナル抗体との結合は、ブロムシアン
法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、もしくは
ホルミル基等を介して結合させることができる。 このモノクローナル抗体抗体結合不溶性担体か
らなるカラムに粗TMを添加し、カラムに吸着し
たTMを溶出させることにより高純度のTMが得
られる。 本発明モノクローナル抗体の標識体を利用する
TMの免疫測定法は、例えば本発明モノクローナ
ル抗体を酵素、各種のアイソトープ、蛍光物質等
の標識剤で標識し、これにTMを含む試料を加
え、TMと標識剤との免疫反応生成物の標識量を
測定することによつて実施される。また一般的な
方法としてELISA法を用いることもできる。 （発明の効果） 本発明のハイブリドーマは、TMの特定の部位
を認識するモノクローナル抗体を産生する。そし
てこのモノクローナル抗体は前記のヒト胎盤由来
のTMのほか、ヒト尿由来のTM、ヒト血漿由来
のTM、ヒト肺由来のTM等とも異的に結合する
ので、これを用いれば、各種TMの分離精製工程
を短縮でき、極めて高純度のTMを高回収率で得
ることができる。さらに、モノクローナル抗体と
結合させた不溶性担体は、洗浄すれば再使用可能
であり、精製工程の短縮だけでなく経済的である
ことから工業的に極めて有用である。 また、本発明の抗TMモノクローナル抗体は、
血液の凝固線溶系の異常疾患の治療におけるTM
の免疫定量に使用できる。 （実施例） 次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 １ 抗TMモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の製造： (1) 免疫脾細胞の調製 ヒトの胎盤より抽出、精製したTM（分子量
71000）20μｇをフロイント・コンプリート．
アジユバントに乳濁化させ、雄性のBALB／
ｃ系マウスの皮下内に投与した。以後２〜４週
間の間隔で10ケ月間20〜100μｇのTMを腹腔内
に投与し、最後に100μｇを静脈内に投与した。 ３日後にマウスから脾臓を取り出し、
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium
（IMDM）中で脾臓細胞をほぐし、100メツシ
ユの網を通過した単細胞を得、これに低張液
（155ｍＭ塩化アンモニウム）を加えて赤血球を
溶血したのちIMDMで細胞を３回洗浄した。 (2) 骨髄腫細胞の調製 マウス骨髄腫細胞（P3−Ag8−γ）の細胞
をIMDMにウシ胎仔血清（FCS）を10％加え
た培地中で培養した。３日間隔の継代培養を行
い、融合の前日に新鮮な培地に交換して生存率
が90％以上の細胞をIMDMで３回洗浄した。 (3) 細胞融合 (1)及び(2)で調製された両細胞数を計測し、脾
細胞と骨髄腫細胞を３：１の割合に混合して遠
心した。上清を捨て、細胞沈渣を充分解きほぐ
したのち、50％ポリエチレングリコール1500を
１ml滴下して融合を行つた。室温で30秒間放置
したのち、IMDM1mlを１分間かけて滴下し、
次いで10mlを５分間かけて滴下しながら緩やか
に混合した。最終50mlにして、1000rpmで８分
間遠心した。 (4) ハイブリドーマの選択的増殖 上記の沈渣を10％FCS添加IMDMに浮遊さ
せ、再度遠心し、上清液を捨てたのち、HAT
含有10％FCS添加IMDMに細胞を３×10⁵／ml
浮遊させて96穴マイクロプレートに100μず
つ分注した。３〜４日ごとに培地を50μ追加
し、この培地の選択によりハイブリドーマのみ
を増殖させた。 (5) 抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖した穴の培養液を採取
し、酵素免疫法によりTMに対する抗体を産生
している穴を検索した。すなわち、96穴マイク
ロプレートにTMを0.5μｇ／100μ／well分注
し、４℃で18時間静置して吸着させた。次いで
検体である培養液を100μ／well分注し、25
℃で２時間反応させた。0.05％ツイーン
（Tween）20を含むリン酸緩衝食塩水（PBS−
Tween）で３回洗浄後、西洋ワサビ−パーオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgGを100μ／
well加え、２時間後PBS−Tweenで３回洗浄
した。これに、過酸化水素0.001％及びオルト
フエニレンジアミン0.4mg／mlを含有する0.1M
クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（PH4.0）
を加え、25℃で30分間反応させた後、4.5M硫
酸50μ／wellを加え、波長492nｍの吸光度を
測定した。 (6) 目的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の選択 発色した穴の培養液を用い、以下の実験１、
２及び３を行つた。 実験１ プロテインＣの活性化能阻害作用： ヒト−胎盤由来のTMを0.1M塩化ナトリウ
ム及び0.1％ルブロールを含有する0.02Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH0.6）に溶解（200μｇ／ml）
し、その10μ及びハイブリドーマの培養液
10μとを合し、37℃で１時間インキユベート
した。 上記の反応液にヒト−プロテインＣの0.15M塩
化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウムを含有す
る0.02Mトリス−塩酸緩衝液溶液（PH7.5）30μ
及びウシ−トロンビンの上記緩衝液溶液（5U／
ml）50μを加え、37℃で30分間インキユベート
したのち、ヒト−アンチトロンビンの0.15M塩
化ナトリウムを含有する0.05Mトリス−塩酸緩衝
液溶液（2U／ml）100μを加えて37℃で10分間
インキユベートし、次いで上と同じ緩衝液に溶解
（0.2ｍＭ）したMCA基質200μを加えて37℃で
10分間インキユベートした。これに20％酢酸
600μを加え、生じたAMCの濃度を蛍光光度度
計で測定した。 対照として市販正常マウスIgGを用い、その測
定値との差のあるものは阻害作用のあるもの（す
なわちトロンビンとの結合部位を認識）とした。 実験２ Ca²⁺イオンの影響： 96穴平底マイクロプレートにヒト−胎盤由来の
TM（1000倍希釈）をコーテイングし、ハイブリ
ドーマの培養液を10ｍＭ EDTAを含有する
PBS−Tweenと１：１に混合したもの100μを
加え、25℃で２時間インキユベートした。 これをPBS−Tweenで洗浄したのち、HRPで
標識した羊−抗マウスIgGのPBS−Tween溶液を
加え、25℃で２時間インキユベートした。これを
PBS−Tweenで洗浄したのち、基質溶液（オル
トフエニレンジアミン0.4mg／ml及び0.01％過酸
化水素の0.1Mクエン酸緩衝液、PH5.0）を100μ
加え、25℃で30分間インキユベートした。これに
4.5M硫酸50μを加え反応を停止させたのち、
492nｍにおける吸光度を測定した。この値と前
記実施例１(5)で求めた値とに差があるものはカル
シウムイオンの影響を受けるもの（すなわち、カ
ルシウムイオンによる構造変化認識）とした。 実験３ 酵素処理したTMとの反応： ヒト胎盤由来のTMのトリス塩酸緩衝食塩水
（以下「TBS」とする）溶液（１mg／ml）10μ
とトリプシン（シグマ社製Type）のTBS溶
液（100μｇ／ml）又はエラスターゼ（ブタ由
来；シグマ社製）のTBS溶液（２mgｇ／ml）10μ
とを37℃で30分間反応した。これをレムリー法
によりSDS−PAGE（アクリルアミド濃度：10％）
を行い、次いでウエスタンブロツテイングを行な
つた。ニトロセルロース膜とハイブリドーマの培
養液を0.05％Tween20を含むトリス緩衝食塩水
（PH7.6；以下「PBS−Tween」とする。）で10倍
希釈した溶液とを25℃で３時間反応させた。これ
をPBS−Tweenで洗浄したのち、HRPで標識し
た羊−抗マウスIgGのPBS−Tween溶液を加え、
25℃で３時間反応させた。これをTBS−Tween
で洗浄したのち、30mgの４−クロロ−１−ナフト
ールを含むメタノール10ml及び30％過酸化水素
30μのTBS50ml溶液中で発色させた。発色した
ものは酵素処理したTMと反応した（分子量変化
を認識しない）ものとした。 以上の実験結果により、下記の６種のハイブリ
ドーマを選択した。 TM−H54 実験１：阻害作用あり。 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。 TM−H59（FERM BP−1697） 実験１：阻害作用なし。 実験２：影響を受けない。 実験３：反応する。 TM−H60（FERM BP−1698） 実験１：阻害作用なし。 実験２：影響を受けない。 実験３：反応しない。 TM−H65 実験１：阻害作用なし。 実験２：影響を受けない。 実験３：反応する。 TM−H73（FERM BP−1699） 実験１：阻害作用あり。 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。 TM−H91（FERM BP−1700） 実験１：阻害作用なし。 実験２：影響を受ける。 実験３：反応する。 (7) モノクローナル抗体産生細胞のクローニン
グ： 正常マウスの腹腔にIMDMを注射して採取
した腹腔細胞をフイーダー細胞として使用し
た。この腹腔細胞を10％FCS添加IMDMに浮
遊させ（１×10⁵個／ml）、96穴マイクロプレー
トに50μずつ分注した。翌日、抗体産生ハイ
ブリドーマを５個／mlに調製し、各穴に100μ
ずつ分注した。３日ごとに培地を追加又は交
換して、細胞が増殖した穴から順に培養上清を
採取し、上記と同一の方法で抗体の産生を確認
した。陽性の穴は再度クローニングして抗TM
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得
た。 実施例 ２ 抗TMモノクローナル抗体の製造： ７週令以上のBALB／ｃ系マウスにプリスタ
ン0.5mlを腹腔内投与し、約１週間後、上記で得
たハイブリドーマ１×10⁶個／マウスを腹腔内に
接種した。約10日後、マウスの腹水を採取し、
3000rpmで10分間遠心し、上清を分取した。 この上清液4.8mlに等量の3M塩化ナトリウムを
含有する1.5Mグリシン緩衝液（PH8.9）を加え、
この緩衝液で平衡化したプロテインＡセフアロー
スCL−4B ５mlのカラムに付し、この緩衝液で
充分洗浄したのち、0.1Mリン酸緩衝液（PH4.0）
で溶出した。溶出液は1Mトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）１mlを入れた試験管内に３mlずつ分取し
た。A₂₈₀を測定して蛋白分画を集め、これを水に
対して透析したのち凍結乾燥して抗TMモノクロ
ーナル抗体を得た。 ハイブリドーマとしてTM−H54を用いた場合
は、TM−A54が30mg、TM−H59を用いた場合
は、TM−A59が60mg、TM−H60を用いた場合
はTM−A60が30mg、TM−H65を用いた場合は
TM−A65が30mg、TM−H73を用いた場合は
TM−A73が18mg、TM−H91を用いた場合は
TM−A91が６mg得られた。これらの抗TMモノ
クローナル抗体は前記の性質を示した。 実施例 ３ 免疫吸着クロマトグラフイーによるTMの精製 (1) 抗体カラムの製造 ブロムシアン活性化セフアロース4B 3gを１
ｍＭ塩酸及び0.1塩化ナトリウムを含有する
0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（PH8.3）で順次洗
浄したのち、この緩衝液の８ml溶液とした。こ
れに実施例２で得られるモノクローナル抗体
TM−A59を20mg加え、室温で２時間振盪し
て、グラスフイルターで脱水した。更に、1M
トリス−塩酸緩衝液（PH8.0）40mlを加えて２
時間振盪したのちグラスフイルターで脱水後、
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）40mlを加え、グラス
フイルターで脱水した。得られた抗体結合セフ
アロースを0.5M塩化ナトリウムを含有する
0.1M塩酸緩衝液（PH8.3）及び0.5M塩化ナトリ
ウムを含有する酢酸緩衝液（PH4.0）で交互に
３回洗浄し、1M塩化ナトリウム及び0.05％ル
ブロールを含有する0.02Mトリス塩酸緩衝液
（TBSルブロール；PH7.6）で平衡化して抗体カ
ラムNo.59を得た。 同様にTM−A60及びTM−A65を用いて抗
体カラムNo.60及び抗体カラムNo.65を製造した。 (2) 抗体カラムによるTMの精製 上記で製造した抗体カラムに、ヒト−胎盤よ
り抽出したTM10μｇを含むTBSルブロール
500μをかけ、平衡化に用いたTBSルブロー
ル緩衝液４mlで洗浄した。これを1M塩化ナト
リウム、0.1％ルブロール及び2Mチオシアン酸
カリウムを含有する0.02Mトリス−塩酸緩衝液
（PH7.6）４mlで溶出した。 抗体カラムNo.59、No.60及びNo.65を用いたとき
のTMの回収量を実施例４に記載の方法で測定
した結果は表１に示すとおりである。

【表】 実施例 ４ 抗TMモノクローナル抗体を用いるTMの測
定： S.ヨシタケらの方法〔J.Biochem.921413〜1424
（1982）〕に準じて西洋わさびペルオキシダーゼ
（HRP）を抗TMモノクローナル抗体に結合させ
た。このHRP標識抗TMモノクローナル抗体を
用いて、以下の如くELISA法によりTMの測定を
行つた。 0.05M炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.6）にコー
テイング用モノクローナル抗体を40μｇ／ml溶解
し、これを96穴平底マイクロプレートに100μ
ずつ注入し、25℃で２時間コーテイングした。
0.05％Tween20を含むトリス−塩酸緩衝食塩水で
洗浄後、試料を５ｍＭ塩化カルシウムを含む
PBS−Tweenに溶解して100μずつ加え、25℃
で18時間反応させた。PBS−Tweenで洗浄後、
HRP標識モノクローナル抗体を５ｍＭ塩化カル
シウムを含むPBS−Tweenで希釈して100μず
つ加え、25℃で４時間反応させた。TBS−
Tweenで洗浄後、基質溶液（オルトフエニレン
ジアミン0.4mg／ml及び0.01％過酸化水素の0.1M
クエン酸リン酸緩衝液、PH5.0）を100μ添加し、
25℃で60分間反応させた。4.5M硫酸50μを加えて
反応を停止させた後、492nｍにおける吸光度を
測定した。 コーテイング用モノクローナル抗体としてTM
−A59を用い、標識用モノクローナル抗体として
TM−A73を用いた場合の検量線を第１図に、コ
ーテイング用モノクローナル抗体としてTM−
A60を用い、標識用モノクローナル抗体として
TM−A73を用いた場合の検量線を第２図に、コ
ーテイング用モノクローナル抗体としてTM−
A59を用い、標識用モノクローナル抗体として
TM−A91を用いた場合の検量線を第３図に、コ
ーテイング用モノクローナル抗体としてTM−
A59を用い、標識用モノクローナル抗体として
TM−A60を用いた場合の検量線を第４図に示し
た。これらは何れも極めて感度が高く、しかも良
好な直線性を示しており、0.8〜50nｇ／mlの範囲
のTMを検出できることがわかる。 DIC患者血清及び正常人血清を用いて上記方法
によつて血清中のTM量を測定したところ、上記
の何れの測定系を用いても、DIC患者の血清中
に、正常人の血清中の約1.5倍のTMが認められ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図は、実施例
４のTM測定法におけるTM濃度と吸光度
（492nm）との関係を示す図面である。第１図；
コーテイング用モノクローナル抗体としてTM−
A59を使用、標識用モノクローナル抗体として
TM−A73を使用。第２図；コーテイング用モノ
クローナル抗体としてTM−A60を使用、標識用
モノクローナル抗体としてTM−A73を使用。第
３図；コーテイング用モノクローナル抗体として
TM−A59を使用、標識用モノクローナル抗体と
してTM−A91を使用。第４図；コーテイング用
モノクローナル抗体としてTM−A59を使用、標
識用モノクローナル抗体としてTM−A60を使
用。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ トロンビンと結合してプロテインＣの活性化
   を特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性
   物質に結合するモノクローナル抗体であつて、次
   の性質を有していることを特徴するモノクローナ
   ル抗体TM−A60。 (a) 分子量；180000±8000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.9−9.2 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
   部位を認識しない。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
   よる構造変化を認識しない。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
   化を認識する。 ２ トロンビンと結合してプロテインＣの活性化
   を特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性
   物質で免疫した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細
   胞とを融合し、得られるハイブリドーマを選択的
   に増殖させ、その培養液をトロンビン結合性物質
   と反応させ、抗原抗体反応を示す抗体を産生する
   ハイブリドーマを選択し、次いで上記抗原抗体反
   応物とトロンビンとの反応、EDTAの存在下に
   おける上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で
   処理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応
   をそれぞれ行い、抗原抗体反応物がトロンビンと
   結合し、EDTAの存在下で抗原抗体反応を示し、
   酵素処理したトロンビン結合性物質と反応しない
   抗体を産生するものとして選択されるハイブリド
   ーマが産生する特許請求の範囲第１項記載のモノ
   クローナル抗体TM−A60。 ３ 免疫吸着カラムクロマトグラフイーによるト
   ロンビン結合性物質の精製に当り、トロンビンと
   結合してプロテインＣの活性化を特異的に増強す
   るヒト由来のトロンビン結合性物質に結合するモ
   ノクローナル抗体であつて、次の性質を有してい
   るモノクローナル抗体TM−A60を用いることを
   特徴とするトロンビン結合性物質の精製法。 (a) 分子量；180000±8000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.9−9.2 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
   部位を認識しない。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
   よる構造変化を認識しない。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
   化を認識する。 ４ トロンビン結合性物質の測定に当り、トロン
   ビンと結合してプロテインＣの活性化を特異的に
   増強するヒト由来のトロンビン結合性物質に結合
   するモノクローナル抗体であつて、次の性質を有
   しているモノクローナル抗体TM−A60を用いる
   ことを特徴とするトロンビン結合性物質の測定
   法。 (a) 分子量；180000±8000 (b) IgGサブクラス；IgG₁ (c) 等電点；PH7.9−9.2 (d) トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合
   部位を認識しない。 (e) トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
   よる構造変化を認識しない。 (f) トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
   化を認識する。