JPH02167097A - 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ並びに該モノクローナル抗体を利用するトロンビン結合性物質の精製法及び測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト由来のトロンビン結合性物質に特異的に
結合するモノクローナル抗体及びその利用に関する。

（従来の技術） 細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　４９５〜４９７頁、　１９７５年）以来
急速に発展した。すなわち、哺乳動物の胛細胞と骨髄腫
細胞とを融合させた雑種細胞（）＼イブリドーマ）は、
用いた胛細胞の性質に応じて種々の抗体を生産すること
が知られている。そしてこのノ＼イブリドーマの性質を
利用し、これをクローニングすることにより種々の蛋白
質、ホルモン等の生体物質に対するモノクローナル抗体
を産生ずる融合細胞を作製すること、並びにモノクロー
ナル抗体を生産する試みがなされている（Ｂ、Ｄａｌｅ
Ｓｅｒｖｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、２７゜Ｎα１１，１９７
９〜１８０６．　１９８１）　　。

一方、本出願人は先にトロンビンと結合してプロティン
Ｃの活性化を特異的に増強するトロンビン結合性物質（
以下、ＴＭと称する）をヒトの胎盤から分離、精製する
ことに成功した（特開昭６０１９９８１９）。このＴＭ
＋ま下記の性質を有し、医薬として有用な物質である。

■　分子遣；還元状態でａａ、　ｏｏｏ±１０．０００
非還元状態で７１．０００±１０．０００■　等電点：
ｐＨ４，２±０．５ ■　親和性；トロンビンに対して強い親和性を有する。

■　活性：（ａ）トロンビンと結合してプロティンＣを
活性化する。

以下余白 （ｂ）血液の凝固時間を延長する。

■　安定性、　　ｐｌ＋２〜１０で安定。

変性剤（ドデシル硫酸ナトリウ ム、尿素）及びペプシン処理に対 して安定。

更に、ヒト由来のＴＭについてはその後、以下の論文、
特許公報等に報告されている。

胎盛由来のもの； Ｊ、Ｂｉｏｌ、（：ｈｅｍ、２５９１２２４６−１２２
５Ｈ１９Ｑ４）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ｒｌｅｓｅａｒ
ｃｈ　３７　：１５３−３６４　（１９８５）ＥＰＩＢ
２９２９八 肺由来のもの；冑ＯＱ７１００５０ 血漿、尿由来のもの： Ｊ、ＣｌＩｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７ｆｉ　　　２１７１１
〜２１［１Ｈ１９８５）血管内皮細胞、肺癌細胞由来の
もの； Ｊ、０Ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２６０１５４３２−１５４：
ＨＨ１９（１５）（発明が解決しようとする問題点） しかし、胎盛中のＴｋｌは微量であり、また、通常使用
される各種クロマトグラフィーでは、ＴＭとの特異的結
合が充分ではなく、高純度のＴＬＩを取得することは困
難であり、加えて工程が長く回収率も満足のいくもので
はなかった。

従って、高純度のＴＭを簡便に高収率で取得する特異的
精製法の開発が望まれている。

また、ＴＭの作用メカニズムの解明、血中濃度の測定等
の手段としてＴＭの高感度検出法の開発も望まれている
。

すでに１．マルヤマら（Ｊ、　［１ｌｏ１．　Ｃｈｅｍ
、　２６０１５４：１２〜１５４３８　（１９８５）　
）はヒト胎盤由来のＴＭを用いて抗ＴＭモノクローナル
抗体を作成し、このものの血管内皮細胞及び肺癌細胞由
来のＴＭがトロンビンと結合してプロティンＣを活性化
することを阻害するか否かを検討している。しかしなが
ら、この報文の検討では、このモノクローナル抗体がＴ
Ｍのトロンビンとの結合部位を開織するという性質を有
することのみしか証明しておらず、このモノクローナル
抗体のその他の生物学的性質及び物理化学的性質につい
ては何も示していない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、更に有用な抗ＴＭモノクローナル抗体を
得るため、鋭意研究を重ねた結果、常法に従ってＴＭで
免疫した動物の抗体産生細胞と骨髄肝細胞とを融合して
得たハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体につ
いて、それらの有する特性、すなわち、ＴＭのトロンビ
ンとの結合部位を認識するか、ＴＭのカルシウムイオン
による構造変化を認識するか、ＴＭの酵素処理による分
子量変化を認識するかを検定し、選択すれば特異な性質
を有する新しいモノクローナル抗体が得られることを見
出した。更にこのモノクローナル抗体を利用することに
より、ＴＭの高純度精製及び免疫学的測定がで鮒ること
を見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ＴＭに対して特異的なモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するバイブリドー
マ、該モノクローナル抗体を免疫吸着剤として使用する
ＴＭの精製法及び該モノクローナル抗体の標識体を使用
する免疫学的測定法を提供するものである。

ＴＭに対して特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマは、例えば次の如くして別に骨髄肝細胞を
調製し、（３）これらの細胞を融合させ、（４）得られ
たハイブリドーマを選択的に増殖させ、（５）このハイ
ブリドーマから抗体産生ハイブリドーマを検索し、（６
）抗体産生ハイブリドーマの培養液を用い、培養液中の
モノクローナル抗体が０７Ｍのトロンビンとの結合性部
位を認識するか、０７Ｍのカルシウムイオンによる構造
変化を認識するか、０７Ｍの酵素処理による分子量変化
を認識するかを検討し、（７）目的とするモノクローナ
ル抗体を産生ずるバイプリドーマをクローニングするこ
とにより得られる。

次に上記各工程について説明する。

（１）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗原
であるＴＭで動物を免疫し、その動物の抗体産生細胞を
取得すればよい、このとぎ用いる動物としては、マウス
、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示され
、保取する抗体産生細胞としては、１キ臓、リンパ節、
末梢血液等から分離した細胞などが挙げられる。免疫方
法としては、ＴＭを例えばフロイントのコンブリートア
ジエバントに乳濁させて、例えばマウスを用いる場合に
は、これを皮下又はＩ］Ｉ腔内に投与し、１〜５週間の
間隔で１〜２０ケ月投与を続けて免疫を完成させる方法
の採用が好ましい。

（２）骨髄■１細胞の調製 細胞融合に使用する骨＊Ｉ］ｆｆｉ細胞には特に限定は
なく、多くの咄乳動物の細胞株を利用できるが、抗体産
生細胞の調製に用いた動物と同種の動物の細１１株を使
用するのが好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に
、未融合の骨ｆｉｌ！ｉ制細胞が選択培地で生存できず
、ハイブリドーマだけが増殖で診るようにすることによ
って、未融合細１１１と融合細胞とを分けることを考慮
して、特定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい０例え
ば８−アザグアニン抵抗性の細胞は、１１＾丁培地中で
生育できない性質を有するため、好んで用いられる。具
体的には、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ａｇ８−γ、１’
３−Ｘ８３−Ａｇ３、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ１１−１１１
．　ＮＳｌ−Ａｇ４／ｌ、ｘａ３−＾ｇａ−ａ、ｓ、３
，５ｐ２１０−＾ｇｔ４、Ｍｐｃｔｔ−４ｓ、ａＴＧｌ
、７、ＦＯ１Ｓ１９４１５ＸＸＯ，ＢＵ、１等が用いら
れる。

（３）細胞融合 細胞融合は、通常ＭＥＭ培地、ＩＩＰＭ１１６４０培地
、ＩＭＤＭ培地等の培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞
を１０＝１〜１：１の混合比で混合することにより行わ
れる。このとき融合促進剤として、平均分子ｉ　１，０
００〜６，０００のポリエチレングリコールを使用する
ことが好ましい、ポリエチレングリコールの使用濃度は
通常３０〜５０％である。

（４）ハイブリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、例えばウシ胎仔血清を含有す
るＩＭＤＭ培地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈
漬を遷択培地（例えば、ＩＩ　Ａ　Ｔ培地）に浮遊させ
、９６ウエルのマイクロプレートに分注し、培養を行ｌ
／Ｘ）Ｘイブリドーマのみを生育させる。

（５）抗体産生バイプリドーマの検索 抗体産生バイプリドーマの検索は、常法に従りて行えば
よい０例えば、ノλイブリドーマの増殖した培養液を採
取し、ＴＭと反応させたのち、酵素、ケイ光物質、発光
物質などでラベルした第２抗体との反応により検索でき
る。

（６）■　ＴＶのトロンビンとの結合部位のＢ　Ｌｆｆ
ｌ　：前記（５）で得られる抗原抗体反応物とトロンビ
ンとの反応性を検討すればよく、後記の実験１．に従い
ＴＭがトロンビンが結合してプロティンＣの活性化を阻
害するか否かによって判定できる。すなわち、活性化を
阻害する場合はモノクローナル抗体がＴＭのトロンビン
結合性部位を認識していることを示し、阻害しない場合
は認識していないことを示す。

■　ＴＭのカルシウムイオンによる構造変化の認識； 後記実験２．に従い、培養液（カルシウムイオンが存在
している）にＥＤ丁＾を加えて、前記（５）の反応性を
検討すればよい、すなわち、抗原抗体反応を行う場合に
は構造変化を認識していないことを、反応を行わないと
きは認識していることを示す。

■　ＴＭの酵素処理による分子量変化の認識：後記実験
３．に従い、ＴＭを蛋白分解酵素で処理したのち、前記
（５）の反応性を検討すればよい、すなわち、抗原抗体
反応を行う場合には分子量変化を認識していないことを
、反応を行わないときは認識していることを示す。

（７）クローニング 抗体産生バイプリドーマを含むことを確認した培養ウェ
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行い
、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを得る。

以上の）桑作によってＴＭに特異的な本発明のモノクロ
ーナル抗体産生ハイプリドーマを得ることができる。

本発明者は、後記実施例に記載の方法でＴＶ−１１５４
，ＴＭ−１１５９、ＴＭ−１１６０、ＴＭ−１１８５，
１Ｍ−１１７３、ＴＭ−１１９１と名付けたハイプリド
ーマを得た。これらのハイブリドーマはそれぞれＴＭに
特異的なモノクローナル抗体を産生ずる新規な細胞であ
るので、これらの細胞について工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託すべく手続を行ったが、６２１衣寄文第
１！４０号として拒否された。

叙上の如くして得られたバイプリドーマからＴＭに特異
的なモノクローナル抗体を得るには、次の如くすれば良
い、すなわち、抗体産生バイプリドーマを適当な培地中
で培養し、その培養上清を採取することにより本発明の
モノクローナル抗体を得ることができる。また、モノク
ローナル抗体を大量に製造するのには、用いた骨髄腫細
胞の由来動物と同種の動物にプリスタン（２，６，１０
，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油をＩ
Ｉｌ腔内に投与したのち、抗体産生ハイプリドーマを接
種してインビボで抗体産生バイプリドーマを大量に増殖
させる方法が用いられる。この方法によれば、接種した
動物の血清及び腹水中に高濃度のモノクローナル抗体が
生ずる。モノクローナル抗体の分１ｌｌＩＩ絹製は、通
常の血清からの抗体の精製に使用されている方法に従っ
て実施できる。

以上のようにしてＴＭに特異的なモノクローナル抗体が
得られるが、該モノクローナル抗体の性質は、使用する
ハイブリドーマの種類により若干異なる。これは、同一
のＴＭであっても抗体産生細胞が認識し得る部位が異な
るためと解される。

以下に本発明者が前記ハイブリドーマから調製したモノ
クローナル抗体ＴＭ−＾５４，７トＡ５９、ＴＭ−Ａ６
０、ＴＭ−＾６５、ＴＭ−＾７３、及びＴＭ−＾９１の
有する性質を示す、なお、分子量は５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により、等電点は等電点電気泳
動法（Ｌにト等電点電気泳動装置）により、免疫グロブ
リンサブクラスはオフタロｍ＝の二ｍ免疫拡１１に法（
ウサギポリクローナル抗体（マイルズ社製）使用）によ
り測定した。

ＴＭ−＾５４ （ａ）分子、ｌｆｉ　；　１７５，０００±　５，００
０（ｂ）　１３Ｇサブクラス？　ＩｇＧ。

（ｃ）等電点、　ｐｌ＋７．２−７゜７（ｄ）トロンビ
ン結合性物質のトロンビンとの結合部位を認識する。

（ｅ）　　トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる４＋ｌｌ造変化を認識する。

（ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。

ＴＭは（：ａ”イオンと結合する事が知られているが、
ＴＭ−＾５４はＣａ”イオンによるＴＭの構造の変化を
認識するので、この抗体を用いることにより、例えば先
天性遺伝子病、その他の病態によりＣａ２゛イオンとの
結合部位が傷害を受けた様なＴＭを正常なＴＭと区別す
る事ができる。

ＴＭ−八５９ （ａ）分子量；　１９０，０００±　５，０００（ｂ）
　Ｉｇｃサブクラス；　ＩｇＧｔ（Ｃ）等１１点；　ｐ
ｌ＋７．１−７．［Ｈｄ）　　ｌ−ロンビン結合性物質
のトロンビンとの結合部位を認識しない。

（ｅ）　　ｌ−ロンビン結合性物質のカルシウムイオン
による構造変化を認ＫｎＤ　Ｌ／ない。

（ｆ）　　ｌ−ロンビン結合性物質の酵素による分子量
変化を認識しない。

ＴＭのＣａ２°イオン結合による変化に全く影響を受け
ず、かつエラスターゼ等の酵素処理ＴＭにも反応するこ
とから、例えば遺伝子病等により、ＴＭとしての活性を
持たないもの、あるいは、血中プロテアーゼ活性が異常
に先進し、ＴＭが分解を受けたものについても本抗体に
より認識する１ｊＩがで仕る。

ＴＭ−八６０ （ａ）分子量：　１８０，０００±ａ　、　ｏｏ。

（ｂ）　ＩｇＧサブクラス；　ＩｇＧ。

（Ｃ）等電点：　ｐＨ７．９−９，２ （ｄＨ〜ロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
を認識しない。

（ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
構造変化を認識しない。

（ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識する。

本抗体は、酵素処理により、低分子化したＴＭとは反応
しないことから、例えば、内皮細胞の損傷を供う疾患で
あるＤＩＧ、肺がん等の患者に存在し、正常人には存在
しない高分子ＴＭのみを検出１−ることができる。

ＴＭ−八６５ （ａ）分子Ｆｘ　；　１９０，０００±５．０００（ｂ
）　１ｇＧサブクラス；　ＩｇＧｔ（Ｃ）等１′＆点；
　ｐＨ１７．０−７．５（ｄ）トロンビン結合性物質の
トロンビンとの結合部位を認識しない。

（ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
４１′４造変化を認識しない。

（ｆＨ−ロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。

この抗体は、ＴＭ−Ａ５９とほぼ同じように用いること
ができる。

ＴＭ−八７３ （ａ）分子量、　２００，０００±５，０００（ｂ）　
ＩｇＧサブクラス；　ｆｇＧ。

（Ｃ）等電点、　９１１７．０−７．５（ｄ）トロンビ
ン結合性物質のトロンビンとの結合部位を認識する。

（ｅ）　　ｌ−ロンビン結合性物質のカルシウムイオン
による４１１４造変化を認識する。

（ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
認識しない。

この抗体は、τＭ−八５へとほぼ同様に用いることでと
る。

ＴＭ−八９１ （ａ）分子量、　１９５，０００±５，０００（ｂ）　
［ｇＧサブクラス、ＩｇＧ。

（ｃ）等電点、　ｐｌ＋７．０−７．４（ｄ）　　ｌ−
ロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位を認識し
ない。

（ｅ）　　トロンビン結合性物質のカルシウムイオンに
よる４Ｒ造変化を認識する。

（ｆ）　　トロンビン結合性物質の酵素による分子量変
化を認識しない。

本抗体は、ＴＭのＣａ２＋イオンとの結合による変化を
認識するので、例えば遺伝子疾患、又は酵素等により、
Ｃａ”と結合する部位が失われたＴＭを正常なものと区
別する事ができる。

本発明モノクローナル抗体を免疫吸着剤として利用する
ことによって、ＴＭを精製する方法は、例えば本発明モ
ノクローナル抗体をデキストランゲル、アガロースゲル
、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合させ、該モノク
ローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として用い、カラム
クロマトグラフィーに付すことにより実施される。不溶
性担体とモノクローナル抗体との結合は、ブロムシアン
法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、もしくはホルミ
ル基等を介して結合させることができる。

このモノクローナル抗体結合不溶性担体からなるカラム
に粗ＴＭを添加し、カラムに吸着したＴＭを溶出させる
ことにより高純度のＴＭが得られる。

本発明モノクローナル抗体の標識体を利用するＴＭの免
疫測定法は、例えば本発明モノクローナル抗体を酵素、
各種のアイソトープ、蛍光物質等の標識剤で標識し、こ
れにＴＭを含む試料を加え、ＴＭと標識体との免疫反応
生成物の標識量を測定することによって実り伍される。

また一般的な方法としてＥＬＩＳＡ法を用いることもで
きる。

（発明の効果） 本発明のハイブリドーマは、　ＴＭに対して特異的なモ
ノクローナル抗体を産生ずる。そしてこのモノクローナ
ル抗体は前記のヒト胎盤由来のＴＭのほか、ヒト尿由来
のＴＭ、ヒト血漿由来のＴＭ、ヒト肺由来のＴＭ等とも
特異的に結合するので、これを用いれば、各１ｍＴＭの
分ｌｌ！！精製工程を短縮でと、極めて高純度のＴＭを
高回収率で得ることができる。さらに、モノクローナル
抗体と結合させた不溶性担体は、洗浄すれば再使用可能
であり、精製工程の短縮だけでなく経済的であることか
ら工業的に極めて有用である。

また、本発明の抗ＴＭモノクローナル抗体は、血液の凝
固線溶系の異常疾患の治療におけるＴＭの免疫定量に使
用できる。

（実施例） 次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 抗ＴＭモノクローナル抗体産生バイプリドーマの製造： （１）免疫牌細胞の調製 ヒトの胎盤より抽出、精製したＴＭ　（分子量７１．０
００）　２０　／、ｔ　ｇをフロイント・コンプリート
・アジュバントに乳濁化させ、雄性の［ＩＡＬ［ｌ／ｃ
系マクスの皮下内に投与した。以後２〜４週間の間隔で
１ｏケ月間２０〜１００μｇのＴＭを腹腔内に投与し、
最後に１００μｇを静脈内に投与した。

３日後にマウスから牌臓を取り出し、 ｌ５ｃｏｖｅ　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）中で牌臓細胞をほぐ
し、１００メツシユの網を通過した単細胞を得、これに
低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニウム）を加えて赤血球
を溶血したのちＩＭＤＭで細胞を３回洗浄した。

（２）骨髄ｌ１ｆｆｉ細胞の調製 マウス骨ｇＩｌｆｆｉＩＩｌ胞（Ｐ３−Ａｇ８−γ）の
細胞をｒＭＤＭにウシ胎仔血清（ＦＣ：Ｓ）を１０％加
えた培地中で培養した。３日間隔の継代培養を行い、融
合の前日に新鮮な培地に交換して生存率が９０％以上の
細胞をＩＭＤＭで３回洗浄した。

（３）細胞融合 （１）及び（２）で調製された両細胞数を計測し、牌細
胞と骨髄腫細胞を３＝１の割合に混合して遠心した。上
清を捨て、細胞洗清を充分解きほぐしたのち、５０％ポ
リエチレングリコール１５００をｉｎ＋Ｑ滴下して融合
を行った、室温で３０秒間放置したのち、ＩＭＤＩｉｌ
ｌ［Ｉｌｌを１分間かけて滴下し、次いで１０ｍ１Ｌを
５分間かけてン高下しながら紐やかにン毘合した。！終
り０ｎ＋Ｑにして、１，０００ｒｐｍで８分間遠心した
。

（４）ハイブリドーマの選択的増殖 上記の沈渣を１０％ＦＣ５添加ＩＭＤＭに浮遊させ、再
度遠心し、上清液を捨てたのち、１１＾Ｔ含有１０％Ｆ
ｌ；Ｓ添加ＩＭＯＩｌｌニＫｍ胞’１−３Ｘ１０’７ｍ
ａｔ浮遊させて９６穴マイクロプレートに１００μλず
つ分注した。３〜４日ごとに培地を５０μ文追加し、こ
の培地の選択によりバイプリドーマのみを増殖させた。

（５）抗体産生バイプリドーマの検索 バイプリドーマがＪ曽ｒＪ直した穴の培養ン皮を１呆取
し、酵素免疫法によりＴＭに対する抗体を産生じている
穴を検索した。すなわち、９６穴マイクロプレートにＴ
Ｍを０．５μｇ／ｌｏ。

μＩｌ／ｗｅｌ１分注し、４℃で１８時間静置して扱者
させた０次いで検体である培養液を１００　μＩＩ　／
ｗｅ１１分注し、２５℃で２時間反応させた。０．０５
％ツイーン（丁ｗｅｅｎ）２０を含むリン酸緩衝食塩水
（Ｐ［１Ｓ−Ｔｗａｅｎ）で３回洗浄後、西洋ワサビ−
パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを１００　ｕ
　Ｉｔ　／Ｗｅｌｌ加え、２時間後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
で３回洗浄した。これに、過酸化水素０．００１％及び
オルトフェニレンジアミン０．４ｍｇ／　ｍＪｌを含有
するＱ、１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（＋Ｈ
１４．１））を加え、２５℃で３０分間反応させた後、
４．５Ｍ硫Ｈ５゜μｊ２／＋ｖｅｌｌを加え、波長４９
２ｎｍの吸光度を測定した。

（６）目的モノクローナル抗体産生バイプリドーマの選
択 発色した穴の培養液を用い、以下の実験１．２及び３を
行った。

実験！ プロティンＣの活性化能阻害作用： ヒトー胎盤由来のＴＭを０．１Ｍ塩化ナトリウム及び０
６１％ルブロールを含有する０、０２Ｍ　）−リス−塩
ｒ！ｆｃ１１ｉ　ｊｕ液（ｐＨ７．６）　ニ溶解（２０
０μｍ１７ｍＡ）ｔ、、その１０μλ及びハイプリドー
マの培養液１０μｍとを合し、３７℃で１時間インキュ
ベートした。

上記の反応液にヒト−プロティンＣの ０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び５ｎ＋Ｍ塩化カルシウム
を含有する０、０２Ｍ　）−リス−塩＊　ｉ！Ｉ　？ｌ
ｊｌ溶液（ｐｌ＋７．５）　　３０μ℃及びウシ−トロ
ンビンの上記ＪＪＩ　？ｉ？　ン’ｅｉ　を容ン＆　（
５Ｕ／ｍ））５０　ｔ、ｔＡヲカｏえ、３７℃で３０分
間インキュベートしたのち、ヒト−アンチトロンビンＩ
１１の０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、０５Ｍ
　トリス−塩酸緩’＋Ｍｉ液溶液（２Ｕ／ＩＩＩｊＺＨ
ｏｏμ℃を加えて３７℃で１０分間インキュベートし、
次いで上と同じ１５１　ｉ１？液に溶解（０，２ｍＭ）
　　シたＭＣ八へ′Ｍ、２ｏ。

μｍを加えて３７℃で１ｏ分間インキュベートした。こ
れに２０％酢１１１！６ｏｏμｌを加え、生じた八ＭＧ
の’ｔＱ度をヱ光光度計で測定した。

対照として市販正常マウス１ｇＧを用い、その測定値と
の差のあるものは阻害作用のあるもの（すなわトロンビ
ンとの結合部位を認識）とした。

実験２ Ｃａ’ゝイオンの影響： ９６穴平底マイクロプレートにヒトー胎盛由来のＴＭ（
１０００倍希釈）をコーティングし、ハイブリドーマの
培養液を１０　ｍＭ　ＥＤＴ八を含有するＰｕｓ−Ｔｗ
ａｅｎと１＝１に混合したものｆＯＱμ℃を加え、２５
℃で２時間インキュベートした。

これをＰ［１Ｓ−Ｔｗａｅｎで洗浄したのち、１１１Ｐ
−で標識した羊−抗マウスＩｇＧのＰＤＳ−Ｔｗｅｅｎ
溶液を加え、２５℃で２時間インキュベートした。これ
をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄したのち、基質１容ンＩＲ
（オルトフェニレンジアミン０．４ｍｇ／　ｍｕ及び０
．０１％過酸化水素の０．１Ｍクエン酸綴１ｉｉ（ｌＬ
　ｐ１１５．０）ヲ１００　ｕ　１１加え、２５℃テ３
０分間インキュベートした。これに４．５Ｍ硫酸５０μ
ｍを加え反応を停止させたのち、４９２ｎｍにおける吸
光度を測定した。この値と前記実施例Ｈ５）で求めた値
とに差があるものはカルシウムイオンの影響を受けるも
の（すなわち、カルシウムイオンによる４１ｒ１造変化
認識）とした。

実験３ 酵素処理したＴＭとの反応： ヒト胎盤由来のＴＭのトリス塩酸緩衝食塩水（以下ｒＴ
［ｌｓ、とする）溶液（１ｍｇ／ｎＪｌ！　Ｈ０μｊｌ
とトリプシン（シグマ社製ＴｙｐｅＸＩｎ）のｒｎｓ溶
液（ｔｏｏμＨ／ｍｕ）又はエラスターゼ（ブタ由来；
シグマ社製）の丁ｎｓ＜Ｂ液（２ｍｇ／ｍｊ２　）　１
０　μｍ１とを３７℃で３０分間反応した。これをレム
リーン去により５０５−ＰＡＧＥ（アクリルアミトン４
１度：１０％）を行い、次いでウェスタンブロッティン
グを行なった。

ニトロセルロース膜とハイブリドーマの培養液を０．０
５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリスｉｌｌ衝食塩水（ｐ
Ｈ７．６，以下ｒ　Ｔ［ｌＳ−Ｔｗｅｅｎ　Ｊ　とする
、）で１０倍希釈した溶液とを２５℃で３時間反応させ
た。これをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄したのち、ＨＩＩ
Ｐで標識した羊−抗マウスＩｇＧのＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
溶液を加え、２５℃で３時間反応させた。これをＴＢＳ
−Ｔｗｅｅｎで洗浄したのち、３０＋ｎｇの４−りＤＯ
−１−ナフトールを含むメタノール１０ｍ１！及び３０
％過酸化水素３０μｌのＴＢＳ　５０−溶液中で発色さ
せた。発色したものは酵素処理したＴＭと反応したく分
子量変化を認識しない）ものとした。

以上の実験結果により、下記の６種のハイブリドーマを
選択した。

７Ｍ−Ｈ５４ 実験ｌ：阻害作用あり。

実験２：影響を受ける。

実験３：反応する。

ＴＭ−Ｈ５９実験ｌ二阻害作用なし。

（ＦＯＲＭ　ＨＰ−１６９７）　　　実験２：影響を受
けない実験３：反応する。

ＴＭ−Ｈ６０実験１：阻害作用なし。

（ＦＢＲＭ　ＢＰ−１６９８）　　　実験２：影響を受
けない実験３：反応しない。

ＴＭ−１１６５実験ｌ：阻害作用なし。

実験２：影響を受けない 実験３：反応する。

Ｔ　Ｍ　−Ｈ７３実験１：阻害作用あり。

（ＦＩＥＲＭ　０Ｐ−１６９９）　　　実験２：影響を
受ける。

実験３二反応する。

ＴＭ−１１９１実験１：阻害作用なし。

（ＦＢＲＭ　ＢＰ−１７００）　　　実験２：影響を受
ける。

実験３：反応する。

（７）モノクローナル抗体産生細胞のクローニング： 正常マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取した１復腔
細胞をフィーダー細胞として使用した。この腹腔細胞を
１０％ＦＣ８添加ＩＭＤＭに浮遊させ（ＩＸＩＯ’個／
ｍｌり　、９６穴マイクロプレートに５０μβずつ分注
した。翌日、抗体産生ハイブリドーマを５個／ｄに調製
し、各式に１００μｌずつ分注した。３日ごとに培地を
追加又は交換して、細胞が増殖した穴から順に培養上清
を採取し、上記と同一の方法で抗体の産生を確認した。

陽性の穴は再度クローニングして抗ＴＭモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを得た。

実施例２ 抗ＴＭモノクローナル抗体の製造ニ ア週齢以上のＢＡＬＢ／ｃ系マウスにブリスタン０．５
−を腹腔的投与し、約１週間後、上記で得たハイブリド
ーマ１×１０１′個／マウスを腹腔内に接種した。約１
０日後、マウスの腹水を採取し、３．００Ｏｒｐｍで１
０分間遠心し、上清を分取した。

この上清液４．８ｍｌに等量の３Ｍ塩化す）　ＩＪウム
を含有する１、５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８，９＞を加
え、この緩衝液で平衡化したプロティンＡセファロース
ＣＬ−４８５ｍｉ！のカラムに付し、この緩衝液で充分
洗浄したのち、０．１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ４，０）
で溶出した。溶出液はＩＭ）ＩＪスス−酸緩衝液（ｐ）
Ｈ８、０）　１　ｍＩ！を入れた試験官内に３ｒｎｌず
つ分取した。

Ａ２８０を測定して蛋白分画を集め、これを水に対して
透析したのち凍結乾煙して抗ＴＭモノクローナル抗体を
得た。

ハイブリドーマとしてＴＭ−１１５４を用いた場合は、
ＴＭ−Ａ５４が３０　ｍｇ、　ＴＭ−１１５９を用いた
場合は、ＴＭ−Ａ５９が６０　ｍｇ、　ＴＭ−［１６０
を用いた場合はＴＭ−へ６０が３０ｍｇ。

ＴＭ−Ｈ６５を用いた場合はＴＭ−Ａ６５が３０　ｍｇ
、　ＴＭ−１１７３を用いた場合はＴＭ−八７３が１８
　ｍｇ、　ＴＭ−８９１を用いた場合はＴＭ−へ９１が
６　ｍｇ得られた。これらの抗ＴＭモノクローナル抗体
は前記の性質を示した。

実施例３ 免疫吸着クロマトグラフィーによるＴＭの精製：（１）
抗体カラムの製造 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ３ｇｔｒ１ｍＭ塩
酸及び０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍ炭酸
ナトリウム媛衡液（ｐＨ８．３）で順次洗浄したのち、
この緩衝液の８ｒｎｌ溶液とした。これに実施例２で得
られるモノクローナル抗体ＴＭ−Ａ５９を２Ｑｍｇ加え
、室温で２時間振盪して、グラスフィルターで脱水した
。更に、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　４０
　ｒｎｌを加えて２時間振盪したのちグラスフィルター
で脱水後、０．１Ｍ酢酸緩衝液ＣｐＨ４，０）　４０　
ｆｆＬｌ！を加え、グラスフィルターで脱水した。得ら
れた抗体結合セファロースを０．５Ｍ塩化ナトリウムを
含有する０、１Ｍ塩酸緩衝液（ｐＨ１８，３）及び０．
５Ｍ塩化す）　ＩＪウムを含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，０）で交互に３回洗浄し、１Ｍ塩化ナトリウ
ム及び０．０５％ルブロールを含有する０、０２Ｍ　）
　！ｊス塩酸緩衝液（ＴＢＳルブロール；　ｐＨ７．６
）で平衡化して抗体カラムＮα５９を得た。

同様にＴＭ−Ａ６０及びＴＭ−八６５を用いて抗体カラ
ムＮｏ、　６０及び抗体カラムＮ１１６５を製造した。

（２）抗体カラムによるＴＭの精製 上記で製造した抗体カラムに、ヒト−胎盤より抽出した
ＴＭＩＯμｇを含むＴＢＳルブロール５００μ！をかけ
、平衡化に用いたＴＢＳルブロール緩衝液４ｒｒｄ２で
洗浄した。これを１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ルブロ
ール及び２Ｍチオシアン酸カリウムを含有する０、０２
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ１７．６）　４　ｍｊ！
で溶出した。

抗体カラムＮα５９．Ｎ１１６０及びＮα６５を用いた
ときのＴＭの回収量を実施例４に記載の方法で測定した
結果は表１に示すとおりである。

表１ 実施例４ 抗ＴＭモノクローナル抗体を用いるＴＭの測定：Ｓ、ヨ
シタケらの方法［Ｊ、　Ｏｉｏｃｈｅｍ、９２　１４１
３〜１４２４　（１９８２）　）に準じて西洋わさびペ
ルオキシダーゼ（ＨＩＩＩＰ）を抗ＴＭモノクローナル
抗体に結合させた。このＩＲＰ標識抗ＴＭモノクローナ
ル抗体を用いて、以下の如＜　ｆ！ＬＩＳＡ法によりＴ
Ｍの測定を行った。

０、０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）にコー
ティング用モノクローナル抗体を４０μｇ／−溶解し、
これを９６穴平底マイクロプレートに１００μβずつ注
入し、２５℃で２時間コーティングした。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むトリス−塩酸緩衝食塩水で洗浄後、
試料を５ｍＭ塩化カルシウムを含むＴＢＳ−Ｔｗｅａｎ
に溶解して１００μｌずっ加え、２５℃で１８時間反応
させた。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ＨＲＰ標＋Ｊ＆
モノクローナル抗体を５ｍＭ塩化カルシウムを含むＴＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎで希釈して１００μｌずっ加え、２５℃
で４時間反応させた。Ｔ［］Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、
基質溶液（オルトフェニレンジアミン０．４ｍｇ　／　
ｍ！及び０．０１％過酸化水素の０．１Ｍクエン酸リン
酸緩衝液、ｐ１１５．０）を１００μ！添加し、２５℃
で６０分間反応させた。４．５Ｍ硫酸５０μｌを加えて
反応を停止させた後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定
した。

コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ−＾５９
を用い、標識用モノクローナル抗体としてＴλ（−Ａ７
３を用いた場合の検量線を第１図に、コーティング用モ
ノクローナル抗体としてＴＭ−八６０を用い、標識用モ
ノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ７３を用いた場合の検
量線を第２図に、コーティング用モノクローナル抗体と
してＴＭ−八５９を用い、標識用モノクローナル抗体と
してＴＭ−八９１を用いた場合の検量線を第３図に、コ
ーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ−Ａ２Ｂを
用い、！ＬＴｈ用モノクローナル抗体としてＴＭ−八６
０を用いた場合の検量線を第４図に示した。これらは何
れも極めて感度が高く、しかも良好な直線性を示してお
り、０．８〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲のＴＭを検出できる
ことがわかる。

血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）患者血清及び正常人血
清を用いて上記方法によって血清中のＴＭ［ｌを測定し
たところ、上記の何れの測定系を用いても、ＤＩＣ患者
の血清中に、正常人の血清中の約１．５倍のＴＭがＳ忍
められた◎

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図は、実施例４の７Ｍ
測定法におけるＴＭａ度と吸光度（４９２ｎｍ）との関
係を示す図面である。 第１図；コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ２Ｂを使用、標識用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ７３を使用。 第２図；コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−へ６０を使用、標識用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ７３を使用。 第３図；コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−八５９を使用、標識用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ９１を使用。 第４図；コーティング用モノクローナル抗体としてＴＭ
−Ａ２Ｂを使用、標識用モノクローナル抗体としてＴＭ
−八〇〇を使用。

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＴＭ−Ａ５４、ＴＭ−Ａ５９、ＴＭ−Ａ６５、Ｔ
   Ｍ−Ａ７３及びＴＭ−Ａ９１と名付けられた群から選択
   され、トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を特
   異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質に特異
   的に結合するモノクローナル抗体。
2. （２）ＴＭ−Ａ５４と名付けられ、次の性質を有してい
   る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量；１７５，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ＿１ （ｃ）等電点；ｐＨ７．２−７．７ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
   を認識する。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
   構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
   認識しない。
3. （３）ＴＭ−Ａ５９と名付けられ、次の性質を有してい
   る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量；１９０，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ＿１ （ｃ）等電点；ｐＨ７．１−７．６ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
   を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
   構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
   認識しない。
4. （４）ＴＭ−Ａ６５と名付けられ、次の性質を有してい
   る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量；１９０，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ＿１ （ｃ）等電点；ｐＨ７．０−７．５ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
   を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
   構造変化を認識しない。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
   認識しない。
5. （５）ＴＭ−Ａ７３と名付けられ、次の性質を有してい
   る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量；２００，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ＿１ （ｃ）等電点；ｐＨ７．０−７．５ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
   を認識する。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
   構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
   認識しない。
6. （６）ＴＭ−Ａ９１と名付けられ、次の性質を有してい
   る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量；１９５，０００±５，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス；ＩｇＧ＿１ （ｃ）等電点；ｐＨ７．０−７．４ （ｄ）トロンビン結合性物質のトロンビンとの結合部位
   を認識しない。 （ｅ）トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる
   構造変化を認識する。 （ｆ）トロンビン結合性物質の酵素による分子量変化を
   認識しない。
7. （７）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を特
   異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免疫
   した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合し、得
   られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、その培養液
   をトロンビン結合性物質と反応させ、抗原抗体反応を示
   す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで上記
   抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、ＥＤＴＡの存在
   下における上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で処
   理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応を行い、
   その反応性によりハイブリドーマを選別したのち、選択
   されるハイブリドーマが産生するものである特許請求の
   範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
8. （８）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を特
   異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免疫
   した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合し、得
   られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、その培養液
   をトロンビン結合性物質と反応させ、抗原抗体反応を示
   す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで上記
   抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、ＥＤＴＡの存在
   下における上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で処
   理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応を行い、
   トロンビンと結合せず、ＥＤＴＡの存在下で反応せず、
   酵素処理したトロンビン結合性物質と反応する物質を産
   生するものとして選択されるハイブリドーマが産生する
   ものである特許請求の範囲第１項、第２項もしくは第７
   項記載のモノクローナル抗体。
9. （９）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を特
   異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免疫
   した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合し、得
   られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、その培養液
   をトロンビン結合性物質と反応させ、抗原抗体反応を示
   す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで上記
   抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、ＥＤＴＡの存在
   下における上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で処
   理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応を行い、
   トロンビンと結合し、ＥＤＴＡの存在下で反応し、酵素
   処理したトロンビン結合性物質と反応する物質を産生す
   るものとして選択されるハイブリドーマが産生する特許
   請求の範囲第１項、第３項もしくは第７項記載のモノク
   ローナル抗体。
10. （１０）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を
    特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免
    疫した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合し、
    得られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、その培養
    液をトロンビン結合性物質と反応させ、抗原抗体反応を
    示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで上
    記抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、ＥＤＴＡの存
    在下における上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で
    処理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応を行い
    、トロンビンと結合し、ＥＤＴＡの存在下で反応し、酵
    素処理したトロンビン結合性物質と反応する物質を産生
    するものとして選択されるハイブリドーマが産生するも
    のである特許請求の範囲第１項、第４項もしくは第７項
    記載のモノクローナル抗体。
11. （１１）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を
    特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免
    疫した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合し、
    得られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、その培養
    液をトロンビン結合性物質と反応させ、抗原抗体反応を
    示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで上
    記抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、ＥＤＴＡの存
    在下における上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で
    処理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応を行い
    、トロンビンと結合せず、ＥＤＴＡの存在下で反応せず
    、酵素処理したトロンビン結合性物質と反応する物質を
    産生するものとして選択されるハイブリドーマが産生す
    るものである特許請求の範囲第１項、第５項もしくは第
    ７項記載のモノクローナル抗体。
12. （１２）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を
    特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免
    疫した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合し、
    得られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、その培養
    液をトロンビン結合性物質と反応させ、抗原抗体反応を
    示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで上
    記抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、ＥＤＴＡの存
    在下における上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で
    処理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応を行い
    、トロンビンと結合し、ＥＤＴＡの存在下に反応せず、
    酵素処理したトロンビン結合性物質と反応する物質を産
    生するものとして選択されるハイブリドーマが産生する
    特許請求の範囲第１項、第６項もしくは第７項記載のモ
    ノクローナル抗体。
13. （１３）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を
    増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免疫した動
    物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合することによ
    り得られる、トロンビン結合性物質に特異的に結合する
    モノクローナル抗体を産生する、ＴＭ−Ｈ５４、ＴＭ−
    Ｈ５９、ＴＭ−Ｈ６５、ＴＭ−Ｈ７３、及びＴＭ−Ｈ９
    １と名付けられた群から選択されるハイブリドーマ。
14. （１４）トロンビンと結合してプロテインＣの活性化を
    特異的に増強するヒト由来のトロンビン結合性物質で免
    疫した動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞とを融合し、
    得られるハイブリドーマを選択的に増殖させ、その培養
    液をトロンビン結合性物質と反応させ、抗原抗体反応を
    示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次いで上
    記抗原抗体反応物とトロンビンとの反応、ＥＤＴＡの存
    在下における上記抗原抗体反応及び予め蛋白分解酵素で
    処理したトロンビン結合性物質との抗原抗体反応を行い
    、その反応性によりハイブリドーマを選別したのち、選
    択されるものである特許請求の範囲第１３項記載のハイ
    ブリドーマ。
15. （１５）ＴＭ−Ｈ５４と名付けられ、トロンビンと結合
    してプロテインＣの活性化を特異的に増強するヒト由来
    のトロンビン結合性物質で免疫した動物の抗体産生細胞
    と、骨髄腫細胞とを融合し、得られるハイブリドーマを
    選択的に増殖させ、その培養液をトロンビン結合性物質
    と反応させ、抗原抗体反応を示す抗体を産生するハイブ
    リドーマを選択し、次いで上記抗原抗体反応物とトロン
    ビンとの反応、ＥＤＴＡの存在下における上記抗原抗体
    反応及び予め蛋白分解酵素で処理したトロンビン結合性
    物質との抗原抗体反応を行い、トロンビンと結合せず、
    ＥＤＴＡの存在下で反応せず、酵素処理したトロンビン
    結合性物質と反応する物質を産生するものとして選択さ
    れるものである特許請求の範囲第１３項もしくは第１４
    項記載のハイブリドーマ。
16. （１６）ＴＭ−Ｈ５９と名付けられ、トロンビンと結合
    してプロテインＣの活性化を特異的に増強するヒト由来
    のトロンビン結合性物質で免疫した動物の抗体産生細胞
    と、骨髄腫細胞とを融合し、得られるハイブリドーマを
    選択的に増殖させ、その培養液をトロンビン結合性物質
    と反応させ、抗原抗体反応を示す抗体を産生するハイブ
    リドーマを選択し、次いで上記抗原抗体反応物とトロン
    ビンとの反応、ＥＤＴＡの存在下における上記抗原抗体
    反応及び予め蛋白分解酵素で処理したトロンビン結合性
    物質との抗原抗体反応を行い、トロンビンと結合し、Ｅ
    ＤＴＡの存在下で反応し、酵素処理したトロンビン結合
    性物質と反応する物質を産生するものとして選択される
    ものである特許請求の範囲第１３項もしくは第１４項記
    載のハイブリドーマ。
17. （１７）ＴＭ−Ｈ６５と名付けられ、トロンビンと結合
    してプロテインＣの活性化を特異的に増強するヒト由来
    のトロンビン結合性物質で免疫した動物の抗体産生細胞
    と、骨髄腫細胞とを融合し、得られるハイブリドーマを
    選択的に増殖させ、その培養液をトロンビン結合性物質
    と反応させ、抗原抗体反応を示す抗体を産生するハイブ
    リドーマを選択し、次いで上記抗原抗体反応物とトロン
    ビンとの反応、ＥＤＴＡの存在下における上記抗原抗体
    反応及び予め蛋白分解酵素で処理したトロンビン結合性
    物質との抗原抗体反応を行い、トロンビンと結合し、Ｅ
    ＤＴＡの存在下で反応し、酵素処理したトロンビン結合
    性物質と反応する物質を産生するものとして選択される
    ものである特許請求の範囲第１３項もしくは第１４項記
    載のハイブリドーマ。
18. （１８）ＴＭ−Ｈ７３と名付けられ、トロンビンと結合
    してプロテインＣの活性化を特異的に増強するヒト由来
    のトロンビン結合性物質で免疫した動物の抗体産生細胞
    と、骨髄腫細胞とを融合し、得られるハイブリドーマを
    選択的に増殖させ、その培養液をトロンビン結合性物質
    と反応させ、抗原抗体反応を示す抗体を産生するハイブ
    リドーマを選択し、次いで上記抗原抗体反応物とトロン
    ビンとの反応、ＥＤＴＡの存在下における上記抗原抗体
    反応及び予め蛋白分解酵素で処理したトロンビン結合性
    物質との抗原抗体反応を行い、トロンビンと結合せず、
    ＥＤＴＡの存在下で反応せず、酵素処理したトロンビン
    結合性物質と反応する物質を産生するものとして選択さ
    れるものである特許請求の範囲第１３項もしくは第１４
    項記載のハイブリドーマ。
19. （１９）ＴＭ−Ｈ９１と名付けられ、トロンビンと結合
    してプロテインＣの活性化を特異的に増強するヒト由来
    のトロンビン結合性物質で免疫した動物の抗体産生細胞
    と、骨髄腫細胞とを融合し、得られるハイブリドーマを
    選択的に増殖させ、その培養液をトロンビン結合性物質
    と反応させ、抗原抗体反応を示す抗体を産生するハイブ
    リドーマを選択し、次いで上記抗原抗体反応物とトロン
    ビンとの反応、ＥＤＴＡの存在下における上記抗原抗体
    反応及び予め蛋白分解酵素で処理したトロンビン結合性
    物質との抗原抗体反応を行い、トロンビンと結合し、Ｅ
    ＤＴＡの存在下で反応せず、酵素処理したトロンビン結
    合性物質と反応する物質を産生するものとして選択され
    るものである特許請求の範囲第１３項もしくは第１４項
    記載のハイブリドーマ。
20. （２０）免疫吸着カラムクロマトグラフィーによるトロ
    ンビン結合性物質の精製に当り、ＴＭ−Ａ５４、ＴＭ−
    Ａ５９、ＴＭ−Ａ６５、ＴＭ−Ａ７３及びＴＭ−Ａ９１
    と名付けられた群から選択され、トロンビンと結合して
    プロテインＣの活性化を特異的に増強するヒト由来のト
    ロンビン結合性物質に特異的に結合するモノクローナル
    抗体を用いることを特徴とするトロンビン結合性物質の
    精製法。
21. （２１）トロンビン結合性物質の測定に当り、ＴＭ−Ａ
    ５４、ＴＭ−Ａ５９、ＴＭ−Ａ６５、ＴＭ−Ａ７３及び
    ＴＭ−Ａ９１と名付けられた群から選択され、トロンビ
    ンと結合してプロテインＣの活性化を特異的に増強する
    ヒト由来のトロンビン結合性物質に特異的に結合するモ
    ノクローナル抗体を用いることを特徴とするトロンビン
    結合性物質の測定法。