KR100245542B1 - 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체 - Google Patents

응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역친화성 크로마토그래피하여 인자(XIII) 또는 (XIIIA)를 정제하는 방법, 인자(XIIIA)에 대한 모노클로날 항체, 이를 제조하는 방법 및 이의 용도를 기술하였다.

Description

응고 인자 XIII 또는 XIIIA의 정제방법 및 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체
본 발명은 면역친화성 크로마토그래피에 의해 인자 XIII 또는 XIIIA를 정제하는 방법. 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체, 이를 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
인자 XIII는 피브린 단량체 사이에 공유결합을 형성시켜 혈액 응고의 최종 단계에서 형성되는 피브린을 안정화시키는 글루타민 전이효소이다. 특히, 인자 XIII는 혈장 및 혈소판중에서 발견된다. 혈장에서는 함께 공유결합하지 않는 A 및 B아단위(subunit)의 복합체로서 존재한다. 혈소판에는 유리 A 아단위만이 존재한다. 단지 A 아단위만이 피브린-안정화 작용을 위해 필요하다. 인자 XIIIA의 결핍(선천성 또는 후천성)은 중요한 응고 장애를 초래하는데 이는 인자 XIIIA를 대체시켜 치료할 수 있다.
다양한 출발 물질로부터 인자 XIIIA를 정제하는 다수의 방법은 공지되어 있지만, 인자 XIIIA의 부적당한 순도, 많은 정제 단계 및 낮은 수율과 같은 일정한 단점을 초래한다.
치료 목적을 위해 인체 조직 또는 체액으로부터 단백질을 정제하는데 있어서, 높은 순도는 바이러스 입자 전달의 위험 저하와 관련된다. 외래 유기체로부터 재조합 단백질을 정제하는데 있어서, 잠재적으로 면역원성인 숙주 세포로부터의 단백질을 가능한 한 제거하기 위해서는 매우 높은 순도가 절대 필요하다. 따라서, 모노클로날 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의한 인자 XIII의 정제는 바이러스 안전성(인제 조직 또는 체액으로부터 정제하는 경우에)을 개선시키고 수득되는 재조합 생성물의 요구되는 순도를 조장하는 방법이다.
면역친화성 크로마토그래피에 의한 정제는 다양한 단백질에 대하여 기술되어 있다. 그러나, 모든 모노클로날 항체가 면역친화성 크로마토그래피 방법에 의한 효소 또는 다른 생물학적 활성 분자의 정제에 적합한 것은 아니다. 왜냐하면, 항원-항체 복합체를 해리시키기 위해서는 종종 항원의 생물학적 활성의 비가역학적 파괴를 초래하는 조건이 요구되기 때문이다(예를 들어, 최대 pH값 또는 고농도의 카오트로픽(chaotropic)염). 또한, 면역친화성 크로마토그래피에 의한 인자 XIIIA의 정제는 문헌[참조; Gniewek, R.A. et al.(1985) Fed. Proc. 44 : 1070]에 기술되어 있다. 이에 따르면, B아단위에 대한 항체가 지지체상에 고정화되고 인자 XIIIA와 인자(XIIIB)의 복합체가 혈장으로부터 흡착된다. 이어서, 인자 XIIIA를 B아단위로부터 해리시킨 다음 친화성 겔로부터 용출시킨다. 유리 인자 XIIIA만을 함유하는, 사람 태반 또는 재조합 세포로부터 인자 XIIIA를 정제하기 위해서는 이 방법을 사용할 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈장, 태반 또는 인자 XIIIA쇄에 대한 유전 정보를 함유하는 재조합 세포의 추출물 또는 배양 상등액과 같은 출발 물질로부터 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 인자 XIIIA 또는 XIIIA의 정제 방법에 관한 것이다.
놀랍게도, 상기 출발 물질로부터 인자 XIII 또는 XIIIA를 정제하는데 적합한 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체가 발견되었다.
따라서, 본 발명은 인자 XIII 또는 XIIIA를 함유하는 용액을 지지체물질(친화성 물질)에 결합된 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체와 접촉시키고, 친화성 물질 및 액체를 서로 분리하며, 친화성 물질로부터 인자 XIII 또는 XIIIA를 생물학적 활성 형태로 용출함을 특징으로 하여, 면역친화성 크로마토그래피 방법에 의해 인자 XIII 또는 XIIIA를 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 위한 모노클로날 항체는, 예를 들어, 본 분야의 숙련가에게 그 자체로 공지된, 항체 분자의 F(ab')2, F(ab)또는 Fv 단편 또는 항원-결합 일본쇄와 같은 모노클로날 항체의 면역 반응성 단편 또는 이의 유도체를 포함한다.
인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체는 IgM류를 포함하며 문헌에 기술되어 있다[참조 : Lynch. G. et al. (1985) Thromb. Haemost. 54 : 274]. 일반적으로, IgM항체는 면역화학적 공정에 있어 IgG 항체 만큼은 적합하지 않는데, 이는 IgM 항체가 종종 낮은 특이성 및 친화성을 가지기 때문이다.
따라서, 본 발명의 목적은 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체, 바람직하게는 IgG류의 모노클로날 항체를 제조하는 것이다.
IgG류의 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체는 마우수를 4주 간격으로 정제된 인자 XIIIA로 수회 면역시킨 후 수득된다.
따라서, 본 발명은 IgM류를 제외한, 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체, 바람직하게는 IgG류의 모노클로날 항체에 관한 것이다.
모노클로날 항체는 문헌[참조 : Kohler 및 Milstein(Nature 256 : 285-308)]의 방법 또는 당해 분야의 숙련가에게 그 자체로 공지된 많은 변형 방법(예 : Goding, J.W.(1980). J. Immunol. Meth. 39 : 285-308). 예를 들어 하기 방법으로 제조할 수 있다 : 포유동물, 바람직하게는 마우스 또는 랫트를 1 내지 8주, 바람직하게는 4 내지 6주 간격으로 인자 XIII를 함유하는 액체, 바람직하게는 프로인트 보조제중 정제된 인자 XIIIA의 유제로 수회 조사하여 면역시킨다. 최종 주사에 있어서, 인자 XIIIA는 수용액으로, 바람직하게는 복강내 또는 정맥내로 융합 예정일의 3 내지 5일전에 투여한다. 항체-생성 세포를 수득하기 위해서, 면역시킨 동물을 죽이고 림프 기관, 바람직하게는 비장을 떼어내어 림프구를 취한다. 세포 배양액에서 영구적으로 성장하는 항체-생성 세포를 수득하기 위해서는 림프구가 비사멸되어야만 한다. 이는 다양한 방법, 예를 들어 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 또는 레트로바이러스로 형질전환시켜 수행할 수 있다. 그러나, 림프구는 바람직하게는 골수종 세포와 융합된다. 특히 적합한 골수종 세포주는 예를들어 면역글로불린을 분비하지 않는 세포주 SP2/0-Ag14 또는 X63-Ag8.653이다. 세포는 30 내지 60% 농도의 용액에서 1000 내지 6000의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 배양시켜 융합시킬 수 있지만, 예를 들어 전자 융합과 같은 기타 방법도 적합하다. 림프구의 하이브리드 및 골수종 세포(하이브리도마)를 선별하고, 적합한 영양 배지에서 배양하여 증식시킨다.
하이브리도마를 세포 융합 1 내지 3주후에 특이 항체의 생성에 대해 시험한다. 이를 위해 당해 분야의 숙련가들에게 그 자체로 공지된 다수의 시험 시스템을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 인자 XIII이 고체상에서 흡착되는 ELISA 시험 시스템이 사용된다. 하이브리도마의 세포 상등액을 고체상에서 인자 XIII와 초기에 접촉시키고, 인자 XIII-특이적 항체를 마우스 IgG에 대한 효소-표지된 항체와 함께 배양한 다음 표지 효소에 대한 색소원성 기질을 부가하여 검출한다. 인자 XIIIA에 대한 특이적 항체를 생성하는 세포를 현미경 조사하에 플레이팅하거나 제한 희석 방법으로 클로닝한다. 항체를 수득하기 위해 클로닝된 세포주를 시험관내에서 성장시킨다. 모노클로날 항체는 세포의 소모된 배양 배지로부터 수득된다. 이를 위해 다수의 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 고정화된 단백질 A 또는 인자 XIIIA에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행한다.
이어서, 정제된 모노클로날 항체를 면역친화성 크로마토그래피에 대한 적합성에 대해 시험한다. 이를 수행하기 위해서, 개개의 모노클로날 항체를 당해 분야의 숙련가들에게 친숙한 방법으로 적합한 지지체 물질에 커플링시킨다. 다양한 물질, 예를 들어 아가로즈의 유도체, 폴리아크릴아미드 또는 셀룰로즈가 친화성 크로마토그래피에서 지지체로서 사용된다. 지지체를 활성화시킨 후, 항체를 예를 들어 시아노겐 브로마이드, 카보디이미드와 커플링시키거나 인접한 하이드록실 그룹을 과요오드산염으로 산화시켜 커플링시킬 수 있다. 다수의 다른 지지체 물질 및 커플링 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 원칙적으로, 커플링된 항체의 활성을 손상시키지 않거나 약간만 손상시키는 통상적인 모든 지지체 물질 및 모든 커플링 방법이 적합하다.
이어서, 다양한 모노클로날 항체를 갖는 친화성 겔을 인자 XIIIA의 정제에 대한 그들의 적합성에 대해 시험한다. 이를 수행하기 위해서, 인자 XIIIA를 함유하는 용액을 친화성 겔을 통해 펌핑시키고, 통과물(flow-through)중의 인자 XIII 활성을 측정한다. 인자 XIIIA가 흡착된 겔을 인자 XIIIA의 자연 용출 가능성에 대해 시험한다. 바람직한 방법에서, 면역친화성 겔에 대한 인자 XIIIA의 결합은 낮은 이온 농도의 완충액중에서, pH 5.5 내지 8.5에서 및 온도 4℃ 내지 37℃에서 발생한다. 바람직하게는, 완충액은 0.01 내지 0.05mol/l 트리스 또는 인산염 및 0 내지 0.1mol/l NaCl을 함유한다. 정제된 인자 XIIIA를 수득하기 위한 항원-항체 복합체의 후속적 해리에는 종종 인자 XIIIA의 활성을 비가역적으로 파괴시키는 조건이 요구된다. 이러한 이유로 인자 XIII 활성을 보유시키면서 항원-항체 복합체를 해리시키는 것을 가능하게 하는 항체가 요구된다. 원칙적으로, 예를 들어 특정한 유기 용매, 세정제, 이온 농도가 높은 수용액 또는 다양한 용출제의 배합물과 같은 다양한 마일드 용출제가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 고농도의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 pH 5.5 내지 8.5에서 0.01 내지 0.05mol/l 트리스 또는 인산염을 포함하는 완충액중의 0.5 내지 3mol/l NaCl이 인자 XIIIA의 용출에 사용된다.
하기의 실시예는 본 발명을 예시한다.
[실시예 1]
면역 항원(정제된 인자 XIIIA)의 제조
a) 인자 XIIIA를 정제하기 위한 면역친화성 겔의 제조
인자 XIIIA에 대한 폴리클로날 항체를 친화성 크로마토그래피에 의해 인자 XIIIA에 대한 항혈청(Behringwerke 제품)으로부터 정제한다. 이를 수행하기 위해서, 항혈청 10ml를 단백질 A-R세파로즈(Pharmacia 제품) 50ml에 펌핑시킨다. 겔을 0.14mol/l Na2HPO4(pH 8.0) 500ml로 세척한다. 결합된 항체를 0.1mol/l 글리신(pH 3.0) 100ml로 용출시키고, 1mol/l 트리스(pH 8.0)을 사용하여 pH 6.5로 조절한다. 항체를 0.1mol/l 시트르산 삼나트륨(pH 6.5 : 커플링 완충액)에 투석시키고, 시아노겐 브로마이드로 활성화시킨 R세파로즈 4B에 커플링시키며; 시아노겐 브로마이드로 활성화시킨 R세파로즈 4B 15g을 1mmol/l HCl중에 현탁시키고, 크로마토그래피 컬럼상에 충전시켜 HCl(1mmol/l) 1000ml로 세척한다. 이어서, 컬럼을 커플링 완충액 50ml로 평형시키고, 겔을 정제된 항체(커플링 완충액중 2mg/ml) 40ml를 함유하는 밀폐가능한 용기에 이동시켜 실온에서 2시간 동안 진탕시킨다. 이어서, 겔을 컬럼에 반송하고, 커플링 완충액 100ml로 세척하며, 에탄올아민-HCl(1mol/l, pH 8.0) 100ml를 함유하는 밀폐가능한 용기에 넣고, 실온에서 2시간 동안 진탕시킨다. 겔을 다시 컬럼에 이동시키고, 각각 0.1mol/l 아세트산 나트륨, 1mol/l NaCl(pH 4.0) 및 0.1mol/l 트리스, 1mol/l NaCl(pH 8.0) 300ml를 사용하여 교대로 세척한다. 이 공정을 5회 반복한다. 최종적으로, 겔을 0.01mol/l Na2HPO4, 0.01mol/l NaH2PO4, 0.15mol/l NaCl(pH 7.2)(PBS)로 평형시킨 다음 사용한다.
b) 인자 XIIIA의 정제
태반 인자 XIII(RFibrogammin, Behringwerke AG 제품) 2500단위를 증류수중에 용해시키고, 면역친화성 겔을 통해 펌핑시킨다. 겔을 PBS로 세척하고, 280nm에서의 흡광도가 0.02이하일때 0.2M 글리신(pH 2.5)으로 용출한다. 인자 XIIIA를 함유한 용출액은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 단일 밴드로 나타난다.
[실시예 2]
인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체의 제조
a) 마우스의 면역화
암컷 BALB/c 마우스에 완전 프로인트(Freund) 보조제중 인자 XIIIA 50μg의 유액(실시예 1에서와 같이 제조하다)를 피하 주사하여 면역화시킨다(1일). 불완전 프로인트 보조제로 유화시킨 인자 XIIIA 30μg을 각각 28일 및 56일에 피하 주사한다. 이어서, 92일에 생리학적 식염수 0.5ml중 인자 XIIIA 100μg을 복강내 주사한다.
b) 림프구와 골수종 세포와의 융합
95일에, 비장을 떼어낸 후, 림프구를 기계적으로 파괴(약 1×108세포)하여 수득한다. 림프구를 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글 배지(DMEM)에서 세척하고, 골수종 세포주 SP2/0-Ag14의 5×107세포와 혼합한 후 회전시켜 가라 앉는다. 상등액을 완전히 제거한 다음, DMEM중 폴리에틸렌 글리콜 4000의 50% 농도 용액 0.5ml을 1분에 걸쳐 세포 펠릿에 적가한다. 현탁액을 37℃에서 90초동안 항온처리한 다음 DMEM 7.5ml를 5분에 걸쳐 가하여 희석시킨다. 실온에서 10분 동안 항온처리한 후, DMEM을 사용하여 용적을 40ml 이하로 만들고, 세포를 회전시켜 가라 앉힌다. 상등액을 흡출기로 빨아내어 제거한 다음 20% 송아지 태아 혈청(FCS) 및 13.6mg/ml 하이포크산틴, 0.18mg/ml 아미노프테린, 3.9mg/ml 티미딘(HAT 배지)를 함유하는 DMEM 중에 세포를 재현탁시키고, 6미세역가 플레이트(웰당 20μl)상에 접종시킨다. 사용된 배지를 3 내지 4일 간격으로 신선한 것으로 바꾸고, HAT 배지를 10일 후 HT 배지로 대체시킨다.
c) 인자 XIIIA에 대한 항체 분석
융합 14일후, 융합 세포의 세포 배양 상등액을 효소 면역분석에 의해 인자 XIIIA에 대한 항체에 대해 분석한다 : 폴리스티렌 미세역가 플레이트를 0.1mol/l Nacl, 0.1mol/l 아세트산 나트륨(pH 5.5)중 인자 XIIIA 0.5μg/ml와 함께 항온처리한다(4℃, 24시간). 이어서, 세포 배양 상등액을 적용시킨 다음(37℃, 2시간). 마우스 IgG에 대한 퍼옥시다제-접합된 항체와 함께 항온처리한다. 사용된 기질은 0.1mol/l 시트르산, 0.1mol/l Na2HPO4(pH 4.5)중 0.1%(중량/용적) 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 및 0.012%(용적/용적)H2O2의 용액이다. 37℃에서 30분 동안 항온처리한 후, 405nm에서의 흡광도를 측정한다. 각 배양 단계 사이에 검정 플레이트의 웰을 PBS/Tween으로 세척한다.
d) 항체-생성 세포주의 클로닝
기술된 효소 면역 검정에서 상등액이 강하게 양성 반응(흡광도＆gt;1.5)을 나타내는 세포를 제한 희석 방법에 의해 클로닝시킨다. 이 경우, 20% FCS 및 5% RHECS(Costar 제품)를 함유하는 DMEM중 약 60개의 세포를 세포 배양 플레이트의 96웰상에 분배시킨다. 각 클론을 현미경하에서 동정하여 항체 생성에 대해 분석한다. 클로닝은 2회 반복한다.
e) 모노클로날 항체의 정제
클론 세포주를 롤러 병에 옮기고, 이스코페(Iscove) 변형된 둘베코 배지중에서 배양하여 항체를 생성한다. 원심분리하고 종이 필터로 여과시켜 세포를 제거하고, 상등액을 하외여과에 의해 약 10-배로 농축시킨다. 농축액을 단백질 A-R세파로즈 CL-4B(Pharmacia 제품)을 통해 통과시키고, 결합된 IgG를 0.2mol/l 글리신/HCl(pH 3.0)으로 용출한다. 단백질-함유 분획을 0.1mol/l 시트레이트(pH 6.5)에 대하여 투석하고, 한외여과에 의해 약 5mg/ml로 농축시킨다.
[실시예 3]
면역친화성 크로마토그래피에 의한 천연 대반 인자 XIIIA의 정제
태반 인자 XIII의 동결건조된 농축액(RFibrogammin, Behringwerke AG 제품)을 증류수에 용해시킨다. 용액 10ml 분획(5.2U/mg의 특이적 활성을 갖는 인자 XIII 600단위에 상응한다)을 모노클로날 항체(실시예 2에서와 같이 정제하고 시아노겐 브로마이드로 활성화시킨 R세파로즈 4B에 대해 실시예 1에서와 같이 커플링시킨다)를 갖는 친화성 겔을 통해 펌핑시킨다. 이어서, 비결합된 단백질을 세척 완충액(0.03mol/l NaCl, 0.02mmol/l Na2HPO4, pH 7.4) 100ml로 컬럼으로부터 세척하여 제거한다. 1mol/l NaCl을 함유하는 세척 완충액으로 인자 XIIIA를 용출한다.
특이적 활성은 90 내지 105U/mg이다 : 단백질은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 75,000달톤(Dalton)의 분자량을 갖는 단일 밴드로서 나타난다.

Claims (7)

  1. 인자 XIII 또는 XIIIA를 함유하는 용액을 지지체 물질(친화성 물질)에 결합된, IgM를 제외한, 인자 XIIIA에 대한 모노클로날 항체와 접촉시키고, 친화성 물질 및 액체를 서로 분리하여, 친화성 물질로부터 인자 XIII 또는 XIIIA를 생물학적 활성 형태로 용출함을 특징으로 하여, 면역친화성 크로마토그래피 의해 응고 인자 XIII 또는 XIIIA를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체의 면역반응성 단편 또는 유도체가 지지체 물질에 결합되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, IgG류의 모노클로날 항체가 사용되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 0.5 내지 3mol/l의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염을 함유하는 완충액이 용출용으로 사용되는 방법.
  5. 혈액응고 인자 XIIIA의 생물학적 활성을 유지시키면서 항원-항체 결합으로 결합된 인자 XIIIA의 용출을 가능케하는, IgM류를 제외한, 혈액 응고 인자 XIIIA에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  6. 제5항에 있어서, IgG류인 모노클로날 항체.
  7. 제5항에 있어서, 지지체 물질에 결합된 모노클로날 항체.
KR1019920014956A 1991-08-22 1992-08-20 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체 KR100245542B1 (ko)

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