JP2519561B2 - 酸性糖タンパク質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の利用分野） 本発明は、特定の処理を行ったエリスロポリエチンで
免疫した動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合
させたハイブリドーマ細胞より得られたモノクローナル
抗体に結合可能な特定の酸性糖タンパク質に関する。

エリスロポエチン（EPO）は、貧血患者、手術後患
者、腎摘出後の人工透析患者に広く適用可能な医薬であ
る。本発明にかかる前記ハイブリドーマ細胞等は、EPO
を純粋に取得するのに好適に使用される。

（従来技術と問題点） エリスロポエチンは、赤血球生成促進因子とも呼ば
れ、骨髄に存在する赤血球系幹細胞に働いて、赤血球系
細胞への分化を促進させる一種のホルモンであり、主と
して腎で生成されると考えられている。EPO生成を調節
するのは、酸素需要供給のバランスであり、酸素欠乏状
態に陥ると生成が亢進し、逆に、酸素過剰状態になると
生成が減少する。例えば、貧血患者では、EPO生成が増
加し、EPOが尿に排泄されるようになる。EPOは市販され
ており、分子量３〜４万の酸性糖タンパク質であるが、
化学構造は完全には解明されていない。

尿中にEPOが含まれていることは前記のとおりである
が、その含量は極めて低く、全尿タンパク質中約0.01〜
0.02重量％程度とみられる。このため、尿からEPOを有
効に得ることは困難であり、通常のクロマト吸着法で
は、EPOを高純度で効率よく採取することはできない。

（発明の知見と目的） 本発明者らは、免疫抗体を結合させた吸着カラム（抗
体吸着カラム）を使用して、貧血患者の尿等から免疫特
異的にEPOを製造する方法について検討を行ってきた。
カラムに使用する抗体を得るべく、精製EPOで免疫した
マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合さ
せ、モノクローナル抗EPO抗体を産生するハイブリドー
マ細胞を得ることを試みた。しかし、エリスロポリエチ
ンに対する抗体を生産するハイブリドーマは得られなか
った。この原因は、精製したエリスロポエチンをSDS電
気泳動した時にエリスロポエチンに近接して泳動される
蛋白質で、強い免疫原性を有する蛋白質が存在し、この
蛋白質に対する抗体が優先的に生産されることによると
考えられた。このため、この抗体生産阻害の原因となる
蛋白質に対するモノクローナル抗体をまず作製し、抗原
として使用するエリスロポリエチンから、この抗体と反
応する蛋白質を除去した。ついで、このエリスロポエチ
ンを抗原として、動物を免疫し、エリスロポエチンに反
応性を有する抗体生産ハイブリドーマを得た。このハイ
ブリドーマ細胞が産生した抗EPO抗体を結合させて抗体
吸着カラムを作成し、これに貧血患者の尿タンパク質を
通したところ、目的のEPOが特異的に吸着され、収率よ
く高純度EPOを取得できた。そして、かかるモノクロー
ナル抗体がハイブリドーマ細胞から安定的に得られるこ
とを知見した。

本発明は、この知見に基づき完成されたもので、本発
明の目的は、エリスロポエチンで免疫した動物の脾臓細
胞とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ
細胞より得られたモノクローナル抗体に結合可能な特定
の酸性糖タンパク質を提供しようとするものである。

（発明の構成と効果） 本発明は、次の（ａ）〜（ｅ）の性質を示す糖タンパ
ク質に関する。

（ａ）ソジウム ドデシル サルフェート（SDS）電気
泳動を行なったエリスロポリエチンで免疫した動物の脾
臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリド
ーマ細胞より得られ、SDS処理をしたエリスロポエチン
に結合性を有する抗エリスロポエチンモノクローナル抗
体を用いて、あらかじめSDS処理を行なったエリスロポ
エチン含有液を精製することによって得ることができ、 （ｂ）少なくとも約45,000単位/mgタンパク質以上のエ
リスロポエチン比活性を有し、 （ｃ）SDS−PAGE法で分子量30,000〜40,000を示し、 （ｄ）セファデックス（ファルマシア製）によるゲル濾
過法で分子量45,000〜65,000を示し、 （ｅ）逆相カラムを装置した高速液体クロマトグラフィ
ー分析により単一のピークを示す。

本発明においてハイブリドーマ細胞は、次の事項によ
り特定される。

親細胞マウスミエローマは、親細胞P₃−X63−Ag8,P
₃−NS1/1−Ag4−1,X63−Ag8653などが用いられる。

免疫原EPOはSDS電気泳動により調製をしたEPOであ
る。

IgG抗体を生産する。

また、本発明におけるのモノクローナル抗体は、次の
事項により特定される。

抗体のクラスはIgGである。

抗体の反応性は次のとおりである。

（イ） 天然EPOとは、ゆるやかな結合性を示す。

（ロ）１）SDS処理EPOに対して強い親和力を有する。

２）SDS−PAGE法で35,000〜25,000に分離し、G100ゲル
ロ過で80,000〜12,000の分子量の位置に溶出するEPO活
性をほとんど示さないものとも結合する。

本発明で使用する着剤としては、アフイーゲル10（バ
イオラッド社製）やシアノジエンブロマイド活性化セフ
ァロース4B、トシル化活性化セファロース4B（いずれも
ファルマシア社製）などの市販の担体と、本発明の抗体
が結合することによりEPO吸着能を付与された吸着剤を
挙げることができる。

さらに、本発明にかかる酸性糖タンパク質は以下の特
徴により特定することが可能である。

SDS−PAG法で分子量30,000〜40,000を示す。

クーマシーブリリアントブルーバインディングアッ
セイで卵アルブミンを標準タンパク質とした場合、 を示す。

セファデクスG100（ファルマシア社製）によるゲル
ロ過で分子量45,000〜65,000を示す。

本発明におけるEPOを得る方法として、例えば、下記
の製造方法を挙げることができる。

精製したエリスロポエチンをSDS電気泳動にかけ、エ
リスロポエチンに近接して泳動される蛋白質で、強い免
疫原性を有する蛋白質を分離し、この蛋白質に対するモ
ノローナル抗体をまず作製し、抗原として使用するエリ
スロポエチンから、この抗体と反応する蛋白質を除去す
る。

次いで、この蛋白質を除去したエリスロポエチンを抗
原として動物を免疫し、免疫した動物の脾臓細胞とミエ
ローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマ細胞を作
製し、このハイブリドーマ細胞にエリスロポエチンに反
応性を有するモノクローナル抗体を産生させる。

一方、精製しようとするエリスロポエチン含有液をあ
らかじめSDS処理を行い、この抗エリスロポエチンモノ
クローナル抗体にSDS処理されたエリスロポエチンを効
果的に吸着させることによって精製する。

この方法は、EPOを特異的に吸着させ、これを吸着分
として取得するアフィニティクロマト法である。これに
よれば、使用吸着支持体に結合させた抗体がモノクロー
ナル抗体であるから、抗体に同一の性質を持たせること
ができ、また、モノクローナル抗体が、選出樹立された
ハイブリドーマ細胞により産生されるため抗体を安定的
に入手することができ、さらに、EPOを免疫特異的に吸
着し、溶出するため貧血患者尿等から高純度のEPOを効
率よく製造することができる。

この方法では、モノクローナル抗体の結合した吸着剤
が使用される。そして、このモノクローナル抗体は、ハ
イブリドーマ細胞より産生される。

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
は、EPO、例えば、貧血患者尿より精製したEPOで免疫し
た実験動物の脾臓細胞と、ミエローマ（骨髄腫）細胞と
を細胞融合して作られる。この場合の実験動物は、例え
ば、マウスやラット等であり、細胞融合は、同種の動物
の細胞間で行わせるのが好ましい。例えば、マウスの脾
臓細胞とマウスのミエローマ細胞との間で、細胞融合さ
せる。ミエローマ細胞は、悪性腫瘍細胞の一種であっ
て、増殖性に富む細胞である。

マウスに対する免疫（抗原抗体反応）は、EPO、例え
ば、貧血患者の尿より精製したEPO標品を抗原として使
用し、これをマウスに投与して行う。ここで抗原として
使用されるEPO標品は次のようにして得られたものであ
ってもよい。すなわち、後記実施例で示す方法の前半部
分に準じてハイブリドーマ細胞を作成し、それから得ら
れた抗体を結合してなる吸着カラムに貧血患者尿を通し
て逆相クロマトに付し未吸着画分としてEPOを得る。

マウスへの抗原投与は、通常腹腔内注射により行わ
れ、免疫を充分に進めるため、例えば２週間の間隔にあ
けて、数回注射する。注射液は、前記の精製EPOタンパ
ク質を例えばPBSと呼ばれる燐酸塩緩衝食塩水に溶解
し、これにフロイントのアジュバンドを混合して、エマ
ルジョンを形成させて調製する。

このようにして免疫したマウスから、免疫処理終了
後、約３日後に、脾臓に摘出し、この脾臓細胞（主にＢ
細胞）と、別に調製したマウスのミエローマ細胞との間
で細胞融合を行わせる。マウスのミエローマ細胞として
は、P₃−X63−Ag8、P₃−NSI/1−Ag4−１、X63−Ag8 65
3などを培養して増殖させたものを使用する。

細胞融合は、公知の技法に従って行われる。通常、ペ
ニシリン（100単位/ml）及びストレプトマイシン（100
μg/ml）、さらに、2mMグルタミン、1mMピルビン酸を添
加したRPMI 1640合成培養液（以下RPMI 1640液と記
す）と牛胎児血清（FCS）との混合液中で前記脾臓組織
を細断し、単細胞化して充分細胞を分散した後、RPMI
1640液に分散し、これに前記ミエローマ細胞を混合し、
遠心後、上清を除去した混合細胞に対し、細胞融合剤の
ポリエチレングリコール1500の50％溶液を添加して、細
胞融合させる。

かくして作られた融合細胞の中から雑種の、いわゆる
ハイブリドーマ細胞を公知のHAT選択によって選び出
す。

HAT選択は、マイクロタイタープレートを使用して行
うことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を96
穴マイクロタイタープレート上にまいて、HAT（ヒポキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン）培養液で培養を
行い、約２週間後、ハイブリドーマが死滅しないで増殖
している穴を確認し、ハイブリドーマを得る。

次に、かくして選ばれたハイブリドーマについて、EP
Oと特異的に結合する抗体を産生するか否かをソリッド
フェーズ法にて検定したのち、さらに、本ハイブリドー
マをマウス腹腔内に移植して腹水を発生させ、腹水から
公知の方法、例えば、硫安分画法により、タンパク質を
得る。このものは、主として免疫グロブリン（IgG）で
ある。この抗体を吸着剤に結合させ、得られた抗体結合
吸着剤をカラムに充填し、抗体吸着カラムを作成し、こ
のカラムに、EPO標品を通し、EPOの吸着能を調べ、ハイ
ブリドーマが抗EPO抗体を産生するか否かを検定する。
この目的に使用される吸着剤としては、例えばアフィゲ
ル（バイオラッド社製）、セファデックス（ファルマシ
ア社製）がある。このようにして得られた抗EPO抗体産
生ハイブリドーマは、さらに、公知の限界希釈法により
モノクローン化を行う。抗EPO抗体の産生能は、前記の
ソリッドフェーズ法及び抗体吸着カラムへのEPOの吸着
能で検定を行う。この中から、安定して、モノクローナ
ル抗体を産生する細胞を選出する。細胞は、凍結保存が
可能であるので、必要に応じて融解し、マウスの腹腔内
に移植すれば、必要な抗体を永続的に供給することがで
きる。

以上のようにして選出した、モノクローナル抗EPO抗
体産生ハイブリドーマ細胞により、前記と同様にしてマ
ウス腹腔内で生産させたモノクローナル抗EPO抗体を精
製後、吸着支持体に結合し、抗体結合吸着剤を作成す
る。これを原料のEPO含有物、好ましくは貧血患者の尿
又はその処理物と接触させ、EPOを吸着させ、次いで、
溶出し、吸着画分としてEPOを取得する。

この方法における原料であるEPO含有物としては、正
常人尿若しくは貧血患者尿又はその各処理物、或は、EP
O産生細胞の培養上清液又はEPO産生細胞移植動物の体
液、組織抽出液若しくは尿などが挙げられる。例えば、
貧血患者尿をロ過、濃縮、脱塩して得た全尿タンパク質
又はその含有液が使用される。尿中のプロテアーゼを失
活させるため予めフェノール処理又は加熱処理を行って
もよい。また、SDS処理を行う。ここでいうSDS処理は実
施例に示すようにSDSを混合し加熱処理することをさ
す。

この方法において、EPOはアフィニティクロマト法の
通常の技法により取得することができる。吸着カラムを
使用する場合には、前記の尿処理液をカラムに通し、EP
Oを吸着し、溶出液としてEPOを取得する。

使用した吸着カラムは再生させて再使用することがで
きる。再生は、例えば、酢酸と食塩水との混合液を通す
ことにより行われる。

以上のごとき、抗体吸着法では、モノクローナル抗EP
O抗体がEPOを特異的に吸着する結果、カラムを１回通す
だけで、溶出液としてEPOを特異的に高純度で効率よ
く、取得することができる。

EPOの純度は、液中のタンパク質のEPO活性（単位）を
測定することにより決めることができる。EPOの活性の
測定法としては、マウス胎児肝細胞を用い、赤血球系コ
ロニーを形態学的に観察するコロニー法、³H−チミジン
のDNAへの取り込み率を調べる³H−チミジン法、⁵⁹Feの
ヘムへの取り込み率を調べる⁵⁹Fe法等が知られている。
本発明の後記実施例で示すEPO活性は、⁵⁹Fe法又は³H−
チミジン法で測定されたものである。

EPO測定の標準物質としては、フェニルヒドラジン処
理した貧血ヒツジの血清から調製されたEPO（カナダ、
コンノート社製エリスロポエチン ステップ３）を用い
ることができる。

抗EPO抗体生産ハイブリドーマを培養することにより
得られる抗EPOモノクロナール抗体は、固定化担体に結
合させ、EPO吸着剤を作製する。固定化担体としては、
一般的な抗体の結合性を有するものであればどのような
ものでも使用できる。抗体を結合させるための担体とし
ては、アフィゲル10、アフィゲル15（バイオラッド社
製）、シアノジエンブロマイド化活性セファロース4B、
トシル化活性セファロース4B（いずれもファルマシア社
製）などを挙げることができる。これらの抗体結合性担
体と抗EPO抗体は、スペーサーを介して結合し、抗体吸
着能を持つ吸着剤として、EPOの精製や回収に使用が可
能である。

このようにして得られた精製EPOは、SDS−PAGE法で単
一のバンドを示し、比活性は45,000IU以上を示す。この
ものは、極めて高純度のEPOであり、分子量として約34,
000であり、構成糖としてシアル酸を含有している酸性
多糖である。

次に、本発明を実施例によって説明する。

実施例１ 〔抗原タンパク質（EPO）の調製〕 貧血患者の尿600を限外ロ過装置に通し、分子量10,
000までの低分子物質を除去することにより濃縮を行
い、さらに、水を加えて同様に濃縮することにより脱塩
を行った。得られた尿濃縮液20を凍結乾燥して全尿タ
ンパク質粉末31.0g（EPO活性1,800,000単位/31.0g）を
得た。（なお、タンパク量はバイオラッド社製プロテイ
ンアッセイキットにより測定した。） （第１回クロマト） この粉末を5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液に溶解
し、予め5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液で平衡化したD
EAE−セルロース充填カラムに通して、尿タンパク質を
吸着させた後、200mMのNaClを含む5mMトリス−HCl（pH
6.8）緩衝液で溶出し、EPO活性画分を得た。このものに
含まれるタンパク質は、16.0gであり、EPO比活性は、99
単位/mgタンパク質であった。

（第２回クロマト） 得られた前記EPO活性画分を水に対し透析し、透析物
を凍結乾燥して粉末を得た。この粉末を、10mM燐酸ナト
リウム（pH6.8）と4MのNaClからなる緩衝液に溶解し、
予め10mM燐酸ナトリウム（pH6.8）と4MのNaClからなる
緩衝液で平衡化したフェニルセファロースCL−4B充填カ
ラムに通してタンパク質を吸着させた後、10mM燐酸ナト
リウム（pH7.1）と0.5MのNaClからなる緩衝液で洗浄
し、次いで、10mMのNaOH、20％エチレングリコール及び
6M塩酸グアニジンからなる混合液で溶出し、EPO活性画
分を得た。このものに含まれるタンパク質は2.3gであ
り、EPO比活性は421単位/mgタンパク質であった。

（第３回クロマト） 得られた前記EPO活性画分を水に対して透析し、透析
物を凍結乾燥させて、粉末を得た。このものを5mM隣接
ナトリウム（pH6.9）緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対
し透析した。予め5mM燐酸ナトリウム（pH6.9）緩衝液で
平衡化したヒドロキシルアパタイト充填カラムに前記透
析溶液を通し、非吸い着画分を得た。このものに含まれ
るタンパク質は672mgでありEPO比活性1,240単位/mgタン
パク質であった。

（第４回クロマト） 得られた前記EPO活性画分（非吸着画分）を水に対し
透析し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このもの
を、10mM燐酸ナトリウム（pH6.9）と150mMのNaClからな
る緩衝液に溶解した。予め前記と同じ緩衝液で平衡化し
たセファデックスG100充填カラムに、前記溶液を通し、
分子量による分画を行い、EPO活性画分を得た。このも
のに含まれるタンパク質は83mgであり、EPO比活性は3,0
00単位/mgタンパク質であった。

（第５回クロマト） 前記EPO活性画分を水に対して透析後、透析物を凍結
乾燥して粉末を得た。このものを、5mMのCaCl₂（pH7.
2）水溶液に溶解した後、同じ水溶液に対し透析し、次
いで、0.1MのHClでpH4.5に調整した。予め5mMのCaCl
₂（pH4.5）水溶液で平衡化したSP−セファデックス充填
カラムに、前記調整後の液を通し、吸着後、5mM酢酸カ
ルシウム（pH4.5）緩衝液で洗浄し、次いで、20mM酢酸
カルシウム（pH5.5）緩衝液で溶出し、EPO活性画分を得
た。このものに含まれるタンパク量は16mgであり、EPO
比活性は5,100単位/mgタンパク質であった。

（第６回クロマト） 前記EPO活性画分を、予めPBSで平衡化したセファデッ
クスG5.0充填カラムに通した後、前記の緩衝液で溶出し
てEPO活性画分を得た。

この液を後記の抗体結合吸着カラムに通して、逆相ク
ロマトに付し未吸着画分を得た。このものに含まれるタ
ンパク質は4mgであり、EPO比活性は25,000単位/mgタン
パク質であった。

前記カラムは次のようにして作った。すなわち、第５
回クロマト後のEPO標品で免疫したマウスを用いて前記
の方法の前半部分に準じてハイブリドーマ細胞を作成
し、これより得られる抗体のうちから、SDS電気泳動を
行ったときEPO活性に近接して低分子側に見出される免
疫力の高い主要タンパク質と結合するところの抗体を選
び出し、この抗体をアフィゲル−10（バイオラッド社
製）に結合させて抗体結合吸着カラムを作った。

この抗体カラムを通してEPO活性に近接して泳動され
る免疫力の高いタンパク質を除去した。

（SDS電気泳動によるEPOの精製） 得られたEPO活性画分（未吸着画分）を水に対し透析
し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを２％
SDSを含むトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）に溶解し、常法
により13％ポリアクリルアミドゲルSDS電気泳動を行
い、EPO活性画分のゲルを切り出した。ゲルに対し、３
倍量のPBSを添加し、ゲルを磨細し、タンパク質を抽出
した。抽出液中のタンパク質は1.2mgであり、EPO比活性
は50,000単位/mgタンパク質であった。抽出液を水に対
し透析後凍結乾燥して粉末を得た。

〔マウスの免疫〕

前記のSDS電気泳動精製EPO標品を抗原として使用し、
マウス（BALB/Cマウス）に対し、次のとおり３回の免疫
を行った。

（第１回）PBS（リン酸塩緩衝食塩水）中に精製EPOタン
パク質を200μg/mlで溶解し、これにフロイント完全ア
ジュバンドを混合して得たエマルジョンを用いてマウス
に対し、0.5ml（EPOタンパク質50μｇ）を腹腔内注射で
投与した。

（第２回）PBS中に精製EPOタンパク質100μg/mlで溶解
し、これにフロイント完全アジュバンドを混合して得た
エマルジョンを用いて２週間後にマウスに対し、0.5ml
（EPOタンパク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。

（第３回）PBS中に精製EPOタンパク質50μg/mlで溶解し
た液を用いて、さらに２週間後にマウスに対し、0.5ml
（EPOタンパク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。

〔細胞融合〕

前記免疫処理終了から３日後に、免疫マウスの脾臓細
胞を無菌的に摘出し、合成培養液RPMI 1640液と15％牛
胎児血清（FCS）との混合液で洗浄後、該混合液中で、
脾臓組織をハサミで細断して単細胞化を行い、該混合液
で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI 1640液に
分散した。細胞数は2.0×10⁸個であった。

別に、マウスのミエローマ細胞（P₃−NSI/1−Ag4−
１）を前記RPMI及びFCSの混合液中で培養し、増殖した
細胞とRPMI 1640液で洗浄した。細胞数は1.0×10⁸個で
あった。

次に、前記で調製した免疫マウス脾臓細胞とマウスミ
エローマ細胞とを、RPMI 1640液に分散し、混合した
後、遠心し、上清を除去した。混合細胞を、ポリエチレ
ングリコール1500の50％溶液中で、細胞融合させた後、
融合細胞群をHT培養液（ヒポキサンチンとチミジン及び
15％牛胎児血清を含むRPMI 1640液）に混合し、混合液
を３枚の96穴マイクロタイタープレートにまいて、２日
目以降、HAT培地（ヒポキサンチン，アミノプテリン，
チミジン及び15％牛胎児血清を含むRPMI 1640液）を添
加して、各穴で２週間培養してHAT選択を行った。増殖
したハイブリドーマ細胞を264穴において確認した。

〔抗体産生細胞の選択〕

前記で得た264種類のハイブリドーマより、特定の細
胞、すなわち、精製EPO標品と特異的に結合しうる抗体
を産生するハイブリドーマを選び出すために、ビオチン
−アビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法によ
り、スクリーニングを行った。その結果、目的に適合し
たものとして、19種類の細胞が選出され、そのうち７種
類が安定的に抗体産生を行うことを認めた。

〔EPO吸着能による抗EPO抗体産生細胞の選択〕

前記７種類の各細胞を用いて抗体吸着カラムを作成
し、EPO活性の吸着能を検定し、抗EPO抗体産生細胞の選
択を行った。

すなわち、それぞれの細胞について、７匹のマウスに
対し、１つの種類の細胞をマウス１匹当り５×10⁶個腹
腔内に注射して抗体を産生させた後、マウスから腹水を
採取し、これを45％飽和硫安水溶液で硫安分画に付し、
それぞれの種類の細胞について抗体としてIgG画分を40
〜60mg得た。前記で得られたIgG画分をアフィゲル10
（バイオラッド社製）と結合し、抗体吸着カラムを作成
した。すなわち、アフィゲル10をガラスフィルター上で
氷水冷却下イソプロパノールで洗浄し、さらに、氷水で
３回洗浄しゲルを回収した。このゲルと、前記で得た抗
体を含む液（0.2MのNaHCO₃ pH8.3−0.3MのNaCl）とを等
容量で混合し、４℃で５時間撹拌しながら、結合反応を
行わせた。反応後、ゲルを遠心回収した。このものを、
0.1MのNaHCO₃と0.15MのNaClとの混合液で２回洗浄、0.1
Mエタノールアミン−塩酸塩（pH8）と室温で60分間よく
混合して抗体結合ゲルを得た。このゲルをカラムに充填
して、抗体吸着カラムを作成した（７種類のハイブリド
ーマにつき、各１本、合計７本）。ここで得た７本の抗
体吸着カラムに対して、前記精製EPO標品を用いEPO活性
吸着能を検定した。

すなわち、EPO標品をPBSに溶解し、この液を、予めPB
Sで平衡化した前記吸着カラムに通した。溶出は、0.2M
酢酸と0.15MのNaClとの混合液で行い、未吸着画分及び
溶出画分のEPO活性を測定した。ここで得た７種のカラ
ムのうち３種類についてEPO活性の吸着を認めた。

〔抗EPO抗体産生細胞のクローニング〕

前記３種類の抗EPO抗体産生ハイブリドーマについ
て、常法に従い、限界希釈法により、クローニングを行
った。

すなわち、ハイブリドーマ細胞50個と、４週令BALB/C
マウスの胸腺より常法により調製した胸腺細胞10⁸個をP
RMI 1640液と15％FCSとの混合液10mlに分散し、96穴マ
イクロタイタープレートの各穴に0.1mlずつまき、５日
目及び12日目にRPMI 1640液と15％FCSの混合液（培養
液）を添加し増殖したハイブリドーマ細胞について、前
記と同様にしてソリッドフェーズ法による抗EPO抗体産
生細胞のスクリーニングを行い、さらに、EPO吸着能に
よる抗EPO抗体産生細胞の選択を行いクローニングを行
った。このようにして、前記３種類の抗EPO抗体産生ハ
イブリドーマよりそれぞれ細胞株Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−
３を樹立した。

〔モノクローナル抗EPO抗体の産生〕

前記のクローニングにより得た、抗EPO抗体産生細胞
株（Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３）を用いて、抗体産生を行
った。すなわち、前記と同様に、マウスの腹腔内で抗体
産生をさせ、45％硫安分画によりIgG画分を得た。各細
胞株についてマウス20匹を用い、500mgのモノクローナ
ル抗体を得た。

〔抗体吸着カラムの作成〕

前記と同様の操作でIgGとアフィゲル10との結合を行
わせ各モノクローナル抗体について50mlの抗体結合ゲル
を得た。

このゲルをカラムに充填し、吸着カラムを作成した。

〔EPOの取得〕

原料液を調製するため本実施例の抗原タンパク質の調
製の冒頭で記載した限外ロ過装置を用いて調製した全尿
タンパク粉末50mg（2,900単位）をPBS10mlに溶解し、外
液40のPBSに対し、１液透析を行い、遠心後、上清液
を得、原料液10mlを得た。

この試料に２％濃度になるようにSDSを加え、100℃、
３分間加熱処理後、外液10のPBSに対し、１夜透析を
行い、遠心後、上清液（原料液）10mlを得た。

前記で作成した抗体吸着カラム（0.8cm×4cm床容量2m
l、Ｅ−１）にPBS20mlを20ml/hrで流し平衡化し、次い
で0.2M酢酸と0.15MのNaClとの混合液50mlを同じ流速で
流し、洗浄した後、さらに、PBS20mlを同様に流し平衡
化した。

このように前処理した吸着カラムに、前記で調製した
原料液10mlを5ml/hrの流速で通した。次にPBS20ml、0.5
MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液20ml、0.15MのNaCl20ml
の順に20ml/hrでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15M
のNcClとの混合液20mlを5ml/hrの流速で流し、溶出液と
して高純度のEPO（本発明目的物の酸性糖タンパク質）
を含む液を得た。

本液中のEPO活性は1,160単位であった。これを原料液
のそれの2,900単位に対比すると、回収率は40％であっ
た。また、本液中のEPO比活性は45,000単位/mgタンパク
質であり、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対比
すると、EPO純度は、780倍向上したことがわかる。

実施例２ 実施例１で作成した抗体結合ゲルを充填した抗体吸着
カラム（0.8cm×4cm床容量2ml、Ｅ−２）を用いて次の
とおり操作を行った。原料を調製するため実施例１と同
様に、限外ロ過装置を用いて調製した全尿タンパク質粉
末50mg（2,900単位）を２％SDSを含むPBS10mlに溶解
し、100℃３分間加熱処理後外液10のPBSに対し、１夜
透析を行い、遠心後、上清液10mlを得た。本溶液をPBS
で５倍希釈した後、実施例１と同様にして前処理を行っ
た前記抗体吸着カラムに対し、5ml/hrの流速で通した。
次に、PBS20ml、0.5MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液20m
l、0.15MのNaCl20mlの順に20ml/hrでカラムを洗浄した
後、0.2M酢酸と0.15MのNaClとの混合液20mlを5ml/hrで
流し、溶出液として高純度のEPOを含む液を得た。本液
中のEPO活性は2,600単位であった。これを原料液のそれ
の2,900単位に対比すると回収率90％であった。また本
液中のEPO比活性は、60,000単位/mgタンパク質であり、
原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対比すると、EPO
純度は、約1,000倍向上したことがわかる。

実施例３ 実施例１で作成した抗体結合ゲルを充填した抗体吸着
カラム（2cm×6.4cm、床容量20ml、Ｅ−３）を作成し、
実施例１と同様にして、前処理を行い、使用した。原料
液は、実施例２と同様に、全尿タンパク質粉500mg（29,
000単位）を２％SDSを含むPBS50mlに溶解し、100℃３分
間加熱処理した後、外液40に対し、１夜透析を行い、
遠心後、上清液50mlを得、PBSで５倍希釈した。本原料
液を前記全処理ずみ抗体吸着カラムに対し、20ml/hrの
流速で通した。次いで、PBS200ml、0.5MのNaClを含む10
mMリン酸緩衝液200ml、0.15MのNaCl 200mlの順に、100m
l/hrでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15MのNaClと
の混合液200mlを20ml/hrで流し、溶出液として高純度の
EPOを含む液を得た。

本液中のEPO活性は、25,000単位であった。これを原
料液のそれの29,000単位に対比すると、回収率86％であ
った。また本液中のEPO比活性は、60,000単位/mgタンパ
ク質であり、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対
比すると、EPO純度は、約1,000倍向上したことがわか
る。

〔EPOのHPLC〕

上述の工程で得られた精製EPOを280nmの吸光度で測定
し24μg/mlの濃度の溶液を240μｌ、逆相HPLCに注入
し、クロマトパターンを求めた。使用したカラムは、C₄
カラム（0.46×25cm、バイダック社製）である。これを
展開相としてアセトニトリル及び水（0.1重量％TFA含
有）を使用し溶出した。280nmの吸収をモニターした。
得られたパターンを調べたところ、ほぼタンパク質とし
て純粋のEPOが得られたことが確認できた。

以上実施例１〜３で得られたEPO（本発明目的物の酸
性糖タンパク質）は、いずれも下記の特性を有する。

SDS処理を行ったエリスロポエチンに対して強い結合
性を有し、天然のエリスロポエチンに対してはゆるやか
な結合性を有する抗エリスロポエチンモノクローナル抗
体に強い結合性を有する。

SDS−PAGE法で分子量約30,000〜40,000を示す。

クーマシーブリリアントブルーバインディングアッセ
イで卵アルブミンを標準蛋白質とした場合、Ｅ^１％cm＝
13.1を示す。

セファデックスG100（ファルマシア社製）によるゲル
ロ過で分子量45,000〜65,000を示す。

約45,000IU/mgタンパク質以上（約45,000単位/mgタン
パク質以上）のエリスロポエチン比活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−155395（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500558（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．252, （15），5558−5564（1977) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，79，（18）5465−5469 （1982) Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｓ，41，（３），520 ａｂｓ ｔｒａｃｔ 1463（1982)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の（ａ）〜（ｅ）の性質を示す酸性糖タ
   ンパク質； （ａ）ソジウム ドデシル サルフェート（SDS）電気
   泳動を行なったエリスロポエチンで免疫した動物の脾臓
   細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドー
   マ細胞より得られ、SDS処理をしたエリスロポエチンに
   結合性を有する抗エリスロポエチンモノクローナル抗体
   を用いて、あらかじめSDS処理を行なったエリスロポエ
   チン含有液を精製することによって得ることができ、 （ｂ）少なくとも約45,000単位/mgタンパク質以上のエ
   リスロポエチン比活性を有し、 （ｃ）SDS−PAGE法で分子量30,000〜40,000を示し、 （ｄ）セファデックス（ファルマシア製）によるゲル濾
   過法で分子量45,000〜65,000を示し、 （ｅ）逆相カラムを装置した高速液体クロマトグラフィ
   ー分析により単一のピークを示す。