JPH0491099A - ヒトα↓１―アンチキモトリプシンの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトα、−アンチキモトリブンンに特異的に
結合するモノクローナル抗体を利用した試料中のヒトα
１−アンチキモトリプシンの精製法に関するものである
。さらに詳しくは、ヒトα１−アンチキモトリプシンで
免疫された噴孔動物の牌細胞と骨髄腫細胞との細胞融合
によって得られたハイブリドーマの産生ずるヒトα１−
アンチキモトリプシンに対するモノクローナル抗体、お
よび該モノクローナル抗体を利用した試料中のヒトα、
−アンチキモトリブンンの精製法に関する。

（従来の技術） ヒトα１−アンチキモトリプシンは１９７８年にその性
状が明らかになった糖タンパク質である（ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　１７巻２６号５６５１−５６５６頁）。

詳しくはアミノ酸４０８残基からなり、約２６％の糖を
含む分子量的６８，０００の糖タンパク質であり、その
主な生体内作用は、肥満細胞のキマーゼや好中球のカテ
ブシンＧなどのキモトリプシン様プロテアーゼの阻害で
ある。ヒトα、−アンチキモトリプシンはα１−アンチ
トリプシンと同様にアキュート・フェイズ・プロティン
であることも知られており、肺や腎での感染防止とプロ
テアーゼ・プロテアーゼインヒビターの平衡化に関与し
ていると考えられている（蛋白質・核酸・酵素第３４巻
　８号　９４９−９６２頁　１９８９年）。生体内での
主な産生臓器は肝臓で、健常人の血清中濃度は３００〜
６００μｇ　／　ｍ　１に達する。

最近ではその臨床的な知見も幾つか得られており、特に
骨癌、肉腫、カポシ肉腫、癌腫、悪性メラノーマのマー
カーとなることが報告されている（Ｐａｔｈｏｌ　Ｒｅ
ｓ　Ｐｒａｃｔ　１．８２巻　３３Ｂ−３４３頁　１９
８７年、Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｐａｔｈｏｌ　１１巻１
３ｔ−１３９頁１９８７年）。

その他では、炎症反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳
傷害においてもヒトα１−アンチキモトリプシンの血清
中濃度の増加が観察されている。このように近年ヒトα
、−アンチキモトリプシンは臨床的なマーカーとして注
目されているが、その作用や機能はいまだ明らかではな
い。さらにアルツハイマー病患者の血清中及び髄液中で
ヒトα１−アンチキモトリプシンが増加していることも
報告され、その成因、病体との関連についても注目され
ている（Ｃｅｌｌ　　５２巻４８７−５０１頁　１９８
８年、生化学第６１巻　第　５号　３８５頁　１９８９
年、日経メディカル１９９０年　３月１０日号　６６−
７４頁）。

ヒトα１−アンチキモトリプシンの精製法としては、従
来からイオン交換クロマトグラフィー疎水クロマトグラ
フィー、ゲル濾過法などによるものがある。

（発明が解決しようとする課８） 上述の精製法のいずれの方法においても繁雑な操作を必
要とするため、本発明は、より簡便な方法で純度良くヒ
トａ１−アンチキモトリプシンを精製できる方法を提供
することを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上述の精製法の問題点を解決するため、
ヒトα１−アンチキモトリプシンに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を用いたヒトαよ−アンチキモトリプ
シンの精製法を見出たした。

即ち本発明は、ヒトα１−アンチキモトリプシンに特異
的に結合するモノクローナル抗体を不溶性担体と結合し
た免疫吸着剤に、ヒトσ、−アンチキモトリプシンを含
む試料溶液を接触させ、ヒトα１−アンチキモトリプシ
ンを該吸着剤に特異的に結合させた後、溶出させること
を特徴とするヒトαカーアンチキモトリプシンの精製法
である。

ヒトαカーアンチキモトリプシンに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、それ自
体公知である方法 （Ｇ、Ｋ　　ｈｌｅｒ＆ｃ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ’、２５６，４９５．（１９７５））に準
じて製造することができ、例えば次の如くして製造する
ことができる。すなわち、 ■抗原としてヒトαカーアンチキモトリプシンを用いて
免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、■これとは別
に骨髄腫細胞を調製し、 ■これらの細胞を融合させ、 ■得られた融合細胞のうちハイブリドーマのみを選択的
に増殖させ、 ■得られたハイブリドーマからヒトαカーアンチキモト
リプシンに対する抗体を産生ずるハイブリドーマを検索
し、 ■ヒトα１−アンチキモトリプシンに対する抗体を産生
ずるハイブリドーマをクローニングすることにより得ら
れる。

得られた抗ヒトａ１−アンチキモトリブンン・モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマから、抗ヒトα１−アン
チキモトリプシン・モノクローナル抗体を得るには例え
ば次の如くすればよい。すなわち、抗ヒトα、−アンチ
キモトリプシン・モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを適当な培地中で培養し、その培養上清を採取するこ
とにより、抗ヒトα、−アンチキモトリプシン・モノク
ローナル抗体を得ることができる。また、細胞融合の際
に用いた骨髄肝細胞の由来動物と同種の動物にブリスタ
ン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）
などの鉱物油を腹腔内に投与した後、抗ヒトα、−アン
チキモトリプシン・モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを接種して腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、目
的とするモノクローナル抗体を含有する腹水を作らせ、
腹水を採取することによっても目的とするモノクロ−ナ
ル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を分離
精製する方法としては、イオン交換クロマトグラフィー
、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィーなどによる方法がある。

抗ヒトα、−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗
体を免疫吸着剤として利用することによってヒトαイー
アンチキモトリプシンを精製するには例えば次の如くす
ればよい。

すなわち、該モノクローナル抗体をアガロースゲル、デ
キストランゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合
させ、該モノクローナル抗体結合担体を免疫吸着剤とし
て用いることにより実施される。

不溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、ブロムシ
アン法やエポキシ、アミノ、カルボキシルあるいはホル
ミル基等を介して結合させる方法により行うことができ
る。

このようにして得た免疫吸着剤に、例えば、適当な緩衝
液などを用いて、好ましくはｐ＋＋６．５〜８．５にし
て、ヒトα１−アンチキモトリプシンを吸着させればよ
い。そして、非吸着性物質などの不純物を除去した後、
好ましくは、ｐＨ２，５〜４．５にして、目的とするヒ
トα１−アンチキモトリプシンを溶出すれば良い。この
ときｐＨを低くしすぎると、モノクローナル抗体に悪影
響を及ぼし、ヒトα１−アンチキモトリプシンの吸着量
が低下してしまうため、上記のようなｐ）Ｉ範囲が好ま
しい。

吸着・溶出時の温度については、ヒトａ１−アンチキモ
トリプシンは温度にあまり敏感ではないため、特に限定
されることはなく、通常行われている免疫吸着剤への吸
着・溶出と同様に行えばよい。

免疫吸着剤と試料の接触方法としては、カラムクロマト
グラフィー法や、バッチ法を行うことができる。

（発明の効果） 本発明によれば、従来法より簡便な操作により高純度に
ヒトα１アンチキモトリプンンを精製することが可能で
ある。

特に本発明では、モノクローナル抗体を用いているため
、ポリクローナル抗体を用いるよりも、より緩和な条件
で目的とするヒトα１−アンチキモトリプシンを溶出で
き、抗体の吸着量を低下させることなく、免疫吸着剤を
再利用することができる。

（実施例） 以下実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、
本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない
。

［実施例１］ 抗ヒトａ１−アンチキモトリブンン・モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマの製造 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造は、前記
したようにＧ、Ｋ　　ｈｌｅｒとＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
らの方法（Ｎａｔｕｒｅ２５６．４９５．　　（１９７
５））に従った。

（Ａ）ヒトα１−アンチキモトリプシン感作動物細胞の
調製 Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　Ｃ７ウス（♀）をヒトａ１−アン
チキモトリプシンで免疫した。免疫は、マウスの腹腔に
フロイントの完全アジュバントとヒトα１アンチキモト
リプシンとを乳化させた試料（０，７回ｇ・α、−アン
チキモトリプシン／ｍｌ）を１００μｍ／匹ずつ投与し
た。それから−ケガ後に追加免疫としてヒトαイーアン
チキモトリプシンをフロイントの不完全アジュバントと
乳化させた試料（０，７ｍｇ・α、−アンチキモトリプ
シン／ｍｌ）を１００μｍ／匹ずつマウス腹腔に投与し
た。二週間後に最終免疫としてヒトαイーアンチキモト
リプシンをリン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ
１を含む０．０１％リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　、以
下ＰＢＳと省略する）に溶解したもの（０，７ｍｇα、
−アンチキモトリプシン／ｍ１）を１００μｍ／匹ずつ
腹腔内に投与し、３日後この処置マウスの肺臓を無菌的
に取出した。あらかしめカルチャーデイツシュにナイロ
ンメツシュとＥ−ＲＤＦ培地を入れてナイロンメツシュ
をＥ−ＲＤＦ培地中に浸しておき、このナイロンメツシ
ュの上に取出した肺臓をゆっくりと置き、＊ｍｔを挟む
ようにナイロンメツシュを半分に折り、肺臓をピンセッ
トで押しつぶしてはぐし膵臓細胞を培地中に懸濁させた
。細胞懸濁液を遠心管に入れ、１１０００ｒｐで１０分
間遠心した後上澄を捨て、さらに細胞ベレットをＥ−Ｒ
ＤＦ培地で２回同様に遠心洗浄して膵臓細胞とした。

（Ｂ）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としてはＢａ１ｂ／ｃマウス由来の８−アザ
グアニン耐性株であるＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ１５８０、以下５Ｐ２１０と省略する）を使用
した。細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ／ｍｌの８
−アザグアニン、１５％子牛脂児血清（以下１５％ＦＣ
３と省略する）を含むＥ−ＲＤＦ培地で培養し、その後
細胞融合日まで１５％ＦＣ５を含むＥ−ＲＤＦ培地を使
用した。細胞融合直前に、Ｓ　Ｐ　２１０は無菌的にＥ
−ＲＤＦ培地で１１０００ｒｐで１０分間遠心洗浄を２
回繰り返し調製した。

（Ｃ）細胞融合 実施例１の（Ａ）項で調製した膵臓細胞と実施例１の（
Ｂ）項で調製した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心
（１０００ｒｐｍ、１０分）し細胞ペレットを集めた。

遠心チューブを軽くたたいて細胞ベレットを壁面に薄く
広げ、その中に３７℃に加温しておいた５０％ＰＥＧ　
（ＭＥＲＫ社製ポリエチレングリコール４０００）を含
むＥ−ＲＤＦ培地培地１奢ｌ１分間に１ｍｌの割合で遠
心チューブを回しながら少しずつ滴下した。その後、３
７℃に加温しておいたＥ−ＲＤＦ培地１０ｍ１を３０秒
に１ｍｌの割合で遠心チューブを回転しながら加えた。

つぎにＦＣ３２ｍｌをゆっくりと入れ、１１０００ｒｐ
で１０分間遠心した。細胞ペレットを１５％ＦＣＳとＩ
　Ｘ　１０−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０’−’Ｍア
ミノプテリン、１．６×１０−５Ｍチミジンを含むＥ−
ＲＤＦ培地（以下ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心洗
／？＋（１０００ｒｐｍ、１０分間）し、この培養液を
９６ｗｅｌｌ　　ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４２
）１：　Ｉ　Ｘ　１０５細胞個／ウェルになるように２
００μｌずつ分注した。５日目ごとにＨＡＴ培地をコ０
０μｍ／ウェル交換した。２週間後からは、１５％ＦＣ
５とＩ　Ｘ　１０−’Ｍヒポキサンチン、１．６Ｘ１０
−５Ｍチミジンを含むＥ−ＲＤＦ培地（以下ＨＴ培地と
省略する）を培地交換に用いた。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択 ９６ｗｅｌｌ　　ｐｌａｔｅに細胞コロニーが認められ
る１００日目後からＥＬＩＳＡを行い、培養上清に抗ヒ
トα、−アンチキモトリブンン抗体が存在するかどうか
調べた。９６ｗｅｌｌｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ平底（イ
ンターメッド社製）に、ヒトα１−アンチキモトリプシ
ン２μｇ／ｍｌを５０μｍ／ウェル分注し、４℃で一夜
静置した。その後、ウェルの溶液を除去しウェルを０．
０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含むＰＢＳ　（
以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．５％ウシ血清
アルブミン（以下０．５％ＢＳ八と省略する）を含むＰ
ＢＳ２８０μｌを各ウェルに加えて４℃で一夜静置して
ＢＳＡで各ウェルをブロッキングしそのまま冷蔵保存し
た。次に、ウェルの溶液を除去しウェルをＰＢＳ−Ｔで
３回洗浄した後、各ウェルに上記培養上清を５０μｍず
つ分注し３７℃で１．５時間静置した。その後、ウェル
の溶液を除去しウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、
ペルオキシダーゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジ
ャクソン社製）を５　ｏ　ｏ　ｏ　倍に希釈した溶液を
５０μｍ／ウェルずっ分注し、３７℃で１．５時間静置
した。その後、ウェルの溶液を除去しＰＢＳ−Ｔで３回
洗浄したのち、基質溶液（１，２％　２，２−アジノジ
−（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウ
ム塩（以下ＡＢＴＳと省略する）及び０．０１％過酸化
水素（Ｈ２ｏ２）を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、（ｐ
Ｈ４，０））を各ウェルに］００８ｍずっ添加した。３
０分間室温で放置した後、０．　５Ｍシュウ酸溶液を１
００μｌ加えて酵素反応を停止させ、４１５ｎｍでの吸
光度を測定し、酵素活性が認められたウェルに抗ヒトα
、−アンチキモトリブンン抗体を産生ずるハイブリドー
マが存在することから、そのウェルのハイブリドーマを
スヶ−ルアツブし増殖させた。以上のようにして、抗体
価の強い抗体産生ハイブリドーマを取得した。

（Ｅ）コンデショニジグメディウムの調製冷蔵しておい
た０、３４Ｍサッカロース溶液を２６ゲージの注射針を
つけた注射器に１０ｍ１吸い取り、を椎脱臼死させてお
いたＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウス（♂）の腹腔内に無
菌的に上記溶液を注入した。注入後５分以内に、氷冷し
ておいた１８ゲージの注射針をつけた注射器で左側腹部
から腹腔内溶液を回収した。氷冷しておいた遠心チュー
ブに上記回収液を流し込み、１１０００ｒｐで１０分間
遠心分離した。遠心後上清を廃棄し、細胞ベレットに１
５％ＦＣ３を含むＥ−ＲＤＦ培地を加え攪拌しプッシュ
に入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％湿度で一
晩培養し、培養上清を集め、０．２２μｍのメンブレン
フィルターで濾過し、これをコンデショニジグメディウ
ムとした。

（Ｆ）クローニング 抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。実施例１の（Ｅ）項で作製
したコンデショニジグメディウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培
地２０ｍ１を用意し、クロニジグしたいハイブリドーマ
細胞約８０個を上記培養液中に懸濁し、２００μｌ／ウ
エルずつ９６ｗｅｌｌ　　ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ＃
３０４２）に分注した。培養１０日目前後から細胞コロ
ニーが認められるウェルについて、実施例１の（Ｄ）項
に記載したのと同様にして抗ヒトα１アンチキモトリプ
シン抗体産生ハイブリドーマを選択し、さらに再度クロ
ーニングを繰り返し単一ハイブリドーマを樹立した。最
終的に１４クローンのハイブリドーマを確立した。

［実施例２コ 抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクローナル抗
体の製造 Ｂａ１ｂ／ｃマウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
）を０．５ｍｌ／匹投与し、２週間後実施例１の（Ｅ）
項で得られた抗ヒトα。

アンチキモトリプシン・モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ株をマウス腹腔内に各クローンについて２×１
０６細胞個／匹移植した。マウス腹腔内に腹水が溜まる
１０日目前後に、１８ゲージの注射針を腹部に差し込み
、腹腔内に溜まった腹水を］／２０量の０．２Ｍ−ＥＤ
ＴＡをいれた遠心チューブに滴下させた後、遠心チュー
ブを３５００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を集めた。

採取した上清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にし
たがって粗精製し、ＰＢＳ溶液に透析後、ＴＳＫ−ゲル
　ＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換クロマトグラフイーをお
こない精製した。精製したモノクローナル抗体は、ゲル
濾過および、β−メルカプトエタノール還元下および非
還元下での１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で見た限りでは単一標品となっていた。また、ＥＬ
ＩＳＡ法により、精製したモノクローナル抗体が抗体価
を有することを確認した。

［実施例３］ アフィニティーカラムクロマトグラフィーによるヒトα
、−アンチキモトリプシンの精製（Ａ）抗体カラムの製
造 プロムンアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ、社製）の乾燥ゲル３ｇを１ｍＭ
−ＨＣＩ中で１５分間膨潤させた後、Ｇ３グラスフィル
ター上で４００ｍ１の１ｍＭ・ＨＣＩを数回に分けて加
え、その度に洗浄液を吸引除去することによりゲルの洗
浄を行った。次に、同様にしてカップリングバッファー
（０，５Ｍ・ＮａＣ１を含む０．１Ｍ−ＮａＨＣＯｉ　
　（ｐＨ８，３））でゲルを洗浄した。ゲルからカップ
リングバッファーを吸引除去した後、直ちにあらかじめ
カップリングバッファーに対して４℃で一夜透析してお
いた抗ヒトα１−アンチキモトリプシン・モノクローナ
ル抗体ＡＣＴＩ　　（抗体量）の溶液２０ｍ１（抗体量
５０ｍｇ）をゲルに加えて懸濁させ、ゲル懸濁液を４℃
で一夜緩やかに振とうした。その後、Ｇ３グラスフィル
ターでゲルから溶液を吸引除去した後、ゲルに１Ｍエタ
ノールアミン−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）２０ｍ　ｌを
加えて懸濁させ、ゲル懸濁液を室温で２時間緩やかに振
とうした。次に、Ｇ３グラスフィルター上でゲルを０．
５ＭＮａＣ１を含む０゜１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）
とカップリングバッファーを交互に用いて数回洗浄した
後ＰＢＳで十分洗浄した。

その後、ゲルをＰＢＳ中に懸濁させカラムに充填して抗
体カラムＡＣＴｒセファロース４Ｂを得た。

（Ｂ）抗体カラムによるヒトα１−アンチキモトリプシ
ンの精製 ＰＢＳで平衡化した抗体カラムＡＣＴＩセファロース４
Ｂにヒト血清５ｍｌをアプライしＰＢＳでカラムを十分
洗った後、カラムに流す溶液を０．１Ｍグリシン−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ３，０）に変えてカラムに吸着したタン
パクを溶出した。

溶出液は１ｍｌずつ試験管に分画し、各フラクションの
２８０ｎｍの吸光度を測定した。各フラクションの溶液
が中性になるようにするため試験管にはあらかじめ３Ｍ
−Ｔｒｉｓ溶液６μｌを分注しておいた。Ｏ，１Ｍグリ
シン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３，０）で溶出したタンパク
画分を集め、集めたタンパク画分についてゲル濾過およ
び、β−メルカプトエタノール還元下および非還元下の
１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
たところ、これらの方法で見た限りではタンパク画分は
ヒトα１−アンチキモトリプシンの単一標品となってい
た。ヒト血清５ｍｌから精製されたα、−アンチキモト
リプシンは４５３μｇであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトα＿１−アンチキモトリプシンに特異的に結
   合するモノクローナル抗体を不溶性担体と結合した免疫
   吸着剤に、ヒトα＿１−アンチキモトリプシンを含む試
   料溶液を接触させ、ヒトα＿１−アンチキモトリプシン
   を該吸着剤に特異的に結合させた後、溶出させることを
   特徴とするヒトα＿１−アンチキモトリプシンの精製法
   。