JPS608228A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS608228A JPS608228A JP11519783A JP11519783A JPS608228A JP S608228 A JPS608228 A JP S608228A JP 11519783 A JP11519783 A JP 11519783A JP 11519783 A JP11519783 A JP 11519783A JP S608228 A JPS608228 A JP S608228A
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- JP
- Japan
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- serum albumin
- bovine serum
- monoclonal antibody
- antibody
- mouse
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- Pending
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Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、牛血清アルブミンに対するモノクローナル抗
体および該抗体の利用方法ならびにその製造法に関する
。
体および該抗体の利用方法ならびにその製造法に関する
。
牛血清アルブミンは、牛血清中に含まれる分子量６６，
０００の蛋白質である。動物組織培養においては、一般
に牛胎児血清あるいは修生血清あるいは牛血清を培地中
に添加する。無血清化していく過程でも牛血清アルブミ
ンを蛋白源として添加する場合も多い。従りて、動物組
織培養によって各種の有用物質を生産し、精製単離しよ
うとするとき、培地由来の牛血清アルブミンを除くこと
が必要となるが、従来の精製手段では、牛血清アルブミ
ンの除去は回器な場合が多い０ 牛血清アルブミンをマウスなどの異種動物に免疫した場
合、牛血清アルブミンに対する抗血清（ポリクローナル
抗体）が産生されることは、古くから知られている。抗
血清中の抗体を採取し、これを牛血清アルブミンの除去
に用いることはできる。しかし、このような抗血清は均
一ではなく、しかも工業的に用いるほどの規模での大量
供給源とはなり得す、またヒト血清アルブミンなど牛以
外の動物の血清アルブミンとも反応するなどその特異性
にも問題がある。
０００の蛋白質である。動物組織培養においては、一般
に牛胎児血清あるいは修生血清あるいは牛血清を培地中
に添加する。無血清化していく過程でも牛血清アルブミ
ンを蛋白源として添加する場合も多い。従りて、動物組
織培養によって各種の有用物質を生産し、精製単離しよ
うとするとき、培地由来の牛血清アルブミンを除くこと
が必要となるが、従来の精製手段では、牛血清アルブミ
ンの除去は回器な場合が多い０ 牛血清アルブミンをマウスなどの異種動物に免疫した場
合、牛血清アルブミンに対する抗血清（ポリクローナル
抗体）が産生されることは、古くから知られている。抗
血清中の抗体を採取し、これを牛血清アルブミンの除去
に用いることはできる。しかし、このような抗血清は均
一ではなく、しかも工業的に用いるほどの規模での大量
供給源とはなり得す、またヒト血清アルブミンなど牛以
外の動物の血清アルブミンとも反応するなどその特異性
にも問題がある。
本発明者らは、工業的規模での牛血清アルブミン含有物
質の精製に際して、抗生血清アルプな ミン抗体カラムに使用できるよう声牛血清アルブミンモ
ノクローナル抗体の作成と生産法について鋭意検討した
結果、牛血清アルブミンに特異的なモノクローナル抗体
を著量産生するハイブリドーマ株を作製することに成功
し、本発明を完成するに到った。
質の精製に際して、抗生血清アルプな ミン抗体カラムに使用できるよう声牛血清アルブミンモ
ノクローナル抗体の作成と生産法について鋭意検討した
結果、牛血清アルブミンに特異的なモノクローナル抗体
を著量産生するハイブリドーマ株を作製することに成功
し、本発明を完成するに到った。
本発明によって得らる抗生血清アルブミンモノクローナ
ル抗体ならびに、それと担体を結合させて作製したアフ
ィニティーカラムは、動物組織培養によって得られる種
々の有用物質たとえばインターフェロン−αの精製に用
いることのできる極めて汎用性の広い応用価値の高いも
のである。
ル抗体ならびに、それと担体を結合させて作製したアフ
ィニティーカラムは、動物組織培養によって得られる種
々の有用物質たとえばインターフェロン−αの精製に用
いることのできる極めて汎用性の広い応用価値の高いも
のである。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明では、牛血清アルブミンに対するモノクローナル
抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体の製造は
次のとおりに行う。
抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体の製造は
次のとおりに行う。
（１） 免疫化動物細胞の調整
マウス、ラットなどを牛血清アルブミンで免疫して、そ
の動物から牌細胞を調整する。
の動物から牌細胞を調整する。
免疫の方法は、８〜１０週令のマウスの皮下Ａｄｊｕｖ
ａｎｔありいは水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワク
チンなど）とともに牛血清アルブミン２０〜４００μＬ
洒を投与する。以後、１〜２週問おきに、牛血清アルブ
ミン２０〜４００μ２／匹を２〜１０回投与する。各免
疫後３〜７日目に、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗
生血清アルブミン抗体価を以下に示法：医学書院刊 １
９７８年）で調べる。
ａｎｔありいは水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワク
チンなど）とともに牛血清アルブミン２０〜４００μＬ
洒を投与する。以後、１〜２週問おきに、牛血清アルブ
ミン２０〜４００μ２／匹を２〜１０回投与する。各免
疫後３〜７日目に、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗
生血清アルブミン抗体価を以下に示法：医学書院刊 １
９７８年）で調べる。
酵素免疫測定法：
９６穴のＥＩＡ用プレート（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社製）に、１％牛血清アルブミン−フォスフ
ェート・バッファー・セイライン（ＢＳＡ−ＰＢＳ）（
牛血清アルブミン１０り・ リン酸２ナトリウム１．８
３？、リン酸１カリウム０．２１グ２食塩７．６５グ、
蒸留水ＩＡ、ｐＩ（７，２）を１００〜２００μｌ／穴
づつ分注し、４℃で１〜２晩放置して、牛血清アルブミ
ンをプレート穴底面にコートし、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て
た後レジン水でよく洗浄後、第１抗体として、ヒト血清
アルブミン−ＰＢＳで希釈した試料（マウス血清、）・
イブリドーマ培養土清、粗製モノクローナル抗体）を１
００／ｊＡ！／穴分注し、４℃で１晩放置する。レジン
水で１回、２ＭＮａ（Ｍ溶液で６回洗浄した後、第２抗
体としてウサギの抗マウスグロブリンＦ（ａｂ ’）２
−ランアーゼ結合物（Ｏｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅ
ｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｍ（Ｃ８Ｌ）社製９代理
店マルタケミカル〕の１００倍希釈液を１００μｌ／穴
分注し、室温で２時間放置する。レジン水で３回洗浄後
、ウレアーゼ基質液（Ｃ８Ｌ社製）１００μｌ／穴を分
注し、室温で１０〜３０分放置後、１係メルチオレート
２０μｌを加え反応を停止する。
ｏｒｉｅｓ社製）に、１％牛血清アルブミン−フォスフ
ェート・バッファー・セイライン（ＢＳＡ−ＰＢＳ）（
牛血清アルブミン１０り・ リン酸２ナトリウム１．８
３？、リン酸１カリウム０．２１グ２食塩７．６５グ、
蒸留水ＩＡ、ｐＩ（７，２）を１００〜２００μｌ／穴
づつ分注し、４℃で１〜２晩放置して、牛血清アルブミ
ンをプレート穴底面にコートし、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て
た後レジン水でよく洗浄後、第１抗体として、ヒト血清
アルブミン−ＰＢＳで希釈した試料（マウス血清、）・
イブリドーマ培養土清、粗製モノクローナル抗体）を１
００／ｊＡ！／穴分注し、４℃で１晩放置する。レジン
水で１回、２ＭＮａ（Ｍ溶液で６回洗浄した後、第２抗
体としてウサギの抗マウスグロブリンＦ（ａｂ ’）２
−ランアーゼ結合物（Ｏｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅ
ｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｍ（Ｃ８Ｌ）社製９代理
店マルタケミカル〕の１００倍希釈液を１００μｌ／穴
分注し、室温で２時間放置する。レジン水で３回洗浄後
、ウレアーゼ基質液（Ｃ８Ｌ社製）１００μｌ／穴を分
注し、室温で１０〜３０分放置後、１係メルチオレート
２０μｌを加え反応を停止する。
６００ ｎｍで比色足音し、抗体価を算出する。
牛血清アルブミンに対する抗体価が正常マウス血清の１
０３以上になったマウスを免疫化動物細胞の供給源とし
て用いた。
０３以上になったマウスを免疫化動物細胞の供給源とし
て用いた。
細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、牛血清アルブミンを２０〜４００Ｐグ
／匹腹腔内に投与し、牌臓細胞を摘出し、牌細胞を調整
する。牌豚をＭＥＭ（日永製薬社製）中で細断し、ピン
セットでほぐし、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離にか
け、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，６５）で１〜２分間処理し７赤面球を除去し、
ｈｉ Ｅ Ｍで３回洗浄して融合用牌細胞として提供す
る。
の３〜４日前に、牛血清アルブミンを２０〜４００Ｐグ
／匹腹腔内に投与し、牌臓細胞を摘出し、牌細胞を調整
する。牌豚をＭＥＭ（日永製薬社製）中で細断し、ピン
セットでほぐし、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離にか
け、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，６５）で１〜２分間処理し７赤面球を除去し、
ｈｉ Ｅ Ｍで３回洗浄して融合用牌細胞として提供す
る。
（２）骨髄腫細胞の調整
骨髄肺細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ ／ｃ由来＝）ｉｔ髄腫細胞株Ｐ ３−Ｘ６３ Ａ
ｆ８−Ｕｌ （Ｐ３−Ｕｌ）［Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄｌｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ−４エ１−７（１９７８） ］ 、
Ｐ３−ＮＳＩ ／１−Ａｌ１’４．１（ＮＳ−１） （
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｏｇｙ旦５１
１−５１９（１９７６）） 、ＳＰ２１０−Ａ９１４
（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ２７６、２６９−２７０（
１９７８） ：］ 、］Ｐ３−Ｘ６３−Ａｓ’８６５３
（６５３） （Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２３．
１５４８−１５５０（１９７９））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｆ８（Ｘ６３）（：Ｎａｔｕｒｅ ２５Ｇ、 ４９５
−４９７ （１９７５））７とが用いられる。
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ ／ｃ由来＝）ｉｔ髄腫細胞株Ｐ ３−Ｘ６３ Ａ
ｆ８−Ｕｌ （Ｐ３−Ｕｌ）［Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄｌｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ−４エ１−７（１９７８） ］ 、
Ｐ３−ＮＳＩ ／１−Ａｌ１’４．１（ＮＳ−１） （
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｏｇｙ旦５１
１−５１９（１９７６）） 、ＳＰ２１０−Ａ９１４
（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ２７６、２６９−２７０（
１９７８） ：］ 、］Ｐ３−Ｘ６３−Ａｓ’８６５３
（６５３） （Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２３．
１５４８−１５５０（１９７９））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｆ８（Ｘ６３）（：Ｎａｔｕｒｅ ２５Ｇ、 ４９５
−４９７ （１９７５））７とが用いられる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ
−１６４０培地にグルタミ７ （１−５ｍ Ｍ ）、２
メルカプトエタノール（５Ｘ １０−’Ｍ ）、ジエン
タマイシン（１０μ？／ｄ）および牛胎児血清（Ｆｅ２
）（Ｃ８Ｌ社製）（１０チ）を加えた正常培地に、さら
に８アザグアニン（１５μ７／ｄ）を加えた培地〕で、
継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し
、融合当日２Ｘ１０７以上の細胞数を確保する。
−１６４０培地にグルタミ７ （１−５ｍ Ｍ ）、２
メルカプトエタノール（５Ｘ １０−’Ｍ ）、ジエン
タマイシン（１０μ？／ｄ）および牛胎児血清（Ｆｅ２
）（Ｃ８Ｌ社製）（１０チ）を加えた正常培地に、さら
に８アザグアニン（１５μ７／ｄ）を加えた培地〕で、
継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し
、融合当日２Ｘ１０７以上の細胞数を確保する。
（３）細胞融合
（１）で免疫したマウスに２０〜４００Ｐｙ／匹の牛血
清アルブミンを胆腔内投与し、３〜４日後、膵臓を摘出
し、牌細胞を調整する。この牌細胞と（２）で見られる
骨髄肺細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細
胞数が、月卑細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
う混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ ５分）した後
、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌
し寿から、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０
００（ＰＥＧ−１０００）２り、。
清アルブミンを胆腔内投与し、３〜４日後、膵臓を摘出
し、牌細胞を調整する。この牌細胞と（２）で見られる
骨髄肺細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細
胞数が、月卑細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
う混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ ５分）した後
、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌
し寿から、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０
００（ＰＥＧ−１０００）２り、。
Ｍ Ｅ Ｍ ２ ｍｌ、ジメチルスルホキシド０．７
！ＩＬｌｌの混液０．２〜１ ｍｌ ／１０”牌細胞を
加え、１〜２分分毎にＭＥＭ１〜２ｖｔｌｊを数回加え
た後、ＭＥＭを加えて全斌が５０ ｒｒＪになるように
する。
！ＩＬｌｌの混液０．２〜１ ｍｌ ／１０”牌細胞を
加え、１〜２分分毎にＭＥＭ１〜２ｖｔｌｊを数回加え
た後、ＭＥＭを加えて全斌が５０ ｒｒＪになるように
する。
遠心後（９００ｒｐｍ ５分）、上清を捨て、ゆるやか
に細胞をほぐした後、正常培地１０〇−を加え、メスピ
ペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに体用胞をｗ：
：濁する。
に細胞をほぐした後、正常培地１０〇−を加え、メスピ
ペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに体用胞をｗ：
：濁する。
この懸濁液を２４穴培養用プレートに１ ｔｒｔｌ／穴
ずつ分注し、５％Ｃ０２インキユベーター中、３７℃で
２４時間培養する。培養プレートに１罰／穴のＨＡＴ培
地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）チミジン
（１，５Ｘ １０−５Ｍ）夕 およびアミノプテリン（４Ｘ１０””Ｍ）を加えた培地
〕を加え、さらに２４時間培養する。以後２日間、２４
時間目毎に、培養上清」ゴを捨て、新たに同量のＨＡＴ
培地を加え、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０
〜１４日間培養する。
ずつ分注し、５％Ｃ０２インキユベーター中、３７℃で
２４時間培養する。培養プレートに１罰／穴のＨＡＴ培
地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）チミジン
（１，５Ｘ １０−５Ｍ）夕 およびアミノプテリン（４Ｘ１０””Ｍ）を加えた培地
〕を加え、さらに２４時間培養する。以後２日間、２４
時間目毎に、培養上清」ゴを捨て、新たに同量のＨＡＴ
培地を加え、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０
〜１４日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１ｍ６を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２
４時間培養にＨＴ培地への変換を行う。
いて、上清１ｍ６を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２
４時間培養にＨＴ培地への変換を行う。
ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、抗生血清アルブミン抗体価
を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト血清アルブ
ミンや卵白アルブミンなどとの反応性も測定し、牛血清
アルブミンに特異的に反応するものを選択する。牛血清
アルブミンに強く反応し、ヒト血清アルブミン、卵白ア
ルブミンなどに反応しない穴について、限界希釈法によ
りクローニングを２回繰り返し、安定して、牛血清アル
フミ／に強い抗体価の認められたものを、抗生血清アル
ブミンモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ様として
選択する。
記の酵素免疫測定法により、抗生血清アルブミン抗体価
を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト血清アルブ
ミンや卵白アルブミンなどとの反応性も測定し、牛血清
アルブミンに特異的に反応するものを選択する。牛血清
アルブミンに強く反応し、ヒト血清アルブミン、卵白ア
ルブミンなどに反応しない穴について、限界希釈法によ
りクローニングを２回繰り返し、安定して、牛血清アル
フミ／に強い抗体価の認められたものを、抗生血清アル
ブミンモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ様として
選択する。
（４）モノクローナル抗体の調整
プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン０．５ｄを腹腔内投与し、２週間飼育する）
した８〜１０週令のＢＡＬＢ ／ＣＩ准マウマウス（３
）で得られた抗生血清アルブミンモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ細胞２〜４ Ｘ １０’細胞７／匹を
腹腔内注射する。
ンタデカン０．５ｄを腹腔内投与し、２週間飼育する）
した８〜１０週令のＢＡＬＢ ／ＣＩ准マウマウス（３
）で得られた抗生血清アルブミンモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ細胞２〜４ Ｘ １０’細胞７／匹を
腹腔内注射する。
】０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマ
ウスから腹水を採取し、遠心（３０００ｒｐｍ ５分）
して固形分を除去後、５０％硫安、４０チ硫安塩析をし
、Ｐ Ｂ Ｓ （ｐ Ｈ７，２）で１〜２日間透析する
。この透析画分を、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プ
ロティンＡ−セファロースカラムなどに通塔し、ＩｇＧ
画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
ウスから腹水を採取し、遠心（３０００ｒｐｍ ５分）
して固形分を除去後、５０％硫安、４０チ硫安塩析をし
、Ｐ Ｂ Ｓ （ｐ Ｈ７，２）で１〜２日間透析する
。この透析画分を、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プ
ロティンＡ−セファロースカラムなどに通塔し、ＩｇＧ
画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
モノクローナル抗体の特異性の決定は、先に述べた、酵
素免疫測定法によるパインディングアッセイならびにイ
ンヒビジョンアッセイで行々う。
素免疫測定法によるパインディングアッセイならびにイ
ンヒビジョンアッセイで行々う。
抗体のイソタイプの決定は、０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法
（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化学実験法
１５、学会出版センター刊、Ｐ、７４１９８１年）によ
って行う。
（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化学実験法
１５、学会出版センター刊、Ｐ、７４１９８１年）によ
って行う。
蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度［１，４（ＯＤ２８０）中イムノグロブリン１■／
ｄ〕より算出する。
光度［１，４（ＯＤ２８０）中イムノグロブリン１■／
ｄ〕より算出する。
かくして、ＫＭ−１０と命名したハイプリドーマ株から
得られるモノクローナル抗体ＫＭ−１０はＩｙＧ□クラ
スのインタイブに属することを同定した。
得られるモノクローナル抗体ＫＭ−１０はＩｙＧ□クラ
スのインタイブに属することを同定した。
ＫＭ−１０の抗原特異性は、実施例１に示すとおりであ
る。
る。
・・２本発明の七ツクローナル抗体を用いる牛血清アル
ブミン含有蛋白性物質からの牛血清アルブミンの除去の
方法は次のとおりである。
ブミン含有蛋白性物質からの牛血清アルブミンの除去の
方法は次のとおりである。
本発明のモノクローナル抗体ＫＭ−１０，１０７ｖをＰ
Ｂ８１ｍＡにとかし、ＣＮＢ ｒ活性化セファ四−スー
４ Ｂ （Ｐｈａｎｎａｓｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）などの担体１ｄと反応させ、固定化モノ
クローナル抗体をうる。この固定化モノクローナル抗体
をカラムに充填後、これに、牛血清アルブミン含有（５
ｍ７以下）液を通塔する。この操作で、９９％〜１００
％の牛血清アルブミンがカラムに吸着する。この通塔し
た試料に牛血清アルブミン以外の蛋白が含まれている場
合には、それらの蛋白は、非吸着画分にカラムを素通り
して出てくる。モノクローナル抗体と牛血清アルブミン
の量比が２対ｌの範囲内であれば、−回の通塔で、牛血
清アルブミンを試料中より完全に除くことができる。
Ｂ８１ｍＡにとかし、ＣＮＢ ｒ活性化セファ四−スー
４ Ｂ （Ｐｈａｎｎａｓｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）などの担体１ｄと反応させ、固定化モノ
クローナル抗体をうる。この固定化モノクローナル抗体
をカラムに充填後、これに、牛血清アルブミン含有（５
ｍ７以下）液を通塔する。この操作で、９９％〜１００
％の牛血清アルブミンがカラムに吸着する。この通塔し
た試料に牛血清アルブミン以外の蛋白が含まれている場
合には、それらの蛋白は、非吸着画分にカラムを素通り
して出てくる。モノクローナル抗体と牛血清アルブミン
の量比が２対ｌの範囲内であれば、−回の通塔で、牛血
清アルブミンを試料中より完全に除くことができる。
また、カラムに吸着した牛血清アルブミンは、０．０１
〜０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ２，３）など
で、はぼ１００チ溶出することができる。この操作によ
り、本抗体カラムは、５〜１０回の再使用が可能である
。
〜０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ２，３）など
で、はぼ１００チ溶出することができる。この操作によ
り、本抗体カラムは、５〜１０回の再使用が可能である
。
以下本発明の実施例を示す。
実施例】。
（１）免疫マウス牌細胞の調整
８週令のＢＡＬＢ ／ ｃ Ｑマウス（静岡県実験動物
農莱協同組合）５匹にアジ−パントとして水酸化アルミ
ニウムゲル２ｒｎｙ／匹、百日咳菌死菌ワクチン（千葉
系血清研究所）ＩＸＩＯ’ 。
農莱協同組合）５匹にアジ−パントとして水酸化アルミ
ニウムゲル２ｒｎｙ／匹、百日咳菌死菌ワクチン（千葉
系血清研究所）ＩＸＩＯ’ 。
細胞７匹と抗原として牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ
Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ 、 Ｆｒａｃｔｉｏｎ
’Ｊ、 Ｓｉｇｍａ社＃り １００μＬｉ／／匹を腹
腔内に投与して免疫した。
Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ 、 Ｆｒａｃｔｉｏｎ
’Ｊ、 Ｓｉｇｍａ社＃り １００μＬｉ／／匹を腹
腔内に投与して免疫した。
以後、１週毎に、牛血清アルブミン１００＃水を腹腔内
に投与し、２回目以降の免疫をかけた。３回目の免疫以
降、免疫の５〜７日後に採血し、血中の抗生血清アルブ
ミン抗体価を前記の同相法による酵素免疫測定法で調べ
た。
に投与し、２回目以降の免疫をかけた。３回目の免疫以
降、免疫の５〜７日後に採血し、血中の抗生血清アルブ
ミン抗体価を前記の同相法による酵素免疫測定法で調べ
た。
３回以降５匹全例で抗体価が認められたが、さらに２回
、つごう５回の免疫を行なった。
、つごう５回の免疫を行なった。
５回目の免疫後、３日目にマウスより胱１．蓮を摘出し
、牌細胞を調整して、細胞融合に供した。
、牌細胞を調整して、細胞融合に供した。
（２）マウス骨髄腫細胞の調整
８アザグアニン耐性マウス骨髄腿７１’ｆｆｌ Ｉｌｄ
株Ｐ３−Ｕｌを正常培地で培養し、細胞融合時に２Ｘ１
０’以上の細胞をえ、細胞融合に親株として供した。
株Ｐ３−Ｕｌを正常培地で培養し、細胞融合時に２Ｘ１
０’以上の細胞をえ、細胞融合に親株として供した。
（３）ハイブリドーマの作製
（１）と（２）で得られた牌細胞と骨髄肺細胞を５：１
の割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨＡ Ｔ培地
で３７℃、１４日間ＣＯ□５％下で培養して、融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗生血清ア
ルブミン抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さらに
正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、牛血
清アルブミンに特異的なモノクローナル抗体を産生ずる
ハイプリドーマ株、ＫＭ−１０を選択した。
の割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨＡ Ｔ培地
で３７℃、１４日間ＣＯ□５％下で培養して、融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗生血清ア
ルブミン抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さらに
正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、牛血
清アルブミンに特異的なモノクローナル抗体を産生ずる
ハイプリドーマ株、ＫＭ−１０を選択した。
（４）精製モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに（３
）でえられたハイプリドーマ株ＫＭ −１０を４Ｘ１０
’細胞／匹腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブ
リドーマは腹水癌化する。
）でえられたハイプリドーマ株ＫＭ −１０を４Ｘ１０
’細胞／匹腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブ
リドーマは腹水癌化する。
脱水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜１０１！
Ｌｅ／匹）し、遠心分熱（３０００ｒｐｍ ５分）して
固形分を除去した。上清を５０％硫安塩析、４０係硫安
塩析し、Ｐ Ｂ Ｓ （ｐ Ｈ７，２）で２日間透析し
た。この透析品１０．２ｍＡ！（３１ｆ／ｒｄ）を、Ｄ
ＥＡＥセルロース’１６ｍ１ｌのカラム（ｘ、ｔｘ２ｏ
ｔＭ）にかけ、クロマトグラフィーを行ない１１ｉＬｅ
づつ分画しＩｙＧ画分（４−５番目の分画）を集めて、
精製モノクローナル抗体とした。この抗体標品は、電気
泳動的に単一蛋白であることを確認した。
Ｌｅ／匹）し、遠心分熱（３０００ｒｐｍ ５分）して
固形分を除去した。上清を５０％硫安塩析、４０係硫安
塩析し、Ｐ Ｂ Ｓ （ｐ Ｈ７，２）で２日間透析し
た。この透析品１０．２ｍＡ！（３１ｆ／ｒｄ）を、Ｄ
ＥＡＥセルロース’１６ｍ１ｌのカラム（ｘ、ｔｘ２ｏ
ｔＭ）にかけ、クロマトグラフィーを行ない１１ｉＬｅ
づつ分画しＩｙＧ画分（４−５番目の分画）を集めて、
精製モノクローナル抗体とした。この抗体標品は、電気
泳動的に単一蛋白であることを確認した。
（５）精製モノクローナル抗体の抗原特異性同相酵素免
疫測定法により、精製モノクローナル抗体の抗原特異性
を検討した。抗原としては、牛血清アルブミｙ （Ｂ
Ｓ Ａ ）（Ｓｉｇｍａ社製）、ヒト血清アルブミン（
ＩＳＡ）（ミドリ十字社製）、カゼイン（ＣＡ）、卵白
アルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｔ詞ａ社製）、牛胎児血清（
Ｆ ＣＳ ） （Ｃ８Ｌ社製）を用いた。結果を第１表
に示す。
疫測定法により、精製モノクローナル抗体の抗原特異性
を検討した。抗原としては、牛血清アルブミｙ （Ｂ
Ｓ Ａ ）（Ｓｉｇｍａ社製）、ヒト血清アルブミン（
ＩＳＡ）（ミドリ十字社製）、カゼイン（ＣＡ）、卵白
アルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｔ詞ａ社製）、牛胎児血清（
Ｆ ＣＳ ） （Ｃ８Ｌ社製）を用いた。結果を第１表
に示す。
第１表
抗 体 希釈 結合活性（ＯＤ６ ａ ｏ ）ＢＳＡ
ＩＳＡ ＣＡ ＯＶＡ Ｆｅ２−■席マウス血清 １ｏ
−２０，０１０ｏ、ｏｏａ ｏ、６ｏ−ｓ−−−０，ｏ
ｓｏ Ｏ，（１（１−１０” ０．００３ ０．００５
０．００４ ０．０３３ ０．００１０−’ ０．０
０２ ０．００２ ０．００５ ０．００５ ０．００
１０−３０Ｂ４５ ａ２１５ ０．０９０ ０．４８０
０．６７・１（１−’ ０．８２０ ０．０８５ ０
．０４５ ０．１１０ ０，４０１ＫＭ−１０精製モノ
クロー：ｔｏ−２ｏＢａｏ Ｏ，１９００，１１００，
３０７０，６９１す″抗体 １Ｏ−３０Ｂ３４ ０．１
５０ ０．０４０ ０．２４５ ０．４０１０−’ ０
Ｂ４５ ０．０４５ ０．０００ ０．０９２ ０．４
０＋’１０−’０．２８００．００２０．００００．０
５００３９二１０−’ ０．０４０ ０．０００ ０．
０００ ０．０４０ ０．０５０次に、本モノクローナ
ル抗体ＫＭ−１０の牛血清アルブミンへの結合を、牛血
清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、卵白ア
ルブミン牛胎児血清が、どの位阻害するか（インヒビジ
ョンアッセイ）を次の方法で調べた。即ち、抗体を阻害
物と混ぜて３７℃３０分反応させ、それを第１次抗体と
して使用して酵素免疫測定法にかけた。その結果を第２
表に示した。
ＩＳＡ ＣＡ ＯＶＡ Ｆｅ２−■席マウス血清 １ｏ
−２０，０１０ｏ、ｏｏａ ｏ、６ｏ−ｓ−−−０，ｏ
ｓｏ Ｏ，（１（１−１０” ０．００３ ０．００５
０．００４ ０．０３３ ０．００１０−’ ０．０
０２ ０．００２ ０．００５ ０．００５ ０．００
１０−３０Ｂ４５ ａ２１５ ０．０９０ ０．４８０
０．６７・１（１−’ ０．８２０ ０．０８５ ０
．０４５ ０．１１０ ０，４０１ＫＭ−１０精製モノ
クロー：ｔｏ−２ｏＢａｏ Ｏ，１９００，１１００，
３０７０，６９１す″抗体 １Ｏ−３０Ｂ３４ ０．１
５０ ０．０４０ ０．２４５ ０．４０１０−’ ０
Ｂ４５ ０．０４５ ０．０００ ０．０９２ ０．４
０＋’１０−’０．２８００．００２０．００００．０
５００３９二１０−’ ０．０４０ ０．０００ ０．
０００ ０．０４０ ０．０５０次に、本モノクローナ
ル抗体ＫＭ−１０の牛血清アルブミンへの結合を、牛血
清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、卵白ア
ルブミン牛胎児血清が、どの位阻害するか（インヒビジ
ョンアッセイ）を次の方法で調べた。即ち、抗体を阻害
物と混ぜて３７℃３０分反応させ、それを第１次抗体と
して使用して酵素免疫測定法にかけた。その結果を第２
表に示した。
第２表
Ｆｅ２ Ｏ，０１チ ８５゜１
以上の結果より、本モノクローナル抗体は、牛血清アル
ブミンに極めて高い特異性を有していることがわかる。
ブミンに極めて高い特異性を有していることがわかる。
（６）モノクローナル抗体の分類
０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法で、ＫＭ−１０のイソタイプ
をしらべたところ、ＩｇＧクラスに属するモノクローナ
ル抗体で、さらにＩｇＧ１クラスの抗体であると同定さ
れた。
をしらべたところ、ＩｇＧクラスに属するモノクローナ
ル抗体で、さらにＩｇＧ１クラスの抗体であると同定さ
れた。
実施例λ
実施例１で得られた抗生血清アルブミンモノクローナル
抗体ＫＭ−１０の１ｏｙｒ！ｇ／炭酸バッファ −（０
，１Ｍ ＮｐＢ■３＋ ０．５ＭＮａＣｆｆ１ ｐＨ８
，３）をＣＮＢ ｒ−活性化セフ７ ｏ −ス４ Ｂ
（Ｐｂａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｎｅｍｉ−ｃａｌ
ｓ社製→１ ｍ、ｅと室温で２時間反応させ、固定化モ
ノクローナル抗体を得た。この固定化モノクローナル抗
体をカラム（１ｒＩＬ＃）に充填し、そのカラムに０．
５”ｉｉ’ ／ ｍｅの牛血清アルブミン／炭酸バッフ
ァー （０，１ＭＮａＨＣＯ３、０，５ＭＮａＣ１，ｐ
Ｈ８，３）を６．７ ｍ１３７時の流速で通塔し１ｍ＃
づつの流出分画液の２８０ｎｍでの吸光度を第１図に示
しだ。
抗体ＫＭ−１０の１ｏｙｒ！ｇ／炭酸バッファ −（０
，１Ｍ ＮｐＢ■３＋ ０．５ＭＮａＣｆｆ１ ｐＨ８
，３）をＣＮＢ ｒ−活性化セフ７ ｏ −ス４ Ｂ
（Ｐｂａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｎｅｍｉ−ｃａｌ
ｓ社製→１ ｍ、ｅと室温で２時間反応させ、固定化モ
ノクローナル抗体を得た。この固定化モノクローナル抗
体をカラム（１ｒＩＬ＃）に充填し、そのカラムに０．
５”ｉｉ’ ／ ｍｅの牛血清アルブミン／炭酸バッフ
ァー （０，１ＭＮａＨＣＯ３、０，５ＭＮａＣ１，ｐ
Ｈ８，３）を６．７ ｍ１３７時の流速で通塔し１ｍ＃
づつの流出分画液の２８０ｎｍでの吸光度を第１図に示
しだ。
第１図より明らかなように、１０■のモノクローナル抗
体を固定化しだカラムで、牛血清アルブミンの総量が４
１１ｑ （０，５ｍｑ ／ ｍｌＸ ８ ｍ／！ ）に
なるまでは、牛血清アルブミンは、完全に、抗体カラム
に吸着されることがわかる。
体を固定化しだカラムで、牛血清アルブミンの総量が４
１１ｑ （０，５ｍｑ ／ ｍｌＸ ８ ｍ／！ ）に
なるまでは、牛血清アルブミンは、完全に、抗体カラム
に吸着されることがわかる。
また、この一度吸着された牛血清アルブミンは、抗体カ
ラムに０．０４Ｍグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）
を通塔することにより、はぼ１００チ溶出でき、抗体カ
ラムは、再使用することができる。
ラムに０．０４Ｍグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）
を通塔することにより、はぼ１００チ溶出でき、抗体カ
ラムは、再使用することができる。
実施例３゜
実施例２と同様のＫＭ−１０抗体カラムに、同様の条件
で、午血清アルブミン１■、リボヌクレー、ｘ１′Ｉｎ
Ｌｉ、キモトリプシノーゲン１ｍｖ、卵白アルブミン１
■を炭酸バッファー（０，１Ｍ ＮａＨＣｏ ３ 。
で、午血清アルブミン１■、リボヌクレー、ｘ１′Ｉｎ
Ｌｉ、キモトリプシノーゲン１ｍｖ、卵白アルブミン１
■を炭酸バッファー（０，１Ｍ ＮａＨＣｏ ３ 。
０．５ＭＮａ（ｊ！、 ｐＨ８，３） １ ｍｇに溶か
した液を通塔し、流出液を電気泳動でしらべたところ、
非吸着画分としてリボヌクレース、キモトリプシノーゲ
ン、卵白アルブミンは素通りして、全量回収される。し
かし、牛血清アルブミンは、その総量が４■になるまで
は、全量カラムに吸着され流出液中には認められないこ
とがわかった。すなわち、各種蛋白質混液中から、牛血
清アルブミンのみを、本抗体カラムにより、完全に除く
ことができた。
した液を通塔し、流出液を電気泳動でしらべたところ、
非吸着画分としてリボヌクレース、キモトリプシノーゲ
ン、卵白アルブミンは素通りして、全量回収される。し
かし、牛血清アルブミンは、その総量が４■になるまで
は、全量カラムに吸着され流出液中には認められないこ
とがわかった。すなわち、各種蛋白質混液中から、牛血
清アルブミンのみを、本抗体カラムにより、完全に除く
ことができた。
第１図は実施例２における牛血清アルブミン吸着を示す
。
。
Claims (4)
- （１） 牛血清アルブミンに対するモノクローナル抗体
。 - （２） 該モノクローナル抗体がＴｇＧイソタイプに属
することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノ
クローナル抗体。 - （３）牛血清アルブミンを含む物質を、牛血清アルブミ
ンに対するモノクローナル抗体を用いるアフィニティー
クロマトグラフィにかけるΔ ことにより該物質から牛血清アルブミンを除くことを特
徴とする物質の精製法。 - （４）マウスを牛血清アルブミンで免疫して得られる牌
細胞とマウスの骨髄腫細胞とを通常の方法で融合させて
得られたハイプリドーマでかつ、牛血清アルブミンに対
するモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイプ
リドーマを培地で培養するかまたはマウス腹腔内に移植
して腹水癌化することにより、培養液中あるいは腹水中
に該モノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養液ある
いは、腹水中からモノクローナル抗体を採取することを
特徴とする牛血清アルブミンに対するモノクローナル抗
体の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11519783A JPS608228A (ja) | 1983-06-28 | 1983-06-28 | モノクロ−ナル抗体 |
| CA000457413A CA1235078A (en) | 1983-06-28 | 1984-06-26 | Monoclonal antibodies, to bovine serum albumin and their use in bsa isolation |
| EP84304431A EP0131415A3 (en) | 1983-06-28 | 1984-06-28 | Monoclonal antibodies, processes for their preparation and methods for their use |
| DE1984304431 DE131415T1 (de) | 1983-06-28 | 1984-06-28 | Monoklonale antikoerper, verfahren zu deren herstellung und methoden zu deren verwendung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11519783A JPS608228A (ja) | 1983-06-28 | 1983-06-28 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS608228A true JPS608228A (ja) | 1985-01-17 |
Family
ID=14656757
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11519783A Pending JPS608228A (ja) | 1983-06-28 | 1983-06-28 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0131415A3 (ja) |
| JP (1) | JPS608228A (ja) |
| CA (1) | CA1235078A (ja) |
| DE (1) | DE131415T1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8618443D0 (en) * | 1986-07-29 | 1986-09-03 | Univ London | Monoclonal antibodies |
| CN111647080B (zh) * | 2020-02-14 | 2022-04-08 | 北京纳百生物科技有限公司 | 一种免疫胶体金混合标记用c线抗体及其应用 |
| CN112694531A (zh) * | 2020-03-30 | 2021-04-23 | 天津昂赛细胞基因工程有限公司 | 一种bsa单抗制备方法 |
| CN114591430B (zh) * | 2022-05-10 | 2022-08-12 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | Bsa单克隆抗体及其应用、含有抗体的bsa检测试剂盒 |
| CN117343171B (zh) * | 2022-11-01 | 2024-03-19 | 上海百英生物科技股份有限公司 | 一种抗bsa的兔单克隆抗体及其应用 |
-
1983
- 1983-06-28 JP JP11519783A patent/JPS608228A/ja active Pending
-
1984
- 1984-06-26 CA CA000457413A patent/CA1235078A/en not_active Expired
- 1984-06-28 EP EP84304431A patent/EP0131415A3/en not_active Withdrawn
- 1984-06-28 DE DE1984304431 patent/DE131415T1/de active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE131415T1 (de) | 1985-12-19 |
| CA1235078A (en) | 1988-04-12 |
| EP0131415A3 (en) | 1987-01-07 |
| EP0131415A2 (en) | 1985-01-16 |
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