JPS63180860A

JPS63180860A - 抗ｇ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体

Info

Publication number: JPS63180860A
Application number: JP62012721A
Authority: JP
Inventors: Hajime Koda; 好田　肇
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1987-01-22
Filing date: 1987-01-22
Publication date: 1988-07-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、Ｇ−ＣＳ　Ｆの精製や定量に有用な抗Ｇ−Ｃ
ＳＦモノクローナル抗体に関する。

従来の技術（、−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体は知られてい
ない。

発明が解決しようとする問題点組換えＤＮＡ技術の発達により、Ｇ−ＣＳ　Ｆを微生物
たとえば大腸菌により製造し大量に供給することが可能
となった。

組換えＤＮＡ技術により製造したＧ−ＣＳＦの確実な評
価および薬剤としての開発のために、優れた精製手段お
よび簡便で高精度の定量法が求められている。

問題点を解決するための手段本発明者は、Ｇ−ＣＳＦについて精製、定量などに使え
るモノクローナル抗体を得るべく研究した。その結果、
第１表で示されるＧ−ＣＳＦでマウスを免疫して得られ
る肺細胞とマウスの骨髄腫細胞とを通常の方法で融合さ
せて得られるハイブリドーマが、該Ｇ−ＣＳＦに対して
反応するモノクローナル抗体を生成し、該モノクローナ
ル抗体はその精製、定量に使用することができることを
見出し本発明を完成した。

ロコ　　　ロコ　　　ＬｊＬ　　　　＜コ　　　くコ　
　　←−じ５　　ご；　　　淀ｙ　　　ご；　　　ご；
　　　包よ冒＝　　　わ５　　　　ｅ５　　　　翼；　
　　１饗　　　３ｇ以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のモノクローナル抗体の製造は次のとおりに行う
。

（１）免疫化動物細胞の調製マウス、ラットなどをＧ−ＣＳＦで免疫して、その動物
から肺細胞を調製する。

Ｇ−ＣＳＦは、ヒトの顆粒球から採取されたものまたは
組換えＤＮＡ技術で大腸菌で製造したもの（Ｎａｔｕｒ
ｅ　３１９．４１５（１９８６）、５ｃｉｅｎｃｅ　２
３２　。

６１（１９８６））を使用する。第１表のアミノ酸配列
第１〜１７４で示されるＧ−ＣＳＦが好適に利用できる
。

免疫の方法は、８〜１０週令のマウスの皮下あるいは、
静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば
、フロイントの完全アジュバント　（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）　あるいは、
水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とと
もに該Ｇ　−ＣＳ　Ｆ　１０ｘｒ　〜１０ｏｌＬｇ／匹
を投与する。以後１〜２週問おきに、該Ｇ−ＣＳＦを２
〜１０回投与する。

各免疫後１週間で、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗
Ｇ−ＣＳＦ抗体価を以下に示す固相法による酵素免疫測
定法で調べる。

抗体価の測定法は、固相酵素免疫測定法（酵素免疫測定
法；医学書腕利１９７８年）によった。

９６大のＥＩＡ用プレート〔Ｆｌｏｗ　１ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ社（米）製〕に、特異抗原〔Ｇ−ＣＳＦが１０ｇ
ｇ／ｍｌとなるようフォスフェートバッファー・セイラ
イン（ＰＢＳ）　　（リン酸２ナトリウム１８３ｇ、リ
ン酸１カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１
ｊｌ’、ｐＨ７，２）で希釈した溶液、交差反応をみる
場合には、Ｇ−ＣＳＦのかわりに他の抗原あるいはＢＳ
’Ａ／ＰＢＳ溶液を用いる〕を１００ＪＬ（！／穴ずつ
分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレート穴底面にコ
ートさせ、その後１％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液２０
０μｇ／穴を分注し、４℃で一晩放置して、プレート底
面上の蛋白質結合性残基をＢＳＡでコートする。

上記プレートをＰＢＳでよく洗浄後、第１抗体として、
段階希釈した試料（マウス抗血清、ハイブリドーマ培養
上清、精製抗体）を５０ｉｔｌｌ／穴分注し、４℃で一
晩または室温で３〜４時間放置する。ＰＢＳで６回洗浄
した後、第２抗体として、ウサギの抗マウスイムノグロ
ブリン−ペルオキシダーゼ結合物［：ＤＡＫＯ社製、販
売：協和メデックス〕の４００倍希釈液を１００ρ／穴
分注し、室温で２時間放置する。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢ
ＴＳ基質液Ｃ２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム５５０ｍ
ｇを０．１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，２）ＩＡに溶
かした溶液に、使用直前に過酸化水素１ρ／ｍｌを加え
た溶液〕１００ｍを加え、発色をＯＤ４１５１ｍで吸光
度を測定する。Ｇ−ＣＳＦに対する抗体価が、正常マウ
ス血清の１０３倍以上（４１５ｎｍでのＯＤ値）になっ
たマウスを免疫化動物細胞の供給源として使う。

細胞融合に供するために、免疫マウスに融合処理の３〜
４日前にＧ−ＣＳＦを５×１０５〜１０７１０／匹腹腔
内投与し、追加免疫後、肺臓を摘出し、肺細胞を調製す
る。

（２）骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３　　Ａｇ８−
Ｕｌ　（Ｐ３−Ｕｌ）［Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｔｏｐｉｃｓ
　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　　８１　１−７　（１９７８）〕Ｐ　３−
ＮＳ　Ｉ／１−Ａｇ４．１　　（ＮＳ−１）　　［Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎ　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　、６　５１１−５１９（１９７
６）　）　ＳＰ２１０−Ａｇ　１４　（ＳＰ−２）　　
（Ｎａｔｕｒｅ　２７６　．２６９−２７０（１９７８
））　、　　Ｐ　３−Ｘ６３−Ａｇ３．６５３（６５３
）　　（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２３．１５４８
−１５５０（１９７９））　、　Ｐ　３−Ｘ　６３−Ａ
ｇ　８　（Ｘ　６３）〔Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５
−４９７（１９７５）Ｅなどが用いられる。これらの細
胞株は、８−アザグアニン培地ＣＲＰＭＩ−１６４０培
地にグルタミン（１，５ｍＭ）、２−、Ｉルヵプ）エタ
／−ル（５Ｘ　１０−５Ｍ）　、　ジエンタマイ”ン（
１０ｘ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣ３）（１０％）
を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５ｔ
ｔｇ　／ｍ　ｌ　）を加えた培地〕で継代するが、細胞
融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２Ｘ１
０７以上の細胞数を確保する。

（３）細胞融合（１）で免疫したマウスに５Ｘ１０５〜１０７Ｉ［１Ｘ
匹のＧ−ＣＳＦを腹腔内投与し、３〜４日後に肺臓を摘
出し、肺細胞を調製する。この肺細胞と（２）で得られ
る骨髄腫細胞をＭＥＭ培地（日永製薬社製）またはＰＢ
Ｓでよく洗浄し、細胞数が、肺細胞：骨髄腫細胞＝５〜
１０：１になるように混合し、遠心分離にかける。上清
を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しなが
らポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　（、−１０００〜
４０００）１〜４ｇＳＭＥＭ培地１〜４ｍｌ、ジメチル
スルホキシド（口ｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
０．５〜１．Ｑｍｌの混液０．１〜１．０ｍｌ／　１０
８胛細胞を加え、０．５〜１０分後にＭＥＭ培地０．５
〜３ｍｌを加える。その後０．５〜２分毎にＭＥＭ培地
０．５〜３ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を３０〜６
０ｍ１加える。遠心後、上清を捨て、ゆるやかに細胞を
ほぐした後、正常培地５０〜２０　Ｑｍｌを加え、メス
ピペットでゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培
養用プレートに半容量／穴ずつ分注し、３〜７％ＣＯ２
インキユベーター中、３５〜４０℃で１０〜３０時間培
養する。培養プレートに半容量／穴のＨＡＴ培地〔正常
培地にヒポキサンチン（１０−５〜１０−３Ｍ）　、チ
ミジ７　（１０−６〜１０−’Ｍ）　オよびアミノプテ
リン（１０−８〜１０−７Ｍ）　ヲ加えた培地〕を加え
、さらに１０〜３０時間培養する。以後１〜３日間日間
１０註３０培養上清半容量を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え
、ＣＯ２インキユベータ−中、３５〜４０℃で１０〜１
４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清半容量を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後１〜３日
間日間１０註３０ＨＴ培地で３〜４日培養後、培養上清
の一部をとり上記の酵素免疫測定法により、抗Ｇ−ＣＳ
Ｆ抗体価を測定する。

抗体価の認められた穴について、限界希釈法によりクロ
ーニングを２〜４回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗Ｇ−Ｃ８Ｆモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ株として選択する。

（４）モノクローナル抗体の調製プリスタン処理した８〜１０週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
に（３）で得られた抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ細胞２〜４×１０６個／匹を腹腔内注
射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する
。このマウスから腹水を採取し、遠心して固形分を除去
後、５０％硫安塩析、４０％硫安塩析をし、ＰＢＳ　（
ｐＨ７，２）で１〜２日間透析する。この透析画分を粗
精製モノクローナル抗体として分離し、定量用に供する
ことができる。

さらに精製が必要な場合には、ＤＥＡＥ−セァロースカ
ラム、プロティンＡ−セファロースカラムなどに通塔し
、ＩｇＧ画分を集める。

抗体のイソタイプ、サブクラスの決定は、０ｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１５．
学会出版センター刊、ｐ７４．１９８１年）によって行
う。

蛋白質の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度〔１，４（○Ｄ２Ｂ［１）″−、イムノグロブリン
１ｍｇ／ｍｌ　：］より算出する。

かくして、ＫＭ−３４２と命名したハイプリドーマ株か
ら得られるモノクローナル抗体ＫＭ−３４２は、ＩｇＧ
＋　に属することを同定した。

ＫＭ−３４２の抗原特異性、Ｇ−ＣＳ　Ｆ活性の中和活
性は実施例に示すとふりである。

本発明のモノクローナル抗体を用いるＧ−ＣＳＦの精製
方法の一例を示せば次のとおりである。

本発明のモノクローナル抗体１０ｍｇをＰＢ３１〜１０
ｍ１にとかしＣＮＢｒ活性化セファロース−４Ｂ　（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）などの担体１ｍｌと反応させ、固定化モノクローナル
抗体を得る。この固定化モノクローナル抗体をカラムに
充填後、これに組換えＤＮＡ技術により製造したＧ−Ｃ
ＳＦ　（３ｍｇ以下）を含む溶液を通塔する。この操作
で９５〜１００％のＧ−ＣＳＦがカラムに吸着される。

溶媒、たとえば、７Ｍ尿素とＩＭＮａＣｊ２とを含む溶
液（ｐＨ７，０）で溶出すると、吸着量の約８０％のＧ
−ＣＳＦが溶出する。−回の通塔により約５、０００倍
の精製が可能である。これに対して、加熱などにより失
活させたＧ−ＣＳ　Ｆは全く本抗体カラムに吸着されな
い。

本発明のモノクローナル抗体は同相サンドウィッチ法に
よる酵素免疫測定法などによりＧ−ＣＳＦを定量するた
めに使用できる。

実施例１（１）免疫マウス脾細胞の調製８週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌マウス（静岡系実験
動物農業協同組合）５匹にアジュバントとして水酸化ア
ルミニウムゲル２ｍｇ／匹および百日咳菌死菌ワクチン
（千葉系血清研究所）１×１０９細胞／匹と抗原として
第１表のＧ−ＣＳＦ１００■／匹を腹腔内投与し免疫し
た。

以後、２週問おきに、該Ｇ−ＣＳＦ　　１００μｇ／匹
を腹腔内に投与し、２回目以降の免疫をかけた。３回目
の免疫以降、免疫の５〜７日後に眼底静脈叢より採血し
、血清中の抗Ｇ　−ＣＳＦ抗体価を前記の同相法による
酵素免疫測定法で調べた。

３回免疫以降５匹全例で抗体価が認められたが、■ｇＧ
クラスのモノクローナル抗体を効率よく得るために、総
計５回の免疫を行った。

５回目の免疫後、Ｇ−ＣＳＦ　　１００μｇ／匹を腹腔
内投与して追加免疫し、３日後このマウスから肺細胞を
調製して細胞融合に用いた。

（２）マウス骨髄腫細胞の調製８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−ＵＩを正
常培地（ＲＰＭＩ−１６４０にグルタミンｌ、５ｍＭ、
２−メルカプトエタノール５Ｘ　１０−５Ｍ、ジェンク
マイシン１０μｇ　／　ｍ　］および牛脂児血清Ｑ、　
ｌ　ｍｌ　／＋ｎｌを加えた培地〕に培養し、４日後に
２Ｘ１０７以上の細胞を得た。

（３）ハイブリドーマの作製ＭＥＭ　（田水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス肺
細胞ｌＸｌ０’個とマウス骨髄腫細胞ＰＩ−ＵＩ　　２
Ｘ１０７個を混合し、１．２０Ｏｒｐｍで５分間遠心分
離にかけた。

沈澱として得られた肺細胞とＰ３−ＵＩの混合した細胞
群をよくほぐした後、撹拌しながら３７℃、ポリエチレ
ングリコール−１，０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、
ＭＥＭ２ｍｌおよびＤＭＳ○　Ｑ、７ｍｌの混液０．５
ｍｌを加え、１分後にＭＥＭｌｍｌを加えた。その後Ｍ
ＥＭ１ｍｌを１分毎に５回加えた後、ＭＥＭを全容量が
５０ｍ１となるように加えた。９００ｒｐｍで遠心分離
後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正常培
地１０３ｍｌを加え、１０ｍ１メスピペツトでゆるやか
に細胞を懸濁した。

懸濁液を２４穴培養用プレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ社（米）製〕に１ｍ１／穴ずつ分注し、５％
ｃｏ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した
。培養プレートに１ｍ１／穴のＨＡＴ培地〔上記正常培
地にヒポキサンチン１０−’Ｍ、チミジン１．５　Ｘｌ
０−５Ｍおよびアミノプテリン４　Ｘｌ０−７Ｍを加え
た培地〕を加え、さらに２４時間培養した。培養上清１
ｍｌを捨て、あらたにＨＡＴ培地培地１奢ｌえ、３７℃
でさらに２４時間培養した。培養上清１ｍｌを捨て、Ｈ
ＡＴ培地培地１奢ｌえ、３７℃でさらに１０〜１４日間
培養した。

コロニー状に生育してきた融合細胞のみられる穴につい
て、上清１ｍｌを捨て、ＨＴ培地〔上記ＨＡＴ培地より
アミノプテリンを除いた培地〕を１ｍｌ加えて３７℃で
培養した。以後２日間同様にＨＴ培地への交換を行い、
培養を続け４日後、培養上清の一部を採取し、抗Ｇ−Ｃ
ＳＦ抗体価を上記の同相酵素免疫測定法により測定した
。

抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンを抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ株とじてＫＭ−３４２を選択した。ハイプリ
ドーマ株ＫＭ−３４２は英国Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅｓにＥＣＡＣＣＮｏ、８７０１１６０１として
昭和６２年１月１６日付で寄託しである。

（４）モノクローナル抗体の部分精製プリスタン処理Ｃ２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈ
ｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）０．５ｍｌ／匹を腹腔内
投与し、２週間飼育する。〕した８週令ＢＡＬＢ／ｃ雌
マウスに上記で得られたハイプリドーマ株各４Ｘ１０６
細胞／匹を腹腔内注射した。１０〜２１日後にハイプリ
ドーマ株は腹水癌化する。１０〜２１日後に腹水のたま
ったマウスから腹水（４〜１０ｍ１）を採　　玉取し、
遠心分離して固形分を除去した。上清を　　Ｇ免□ ５０％硫安塩析、４０％硫安塩析し、ＰＢＳＭ− （ｐＨ７，２）で２日間透析した。これを粗精製　モノ
シモノクローナル抗体ＫＭ−３４２とした。

（５）粗精製モノクローナル抗体の抗原特異性固相酵素
免疫測定法により粗精製モノクローナル抗体の抗原特異
性を測定した。抗原とじては第１表のＧ−ＣＳＦのほか
、組換えＤＮＡ技術インターフェロン−γ　（ＨＩＦＮ
−ｒ）　　Ｃ実験医学第２巻　４４　（１９８４）　）
　、組換えＤＮＡ技術インターフェロン−β　（ＨＩＦ
Ｎ−β）〔遺伝子組換実用化技術第４巻、１６５　（１
９８３））　、ホスト大腸菌由来夾雑タンパクおよび牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業社製）を用いた
。

結果を第２表に示す。

第　　　２　　　表尻騎− −ＣＳＦ　　　ｘｌＯ−２０，９８００，０１５０，０
２００，００５０，３４０蔓マウス　血清３４２粗精製　１０ｘｒ／ｍｌ　’０．８９０　０．０
０８　０．０１０　０．００５　０．０２５０−ナル　
抗イ本粗精製モノクローナル抗体をＤＥＡＥセファロースカラ
ムに通塔後溶出し、ＩｇＧ画分を集め精製モノクローナ
ル抗体とした。

（６）抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体によるＧ−ＣＳ
Ｆの中和活性マウス骨髄細胞を用いる顆粒球コロニー形成法（ソフト
サイエンス社刊、　１９８５．最新組織培養応用研究法
−Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　アッセイと有用物質生産−、Ｐ
、２０５〜２０９）により、抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナ
ル抗体のＣＳＦ活性中和活性を調べた。５０．ｑ／ｍｌ
のＧ−ＣＳＦと、１■〜１．０００　／４ｇ／ｍｌのＫ
Ｍ−３４２とを混合し、室温３０分静置後、骨髄細胞含
有寒天プレートに加え、３７℃、７〜１０日間Ｃ０２イ
ンキユベーター中で培養し、出現した顆粒球のコロニー
数を測定した。その結果を第１図に示す。

第１図より明らかなように、ＫＭ−３４２は、（、ＣＳ
Ｆによる顆粒球コロニー形成を中和した。

（７）モノクローナル抗体の分類０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学
実験法１５．学会出版センター刊　ｐ、７５　１９８１
年）でＫＭ−３４２の抗体のインタイブを調べたところ
、抗体がＩｇＧクラスに属するモノクローナル抗体であ
り、さらにＫＭ−３４２はＩｇＧ。

クラスの抗体であると同定された。

実施例２実施例１で得られた抗Ｇ−Ｃ，Ｓ　Ｆモノクローナル抗
体ＫＭ−３４２の１０ｍｇ／ＰＢＳをＣＮＢ　ｒ活性化
セフ　７　ｏ−ス−４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉ
ｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）１ｍｌと反応させ、固
定化モノクローナル抗体を得た。この固定化モノクロー
ナル抗体をカラムに充填し、そのカラムに２．５ｍｇの
Ｇ−ＣＳＦを含んだ培養抽出物５ｍｌを通塔したところ
、２．４ｍｇ（９６％）のＧ−ＣＳＦがカラムに吸着し
た。

次にＰＢＳで洗浄後７Ｍ尿素とＩＭ　　ＮａＣｊ７とを
含む溶液で溶出したところ、１．９４ｍｇ（吸着量の８
１％）のＧ−ＣＳＦが溶出した。この−回の通塔により
、Ｇ−ＣＳＦが約５．０００倍精製された。

一方加熱などにより失活させたＧ−ＣＳＦは、全く本抗
体カラムに吸着しなかった。

実施例３第１表のＧ−ＣＳＦをウサギに免疫して得た、抗Ｇ−Ｃ
ＳＦウサギ抗血清を第１抗体として、１００■／ｍ　１
の濃度で９６穴ＥＩＡ用プレート［：Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ社（米）製〕に５０ρ／穴ずつ分注した
。４℃で２４時間放置し、プレートの穴の底面に第１抗
体をコートした。ついで、プレート穴の底面の蛋白結合
基の残りを覆うため、１％牛血清アルブミン／ＰＢＳを
２００ρ／穴ずつ分注し、４℃で２４時間放置した。レ
ジン水でよく洗浄後、１００ｍｇ〜１００　μｇ／ｍｌ
の（、−ＣＳＦを５０〃／穴ずつ分注し、室温に２時間
放置した。

ＰＢＳでよく洗浄した後、第２抗体として、ビオチン化
ＫＭ−３４２（１０μｇ／ｍｌ）を５０鴻／穴加え、４
℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−
ビオチン−ペルオキシダーゼ〔ベクトール（ＶＥＣＴＯ
Ｒ）社製〕（１０μｇ／ｍｌ）　　１００ρ／穴加え、
室温で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄した。次にＡＢ
ＴＳ基質液を１００ｄ／穴加え、室温で３０分間反応さ
せ、５％ＳＤＳ溶液１００ＩＩｊｌ／穴を加え反応を停
止した。各穴の発色を吸光度計（ＯＤ４１５）で測定し
た。

その結果、第２図に示した様に、０．５〜５０μｇ／ｍ
ｌの範囲でＧ−ＣＳＦを定量することが可能であった。

この系に、Ｇ−ＣＳＦの代わりに、熱失活させたＧ−Ｃ
ＳＦを加えても、全く反応しなかった。

発明の効果本発明のモノクローナル抗体を用いて、第１表に示した
Ｇ−ＣＳＦを効率よく精製し、高感度。

簡便、迅速に定量することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＧ−ＣＳＦによる顆粒球コロニー形成能の抗（
、−ＣＳＦ抗体（ＫＭ−３４２）による中和活性を示す
。第２図はＧ−ＣＳＦの含有量と４１５ｎｍの吸光度の関
係を示す。黒丸は（、−ＣＳＦ５０■添加、白丸はＧ−ＣＳＦ無添
加を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−ＣＳＦと
略記する）に対する抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体。
（２）Ｇ−ＣＳＦが第１表のアミノ酸配列１〜１７４で
示されるものであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項のモノクローナル抗体。
（３）Ｇ−ＣＳＦ活性の中和活性を有することを特徴と
する特許請求の範囲第１項のモノクローナル抗体。
（４）Ｇ−ＣＳＦでマウスを免疫して得られる脾細胞と
マウスの骨髄腫細胞とを通常の方法で融合させ、得られ
るハイブリドーマを培地に培養するか、またはマウスの
腹腔内に移植して腹水癌化することにより、培養液中ま
たは腹水中に抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体を生成蓄
積させ、該培養液または腹水から該モノクローナル抗体
を採取することを特徴とする抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナ
ル抗体の製造法。
（５）抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーにより、Ｇ−ＣＳＦ含有物
質からＧ−ＣＳＦを単離することからなるＧ−ＣＳＦの
精製法。
（６）抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体を用い、固相サ
ンドウィッチ法による酵素免疫測定法によりＧ−ＣＳＦ
を定量する方法。