JPH0213376A - 緑膿菌に対するモノクローナル抗体、ならびにその調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、これまでに開示°された緑膿菌（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型の１９種
類のすべてと交差反応するモノクローナル抗体（ｒｎＡ
ｂ）に関する。この抗体は、診断補助物として、活性物
質としてまたは活性物質担体としての使用が可能である
。

緑膿菌は、日和見性（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ）病
原性のダラム陰性細菌である。これは、例えば、嚢胞性
線維症を有する患者の肺炎、または火傷患者または骨も
しくは尿路感染症患者の敗血症など、生命を脅かす疾患
を引き起こす。緑膿菌によって起きる疾患の抗生物質に
よる治療は難しく、しばしばその耐性パターンのために
不成功に終わる。これが、免疫予防および免疫治療によ
る感染のコントロールが注目されてきた理由である。緑
膿菌の１９種類の血清型のすべてに対する防御は、精製
された外膜タンパク質（ＯＭＰ）、Ｆ、Ｈ２および■の
混合物によって行われた（ｖｏｎ　５ｐｅｃｈｔら：Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｌｌ、４０８−４１２．１９８７）
。上記の研究において、リンパ球は、免疫されたマウス
から単離してＮＳ−１ミエローマ細胞と既知の方法にて
融合させたものであった（　Ｋｅａｒｎｙら：　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ工、４．１５４８−１５５０．１
９７９）。得られた約５００個のハイブリドーマから１
個のｍＡｂ（以下ｍＡｂ６Ａ４と称する）が選択された
。これは、以下に列記するような有利な性質を有する。

−１９種類の緑膿菌血清型のすべてと強くて均一な反応
をすること。

−Ｃ１ｑ固定試験で陽性を示すこと。

−マウスな緑膿菌感染に曝した場合に防御効果を示すこ
と。

さらに、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが決定された（諸例、表１およ
び表２を参照されたい）。いまやヒトｍＡｂを、マウス
抗体遺伝子の不変領域を、それと対応するヒト配列に置
き換えることによって得ることができる。この「ヒト化
された（ｈｕｍａｎｊｚｅｄ）　＝抗体配列を真核細胞
、例えばＣＨＯ細胞または酵母、において発現させるこ
とによって、診断目的、予防および治療のために用い得
る対応するヒ）ｍＡｂを得ることができる。

したがって、本発明は以下の内容に関する。

ａ　）　　ｍ　Ａ　ｂ　６　Ａ　４またはその部分をコ
ードする精製単離したＤＮＡ配列、これらの転写産生物
および「ヒト化」配列の対応する組合せ、ｂ）　これら
の配列の全部または部分を含むＤＮＡ構造物およびベク
ター、 Ｃ）　そのようなりＮＡによって形質転換された原核細
胞または真核細胞、 ｄ）　形質転換によるこれらの細胞によって発現された
ポリペプチド、またはそれらの部分。

ｅ）　それらのアミノ酸配列、 ｆ）　　　（ｅ）からのペプチドまたはアミノ酸配列物
を単一でまたは絹合せとして含む、診断補助物、予防剤
または治療剤、 ｇ）　遺伝子操作による、（ｄ）に記述のポリペプチド
またはその部分の調製法、およびｂ）　　　（ａ）に記
述の配列によってコードされる抗体が結合するエピトー
プ。

本発明のさらなる態様は以下の諸例、諸表および特許請
求の範囲に詳述される通りである。

例１：ｍＡｂ６Ａ４の調製 ｌａ）　　免疫使用のための、緑膿菌血清型１２の外膜
タンパク質ＯＭＰ　Ｆ、Ｈ２および■の調製。

ＯＭＰ　　Ｆ、Ｈ２および■を、Ｔ、　Ｍｉｚｕｎｏ　
ＢよびＭ、　Ｋａｇｅｙａｍａ　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　９．１７９−２５８．１９７８）の記載のように
して緑膿菌血清型１２から精製した。すなわち、細胞を
、後間対数期に集めてから超音波処理によって破砕して
、次いて、細胞膜を１００．０００Ｘｇにて約１時間遠
心分離して集めた。細胞膜を段階的に２％ＳＤＳ、１０
％グリセロールおよび２％ＳＤＳおよび最後に０．１　
ＭＮａＣＩで抽出した。残留する不溶性の両分は、主と
してＯＭＰ　　Ｆ、ＯＭＰ　　Ｈ２であり、いくらかの
ＯＭＰＩを含む。

１　ｂ）　　ＯＭＰ　　Ｆ、Ｈ２およびＩによるＢａ１
ｂ／Ｃマウスの免疫 免疫のために、第１日日に、２０μｇのＡ　Ｉ　（ＯＨ
）３とともに５０７ｚ　ｇの精製したＯＭＰ（８０μｍ
）を含む懸濁液を各マウスの腹腔内に注射した。同じ投
与量で、１４日日目よび２１日日目注射を繰り返した。

さらに４週間の経過後に、別の追加注射（ｂｏｏｓｔｅ
ｒ）　　（同一投与１１）を行って、さらに３日の後に
脾臓を摘出した。

ｌｃ）　　細胞融合 細胞の融合は、実質的にＧ、　ＫｏｅｈｌｅｒおよびＣ
１Ｍ１ｌｓｔｅｉｎ　（Ｅｕｒ、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ
１．　（ｉ、５１１−５１９．１９７６）の方法に従っ
て行った。（１ｂ）からの摘出脾臓から調製した約ｌＸ
１０６個の脾臓細胞を、５Ｘ１０７個のＨ５−１ミエロ
ーマ細胞（Ｋｅａｒｎｙら二助出、ＡＴＣＣＮｏ、Ｔ　
Ｉ　Ｂ−１８としてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから市販されている
もの）と２ｍｌの５０％ポリエチレングリコールｌ　５
　Ｑ　Ｑ　（Ｓｅｒｖａ社、ハイデルベルグ）中で融合
させた。融合処理の後、細胞をＩ　Ｘ　１０６個／ｍｌ
の正常脾臓細胞とともにヒボキサンチン、アミノプテリ
ンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含むＤ旧ｂｅｃｃｏの１
１ざ飾ミニマル培地（ＭＥＭ）にプレートした。抗体産
生を、以下に記述する酵素結合免疫吸着分析（ＥＬ■Ｓ
Ａ）で試験して、目的のクローンを希釈法によって得た
。

ｌｄ）　　抗体分泌クローンを検出するためのＬＩＳＡ 直接ＥＬＩＳＡを用いて、抗原に結合しているか、また
どの程度に結合しているかを種々のｍＡｂについて調べ
た。

Ｄｙｎａｔｅｃｈ社（Ｐ　ｌ　ｏｃｈ　ｉ　ｎｇｅｎ　
）のポリ塩化ビニール製の９６ウエルのマイクロタイタ
ープレートを血清型１２０緑膿菌の超音波処理物（ｓｏ
ｎｉｃａｔｅ）（ＰＢＳにて１：２００に希釈したもの
＝４．５Ｍｇ／ｍｌ、以下を参照されたい）１００μｌ
にてコーティングして、４℃で一晩インキユベートした
。次いで、プレートを３回洗浄してからＰＢＳで希釈し
たウシ血清アルブミンで３７℃で１時間飽和させた。さ
らに洗浄した後に、ウェルをフィルムで覆って、プレー
トを一２０℃で使用時まで保存した。

５０μ＋の腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）　　［：対（ｄｕｐ
ｌ　１ｃａｔｅｓ）として］を試験する各クローンのた
めにピペットで注入した（連続的対数希釈、ｌ：２、ｌ
：４．１：８、ｌ：１６、・・・） 陽性の対照としては、膜タンパク質（希釈、１：１００
．１：１０００．１：１０，０００）で盛んに免疫され
て４回の追加注射を受けたマウスからのポリクローナル
マウス血清を用いた。非免疫マウスからの血清を陰性の
対照血清として用いた。

ＰＢＳ　（燐酸緩衝生理食塩水）を希釈培地として用い
た。プレートを３７°Ｃて１時間インキスペードしてか
ら３回洗浄した後に、５０　／Ｚ　ｌのペルオキシダー
ゼ結合抗マウスＦ（ａｂ）２を希釈率１：５００にて加
えた。

ざらに３７℃で１時間インキスペードしてから３回洗浄
した後、５０μｍの基質、０−フェニレンジ７ｉン（０
，２％ＯＰＤ、０．０１５％Ｈ２ｏ２）を加えた。すべ
てのＥＬＩＳＡ試薬は、ＮＥＮ　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
　Ｎｕｃｌｅａｒ社（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）のＮＥＩ５０
１キットのものを用いた。

ざらに３０分間インキュベートした後、５゜７１１の４
．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させて、Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈ社製のＥＬＪＳＡエバリュエーターＭＲ５８０を用
いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。陽性りａ−ンは、
吸光度０．２またはそれ以上を示した。

選択リストの７個のクローンから、ｍＡｂＧＡ４を分泌
するクローンを次の工程のために選択した。なぜならば
、ｍ　Ａ　ｂ　６　Ａ　４は第１頁で記述したような利
点を有しており、さらに大量に分泌されるからである（
腹水液中のγグロブリン画分の約１％がｍＡｂ６Ａ４で
ある）。

ｍＡｂ６Ａ４は、ＩｇＧ２ａクラスに属しており、ＯＭ
Ｐ　１と反応する。

超音波処理物の調製： 血清型０−１２の細菌をトリブチケース−ソイブロス（
ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ−ｓｏｙａ　ｂｒｏｔｈ）中で培
養した。次いで、細菌を３回洗浄してから塩化ナトリウ
ム緩衝液中に懸濁させた。懸濁液を３回各５分間ずつ超
音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｅ）　Ｌ／た（毎回２分間の
間隔をおく）。

さらに遠心分離（５０００ｒｐｍ／　１０分間で１回）
した後、玉清液を少量ずつに分けて一２０℃で使用時ま
で保存した。被覆したプレート上でのタンパク質濃度は
、４．５Ｂｇ／ウェルてあった。

例２：可変領域をコードするｍ　Ａ　ｌ）　６　Ａ　４
のｃＤＮＡの単離および配列決定。

２ａ）　　ｃＤＮＡの単離 ６Ａ４ハイブリドーマ細胞を遠心分離によって腹水液か
ら分離した（１５０’ＯＸｇで４℃で１０分間）。ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡを、Ｈ，Ｄｏｍｄｅｙら（Ｃｅｌｌ凹、
６１１−６２１．１９８４）の方法によってこれから得
た。ｃＤＮＡを、市販されてるｃＤＮＡ合成キット（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて１５７［のポリ（Ａ）＋
　ＲＮ　Ａから合成した。ＮＥＮ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄＮｕｃｌｅａｒ社から人手可能なりローニングキッ
トを用いて、平滑末端を有する二本鎖のｃＤＮＡに一本
鎖のオリゴ−ｄＣ末端を付与して、対応するオリブーｄ
Ｇ末端を有するプラスミドｐＢＲ３２２とアニール（ａ
ｎｎｅａ　Ｉ　）させた。コンピテントにした大腸菌（
Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２株ＪＭ１０９細胞（Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃ，ら：　ｇｅｎｅ　’；Ｑ
、　１０３−１１９．１９８５）を形質転換（Ｈａｎａ
ｈａｎ、　Ｄ、：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１ｆ
Ａ、５５７−５８眠１９８３）させた結果、約１２，０
００個の形質転換体が得られた。これらを、３２　ｐ末
端ラベルしたオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＧＧＣＡＴ
ＣＣＴＡＧＡＧＴＣＡＣ−３’（［）とハイブリダイズ
させて、サブグループＩＩＢの重鎮のｃＤＮＡを含むク
ローンを検出した。

同様に、ハイブリダイゼーションにプラスミドＣ１（Ｗ
、　０．　Ｗｅｉｓｃｂｅｒｔら：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

■、３Ｇ２７−３６４５．１９８２）のＨｉ　ｎ　ｄ　
ｍ−Ｂ　ａｍＨＩフラグメント（ｎ）を用いた。これは
２８５０塩基対（ｂｐ）の大きさで、デオキシヌクレオ
チド３２　ｐ−トリホスフェートでニックトランスレー
トされた（　ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）もので
ある。（１）はマウスのＩｇＧ２ａ３対立形質の領域（
重鎮）に由来する。（ＩＩ）は、に定常領域（軽鎖）を
コードする。ハイブリダイゼーションは、Ｄ、　Ｗｏｏ
ｄｓ（Ｆｏｃｕｓ６．１−２．１９８４）の記載の方法
によって行った。コロニーの約４．２％および１．６％
がそれぞれに−およびγ−特特異ジブローブ陽性反応を
示した。

２ｂ）　　ｃ　ＤＮＡ配列決定 軽鎖または重鎮の完全なｃＤＮＡを含むと思われる、プ
ラスミドを含むコロニーを、上記で得たコロニーから探
索した。プラスミドｐＵＬ５　（軽鎖のｃＤＮＡを含む
）およびｐＢＨ７（重鎮のｃＤＮＡを含む）の挿入ＤＮ
Ａを、Ｅ、Ｙ、　ＣｈｅｎおよびＰ、　５ｅｅｂｕｒ３
　（ＤＮＡ　ｌｌ、１６５−１７０．１９８５）による
記述のように修飾した標準法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら：
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ＩＡ
、５４６３−５４６７．１９７７）によって配列決定し
た。関連の可変領域のヌクレオチド配列は、表１（軽鎖
）および表２（重鎮）に示される通りである。定常領域
のヌクレオチド配列（表中に含まれていない）は、文献
にて公知の配列とそれぞれ一致している（γ鎮：５ｃｈ
ｒｅｉｅｒら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　Ｚｆｌ。

４４９５−４４９９．１９８１、に鎖：　Ｐ、Ｈ，Ｈａ
ｍｌｙｎら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
９．４４８５−４４９４）。コード領域の全長は、軽鎖
で７１７ｂｐ、重鎮で１４０７ｈρであり、軽鎖の最初
の２０個のアミノ酸はリーダーペプチドを表している。

したがって、成熟（ｍａｔｕｒｅ）軽鎖は２５９個のア
ミノ酸の長さである。重鎮は１９個のアミノ酸のリーダ
ーペプチドを有しており、したがって、成熟分子は４５
０個のアミノ酸の長さである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体可変領域をコードする、表１および表２に示さ
   れるＤＮＡ配列、またはそれらの部分。 ２、可変領域に表１および表２に示されるアミノ酸配列
   またはそれらの部分を含み、対立形質および突然変異体
   が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓ
   ａ）のＯＭＰ I と反応する限りはそれら対立形質およ
   び突然変異体を含む、ことを特徴とする、モノクローナ
   ル抗体。 ３、定常領域またはそれらの部分がネズミ由来であって
   好ましくはＩｇＣ２ａに対応することを特徴とする、請
   求項２に記載のモノクローナル抗体。 ４、定常領域またはそれらの部分がヒト由来であること
   を特徴とする、請求項２に記載のモノクローナル抗体。 ５、請求項２または３に記載のモノクローナル抗体を分
   泌するハイブリドーマ。 ６、請求項４に記載のモノクローナル抗体を発現させる
   発現系（ｓｙｓｔｅｍｓ）。 ７、請求項２、３または４に記載のモノクローナル抗体
   が結合するエピトープ。 ８、緑膿菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）で哺乳動物を免
   疫し、そのような動物から脾臓細胞を採取してからミエ
   ローマ細胞、好ましくはＮＳ−１細胞、と融合させ、得
   られたハイブリドーマを緑膿菌のＯＭＰに対するモノク
   ローナル抗体の分泌に関して選択することからなる、請
   求項５に記載のハイブリドーマの調製法。 ９、可変領域をコードするＤＮＡ配列、またはそれらの
   部分、を定常領域をコードする抗体配列、またはそれら
   の部分、に連結させ、発現系で発現させることからなる
   、請求項２または３に記載のモノクローナル抗体の調製
   法。 １０、請求項１に記載の可変領域をコードするＤＮＡ配
   列、またはそれらの部分、をヒト定常領域をコードする
   抗体配列、またはそれらの部分、に連結させ、発現系で
   発現させることからなる、請求項４に記載のモノクロー
   ナル抗体の調製法。 １１、医薬物としての、請求項２、３または４に記載の
   モノクローナル抗体。 １２、請求項２、３または４に記載のモノクローナル抗
   体の、診断補助物における使用。１３、請求項２、３ま
   たは４に記載のモノクローナル抗体の、医薬物活性物質
   の担体としての使用。