JPH05501399A - 敗血症治療用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （関連技術） 本発明は敗血症の予防または治療に関する方法および組成物に関する。特に本発 明はＣＤ１４単球分化抗原またはＬＰＳ−ＬＢＰ複合体に結合し、そのことによ ってＣＤ１４発現細胞によるＬＰＳ−ＬＢＰ複合体の結合を阻止する分子に関す る。

（背景） 敗血症はトキシンによって誘導される病気で、そのトキシンは一般に感染や外傷 によって誘導または蓄積される。一般に敗血症の初期症状には悪寒、多量の汗、 異常な発熱、衰弱などがあり、引きつづいて恒常的発熱、ショックを起こす低血 圧、好中球減少症、白血球減少症、分散住血管内凝血、成人性呼吸困難および多 重器官疾患などが起こる。

敗血症誘導トキシンは病原性バクテリア、ウィルス、植物および毒液と関連して いることが分っている。バクテリアトキシンの中でよく分がっているものにグラ ム陰性菌のエンドトキシンまたはリボ多糖（ＬＰＳ）がある。これらの分子は全 てのグラム陰性菌の外膜に偏在する糖脂質である。はとんどのＬＰＳ分子の化学 構造は複雑カリ多様であるが、その一般的特徴にはＬＰＳのリピドＡ領域がある 〔リーシエル（Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ）、Ｅ、　Ｔｈ、等、−ンドトキシンハンド ブック″、１：ｌ８７−２２４、Ｒ，Ａ、ブロクターＣＰｒｏｃｔｏｒ＞および Ｅ、　Ｔｈ、ソーシェル（Ｒｒｅｔｓｃｈｅｌ）纒、エルスピア版、アムステル ダム（１９８４））。生体系におけるリビドＡの認識が全てではないにしろ多く の敗血症の病理生理学的変化を開始させる。

現在、宿主（ヒトを含む）のＬＰＳへの一次応答が単球／マイクロファージ系統 の細胞によるＬＰＳの認識と関連し、つづいて一般にサイトカインと呼ばれてい る物質を含む多くの細胞産物の急速な生成が起こるという主張が支持されている 。

敗血症、特にＬＰＳへの応答に関すると考えられている他の細胞には多形核白血 球および内皮細胞がある。

これらの細胞もＬＰＳに応答し強力な炎症物質を生成し得る。

特に成人性呼吸困難ｔ　（ＡＲＤＳ）の場合、ＬＰＳがグラム陰性敗血症におけ るヒトの死亡の第１の原因となると信じられている。ヴアンデベンター（ｖａｎ 　Ｄｅｖｅｎｔｅｒ）等、Ｌａｎｃｅｔ、ｌ　：　６０５　（１９８８）、ジ− グラ−（Ｚｉｅｇｌｅｒ）等、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１３６：１９−２ ８　（１９８７）。たとえば最近、特定のサイトカイン、腫瘍壊死因子アルファ ／カチェクチン（ＴＮＦ）は敗血症ショックの一次仲介物であると報告されてい る。

ビュートラ−（Ｂｅｕｔｌｅｒ）等、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、、３１６　：３ ７９　（１９８７）実験動物やヒトへのバクテリア由来ＬＰＳエンドトキシンの 静脈注射がＴＮＦの急速かつ一時的放出か起こる。ビュートラ−（Ｂｅｕｔｌｅ ｒ）等、Ｊ、　ｆｍｍｕｎｏｌ　、Ｉ　３５：３９７２　（１９８５）、マチソ ン（ｌｉｌａｔｈｉｓｏｎ）等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖｅｓｔ、８１゜１９２ ５　（１９８８）。ＴＮＦが敗血症ショックの重要な仲介者であるという証拠は 基本的に抗ＴＮＦ抗体による動物の前処理が到死を減するという実験から得られ た。ビュートラ−（３ｅｕｔｌｅｒ）等、５ｉｒｅｎｃｅ　１２２９：８６９　 （１９８５）、マチソン（Ｍａｔｈｉｓｏｎ）等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ１［ｎｒｅｓｔ 、　８１　：１９２５　（１９８８）、これらの報告はＬＰＳまたは他の因子に よって引き起こされるＴＮＦの分泌が敗血症の致死的症状を軽減することを示し ている。

血液にＬＰＳを導入すると、それがリポ多糖結合たんばく質（ＬＢＰ）と呼ばれ るたんばく質と結合する。ＬＢＰは健康なヒトや動物の血清中に１００ｎｇ／＋ ｎＪ程の濃度で存在する６０ＫＤの糖たんばく質である。

急性状態の場合、ＬＢＰは肝細胞で合成さね、血清中の濃度は３０〜５０μｇ／ ｒＩＬｌに達する。ＬＢＰは急性状態のヒトやウサギの血清から精製できる。ト ビアス（Ｔｏｂｉａｓ）等、Ｊ、Ｅｐｐ、Ｍｅｄ、１６４ニア７７−７９３　（ １９８６）、ＬＢＰはＬＰＳのリビドＡ領域を認識し、ラフおよびスムーズ両型 のＬＰＳと高アフィニティーなｌ：１の化学量論的複合体を形成する。トビアス （Ｔａｂｉｎｓ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ。

２６４：１０８６７−１０８７１　（１９８９）。ＬＢＰは殺菌性透過促進因子 （ＢＰＩ）として知られているＬＰＳ結合たんばく質とホモロジーを持っＮ末端 配列を有している。トビアス（Ｔｏｂｉａｓ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　 ２６３　：　１３４７９−１３４８１　（１９８８）。ＢＰＩはＰＭＮの特定の 顆粒中に保存されており（ウニイス（Ｗｅｉｓｓ）等、Ｂｌｏｏｄ、６９　：　 ６５２−６５９　（１９８７））、ＬＰＳに結合しその透過性バリヤーを破壊す ることによりグラム陰性菌を殺す。

ウニイス（ｌｌｌｅｉｓｓ）等、Ｊ、　Ｉａｎｕｎｏｌ、１３２：３１０９−３ １１５　（１９８４）。

ＢＰＩとは対照的に、ＬＢＰはグラム陰性菌に対して直接的細胞毒性を示さず［ トビアス（Ｔｏｂｉａｓ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２６３：１３４７９− １３４８１（１９８８）］その詳細な機能は不明である。

その他の背景として、単球／マクロファージ系統の細胞は微生物の食作用、抗原 物質の取り込みおよびヘルパーＴ細胞を刺激する形態の提示などを含む多様な免 疫機能を行う。おそらくこれらも腫瘍に対する免疫探索に関係しており、ある種 の補体成分やサイトカインを分泌している。表面膜抗原はこれらの活性を調節す る上で重要な働きをしている。い（つかの単球／マクロファージ表面抗原か同定 され、それらの分子量が決定された。これらの抗原の１つであるＣＤ１４は単球 、マクロファージおよび活性化顆粒球が発現する５５ＫＤの糖たんばく質である 。これはＭＯ２、ＭＹ４．３Ｃ１０およびＬＥＵＭ３を含む多くのモノクローナ ル抗体（ｍＡｂ）で認識される。ＣＤ１４の生物学的機能は分かっていないが、 成熟細胞におけるその制限的発現は重要なエフェクター機能を暗示している。単 球細胞表面分化抗原ＣＤ１４をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が決定され 、それからＣＤ１４のアミノ酸残基配列が誘導された。（フエレロ（Ｆｅｒｒｅ ｒｏ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、１６ 　：　４１７３　（１９８８）（発明の概要） 本発明はサイトカインの生産および放出の基本的レギュレーターは、特に単球／ マクロファージ系統の細胞の場合、ＣＤ１４レセプターであるという発現から産 まれた。サイトカインの分泌が敗血症の症状の発現に重要な役割を果たしている ことから本発明はサイトカイン、特にＴＮＦの分泌を阻止する方法および試薬に 関する。

それゆえ、ある態様において本発明は敗血症の危機にある患者に治療効果量の抗 ＣＤ１４抗体、抗ＬＢＰ抗体、ＬＢＰペプチドアナログもしくはこれらの組合せ 物を好ましくは静脈注射で投与することに関する。この方法は単独、もしくは抗 生物質、ステロイド、抗ＴＮＦ抗体、ＴＮＦアンダゴニストなど１つ以上の試薬 で治療することを含む敗血症の症状を阻止または軽減することが知られている他 の治療法と組合せて使用できる。

さらに本発明は敗血症の症状を肚または軽減するのに有用な典型的には単位投与 量形の治療組成物に関する。この組成物には活性成分として抗ＣＤ１４抗体、抗 ＬＢＰ抗体およびＬＢＰアンダゴニストとして働＜ＬＢＰペプチドアナログを１ つ以上含む医薬的に許容し得るキャリヤーが含まれる。好ましい態様において本 発明の治療組成物にはさらに活性成分として抗生物質、ステロイド、抗ＴＮＦ抗 体、ＴＮＦアンダゴニスト、可溶性ＣＤ１４など敗血症の症状を阻止または軽減 することが知られている試薬を単独または組合せ物の形で含まれる。

（図面の簡単な説明） 図面は本発明の公開の一部を構成する。

第１図はＬＢＰがＥＬＰＳとＭＯとの相互作用を促進することを示している。

単一層のＭＯを種々の量のり、ＢＰ存在下ＥまたはＥＬＰＳ”とインキュベート しその吸着指数を測定した。コントロールとしての急性状態たんばく質、マンノ ース結合たんばく質（ＭＢＰ）（５μｇ／ｍｆ）はＥＬＰＳ”の結合を促進しな かった（吸着指数４．９）。

これらの結果は４回の別個の実験における代表的なものである。

第２図はＥＬＰＳのＭＯへのＬＢＰ依存的結合がＥ膜中のＬＰＳの密度に依存す ることを示している。ＥＬＰＳを種々の量のＬＰＳで調製し、５μｇ／ｄＬＢＰ の存在下、または非存在下単一層のＭＯとインキュベートした。それらの結果は ４回の別個の実験における代表的なものである。

第３図はＭＯがＬＰＳ非存在下ではＬＢＰを認識しないことを示している。ビオ チンおよびストレプトアビジンでコートしたＥ（ＥＢＡＶ）をビオチン化ＬＢＰ とインキュベーションしてＥＬＢＰを生成させた。

ＥＬＢＰおよびＥＢＡＶの両方を３７°Ｃで２０分同種々の量のＬＰＳとインキ ュベートし、洗浄後単層のＭＯへの結合を測定した。

第４図はＬＢＰがＦｃ仲介食作用を促進することを示している。

単層のＭＯ（５日間培養）を種々の量の抗Ｅ−１ｇＧの存在下、４５分間Ｅ、Ｅ ＬＢＰまたはＥＣ３ｂｉとインキュベートした。Ｅの食作用は材料の方法のセク ションで説明する方法で測定した。ＥＬＢＰはＭＯとのインキュベーションの際 にＥＬＰＳ”に１μｇ／−のＬＢＰを添加することにより得られた（０．３μｇ ＬＰＳ／３ｘ１０’　Ｅ）。抗ＥＩｇＧの非存在下におけるＥの吸着は以下のと おりであった：Ｅ、吸着指数（ＡＩ）−０；ＥＣ３ｂｉ、Ａｌ−４１７；ＥＬＢ Ｐ。

Ａｌ−４０４゜これらの結果は４回の別個の実験における代表的なものである。

８５図はりガントコート表面にＭＯを拡げる際の過酸化水素の分泌を示している 。３Ｘ１０’個のＭＯ（３日間培養）をコートしたマイクロプレートのウェルに 添加し、経時的に過酸化水素の発生を測定した。過酸化物の活発な生成は免疫複 合体（Ｈ８Ａ−抗Ｈ３Ａ、黒丸）上へのブレーティングまたは可溶性アゴニスト ＰＭＡに応答して（黒ダイヤモンド）起こった。ＬＰＳコート化表面表面相互作 用の際には低いが再現性のある過酸化物の放出が観察された（白三角）。しかし 、ＬＢＰコート化表面表面ブレーティングの場合放出は起こらず（白画角）、ま たＬＰＳコート化表面表面ＬＢＰのコーティングはＬＰＳにより誘導される過酸 化物の生成が阻害された（白ダイヤモンド）。ＬＢＰコート化ウェつ中のＭＯは ＰＭＡに応答した正常な過酸化物の発生を示すことからＬＢＰが過酸化物の生成 や測定を妨害することはなかった。

第６図はモノクローナル抗ＣＤ１４抗体によるＬＰＳ−ＬＢＰ複合体結合の阻害 を示している。単層のヒトＭＯを０℃で１５分間指示濃度のモノクローナル抗体 とインキュベートした。ＬＰＳとＬＢＰで順次コートした赤血球を添加し、その 吸着を測定した。これらの結果は３回の別個の投与応答実験および固定濃度の抗 体を用いて行った１０回の実験における代表的なものである。マクロファージ上 の別の決定基に対する多くの高濃度のｍＡｂはＥＬＢＰの結合になんの影響も示 さなかった。

第７図は表面に結合した抗ＣＤ１４ｍＡｂがＬＢＰ−ＬＰＳ複合体の結合を低減 することを示している。単層のヒトマイクファージを指示モノクローナル抗体２ ５μｇ　／ｍｒｃコートした基質に定着させた。この細胞を洗浄後ＥＬＰＳ１０ を添加し、その吸着を測定した。

第８図はＬＰＳがＴＮＦ生産を誘導するのにＬＢＰが必要とされることを示して いる。ウサギの腹腔滲出マクロファージ（ＰＥＭ）に指示濃度のＬＢＰ（ＬＢＰ ）加熱（変性）ＬＢＰ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはウシ胎児血清（Ｆ ｅ２）の存在下ＬＰＳを作用された。

そのＰＥＭによって生産されるＴＮＦ量を測定した。

第９図はＬＢＰのトリプシン消化に対する感受性をそれが結合するリガンド、す なわちＲｅ５９５ＬＰＳの存在下または非存在下の条件で示している。分子量マ ーカー（ファルマシア、ピスカタウエイ、Ｎ＋Ｊ、；カタロ’ｆｔｋ　ｌ　７− ０４４６−０１．９４キロダルトン（ＫＤ）のホスホリラーゼＢ、６７ＫＤのウ シ血清アルブミン、４３ＫＤのカバルプミン、３０ＫＤのカルボニツクアンノ１ イドラーゼ、２０、ＩＫＤの大豆トリプシンインヒビターおよび１４．４ＫＤの アルファラクトアルブミン）をＬＢＰを含むレーンの隣りに示した。これらの結 果はＬＰＳへのＬＢＰの結合はＬＢＰの構造変化を生じ、このことはＬＰＳ−Ｌ ＢＰ複合体の一部として存在するときのみＣＤ１４を結合する能力を説明するこ とを示している。

（発明の詳細な説明） Ａ、定義 アミノ酸残基：ここで述べられているアミノ酸残基はＬ型のものが好ましい。

しかし、そのポリペプチドが免疫グロブリン結合の望ましい機能を維持するかぎ りＤ型残基でＬ型アミノ酸残基で置換し得る。ＮＨｌはポリペプチドのアミノ末 端に存在するフリーのアミノ基を意味する。Ｃ０ＯＨはポリペプチドのカルボキ シ末端に存在するフリーのカルボキシ基を示す。標準的ポリペプチド命名法；Ｊ 。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４３　：　３５５２−５９　（１９６９）に従かい アミノ酸残基の略号を以下の対応表に示す。

対応表 記号　アミノ酸 （１文字）　（３文字） ）’　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｍ　Ｍｅｔ　メチオニン Ａ　Ａｌａ　アラニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン ＨＨｉｓ　ヒスチジン Ｑ　Ｇｉｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｗ　Ｔｒｙ　トリプトファン ＲＡｒｇ　アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　アスノくラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン ＣＣｙｓ　システィン 全てのアミノ酸配列は左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方法で示され ている。さらにアミノ酸残基配列の始めまたは終りにあるダラシはさらに１つ以 上のアミノ酸残基配列につづくペプチド結合を示している。

種々の文法型の“抗体”という言葉は免疫グロブリン分子および、または免疫グ ロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープ を含む分子を含む組成物を意味する。

好ましい態様において使用される抗体はアフィニティー精製したものである。

“抗体結合部位”とは抗原を特異的に結合する重鎮および軽鎖の可変および超可 変部からなる抗体分子の構造部分である。

種々の文法型の“抗体分子”という語句は本来の免疫グロブリン分子および免疫 グロブリン分子の免疫学的活性領域の両方を示している。

代表的抗体分子には本来の免疫グロブリン分子、実質的免疫グロブリン分子およ び当分野でＦａｂ、Ｆａｔ＋”、Ｆ（ａｂ”）＊およびＦ（ｖ　）として知られ ている領域を含むパラトープを有する免疫グロブリンの一部分がある。これらの 免疫グロブリンの一部分は本治療法に有用である。

抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ−）２部分は当分野でよく知られている方法に より実質的免疫グロブリンを各々パパインおよびペプシンでたんばく質分解する ことにより得られる。たとえば米国特許Ｎα４，３４２，５６６、セオフイロホ ラス（Ｔｈｅ。

ｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ）等（本明細書では参考として引用している）参ｆｆｌ。

Ｆａｂ−抗体分子部分はよく知られており、２つの重鎮部を結合するジスルフィ ド結合をメルカプトエタノールで還元し、生成したたんばく質メルカプタンをヨ ードアセトアミドなどの試薬でアルキル化することによりＦ（ａｂ″）２部分か ら生成する。本来の抗体分子を含む抗体が好ましく、例にはこれが使用される。

種々の文法型の“モノクローナル抗体２という語句は特定の抗原と免疫反応し得 る唯一種の抗体結合部位を有する抗体を示す。一般にモノクローナル抗体は免疫 反応する抗原に対して単一の結合アフィニティーを示す。それゆえモノクローナ ル抗体には各々異なる抗原に対して免疫特異的な抗体結合部位を多数含む抗体、 たとえば二特異的（キメラ）モノクローナル抗体が含まれる。

“実質的に同時”という語句は同時発生的結果、たとえば抗生物質投与と抗ＣＤ １４抗体、抗ＬＢＰ抗体、ＬＢＰペプチドアナログ、またはこれらの組合せ物の 投与の結果として起こる敗血症の症状の軽減または予防などを生じるのに十分な 時間以内を意味する。

“医薬的に許容し得る”という語句は生理的に許容し得る、かつヒトに投与した 場合胃の不調、めまいなどアレルギーまたは不都合な反応を起こさない分子また は組成物に対して使用される。

Ｂ、治療法 本発明は敗血症の１つ以上の症状、特に発熱、低血圧、好中球減少症、白血球減 少症、赤血球減少症、ショックおよび多重器疾患などＴＮＦの血中レベルの一時 間増加に関連する症状の治療および、または予防に関する。このような治療を必 要とする患者にはグラム陰性菌感染、ヘビ毒中毒、肝臓疾患などから生じるエン ドトクセミアなどトクセミアの危機にある患者が含まれる。さらに、ダラム陽性 菌、ウィルスまたは菌類感染した患者も敗血症の症状を示し、本発明の治療の対 象となる。特に本発明から恩恵を蒙る患者には大腸菌、ヘモフィラスインフルエ ンザＢ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ　１ｎｆｌｎｅｎｚａ　Ｂ）、ナイセリアメ ニンジチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｇｉｔｉｄｅｓ）、スタフィロコッ カス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）またはニューモコツカス（ｐｎｅｕｍｏｃ ｏｃｃｉ）に感染した患者がある。敗血症の危機にある患者には、火傷、銃によ る負傷、化学物質による中毒や乱用による腎臓または肝臓障害をもつ患者も含ま れる。

したがっである態様では本発明は治療を必要とする患者に治療効果量の抗ＣＤ１ ４抗体を投与することにより敗血症の１つ以上の症状を軽減する方法に関する。

“治療効果量”という語句はＴＮＦの血漿レベルの臨床的に有意な上昇を防ぎ、 好ましくは少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも約５０パー セント、最も好ましくは少なくとも約９０パーセント減少させるのに十分な量を 意味している。活性成分として用いる試薬の好ましい治療効果量にはセクション Ｃで述べるものか含まれる。

ＴＮＦの血漿レベルの臨床的に有意な上昇は少くとも約２５　ｐｇ／−＊での上 昇である。血漿ＴＮＦレベルの測定法は当分野でよく知られており、ここでは特 に好ましい方法について説明する。

健康人または正常な実験動物のＴＮＦレベルはせいぜい約１０ｐｇ／ｍｌと見積 られ、この値はＴＮＦの最も感度の高い検定法の検出限界である。ミシー（Ｍｉ ｃｈｉｅ）等、ＮｅｗＥｎｇＪ、Ｍｅｄ、３１８：１４８１−１４８６　（１９ ８８）；ｖチソン（Ｍａｔｈｉｓｏｎ）等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　［ｎｖｅｓｔ、８ １　：１９２５　（＋　９８８）およびワーノＧ！ｌａａｇｅ）等、Ｌａｎｃｅ ｔｌ　１　：３５５−３５７　（１９８７）、ＬＰＳで処理した後のＴＮＦレベ ルは２０倍上昇して４００　ｐｇ／ｍｌまで到達することが示された。最近、グ ラム陰性ＬＰＳ含存メニンゴコッ力スバクテリアに感染した場合の致死転帰と血 清ＴＮＦレベルの良い相関関係が示された。ワーノ（％ｔｌａａｇｅ）等、Ｌａ ｎｃｅｔ、１：３５５−３５７（１９８７）。さらに霊長類の敗血症モデルでＴ ＮＦの同様の増加か示され、これらの変化は致死と直接相関していた。

トレーシー（Ｔｒａｃｅｙ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３３０　：　６６２−６６４　 （１９８７）。

別の態様においてこの方法には敗血症の危機にあり治療を必要とする患者に治療 効果量の抗ＣＤ１４抗体を、好ましくは単球／マイクロファージ系統、好ましく は単球由来のマイクロファージ細胞などの細胞によるインビボにおけるＬＰＳ誘 導型のＴＮＦ分泌を阻止するのに十分な量の抗ＣＤ１４抗体を投与することが含 まれる。

本発明の治療法で使用する抗ＣＤ１４抗体はアフィニティー精製したポリクロー ナル抗体であることが好ましい。さらにこの抗体はモノクローナル抗体であるこ とが好ましい。さらにここで用いる抗体ＣＤ１４抗体分子は抗体分子のＦａｂ。

Ｆａｂ−１Ｆ（ａｂ″）３、またはＰ（ｖ）部分であることが好ましい。

本発明を実施するのに有用なモノクローナル抗体はアシュマン（Ａｓｈｍａｎ） 等（Ｂｌ。

ｏｄ、６９：８８６−８９２　（１９８７））によって報告された６０ｂおよび バンブーリス（Ｖａｎ　Ｖｏｏｒｈｉｓ）等（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１５ ８：’１２６−１４５　（１９８３））によって報告されている３Ｃ１０（アメ リカンタイプカルチャーコレクション登録番号ＴｌＢ２２Ｂ、ロックビル、ＭＤ ）などのハイブリドーマによって生産されるものが好ましい。ｍＡｂ　６０　ｂ および３Ｃ１０はハイブリドーマ培養で生成できるが、本発明はこれに限定され るものではない。また本発明は６０ｂおよび、または＃Ｃ１０などのハイブリド ーマからクローン化される抗ＣＤ１４免疫グロブリン発現核酸によって生成する ｍＡｂの使用に関する。すなわち、／％イブリドーマ３Ｃ１０などによって分泌 される抗ＣＤ１４抗体分子を発現する核酸は他の細胞系列に移してトランスホー マントを生成し得る。このトランスホーマントは遺伝子型的に本来のハイブリド ーマとは異なるが、そのハイブリドーマによって分泌されるものに対応する抗体 分子の免疫学的に活性なフラグメントを含む抗ＣＤ１４抗体分子を生産し得る。

たとえばリーディング（Ｒａｄｉｎｇ）の米国特許Ｎα４．６４２．３３４：ロ ビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）等のＰＣＴ刊行物ＮａＷＯ８９００９９：ウィン ター（Ｗｉｎｔｅｒ）等のヨーロッパ特許１ｋｏ　２３９４００．キャビンー（ Ｃａｂｉｌｌｙ）等、ヨーロッパ特許Ｎａ０１２５０２３参糺モノクローナル抗 体は上述のハイブリドーマによって生成されるものと同じＣＤ１４に対する免疫 反応性を示すことが望ましい。ここで用いているように、種々の文法型の“免疫 反応性”という言葉は所定量の抗体および所定量のＣＤ１４抗原間の免疫反応を ５０％阻害するのに必要な抗原濃度を示している。

すなわち、免疫反応性とは、Ｂ／Ｂｏ値０．５を達成するのに必要な抗原濃度で ある（ここでＢｏは競合する抗原非存在下で結合する抗体の最高量であり、Ｂは 競合抗原存在下の結合する抗体量である。ＢＯおよびＢはバックグランドに関し 補正したものである。）。ロバード（Ｒｏｂａｒｄ）　、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ 、　２０　：　１２５５−１２７０（１９７４）参照。

別の態様において、本発明の治療法には治療効果量の抗ＬＢＰ抗体、好ましくは アフィニティー精製したポリクローナル抗体、より好ましくはｍＡｂを投与する ことが含まれる。さらに、ここで用いられる抗ＬＢＰ抗体分子は抗体分子全体の うちのＦａｂ、　Ｆａｂ　−１Ｆ（ａｂ　−）ｚまたはＦ（ｖ　）部分の形であ ることが望ましい。

投与する抗ＬＢＰ抗体量は少なくとも敗血症の症状の１つを示す患者のＴＮＦの 血中レベルのＬＢＰ−ＬＰＳ複合体によって誘導される臨床的に有意な増加を少 なくとも約３０パーセント、好ましくは少なくとも８０パーセント減少させるの に十分な量であることが好ましい。先に議論したように本方法の恩恵を蒙る患者 にはグラム陰性菌感染の結果内毒素中毒症を被った患者である。ＬＢＰを単離し 、抗ＬＢＰ抗体を誘導する方法は当分野でよく知られている。たとえばトビアス （Ｔｏｂｉａｓ）等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６４　：　７７７−７９３　（ １９８６）参照。ＣＤ１４に、対するＬＢＰ−ＬＰＳ複合体の結合を阻害し、そ れによりＬＢＰ誘導壓のＴＮＦ分泌を阻害する抗ＬＢＰ抗体の能力を測定し、か つ至適化する方法は当分野でよく知られている。たとえば、実施例１６で示した 検定法において抗ＣＤ１４の代りに抗ＬＢＰ抗体を用いることができる。

本発明を実施するのに有用な抗ＬＢＰ抗体はＬＢＰのペプチドアナログと免疫学 的に交叉反応する。“ＬＢＰペプチドアナログとは単球由来のマクロファージの 表面に発現するＣＤ１４へのＬＰＳ−ＬＢＰ複合体の結合を競争的に阻害し得る ポリペプチドである。好ましいＬＢＰペプチドアナログを第１表に示す。

第１表 名　称　アミノ酸配列 Ｃ１６Ｙ　ＣＮＲＬＮＲＡＰＱＰＤＥＬＹＹｌ　６ＣＹＴＴＰＥＰＳＥＬＤＤＥ ＤＦＲＣＫｌ　６ＣＫＲＶＤＡＤＡＤＰＲＱＹＡＤＴＣポリクローナル抗ポリペ プチド抗体の生成法は当分野でよく知られている。ネスター（Ｎｅｓｔｏｒ）等 、米国特許Ｎｅｔ４．４９３．７９５参照。一般に有用な抗体分子のＦａｂおよ び、またはＦ（ａｂ’　）ｚ部分を含むモノクローナル抗体はここで参考として 引用している“抗体、ラボラトリ−マニュアル”バーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およ びレーン（Ｌａｎｅ）編、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、ニューヨ ーク（１９８８）に述べられているハイブリドーマ技術で調製し得る。簡単に云 うと、そのモノクローナル抗体組成物を生成するハイブリドーマを形成するため ミエローマまたは他の自己複製細胞系列をＣＤ１４またはそのＬＢＰ結合部分、 またはＬＢＰまたはそのＣＤ１４結合部分で高度免疫化した哺乳類の膵臓から得 られるリンパ球と融合する。

このミエローマ細胞系列はリンパ球と同じ種由来のものが好ましい。一般的に、 マウス１２９ＧＩＸ＋株が好ましい。本発明に使用するのに適したマウスミエロ ーマには各々名称ＣＲＬ　１５８０およびＣＲＬ１５８１でアメリカンタイプカ ルチャーコレクション、ロックビル、ＭＤから入手し得るヒボキサンチン−アミ ノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細胞系列Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３お よびＳｐ　２１０−Ａｇ　１４がある。

一般に牌細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を用いてミエローマ 細胞と融合する。融合したハイブリドーマはＨＡＴに対する感受性で選択する。

本発明を実施する上で有用なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは実 施例１６に示した方法でＣＤ１４またはＬＢＰと免疫反応する能力およびＬＰＳ 誘導型ＴＮＦ分泌を阻害する能力を見積ることで同定する。

本発明で使用するのに有用なモノクローナル抗体は適当な抗原特異性を有する抗 体分子を分泌するハイブリドーマを含む栄養培地からなるモノクローナル／）イ ブリドーマ培養を行なうことで生成し得る。この培養をそのハイブリドーマが培 地中に抗体分子を分泌する条件および十分な時間維持する。この抗体含有培地を 回収し、その中にある抗体分子を従来法を用いて単離する。

これらの組成物を調製するのに有用な培地は当分野でよく知られているもので市 販もされており、これらには合成培養培地、近文系マウスなどが含まれる。代表 的合成培地には４．５ｇ、／ｊ’グルコース、２０ｍＭグルタミンおよび２０％ ウシ胎児血清を補ったダルベコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ、ダルベコ（Ｄｕｌｂｅ ｃｃｏ）等、Ｖｉｒｏｌ、８　：　３９６　（１９５９））がある。代表的近文 系マウスにはＢａＩ！ｂ／ｃがある。

また、モノクローナル抗ポリペプチド抗体の生成法は当分野でよく知られている 。ナイマン（Ｎｉｍａｎ）等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ、　８０：４９４９−４９５３　（１９８３）参照。一般に、先に述べた 抗ＣＤ１４モノクローナル抗体生成操作における免疫原として１つ以上のＬＢＰ ペプチドアナログを単独、もしくは免疫原キャリヤーに結合して使用する。ハイ ブリドーマをＬＢＰペプチドアナログおよびＬＢＰと免疫反応する抗体産生能で スラリーニングする。適当な免疫交叉反応を示すｍＡｂによるＣＤ１４へのＬＰ Ｓ−ＬＢＰ複合体の結合を阻害能は実施例１６の検定で確める。

別の態様で本発明の治療法には治療効果量のＬＢＰペプチドアナログ、好ましく は第１表で示した配列を有するアナログを投与することが含まれる。

敗血症の症状を示す患者はこれらの症状を予防または軽減する当分野でよく知ら れた治療様式の投与でその恩恵を蒙ることができる。したがって本発明は敗血症 の症状を予防または治療することが知られている様式の治療投与と実質的に同時 に治療効果量の抗ＣＤ１４抗体、抗ＬＢＰ抗体、ＬＢＰペプチドアナログ、これ らの組合せ物を投与することに関する。たとえば、抗ＴＮＦ抗体および、または ＴＮＦアンタゴニストを使用するなど直接的または間接的に敗血症におけるＴＮ Ｆの役割を阻害することが敗血症の症状を阻止または軽減し得る。特に、トレー シー（Ｔｒａｃｅｙ）等（Ｎａｔｎｒｅ、３３０：６６２−６６４（１９８７） ）によって報告されているものに対応するＴＮＦに対する免疫特異性を有するモ ノクローナル抗体など活性成分として抗ＴＮＦ抗体を使用することが好ましい。

同様に、本発明の治療法は、さらにコルチソール、ハイドロコルチソンなどのス テロイドによる実質的に同時の治療を含み得る。

通常、敗血症の症状を示す患者は抗生物質、一般にはゲンタマイシンなどのアミ ノグリコシドまたはペニシリンやセファロスポリンなどのベーターラクタムで治 療する。したがって殺菌量の抗生物質を投与するのと実質的に同時にここで述べ ている治療効果量の抗ＣＤ１４抗体、抗ＬＢＰ抗体、ＬＢＰペプチドアナログ、 これらの組合せ物を投与する事が好ましい治療法である。“殺菌量”という語句 は治療を受けた患者においてバクテリアを死滅させる血中濃度に達するのに十分 な量を意味する。

一般に、ヒトへの投与に関して安全と認識される抗生物質の殺菌量は当分野でよ く知られており、これもよく知られているように抗生物質の種類や治療するバク テリア感染のタイプによって異なる。

好ましい態様において本明細書で述べている抗ＣＤ１４抗体、抗ＬＢＰ抗体、Ｌ ＢＰペプチドアナログ、またはこれらの組合せ物の投与は抗生物質の投与から約 ４８時間以内、好ましくは約１２〜３６時間以内、最も好ましくは実質的に同時 に行なう。

本発明を実施するのに有用な抗生物質には医師デスクレファレンス、／％フ（Ｈ ｕｆｆ）、Ｂ、　Ｂ、編、メディカルエコノミーカンパニー、オラデル、ＮＪ、 　（１９８９）に述べられている処方の抗生物質、抗菌物質および消毒剤がある 。他の態様において本発明は治療効果量のＣＤ１４、好ましくはＬＰＳ−ＬＢＰ 複合体を結合するその可溶性部分を単独もしくは治療効果量の抗ＴＮＦ抗体、抗 ＬＢＰ抗体および抗生物質と半組合せ又は組合せて投与することに関する。ＣＤ １４をコードするｃＤＮＡおよびこれから誘導されるアミノ酸残基配列は当分野 でよく知られている。ゴヤート（Ｇｏｙｅｒｔ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９ ：４９７−５００（１９８８）、フエレロ（Ｆｅｒｒｅｒｏ）等、Ｎｕｃ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：４１７３（１９８８）およびバジル（Ｂａｚｉｌ） 等、Ｅｕｒ、　Ｊ、　ｒｒｍｕｎｏｌ、。

１６　：　１５８３＃１５８９（１９８６）参照。

Ｃ６治療組成物 さらに本発明は本発明の治療法を実施するのに有用な治療組成物に関する。本治 療組成物には混合物として医薬的に許容可能な賦形剤（キャリヤー）および活性 成分として本明細書で述べている抗ＣＤ１４抗体、抗ＬＢＰ抗体およびＬＢＰポ リペプチドアナログのうちの１つ以上が含まれる。好ましい態様においてこの組 成物にはＬＰＳ−ＬＢＳ複合体のＣＤ１４への結合を阻害し得る抗ＣＤ１４ｍＡ ｂが含まれる。好ましいｍＡｂは６０ｂであり、より好ましいものには３ＣＩＯ がある。

他の好ましい態様における組成物には、ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体のＣＤ１４への結 合を阻害する抗ＬＢＰ抗体、好ましくはｍＡｂが含まれる。第１表に示した配列 を有するＬＢＰペプチドアナログと免疫反応する抗ＬＢＰ抗体を含む組成物が特 に好ましい。

また好ましい態様の１つにはＣＤ１４への結合に関してＬＰＳ−ＬＢＰ複合体へ のアンタゴニストとして働＜ＬＢＰペプチドアナログが含まれる。本発明の組成 物に使用する上で好ましいＬＢＰペプチドアナログは第１表に示した配列を有す るものである。

さらに、好ましい治療組成物には以下の活性成分：抗生物質、ステロイドおよび 抗ＴＮＦ抗体およびＴＮＦアンタゴニストのうちの１つ以上が含まれる。代表的 処方を以下に示す。

ゲンタマイシン（硫酸塩）４０ 抗ＣＤＩ４　（ｍＡｂ３ｃ１０）　１０亜硫酸水素ナトリウム　ＵＳＰ　３．２ ＥＤＴＡナトリウム塩　ＵＳＰ　０．１注射用水　ｑ、ｓ、ａ、ｄ、　１．０ｍ ｌ’（処方Ｂ） 成　分　投与量（■／−） 抗ＴＮＦ抗体　１０ 抗ＣＤ１４　（ｍＡｂ３ｃ１０）　１０亜硫酸水素ナトリウム　ＵＳＰ　３．２ ＥＤＴＡナトリウム塩　ＵＳＰ　０．１注射用水　ｑ、ｓ、ａ、ｄ、　１．０ｒ Ｒｆ！（処方Ｃ） 成　分　投与量（■／ｍｌ） ゲンタマイシン（硫酸塩）４０ 抗ＴＮＦ抗体　１０ 抗ＣＤ１４　（ｍＡｂ３ｃ１０）　ｔ。

亜硫酸水素ナトリウム　ＵＳＰ　３．２ＥＤＴＡナトリウム塩　ＵＳＰ　０．１ 注射用水　ｑ、ｓ、ａ、ｄ、　１．Ｏｒｄ別の態様において本発明は医薬的に許 容し得るキャリヤー中、ＣＤ１４またはそのＬＢＰ結合可溶性部分を含む敗血症 治療に有用な治療組成物に関する。さらにこの組成物には治療効果濃度の抗ＴＮ Ｆ抗体、抗ＬＢＰ抗体および抗生物質のうちの１つ以上を含まれることが望まし い。

活性成分としてポリペプチドまたは抗体分子を含む治療組成物の調製は当分野で よく知られている。一般にはそのような組成物は溶液やサスペンションなど注射 可能な形で調製されるが、溶液イＬサスペンション化、液体化に適した固体も調 製し得る。またエマルシヨンも調製される。活性治療成分を医薬的に許容可能で 、カリ活性成分に適合する賦形剤と混合することがよくある。たとえば適当な賦 形剤には水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、やその組合 せ物がある。さらに望ましい場合は活性成分の効果を高める保湿またはエマルジ ョン剤、ｐＨ緩衝剤など少量の補助剤が含められる。

ポリペプチドまたは抗体は中和した医薬的に許容可能な塩として治療組成物に処 方される。医薬的に許容可能な塩には酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の 遊離したアミノ基と形成される。）が含まわ、これはたとえば塩酸やリン酸など の無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される 。また遊離のカルボキシ基で形成される塩は、たとえばナトリウム、カリウム、 アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基およびイソプロピル アミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ力 インなどの有機塩基で誘導することができる。

治療用のポリペプチドまたは抗体含有組成物は従来たとえば注射により静脈に単 位投与量が投与される。本発明の治療組成物に関して使用する“単位投与量”と いう言葉はヒトに一回投与するのに適した物理的に独立した単位で、その各々が 必要とされる希釈剤、すなわちキャリヤーまたはベヒクルと共に所望される治療 を受ける検体、活性成分を利用する検体の免疫系の能力および所望されるＣＤ１ ４またはＬ　Ｐ　Ｓ　−Ｌ　Ｂ　Ｐ複合体結合能の阻害または中和の程度に依存 する。投与に必要とされる活性成分の詳細な量は担当医の判断に依存し各々の患 者によって異なる。しかし適当な投与量範囲は１日当り体重１キログラム当り活 性成分０．１〜２０、好ましくは約０．５〜約１０．より好ましくは１〜数ミリ グラムのオーダーでありそれらは投与の経路にも依存する。初期投与や二次投与 に関する適当な投与様式も様々であるが初期投与につづいて次の注射または他の 投与法で１時間以上の間隔をあけて反復して投与するのが一般的である。それと は別に、血中に１０ナノモル〜１０マイクロモル濃度が維持されるような連続的 静脈内注入も使用される。

本明細書で使用している“ｐｇ”はピコグラム、“ｎｇ”はナノグラム、“μｇ ＃はマイクログラム、１■”はミリグラム、“μＩ！”はマイクロリットル、“ −”はミリリットル、“ｉ！”はリットルを意味する。

（実施例） 以下に示す実施例は本発明を説明するものであり、これを制限するものではない 。

実施例１−１１は単球／マクロファージ系統のヒト細胞が膜面上を動く細胞表面 レセプターを介してＬＰＳ−ＬＢＰ複合体を結合することを明確にした実験を示 している。

実施例１２は抗ＣＤ１４抗体がＬＰＳ−ＬＢＰ複合体のＣＤ１４への結合を特異 的に阻害することを示している。

実施例１３〜１５はＣＤ１４がＬＰＳ−ＬＢＰ複合体と特異的に結合し、かつそ の結合がＭＯ由来のＴＮＦ分泌を誘導することを示している。

実施例１６は抗ＣＤＩ　４ｍＡｂがヒト血液におけるＬＰＳ−ＬＢＰ複合体が誘 導するＴＮＦの分泌を阻害することを示している。

実施例１７は実施例１〜１６の結果のまとめおよび議論を提供している。

■、試薬 ＬＢＰは急性状態のウサギ血清から精製した（トビアス（Ｔｏｂｉａｓ）等、Ｊ 、　ＥＸｐ。

Ｍｅｄ、　、　１６４：ｍ−７９３（１９８６））　、これは銀染色ゲル上では 均一であると考えられる。

抗ウサギＬＢＰはヤギで調製した。ＭＢＰはＲ，Ａ、　Ｂ、エゼコビツツ（Ｅｚ ｅｋｏｗｉｔｚ　）博士（ボストン、ＭＡ）から提供さた。殺菌／透過促進因子 （ＢＰＩ）はＪ、ガベイ（Ｇａｂａｙ　）博士にューヨーク、ＮＹ）から提供さ れた。サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）のＬ ＰＳ　（Ｒｅ５９５または野生量）はリストバイオロジカル（キャンベル、ＣＡ ）から入手した。ＣＤ１８に対するモノクローナル抗体（ｌＩＩＡｂ）ＩＢ４お よびＦｃｙＲＩ［（ＣＤ１６）に対するｍＡｂ、３０８はライト（Ｗｒｉｇｈｔ ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０：５６ ９９−５７０３（１９８３）に報告■ れている。ＣＲ１に対するｍＡｂ　５４３は、Ｒ，シュレーバー（Ｓｃｈｒｅｉ ｂｅｒ）　（セントルイス、ＭＯ）から提供され、ＦｃｙＲＩおよびＦｃｙＲＩ Ｉに対するｍＡｂ２２および■、３はＭ、ファンガ−（Ｆａｎｇｅｒ）　（ハノ バー、ＮＨ）から提供された。

パイロジエンフリーのヒト血清アルブミン（ＩＳＡ　’）はアーマーファーマシ ューティカルスから入手し、また、パイロジエンフリーのＰＢＳおよびＤＧＶＢ ″″′″はホワイテーカーＭＡバイオプロダクツから入手した。ＮＨ３−ビオチ ン、スルホ−ＮＨ３−ビオチンおよびストレプトアビジンはピアスケミカルから 入手した。

２表面 組織培養用プラスチック表面は２０℃で１時間、ＬＰ３１μｇ／ｍｊ’当り２５ μｇ／ｉたんばく質（抗体、ＬＢＰ・またはＨＳＡ）または１（μｇ／−とイン キュベーションすることでコーティングした。免疫複合体を形成するため、Ｈ３ Ａコート表面をさらに３０分間抗ＨＳＡ抗血清（１：５０）とインキュベーショ ンした。ある場合には、つづいてＬＰＳコート表面を２０°Ｃで３０分間、１０ μｇ／−のＬＢＰで処理した。過酸化水素生産の検定のためには全てのコート化 表面を食細胞添加の前、１時間、１ミリグラム／ミリリツトル（■／ＲＩ＞ＨＳ Ａで処理した。コート化した表面は検定前パイロジエンフリーのＰＢＳで注意深 く洗浄した。

３、細胞 単球由来のマクロファージ（ＭＯ）はライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、、１５６：１１４９−１１６４（＋９８２）に報告されている方法に示 かい３〜ｌＯ日間テフロンビーカー中で精製したヒトの単球を培養することによ って得た。単層の新鮮な単球は３７°Ｃで４５分間、末梢血液単核細胞がたんば く質コート化プラスチックに粘着させることにより得た。ＰＭＮはイングリッシ ュ（Ｅｎｇｌｉｓｈ　）等、Ｊ、　Ｉｏｎｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５： ２４９（＋９７４）の方法により新鮮な血液から精製した。赤血球でロゼツト形 成させることにより精製したＴ細胞はＪ、ミンク（ｌＪｉｎｇ）　（ロックフェ ラー大学）から提供された。ヒトのヘソの静脈内皮細胞単層（ｃ７　（Ｌｏ）等 、Ｊ、Ｅｘｐ、１Ｊｅｄ、１６９：１７７９−１７９３　（１９８９））はＳ、 　Ｋ口（Ｌｏ）　（ロックフェラー大学）博士から提供された。ヒツジ赤血球（ Ｅ）はライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　、　１５６：１１ ４９−１１６４（１９８２）に示された方法を用いＩ　ｇ　Ｇ　（ＥＩｇＧ）ま たはＩｇＭ（Ｅ［ｇＭ）でコートした。

Ｃ３ｂ１は１０％Ｃ５−欠損ヒト血清（ジグｖ）ｂ＋＋１中３７°Ｃで３０分間 ２〜１０Ｘ　１０″のＥＩｇＭをインキュベートすることによりＥ　Ｉ　ｇＭを 付着させた。

それからこの赤血球を洗浄し、ついで２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸Ｄ ＴＡ）を含むバッファ中、０°Ｃで１０分間インキュベーションした。生成した ＥＣ３ｂｉはＥＤＴＡ耐性のＭＯとのロゼツト形成による検定で示されるように Ｃ３ｂを育していない。ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　、　１６４：　１８７６−１８８８（１９８６）に従がいＥをＬＰＳでコート した。調製に用いたＬＰＳ量を変化させてＥＬＰＳ”（１−１０μｇ／４Ｘ１０ ’Ｅ）またはＥＬＰＳ”　（０，２−１μｇ／４Ｘ１０’Ｅ）が生成した。等容 量のＥＬＰＳＩＯ（１０°／−およびＬＢＰＩＯμｇ／−を３７°Ｃｌ２Ｏ分間 インキュベーションすることによりＥＬＰＳ”をＬＢＰでコートした。

生成したＬＢＰコートＥＬＰＳ　（リガンドコートＥ）は洗浄し、直ちに使用し た。

いくつかの実験ではＥを別の方法でＬＢＰコートした。まず５Ｘ１０”個のＥを ０．１Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ９，２中５°Ｃで２０分間・２５０μｇのスルホ− ＮＨ８−ビオチンとインキュベーションすることによりＥをビオチン化し、また ５０μｇのＬＢＰを５μｇのスルホ−ＮＨ３−ビオチンとインキュベーションす ることによりＬＢＰをビオチン化した後ＰＢＳに対して透析した。このビオチン 化したたんばく質はストレプトアビジンブリッジを介してビオチン化Ｅに結合さ せた。

洗浄した１０８個のビオチン化Ｅ　（ＥＢ）を２０℃で３０分間ｌＯμｇのスト レプトアビジンとインキュベーションしてアビジンコート赤血球（ＥＢＡＶ）を 生成した。フルオレセイン化ストレプトアビジンを用いた予備実験はＥＢＡＶが 均一で強い蛍光性を有し、かつ凝集が見られないことを示した。洗浄した２、５ Ｘ１．０７個のＥＢＡＶを２０℃で３０分間、２．５μｇのビオチン化ＬＢＰと インキュベーションしてＥＢＡＶ−ＬＢＰを生成した。

ガラクトースの存在下または非存在下でサルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　ＬＴ２　Ｇａｆ　Ｅを増殖させ、それ ぞれ完全な、または短縮したＬＰＳを含む細胞を得た。ライト（Ｗｒｉｇｈｔ） 等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６４：１８７６−１８８８（１９８６）。対数増 殖培養物を洗浄し、フルオレセインでラベル化した後ＰＢＳで２Ｘ１０”／マイ クロリットルＣｕｒｌ’）に調製した。ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、　Ｅｘ ｐ、　Ｍｅｄ、、！６４：１８７６−１８８８（１９８６）。

４、検定 ＬＰＳコート赤血球の凝集（実施例３）は丸底マイクロプレート中２１″Ｃで３ ０分間希釈ＬＢＰＩＯμ！中の１０６個のＥＬＰＳ”を振とうすることにより測 定した。凝集は沈着パターンから読み取った。

ＭＯへのりガントコートＥの結合をライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、、１５６：１１４９−１１６４（１９８２）の方法で測定した（実施例３ ）。簡単に云うとテラサキ（Ｔｅｒａｓａｋｉ）組織培養プレートをＨＳＡまた は他のたんばく質でコードン〈実施例２）、ついで３ｍＭグルコース、０．５　 ｍｇ／ｒｄＨＳ　Ａおよび０．３　ｕ／Ｔｎｌアプロチニン（シグマ）を含むＰ ＢＳ中の５μｌの細胞（０，５Ｘ　１０″／−を３７℃で、４５分間インキュベ ーションすることによりＭＯの単層を形成した。この単層にリガンドコート化Ｅ および指示たんばく質を添加した。Ｅを０℃、１０分間かけて沈着させ、ついで そのプレートを３７°Ｃに１５分間維持した。洗浄して未吸着のＥを除いた後位 相差顕微鏡で吸着を測定した。ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ 、、１６４：１８７６−１８８８（１９８６）に示されているように３７℃、１ ５分間のインキュベーションを採用した同様の方法でフルオレセイン化サルモネ ラ（Ｓａｌａ＋ｎｅｌｌａ）の結合を検定した。

この結果は１００個のＭＯ当りのＥまたはバクテリアの数を示す吸着指数として 報告する。３７°Ｃで４５分間ＭＯをＥとインキュベーションし、かつウェルを 測定する前、低張培地で簡単に処理することにより未摂取Ｅを分解すること以外 は同様の方法により（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　 、　１５６：１１４９−１’１６４（１９８２））リガンドコート化Ｅの食作用 を測定した。

５、　Ｌ　Ｂ　Ｐは赤血球膜へ挿入したＬＰＳに結合する。

０．５μｇ／−程のＬＢＰのＥＬＰＳ”への添加が凝集を起こした。リン脂質と の疎水性相互作用によりＥの膜へのＬＰＳが分配されるので、この観察結果はＬ ＢＰがリビドＡの露出した親水性部分を認識し、かつ、ＬＢＰが多量体を形成す る能力を育することを示している。ＥＬＰＳは強く凝集せず、緩やかなピペッテ ィングで分散し得る。

６、　Ｌ　Ｂ　ＰはＥＬＰＳおよびサルモネラのマクロファージへの結合を増進 する。

ＬＰＳと白血球上のレセプターのＣＤ１８複合体とＬＰＳとの相互作用を介して グラム陰性菌およびＬＰＳコート化赤化法血球Ｏと結合する。ライト（Ｗｒｉｇ ｈｔ）等、Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　、　１６４：　１８７６−１８８８（１ ９８６）。その相互作用を乱すＬＢＰの能力を調べた。最初の実験は高レベルの ＬＰＳで調製したＥを使用した。これらのＥＬＰＳ”はＭＯに強力に結合し、Ｌ ＢＰの添加は結合をわずかに促進させた。この促進の性質を試験するため、低レ ベルのＬＰＳでＥを調製した。５マイクログラム／ミリリツトル（μｇ　／ｍｌ ）　Ｌ　Ｂ　Ｐの存在化または非存在下単層のＭＯをＥＬＰＳ”とインキュベー ションした。ＥＬＰＳ”はＭＯとほとんど結合しなかったが、ＬＢＰの添加で結 合が劇的に促進された（第１図）。結合の増進は１μｇ／−ＬＢＰで効果が最も 大きくなる投与量依存性を示す。この効果の特異性は他の急性状態反応体、マン ノース結合たんばく質が１００μｇ／−の濃度でもＥＬＰＳ”のＭＯへの結合に 影響せず、別のＬＰＳ結合たんばく質ＢＰＩは１０μｇ／−の濃度でもその結合 に影響せず、またポリクローナル抗ＬＢＰ抗血清（１：２００）がＬＢＰによっ て起こるＥＬＰＳ’°のロゼツト形成を２０倍も減少させるという観察によって 支持されている。

また、ＭＯとＥＬＰＳとの相互作用を促進するＬＢＰの能力は赤血球膜中のＬＰ Ｓ量に依存していた（第２図）。ＬＢＰはＥＬＰＳとＭＯとの直接的相互作用を 維持するのに必要な量よりも２０〜１００倍も少ないＬＰＳ量で調製したＥの結 合を効果的に仲介し得る。

短縮型ＬＰＳを発現するグラム陰性菌の株（ラフ株）はＭＯと強力に結合するが 、完全なＬＰＳを育するスムーズ株はあまり結合しない。ライト（Ｗｒｉｇｈｔ ）等、Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　、　１６４＋１８７６−１８８８（１９８６） 。ＬＢＰはスムーズおよびう７ＬＰＳと等しく良く結合するので［トビアス（Ｔ ｏｂｉａｓ）等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２６４：　１０８６７− １０８７１（１９８９））スムーズサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）へのＬ ＢＰのオプソニン作用を調べた。第２表のデータが示すように、ＬＢＰの添加が スムーズサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のＭＯへの結合を激しく促進させ た。

第２表 ＬＢＰはサルモネラのＭＯ’への結合を促進する。

−ＬＢＰ　２７３　１０９６ ＋ＬＢＰ　１６６１　２．１０９ １、Ｓ、チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　）　ＬＴ　２のスムーズお よびラフ型調製物はライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、　Ｆｉｘｐ、　Ｍｅｄ、　 、　１６４　：　１８７６−１８８８（１９８６）に報告されているようにガラ クトースの存在下または非存在下でこの株のＧａ１Ｅ変異体を増殖することによ り得た。

マクロファージ単層へのバクテリアの結合は２．５μｇ／−のＬＢＰの存在下ま たは非存在下で測定した。スムーズ型バクテリアのＭＯへの結合に関しＬＢＰの 添加は５．９±１．９（ｎ−４）倍の増加を起した。第２表はＬＢＰの添加もラ フ型サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）の結合を促進するがその効果はオプ ソニン化していないバクテリアの激しい結合によりスムーズ型Ｓ、チフイリウム （Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）で見られるものよりも著しく小さいことを示してい る。したがって、ＬＢＰは生きている本来のバクテリアのＭＯとの相互作用を促 進させる。

７、ＭＯはＬＢＰのＬＰＳとの複合体を認識する。

実施例６において、ＬＢＰをＭＯおよびＥＬＰＳと一緒にした。ＬＢＰがＭＯま たはＥＬＰＳと結合するかどうかを測定するため、細胞を別々にＬＢＰとインキ ュベートし、洗浄後それらを合わせた。この実験を第３表に示す。

第３表 ＥＬＰＳのＬＢＰによる前処理はそれらの相互作用を促進するがＭＯには促進が 見られない。！ 吸着指数 条件　塞！１１　割畦　大勢」＝ ＬＢＰなし　６　１７　４ 前処理ＥＬＰＳ”　８２０　７１５　９４２前処理ＭＯ５２１１６ ＬＰＢ、ＥＬＰＳ”および　ＭＯの　コインキュベーノヲン　６２９　５２０　 ７９６１、単層のＭＯへのＥＬＰＳ”の結合は実施例４に示した方法で測定した く０．２μｇ／４Ｘ１０”’Ｅ）ａ’　ＥＬＰＳ”またはＭＯを３７°Ｃテ２０ 分子１ｌ１５　μｇ　７ｍＦｃ前処理し検定前に洗浄した。別に吸着検定の際に ５μｇ／ｄＬＢＰを添加した。

ＥＬＰＳ”のＬＢＰによる前処理はコインキュベーション実験で観察されるもの と同じ（データを示さず）投与・応答曲線に従かいＭＯへの結合を強く促進した （第３表）。この結果はＬＢＰはＥＬＰＳと安定に会合し、カリ表面に結合した ＬＢＰはＭＯによって認識されることを示している。一方ＭＯの前処理はつづ＜ ＥＬＰＳの結合に影響しなかった（第３表）。

ＥＬＰＳ表面のＬＢＰはＬＰＳと複合体を形成する。ＬＰＳの非存在下ＭＯがＬ ＢＰと結合するかどうかを測定するため、ＬＢＰをビオチン化し、ストレプトア ビジンコート化赤血球に結合した。生成したＥＢＡＶ−ＬＢＰはＭＯとは結合し ないが（第３図）、ＬＰＳの添加はＥＬＢＰのＭＯへの強い吸着を引き起こした 。ＥＬＢＰの吸着を引き起こすのに必要なＬＰＳ量はＥ欠失ＬＢＰの吸着に必要 な量よりも５０倍も少ないことから（第３図）、ＬＰＳはＬＢＰへの結合により ＥＢＡＶ−ＬＢＰの粘着を促進させるように思われる。さらに、ＬＰＳ処理ＥＬ ＢＰはＣＤ１８欠失ＭＯに強く結合するが、ＥＬＰＳはこれと結合しない。

したがって、ＬＰはＭＯによって認識されるためにはＬＰＳと複合体を形成しな ければならない。

８、　Ｌ　Ｂ　Ｐは単核食細胞に限定される移動性レセプターによって認識され る。

ＬＢＰ処理ＥＬＰＳは単球およびＭＯと実質的に１００％結合する。このことは 結合活性がこれらの集団の全てのメンバーに存在することを示している。ＬＢＰ が他のタイプの細胞と相互作用するかどうかを決定するため、単層のＰＭＮ、Ｔ 細胞、およびヘソの静脈内皮細胞をＬＢＰ処理したＥＬＰＳｌｏとインキュベー トした。結合は観察されなかった。同様に、たまたまＭＯ調製物に混入したリン パ球がＬＢＰコート化Ｅと結合することは決して観測されなかった。したがって 、ＬＢＰコート化粒子粒子合する能力は単核食細胞に限定された性質であると思 われる。

ＬＢＰに対する特異的なレセプターの存在がＬＰＳおよびＬＢＰの複合体でコー ドンた表面上にＭＯを拡げることで示された。第４表は表面結合したＬＢＰはＬ ＢＰ処理したＥＬＰＳの結合を強く低下させるがＥｌｇＧまたはＥＣ３ｂｉの結 合にはなんの影響も持たないことを示している。

第４表 ＬＢＰのレセプターは膜面中を移動する。′二匡　ＥＬＰＳ　’°ＬＢＰ　ＥＬ ＰＳ　”　ＥＣ３ｂｉ　町酋Ｈ３Ａ　８３３　５０７　９１５　６２１ＨＳＡ− 抗−Ｈ５Ａ　７９５　４５５　１０５１　４５１Ｂ４　８４６　１４９　２００ 　２５３ＬＰＳ−ＬＢＰ　１４７　６２８　１１６１　７６２１、プラスチック 表面を２１°Ｃで２時間ＨＳＡ　（５００μｇ／ｍｆ）　、ｍＡｂＩＢ４（２５ μｇ／−またはＬＰＳ　（１μｇ／−でコートし、ついで十分に洗浄した。指示 されている場合は、抗−Ｈ８Ａ　（ウサギ抗ＨＳＡ抗血清のｌ：４０希釈物）ま たはＬＢＰ　（５μｇ／−を加え、２０℃で３０分間インキュベートした。ＭＯ を３７°Ｃで４５分間洗浄したコート化表面上を拡散させ、さらに洗浄した後、 リガンドコート化赤血球を添加した。３μｇ　ＬＰＳ／４Ｘ１　ｏ’　Ｅを用い てＥＬＰＳ”を調製した。ＥＬＰＳ”は実施例３に示したように０．３μｇ　Ｌ ＰＳ／４Ｘ１０’Ｅで調製し、つづいて５μｇ　／ｍｌのＬＢＰで処理した。示 したデータは４回の実験の代表値である。

上述の結果はＬＢＰが膜面中を移動する分子によって認識されることを示してお り、このレセプターはＣＲ３およびＦｃＲとは異なることを示している。

９、　Ｌ　Ｂ　ＰはＣＲ３またはＦｃＲとは相互作用しない。

ＬＰＳはＣＲ３やＣＤ１８複合体の他のメンバー（ＬＦＡ−１およびｐ　Ｉ　５ ０゜９５）によって認識されることが知られているので（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ ）等、Ｊ、　ＥＸｐ。

Ｍｅｄ、　、　１６７：　１８７６−１８８８（１９８６））　、これらのレセ プターと少量のＥＬＰＳの相互作用を容易にすることによりＬＢＰがＥＬＰＳの 結合を促進させるらしい。しかし、いくつかの観察結果はこの可能性を排除した 。第７表の結果はＬＢＰがＣＤ１８の先天性欠損患者２人から単離した単球への ＥＬＰＳの強い結合を引き起こすことを示している。ＣＤ１８欠損細胞は平行し た検定でＥＬＰＳ”またはＥＣ３ｂｉとほとんど結合しなかった。

第５表 ＬＢＰはＣＤ１８欠損患者由来の単球へのＥＬＰＳｌｏの結合を仲介する１゜コ ントロール１　１０８　３１　２８２コントロール２　１８５　２７　４３７患 者１　１７　１５　３９４　４ 患者２　５　１４　５２９　１６ １．２人のＣＤ１８欠損患者の単球の単層（ＣＤ１８欠損白血球はインビトロで ＬＰＳに応答する）および２人の正常な成人コントロールをＥＣ３ｂｉ、ＥＬＰ Ｓ”（３μｇ／４Ｘ１０”　Ｅ）、ＥＬＰＳ”　（１μｇ／４Ｘ１０”Ｅ）、と インキュベートし、その吸着係数を測定した。指示されている場合は、ＥＬＰＳ ”に２．５μｇ／イのＬＢＰを添加した。

ＬＢＰ処理ＥＬＰＳ”の認識にＣＤ１Ｂが関与している証拠はＣＤ１８を抗ＣＤ １８ｍＡｂでコートした表面に拡げることによりＭＯの頂点表面からＣＤ１８分 子を放出させる実験から得られる。

ＭａｌＢ４はＥＣ３ｂｆおよびＥｌ、ＰＳ”の結合の減少によって示されるよう にＣＤ１８分子を減少させるが、ＬＢＰ処理ＥＬＰＳ”はこれらの細胞に正常に 結合する（第４表）。最後にＣａ”＋およびＭｇ−の欠失はＣ３ｂ１およびＬＰ ＳのＣＤ１８複合体の結合を完全にブロックするが〔ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等 、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　。

１５６：１１４９−１１６４（１９８２）およびライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ 、Ｂｙ＋ｐ、Ｍｅｄ、、１６４：１８７６−１８８８（１９８６））　、ＥＤＴ Ａ含有バッファにおけるＬＢＰ処理ＥＬＰＳ”の結合は等しかった。

ＬＢＰ認識におけるＦｃレセプターの関与も除外された。ＥＩｇＧの結合により 検定されるように免疫複合体コート化表面上の細胞の拡散がＦｃレセプターを著 しく減少させる。しかし、ＬＢＰコート化ＥＬＰＳ”の結合は変化しなかった（ 第４表）。同様の実験で表面結合マンノース結合たんばく質、ＦｃＲＩ、ＦｃＲ ＩＩ、ＦｃＲＩ［に対する表面結合ｍＡｂおよびＣＲＩはＬＢＰのＭＯへの結合 に影響しないことが示された。これらのデータはＬＢＰがＣＲＬ　ＣＲ３、Ｆｃ Ｒまたはマンノース結合たんばく質レセプターによって認識されないことを示し ている。

１０、ＬＢＰのレセプターはＦＣ仲介の貧食作用を促進する。

抗ＥＩｇＧの添加はり、ＢＰコート化ＥＬＰＳ”のＭＯによる食作用を著しく強 める（第４図）。最大の食作用の半分を起こすのに必要な抗ＥＩｇＧの投与量は 非コート化Ｅの食作用を起こすのに必要な量よりも５倍も少ない。このようにＬ ＢＰは食作用応答の誘導にＩｇＧと相乗的に作用するように思われる。先の報告 に従がうと〔アーレンバーガー（Ｅｈｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）等、Ｊ、　Ｅｘｐ　 、　Ｍｅｄ、　１４５：３５７−３７１　（１９７７））、ＥへのＣ３ｂ１の吸 着はＩｇＧに仲介される食作用を促進し、またこの促進度はＬＢＰによるものと 同程度である（第４図）。

ＬＢＰのみに仲介される食作用も調べた。ＬＢＰコート化ＥＬＰＳはＭＯときれ いなロゼツトを形成するが、結合したＥはいずれも残存（第４図）、フィブロネ クチン−１またはＰＭＡ−刺激化ＭＯのどれによっても貧食されなかつた。並行 した実験でＥＣ３ｂｉの強いフィブロネクチン−およびＰＭＡ−刺激化貧食作用 が示された。ＬＢＰ仲介貧食作用が無いことの説明は赤血球表面上のＬＰＳの著 しい横方向への移動である。ＬＰＳはＭＯに吸着するＥの極に“キャップ″をし てＥの円周上のリガンドを不十分なものにし、シュードボドに誘導する。このキ ャッピングを防ぐため、ビオチン化したＬＢＰを第４図で示した方法でビオチン 化したＥたんば（質に結合させる。ここでも、このような結合を受けたＥはＥコ ート化した残存またはＰＭＡ刺激化ＭＯのいずれによっても貧食されることはな かった（貧食指数＝０）。並行した実験では抗ＣＤ１８ｍＡｂ　（ＩＢ４）のビ オチン化Ｆ　（ａｂ）＊によって容易に貧食されることが示された（貧食指数＝ ４８２）。したがって、ＬＢＰのレセプターはそれ自身ではコート化赤血球の貧 食作用を開始できない。

１１、ＬＢＰのレセプターは酸化的破壊を開始しない。

ＬＢＰとそのレセプターの相互作用がＭＯからの細胞毒性応答を開始するかどう かを決めるため、コート化表面とＭＯとの相互作用の際の過酸化水素の生産を測 定した。

コート化表面上のＭＯの拡散の際の過酸化水素の放出をプラノ入ルブ（ｄｅｌａ Ｈａｒｐｅ）等、Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、７８：３２３−３ ３６　（１９８５）の方法で測定した。簡単に云うと、３〜４Ｘ１０’個のＭＯ （３日または４日目）をホースラディツシュパーオキシダーゼおよび４．２　ｎ ｍｏｌｅのスコボレチンを入れたたんばく質コート化組織培養ウェルに添加した 。このプレートを３７℃でインキュベートし、間隔をおいて自動蛍光プレートリ ーダーを用いてスコボレチンの消費を測定した。３個のウェルの平均を結果とし てウェル当りに生産される過酸化物のｎｍｏｌｅ数で表わした。コントロール刺 激物、ＰＭＡ（１００ｎｇ第５図は、ＬＰＳコート化表面表面ＭＯの結合がわず かな過酸化物の放出を起こすことを示している（免疫複合体またはＰＭＡによる 刺激の１２％）。しかし、ＬＢＰでコートした表面は基底量販上の過酸化物の放 出はなかった。さらに、ＬＰＳコート化表面表面ＬＢＰの添加はＬＰＳによる放 出をプロ・ツクし、このことはＬＢＰがこの実験系でＬＰＳと効率よ（相互作用 していることを示している。並行した実験でＬＢＰまたはＬＰＳ＋ＬＢＰコート 化表面上のＭＯの拡散かＬＢＰ処理ＥＬＰＳ”の結合を減少させることが示され た。このことでＬＢＰレセプターの結合が起きていることが確められた。したが って、ＬＢＰレセプターは酸化的破壊を開始できないと考えられる。

１２、抗ＣＤ１４抗体によるＬＰＳ−ＬＢＰ複合体のＭＯへの結合の阻害。

ＭＯへのＬＰＳ−ＬＢＰ複合体の結合を阻害する３つの抗ＣＤ１４ｍＡｂの能力 を測定した。単層のヒトＭＯをＯ″Ｃで１５分間、それぞれＯμｇ／ｍｌ、０． １５ｔｔ　ｇ／ｍｌ、　０．５　ｔｔ　ｇ／ｍｌ、１．５　ｕ　ｇ／ｍｌ、　５ 　ｕ　ｇ／ｍｌ、および１５μｇ／−濃度のｍＡｂ３ｃ１０．６０ｂまたは２ｂ ｉｃとインキュベートした。この単層がＬＢＰ処理ＥＬＰＳ”　（実施例３）と 結合する能力を実施例４に示した方法で検定した。

第６図に示したこの実験結果は、ｍＡｂ３ｃ１０および６０ｂは使用したｍＡｂ 濃度を増加させるにつれ減少する吸着指数を示し、一方、ｍＡｂ３ｃ１０および ６０ｂが認識するものと異なるエピトープを認識するｍＡｂ２ｂｉｃはコントロ ールｍＡｂ濃度（０μｇ／−で得られるレベルより低い指数に減少させることは でききない、すなわち結合を阻害することはできなかった。このようにｍＡｂ３ ｃ１０および６０ｂはＭＯへのＬＰＳ−ＬＢＰ複合体の結合を阻害する能力を有 する。この阻害の特異性は、ＣＤＩ　ｌｂ、ＣＤＩ　８、ＣＤ１６およびＨＬＡ に対する抗体は結合を阻害しないことによって支持される（データ示さず）。

一方、第７図ではｍＡｂ２ｂｉｃ、３Ｃ１０および６０ｂが全てＭＯへのＬＰＳ −ＬＢＰ複合体の結合を減少させうることを示している。ＭＯ単層を作る前にモ ノクローナル抗体を組織培養プレートに固定した。このことは、プレートに５μ ｇたんばく質／ｒｎｉの濃度のｍＡｂを加え、ＭＯを接種する前に未結合のｍＡ ｂをプレートから洗い落とすことによって行った。抗ＣＤ１４ｍＡｂでコートし た表面に吸着したＭＯはＬＰＳ−ＬＢＰ複合体でコートした赤血球の結合を減少 させたが、他のｍＡｂは減少させなかった。このように吸着したマクロマージの 基底表面に再分布したＣＤ１４がＬＳＰ−ＬＢＰ複合体の結合に必要である。こ の結果はＣＤ１４がＬＰＳ−ＬＢＰ複合体のレセプターとして働くという第６図 の結論を確認している。

＋３．ＣＤ１４はＬＰＳ−ＬＢＰ複合体と特異的に結合する。

ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体と特異的に結合する精製ＣＤＩ４の能力を測定した。

表面をまず抗ＣＤ１４ｍＡｂでコートし、ついで単球のＴｒｉｔｏｎＸ−１００ 抽出物でコートすることによりＣＤ１４をそれに固定した。１０”個の卓球を１ ％Ｔｒｉ　ｔｏｎ　Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液に懸濁し、Ｏ″Ｃで１５分間インキュベーシ ョンした後不溶性物質を遠心で除いた。ＣＤ１４を含む抽出物を抗体コート化表 面と接触させた。

この操作でＣＤ１４でコートした表面ができる。ＣＤ１４以外の抗原に対する抗 体を含むコントロールウェルではこの操作でＣＤ１４以外のたんばく質でコード ンた表面ができる。十分洗浄した後ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体でコートした赤血球を コート化ウェルに入れ、その赤血球（ＥＬＰＳ”　）の吸着を写真に撮った。

ＬＰＳ−ＬＢＰ結合部位に対する結合部位をブロックしないＣＤ１４に対する抗 体ｍＡｂ　２ｂｉｃにより表面に吸着したＣＤ１４はコート化赤血球に強く結合 した。他の抗原でコートした表面はこの活性を示さなかった。このように、精製 したＣＤ１４分子はＬＰＳ−ＬＢＰ複合体を結合する能力を有する。この観測で ＣＤ１４がＬＰＳ−ＬＢＰ複合体のレセプターとして働いていることが確認され た。

１４、ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体はＭＯにおけるＴＮＦの分泌を誘導する。

ＬＢＰ、加熱処理ＬＢＰ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはウシ胎児血清（ Ｆｅ２）の存在下、腹腔滲出性マクロファージ（ＰＥＭ）におけるＴＮＦ分泌を 誘導するＬＰＳの能力を測定した。

ウサギのＰＥＭを得るため、ＮＺＷウサギ（２〜２．５ｋｇ）にＢＣＧ　（ＢＣ Ｇ細胞壁、Ｒ−２００、リビイム／ケムリサーチ社、ハミルトン、ＭＴ）由来の 細胞壁をｌＯμｇ含む３５ミネラルオイル（ドラゲオール　ｂＶＲ、パンレコ、 パトラ−１ＰＡ）を腹腔内注射した。３日後、ベントパルビタールナトリウム（ ウェスタンメディカルサプライ社、アルカディア、ＣＡ）１２０■の静脈注射を 行い、ついて２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ１５ ０μｇペニシリン／ストレプトマイシン／ｍｌ、１０ｍＭヘペス、２％ウシ胎児 血清、および５Ｕ／−ヘパリンを補った５　０　（７の氷冷ＲＰＭＩ−１６４０ による腹腔の無菌的洗浄を行った。収穫した細胞を遠心しく１０００ｘＧ、１０ 分、４℃）、をＦＢＳを含まない上記培地（無血清培地）に懸濁した。さらに遠 心と無血清培地への懸濁を行った後、その細胞をヘモサイトメーターを用いて計 数し、８〜ｌ０ＸＩＯ’マクロフアージ／フラスコの密度になるように１５０ａ ｌフラスコにブレーティングした。３７°Ｃ，５％ＣＯ２で２時間後、激しい洗 浄と２０−の無血清培地の補充により非粘着細胞を除去した。ライト染色した細 胞遠心調製物を用いて調べた時、ミネラルオイル誘導型の腹腔滲出液細胞には約 ６０％のマクロファージ、３５％の好中球、および５％の白血球が含まれていた 。ブレーティングと洗浄後、粘着細胞の９０％以上がマクロファージとなった。

このように生成したウサギＰＥＭを１２時間、先に示したたんばく質の存在下お よび非存在下、サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｅｓｏｔａ ）Ｒｅ５９５から単離したＬＰＳ　（１００ｐｇ／−で処理し、その無細胞上清 をマチソン（Ｍａｔｈｉｓｏｎ）等、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　、８ １　：　ｌ　９２５　（１９８８）に述べられているラフ（Ｒｕｆｆ）等、Ｌｙ ｍｐｈｏｋｉｎｅｓ、２　：　２３５−２４２（１９８１）のＬ９２９検定法の 修正法を用いて上述のようにＴＮＦを検定した。

簡単に言うと、Ｌ９２９細胞（ＣＣＬＩ、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン、ロックビル、ＭＤ）をｌｏｍＭヘペスおよび１０％ウシ胎児血清を補った ＲＰＭＩ　Ｉ　６４０　（ハイクロン、レバツイン（Ｒｅｈａｔｕｉｎ）　Ｆ、 Ｓ、　、レヘイスケミカル社、フェニックス、ＡＺ）で培養した。この集密培養 物を５ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭヘペスを含む生理食塩水中０．５％トリプシ ン（ＴＲＬ３、ワーシントンバイオケミカル社、フリーホールド、ＮＪ）溶液で 簡単にすすぎ、アクチノマイシンＤ（１℃ｇ／ｌｄりを含む新鮮な培地に懸濁し た後９６穴プレートに入れた（５〜７Ｘ１０’細胞／ウエル）。培養２時間後、 順次希釈したサンプルをウェルに加え、そのウェルに０．２％クリスタルバイオ レット、１０％ホルマリンおよびＯ，０１Ｍリン酸塩ｐＨ７〜７．５からなる溶 液を満たす。ついで水で十分洗浄した後ウェルを乾燥させた。溶解度はＩＢＭ− ＰＣコンピューターを備えたＢｉｏ−ＴｅｋモデルＥＬ３１０プレートリーダー （Ｂｉｏ−Ｔｅｋインスツルメント、バーリントン、ＶＴ）を用いて分光学的に 定量した。検定結果はＵ／−で表わした。■ユニット（■）は５０％の細胞を溶 解するＴＮＴ量と定義する。

検定にはルーチンに８〜１２個のプレートを作る。各プレートには２つのコント ロール、Ｒｅ５９５ＬＰＳ処理ＲＡＷ２６４．７細胞のならし培地（６×１０’ Ｕ／−およびＲｅ５９５ＬＰＳ処理ウサギＰＥＮのならし培地（１，３タス社、 エミリービル、ＣＡ、２ｘ１０’　Ｕ／ｍｇ）に対して校正し、それに従って検 定結果を標準化した。サンプルは４回検定し、その変動係数は０．１２±０．０ ８（ＳＤ）であった。この検定法を用いてｌｏｐｇ／−程のウサギマクロファー ジ由来ＴＮＦが検出できる（比活性１　ｘ　１０　”　Ｕ／ｍｇ）。しかし、１ ０％以上の血清濃度はＬ９２９細胞の非特異的ラウンディングおよび粘着のロス を起こすので、血清中のウサギＴＮＦの検出限界は２０　Ｕ／ｍｌ　（０，２ｎ 　ｇＴＮＦ／−に相当）である。第８図に示したこの実験結果は、ＬＰＳおよび 活性ＬＢＰの両方が存在する場合のみＴＮＦが生産されることを示している。Ｒ ｅ５９５ＬＰＳはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のラフ株由来のものであ る。大腸菌０１１１ｉＢ４由来のＬＰＳなどスムーズ菌株から単離したＬＰＳを 用いた場合も同様の結果が得られ、このことはこの効果の一般性を示している。

＋５．ＬＢＰへのＬＰＳの結合はＬＢＰをトリプシン切断から保護する。

５０ｍＭヘペス、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，４を含むバッファ中最終濃度０． ３ｍｇ／−のＬＢＰを含むサンプルを調製した。

１つのサンプルに対して最終濃度０．１２５ｍｇ／ｒｄ！どなるようにＬＰＳを 加えた。第２のサンプルには最終濃度が０．１２５ｍｇ／ｒｄとなるように硫酸 デキストリンを加えた。つづいて３個全てのサンプルに最終濃度２μｇ／ｒｒｄ となるようにトリプシンを加えた。３７°Ｃに維持しながら、５．２５．６０お よび１２０分の時間間隔で部分標本を採取した。この部分標本は１２％ゲルを用 いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）で分析した。第９図に示すこの実験結果は、ＬＢＰのＬＰＳによる結合が酵 素分解からＬＢＰ保護することを示している。ＬＰＳは切断を防ぐＬＢＰの構造 変化または切断部位への立体障害を誘導することによりＬＢＰを保護する。

＋６．　ヒト血液において抗ＣＤ１４モノクローナル抗体はＬＰＳ−ＬＢＰ誘導 型のＴＮＦ生産を阻害する。

ヒト血液中において抗ＣＤ１４ｍＡｂがＭＯによるＴＮＦ分泌を阻害する能力を エスペビク（Ｅｓｐｅｖｉｋ）等、Ｊ、１ａｎｕｎｄ：Ｍｅｔｈ、、９５　：　 ９９−１０５　（１９８６）に報告されているＴＮＦ誘導性細胞毒性検定法を用 いて測定した。簡単に言うと、ヘパリンで抗凝集処理したヒト血液を調製し、３ ７°Ｃで３０分間、最終濃度ｌμｇ／−となるようなｍＡｂ３ｃＩｏ、Ｓｏｂま たはＩＢ４とインキュベーションした。つづいて、この細胞を３７℃、１２時間 、加湿、１０％Ｃ０２インキユベーター中で最終濃度Ｏ１０，０１，０，ｌ、ま たは１．０ｎｇ／−のＲｅ５９５・ＬＰＳとインキュベーションした。それから 各サンプルの血漿を採取しＴＮＦの存在を検定した。

これらの実験では、健康な検体の血液中の構成的ＬＢＰレベルが１００〜２５０ ｎｇ／ｍｌと見積られるため、さらにＬＢＰを添加する必要はない。トビアス（ Ｔｏｂｊａｓ）等、Ｊ、ＥｘｐｌＭｅｄ、１６４ニア７７　（１９８６）および トビアス（Ｔｏｂｉａｓ）等、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、５０　：　７３ −７６　（１９８５）、　ＬＢＰに対するＬＰＳのアフィニティーの見積もりに 基づき、（トビアス（Ｔｏｂｉａｓ）等、Ｊ、ＢｉｏｌＳＣｈｅｍ、２６４：１ ０８６７−１０８７１　（１９８９））、ＬＢＰの構成的レベルは添加した全て のＬＰＳと結合するのに十分な量である。

ＷＥＨＩクローン１３細胞はトロンドヘイム大学のＴ１エズペビク（Ｅｚｐｅｖ ｉｋ）から提供さ札　１０％ＦＣ３，０，１ｍＭグルタミンおよび３０μｇ／− ゲンタマイシンを含むＲＰＭ１１６４０培養培地（ギブコ）で培養した。この細 胞をＲＰＭ１１６４０培養培地１００μｌ中２Ｘ１０’個となるようにマイクロ プレートのウェルに接種した。ついでＭＯ培養土＃５〜５０マイクロリットル（ μｌ）のサンプルをＷＥＨＩクローン１３細胞増殖培地に加え、３７°Ｃで２０ 時間インキュベーションした。つづいてＰＢＳ中５ｍｇ／−濃度のＭＴＴテトロ リットルを各ウェルに添加し、さらにそのウェルを３７℃で４時間インキュベー トした。ウェルから上清１００マイクロリツトルを吸引した後、０．０４ＮＨＣ ｆを含むイソプロパツール１００マイクロリツトルを各ウェルに添加した。濃青 のホルマザン結晶を溶解した後、そのプレートをテスト波長５７０ｎｍおよび参 照波長６３０ｎｍを用いたマイクロプレートリーダーでプレートの測定ＣＰ／Ｔ ＮＰを含むウェルの光学密度 ＋００−　Ｘ１００ コントロールウエルの光学密度 実験培養で得られる死細胞の割合を種々の既知の希釈率のＴＮＦで得られた割合 と比較して各実験培養物中のＴＮＦ濃度を測定した。この実験結果を第６表に示 す。

第６表 ヒト血液におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦ生産に関するモノクローナル抗体の効果。

（Ｒｅ　５９５　ＬＰＳ）　、ｎｇ／Ｔｎｌ　抗体’　（ＴＮＦ）　、Ｕ＃２０ 、０１　３　Ｃ１０＜０．５ ０．１　３Ｃ１０＜０．５ １．０　３Ｃ１０３ −６０ｂ　＜０．５ ０、０１　６０　ｂ　＜０．５ ０．１　６０ｂ　２ １．０　６０ｂ　１２ −　ＩＢ４’　＜０．５ ０．０１　１Ｂ４　２ ０．１　１Ｂ４　１３ １．０　１Ｂ４　４０ ■、全てのモノクローナル抗体は最終濃度ｌμｇ／ｍｌとなるように添加した。

２．７ＮＦ検定は標準物質として■当り２ＸＩＯ’ユニツトの比活性を育する組 換えＴＮＦを用いたＷＥＨＩクローン１３検定法で行った。

３、抗ＣＤ１８ｍＡｂ。

第６表からヒト血液中のＬＰＳ誘導ＴＮＦ生産はＬＰＳ濃度の増加とともに増加 することが分る。さらに、ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体誘導ＴＮＦ生産は抗ＣＤ１４抗 体３Ｃ１０および６０ｂによって有意に阻害されるが、抗ＣＤ１８１Ｂ４モノク ローナル抗体はＴＮＦ生産を有意に阻害しないことが分る。スムーズ型バクテリ ア大腸菌０１１１：Ｂ４から単離したＬＰＳで同じ実験を行ない、炭水化物含量 は異なるがリビドＡ構造は保存されているＬＰＳＩｉ製物に関するその一般性が 示された。

血液中に存在する細胞毒性のＴＮＦ特異性はマチソン（Ｍａｔｈｉｓｏｎ）等Ｊ 、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、、８１：　１９２５　（１９８８）に述べられてい るようにポリクローナルヤギ抗ヒトＴＮＦ　［ｇＧ抗体を用いて確認した。この 抗体はＬＰＳ処理血液サンすル中の全ての細胞毒性を完全に中和した。

１７、実施例１〜１６の結果に関する考察これまで述べてきた事項はＬＰＳがバ クテリアに結合しオプソニンとして機能することおよびマクロファージによりそ の結合および貧食作用が容易になることを示している。ＬＢＰはＢＰＩのＬＰＳ 結合ドメインと相同的なドメインを介してＬＰＳと結合する一方、ＬＢＰの細胞 への吸着はＬＢＰにユニークなドメインに仲介されると考えられている。

ＬＰＳコート化粒子粒子表面上ＢＰはＭＯ上の膜面を移動する特異的レセプター ＣＤ１４によって確認される。ＬＢＰコート化粒子粒子ＯなどＣＤ１４発現細胞 に結合するが他の血液細胞には結合しない。ＭＯの頂点表面上の結合活性はＬＢ Ｐ−ＬＰＳ複合体でコートした基質上を細胞が拡散することにより消失する。

ＣＲＩ、ＣＲ３およびＦｃＲに対する表面結合抗体はＬＢＰコート化粒子粒子合 を減じないことからＬＢＰのレセプター〇Ｄ１４は他のオプソニンレセブターと は異なる。

オプソニンとしてＬ　Ｂ　Ｐはグラム陰性菌など敗血症誘導性感染体の除去を促 進する。しかし、敗血症になった場合の菌分解は補体や分解性酵素を含む内在性 分解システムの作用またはその後の抗生物質の作用によって起こる。分解はＬＰ Ｓの血中レベルの増加を起こす全身的なＬＰＳの放出を誘導する。このレベルは １〜１０００　ｐ　ｇＬＰＳ／ｍｌと見積られるので高アフィニティーのＬＰＳ −ＬＢＰ複合体を形成するのに十分なＬＢＰが存在する。〔スターク（Ｓｔｕｒ ｋ）等、リムラスアメポサイト（Ｌｉｍｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ）溶解物 テストによるバクテリア内毒素の検出、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）Ｓ、　Ｗ、ア ラン（Ａｌｌａｎ）　Ｒ，リス（Ｌｉｓｓ）、ＮＹ１９８７：３７１−３８５） ヴアンデベンター（ｖａｎ　Ｄｅｒｅｎｔｅｒ）、Ｓ、Ｊ、　ＨｏＬａｎｃｅｔ ｌ　：６０５−６０８　（１９８８）。ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体はマクロファージ ／単球系統の細胞上のＣＤ１４に結合して、モノカインＴＮＦの迅速な合成およ び放出を開始し、それによって完全な敗血症への進展に有意に寄与する。

従来から知られているオプソニン、ＩｇＧはＩｇＧコート化粒子粒子合、それら の貧食作用的な取込みおよび過酸化水素などの毒性化合物の放出を可能にする。

別のオプソニン、Ｃ３は基本的に０３コ一ト化粒子の結合を可能にする。非刺激 ＭＯによる貧食作用はＣ３コ一ト化粒子がＩｇＧを有する場合のみ観察され（ア ーレンバーガー（Ｅｈｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４５　 ：３５７−３７１（１９７７）、かつ過酸化水素の発生は開始しない。ライト（ Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５８　：２０＋６−２０２３　（ １９８３）。

ＬＢＰのオプソニン活性はｅ３のものと非常に煮ている。ＬＢＰコート化粒子粒 子Ｏに強く結合するが、その場合は貧食作用または過酸化水素の放出は開始しな い（第５図）。またＬＢＰは少量のＩｇＧでコートした粒子の貧食作用を促進す る上でＣ３に似ている（第４図）。ＬＢＰのオプソニン効果は唯一の点でＣ３と 異なる。補体たんばく質はＭＯをＰＭＡ　（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、　 Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１５６：１１４９−１１６４　（１９８２））またはフィブロネクチン（ライト （Ｗｒｉｇｈｔ）等、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、、１５８：１３３８−１３４ ３　（１９８３））などの補助刺激物で処理した場合貧食作用を開始するが、Ｌ ＢＰはそのように刺激した細胞でさえ貧食作用を仲介しない。

オプソニンとして作用することによりＬＢＰは動物体内においてグラム陰性ノく クチリアの拡散を制限する。急性状態におけるＬＢＰの出現が感染との戦いにう まく適応する。それゆえ、ＬＢＰはグラム陰性菌などの感染体に対する防御シス テムを代表するものであると考えられる。

特定の態様および実施例を含むこれまでの明細は本発明を説明するものでありこ れを制限するものではない。本発明の精神および範囲を逸脱することなしに多く の変化や修正が可能である。

吸着指数 貧食指数 過酸化物（ｎｍｏｌｅ）／ウェル 吸着指数 吸着指数 たんばく質濃度（ＬＯＧ　Ｇ／ＭＬ） ＩＧ　８ 手続補正書（方式） ４．１１１１Ｑ 平成　年　月　日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．治療効果量の抗ＣＤ１４抗体を患者に投与することを含む敗血症の治療方法 。
2. ２．前記抗ＣＤ１４抗体がリポ多糖リポ多糖結合たんばく質複合体のＣＤ１４へ の結合を阻害するモノクローナル抗体である請求項１記載の方法。
3. ３．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣＴＩＢ２２Ｂまたはその 抗ＣＤ１４抗体分子発現核酸によって生産される請求項２記載の方法。
4. ４．前記モノクローナル抗体が抗ＣＤ１４抗体分子の下（ａｂ′）２部分を含む 請求項２記載の方法。
5. ５．前記治療効果量が１日当り体重１キログラム当り０．１乃至２０ミリグラム である請求項２記載の方法。
6. ６．前記方法がさらに実質的に同時に殺菌量の抗生物質を前記患者に投与するこ とを含む請求項１記載の方法。
7. ７．前記抗生物質がグラム陰性菌に対して有効な抗菌剤である請求項６記載の方 法。
8. ８．前記敗血症がグラム陰性菌の感染に由来する請求項１記載の方法。
9. ９．前記敗血症がウイルス、グラム陰性菌または菌類の感染に由来する請求項１ 記載の方法。
10. １０．前記方法がさらに実質的に同時にＴＮＦ血中濃度減少量の抗ＴＮＦ抗体を 前記患者に投与することを含む請求項１記載の方法。
11. １１．前記方法がさらに前記抗ＣＤ１４抗体と実質的に同時に殺菌量の抗生物質 を前記患者に投与することを含む請求項１０記載の方法。
12. １２．前記患者がいかに示す症状：成人性呼吸困難、分散性血管内凝血、腎臓疾 患および肝臓疾患のうちの１つ以上の症状を示す請求項１記載の方法。
13. １３．前記敗血症が化学的または物理的外傷に由来する請求項１記載の方法。
14. １４．患者の内毒素血症の症状の改善方法で、該患者に単球マクロファージ系統 細胞によるリポ多糖誘導型腫瘍壊死因子分泌を阻止するのに十分な量の抗ＣＤ１ ４抗体を投与することを含む方法。
15. １５．前記抗ＣＤ１４抗体がリポ多糖リポ多糖結合たんぱく質複合体のＣＤ１４ への結合を競争的に阻害するモノクローナル抗体である請求項１４記載の方法。
16. １６．前記モノクローナル抗体がハイプリドーマＡＴＣＣＴＩＢ２２Ｂまたはそ の抗ＣＤ１４抗体分子発現核酸から生産される請求項１５記載の方法。
17. １７．患者の敗血症の治療方法で、該患者に治療効果量の抗リポ多糖結合たんば く質抗体を投与することを含む方法。
18. １８．患者の敗血症の治療方法で、該患者に治療効果量のリポ多糖結合たんぱく 質のペプチドアナログを投与することを含む方法。
19. １９．前記ペプチドアナログが以下の式：【配列があります】、 【配列があります】、または 【配列があります】． で表わされるアミノ酸配列を有する請求項１８記載の方法。
20. ２０．医薬的に許容可能な賦形剤中、ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体のＣＤ１４への結合 を阻止し得る抗ＣＤ１４抗体分子を含む単位投与量型の治療組成物。
21. ２１．請求項２０記載の組成物で、さらに単位投与量の抗ＴＮＦ抗体分子を含む 組成物。
22. ２２．請求項２０記載の組成物で、さらに殺菌量の抗生物質を含む組成物。
23. ２３．請求項２１記載の組成物で、さらに殺菌量の抗生物質を含む組成物。
24. ２４．活性成分として敗血症の治療のためにヒトに投与するのに適した濃度の、 ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体のＣＤ１４への結合を阻止し得る抗ＣＤ１４抗体分子なら びに、抗生物質および抗ＴＮＦ抗体分子のうちの１つまたは両方を含む組成物。