JPH05506435A

JPH05506435A - メロシン、それをコードする核酸、フラグメントおよびその使用

Info

Publication number: JPH05506435A
Application number: JP91505550A
Authority: JP
Inventors: イングバル，エバ; レイボ，イルモ; セインズ，ジョシュア　アール．
Original assignee: ラ　ホヤ　キャンサー　リサーチ　ファウンデーション; ワシントンユニバーシティ
Priority date: 1990-01-30
Filing date: 1991-01-30
Publication date: 1993-09-22
Also published as: EP0514481B1; DE69132159T2; DE69132159D1; AU7334291A; US5444158A; WO1991011462A3; WO1991011462A2; EP0514481A1; ATE192458T1; CA2074361A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

２２、ハイブリダイゼーションを可能にする、図１の核酸の一部と充分に相捕的なヌクレオチド配列を含有する、核酸プローブ。２３、メロシンをコードする核酸細胞の存在を検出する方法でありで、該方法が、請求項２２に記載のプローブを該核酸と接触させること、および該核酸に対する該プローブのハイブリダイゼーシヨンを測定することを包含する、方法。２４、細胞中のメロシンの存在を検出する方法であって、該方法が、請求項１２に記載の抗体をメロシンと接触させること、およびメロシンの一部に対する該抗体の結合を測定することを包含する、方法。２５、図１の核酸の一部に対応する、核酸。２６、細胞中の分化の程度を測定する方法であって、該方法が、該細胞により生成されるメロシンを検出することを包含し、ここで、実質的なメロシンの存在が、高度に分化した細胞を意味している、方法。２７、腫瘍の悪性度を測定する方法であって、該方法が、該腫瘍により生成されるメロシンを検出することを包含し、ここで、メロシンが実質的に存在しないことが、悪性腫瘍を意味している、方法。２８、メロシンの生成を誘発する方法であって、該方法が、メロシン生成細胞を、該メロシン生成細胞中にて、メロシンの生成を誘発する細胞またはマトリックスと接触させることを包含する、方法。２９、請求項２８に記載の方法であって、メロシンの生成を誘発する前記細胞が、間充繊細胞である、方法。３０、神経突起の成長を促進する方法であって、該方法が、二ニーロンを請求項１に記載のタンパク質と接触させることを包含する、方法。３１、神経突起の成長を促進する方法であって、該方法が、二ニーロンを請求項２に記載のタンパク質と接触させることを包含する、方法。３２、神経突起の成長を促進する方法であって、該方法が、ニエーロンを請求項１１に記載のタンパク質と接触させることを包含する、方法。３３、神経突起の成長を阻害する方法であって、該方法が、メロシンを神経突起促進活性の阻害剤と接触させることを包含する、方法。３４、神経突起の成長を促進する方法であって、該方法は、メロシンの神経突起促進活性の阻害剤と、メロシンとの結合を妨害することを包含する、方法。３５、メロシンと結合する細胞における細胞付着を促進する方法であって、該方法が、該細胞を、メロシンまたはその細胞付着促進部分と接触させることを包含する、方法。３６、構造Ｍ−Ｘ−８２を含有する、実質的に純粋なヘテロトリマーの変種であって、ここで、Ｍが、メロシンのＭポリペプチドであり；Ｘが、ラミニンのＢ１鎖およびＳ−ラミニンからなる群から選択され；そして８２が、ラミニンの８２鎖である、ヘテロトリマーのラミニン変種。３７、ｘがＳ−ラミニンである、請求項３６に記載の実質的に純粋なヘテロトリマーのラミニン変種。３８、ｘがラミニンの８１鎖である、請求項３６に記載の実質的に純粋なヘテロトリマーのラミニン変種。３９、　Ｍ−５−８２ラミニン変種を含有する物質から、実質的に純粋なＭ−Ｓ −８２ラミニン変種を単離する方法であって、該方法は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程を包含する：（ａ）Ｂｌに選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｂ）該Ｍ−Ｓ−８２含有物質を、８１に対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と接触させる工程；（ｃ）Ｂｌに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体とは結合していない物質を回収する工程であって、該回収した物質が、Ｍ−Ｓ−Ｂ２およびＡ−Ｓ−Ｂ２を含有する混合物である、工程；（ｄ）Ｍに対する選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｅ）　Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体に、該混合物を接触させる工程；そして（ｒ）　Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と結合した物質を回収する工程であって、該回収した物質が、実質的に精製したＭ−Ｓ−８２である、工程。４０、請求項３９に記載の方法であって、Ｍに対する免疫反応性を有する前記固定化した抗体と結合していない物質が、工程（ｆ）の前に回収され、そして実質的に純粋なＡ−５−８２である、方法。４１　、　Ｍ−Ｓ−８２ラミニン変種を含有する物質から、Ｍ−Ｓ−８２ラミニン変種を単離する方法であって、該方法は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程を包含する：（ａ）Ｍに選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｂ）該Ｍ−Ｓ−８２含有物質を、Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と接触させる工程；（ｃ）　Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と結合している物質を回収する工程であって、該回収した物質が、Ｍ−Ｓ−Ｂ２およびＭ−Ｂｌ−Ｂ２を含有する混合物である、工程；（ｄｏｓに対する選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｅ）Ｓに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体に、該混合物を接触させる工程：そして（ｆ）　Ｓに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と結合した物質を回収する工程であって、該回収した物質が、実質的に精製したＭ−Ｓ−８２である、工程。４２、請求項４１に記載の方法であって、Ｓに対する免疫反応性を有する前記固定化した抗体と結合していない物質が、工程（ｆ）の前に回収され、そして実質的に精製したＭ−Ｂｌ−８２である、工程。明細書メロシン、それをコードする核酸、フラグメントおよびその使用本発明は、助成金番号Ｄｉ［３００５１、ＣＡ　４５５４６、ＣＡ　２８８９６、および国立衛生研究所の癌センターの助成交付金番号ＣＡ　３０１９９により、援助されている。この発明の権利は、米国政府が有し得る。発ｌ目とえ景本発明は、一般に、基底膜に関し、特に、新規な組織特異性の基底膜会合タンパク質に関する。基底膜とは、上皮細胞を、その下にある組織のストローマから分ける細胞外マトリックスの薄いシートである。これらの膜は、上皮器官と内皮器官とを区分し、そして組織構造を維持する。ある種の組織では、基底膜は、数種の細胞タイプの相互作用の生成物である；例えば、骨格筋では、筋内膜に由来の線維芽細胞は、基底膜の組立てに、タイプＩｖコラーゲンを寄与させ得る。神経基板の形成には、シ二ワン細胞と二ニーロンの相互作用が必要である。さらに、基底膜は、細胞の付着、移動および増殖を促進することにより、そして組織相互作用の信号を媒介することにより、発生および組織の修復に機能する。全ての基底膜は、ラミニン、タイプＩＶコラーゲン、エンタフチン（ｅｎｔａｃｔｆｎ）、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有する。ラミニンは、３個のポリペプチド鎖、すなわち４０ＯｋＤのＡ鎖および約２００　ｋＤの２個のＢ鎖、から構成される大きな糖タンパク質である。Ａ鎖アミノ末端側の３分の２は、Ｂｌ鎖およびＢ２鎖と相同であるのに対して、カルボキシ末端側の３分の１は、興なる構造を有する。ラミニンは、種々の細胞タイプの付着、分散、運動性および成長を促進する。ラミニンの最も顕著な特徴の１つは、培養した神経細胞からの神経突起の成長を促進する能力である。細胞接着および神経突起促進活性の主な部位は、この分子の長い腕の末端にある球状ドメインにあると思われる。ある種の膿瘍細胞の転移性もまた、ラミニンに影響され得る。例えば、ラミニンは、タイプ！Ｖコラーゲンへの悪性力ルチノーマ細胞の結合を媒介し、そしてマウスの黒色腫細胞の転移可能性を増すことを示した。血管や他の上皮組織の基底膜への転移性腫瘍細胞の付着には、他の基底膜タンパク質およびそれらのレセプターが関与し得る。Ａ鎖、Ｂｌ鎖およびＢ２鎖から構成されるラミニンに加えて、少な（とも２種のラミニン関連のタンパク質、すなわち、メロシン（ｍｅｒｏｓｉｎ）およびＳ− ラミニンが存在する。ＬｅｉｖｏオヨｄＥｎｇｖａ１１の参考文献、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８５：　１５４４−１５４８（１９８ｇ）の内容は、本明細書に参考として援用されており、最近では、６５ −ｋＤａおよび８Ｏ−ｋＤａ前駆体である、メロシンと呼ばれる、基底膜が会合したタンパク質の単離を記述している。しかしながら、本明細書および請求項で記述のほぼ８００　ｋＤａのタンパク質の開示はない。この６５−ｋＤａおよび８Ｏ−ｋＤａタンパク質は、８００　ｋＤａタンパク質のサブユニットと思われるので、「メロシン」との用語はまた、現在では、本明細書および請求項で記述の８００　ｋＤａにも適用される。他に特徴のあるラミニン関連のポリペプチドには、Ｓ−ラミニンがある。このラミニン関連のポリペプチドのアミノ酸配列は、ラミニンポリペプチドのうちでは、Ｂｌ鎖に最も関連がある（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８：　２２９ −２３４（１９８９）、この内容は本明細書に参考として援用されている）。さらに、他のラミニン関連のポリペプチドも記述されている。例えば、ラミニンと類似しているが同一ではない神経突起の促進因子は、非常に多くの起源に由来の細胞に記述され、これには、筋肉細胞および心臓細胞、および正常および悪性のシニワン細胞が含まれる（Ｄａｖｔｓら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、５：　２６６２−２６７１（１９８５）；　Ｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　８２：　２１８３−２１８７（１９１１５）　；Ａｒａｔａｎｉ、　Ｙ、およびＫｉｔａｇａｖａ、　Ｙ、、Ｊ、　Ｂｆｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：　１６１６３−１６１６９（１９８８）、およびＥｄｇａｒら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０６：　１２９９−１３０６　（１９８８）、これらの全ての内容は本明細書に参考として援用されている）。これらの因子は、馴化培地で確認され、またある場合には、そこから精製されており、ラミニンＢ様のサブユニットと類似の分子量を有するが、４００　ｋＤすなわちＡ様のサブユニットがない。これらの因子は、ラミニンＢ鎖と免疫学的に交差反応するが、ラミニンに対する抗体は、それらの活性を妨害しない（ＳｔｅｅｌｇおよびＨｏｆｆｍａｎ、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。Ｒｅｓ、１５：　３２３−３３９（１９８６）；　５ａｎｄｒｏｃｋおよびＭａｔｊｈｅｖ％Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８４：　６９３４−６９３８（１９８７）　；　Ｌａｎｄｅｒら、ム、これらの全ての内容は、本明細書に参考として援用されている）。免疫組織化学の研究から、全ての基底膜には、その発生過程を通じて、ラミニンが存在するとの考えが導かれている。しかしながら、メロシンは、現在では、筋肉および神経に特異的なラミニン様の基底膜タンパク質であることが確認されている。この発見は、Ｓ−ラミニンの同定と関連して、種々の基底膜におけるラミニン様の分子の同定の問題を提起する。これらの発見はまた、ラミニン関連のポリペプチドの新規なヘテロトリマーの（ｈｅｔｅｒｏｔｒｉ■ｅｒｉｃ）変種が存在するかどうかの問題を提起する。発生、組織修復、神経突起の成長および癌では、基底膜が重要な役割を有するために、新しい基底膜成分を同定する必要性だけでなく、全てのラミニン関連ポリペプチドのヘテロトリマーな会合およびそれらの組織分布を確認して、その会合過程の操作を可能にする必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たす。良肌二！１本発明は、メロシンと呼ばれる精製したタンパク質であって、約８００　ｋＤａの見かけの分子量を有するものを提供する。本発明はまた、Ｍ−Ｘ−８２構造を含む実質的に純粋なヘテロトリマーのラミニンを提供する。ここで、Ｍは、メロシンのＭポリペプチドであり；Ｘは、ラミニンのＢ１鎖およびＳ−ラミニンからなる群から選択され；そして８２は、ラミニンのＢ２ｊｊｌである。本発明はまた、メロシンをコードする単離した核酸配列を提供する。本発明はさらに、抗体、ベクター、および宿主−ベクター系の使用による組換えタンパク質の発現を提供する。本発明はまた、神経突起の成長を促進するためのメロシンの使用を提供する。

【１東ｉ星工笠■ 図１は、メロシンｃＤＮＡの一部のＤＮＡ配列、およびその推定アミノ酸配列を示す。可能性のあるトグリコシル化部位は（ム）により示され、システィンは丸で囲まれている。アミノ酸を配列決定することにより得られた配列は、アンダーラインされている。アミノ酸配列内の保存されたモチーフは、枠で囲まれている。図２は、点マトリックスプロットによる、メロシンのアミノ酸配列と、マウスのラミニンＡ鎖のＣ０ＯＨ末端部分との比較を示す。配列は、Ｍｉｃｒｏ　Ｇｅｎ１ｅマトリツクス比較プログラムを用いて、比較された。最低で４０％が一致する８個のアミノ酸について、枠組が設定された。図３は、ペプチド抗血清を用いた胎盤抽出物のイムノプロットを示す。胎盤のＮａＤｏｄＳＯ４抽出物（レーン１）、および胎盤のヘフシン消化物からのメロシンの精製したフラグメント（レーン２）を、ＮａＤｏｄＳＯ４の存在下にて、２〜１６％の勾配のアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。（ａ）のプロットは、図１の残基４７５〜４８８に相当する１３−アミノ酸ペプチドに対するペプチド抗血清で染色した。（ｂ）のプロットは、メロシンのＣ０ＯＨ末端フラグメントを識別するモノクローナル抗体で染色した。比較のため、マウスのラミニンのプロットは、抗ラミニン（Ｃ）で染色した。先頭の印は、分離したゲルの先端の位置を示し、数字は分子量マーカーの位置を示す（ｋＤａ）。図４は、胎盤に由来の完全なメロシンの分析を示す。Ａ：ラットのラミニン（レーン１）およびヒトの胎盤に由来のメロシン含有画分（レーン２）のＮａＤｏｄＳＯａ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。分子量マーカーの位置は、左に示されている。Ｂ：メロシン含有試料のロータリーシャドウインク後ノ電子顕微鏡写真。Ｃ：メロシン含有試料でコートされたマイクロタイターウェル、およびラミニンの大きなペプシン消化フラグメントでコートされたウェルでのＥＬＩＳＡ、抗体は、３Ｅ５（震；抗−Ｂｌ）　、２Ｅ８　（・；抗−８２）　、ｌＩＤ５　（△；抗−Ａ）および２Ｇ９（ム；抗−メロジン）であった。図５は、（３５−Ｓ）メチオニンでインキュベートしたＪＡＲ絨毛癌細胞の馴化培地に由来の免疫沈降反応を示す。用いた抗体は、２Ｅ８抗−８２（レーン１　）　、　４Ｅ１０抗−８１（レーン２）、４Ｃ７抗−Ａ（レーン３）、２Ｃ４抗 −Ｂ（レーン４）、ＩＦ５および１１Ｄ５抗−Ａ（レーン５〜６）、ＩＦ９抗− Ｍ（レーン７）、および対照３Ｅ１（抗−インテグリンβ４、レーン８）であった。７％のアクリルアミドゲルが、還元条件下にて使用された。図６は、ラミニンＡｍ（抗−４０７；左側のパネル）またはメロシンＭ鎖（抗− ５Ｈ２；右側のパネル）に対するモノクローナル抗体を用いた、組織切片の間接免疫蛍光分析である。ＡおよびＢは、成体ウサギの舌である。うｐは表皮、ｄｅは真皮、ｍｕは筋肉である。ＣおよびＤは、成体ウサギの心臓である。ＥおよびＦは、ヒトの腑帯である。Ｓ１１は平滑筋、ｃｔは結合組織である。ＧおよびＨは、１歳半の幼児の足指の組織である。矢印は、４個の異なる末梢神経を示す。■およびＪは、ヒトの胎膜である。ａ＋ｎは羊膜、ａｈは絨毛膜、ｆｔは中間栄養芽層である。Ｂａｒは５０μｍである。図７は、筋腿結合部位におけるラミニンおよびメロシンの免疫蛍光分析である。１歳半の幼児の足指の筋肉の切片を、間接免疫蛍光法にて、モノクローナル抗体で染色した。Ａは抗−Ｍ　（５Ｈ２）　、Ｂは抗−Ａ　（４Ｃ７）　、Ｃは抗− Ｂｌ　（４Ｅ１０）、Ｄは抗−Ｂ２　（２Ｅ８）　、　Ｄは抗−Ｓ　（Ｃ４）である。肛は筋肉、ｔｅは腿、二重矢印は筋腿結合部位を示す。Ｂａｒは５０μｍである。図８は、胎盤のラミニンおよびメロシンのサブユニットの免疫蛍光分析を示す。末端の胎盤絨毛の切片を、間接免疫蛍光分析にて、モノクローナル抗体で染色した。Ａは抗−Ａ（４０７）、Ｂは抗−Ｂｌ　（４ＥＬＯ）　、Ｃは抗−Ｂ２　（２Ｅ８）　、Ｄは抗−Ｍ’（５ＥＩ２）　、Ｄは抗−５（Ｃ４）である。Ｂａｒは５０μｍである。図９は、Ｓ　（Ｃ４）　、Ｂｌ　（３ＥＳ）　、Ｂ２　（２Ｅ８）およびメロシンＭ鎖（５Ｈ２）の８０　ＫＤａフラグメントに対する抗体と、単離した完全なメロシンとのイムノプロットである。図１０は、ＥＬＩＳＡにより測定したアフィニティー精製の試料におけるラミニン関連ポリペプチドの定量分析を示す。ヘテロトリマーのタンパク質を、４Ｅ１０抗−Ｂ１セファロース（Ｂｌ、　縞状カラム）　、４Ｃ７抗−Ａセファロース（Ａ、点状カラム）および５Ｈ２抗−Ｍセファロース（Ｍ、白色カラム）のいずれかにて、アフィニティークロマトグラ１イーにより、胎盤のペプシン消化物から単離した。タンパク質はまた、５Ｈ２抗−Ｍセファロース（Ｍ−Ｂｌ、黒色カラム）上にて、抗−８１反応性物質から取り除かれた消化物から単離した。マイクロタイターウェルを、およそ１Ｍｇ／ｍｌの各試料でコートした。試料中の異なるサブユニットの相対量は、抗体Ｃ４（抗−３）、４Ｅ１０（抗−Ｂｌ）　、２Ｅ８　（抗−８２）　、１１Ｄ５　（抗−ＡＱ）および２Ｇ９（抗−Ｍ）とのインキュベージコン後、決定した。結合抗体は、アルカリホスファターゼで標識した抗−マウスＩｇＧとのインキユベーションおよび結合酵素活性（Ｅ　４０５）の測定後に決定した。図１１は、種々のタイプの細胞上のインテグリンレセブターの相対量、およびメロシンおよびラミニンに対する各細胞タイプの結合活性を示す。図１２は、完全なメロシン（ａ）、およびＭ鎖の球状のＣ−末端ドメインの最後に２個の反復単位を含有する、メロシンの５５ｋＤフラグメント（ｂ）のヘパリンセファロースクロマトグラフィーを示す。０．０５Ｍ）リス［ｌＣＬ　ｐＨ７，５のヘノｆリンカラム１こ試料を入れ、０．０５Ｍ）リス緩衝液中の０．５Ｍ　ＮａＣ１で、結合タンパク質を溶出させた（矢印）。差込み部分は、分画後のタンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１３は、インテグリンβ１に対する抗体による、メロシンおよびラミニンによる神経突起の成長の阻害を示す。ＪＧ２２抗体く黒丸）または対照抗体（白丸）の腹水を、メロシン（実線）またはラミニン（点線）で処理した細胞で滴定し、そしてインキュベートした。神経突起を有する二ニーロンの割合は、図３と同様に算出した。図１４は、ＲＮ２２ラミニン様タンパク質のイムノプロットを示す。ＲＮ２２ヌードマウスの腫痛に由来の一部精製したタンパク質を、２〜１６％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、そして抗−ラットＬ２ラミニン、抗−３００ｋＤ心臓ラミニンまたはＭ鎖（ａ−８０Ｋ）のＣ末端フラグメントに対する抗血清を用いてインキュベートした。イムノペルオキシダーゼ法により、結合抗体を検出した。図１５は、ヒト胎盤（ｕｇ）およびラット骨格筋（ｕｇ）に由来のＲＴ−ＰＣＲ，ａ、　ＲＮＡを逆転写し、メロシンブライｖ−（Ｍ）またはラミニンプライマー（Ｌ）で増幅した生成物のアガロースゲルを示す。ラット神経鞘１１１２Ｎ２２細胞およびラット卵黄嚢腫瘍細胞Ｌ２に由来のす、　ＲＮＡは、同様に、ＲＴ −ＰＣＩＩＩに懸けられる。良豆旦１皿ユ■里本発明は、メロシンと呼ばれる新規なタンパク質を提供し、これは、構造的にラミニンと関連している。このタンパク質は、約８００　ｋＤａの見かけの分子量を有し、３００　ｋＤａ、　２００　ｋＤａ。２００　ｋＤａおよび８０　ｋＤａの見かけの分子量を有する４個のポリペプチドから構成される。３００　ｋＤａのポリペプチドは、ジスルフィド結合により、２００　ｋＤａのポリペプチドと結合しており、そして３００　ｋＤａおよび８０　ｋＤａのポリペプチドは、実質的に、図１に示すアミノ酸配列を有する。メロシンは、胎盤、槙紋筋、末梢神経、栄養芽層およびヒトシニクン細胞新生物で発見されている。本発明はまた、ラミニンの新規なヘテロトリマーの変種、およびこのような変種の単離方法を提供する。この新規なヘテロトリマーの変種は、Ｂ１ポリペプチドまたはＳ−ラミニンと関連したＭ鎖ポリペプチド、およびＢ２鎖ポリペプチドから構成される。このような変種は、異なるそして時には、相互に排他的な組織分布を示す。各変種は、組織から単離され、そして細胞接着過程の研究に用いられ得る。メロシンの生物学的機能またはラミニンヘテロトリマーの変種の全てのサブユニットの生物学的機能を破壊せず１こ、一定の変更が行われ得、そして活性を示すには、全体の一次構造の一部だけが必要であることが分かる。例えば、本発明のメロシンタンパク質は、図１に示される配列と実質的に類似のアミノ酸配列を有するが、しかし、その活性を損なわな０ようなこの配列の僅かな変更もまた、メロシンの定義に入り、そのように請求項に記載のタンノイク質の定義に含まれる。さらに、図１の配列のフラグメントまたはその変種のサブユニットのフラグメント（これには、全体のタン７−ｃり質の機能を保持している前記８０　ｋＤフラグメントは含まれな（１）ζよ、この定義に含まれる。第一級アミノ酸の僅かな変更の結果、図１で示した配列と比較して、またはヘテロトリマーの変種に対して定義のように、実質的に同じ機能を有するか、またはさらに高い機能を有するタンパク質が生じ得ることも分かる。これらの変更は、例えば、部位特異的変異誘発によって計画的に行われか、または例えば、メロシン生産者である宿主における突然変異によって、偶然に起こり得る。これらの変更は、全て、メロシンの生物学的な機能が保持されている限り、ここに含まれる。さらに、種々の分子がメロシンに結合し得、それには例えば、他のタンパク質、炭水化物または脂質がある。このような変更は、メロシンの定義に含まれ、そしてヘテロトリマーの変種の定義に含まれる。「精製した」とは、メロシンの状態を記述するのに用いられるとき、その未変性の環境にて、通常、メロシンと会合しているかまたはメロシンを生じる他のタンパク質および分子の一部を含まないタンパク質を表す。「実質的に純粋な」との用語は、ヘテロトリマーのラミニン変種の状態を記述するのに、本明細書および請求項で用いるとき、実施例ＩＶに記述の実験操作により得られるレベルと実質的に等しい純度レベルを表す。この実施例は、ラミニン族の一部ではないタンパク質、または自然環境にて、これらのタンパク質と普通に会合した他の物質を実質的に含有しない純度レベルを示す。特定のヘテロトリマーの変種はまた、本明細書および請求項で参照されるとき、他の変種を実質的に含有しない。例えば、実質的に純粋なヘテロトリマーの変種Ｍ−Ｓ−８２とは、自然に会合した非ラミニン群のタンパク質だけでなく、ラミニン族の一部であるＭ−Ｂｌ−Ｂ２、Ａ−Ｂｌ−Ｂ２およびＡ−３−８２を実質的に含有しないことを意味する。本明細書および請求項で用いられるとき、「ヘテロトリマーのラミニン変種」との用語は、ラミニン関連のポリペプチドから構成されるヘテロトリマーの構造を表し、ラミニンＢ２およびＳ−ラミニンと組み合わせて、ラミニンＡ鎖ポリペプチドまたはメロシンＭ鎖ポリペプチドのいずれかを含有する。あらゆるこのポリペプチド鎖の機能的なフラグメントは、ヘテロトリマーの変種の機能的なフラグメントと共に、含まれる。本明細書および請求項で用いられるとき、「メロシンＭ鎖」または「Ｍ鎖ポリペプチド」とのＦｆＩ語は、図１で記述のメロシンの大きな３８０　ｋＤサブ二ニレットと実質的に等しいポリペプチドを表す。本明細書および請求項で用いられるとき、「Ｓ−ラミニン」または「Ｓ鎖」との用語は、Ｈｕｎ　ｔｅｒらのＮａｔｕｒｅ、３３８：　２２９−２３４（１９８９）に記述の１９０　ｋＤラミニン関連のポリペプチドを表し、その内容は、本明細書に参考として援用されている。本明細書および請求項で用いられるとき、「ラミニンＢ２Ｊまたはｒ　Ｂ２ｆｌｉポリペプチドＪとの用語は、Ｐｉｋｋａｒａｉｎｅｎらのｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：　６７５１．（１９８８）に記述のラミニンの２００　ｋＤサブユニットを表し、その内容は、本明細書に参考として援用されている。本明細書および請求項で用いられるとき、「ラミニンＢＩＪまたはｒＢ１鎖ポリペプチド」との用語は、Ｐｉｋｋａｒａｉｎｅｎらのｊ、　Ｒｉａｌ、　ＣｈｅＩＮ、　２５２：　１０４５４−１０４５２（１９１１７）ｉ：記述のラミニンノ２００　ｋＤサブユニットを表し、その内容は、本明細書に参考として援用されている。本明細書および請求項で用いられるとき、「選択的な免疫反応性」との用語は、その抗体が選択的な免疫反応性を有するようなポリペプチド以外のラミニン関連ポリペプチドと反応しないかまたは反応させ得ない抗体または抗体フラグメントを表す。選択的な免疫反応性には、従って、結合特異性、親和性および結合活性が含まれる。」　「単離した」とは、核酸でコードしたメロシンの状態を記述するのに用いるとき、自然環境にて、核酸と会合しているかまたは核酸を生じる分子の少なくとも一部を含有しない核酸を表す。「組換え発現ベクター」には、そこに含まれるＤＮＡ配列を発現できるベクターが含まれ、この場合、このような配列は、その発現を生じ得る他の配列と機能するように連結している。これらの発現ベクターは、エピゾームとしてか、または染色体ＤＮＡの肝要な部分としてのいずれかで、宿主生物内にて、複製可能でなければならないことが示唆されるが、必ずしも明白には断定できない。要するに、「発現ベクター」とは、機能的な定義であり、そこに配置された特定のＤＮＡ配列の発現を生じ得るいずれのＤＮＡ配列も、それが特定の配列に適用されるとき、この用語に包含される。一般に、組換えＤＮＡ方法で有用な発現ベクターは、しばしば、環状二本鎖ＤＮＡループである「プラスミド」の形状であり、このＤＮＡのループは、ベクター形状では、染色体には結合していない。本明細書では、「プラスミド」および「ベクターｊは、プラスミドが最も普通に用いられるベクター形状であるため、交換可能に用いられる。しかしながら、本発明は、等しい機能を担い、そして当該技術分野で後に周知になった他の型の発現ベクターも包含することを意図している。「宿主ベクター系」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質移入された細胞を示す。本明細書および請求項で開示のベクターおよび方法は、広範囲の原核生物および真核生物の宿主細胞での使用に適当である。基礎技術を行うための定義および方法および手段で本発明に含まれるものが記述されている分子生物学の標準教本を参考に挙げる。例えば、ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏ　ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ’　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｒ＋ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）、および本明細書で引用されている種々の参考文献を参照せよ。この参考文献および引用された文献の内容は、本明細書に参考として援用されている。さらに、当業者が現在使用している組換えＤＮＡ方法は、オリゴヌクレオチドの合成と組み合わせたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣｌｌ）を含み、この反応は、ＤＮＡ配列の復製を容易にする。およそ６０００塩基対までの長さのＤＮＡセグメントは、１個程度の遺伝子コピーから始まって、ＰＣＨによって指数関数的に増幅され得る。この技術では、変性したＤＮＡ試料は、新しい相補鎖をＤＮＡポリメラーゼに依存して合成させる２個のオリゴヌクレオチドブライマーとともにインキュベートされる。複数サイクルの合成は各々、標的配列の量をほぼ２倍にすることができる。各サイクルは、ＤＮＡ鎖を変性できるように温度を変え、プライマーをアニーリングし、そして新しいＤＮＡ鎖を合成するように、制御される。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、各サイクルに新しい酵素を加える必要がなくなり、それゆえ、完全に自動化したＤＮＡ増幅が可能になる。２５サイクルの増幅サイクルにより、標的配列の量は、およそ１０６倍に増加する。このＰＣＲ技術は、米国特許第４．６８３．１９５号、第４．１１００．１５９号、第４．７５４．０６５号および第４．６８３．２０２号の題材であり、これらの全ての内容は、本ＦｉＪＩＩｌＩＩ書に参考として援用されている。本発明と関連して、図１で示したｃＤＮＡまたはその一部は、当該技術分野で周知のように、所望の配列をＰＣＢで増幅し、それを適当なベクターにクローニングすることにより、クローニング目的および発現目的に再生され得る。細胞中の核酸またはタンパク質の存在を検出する方法には、核酸プａ−ブと細胞の核酸とのハイブリダイゼーシ運ン、およびポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で細胞染色することが包含される。このような技術は、当業者に周知の方法により行われる。メロシンに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法に従って、調製した。これらの抗体の特異性は、胎盤抽出物のエンザイムイムノアッセイおよびイムノプロットを行うことにより、検出される。モノクローナル抗体は、当該技術分野で周知のように、タンパク質を含有する物質（例えば、ヒト胎盤組織の抽出物）で動物を免疫し、続いて、抗体形成ハイブリドーマ細胞を単離することにより、調製される。（例えば、ＨａｒｌｏｔおよびＬａｎｅＳＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：　Ａ　ＬＡＢＯＬＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。ｒ、　１９８８年９および本明細書で引用されている参考文献を参照せよ；これらの全ての内容は、本明細書に参考として援用されている）。抗メロシン抗体は、栄養芽層、横絞筋およびシ二ワン細胞の基底膜にはあるが他のほとんどの組織の膜では存在しない箇所で、メロシンが局在化している組織切片の免疫蛍光分析を行うことにより、選別される。抗体の同定は、上記ポリペプチドの１種以上を解明するイムノプロット法および免疫沈降法により、確認される。適当なハイブリドーマは、精製したメロシンまたはメロシンフラグメントと反応性である。メロシンフラグメントは、図１で示すメロシンｃＤＮＡを、上記の原核発現ベクターまたは真核発現ベクターにて発現させることにより、調製し得る。他方、抗メロシン抗体は、当該技術分野で周知のように、図１で示す配列から調製される合成ペプチドまたは組換えタンパク質フラグメントで、動物を免疫することにより、調製し得る。抗体生成に適当なことが立証されている１つの配列には、図１で示すアミノ酸残基が含まれる。抗メロシン抗体は、上記のように選別される。メロシンノｃｏｏＨ末端部分は、ラミニンＡ鎖のＣ０ＯＨ末端と構造的に関連している。しかしながら、メロシンのアミノ酸配列は、マウスおよびヒトのラミニンＡ鎖の相同部分とは、それぞれ６１％および６２％異なっている。親和性で精製した抗体は、２つノハンドを染色する。このことは、メロシンベフチドが、それぞれ、　３００　ｋＤおよび８０　ｋＤの２個のフラグメントにプロセシングされたことを示唆している。メロシン間鎖に対するｃＤＮＡクローンは、メロシンに特異性でありかつ親和性で精製した抗体を用いて、ヒト胎盤ラムダｇｔｌｌ　ｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離した。２７１および２２５と呼ばれる２個のｅＤＮＡクローンは、それぞれ３．６ｋｂおよび１．７ｋｂの挿入物を有し、配列決定のために選別された。このｃＤＮＡの核酸配列決定により、３．４ｋｂの読み取り枠に続いて、１５５　ｂｐの未翻訳の３°領域が明らかとなった。このｃＤＮＡおよび推定アミ／酸配列ヲ、図１に示す。胎盤のペプシン消化物またハキモトリブシン消化物から単離したフラグメントのＮＨ２末端アミノ酸配列、およびトロンビンを用いて生成した１６　ｋＤフラグメントのＮＨ２末端アミノ酸配列（表１）は、この推定配列に含まれ、それゆえ、メロシンｃＤＮＡとしてのこのクローンが定義された。ＲＮＡプロット分析により、ヒト胎１１ＲＮＡにおける約１（ｌ　ｋｂの単一の転写物が明らかとなった。メロシンの推定部分配列には、１１３ｏアミノ酸が含まれ、可能性のある１３個のＮ〜グリコジル化部位を含有する。この配列は、約１９ｆ）個のアミノ酸からなる５個の反復単位を含む。これらの反１４１位は、保存された７個のアミノ酸配列であるＬＦＶＧＧＬＰ、またはその変種を含有する。これは、はとんどの場合グリシンを先頭として、１７−２１残基および４０−４３残基うしろにシスティンを有する。５個の反復単位のうち、平均して約２５％が一致している。周知のタンパク質を持ったメロシンのアミノ酸配列の比較分析により、マウスおよびヒトのラミニンＡ鎖との顕著な類似性が明らかとなった。データバンクの検索では、他に著しい類似は発見されなかった。メロシンの５個の反復単位はまり、ラミニアＡＭＩｉのＣｏ０Ｂ末端部分にも存在する。このメロシン配列と、マウスのラミニンＡ８Ｎの対応する部分との全体的な一致は、３９％である。さらに、悪性腫瘍は、悪性でない腫瘍に比Ｑて、僅かな量のメロシンを有することが発見された。メロシンの正確な量は、特定の腫瘍に依存し、そして本発明の教示する当業者により、決定され得る。本発明は、Ｍ−Ｘ−８２構造からなる実質的に純粋なヘテロトリ？−（７１）５！ニン変種を提供する。ここで、Ｍは、メロシンのＭポリペプチド、Ｘは、ラミニンのＢ１鎖またはＳ−ラミニンのいずれかであり、そして８２は、ラミニンの８２鎖である。本発明は、Ｍ−３−８２ヘテロトリマーの変種を含有する物質から、実質的に純粋なＭ−Ｓ−８２ヘテロトリマーの変種を単離する方法を提供する。この方法は、以下のａ）、（ｂ）、　Ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程を包含する：　ａ）８１に対する選択的な免疫活性を有する抗体を、固体担体に固定すること：（ｂ）このＭ−５−８２含有物質を、Ｂ１に対する免疫活性を有する固定化した抗体と接触させること；　（ｅ）８１に対する免疫活性を有する固定化した抗体とは結合していない物質を回収すること、ここで、回収した物質は、Ｍ−Ｓ −８２およびＡ−Ｓ−８２を含有する混合物である；（ｄ）Ｍに対する選択的な免疫活性を有する抗体を、固体担体に固定化すること；　（ｅ）Ｍに対する免疫活性を有する固定化した抗体に、この混合物を接触させること；そして（ｆ）Ｍに対する免疫活性を有する固定化した抗体と結合した物質を回収すること、ここで、回収した物質は、実質的に精製したＭ−Ｓ−８２である。本発明はまた、Ｍ −Ｓ−８２変種を単離する方法を提供する。この場合、この変種は、Ｓと免疫反応性である固定化した抗体から回収される。既に知られており本明細書および請求項で開示のラミニンヘテロトリマーおよびメロシンヘテロトリマーのうち、Ａｌｌ［またはＭ鎖のいずれかが、Ｂ鎖と会合している。これらのヘテロトリマーでは、メロシンのＭ鎖は、ラミニンのＡ鎖と相同である。これらの２個のポリペプチドはまた、同様の大きさを有する。はとんどの基底膜は、ラミニンおよびメロシンの相互発現を示し、従って、Ａ鎖含有ヘテロトリマーまたはＭ鎖含有ヘテロトリマーのいずれかを含有するが、両方は含有しない。１つの例外は、これらのポリペプチドの両方を含有する栄養芽層基底膜である。この基底膜は、栄養芽層、合胞体栄養芽層および中間栄養芽層の細胞のようないくつかの細胞のタイプを供給され得る。もう１つの例外は、筋肉および筋昶結合部位および筋反結合部位にあるシナプス基板であり、これはまた、いくつかの細胞タイプから供給され、モしてＡサブユニットおよびＭサブユニットの両方を含有する。栄養芽層基底膜およびシナプス基板以外の、組織中のＡ鎖およびＭ鎖の相互発現は、これらのサブユニットの存在に特徴のあるヘテロトリマーが、基底膜では、互いに機能的な代替物であることを示している。他方、これら２個のタンパク質は、その活性は明らかに類似しているにもかかわらず、異なる機能を有するようである。そのＳ鎖は、ラミニンのＢ１鎖およびメロシンと非常に相同である。Ａ鎖およびＭ鎖の場合と同様に、Ｓ鎖およびＢｌＭの組織分布はまた、相互的であり、はとんどの基底膜は、主として、一方または他方を含有する。このＢ２鎖は、検討した全ての基底膜で見いだされ、このことは、このサブユニットの相同物が存在しないことを示している。別の解釈では、その８２鎖を検出するのに用いられる抗体は、他の保存された領域であるＢ２様のサブユニットを識別し得るといえる。Ｓ鎖の組織分布は、はとんどの組織では、Ｍ鎖よりもＡ鎖の組織分布に対応していた。この分布は、このＳ鎖が、Ａ鎖を有するヘテロトリマーに優先的に含有されていることを示している。しかしながら、筋昶結合部位では、１つの例外が発見された。Ｍ＠およびＳ鎖は共に局在化しており、これは、Ｓ鎖およびＭ鎖の両方を含有するヘテロトリマーの変種もまた存在し得ることを示している。全部で４個のヘテロトリマーは、胎盤から単離したヘテロトリマーの分析により確認した。これらのポリペプチド成分は、旧来のラミニンであるＡ−Ｂｌ−８２鎖、最初のミロシンであるＭ−８１−８２鎖および２個のヘテロトリマーの変種含有のＳ鎖ポリペプチドから構成されるヘテロトリマーに対応していた。この２個のヘテロトリマーの変種の形状は、　Ａ−Ｓ−Ｂ２構造およびＭ−Ｓ−８２構造を有する。これらのヘテロトリマーの変種、およびそれらの抗体を利用すると、その機能的な性質の分析が可能となる。ラミニンへの細胞接着を媒介すると考えられている非常に多くのインテグリンおよび他の分子が知られている。おそら（、これらのラミニン接着分子のいくつかは、ラミニン族の個々の群または本明細書および請求項で記述の変種に特異的であり得るＯ以下の実施例は、本発明を例示するがそれを限定する意図はない。寛敷匠工ｆｉａ？：り化１製ｃＤＮ　イブ−ｆ−のスクリーニング λｇｔｌｌにおけるヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーを、ＬｅｉｖｏおよびＥｎｇｖａｌｌ　（ｆＬＩｌｌｌｉ）に記述のようにして、メロシンノ変性６ＳｋＤ牛モトリプンンフラグメントに対する、アフィニティー精製した抗体を用いて、スクリーニングした。単離したｃＤＮＡクローンは、Ａｒｇｒａｖｅｓら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５．１１８３〜１１９０（１９８７）に記述の方法に従って同定し、その内容はここに参考として援用されている。ｃＤＮＡｌの゛　およびｃＤＮＡ挿入物を、種々の制限酵素で切断し、そのフラグメントを、Ｍ１３ｍｐ１９（＋）　（Ｂａｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド）、またはＢｌｕｅｓｃｒｉ’ｐｔ　ＳＫ　Ｎ１３（＋＞　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア）のいずれかにサブクローニングした。核酸の配列決定は、デオキシアデノシン　５°−α−［３５Ｓ］チオリン酸塩（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、マサチューセッツ）およびＵＳＨのキット（Ｃ１ｅａｖｅｌａｎｄ１　オハイオ）を眉いて、Ｓａｎｇｅｒらのチェインターミネータ−法により行った。ＤＮＡ合成装置（Ａｐｌ）ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成した１５塩基のオリゴヌクレオチドブライマーを用いて、ある領域を配列決定した。配列分析は、ＭｉｃｒｏＧｅｎｉｅプログラム（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて行った。相同性の探索は、ＥＭＢＬを用０たＢｉｏｎｅｔ、　Ｇｅｎｂａｎｋ、　ＮＢＲＦ／ＰＩＲおよび５ｗ１ｓｓ−Ｐｒｏｔのデータベースを用いて行った。ンパク　の　ドＬｅｉｖｏおよびＥｎｇｖａｌｌ　（紅斑）にＳ己述のようにして、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーを用いて、ヒト胎盤のペプシン消化物から５５　ｋＤメロンンフラグメントを単離した。このメロシンのペプシンフラグメントをさらにトロンビンで消化し、そして１６　ｋＤのフラグメントを配列分析のために選別した。このメロシンフラグメントを、ＮａＤｏｄＳＯａの存在下にて、１０〜２０％の勾配のアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離し、ニフッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ボストン、マサチューセッツ）にプロットし、そしてＭａｔｓｕｄａｆｒａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６２１００３５〜１００３８（１９８７）に記述のように（その内容は、本明細書に参考として援用されている）　、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの配列分析装置で配列決定した。 ■Ａ　２０　二旦立丘クローン２２５に由来の８００　ｂｐ　ＥｃｏｔＬフラグメントを、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中で増殖し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　（Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、ニューシャーシー）のオリゴｊｌＡＷｉキットを用いて、［３２Ｐ］　ａｃＴＰで標識した。この放射線標識したプローブを、ヒト胎盤に由来のＲＮＡを含有するプロットとハイブリダイズさせた（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、カリフォルニア）。ム　ペプチド　およびイムノブロード”。２種の１３アミノ酸の長いペプチドであるＣＮＮＦＧＬＤＬにＡＤＤＫＩおよびＣ５ＩＶＤＩＤＴＮＱＥＥ［を、ｃＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列に基づいて合成した。これらのペプチドのＮ１１２末端部分にて、担体タンパク質へのカップリングを促進するために、システィンを付加した。これらのペプチドを、０°Ｓｕｌ　１１ｖａｎらのＡｎａ　１、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　上、　１００〜１０８（１９７９）　（その内容は、本明細書に参考として援用されている）に従って、ｍ−マレイミドベンシイルートヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、キーポールリンベットヘモシアニンとカップリングＩ、ｆ、　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ロックフォード、イリノイ）。得られた複合体を、完全フロインドアジュバント中で乳化し、そしてウサギに注入した。１力月および２力月後に、不完全フロインドアジュバント中の複合体による追加免疫を行った。各注射投与量は、０．５ｍｇのペプチド当Ｉであった。３回口の注射後１０日経って、採血した。得られた抗血清を、グルタルアルデヒド架橋のペプチドに対して、ＥＬＩＳＡで試験し、そしてＭＨｌのＮａＤｏｄｓｏ□抽出物および単離したタンパク質に対して、ＬｅｉｖｏおよびＥｎｇｖａｌｌ　（ｆＬｍ）に記述のようにして、イムノプロット法で試験した。メロシンｃＤＮＡのオーブンリーディングフレームの長さから、成熟メロシンポリペプチドは、胎盤抽出物中で最初に同定された８０　ｋＤフラグメントよりずっと長いことが示された。推定アミノ酸配列から、６５　ｋＤフラグメントおよび８０　ｋＤ組織ポリペプチドは、メロシンのＣ０ＯＨ末端フラグメントであることが示唆された。完全メロシンポリペプチドにはない部分は、８０ｋＤフラグメントのＮＨ２末端であると推定される推定アミノ酸の一部から、２橿の１３アミノ酸の長いペプチドを合成した後に、同定されたく図１の残基４７５〜４８８および４５７〜４６９）。これらのペプチドを用いたウサギの免疫化により、イム／プロット法では、胎盤のＮａＤｏｄＳＯ，抽出物中の約３００　ｋＤのポリペプチドを染色する抗血清が得られた。この抗ペプチド抗血清は、メロシンの８０　ｋＤまたは６５　ｋＤのＣ０ＯＨ末端フラグメントとは反応しなかった。同じ抽出物中に８０　ｋＤフラグメントが存在することは、モノクローナル抗体により明らかとなった（図３ｂ。レーン１）。固定化されたペプチド上にて、抗ペプチド抗血清からアフィニティー精製した抗体はまた、３００　ｋＤのバンドを染色した。他のペプチド抗血清および免疫前の血清は、イムノプロット法では、全く染色しなかった。これらの結果は、メロシンポリペプチドが、それぞれ３００　ｋＤおよび８０　ｋＤの２個のフラグメントにプロセッシングされたことを意味している。か゛の６　メロシンの次いで、マウス組織からのラミニンの単離にてさきに便溜した方法を用いて、メロシンを単離した（Ｐａｕｌｓｓｏｎら、Ｅｕｒ。Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６６：　１１〜１９（１９８７）：本明細書に参考として援用されている）。これらの方法は、ＥＤＴＡ含有緩衝液を用いた、基底膜に由来のラミニンの選択的な可溶化に基づいている。ヒトの胎盤を、中性緩衝液および同じＥＤＴＡ含有緩衝液で連続的に抽出したとき、メロシンの抗原活性は、主に、このＥＤＴＡ抽出物に見いだされた。メロシンであれば、４Ｍ　ＮａＣ１または４０％飽和の硫酸アンモニウムのいずれかから、沈澱され得る。セファロース６Ｂ上でゲル濾過を行うと、ボイドポリニームビークで、メロシンの抗原活性が溶出した。それはＤＥＡＥセルロースに結合し、約０．２　Ｍ　！ｆａｃＩで溶出した。図４は、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーから得たメロシン含有のピーク画分のＮ　ａＤｏｄ　ＳＯａ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動、ロータリーシャドウィング後の電子顕微鏡写真およびＥＬＩＳＡ分析を示す。この画分中の主な成分は、ゲル電気泳動で測定されるように、分子の大きさは約７００　ｋＤａであり、これは、ラットのラミニンの分子の大きさ８００　ｋＤａより僅かに小さかったく図４ａ）。メルカプトエタノールで還元した後のメロシン画分は、約５００　ｋＤａ、　３００　ｋＤａ、および１８０〜２００　ｋＤａのポリペプチドに加えて、６０〜９０　ｋＤａのある種の微少な成分を含有していた（図４ａ）。合成ペプチドの抗血清は、イムノプロット法では、６００　ｋＤａと３００　ｋＤａのバンドに結合した。メロシンのＣ０ＯＨ末端フラグメントに対する抗体は、８０　ｋＤａのバンドに結合した。このメロシン画分をさらに確認するために、ロータリーシャドウィング後の電子顕微鏡写真を用いた。マウスおよびラットのラミニンと非常に類似している十字形の像は、観察された構造のうち主なものであった（図４ｂ）。メロシンに特異的なモノクローナル抗体およびラミニンサブユニットに特異的なモノクローナル抗体を用いた、ＥＬＩＳＡによる画分の分析では、調製物は、メロシンポリペプチド鎖およびラミニンＢ１およびＢ２の軽鎖を含有していることが分かった。　ラミニン重鎮に特異的な抗体との反応性は得られなかった（図４ｃ）。ラミニンの切型のペプシンフラグメントは、ラミニン重鎮に特異的なモノクローナル抗体で単離したちのであるが、その重鎮に特異的な抗体だけでなくＢｌ鎖およびＢ２鎖に特異的な抗体とも反応した。このラミニン調製物は、メロシン抗体とは反応しなかった（図４ｃ）にれのら結果から、胎盤のＥＤＴＡ抽出物から単離した高分子量のラミニン様分子は、検出可能なラミニン重鎮を含有しないが、メロ２２重鎮と会合したラミニン軽鎖を含有していたことが分かる。支１匠ＵＬ三ヱヱ孟並メロシンの　、の　゛メロシンによる細胞接着の促進を、当該技術分野で周知であり、本明細書に参考として援用されているｇｙｌｇｖａｌ　１およびＲｕｏｓｌａｎｔｉＳＣｏｌｌａｇｅｎ　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、、３　：　３５９〜３６９（１９８３）　（この内容は、本明細書に参考として援用されている）に示されている方法により測定した。要約すると、ポリスチレンマイクロタイタブレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｒｖｉｎｅ、カリ乙オルニア）を、室温にて、３〜１６時間、ＰＢＳ中で、異なる濃度のタンパク質を１００μｌ入れたウェルをインキ二ベー卜することにより、種々のタンパク質でコートした。結合していないタンパク質は、ＰＢＳで３回洗浄することにより、除去した。ある実験では、タンパク質溶液の入ったウェルを、　３７”Ｃで空気乾燥し、次いで洗浄した。細胞をトリプシン処理して、ＥＭＥＭ中の０．５　ａ＋ｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤で洗浄した。１　重ｌのＥＭＥＭあたりおよそ２５０．０００個の細胞の１０　ｍＷ　ＨＥＰＥＳの懸濁液を調製し、すでに０．１ｍｌのＥＭＥＭを有する各ウェルに、０．１■ｌを加えた。このプレートを、次いで、空気中に１０％ＣＯ２が存在する雰囲気にて、３７℃ で３０〜９０分間インキコベートした。細胞接着は、次の方法の１種またはそれ以上により評価した：１）接着していない細胞を除去して数えた；２）接着した細胞を固定化し、トルイジンブルーで染色し、そしてＡｒｔｅｋ細胞カウンター（Ｄｙｎａｔｅｅｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ａｌｅｘａｎｄｏｒｉａ、バージニア）を用いて数えた；または３）固定され染色した細胞による吸収光を、自動ＥＬＩＳＡ読み取り装置（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。溶液中でラミニンを試験するとき、細胞を加える前に、ラミニンは、このプレート中にて、１０１Ｍ■ＥＰＥＳを含有するＥＭＥＭ中のＩ　Ｂ／ｍｌ　ＢＳＡの溶液で連続的に希釈した。すべての分析は、試料について３回行った。表１の細胞系を、メロシンに対する細胞接着について、試験した。接着が成功した場合は、「＋」で示す。接着性が良くなるほど、「＋」の数が増える。表土接着度１ｎ糸　メロシン　ラミニンＪＡＲ，絨毛癌（Ｃｈｏｒｔｃａｒｃｌｎｏｍａ＞　＋　＋　＋内皮細胞　−＋＋＋ＳＫＬＭＳ、筋肉　＋＋＋＋＋ＭＧ５３、骨肉腫　＋＋＋　＋＋＋Ｕ２５１、神経膠腫　＋＋＋　＋＋＋ＩＭＲ３２、神経芽腫　＋＋＋　＋＋＋これらの結果は、メロシンが、全てのタイプの細胞ではないが、多くの細胞の接着を促進することを示している。メロシンの　レセプター細胞のラミニンへの接着は、インテグリンタイプのレセプターであるα１βｌ、 α２β１、α３β１、およびα６β１により、主に媒介される。インテグリンがメロシンを識別できることを確認するために、異なるインテグリンを有する非常に多くの異なるタイプの細胞、メロシンおよびラミニンに対する接着性について試験した。結果を図１１に示す。Ａ２０４横紋筋肉腫は、検出可能なα１およびα２インテグリンサブユニツトを持っておらず、非常に低いレベルのα３およびα６インテグリンサブユニツトしか有していなかったため、主要な周知のラミニンレセプターには入っていなかった。これらの細胞は、試験された最も高い濃度でも、メロシンまたはラミニンのいずれとも接着しなかった。このＡ２０４ｍ胞は、高レベルのα５インテグリンサブユニツトを有しており、フィブロネクチンと非常によく接着した。ＩＭＦＩ３２細胞は、その主要なインタグリンαサブユニットとして、α１を有していた。この細胞は、メロシンおよびラミニンの両方によく接着した。ＲＤＳＵ２５１および１ＩＴ２９は、ラミニン接着性インテグリンのいくつかの αサブユニットを高レベルで有しており、また、メロシンおよびラミニンを同程度によく接着した。主要なラミニン接着性インテグリンがα２β１である内皮細胞（Ｌａｎｇｕｉｎ。ら、Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０９：　２４５５〜２４６２（１９８９）：本明細書に参考として援用されている）、およびα６β１を介してラミニンと結合する血小板（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：　４８７〜４８９（１９８８）：本明１［１書に参考として援用されている）は、ラミニンだけでなくメロシンとも結合した。それゆえ、ラミニンに対して周知の親和性を持った少なくも１種のインテグリンを有する各々のタイプの細胞に対して、メロシンの接着促進活性は、ラミニンの接着促進活性に類似していた（図１１）。この研究では、内皮細胞が、表１で示した内皮細胞と比較して、メロシンへの結合性を示した理由は、分からない。これら追加の結果は、少なくとも主要なラミニン結合性インテグリンがまた、メロシンとも結合することを示している。しかしながら、このインテグリンが、２つの分子内に含まれている類似の部位に結合するかどうかは分かっていない。メロシンは、細胞の接着だけでな（、その分散も促進する。メロシンおよびラミニンに接着した各々のタイプの細胞は、メロシン上では、ラミニン上と同じ特徴の形態を示した。この形態は、フィブロネクチンとの接着後の同じ細胞の形態とは異なっている。メロシンによる　０　の　の　Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０３：　２４５７〜２４６５（１９８６）、およびＭａｎｔｈｏｒｐｅら、Ａ　Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｍａｎｕａｌｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　５ｙｓｔｅ＋＊、　３２２〜３２６（１９８９）、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｔｓｓ、　１ｎｅ、　、この両方の内容は参考として援用されている）に示されている周知の方法により、メロシンによる神経突起の促進活性を測定した。要約すると、ふ化後８日目のひよこの毛様体神経節の神経培養物を用いた。ポリオルニチンでコートした組織培養物を入れたプラスチックウェル（直径６　ｍｍ、　９６個のウェルマイクロプレート）を、ＰＢＳ中のヒトのラミニンまたはメロシン５ μｇ　１０１１で、２〜３時間にわたり３７℃で処理した。これらのウェルを、工％ＢＳＡを含有するｌＯＯμｌのＰＢＳで１＠洗浄した。１．０００個のニューロンを含有する１００μ】の培養培地（０，５％のＢＳＡ、８　Ｘ　１０−７Ｍのインシユリン、３．３Ｘ　１０−２Ｍのグルコース、２．６Ｘ　１０−２Ｍ（７）ＮａＨＣＯ３，２Ｘ１０−３Ｍのし一グルタミン、１００μｍ　／ｍｌのペニシリン、および１００栄養単位／ｍｌの毛様体神経栄養因子を補給したダルベツコの改変イーグル基本培地）を加えた。２００μｌの２％グルタルアルデヒドを２０分間かけて添加した３時間後、培養物を固定化し、水洗し、そして水中の０．１％トルイジンで染色した。各培養条件に対し、約１５０個の二ニーロンを電子顕微鏡で観察した。二ニーロンは、神経突起全体の長さが少なくとも５０μｍであるなら、神経突起を基準にして記録した。さらに、接着用に、１００μｇ／ｍｌのポリオルニチン（ｐｏｌｙｏｒｕｉｔｈｉｎｅ）　（ＰＯＲＮ）で表面をコートした。次いで、神経突起の成長用に、２５μｇ／＋＊ｌのラミニンまたはメロシンを加えた。細胞は、７２時間にわたり、神経突起まで伸びていった。成長度を表２に示す。神経突起の成長の促進は、「＋」で示す。促進の程度が大きいほど、「＋」の数が増える。ムムニレｆｆｌ上　ラミニン　メロンンポリオルイチンなし　−−− ポリオルイチン　＋　＋＋＋　＋＋＋この結果は、メロシンが神経突起の成長の促進剤であり、それだけでラミニンと同程度に効率的であることを示してｔする。このことは、ある種の応用（臨床的な）には、メロシンは、例えば、脈管形成活性を有しないので、神経再生にはラミニンより好都合でありことを示唆して％ｚる。尖１１土■ ヒトのシュワン　におするメロシンＬ狭肚五基底膜タンパク質のメロシンおよびラミニンの発現は、一連の良性および悪性の神経鞘層、および叢状神経線維腫ζこおいて、免疫組織化学的に研究した。新鮮な組織試料を液体窒素で凍結した。メロシンおよびラミニンに対するモノクローナル抗体を、凍結切片に供し、間接イムノｌく−オキシダーゼ法または間接免疫蛍光法を用いて、組織中の２種のタンノ（り質を検出した。これらの結果は、ＬｅｉｖｏらのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　６１：　４２６〜４３２（１９８９＞に記述されて（する。この参考文献およびそこで引用された参考文献の内容は、本明細書（こ参考として援用されている。甚組１ｕ１料ヒトの神経由来の腫瘍を、ヘルシンキ大学病理学部門にて、固定することな（新鮮な状態で得た。ある場合には、組織は、フォンレクリングハウゼン（ｖｏｎ　Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｅｎ）病にかかり頬の悪性神経鞘層にかかって死んだ患者の死体解剖から手に入れた。この組織試料を液体窒素で凍結し、組織−Ｔｅｋ　ＯＣＴ　（Ｍｉｌｅｓ、　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、イリノイ）に包埋した。この凍結切片を１〜２時間にわたり空気乾燥し、そしてアセトン中に固定した。各組織試料の一部を、ヘマトキシリン−エオシンを用いた従来の組織評価用に、ホルマリンに固定し、そしてパラフィン中に包埋した。 ■ メロシンの還元しアルキル化した６５−ｋＤａポリペプチドフラグメントに対して誘起したモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体は、変性したヒトメロシンを検出し、ヒト胎盤のドデシル硫酸ナトリウム抽出物中の、　８０　ｋＤａポリペプチドをプロットした。同様の染色結果を示す抗体の以下のクローンを用いた：５Ｈ２，４Ｅ１０．２Ｇ９．４Ｂ２、ＩＦ６．２Ｅ１０および２Ｄ１ｏ０モノクローナル抗体で得た結果と同様の染色結果はまた、メロシンに対するポリクローナル抗血清を用いて、通常の組織で得られた。はとんど完全なヒトのラミニンに対するモノクローナ）Ｉ抗体ｒｔ、Ｅｎｇｖａｌｌら、庇上に記述されている。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルから移したラミニンの２００　ｋＤａ　Ｂｌ鎖をプロットするモノクローナル抗体２Ｅ８を用いた。シュワン細胞腫瘍の免疫組織化学的な特徴では、ウシＳ−１００夕″′り質（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、　Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、　デンマーク）１こ対するウサギのポリクローナル抗体を１　：　３００の希釈度で用い、そしてダリアの原繊維酸性タンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、　ヘルシンキ、フィンランド）を１：３０の希釈度で用いた。免止１監止ヱ凍結した切片は、平均１：２〜１：５の希釈度にて、ハイブリドーマ培養物で処理した。マウス−次抗体を、その切片に３０分間または一晩にわたり付与し、続いて、ビオチン処理したウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清（Ｄａｋｏ、コペンノ１− ゲン、デンマーク）とともにｌ　：　５００の希釈度でインキユベートした。最後に、結合ビオチンを、インビトロでビオチンパーオキサダーゼにアビジンを結合して（ＡＥ複合体、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）検出した。希釈度は、共に１　：　１６０であった。０．０２％過酸化水素を補給した３− アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ）を用いると、発色した。ある場合には、結合した一次抗体を間接免疫蛍光法で検出するために、フルオレセインイソチオシアネートをカップリングしたヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、リッチモンド、カリフォルニア）を用いた。メロシンの染色に対する特異性を制御するために、ノ・イブリドーマの培地に代えて、正常マウス血清（１：　１Ｇ）またはリン酸緩衝溶液を用いた。モノクローナル抗体による、ラミニンの染色に対する特異性の制御を証明した。対照実験では、著しい染色は認められなかった。イムノパーオキシダーゼ法で染色した調製物を、核が見えるように、Ｍａｙｅｒ’　ｓ　ｈｅｍａｌｕｍ　（Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｉｓｔａｄｔ、西ドイツ）で軽く対比染色した。イムノパーオキシダーゼの染色、および免疫蛍光法の試料を、エピイルミネーションを備えたＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｈｏｔの顕微鏡で観察し、写真を撮った。紘１４個のヒト神経鞘層、２個の叢状神経線維腫、および４個の悪性神経鞘層を試験した。１臣■１２個の神経鞘層は腹膜後にあり、１個は縦隔にあり、そして１個は、胃の神経鞘層の組織学的な特徴を示す、胃壁に由来するものであった。組織学的に、全ての神経鞘層は、核の中心領域が棚状配列となった比較的均一な紡錘状細胞の形態を示した。２つのケースでは、細胞領域とルース領域（ｌｏｏｓｅ　ａｒｅａ）が交互の模様を示し、それぞれ、いわゆるアントニー　（Ａｎｔｏｎｉ）　Ａ領域およびアンドニーＢ領域を表していた。３つのケースについて行った電子顕微鏡試験では、粗い小胞体の豊かな紡錘細胞が明らかとなり、これは、基底膜物質の顕著な沈澱物で覆われた多数の薄手細胞過程を示した。これらの発見は、神経鞘層の超微細構造の特徴と一致する。免疫組織学的な研究では、全ての神経鞘層は、Ｓ−１００タンパク質に強い陽性を示す。ダリアのＦｔ繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、３つのケースでは、中心に見えた。ラミニンに対する主な染色は、細胞領域では、基底膜の平行な層、および全ての血管壁の厚み全体に見られた。腫瘍のルーズで細胞の少ない領域、および血管壁のまわりにある結合組織の鞘は、免疫反応性のラミニンを含有していなかった。ベロツァイ小体を含む細胞領域は、メロシンを含有しないが、または無視できる程度の量のメロシンしか含有していなかった。しかしながら、メロシンに対する顕緒な染色は、細胞領域がルーズなストローマ領域と境界をなす界面、または細胞領域が血管隔壁と境界をなす界面に、一定して見いだされた。１太竺巨皿亘】２個の叢状神経線維騰は、フォノレタリングハウゼン病の患者の背中および縦隔の副真皮の神経幹から手に入れた。これらの腫瘍は、シュワン細胞および線維芽細胞に匹敵する波状（ｗａｖｙ）コラーゲンおよび紡錘細胞を含む、拡大した蛇行性の神経幹を表した。両方の腫瘍では、メロシンおよびラミニンは、蛇行した神経のＲ維束の輪郭を作る基底膜に沿って、線状の免疫反応性の形状で、共に局在化している。ラミニンはまた、血管壁にも見いだされた。しかしながら、メロシンはこの位置には見られなかった。１１旦坦旦亘１これらの腫瘍は、フォノレタリングハウゼン病の患者の大腿組織、腹膜後組織および頬組織の深い神経幹に由来してぃた。組繊学的に、これらは、明白な有糸分裂活性を持った悪性のハイグレート紡鍾細胞、および壊死部分の中心の領域に示された。悪性の神経鞘層は、Ｓ−；ＯＯタンパク質に対し、僅かな中心部に免疫染色を示したにすぎなかった。ＧＦＡＰに対する抗体には、染色は検出されなかった。ある腫の脈管周囲の腫瘍細胞では、ラミニン対し、僅かな中心部の染色だけがあった。しかしながら、全ての血管壁は、ラミニンに対して陽性が高かった。４個の悪性の神経鞘層のうち３個は、腫瘍細胞では、メロシンに呈する免疫染色を示さなかった。ラミニンとは対照的に、血管壁の外縁だけが一定の染色を示した。最初の神経幹の残片が顕微鏡で確認された部分では、メロシンに対する染色により、メロシンに陰性の腫瘍領域と混合した残りの正常な軸索のシュワン細胞基底膜に、輪郭が描かれた。悪性の神経鞘層を取り囲んでいる線維被膜は、メロシンに対して陰性であった。しかしながら、隣接する横紋筋組織では、基底膜はメロシンに対して陽性であった。１つのケースでは、Ｒ筋細胞の開に点状の沈澱物として、少量ではあるが一定量のメロシンが認められた。この場合、ラミニンに対する免疫染色と類似の模様が見られた。 ■ 要約すると、神経鞘層におけるメロシンの分布は、ラミニンの分布よりも限定されていた。これに対して、叢状神経線維腫では、両方のタンパク質は、同じ位置に存在していた。悪性の神経鞘層では、いずれのタンパク質の有意量も見いだされなかった。神経鞘層では、細胞のアン）　二（Ａｎｔｏｎｉ）Ａ領域の基底膜において、ラミニンに対する著しい染色が観察された。対照的に、これらの領域には、メロシンがなかった。免疫反応性のメロシンは、腫瘍細胞と血管壁との間の境界領域にて見られた。神経鞘層における２腫の基底膜タンパク質の分布の不一致は、シュワン細胞の基底膜にてメロシンとラミニンの両方が見られる正常な末梢神経の状態とは異なっている。この相違の理由は不明だが、この結果は、２腫の基底膜タンパク質の異なる生物学的な役割を反映しているかも知れない。超微細構造的には、神経鞘層の新生物性の基底膜と、シュワン細胞の周りの正常な基底膜との間には、明白な相違は存在しないように思われる。神経鞘層細胞と、非シュワン細胞の開票成分との境界部分にだけメロシンが存在することは、メロシンの発現が、開票組織または細胞外基質とのシュワン細胞の接触または相互作用により誘起され得ることを示し、比較的に分化型の腫瘍においてさえ、単離シュワン細胞によっては発現が起こらないことを示している。同じように、末梢神経のシュワン細胞には、メロシンの合成および／または沈積のために、他のタイプの神経線維束（例えば、ニューロン、神経内膜の線維芽細胞または神経層膜細胞）との相互作用が必要とされる。神経をインビトロで成育する際には、シュワン細胞の髄鞘形成および構築は、シュワン細胞と神経突起との間の相互作用に依存することが示されている。同様に、培養したシュワン細胞によるタイプＩＶコラーゲンの分、必は、神経突起との接触により調節される。叢状神経線維腫では、多量のメロシンおよびラミニンが、全く同じ位置で見いだされた。これらの新生物は、多数のシュワン細胞および神経層膜細胞だけでなく、完全な神経周膜鞘内に含まれている残留軸索を含有し、そして神経線維束を拡大する。それゆえ、おそらくメロシンの発現に必須であると思われる、比較的よく系統だてられた組織構築物が維持されている。これらの神経線維束に種々の細胞要素が存在することで、多くの細胞の接触や相互作用が可能となり、明らかに、これらのいくつかは、メロシンの分泌に必須である。本研究の悪性の神経鞘層では、メロシンおよびラミニンの両方が欠けているか、僅かに最小の発現を示す。シュワン細胞の鑑別のための免疫組織学的なマーカー（例えば、Ｓ−１００タンパク質およびＧＦＡＰ）が同時に欠けていることは、これらの腫瘍が、シュワン細胞の分化が低レベルの、神経由来の肉層であることを示唆している。神経鞘層を含めて、多くの培養ヒト細胞系を、メロシンの生合成および分泌について試験したが、細胞培養物中では、タンパク質は発見されなかった。逆に、ラミニンの生合成では、タイプＩ＋／コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびエンタフチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）が、シュワン細胞および神経鞘腫細胞の培養物中で、繰り返し認められた。さらに、固形の絨毛癌では、中間栄養芽層タイプの細胞により、メロシンが発現した。これらの細胞系はラミニンを合成したものの、培養した絨毛癌細胞系では、メロシンは検出できなかった。明らかに、新生物性の培養シュワン細胞および他の細胞は、メロシンを分泌する能力を失うが、対応する成熟細胞を特徴づける他のある橿のマトリックスタンパク質は保持している。マウスの成育過程では、誕生後においてのみ、筋肉および末檎神経において、かなりの量のメロシンが発見された。このことは、本発明の結果と共に、メロシンの発現が、分化型の正常または新生物性のシュワン細胞でのみ予測できるような成熟細胞の特徴であることを示している。（以下余白）裏Ｗ巨ラミニンＡ　に・　モノクローナル　の。本実施例は、ラミニンＡ鎖に特異的なモノクローナル抗体の生成を示し、そして実施例Ｖ−１１１で用いたラミニン関連タンパク質に特異的な他の抗体を記述する。ラミニンの精製したペプシンフラグメントに対する数種のモノクローナル抗体は、Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｊ、　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０３：　３４５７〜２４６５（１９８６）に既に記述され、本明細書に参考として援用されている。ラミニンのＢ１鎖およびＢ２鎖を認識するために、これらの抗体のうちの３個を示す：抗体２Ｅ８は、イムノプロット法では、ラットのＬ２ラミニンと交差反応し、ラットのラミニンサブユニットの最小物であるＢ２と結合する。他の２個の抗体である３Ｅ５と４Ｅ１０は、もともとＡ鎖に特異的であると考えられていたが、その後、ＢｌｊｉＩに特異的であることが分かった（Ｇｅｈｌｓｐｎら、Ｊ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈａｔ　２６４：　１９０３４〜１９０３Ｂ（１９８９）：本明細書に参考として援用されている）。他の抗体である４Ｃ７は、長し’腕（７）末端の球状ドメインに結合する。このドメインは、Ａ鎖のＣ末端部分であり、従って、この４Ｇ７抗体は、Ａ鎖に対して特異的である。しかしながら、以前には、この抗体の鎖特異性を指定することは不可能であった。この抗体が、げっ書類のラミニンと交差反応せず、イムノプロット法では作動しなかったからである。メロシンのＣ末端部分に対するモノクローナル抗体５Ｂ２および２Ｇ９はまた、Ｌａ　ｆ　ｖｏおよびｇｌｇｖａｌｌのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：　１５４４〜１５４ｇ（１９８８）に記述され、本明細書に参考として援用されている。ヒトのラミニンと交差反応する、Ｓ−ラミニンに対する２個のモノクローナル抗体であるＣ１およびＣ４もまた、知られており、）Ｉｕｎｔｅｒら、（１９８９）、庇上、に記述されている。完全なメロシンは、実施例ｒに記述のようにして単離した。要約すると、１個の末端胎盤を水洗し、５０ｍＭトリス、ｐＨ７゜４．１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、　０．１　ｍＭ　ＰＭＳＦでホモジナイズした。遠心分離後、上澄み液を捨てた。冷温室にて、トリス−ＮａＣ１−ＰＭＳＦ中の１０　ｍＭ　ＥＤＴＡの１リツトル（攪拌した）で、ベレットを一晩抽出した。遠心分離後、ＮａＣ１を５Ｍまで添加することにより、上澄み液中のメロシンを沈積させた。、１０℃で４〜２４時間後、このベレットを遠心分離により集めた。ＮａＣ１沈澱物に由来のベレットを、２０　ｍｌの０．５　Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭトリス、ｐＨ７，４に溶解し、１．．５ｍｌのゼラチン−セファロースで吸収し、そして遠心分離により清澄化した。この上澄み液を、セファロース、６Ｂを詰め５０厘Ｍトリスと１００曽Ｍ　ＮａＣ１を流した１０Ｘ８０　ａｍのカラムで分画した。７　■１の画分を集めた。ボイドボリュームで溶出したタンパク質を集めた。ラミニンおよびメロシンの大きなペプシンフラグメントは、Ｗｅｔｅｒら、ｊ、旧ｏｆ、　Ｃｈｅｗ、　２５８：　１２６５４〜１２６６Ｇ（１９８３）およびＥｎｇｖａｌｌら、Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｔｏｌ、　１０３＝　２４５７〜２４６５（１９８６）　（本明細書に参考として援用されている）に記述のように、特異抗体を用いて、モノクローナル抗体アブイニテイークロマトグラフィーにより、末端胎盤のペプシン消化物から調製した。要約すると、Ｍ鎖に特異的な抗竺にっ０て、この抗体をカラムに適用する前に、胎盤抽出物をプレーンセファロースにあらかじめ通し、次いで、ゼラチン−セファロースに通すことにより、アフィニティークロマトグラフィーを行った。このカラムを、ＰＢＳおよびＩＭＮａＣｌで洗浄し、結合した物質を、１Ｍ酢酸または４ＭＫＳＣＮで溶出した。Ａ鎖に特異的な抗体を得る目的で、新しい一組のモノクローナル抗体を生成した。そのために、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、抗Ｂ１サブユニツトに特異的な抗体により胎盤から単離したペプシンフラグメントを用いて、免疫した。免疫した肺臓細胞を、Ｈｅ５ｓｌｅらのＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、　２６：　４９〜５４（１９８４）　（本明細書に参考として援用されている）に記述のように、ポリエチレングリコールを用いて、ミエローマ細胞系ａｇ８．６５３に融合した。イムノプロット法により、ペプシンフラグメントと反応した１０個の抗体を発見した。これらの抗体は、胎盤および肋膜切片の免疫蛍光法により、特性付けされた。この免疫蛍光法は、低温装置（Ｃｒｙｏｓｔａｔ）上で切断し顕微鏡のガラススライド上に置いた凍結組織の３μｍ切片で行った。これらの切片を６０分間空気乾燥した。これらの切片を、１０分間、水冷したアセトン中に入れて固定し、次いで、ＰＢＳで洗浄した。各切片を、希釈していない培地かまたは１　：　１００の比で希釈した腹水のいずれかを用いて、約２０μｌのモノクローナル抗体によりコートした。この抗体とともに、冷却状態で、−晩インキ二べ一ションを行った。これらの切片を、次いで、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、フルオレセインで標識したヤギまたはウサギの抗マウスＩｇＧとともに、室温で２時間インキュベートした。これらの切片を、再びＰＢＳで３回洗浄し、次いで、蛍光顕微鏡で試験した。この試験では、胎盤切片において、栄養芽屡の基底膜は染色されたが血管の基底膜は染色されなかったことにより、２個の潜在的なＭ鎖抗体を同定した。他の８個の抗体は、胎盤中の、栄養芽層の基底膜と血管の基底膜の両方を染色した。これらの抗体は、Ｂ１１ｐ、　８２１ＫまたはＡ鎖に対するものと推測した。この８個の抗体がＢ鎖に特異的であることを確認するために、これらの抗体をイムノプロット法で分析した。８個の抗体のうち６１’ｌは、メロシンのＢ１鎖またはＢ２鎖のいずれかを染色した。残りの２個の抗体は、ＩＦ５および１１Ｄ５で表されるが、Ｂ鎖またはＭ鎖を染色せず、Ａ鎖に特異的な抗体であると考えられた。このＡ鎖に特異的な抗体、ＩＦ５および１１Ｄ５を、ＪＡＲ細胞培養培地に由来のラミニンに対する特異性について、免疫沈降により試験した。対照として、周知の８鎖抗体およびメロシン抗体を用いた。３５５で標識した細胞の馴化培地から、免疫沈降を行った。この馴化培地を集め、そして以下の化学物質を括弧内の最終濃度で加えた：　ＮａＣ１（Ｑ、ＳＭ）、トリス−ｆｌｃｌ。ｐＨ８，０（５０ｄ）　、ＰＭＳＦ　（０，Ｌ　＋＊Ｍ）、トリトンＸ−１００（１％）、ＥＤＴＡ　（１０ｍＭ）。免疫吸着剤を調製するために、ＰＢＳ中のプロティンＡ−セファ０−スの０．ｏ５％Ｔｖｅｅｎ　２０との５０％懸濁液１１を、マウスＩｇに対するウサギ抗血清１ｍｌとともに、室温にて１時間にわたりインキュベートした。この混合物５０μｌを、ピペットで個々のチューブに入れ、セファロースビーズを、ＰＢＳ− Ｔｖｅｅｎで１＠洗浄した。ｌｆ↓−プあたり、０．５　ｍｌのモノクローナル抗体（ハイブリドーマ馴化培地）を加え、室温で２時間にわたりインキュベートした。これらのビーズをｓ　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで再び洗浄した。次いで、各チューブに、標識した培地（１，５ｍｌを加え、２時間にわたりインキュベートした。このインキュページ嘗ン後、これらのビーズを％　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、ソシテコ（Ｄ　ヒーＸＳＯμｌ　〕５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（４％５ＤＳ１０．００１　Ｍ）リス、ｐＨ７，５，２０％グリセロール）中で沸騰させることにより、このビーズに結合したタンパク質を放出した。還元条件下にて、７％アクリルアミドゲル上で、タンパク質を分画した。これらの結果を図５に示す。眉いた抗体およびソ１７）特ｇ性１を以下＋７）ｆｉリテアル：　（１）２Ｅ８抗Ｂ２、（２）４Ｅ１（ｌ抗Ｂ１、（３）４Ｃ７抗Ａ、　（４）２Ｃ４抗Ｂ、　（５）ＩＦ５抗Ａ、　（６）１１Ｄ５抗Ａ。（７）ＩＦ９抗Ｍ、　（８）３Ｅ１抗インテグリンβ４゜これらの結果から、ＩＦ５および１１Ｄ５は、ラミニンＡ鎖および的な抗体はまた、ラミニンの３個の抗体の全てを共沈したのに対して、メロシンに特異的な抗体は共沈しなかった。ＪＡＲＩｉ胞ｉＬ　ＡＳＢｌおよびＢ２ポリペプチドのみを形成するので、そしてＩＦ５および１１Ｄ５は、ＢｌまたはＢ２に免疫反応性ではないので、これらの結果から、３個のラミニンポリペプチドの全ての共沈は、Ａ鎖に特異的な相互作用を介していることが明らかとなった。ラミニンサブユニットおよびメロシンサブユニットを局在化するために、ここで用いたこれらの抗体および他の抗体を表■に挙げる。（以下余白）表」− モノクローナル抗体の特徴の要約抗体　１ｇクラス　サブユニット特異性　種の反応性１１Ｄ５　１ｇＧＩ　Ａ　ヒト５１２　ｒｇＧＩ　Ｍ　ヒトウサギ２Ｇ９　１ｇＧＩ　Ｍ　ヒトウサギ４Ｅ１０　ＥｇＧｌ　’８１　ヒトウサギ３Ｂ５　１ｇＧＩ　Ｂｌ　ヒト２Ｅ８　１ｇＧ２３　Ｂ２　ヒトモルモット実上り１竺なる　におζるラミニンＡ　およびメロシンＭ本実施例は、ラミニンＡ鎖ポリペプチドおよびメロシンＭ鎖ポリペプチドの異なる局在化を示す。Ｍ鎖で規定されるメロシン、およびＡ鎖で規定されるラミニンの分布は、成人の骨格筋線維の基底膜において、免疫蛍光分析で評価される。メロシンは、これらの線維中に多く存在することが知られている；しかしながら、この位置のＡ鎖の分布は測定されなかった。Ａ鎖に特異的な抗体による免疫蛍光分析により、舌の筋線維基底膜では、染色が著しく欠如していることが明らかとなった（図６Ａ）。この抗体は、筋肉および真皮の血管だけでなく、表皮の基底膜を強く染色した。抗Ａ鎖抗体ＩＦ５および１１Ｄ５に加えて、先に特性付けした抗体４Ｃ７は、全てのヒト組織にて、同じ染色模様を与えた。抗体４Ｃ７は、ウサギの基底膜と交差反応する。この交差反応性により、ある実験には、さらに容易に入手できるウサギの組織を使用することが可能になった。上の結果（図６Ａおよび図６Ｂ）から、成熟筋線維の基底膜は、主として、メロシン（Ｂ鎖と会合したＭ鎖）を含有し、ラミニン（Ｂ鎖と会合したＡ鎖）をほとんどまたは全く含有しないことが証明された。を格筋の他に基底膜にもラミニンおよびメロシンが存在することも調べた（図６Ｃ−Ｊ）。免疫蛍光分析の結果、心臓では、骨格筋での発見事項と類似して、ラミニンは骨格筋には存在しないが血管に存在していることが分かった（図６Ｃ）。しかしながら、このＡ鎖は、ヒトの謄帯、サルの結腸、およびウサギの胃および膀胱に存在していたのに対して、Ｍ鎖は、これらの組織では検出されなかった（図６ＥおよびＦ）。末梢神経では、Ａ鎖の染色は神経層膜に多かったのに対して、Ｍ鎖は、主として、シュワン細胞の基底膜で発見された（図６ＧおよびＨ）。肋膜では、Ａ鎖は、羊膜および絨毛膜の全ての上皮基底膜で検出された。Ｍ鎖は、中間体の栄養芽層細胞の層においてのみ発見された（図６■およびＪ）。これらの結果から、はとんどの基底膜はＡ＠ポリペプチドまたはＭ鎖ポリペプチドのいずれかを含有するが、両方はめったに含有しないことが明らかとなる。灸嵐匠■ ラミニンＡ　およびメロシンＭ　は　１　たはＳ−ラミニン上」ｌＬＬ得ｊ。本実施例は、メロシンポリペプチドと、Ｓ−ラミニンおよびラミニンＢ２との共局在化を示す。Ｓ−ラミニンの分布は、筋肉のシナプス部位、末梢神経の神経層膜、および腎臓のある種の血管および糸球体に限定されている。これらは全て、Ａ鎖を含有するがＭ鎖は含有しない基底膜である。これらの結果から、ラミニンは、サブユニット組成Ａ−８１−８２またはＡ−Ｓ−８２を宵し得るのに対して、メロシンは、トリマー！＋ｌ−Ｂ１−８２としてのみ生じ得ることが示された。しかしながら、筋肉結合部位の基底膜は、免疫蛍光分析により測定されるように、Ｍを含有しＢ１を欠いていることが認められた（図７）。さらに、Ｍ鎖抗体で観察した染色模様の増加と同じ染色模様の増加は、Ｂ２抗体では見られたが、Ａ鎖抗体で認められなかった（図７）。しかしながら、Ｓ−ラミニンに対する抗体は、筋肉結合部位を強くかつ選択的に染色した。これらの結果は、組成Ｍ−３−８２を有する分子が、筋肉結合部位の染色模様の原因であることを証明している。爽施１ヱ■ か゛のＳ−メロシンの本実施例は、ヒトの胎盤からのラミニンヘテロトリマー変種の単離を示す。胎盤は、ラミニンおよびメロシンの両方の豊かな供給源である（　Ｎｅｗｅｒら、１９８４、ｆ）Ｊｊ４　；　Ｄｉｘｉｔ、　Ｓ、　Ｎ、、Ｃｏｎｎｅｃｔ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、　１４；　３１〜４０（１９８５）、および０ｈｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１１２：　１０９１〜１０９Ｂ（１９８３）：これらの全て＋１、本明細書に参考として援用されている）。胎盤はまた、血管系に富んでおり、多くの血管で見いだされるＳ−ラミニンを含有し得る。この組織がＳ−ラミニンを含有するかどうかを測定するために、胎盤切片を、異なるラミニンポリペプチドおよびメロシンポリペプチドに対する抗体で染色した（図８）。栄養芽層の基底膜および胎児の毛細管の基底膜の両方で、Ａ、Ｂ１およびＢ２ポリペプチドが存在して℃）だの（こ対して、Ｍポリペプチドは、栄養芽層の基底膜でのみ存在していた。このＳ−ラミニン抗体は、主として、栄養芽層の基底膜を染色することを発見した。胎盤が、サブユニット組成Ｍ−Ｂｌ−ＢＺを有するメロシンに加えてサブユニット組成Ｍ−Ｓ−８２を有するメロシンを含有するかどうかを決定するために、胎盤のＥＤＴＡ抽出物に由来の少量のメロジノを、Ｍｊｉｌに特異的な抗体上で、アフィニティークロマトグラフィーにより単離した。溶出したメロシン調製物を、ＥＬＩＳＡおよびイムノプロット法により、Ｂ１鎖、Ｂ２鎖およびＳ鎖の存在について試験した。このイムノプロットの結果を図９に示す。Ｂ１、Ｂ２およびＳに対する抗体は全て、主に、メロシン調製物中の２００　ｋＤポリペプチドと反応した。高分子量側のさらに弱いバンドは、架橋したＢ鎖を表していると思われる。抗Ｓ抗体は、２００　ｋＤ以下の領域で、他のバンドを染色した。これらの別のバンドの数および位置は、調製物によって変わるので、これらのバンドは分解生成物を表している可能性がある。Ｍ鎖の３００　ｋＤ位置および＋１０　ｋＤ位置に対する抗体は、それぞれ、３００　ｋＤポリペプチドおよび８０　ｋＤ　（図９）ポリペプチドと反応した。これらの結果は、この方法で調製したメロシンが、Ｂ１鎖ポリペプチドおよびＢ２鎖ポリペプチドおよびＳ−ラミニンを含有していたことを立証している。この結果は、ＭおよびＢ２が、Ｓ−ラミニンと会合して、ヘテロトリマー変種を形成し得ることを示している。完全なメロシンおよびラミニンの抗体アフィニティークロマトグラフィーによる単離は、非常に収率が悪いため、切型形状のメロシンおよびラミニンは、胎盤のペプシン消化物から単離した。４タイプの試料を調製した；３タイプは、それぞれ、抗Ｂ１抗体、抗Ｍ抗体および抗Ａ抗体上のアフィニティークロマトグラフィーにより得た。４番目の調製物は、抗Ｂｌカラムに繰り返し通すことによりＢ１反応性物質から除いた抽出物の抗Ｍ抗体上にて、アフィニティークロマトグラフィーにより、調製した。アフィニティークロマトグラフィーによる変種の除去および単離の順序は、逆にしてもよ（、このことは当業者に周知であることに注目するべきである。さらに、上記との異なる順序では、異なる抗体カラムが使用され得る。全てのヘテロトリマー変種を単離するのに使用できる順序および抗体カラムは、当業者に周知である。上の４種の試料は、次いで、サブユニット特異性の抗体を結合させることにより、ＥＬＩＳＡによって、異なるラミニンおよびメロノンサブユニットの存在について試験したく図１０）。ＥＬＩＳＡは、０．５Ｍの炭酸ナトリウム中のタンパク質ｌμｇ／ｍｌでマイクロタイターウェルをコートし、室温で単に吸収させることにより行った。分析前に、これらのウェルを、ＰＢＳ−〇、０５％Ｔｖｅｅｎ　２０で２回洗浄した。異なる抗体を、ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで連続して希釈し、それらを１ウエルあたり０．１ｍｌで加え、そして３７℃で２時間にわたりインキュベートした０これらのウェルを、ＰＢＳ　−Ｔｖｅｅｎで３回洗浄し、次いで、３７℃で２時間にわたり、アルカリホスファターゼで標識した抗マウスＩｇＧのＰＢＳ−Ｔｗｔｅｅｎ　１　：　１０００溶液でインキュベートした。　ＰＢＳ−Ｔｖｅｅｎで３回洗浄した後、このウェルに結合した酵素活性を測定した。酵素基質の緩衝液は以下であった＝ＩＭのジェタノールアミン緩衝液中にて１　ｍｇ／ｍｌのｐ−ＮＰＰ、　ｐＨ９，８，１ｅ＋ＭのＭｇＣｌ２゜４０５ｎ国で、発色を測定した。これらの結果から、抗Ｂ１カラム上で単離した試料には、Ｓ−ラミニンは存在しないことが分かり、このことは、上の結果（すなわち、ＳはＢ１の代わりとなり得るが、Ｂ１と同じ分子中には存在しない）を個々に裏付けている。ＡまたはＭに特異的な抗体で単離した物質は、低レベルではあるが有意なレベルのＳ−ラミニンを含有していた。Ｂ１鎖を除いた消化物から単離したメロシン調製物では、最も高いレベルのラミニンが存在していた。このＢ１鎖は、Ｂ１鎖を特別に除去していない各調製物に存在していたのに対して、Ｂ２鎖は、４種の全ての調製物にて、はぼ同じレベルで存在していた。抗Ａを単離した物質中にＭ鎖が存在しないこと、および抗Ｍを単離した試料では、Ａ鎖の量が低い量であることにより、単離手順を特定した。実ＪＬＩ上■ ヘパ１ンに・　るメロシンの　ムイオン交換クロマトグラフィーにより精製した完全なメロシンを、ヘパリンと結合し、そして０．５ＭのＮａＣ１で溶出させた（図１２）。メロシンに結合したヘパリンの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ペプチドの特徴的な型が分かった：約８０　ｋＤにある１個のペプチドは、Ｍ鎖のＣ−末端ドメインの最後の３個の反復単位を表し、約２００　ｋＤの２個のペプチドは、Ｂ鎖を表し、そして約３００　ｋＤの１個のペプチドは、Ｍ鎖のＮ−末端部分を表す。さらに、この調製物は、高分子量の架橋生成物を表すと、古われる、さらに大きなペプチドを含有していた。ラミニン中の主なヘパリン結合ドメインは、Ａ鎖のｇドメインの２個の最多Ｃ− 末端反復単位を含有するフラグメント３中に、存在している（　Ｄｅｕｔｚｍａｎｎら、Ｅｕｒ、　Ｊ−Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９１：５１３〜５２２（１９９０）　：本明細書に参考として援用されている）。メロシンの小さいペプシンフラグメントは、メロシンＭ鎖のＣ−末端の球状ドメインの５個の反復単位のうち、最後の２個のほとんどまたは全部を表しくＥｈｒｉｇら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８７：　３２６４〜３２６ｇ（１９９０）　：本明細書に参考として援用されている）、それゆえ、Ｂ３の相同物である。この小さなフラグメントもまた、ヘパシンに結合した（図１２）。胎盤由来のラミニンの大きなペプシンフラグメントは、現在では、ラミニンフラグメントとメロシンフラグメントとの混合物であることが周知であるが、ヘパリンには結合しない（Ｅｎｇｖａ　１１ら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０３：　２４５７〜２４６５（１９８５）：本明細書に参考として援用されている）。これらのフラグメントは、マウスのラミニンのヘパリンに結合していないフラグメントＥ８と同様に、反復単位４および５を欠いている。従って、反復単位４および５は、メロシンおよびラミニンの両方における、主なヘパリン結合部位を表す。Ｌ血豆」ＲＮ２　はメロシン　る以前に、ＲＮ２２の神経鞘腫細胞の馴化培地から、神経突起促進因子を同定し、単離し、そして特徴付けた。この因子は、機能的および生化学的にラミニンに類似しているが、免疫化学的には、同じではない。比較的に多量のタンパク質を間車な方法で得るために、このＲＮ２２細胞をヌードマウスに腫瘍として成育させ、そしてラミニン様のタンパク質を一部精製し、イムノプロット法で試験した。要約すると、マウス−匹あたり約百万個のＲＮ２２細胞を背中に皮下注射することにより、ＲＮ２２腫瘍をヌードマウスに形成した。２〜６週間後に、腫瘍を集めた。この腫瘍組織を正常組織から分離し、そして胎盤について上で記述のように、トリス緩衝液中でホモジナイズした。次いで、不溶の残留物を、ＥＤ丁Ａを含有するトリス緩衝液で抽出した。ラットのラミニンに対する抗体は、このＲＮ２２腫瘍抽出物にて、約２００　ｋＤの２個のバンドを検出した。これらのバンドは、このＲＮ２２腫瘍が、ラミニンＢ１およびＢ２サブユニットを形成することを示唆している（図１４）。このラットのラミニン抗体は、ＦＩＮ２２ｍ胞にて４００　ｋＤ鎖の欠損を確認するＡ鎖を検出しなかった。ヒトおよびラットのラミニンＢ２サブユニットは認職するがマウスのラミニンサブユニットは認識しないモノクロ’？／Ｌ’ｔｉＪＣ２Ｅ８ハまた、この腫瘍抽出物にて、２００　ｋＤのバンドを染色した。このことは、この８鎖が、　ＲＮ２２腫瘍源の少な（とも一部ではあるが、マウス宿主源ではなかったことを示している。ヒトのメロシンに対する３種の異なる抗血清を、ＲＮ２２タンバク質に対し、イムノプロット法で試験した。ラットの「心臓ラミニン」の３００　ｋＤ酸成分対する抗血清（Ｐａｕｌｓｓｏｎおよび５ａｌａｄｉｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４：　１８７２６〜１ｇ７３２（１９８９）：本明細書に参考として援用されている）は、現在では、メロシンのＭ鎖であることが分かっているが、抽出物中の３００　ｋＤバンドと反応しく図１３）、そしてＭ鎖配列由来の合成ペプチドに対する抗血清と反応した。メロシン間鎖のＣ末端フラグメントに対する抗血清は、Ｈ２２タンパク質の８０　ｋＤのバンドを染色した。結局、このＲＮ２２のラミニン様タンパク質は、メロシンで特徴付けられるポリペプチドを含有する。例えば、このタンパク質は、Ｂ鎖を含有し、Ｍｌｌの３００　ｋＤの大きな訃末端フラグメントおよびＭ鎖の小さなＣ−末端フラグメントを含有する。このＲＮ２２細胞がヌードマウス中で腫瘍として成長としているとき、ＲＮ２２細胞がメロシンのみを形成したとの可能性を除外するために、インビトロで培養したＲＮ２２細胞にて、メロシンｍＲＮＡの発現を、ラミニンＡｇｌｍＲＮＡの発現と比較した。Ｍ鎖およびＡ鎖のメツセージの検出には、感度のよい逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用した。Ａ鎖に特異的なプライマーは、ヒト配列とマウス配列の間で全く同一のｃＤＮＡ配列の２つの領域から選択した。マウスまたはラットのメロシン間鎖の配列は知られていないが、メロシンＭｆｆｌおよびラミニンＡ鎖のある領域では一致しているので、Ａ鎖に対して選んだものと同様にして、Ｍ鎖のｃＤＮＡ配列の対応する領域を選択した。これらのプライマーが、ラットに由来のメロンンＭ鎖のＤＮＡを増幅できるかどうかを試験するために、これらのプライマーを、まず、逆転写したヒト胎盤およびマウス筋肉ノＲＮＡの配列を増幅するために用いた（図１５）。要約すると、培養したＲＮ２２細胞から、ラットのＬ２細胞から、そして生後１２日口のラットの骨格筋から、ポリＡ＋　ＲＮＡを単離し、そしｒＲＴ−ＰＣＨニより分析した。コノＲＮＡを、Ｍ−ＭＬ’／−ＲＴ　（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド）およびランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡに転写し、そしてこのｃＤＮＡを、Ａ＋ｅｐｌｉｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｒｎｅｒ／Ｃｅｔｕｓ、　Ｅｍｖａｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア）を用いて増幅し、続いて、製造者の推薦により、９３で１分間の変性、５５で４５秒間のアニーリングおよび７２で１分間の伸展を３０サイクルかけた。これらのプライマーは、Ａ鎖のＤＮＡコーディングストランドが５’−ＡＡＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧ丁ＣＴＧＣＡＧＡＣであり、Ａ鎖の非コーディングストランドが５’　−ＴＴＡＡＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣであり、Ｍ鎖のＤＮＡコーディングストランドが５°−ＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＡＧＧＡ−３’であり、モしてＭ鎖の非コーディングストランドが５°−ＡＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＣＧ丁ＡＣＡＧＣ−３’であった。このコープインプライマーに、Ｅｃｏ　Ｒ１部位を加え、そして非コーディングブライマーにｋｐｎ　１部位を加えた。生後１２日口のラットの筋肉に由来のＲＮＡ、およびヒトの末端胎盤に由来のＲＮＡから、予想された部位のＰＣＲ生成物を検出した。この結果は、選択したプライマーが、メロシンｃＤＮＡの保存配列を表したことを示している。ラミニンに特異的なプライマーを用いると、ＰＣＢ生成物は得られなかった。この結果は、末端胎盤または生後１２日８のラットの筋肉では、ラミニンＡ鎖の発現はほとんどないことを示している。ＲＮ２２のＲＮＡを転写し増幅したとき、ラミニンに特異的なプライマーではなくメロシンに特異的なプライマーを用いると、４４７　ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られた（図１５）。メロシンプライマーではなくラミニンプライマーでラットＬ２のｃＤＮＡを増幅したときに、４００ｂｐのＰＣＲ生成物が得られた（図１５）。このことは、これらの細胞中では、メロシンではなくラミニンが発現することを立証している。これらの結果から、インビボで成育したＲＮ２２腫瘍には、検出できるＡポリペプチドがなく、インビトロで成育した細胞には、Ａ鎖の発現が欠けていることから判断されるように、ＲＮ２２細胞はラミニンＡ鎖を合成しないことが確認される。さらに重要なことには、これらの結果から、Ｒ？Ｊ２２細胞はメロシン間鎖を形成することが分かる。このＲＮ２２腫瘍は、多く（７）Ｍ鎖ペプチドを含有し、そしてＭ鎖のｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＨにより、培養細胞で検出できたからである。ＲＮ２２中のＭ鎖の合成レベルは、かなり低いと思われる。このＭ鎖は、ノーサンプロット法では検出できず、さらに感度のよいＰＣＨによってのみ検出できた。横絞筋細胞により、そしてシュワン細胞により、ラミニンではなくメロシンが形成されることは、組織中のラミニンおよびメロシンの分布、およびここで挙げたＲＮ２Ｚ細胞中のメロシンの発現から明らかである。内皮細胞および脂肪細胞は、Ａ鎖に加えて、Ａ鎖の特徴の割合を限定する方法で合成されるさらに短い鎖であり、細胞からの分泌前にＢ鎖と会合している鎖を形成する（ＡｒａｔａｎｉおよびＫｉｔａｇａｗａ％Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：　１６１６３〜１６１６９（１９８８）　：本明細書に参考として援用されている）。このより短い人様の鎖と、従来のＡ鎖およびＭ鎖の関係は不明である。本発明は、現在にて好ましい実施態様に関連して記述しているものの、本発明の精神からはずれることなく、種々の変更がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ、限定される。９（シートミルデートミートミート紳ト１Ｆ工απｅ２ｓｍｓａ　藝たｇｕｒｅ３１　２　１　２　ラミシン禰Ｒデヶドポシ−３Ｓ　七ｌフＱ′色呵　巧し２二、ンＦ’ｉｇｕｒｅ　４ＦＩＧ、　５ＦＩＧＪＲＥ　６Ｆｉｇｕｒｅ　１１Ｆｉｇｕｒｅ　１２もＦｉｇｗｅ　１３４ブＬイす斉＃当ゝＦｉｑｕｒｅ　１４Ｆ”ｉｇｕｒｅ　１５要約書本発明は、メロシンと呼ばれる、約８００　ｋＤａの見かけの分子量を有する、精製タンパク質を提供する。本発明はまた、Ｍ−Ｘ−８２構造を含む実質的に純粋なヘテロトリマーのラミニン変種を提供する。ここで、Ｍは、メロシンのＭポリペプチドであり；又は、ラミニンのＢ１５ｊｌおよびＳ−ラミニンからなる群から選択され；そしてＢ２は、ラミニンのＢ２鎖である。本発明はまた、メロシンをコードする単離した核酸配列を提供する。本発明はさらに、抗体、ベクター、および宿主−ベクター系の使用による組換えタンパク質の発現を提供する。本発明はまた、神経突起の成長を促進するためのメロシンの使用を提供する。補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法菓１８４条の８）平成４年７月３０日

Claims

【特許請求の範囲】

１．メロシンと呼ばれ、約８００ｋＤａの見掛け分子量を有し、そして３００ｋＤａ、２００ｋＤａ、２００ｋＤａおよび８０ｋＤａの見掛け分子量を有する４種のポリペプチドから構成される精製したタンパク質であって、該３００ｋＤａのポリペプチドが、ジスルフィド結合により、該２００ｋＤａのポリペプチドと結合し、そして該３００ｋＤａのポリペプチドおよび８０ｋＤａのポリペプチドが、図１で示されるアミノ酸配列を実質的に有する、精製タンパク質。
２．３８０ｋＤの分子量を有し、そして図１で示されるアミノ酸配列を実質的に有する、精製ポリペプチド。
３．請求項２に記載のポリペプチドをコードする、単離した核酸配列。
４．請求項３に記載の核酸配列であって、該配列がＤＮＡである、核酸配列。
５．請求項４に記載の核酸配列であって、該配列がｃＤＮＡである、核酸配列。
６．請求項３に記載の核酸配列であって、該配列がｍＲＮＡである、核酸配列。
７．３５５４個の塩基対を含有する、図１で同定した配列を実質的に有する、単離した核酸。
８．メロシンに対する抗体の作製方法であって、ａ）メロシンまたはそのフラグメントに対応するポリペプチドで、動物を免疫する工程、およびｂ）メロシンと反応性の抗体を集める工程、を包含する、方法。
９．請求項７に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、ａ）ＣＮＮＦＧＬＤＬＫＡＤＤＫＩ、またはｂ）ＣＳＩＶＤＩＤＴＮＱＥＥＮＩ、の配列を本質的に含有する、方法。
１０．請求項７に記載の方法により作製した抗体。
１１．メロシンの３００ｋＤポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
１２．請求項１１に記載の３００ｋＤポリペプチドと反応性の抗体。
１３．請求項１２に記載の抗体であって、該抗体がポリクローナルである、抗体。
１４．請求項１２に記載の抗体であって、該抗体がモノクローナルである、抗体。
１５．請求項３に記載の核酸を含有する組換え発現ベクターであって、該ベクターが、形質転換した宿主細胞にて、メロシンを発現し得る、組換え発現ベクター。
１６．請求項１５に記載の組換え発現ベクターであって、前記メロシンが、図１のアミノ酸配列を実質的に有する、組換え発現ベクター。
１７．請求項１５に記載のベクターが、適当な宿主細胞中に存在する、宿主−ベクター系。
１８．前記宿主が原核細胞である、請求項１７に記載の宿主−ベクター系。
１９．前記宿主が真核細胞である、請求項１７に記載の宿主−ベクター系。
２０．前記原核生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の菌株である、請求項１８に記載の原核細胞。
２１．適当な培地中に、請求項１８に記載の細胞を含有する細胞培養物。
２２．ハイブリダイゼーションを可能にする、図１の核酸の一部と充分に相補的なヌクレオチド配列を含有する、核酸プローブ。
２３．メロシンをコードする核酸細胞の存在を検出する方法であって、該方法が、請求項２２に記載のプローブを該核酸と接触させること、および該核酸に対する該プローブのハイブリダイゼーションを測定することを包含する、方法。
２４．細胞中のメロシンの存在を検出する方法であって、該方法が、請求項１２に記載の抗体をメロシンと接触させること、およびメロシンの一部に対する該抗体の結合を測定することを包含する、方法。
２５．図１の核酸の一部に対応する、核酸。
２６．細胞中の分化の程度を測定する方法であって、該方法が、該細胞により生成されるメロシンを検出することを包含し、ここで、実質的なメロシンの存在が、高度に分化した細胞を意味している、方法。
２７．腫瘍の悪性度を測定する方法であって、該方法が、核腫瘍により生成されるメロシンを検出することを包含し、ここで、メロシンが実質的に存在しないことが、悪性腫瘍を意味している、方法。
２８．メロシンの生成を誘発する方法であって、該方法が、メロシン生成細胞を、該メロシン生成細胞中にて、メロシンの生成を誘発する細胞またはマトリックスと接触させることを包含する、方法。
２９．請求項２８に記載の方法であって、メロシンの生成を誘発する前記細胞が、間充織細胞である、方法。
３０．神経突起の成長を促進する方法であって、該方法が、ニューロンを請求項１に記載のタンパク質と接触させることを包含する、方法。
３１．神経突起の成長を促進する方法であって、該方法が、ニューロンを請求項２に記載のタンパク質と接触させることを包含する、方法。
３２．神経突起の成長を促進する方法であって、該方法が、ニューロンを請求項１１に記載のタンパク質と接触させることを包含する、方法。
３３．神経突起の成長を阻害する方法であって、該方法が、メロシンを神経突起促進活性の阻害剤と接触させることを包含する、方法。
３４．神経突起の成長を促進する方法であって、該方法は、メロシンの神経突起促進活性の阻害剤と、メロシンとの結合を妨害することを包含する、方法。
３５．メロシンと結合する細胞における細胞付着を促進する方法であって、該方法が、該細胞を、メロシンまたはその細胞付着促進部分と接触させることを包含する、方法。
３６．　構造Ｍ−Ｘ−Ｂ２を含有する、実質的に純粋なヘテロトリマーの変種であって、ここで、Ｍが、メロシンのＭポリペプチドであり；Ｘが、ラミニンのＢ１鎖およびＳ−ラミニンからなる群から選択され；そしてＢ２が、ラミニンのＢ２鎖である、ヘテロトリマーのラミニン変種。
３７．ＸがＳ−ラミニンである、請求項３６に記載の実質的に純粋なヘテロトリマーのラミニン変種。
３８．ＸがラミニンのＢ１鎖である、請求項３６に記載の実質的に純粋なヘテロトリマーのラミニン変種。
３９．Ｍ−Ｓ−Ｂ２ラミニン変種を含有する物質から、実質的に純粋なＭ−Ｓ− Ｂ２ラミニン変種を単離する方法であって、該方法は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｃ）および（ｆ）の工程を包含する：（ａ）Ｂ１に選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｂ）該Ｍ−Ｓ−Ｂ２含有物質を、Ｂ１に対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と接触させる工程；（ｃ）Ｂ１に対する免疫反応性を有する該固定化した抗体とは結合していない物質を回収する工程であって、該回収した物質が、Ｍ−Ｓ−Ｂ２およびＡ−Ｓ−Ｂ２を含有する混合物である、工程；（ｄ）Ｍに対する選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｅ）Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体に、該混合物を接触させる工程；そして（ｆ）Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と結合した物質を回収する工程であって、該回収した物質が、実質的に精製したＭ−Ｓ−Ｂ２である、工程。
４０．請求項３９に記載の方法であって、Ｍに対する免疫反応性を有する前記固定化した抗体と結合していない物質が、工程（ｆ）の前に回収され、そして実質的に純粋なＡ−Ｓ−Ｂ２である、方法。
４１．Ｍ−Ｓ−Ｂ２ラミニン変種を含有する物質から、Ｍ−Ｓ−Ｂ２ラミニン変種を単離する方法であって、該方法は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程を包含する：（ａ）Ｍに選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｂ）該Ｍ−Ｓ−Ｂ２含有物質を、Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と接触させる工程；（ｃ）Ｍに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と結合している物質を回収する工程であって、該回収した物質が、Ｍ−Ｓ−Ｂ２およびＭ−Ｂ１−Ｂ２を含有する混合物である、工程；（ｄ）Ｓに対する選択的な免疫反応性を有する抗体を、固体担体に固定化する工程；（ｅ）Ｓに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体に、該混合物を接触させる工程；そして（ｆ）Ｓに対する免疫反応性を有する該固定化した抗体と結合した物質を回収する工程であって、該回収した物質が、実質的に精製したＭ−Ｓ−Ｂ２である、工程。
４２．請求項４１に記載の方法であって、Ｓに対する免疫反応性を有する前記固定化した抗体と結合していない物質が、工程（ｆ）の前に回収され、そして実質的に精製したＭ−Ｂ１−Ｂ２である、工程。