FI105276B - Diagnostinen järjestelmä, jossa käytetään peptidejä ja vasta-aineita, jotka inhiboivat verihiutaleadheesiota - Google Patents

Description

105276

Diagnostinen järjestelmä, jossa käytetään peptidejä ja vasta-aineita, jotka inhiboivat verihiutaleadheesiota Tämä hakemus on jatkoa ratkaisemattomaan US-patenttihakemukseen sarjanumero 5 070 953.

Esillä oleva keksintö kohdistuu DNA- ja yhdistelmä-DNA-molekyyleihin, jotka käsittävät DNA-sekvenssin, joka koodittaa rakennegeeniä GPIIb-raskaan ketjun (hGPIIb) sitä osaa varten, joka muodostaa antigeenideterminantin, kun verihiutaleisiin yhdistynyt GPIIb-IIIa sitoo fibrinogeenin. Esillä oleva keksintö kohdistuu 10 hGPIIb-kryptiseen determinanttipolypeptidianalogiin ja vasta-aineisiin, jotka immu-noreagoivat polypeptidianalogien kanssa.

Soluadheesio käsittää yleensä sen, että solun pintareseptorit tunnistavat spesifiset adhesiiviset proteiinit. Keksinnön mukainen erityinen mielenkiinnon kohteena oleva solun pintareseptorien laji on integriinit.

15 Hynesin, Cell, 48:549-554 (1987), mukaan integriinit ovat funktionaalisesti ja rakenteellisesti toistensa kaltainen reseptorien ryhmä, jotka ovat vuorovaikutuksessa erittäin monien ligandien kanssa, solunulkoiset matriksiglykoproteiinit, komplementti ja muut solut mukaan lukien. Integriinit osallistuvat solu-matriksi-ja solu-so-luadheesioon monissa fysiologisesti tärkeissä tapahtumissa sikiönkehitys, verenvuo-20 don tyrehdyttäminen, verisuonitukos, haavan parantaminen, immuuni-ja ei-immuu- • « « . y' nikatomekanismit ja onkogeeninen transformaatio mukaan lukien. Kaksi ihmisen ge-

• · V

neettistä sairautta, Glazmannin trombastenia ja leukosyyttiadheesiopuutos, vaikutta- ’···’ vat integriiniryhmän jäseniin.

• ·

Integriinit ovat rakenteellisesti heterodimeerisiä komplekseja, jotka koostuvat ei-ko-; 25 valenttisesti yhdistyneistä alfa- ja beta-alayksiköistä. Integriiniiyhmästä on tunnistet- • · tu ryhmiä, joita yhdistää samanlaisen beta-alyksikön läsnäolo ja kuhunkin ryhmään . · · ·. kuuluvat jäsenet erotetaan uniikkien alfa-alayksikköjensä avulla.

• * • · · • · ·

Esimerkiksi GPIIb-IIIa on ei-kovalenttinen CA^+ista riippuva heterodimeerikomp-leksi, joka koostuu alfa- ja beta-alayksiköistä. Jennings et ai., J. Biol. Chem., 30 257:10458-10466 (1982). Alfa-alayksikkö, GPIIb, koostuu raskaasta ketjusta "·] (hGPIIb), jonka suhteellinen molekyylipaino on noin 120 kilodaltonia (KDa), ja ’ noin 20 KDa:n kevyestä ketjusta (lGPIIb), jotka disulfidisidokset liittävät yhteen.

Beta-alayksikkö, GPIIIa, on noin 100 KDa:n yksiketjuinen polypeptidi. Phillips et 2 105276 ai., J. Biol. Chem., 252:2121-2126 (1977). Solun pintamolekyylejä, jotka ovat im-munologisesti sukua GPIIb-IIIa:lle, on identifioitu useissa solutyypeissä. Katso Thiagarajan et ai., J. Clin. Invest., 75:896-901 (1985); Plow et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 83:6002-6006 (1986); ja Fitzgerald et ai., J. Biol. Chem., 260:10893-5 10896 (1985).

GPIIb-lUa myötävaikuttaa verihiutaletoimintaan vuorovaikuttamalla RGB:tä sisältävien proteiinien, kuten fibrinogeeni [Bennett et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:2417-2421 (1983)], fibrinonektiini [Ginsberg et ai., J. Clin. Invest., 71:619-624 (1983)] ja von Willebrand -tekijä [Ruggeri et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 10 79:6038-6041 (1982)], kanssa ja siten se on yleisen verihiutaleadhesiivisen proteii- nireseptorin komponentti [Pytela et ai., Science, 231:1559-1562 (1986) ja Plow et ai., J. Biol. Chem., 259:5388-5391 (1984)].

Nykyinen todistusaineisto osoittaa, että GPIIb-IIIa on yksi monista adheesioresepto-reista, joissa on samanlainen beta-alayksikkö ja funktionaalinen ominaisuus, joka 15 tunnistaa tripeptidiaminohappotähdesekvenssin Arg-Gly-Asp (yksinkertaisia kirjain-symboleita käyttäen RGB). Pytela et ai., Science, 231:1559-1562 (1986) ja Ruos-lahti et ai., Cell, 44:517-518 (1986). GPIIb-IIIa:n lisäksi tämä samansukuisten reseptorien ryhmä sisältää vitronektiinireseptorin (VnR) ja fibronektiinireseptorin (FnR), jotka on eristetty luusarkoomasta [Pytela et ai., Cell, 40:191-198 (1985), Pytela et 20 ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:5766-5770 (1985) ja Sanchez-Madrid et ai., J.

Exp. Med., 158:1785-1803 (1983)].

• · * * * y ·* Näiden proteiinien samankaltaiset funktionaaliset, rakenteelliset ja antigeeniset omi- : ' ” naisuudet vihjaavat siihen, että GPIIb-IIIa ja VnR ovat adheesioreseptoriryhmän, * * * jolle on ehdotettu nimitystä "sytoadhesiini", jäseniä. Plow et ai., Proc. Natl. Acad.

·:**: 25 Sei. USA, 83:6002-6006 (1986). Sytoadhesiiniiyhmässä erilaiset alfa-alayksiköt :T: yhdistyvät yhteen yleisen tai hyvin samanlaisen beta-alayksikön kanssa saaden ai- kaan funktionaalisesti erotettavissa olevat reseptorit. Ginsberg et ai., J. Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987).

• · · , • · *·.·* On identifioitu vähintään kaksi muuta heterodimeeristen adheesioreseptorien ryh- • · · \: 30 mää, joissa on yleinen beta-alayksikkö yhdistyneenä lukuisiin erilaisiin alfa-alayksi- köihin. Yksi ryhmä on löydetty leukosyyteistä ja se on nimitetty leukosyyttiadhee-

• I

.· ·. siolajiksi ja se käsittää LFA-1 :n, Mac-1 :n, P 150,95:n. Sanchez-Madrid et ai., J. Exp.

*·’ Med., 158:1785-1803 (1983) ja Springer et ai., Ciba. Found. Symp., 118:102-126 *·* ' (1986). Toinen on laajemmalle levinnyt ja se on nimetty VLA-lajiksi, Hemler et ai., 35 J. Biol. Chem., 262:3300-3309 (1987). Kananpojassa oleva VLA-lajin beta-alayk- 3 105276 sikkö [Hemler et ai., J. Biol. Chem., 262:3300-3309 (1987)] on kloonattu ja sek-ventoitu ja nimetty "integriiniksi" [Tamkun et ai., Cell, 46:271-282 (1986)]. Kananpojan integriinin sekvenssi on samanlainen kuin GPHIa:n [Fitzgerald et ai., J. Biol. Chem., 262:3936-3939 (1987)] ja leukosyyttiadheesilajin beta-alayksikön [Kishimo-5 to et ai., Cell, 48:681-690 (1987)]. Lisäksi useiden alfa-alayksikköjen osittaiset sekvenssit osoittavat myös samankaltaisuuksia. Ginsberg et ai., J. Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987); Suzuki et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:8614- 8618 (1986); ja Charo et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:8351-8356 (1986).

Paikat GPIIb-IIIa:ssa, tai muut sytoadhesiinit, jotka ovat ratkaisevia niiden toimin-10 nalle adheesioreseptoreina ovat vielä tuntemattomia. Useat havainnot vihjaavat siihen, että funktionaalisesti merkittävä paikka GPIIb-HLssa on lähellä epitooppia, joka on määritetty monoklonaalisella vasta-aineella PMI-1. Tämä vasta-aine sitoutuu GPIIb:n raskaaseen ketjuun [Shadle et ai., J. Cell. Biol., 99:2056-2060 (1984)] ja määrittää GPIIb:n alueen, joka liittyy useisiin erilaisiin funktionaalisiin toimintoi-15 hin. Ensiksikin PMI-1 estää pestyjen verihiutaleiden adheesion kollageeniin. Shadle et ai., J. Cell. Biol., 99:2056-2060 (1984). Toiseksi tämän alueen pintaorientaatiota säätelevät kaksivalenssiset kationit, koska kalsiumin tai magnesiumin millimooliset (mM) konsentraatiot tukahduttavat PMI-1-epitoopin ilmentymisen. Ginsberg et ai., J. Clin. Invest., 78:1103-1111 (1986). Kolmanneksi tämän paikan konformaation 20 epänormaali kaksivalenssinen kationisäätely liittyy funktionaaliseen trombasteeni-seen tilaan. Ginsberg et ai., J. Clin. Invest., 78:1103-1111 (1986). Neljänneksi verihiutaleiden stimulointi 100 mikromooliseen saakka olevalla adenosiinidifosfaatilla :V: (ADP) tai epinefriinillä 1 yksikkö millilitraa trombiinia kohti, tai 50 mikrogrammaa millilitraa vasikan ihon kollageenia kohti ei nosta oleellisesti taustan yli PMI-1-vas- . ’ . 25 ta-aineiden sitoutumista verihiutaleisiin.

• · «··

Nyt on havaittu, että solun pintareseptorit, jotka ovat spesifisesti sitoneet ligandin, : voidaan erottaa ei-varatuista reseptoreista ligandi-indusoidun vasta-ainetta sitovan • « paikan (LIBS) läsnäolon avulla. Se on, että on löydetty antigeenideterminanttien luokka, jotka ilmentyvät, kun solun pintareseptori sitoo spesifisesti ligandin, mutta ' 30 joita joko ei-varattu reseptori tai ei-sidottu ligandi ei ilmennä.

• · · • · w 9

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

• I « * ( « i * • · .···. Hakemuksessa kuvataan menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen muodostamisek- « · si, joka vasta-aine immunoreagoi ligandin kanssa, joka on sitomispaikan indusoima, v ' joka on ilmennetty reseptori-ligandikompleksilla, jolloin kompleksi sisältää solun » » » • # · • · pintareseptorin ja ligandin, jotka ovat spesifisesti sitoutuneet, joka menetelmä käsit tää: 4 105276 (a) nisäkkään immunoimisen kompleksilla; (b) vasta-ainetta tuottavien solujen poistamisen immunoidusta nisäkkäästä ja solu-5 suspension valmistamisen; (c) solujen käsittelemisen transformoivalla aineella transformoitujen vasta-ainetta tuottavien solujen tuottamiseksi; (d) vaiheessa (c) käsiteltyjen solujen kloonaamisen rajoittavalla laimennuksella ku-dosviljelyväliaineessa, joka ei tue ei-transformoituja soluja, kloonattujen transfor- 10 mänttien valmistamiseksi; (e) kloonattujen transformanttien kudosviljelyväliaineen arviomisen erittyneiden vasta-ainemolekyylien toteamiseksi, jotka immunoreagoivat reseptori-ligandikomp-leksin kanssa, mutteivät immunoreagoi solun pintareseptorin tai ligandin kanssa, jos toinen on ei-sitoutuneessa muodossa; 15 (f) kloonatun transformantin valikoimisen ja kasvattamisen kudosviljelyväliaineessa tuottaen eritettyjä vasta-ainemolekyylejä; ja (g) erittyneiden vasta-ainemolekyylien keräämisen valikoidun ja kloonatun transformantin viljelyväliaineesta.

f · • I f I I < .! ' Hakemuksessa tarkastellaan myös menetelmää monoklonaalisen vasta-aineen muo- • · 20 dostamiseksi, joka vasta-aine immunoreagoi ligandi-indusoidun sitoutumispaikan • · *···* kanssa, joka on ilmennetty reseptori-ligandikompleksilla, jolloin kompleksi sisältää solun pintareseptorin ja ligandin, jotka ovat sitoutuneet spesifisesti, joka menetelmä v : käsittää: « · t · t • · · (a) hiiren immunoimisen kompleksilla; ««· 25 (b) pernan poistamisen hiirestä ja pemasolususpension tekemisen; «M • t I » (c) pernasolujen fuusioimisen hiiren myeloomasoluihin fuusiopromoottorin läsnäol- lii ' · ': lessa vasta-ainetta erittävien hybridoomien valmistamiseksi; t ·

I I

• i i t. j. (d) fuusioitujen solujen laimentamisen ja viljelemisen erillisissä koloissa väliainees- ';' sa, joka ei tue fuusioimattomia myeloomasoluja; e · · I I 1 « · 5 105276 (e) kussakin kolossa olevan supematantin, joka sisältää hybridooman, arvioimisen erittyneiden vasta-ainemolekyylien läsnäolon toteamiseksi, jotka molekyylit immu-noreagoivat reseptori-ligandikompleksin kanssa, mutteivät immunoreagoi solun pin-tareseptorin tai ligandin kanssa, jos jompikumpi on ei-sitoutuneessa muodossa; 5 (f) vasta-ainemolekyylejä erittävän hybridooman valikoimisen ja kloonaamisen; ja (g) vasta-ainemolekyylien keräämisen edellisten kloonien supematantista.

Lisäksi tarkastellaan menetelmää monoklonaalisen vasta-aineen muodostamiseksi, joka vasta-aine immunoreagoi ligandi-indusoidun sitoutumispaikan kanssa, joka on ilmennetty reseptori-ligandikompleksilla, jolloin kompleksi sisältää pintareseptorin 10 ja ligandin, jotka ovat sitoutuneet spesifisesti, joka menetelmä käsittää: (a) hiiren immunoimisen kompleksilla; (b) pernan poistamisen hiirestä ja pemasolususpension tekemisen; (c) pernasolujen fuusioimisen hiiren myeloomasoluihin fuusiopromoottorin läsnäollessa vasta-ainetta erittävien hybridoomien valmistamiseksi; 15 (d) fuusioitujen solujen laimentamisen ja viljelemisen erillisissä koloissa väliainees sa, joka ei tue fuusioimattomia myeloomasoluja; (e) kussakin kolossa olevan supematantin, joka sisältää hybridooman, arvioimisen erittyneiden vasta-ainemolekyylien läsnäolon toteamiseksi, jotka molekyylit immu-;·/ noreagoivat solunpintareseptori-ligandikompleksin kanssa, mutteivät immunoreagoi • a « 20 solun pintareseptorin tai ligandin kanssa, jos jompikumpi on sitoutumattomassa '···*. muodossa; • · : T: (f) vasta-ainemolekyylejä erittävän hybridooman valikoimisen ja kloonaamisen; ja • · • · · '* ·' (g) kloonien siirtämisen intraperitoneaalisesti hiireen; ja (h) vesivatsan tai seerumin, joka sisältää haluttua vasta-ainetta, keräämisen hiirestä.

• · · • « « « 25 Tarkastellaan myös menetelmää reseptori-ligandikompleksin läsnäolon havaitsemi- t « seksi in vivo, jolloin kompleksi sisältää solun pintareseptorin ja ligandin, jotka ovat 5,.. spesifisesti sitoutuneet, joka menetelmä käsittää vaiheet: • · · ’·* ’ a) tehokkaan määrän monoklonaalista vasta-ainekoostumusta antamisen intravenoo- » · :.’’i sisesti ihmiskohteelle, joka koostumus käsittää fysiologisesti siedettävän laimennus- 6 105276 aineen ja vasta-ainemolekyylit, jotka immunoreagoivat reseptori-ligandikompleksin kanssa, mutteivät immunoreagoi solun pintareseptorin tai ligandin kanssa, jos jompikumpi on sitoutumattomassa muodossa, ja vasta-ainemolekyylit on liitetty in vivo -indikoiviin välineisiin; 5 b) annetun kohteen ylläpitämisen ennalta määrätyn ajanjakson, joka on riittävä vas-ta-ainemolekyyleille immunoreagointiin reseptori-ligandikompleksin kanssa in vivo ja muodostamaan immuunireaktiotuotteen; ja c) minkä tahansa vaiheessa b muodostuneen immuunireaktiotuotteen läsnäolon testaamisen ja siten kompleksin kohteessa läsnäolon testaamisen.

10 Lisäksi tarkastellaan menetelmää reseptori-ligandikompleksin vaskulaarinestenäyt-teessä läsnäolon toteamiseksi, jolloin kompleksi sisältää solun pintareseptorin ja ligandin, jotka ovat sitoutuneet spesifisesti, joka menetelmä käsittää vaiheet: a) immuunireaktioseoksen muodostamisen sekoittamalla vaskulaarinestenäytteeseen monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka 15 immunoreagoivat reseptori-ligandikompleksin kanssa, mutteivät immunoreagoi solun pintareseptorin tai ligandin kanssa, jos jompikumpi on sitoutumattomassa muodossa, b) seoksen ylläpitämisen ajanjakson, joka on riittävä vasta-ainemolekyylien immu-noreagoimiselle minkä tahansa reseptori-ligandikompleksin kanssa, joka on näyt- 20 teessä läsnä ja immuunireaktiotuotteen muodostumiselle; ja • · 4 9 ’ " c) minkä tahansa vaiheessa b muodostuneen immuunireaktiotuotteen läsnäolon ha- :: vaitsemisen ja siten kompleksin näytteessä läsnäolon havaitsemisen.

• *

Toisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö tarkastelee menetelmää verihiutalei- • · · ta sisältävän vaskulaarinestenäytteen testaamiseksi verihiutaleiden läsnäolon totea- • · · 25 miseksi ilmentämällä GPIIb-IIIa-ligandikompleksi, joka menetelmä käsittää vaiheet:

IM

a) immuunireaktioseoksen muodostamisen sekoittamalla vaskulaarinestenäytteeseen :‘: tehokas määrä monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää anti-GPIIb-Uia- t / : vasta-ainemolekyylejä, jotka on tuotettu hybridoomalla PMI-1 tai PMI-2; I II I I 9 9 9 :... '· b) seoksen ylläpitämisen ajanjakson, joka on riittävä vasta-aineille, jotta ne immuno- .··.·. 30 reagoivat minkä tahansa fibrinogeeniin sitoutuneen verihiutaleen kanssa, joita on : läsnä näytteessä, ja immuunireaktiotuotteen muodostumiseksi; ja · · • · 7 105276 c) minkä tahansa vaiheessa b muodostuneen immuunireaktiotuotteen havaitsemisen.

Diagnostinen järjestelmä, joka on välinesarjamuodossa, reseptori-ligandikompleksin ; läsnäolon vaskulaarinestenäytteessä testaamiseksi sanotun kompleksin sisältäessä solun pintareseptorin ja ligandin, jotka ovat sitoutuneet spesifisesti, joka järjestelmä 5 käsittää: a) pakkauksen, joka sisältää vähintään yhden testin suorittamiseen riittävänä määränä monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka immunoreagoivat sanotun reseptori-ligandikompleksin kanssa, mutteivät immu-noreagoi solun pintareseptorin tai ligandin kanssa, jos jompikumpi on sitoutumatto-10 massa muodossa.

Diagnostinen järjestelmä, joka on välinesarjamuodossa, vaskulaarinestenäytteen testaamiseksi verihiutaleiden läsnäolon toteamiseksi ilmentämällä GPIIb-HIa-ligandi-kompleksi, joka järjestelmä käsittää: a) pakkauksen, joka sisältää anti-GPIIb-IIIa:ta määränä, joka on riittävä vähintään 15 yhden testin suorittamiseen, anti-GPIIb-IHa-vasta-aineiden ollessa tuotettu hybri-doomalla PMI-2.

Diagnostinen järjestelmä, joka on välinesarjamuodossa, veritulpan läsnäolon toteamiseksi in vitro, joka järjestelmä käsittää: a) pakkauksen, joka sisältää määränä, joka on riittävä vähintään yhden testin suorit- • · 20 tamiseen, monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää anti-GPIIb-IIIa-vas- i *' ’ ta-ainemolekyylejä, jotka on tuotettu hybridoomalla PMI-2.

· » * • · · _

Lisäksi nyt on havaittu, että verihiutale-GPIIb-IIIa-ligandikompleksit ilmentävät kahta kryptistä antigeenideterminanttityyppiä LIBS, jotka hybridoomilla PMI-1 ja • · * PMI-2 tuotetut vasta-ainemolekyylit tunnistavat. Lisäksi polypeptidi, joka kykenee * ' 25 jäljittelemään kryptistä monoklonaalisen vasta-aineen PMI1 tunnistamaa determi nanttia, on johdettu DNA-sekvenssistä, joka koodittaa GPIIb-proteiinin osaa, joka * ··· ’ muodostaa kryptisen determinantin in vivo.

* · · • a » a .' , Täten esillä oleva keksintö tarkastelee DNA-segmenttiä, joka ei käsitä enempää kuin noin 12000 nukleotidiemäsparia mukaan lukien sekvenssi, joka määrittää rakenne-30 geenin, joka koodaa GPIIb-proteiinin osaa, jossa on aminohappotähde, esitettynä \' Vi kuviossa 1, noin tähteestä 50 noin tähteeseen 140.

• · • · · 9 · · • a 8 105276

Toisessa suoritusmuodossa tarkastellaan yhdistelmä-DNA-molekyyliä, joka käsittää vektorin, joka on toimivasti kytketty DNA-segmenttiin, joka määrittää rakennegee-nin, joka koodaa GPIIb-proteiinin osaa, jossa on aminohappotähdesekvenssi, esitettynä kuviossa 1, noin tähteestä 50 noin tähteeseen 145.

5 Lisäksi tarkastellaan hGPIIb-kryptistä determinanttipolypeptidianalogia, joka ei käsitä enempää kuin noin 50 aminohappotähdettä ja joka sisältää kaavan: -PSPSPIHPAHHKRDRRQ- esittämän aminohappotähteen.

Tarkastellaan myös hybridoomia, jotka on nimetty PMI-l:ksi ja PMI-2:ksi, jotka 10 tuottavat vasta-ainemolekyylejä, jotka immunoreagoivat fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden kanssa.

Tarkastellaan monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää hybridoomalla PMI-1 tuotettuja vasta-ainemolekyylejä, ja joka immunoreagoi fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden kanssa.

15 Kuvio 1 esittää nukleotidisekvenssiä ja cDNA:n vastaavaa aminohappotähdesek-venssiä, joka koodaa GPIIb:n prekursoriproteiinin osaa, jolloin nukleotidi sekvenssi on esitetty vasemmalta oikealle ja suunnassa 5'-terminaalista 3'-terminaaliin käyttämällä yksikirjaimista nukleotidiemäskoodia esitettynä emäksien katkaisemattomi-na lineaarisina sarjoina emäksestä 1 emäkseen 1104. Aminohappotähdesekvenssi on v.: 20 esitetty vasemmalta oikealle ja suunnassa aminoterminaalista karboksiterminaaliin 11 ’ käyttäen yksikirjaimista aminohappotähdekoodia esitettynä tähteiden katkaisematto- minä sarjoina tähteestä 1 (R), joka on aminoterminaalissa, tähteeseen 227 (S), joka ·;·*: on karboksiterminaalissa.

• · · • « ·

Luentajakso on osoitettu sijoittamalla johdettu aminohappotähdesekvenssi nukleo- • · · *·'·’ 25 tidisekvenssin alle siten, että yksi kirjain, joka esittää kutakin aminohappotähdettä sijaitsee vastaavassa kodonissa ensimmäisen emäksen alla.

* * · • · • · · .···. Aminohappotähdesekvenssien GPIIb-prekursoriproteiinissa olevat sijainnit, jotka ,· , vastaavat polypeptidiä, joka on nimetty pl29- 145:ksi ja polypeptidiä, joka on ni- *; metty pl 14-156, on esitetty suurissa ja pienissä laatikoissa vastaavasti. Polypeptidi- 30 en, jotka on nimetty pl9-34:ksi ja p53-65:ksi, sijainnit on esitetty vastaavasti kak- sinkertaisella tai yksinkertaisella alleviivauksella vastaavasti. GPIIb:n kevyttä ketjua : varten ehdotetun aminoterminaalin aminohappotähdesekvenssi on esitetty pilkkuvii- • · 9 105276 valla ja nuoli tarkoittaa pilkonnan potentiaalista paikkaa GPIIb:n raskaan ja kevyen ketjun generoimista varten.

Kuvio 2 on diagrammi, joka esittää polypeptidin p 129-145 vaikutusta vasta-aineen PMI-1 verihiutaleisiin sitoutumiseen. Verihiutaleisiin sekoitettiin EDTA:a pitoisuu-5 teen 5 mM PMI-l-epitoopin täyden altistumisen hGPIIb:lle mahdollistamiseksi. Sen jälkeen verihiutaleisiin sekoitetaan erilaisia pitoisuuksia polypeptidiä p 129-149 vaihdellen 0-100 mikromooliseen (pm) ja 125j_merkittyä PMI-1-vasta-ainetta, kuten esimerkissä 9 on kuvattu. Verihiutaleisiin sitoutuneen 125i_merkityn PMI-1 :n prosenttimäärä merkittiin testiin lisättyä polypeptidipitoisuutta kohti.

10 Kuvio 3 esittää PMI-1-epitoopin esiintymistä stimuloiduilla fibrinogeeniin sitoutuneilla verihiutaleilla määritettynä kuten esimerkissä 10 on kuvattu. ^[.merkityn PMI-1 :n määrä, joka immunoreagoi fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden kanssa olosuhteissa (1) ei stimulusta, (2) stimulointi 50 μΜ ADP:llä tai (3) stimulointi 50 μΜ epenefriinillä, määritettiin ja ilmaistiin prosenttina suhteessa 125j.

15 PMI-1 :n määrään, joka on immunologisesti sitoutunut ei-stimuloituihin verihiutaleisiin 5 mM EDTA:n läsnäollessa.

Kuvio 4 on tallenneseuranta, joka esittää polypeptidien pl29-145 ja pl44-156 vaikutusta verihiutaleaggregaatioon, kuten esimerkissä 11 on kuvattu. Lineaarinen piirros on esitetty valonläpäisyn prosenttina versus aika minuutissa, jolloin 100 prosen-20 tin läpäisy osoittaa maksimaalista verihiutaleaggregaatiota. Ruutu A kuvaa verihiu-talerikkaan plasman kontrolliliuoksen (PRP) Tyrode's puskurissa valonläpäisypro-senttiä (katkoviiva) ja PRP.n, joka sisältää lisäksi 1 mM polypeptidiä p 129-145, • : ' valonläpäisyprosenttia (kiinteä viiva). Ruutu B kuvaa kontrolliliuoksen valonläpäi-

I I I

syprosenttia (katkoviiva) ja PRP:n, joka lisäksi sisältää 1 mM polypeptidiä pl44-25 156, valonläpäisyprosenttia (kiinteä viiva).

»· · · · • · · ! P> Kuvio 5 on diagrammi, joka esittää kahden erilaisen ligandi-indusoidun sitomispai- ' ’ · * kan ilmentämistä verihiutale GPIIb- mailla. Kukin LIBS indusoitiin ligandin spesifi sellä sitomisella polypeptidin muotoon, jossa on aminohappotähdesekvenssi RGDS, GPIIb-HIa-ligandi-(GPnb-polypeptidi)-kompleksin muodostamiseksi. LIBS-ilmen- • · · 30 tymisen prosenttimäärä erilaisilla polypeptidipitoisuuksilla määritettiin kuten esi- . \ : merkisssä 13 A kuvataan.

« I

A. Määrittelyt

Ml I * · ( I f ! . Aminohappo: Kaikki tässä identifioidut aminohappotähteet ovat luonnollisessa L- konfiguraatiossa. Säilyttäen standardi polypeptidinimitys, J. Biol. Chem., 243:3557- 10 105276 59, (1969), esitetään seuraavassa vastaavuustaulukossa aminohappotähteiden lyhennykset:

Vastaavuustaulukko

Symboli Aminohappo 5 1-kirjaiminen 3-kirjaiminen Y Tyr L-tyrosiini G Gly glysiini F Phe L-fenyylialaniini M Met L-metioniini 10 A Ala L-alaniini S Ser L-seriini I Ile L-isoleusiini L Leu L-leusiini T Thr L-treoniini 15 V Vai L-valiini P Pro L-proliini K Lys L-lysiini H His L-histidiini Q Gin L-glutamiini 20 E Glu L-glutaamihappo W Try L-tryptofaani R Arg L-arginiini D Asp L-asparagiinihappo N Asn L-asparagiini 25 C Cys L-kysteiini • · ·

On otettava huomioon, että kaikki aminohappotähteet on esitetty tässä kaavoilla, joi- • · · *·* ' den vasemmalta oikealle orientaatio on konventionaalisessa suunnassa aminotermi- • · naalista karboksiterminaaliin. Lisäksi pitää ottaa huomioon, että viiva aminohappo-tähdesekvenssin alussa tai lopussa osoittaa sidosta yhteen tai useampaan toiseen • · L..: 30 sekvenssiin kaikkiaan noin viiteenkymmeneen tähteeseen saakka polypeptidiketjus- • « · : : sa.

( ( c I

I f

Polypeptidi ja peptidi: Polypeptidi ja peptidi ovat termejä, joita tässä on käytetty « < · :t><: keskenään vaihtelevasti ei useamman kuin noin 50 aminohappotähteen lineaaristen .·.·. Saijojen nimittämiseksi, jotka on kytketty toinen toiseensa vierekkäisten tähteiden .·. : 35 alfa-amino-ja karboksiryhmien välisellä sidoksella. Proteiini: Proteiini on on termi, • ·« • 11 105276 jota on käytetty tässä suuremman kuin 50 aminohappotähteen lineaaristen sarjojen nimittämiseksi, jotka on kytketty yksi toiseensa kuten polypeptidissä.

Nukleosidi ja nukleotidi: DNA:n tai RNA:n monomeeriyksikkö koostuu sokeriosuu-desta (pentoosi), fosfaatista ja typpiheterosyklisestä emäksestä. Emäs on kytketty 5 sokeriosuuteen glykosidihiilen (pentoosin 1 ’-hiili) kautta ja tämä emäksen ja sokerin yhdistelmä on nukleosidi. Jos nukleosidi sisältää fosfaattiryhmän sitoutuneena pentoosin 3'- tai 5'-asemaan sitä nimitetään nukleotidiksi.

Emäspari (ep): Vetysitoutunut adeniinin (A) kumppanuus tymiinin (T) kanssa tai sytosiinin (C) guaniinin (G) kanssa kaksijuosteisessa DNA-molekyylissä.

10 Reseptori: Reseptori ja reseptoriproteiini ovat termejä, joita on käytetty tässä biologisesti aktiivisen proteiinimaisen molekyylin osoittamiseksi, joka molekyyli sitoutuu muihin molekyyleihin (tai niiden kanssa).

Ligandi ja kognaattiligandi: Ligandi tarkoittaa molekyyliä, joka sisältää rakenneosan, jonka spesifinen vuorovaikutus on sitonut erityisen reseptoriproteiinin kanssa.

15 Ligandilla indusoitu sitoutumispaikka (LIBS): LIBS on neo-antigeenideterminantti, joka on ilmennetty solunpintareseptorikomp-leksilla, mutta joka ei ole ilmennetty joko ei-varatulla reseptorilla tai ei-sitoutuneella ligandilla. LIBS voi olla joko "konformationaalinen" tai "sekventiaalinen". LIBS voi . . olla reseptorin spesifisten vaihteluiden tulos, joka on indusoitu ligandisitoutumisel- ]; ' 20 la, so. "kryptinen antigeenideterminantti", tai se voidaan muodostaa yhdistämällä re-

« I

:"[' septori- ja ligandiaminohappotähteet reseptori-ligandikontaktipaikassa.

* · • · • * · ·;··· Kryptinen antigeenideterminantti: Tarkoittaa neoantigeenideterminanttia, joka on muodostettu muuttamalla reseptoriproteiinin konformaatio- tai membraani-pinta-,·.·. orientaatiota sen kognaatti- (spesifiseen) ligandiin sitoutumisen jälkeen. Tässä kuva- 25 tut reseptoriproteiinit eivät tavallisesti ilmennä kryptistä antigeenistä proteiinia, jol-... lei reseptori ole spesifisesti sitonut ligandia.

S · • · · ·»· • t ψ · I ( ( 9 t « 9 « « • <

« I

• I « • « · · • * · • · · 9 9 · I < «

I M

• « 12 105276 B. DNA-segmentit

Elävissä organismeissa proteiinin tai polypeptidin aminohappotähdesekvenssi on sukua suoraan geneettisen koodin kautta rakennegeenin deoksiribonukleiinihappo-(DNA)-sekvenssille, joka koodaa proteiinia. Täten rakennegeeni voidaan määritellä 5 aminohappotähdesekvensseillä, so. proteiinilla tai polypeptidillä, jota se koodaa.

Geneettisen koodin tärkeä ja hyvin tunnettu piirre on sen redundanssi. Se on, useimmille aminohapoista, joita käytetään proteiinien valmistamiseen, se, että useampi kuin yksi koodaava nukleotiditripletti (kodoni) voi koodata tai tarkoittaa erityistä aminohappotähdettä. Sen tähden joukko erilaisia nukleotidisekvenssejä voi koodata 10 erityistä aminohappotähdesekvenssiä. Tällaiset nukleotidisekvenssit on katsottu funktionaalisesti ekvivalenttisiksi, koska ne voivat saada aikaan saman aminohappo-tähdesekvenssin tuotannon kaikissa organismeissa. Joskus voidaan puriinin tai py-rimidiinin metyloitu variantti liittää annettuun nukleotidisekvenssiin. Kuitenkaan tällaiset metyloinnit eivät vaikuta koodaamissuhteeseen millään tavalla.

15 Esillä olevan keksinnön mukainen DNA-segmentti käsittää rakennegeenin, joka koodittaa proteiinia, joka sisältää GPIIb:n kaltaista aminohappotähdesekvenssiä, so. GPIIb:n kaltaista proteiinia. GPIIbin kaltainen aminohappotähdesekvenssi on sekvenssi, jossa on vähintään noin 10 tähdettä, joiden sekvenssi on homologinen, edullisesti identtinen, kuviossa 1 esitetyn aminohappotähdesekvenssin osan kanssa noin 20 tähteestä 50 noin tähteeseen 227.

:.v Esillä olevan keksinnön mukainen DNA-segmentti käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa aminohappotähdesekvenssiä, esitettynä kuviossa 1, noin tähteestä 50 noin tähteeseen 145. Toisessa suoritusmuodossa tarkastellaan DNA-segmenttiä, joka si- ··· ·:··· sältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa aminohappotähdesekvenssiä, esitettynä ku- 25 viossa 1, noin tähteestä 50 noin tähteeseen 227. Tarkastellaan myös DNA-segment- . v. tiä, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa aminohappotähdesekvenssiä, esi- • · · tettynä kuviossa 1, noin tähteestä 146 tähteeseen 227. Edullinen tämän keksinnön mukainen DNA-segmentti koodittaa aminohappotähdesekvenssiä, esitettynä kuvios- • · *···* sa 1, noin tähteestä 1 noin tähteeseen 227. DNA-sekvenssi on edullisesti läsnä ko- ·♦· 7 • · *···’ 30 donien katkeamattomina lineaarisina sarjoina, jolloin kukin kodoni koodaa amino- happotähdettä, joka on löydetty edellä kuvatuista aminohappotähdesekvensseistä, ;; so. DNA-sekvensseistä, jotka eivät sisällä introneita.

Täten DNA-segmentti, joka koostuu oleellisesti nukleotidisekvenssistä, joka on esi-tetty kuviossa 1, noin emäksestä 148 noin emäkseen 435, muodostaa esillä olevan 13 105276 keksinnön erään suoritusmuodon. DNA-segmentti, joka koostuu oleellisesti kuviossa 1 esitetystä nukleotidisekvenssistä noin emäksestä 148 noin emäkseen 681, muodostaa keksinnön toisen suoritusmuodon. Esillä olevan keksinnön mukainen DNA-segmentti koostuu edullisesti kuviossa 1 esitetystä nukleotidisekvenssistä noin 5 emäksestä 1 noin emäkseen 1104.

Esillä olevan keksinnön mukainen DNA-segmentti, joka koodittaa GPIIb:n kaltaosta aminohappotähdesekvenssiä, voidaan syntetoida helposti kemiallisilla tekniikoilla, esimerkiksi Matteucci et al.:n, J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981) fosfotriesteri-menetelmällä. Koodaavaa sekvenssiä kemiallisesti syntetoitaessa voidaan tietenkin 10 tehdä mitä tahansa haluttuja muutoksia yksinkertaisesti substituoimalla sopivat emäkset niiden tilalle, jotka koodittavat luonnollista aminohappotähdesekvenssiä. Kuitenkin DNA-molekyylit, jotka sisältävät sekvenssejä, jotka ovat täsmälleen homologisia kuviossa 1 esitettyjen kanssa, ovat edullisia. Lisäksi DNA-segmentit, jotka oleellisesti koostuvat rakennegeeneistä, jotka koodittavat GPIIb:n kaltaisia pro-15 teiineja, voidaan saada yhdistelmä-DNA-molekyyleistä, jotka sisältävät näitä geenejä. Esimerkiksi plasmidityyppinen yhdistelmä-DNA-molekyyli HEL-41 sisältää kuviossa 1 esitetyn DNA-sekvenssin ja koodittaa siten kuviossa 1 esitettyä aminohappotähdesekvenssiä tähteestä 1 tähteeseen 227. Escherichia colin (E. coli), joka on transformoitu HEL-41 :llä, viljelmä on talletettu Budapestin sopimuksen vaatimusten 20 mukaisesti American Type Culture Collectioniin (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20952 heinäkuun 7:nä 1987, ja sille on annettu talletusnumero 67456.

« · • I · * « · .·/ DNA-segmentti, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa GPIIb:n kaltaista aminohappotähdesekvenssiä, voidaan valmistaa kytkemällä toimivasti (ligatoimalla) 25 sopivat restriktiofragmentit, jotka ovat peräisin edellä mainitusta talletusta plasmi- • ♦ ·1 · dista, käyttäen hyvin tunnettuja menetelmiä. Esillä olevan keksinnön mukaisilla ’ DNA-molekyyleillä, jotka on tuotettu tällä tavalla, on tavallisesti kohesiivinen ter- • · minaali, so. "ulkonevat" yksijuosteiset osat, jotka ulottuvat molekyylin kaksijuostei-sen osan taakse. Kohesiivisen terminaalin läsnäolo esillä olevan keksinnön mukai- • 30 sissa DNA-molekyyleissä on edullista.

• · « • ·

Esillä olevassa keksinnössä tarkastellaan myös edellä kuvattujen DNA-segmenttien • · •. ’ · ί ribonukleiinihappo-(RNA)-ekvivalentteja.

M» « « · f · · • · f • • 1 • · · 14 105276 C. Yhdistelmä-DNA-molekyylit

Esillä olevan keksinnön mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli voidaan tuottaa kytkemällä toimivasti vektori esillä olevan keksinnön mukaiseen DNA-segmenttiin.

Siten kuin tässä käytetään, tarkoittaa termi "vektori" DNA:ta, joka kykenee replikoi-5 tumaan itsenäisesti solussa ja johon voidaan kytkeä toimivasti toinen DNA-segment-ti, jolloin saadaan kiinnitetyn segmentin replikaatio. Vektoreita, jotka kykenevät säätämään proteiineja koodaavien geenien, joissa on GPIIb.n kaltaisia aminohappo-tähdesekvenssejä, ilmentymistä, nimitetään tässä "ilmentymisvektoreiksi". Täten yhdistelmä-DNA-molekyyli (rDNA) on hybridi-DNA-molekyyli, joka käsittää vähin-10 tään kaksi nukleotidisekvenssiä, joita ei tavallisesti löydetä luonnosta yhdessä.

Vektorin, johon esillä olevan keksinnön mukainen DNA-segmentti kytketään toimivasti, valinta riippuu suoraan, kuten alalla hyvin tiedetään, halutuista funktionaalisista ominaisuuksista, esim. proteiinin ilmentymisestä, ja transformoitavasta isäntä-solusta, ja nämä ovat alalla luontaisia rajoituksia konstruoitaessa yhdistelmä-DNA-15 molekyylejä. Kuitenkin tässä keksinnössä tarkasteltu vektori kykenee vähintään säätämään sen geenin replikaatiota ja edullisesti myös ilmentymistä, joka koodittaa proteiinia, jossa on GPIIb:n kaltainen aminohappotähdesekvenssi sisällytettynä DNA-segmentteihin, joihin se on toimivasti kytketty.

j Edullisissa suoritusmuodoissa sisältää keksinnön tarkastelema vektori prokaryootti- j 20 sen replikonin, so, DNA-sekvenssin, joka kykenee replikoituinaan suoraan itsenäi- - sesti ja ylläpitämään yhdistelmä-DNA-molekyylin ekstrakromosomaalisesti proka- ryoottisessa isäntäsolussa, kuten bakteeri-isäntäsolussa, joka on transformoitu sillä.

: Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja. Lisäksi ne suoritusmuodot, jotka si- • · · sältävät prokaiyoottisen replikonin, sisältävät myös geenin, jonka ilmentyminen an- 25 taa sillä transformoidulle bakteeri-isännälle lääkeresistenssin. Tavanomaiset baktee- lt'm rilääkeresistenssigeenit ovat ne, jotka antavat ampisilliini- tai tetrasykliiniresistens- • · · * ’ sin.

Ne vektorit, jotka sisältävät prokaiyoottisen replikonin, voivat sisältää myös proka-ryoottisen promoottorin, joka kykenee säätämään geenin, joka koodittaa GPIIbrn « * < / . 30 kaltaista aminohappotähdesekvenssiä, ilmentymistä (transkriptiota ja translaatiota) ;i f: bakteeri-isäntäsolussa, kuten E. Coli, joka on transformoitu sillä. Promoottori on il- · mentymisen säätöelementti, joka on muodostettu DNA-sekvenssillä, joka sallii RNA-polymeraasin sitoutumisen ja transkription. Promoottorisekvenssejä, jotka ovat yhteensopivia bakteeri-isäntien kanssa, saadaan tavallisesti aikaan plasmidivek- • · 15 105276 toreissa, jotka sisältävät sopivat restriktiopaikat esillä olevan keksinnön mukaisen DNA-segmentin insertoimiseksi. Tyypillisiä tällaisia vektoriplasmideita ovat pUC8, pUC9, pBR322 ja pBR329, jotka ovat saatavissa Bio- Rad Laboratoriesilta, (Richmond, CA) ja pPL sekä pKK223, jotka ovat saatavissa Pharmaciasta, Piscata-5 way, NJ.

Voidaan käyttää myös ilmentymisvektoreita, jotka ovat yhteensopivia eukaryootti-solujen kanssa, edullisesti niitä, jotka ovat yhteensopivia selkärankaisten solujen kanssa, esillä olevan keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien muodostamiseen. Eukaryoottisoluilmentymisvektorit ovat hyvin tunnettuja alalla ja niitä on 10 saatavissa useista kaupallisista lähteistä. Tavallisesti valmistetaan tällaisia vektoreita, jotka sisältävät sopivat restriktiopaikat halutun DNA-segmentin insertoimiseksi. Tyypillisiä tällaisia vektoreita ovat pSVL ja pKSV-10 (Pharmacia), pPBV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.,) ja pTDTl (ATCC, #31255).

Edullisissa suoritusmuodoissa sisältävät eukaryoottisoluilmentymisvektorit, joita 15 käytetään esillä olevan keksinnön mukaisten DNA-molekyylien konstruoimiseen, valikointimerkitsimen, joka toimii eukaryoottisolussa, edullisesti lääkeresistenssi-valikointimerkitsimen. Edullinen lääkeresistenssimerkitsin on geeni, jonka ilmentyminen saa aikaan neomysiiniresistenssin, so. neomysiini-fosfotransferaasi-(neo)-geeni. Southern et ai., J. Mol. Appi. Genet., 1:327-341 (1982).

20 Tarkastellaan myös retrovirusilmentymisvektoreiden käyttöä esillä olevan keksinnön , , mukaisten rDNA:iden muodostamiseksi. Siten kuin tässä käytetään, tarkoittaa termi • i « ‘ "retrovirusilmentymisvektori" DNA-molekyyliä, joka sisältää promoottorisekvens- i '" sin, joka on johdettu retrovirusgenomin pitkästä terminaalikerrannaisalueesta (LTR): • < t * • · ···

Edullisissa suoritusmuodoissa ilmentymisvektori on tavallisesti retrovirusilmenty-25 misvektori, joka edullisesti on kykenemätön replikoitumaan eukaryoottisoluissa. Sorge et ai., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984) on kuvannut retroyirusvektoreiden • » < * * konstruktiota ja käyttöä.

' Useita menetelmiä on kehitetty DNA:n kytkemiseksi toimivasti vektoreihin komple- mentaalisen kohesiivisten terminaalien kautta. Esimerkiksi voidaan lisätä komple-. 30 mentaalisia homopolymeerialueita insertoitavaan DNA-segmenttiin ja vektori- ;,.' DNA:han. Vektori ja DNA-segmentti liitetään sitten vetysitomisella komplementaa- ' ;'' listen homopolymeerihäntien väliin yhdistelmä-DNA-molekyylien muodostamisek- f«« : : : si.

« · rl·

• · · f I

16 105276

Synteettiset liittäjät, jotka sisältävät yhden tai useamman restriktiopaikan, tarjoavat vaihtoehtoisen menetelmän DNA-segmentin liittämiseksi vektoreihin. DNA-seg-mentti, joka on generoitu endonukleaasirestriktiohajotuksella, kuten aiemmin kuvattiin, käsitellään bakteriofagi-T4-DNA-polymeraasilla tai E. coli-DNA-polymeraasi 5 I:llä, entsyymeillä, jotka poistavat ulkonevat 3', yksijuosteiset terminaalit 3'-5'-ekso-nukleolyyttisillä toiminnoillaan ja täyttävät vajotetut 3'-päät polymerointitoimin-noillaan. Näiden toimintojen yhdistelmä generoi täten tylppäpäisiä DNA-segmentte-jä. Sitten tylppäpäiset segmentit inkuboidaan suurimoolisella ylimäärällä liittäjämo-lekyylejä entsyymin läsnäollessa, joka entsyymi kykenee katalysoimaaan tylppä-10 päisten DNA-molekyylien ligaatiota, kuten bakteriofagi-T4-DNA-ligaasi. Täten reaktion tuotteita ovat DNA-segmentit, joissa on päissään polymeeriliittäjäsekvensse-jä. Nämä DNA-segmentit pilkotaan sitten sopivalla restriktioentsyymillä ja ligatoi-daan ilmentymisvektoriin, joka on pilkottu entsyymillä, joka tuottaa terminaalit, jotka ovat yhteensopivia DNA-segmentin terminaalien kanssa.

15 Synteettisiä liittäjiä, jotka sisältävät erilaisia restriktionukleaasipaikkoja, on saatavissa kaupallisesti lukuisista lähteistä mukaan lukien International Biotechnologies,

Inc., New Haven, CN.

Esillä olevassa keksinnössä tarkastellaan myös edellä kuvattujen yhdistelmä-DNA-molekyylien RNA-ekvivaientteja.

20 D. Transformoidut solut ja viljelmät

« I

v.: Esillä oleva keksintö kohdistuu myös isäntäsoluun, joka on transformoitu esillä ole- van keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä. Isäntäsolu voi olla joko prokaryoottinen tai eukaryoottinen. Bakteerisolut ovat edullisesti prokaryoottisia • · · isäntäsoluja ja tavallisesti ne ovat E. coli -lajia, kuten esimerkiksi E. coli -laji DH5, 25 joka on saatavissa Bethesda Research Laboratories, Inc.istä Bethesda, MD. Edulliset ,·.·. eukaryoottiset isäntäsolut käsittävät hiiva- ja nisäkässolut, edullisesti selkärankaisso-

• 4 I

lut, kuten hiiren, rotan, apinan tai ihmisen sidekudossolulinjasta peräisin olevat so- ... lut. Edulliset eukaryoottiset isäntäsolut käsittävät Kiinan hamsterin munasarja- • · *··;* (CHO)-solut, joita on saatavissa ATCC:stä CCL61:nä ja NIH Sveitsin hiiren sikiö- *···’ 30 solut NIH/3T3, joita on saatavissa ATCC:stäCRL 1658:na.

• « « « · ·

Edullinen transformoitu solulinja on E. coli, joka sisältää yhdistelmä-DNA-mole- t · kyylin HEL41, viljelmä, joka on talletettu American Type Culture Collectioniin (ATCC), Rockville, MD, heinäkuun 7., 1987, ja jolle on annettu talletusnumero 67456.

• · 17 105276

Sopivien isäntäsolujen transformointi esillä olevan keksinnön mukaisella yhdistel-mä-DNA-molekyylillä suoritetaan hyvin tunnetuilla menetelmillä, jotka riippuvat tavallisesti käytetyn vektorin tyypistä. Prokaryoottisten isäntäsolujen transformoin-nin suhteen katso esimerkiksi Cohen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69:2110 5 (1972); ja Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Mammal, Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Selkärankaissolujen transfor-moinnin retrovirusvektoreilla, jotka sisältävät rDNAiita, suhteen katso esimerkiksi Sorge et ai., Mol. Cell. Biol., 4:1730- 37 (1984); Graham et ai., Virol., 52:456 (1983); ja Wigler et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:1373-76 (1978).

10 Menestyksekkäästi transformoidut solut, so. solut, jotka sisältävät esillä olevan keksinnön mukaisen DNA-molekyylin, voidaan identifioida hyvin tunnetuilla tekniikoilla. Esimerkiksi solut, jotka ovat tulosta esillä olevan keksinnön mukaisen rDNA.n käyttöönotosta, voidaan kloonata monoklonaalisten kolonioiden tuottamiseksi. Näistä kolonioista peräisin olevat solut voidaan kerätä, lysoida ja niiden DNA-sisältö 15 voidaan tutkia rDNA.n läsnäolon toteamiseksi käyttämällä sellaista menetelmää, kuten Southemin kuvaama, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) tai Berent et al.:n kuvaama, Biotech., 3:208 (1985).

Lisäksi rDNA:n läsnäolon testaamiseksi suoraan voidaan menestyksekäs transformointi vahvistaa hyvin tunnetuilla immunologisilla menetelmillä, jos rDNA kykenee 20 säätämään GPIIb:n kaltaisen proteiinin ilmentymistä. Esimerkiksi solut, jotka on transformoitu menestyksekkäästi ilmentymisvektorilla, tuottavat proteiineja, joilla osoittavat GPIIb-antigeenisuutta. Solujen näytteet, joiden epäillään transformoitu-neen, kerätään ja testataan GPIIb:n kaltaisen proteiinin toteamiseksi käyttämällä

I I

vasta-aineita, jotka ovat näille antigeeneille spesifisiä, kuten esillä olevan keksinnön • · 25 mukaisella hybridoomalla valmistetut vasta-aineet.

• · :T: Täten itse transformoitujen isäntäsolujen lisäksi esillä oleva keksintö tarkastelee :Y: myös tällaisten solujen viljelmää, edullisesti monoklonaalista (kloonisesti homogee nista) viljelmää, tai viljelmää, joka on johdettu monoklonaalisesta viljelmästä, ravin-. ,···. toväliaineessa. Edullisesti viljelmä sisältää myös proteiinia, jolla on GPIIb-antigee- ,'·*·, 30 nisuutta.

9 * ( ( < . < :' ·,; Ravintoväliaineet, jotka ovat käyttökelpoisia transformoitujen isäntäsolujen viljemi- ," . seen, ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä voidaan saada useista kaupallisista lähteis- ; ] tä. Suoritusmuodoissa, joissa isäntäsolu on nisäkässolu, käytetään edullisesti "seeru- I · > ' ' ‘ mivapaata" väliainetta.

| I 9 «Il • · 18 105276 £. Menetelmät GPIIb:n kaltaisten proteiinien tuottamiseksi

Esillä oleva keksintö kohdistuu toisaalta menetelmään proteiinien, joilla on GPIIb-antigeenisuutta, valmistamiseksi. Proteiinit, joilla on GPIIb-antigeenisuutta, ovat proteiineja, jotka immunoreagoivat vasta-aineiden, jotka on valmistettu luonnolli-5 sella GPIIb:llä, kanssa. Proteiinit, joilla on GPIIb-antigeenisuutta, ovat käyttökelpoisia antigeeneinä ja vasta-aineiden herättämiseen, joista kutakin voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisissa diagnostisissa järjestelmissä ja menetelmissä.

Esillä olevaan menetelmään kuuluu viljelmän initioiminen, joka viljelmä käsittää ravintoväliaineen, joka sisältää isäntäsoluja, edullisesti ihmisen soluja, transformoi-10 tuna esillä olevan keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä, joka kykenee ilmentämään geeniä, joka koodittaa GPIIb:n kaltaista aminohappotähdesekvens-siä. Viljelmää ylläpidetään ajanjakso, joka on riittävä transformoiduille soluille, jotta ne ilmentävät proteiinia, joka sisältää GPIIb:n kaltaisen aminohappotähdesek-venssin. Ilmennetty proteiini otetaan sitten talteen viljelmästä.

15 Menetelmät ilmennetyn proteiinin talteenottamiseksi viljelmästä ovat alalla hyvin tunnettuja ja sisältävät viljelmän proteiinia sisältävän osan fraktonoinnin käyttämällä hyvin tunnettuja biokemiallisia tekniikoita. Esimerkiksi geelisuodatus-, geelikroma-tografia-, ultrasuodatus-, elektroforeesi-, ioninvaihto-, affiniteettikromatografia- ja niiden kaltaisia menetelmiä, joita tunnetaan proteiinifraktonointeja varten, voidaan 20 käyttää viljelmästä löydettyjen ilmennettyjen proteiinien eristämiseksi. Lisäksi im-. . munokemiallisia menetelmiä, kuten immuuniaffiniteetti, immuuniadsorptio ja niiden *;v kaltaisia, voidaan suorittaa käyttämällä hyvin tunnettuja menetelmiä.

• t • < «

Keksinnön mukaisessa polypeptidissä läsnä olevat aminohappotähteet voivat olla ····: sekvenssin, joka on lueteltu jäljempänä ei yli 50 aminohappotähteen kokonaismää- 25 rään, lisäksi mitä tahansa tähteitä, jotka eivät vaikuta aineellisesti polypeptidin pe-rus-ja uusiin ominaisuuksiin, jotka on selostettu jäljempänä. Tällaisia lisätähteitä li- • · · sätään tavallisesti luetellun polypeptidin toiseen tai kumpaankin terminaaliin ja ne voivat sisältää luetellun polypeptidisekvenssin kerrannaisia tai osittaisia kerrannai- • * ’···' siä.

• · P Ψ '<[ ; 30 F. Polypeptidit c c \

- I I

( l(

Esillä olevan keksinnön mukainen polypeptidi sisältää noin alle 50, tavallisesti vä-.. hemmän kuin 35 ja edullisesti vähemmän kuin 25 aminohappotähdettä ja se sisältää vähintään noin 10 tähdettä. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaiselle polypepti- i i i i · 19 105276 dille on tunnusomaista sen aminohappotähdesekvenssi ja uudet funktionaaliset ominaisuudet.

1. hGPIIb-kryptiset determinanttipolypeptidianalogit

Yleisesti ottaen esillä olevan keksinnön eräs suoritusmuoto tarkastelee polypeptidiä, 5 joka sisältää aminohappotähdesekvenssin, joka kykenee jäljittelemään kryptistä an-tigeenideterminanttia, joka on ilmennetty RDG-sitovan sytoadhesiivisen proteiinin alfa-alayksikön raskaalla ketjulla. Kryptisen determinanttipolypeptidianalogin aminohappotähdesekvenssi vastaa sytoadhesiinin alfa-alayksikön raskaan ketjun noin 15 karboksiterminaalista aminohappotähdettä.

10 Edullinen sytoadhesiini-alfa-alayksikkö-raskas ketju-kryptinen determinanttipoly-peptidianalogi kykenee jäljittelemään hGPIIb-kryptistä determinanttia, joka muodostuu, kun hGPIIb sitoo fibrinogeenin. Edullisissa suoritusmuodoissa käsittää hGPIIb-kryptinen determinanttipolypeptidianalogi vähintään seuraavan aminohappotähde-sekvenssin: 15 -PAHHKRDRRQ-, joka edustaa aminohappotähteitä 137-145, kuten kuviossa 1 on esitetty.

Erityisemmin hGPIIb-kryptinen determinanttianalogi sisältää vähintään seuraavan aminohappotähdesekvenssin: • · · !'··· -PSPSPIHPAHHKRDRRQ-, • · * 1 20 joka edustaa aminohappotähteitä 129-145, kuten kuviossa 1 on esitetty.

• · · v : Edulliset hGPIIb-kryptiset determinanttianalogit käsittävät ne, joiden aminohappo- ::: tähdesekvenssit on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1 • · « * · • · ·

Nimitys3 Aminohappotähdesekvenssi

pl36-145 PAHHKRDRRQ

;:··! pl33-145 PIHPAHHKRDRRQ

p 131-145 PSPIHPAHHKRDRRQ

v ; p 129-145 PSPSPIHPAHHKRDRRQ

• · 20 105276 a Kunkin polypeptidin nimitys edustaa sisällytettyä aminohappotähdesekvenssiä, kuten kuviossa 1 on esitetty.

Taulukossa 1 esitetyille polypeptideille on lisäksi tunnusomaista niiden kyky neutraloida (kompetitiivisesti inhiboida) PMI-l-vasta-ainemolekyylien sitoutuminen, ku-5 vattu jäljempänä, hGPIIb:hen, kun hGPIIb:tä on läsnä GPIIb-IIIa/fibrinogeenikom-pleksina.

Sana "kompleksi", kuten sitä on käytetty tässä, tarkoittaa spesifistä sitoutumisreak-tiotuotetta, kuten vasta-aine-antigeeni- tai reseptori-ligandireaktiota. Esimerkkejä komplekseista ovat immuunireaktiotuotteet, GPIIb-IIIa-fibrinogeenisitoutumisreak-10 tiotuotteet ja sytoadhesiini-ligandisitoutumisreaktiotuotteet.

Edullisissa suoritusesimerkeissä on hGPIIb-kryptiselle determinanttianalogille lisäksi tunnusomaista sen kyky kompetitiivisesti inhiboida fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden aggregaatiota. Esimerkki hGPIIb-kryptisestä determinanttianalo-gista, joka kykenee inhiboimaan fibrinogeeniin sitoutuneen verihiutaleen aggregaa-15 tiota on polypeptidi pl29-145.

On ymmärrettävä, että esillä olevan keksinnön mukaisen hGPIIb- kryptisen determi-nanttipolypeptidianalogin ei tarvitse olla identtinen hGPIIbin aminohappotähdesek-venssin kanssa, niin kauan kuin se kykenee inhiboimaan kompetitiivisesti fibrinogeeniin sitoutuneen verihiutaleen aggregaatiota ja/tai kykenee kompetitiivisesti inhi-20 boimaan PMI-l-vasta-ainemolekyylien sitoutumista, kuvattu jäljempänä, • i hGPIIb:hen, kun hGPIIb:tä on läsnä GPIIb-IIIa/fibrinogeenikompleksina. Täten hGPIIb-kryptinen determinanttipolypeptidianalogi voidaan alistaa erilaisille muu-·;··; taksille, kuten insertioille, deleetioille ja substituutioille, joko konservatiivisille tai ei-konservatiivisille, jolloin tällaiset muutokset saavat aikaan tiettyjä etuja niiden 25 käytössä.

• ·

Konservatiivisia substituutioita ovat ne, joissa yksi aminohappotähde korvataan toi-sella, biologisesti samanlaisella tähteellä. Esimerkit konservatiivisista substituutiois- • · · ta sisältävät yhden hydrofobisen tähteen, kuten isoleusiinin, valimiin, leusiinin tai : metioniin, susbtituoimisen toisen sijaan tai yhden polaarisen tähteen substituoimisen 30 toisen sijaan, kuten arginiinin ja lysiinin välinen, glutaamihapon ja aspartaamihapon ' I' välinen tai glutamiinin ja asparagiinin ja niiden kaltaisten välinen. Termi "konserva- < f · tiivinen substituutio" käsittää myös substituoidun aminohapon käytön substituoi-'·,'· mattoman kanta-aminohapon sijasta, edellytyksellä että tällaisella polypeptidillä on myös tarvittavaa sitomistoimintaa.

21 105276

Jos esillä olevan keksinnön mukaisella polypeptidillä on sekvenssi, joka ei ole identtinen hGPIIb:n sekvenssin kanssa, koska on suoritettu yksi tai useampia konservatiivisia substituutioita, tavallisesti ei enempää kuin 20 % ja tavallisemmin ei enempää kuin 10 % aminohappotähteestä on substituoitu, paitsi silloin kun on lisät-5 ty lisätähteitä jompaankumpaan terminaaliin syystä, että saadaan aikaan "liittäjä", jonka avulla tämän keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan kiinnittää sopivasti merkitsimeen tai kiinteään matriksiin tai antigeenikantajaan. Merkitsimiä, kiinteitä matrikseja ja kantajia, joita voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä, on kuvattu jäljempänä.

10 Aminohappoliittäjät ovat tavallisesti yksitähteisiä ja ne voivat olla 40- tai useampi tähteisiä, useimmiten 1-10-tähteisiä. Tavallisia liittämiseen käytettyjä aminohappotähteitä ovat tyrosiini, kysteiini, lysiini, glutaamihappo ja aspartaamihappo tai niiden kaltaiset. Lisäksi tämän keksinnön mukainen polypeptidisekvenssi voi poiketa luonnollisesta sekvenssistä sekvenssillä ollen modifioitu terminaalisella NH2~asyloinnil-15 la, esim. asetylointi tai tioglykolihappoamidointi, terminaalisella karboksyamidoin-nilla, esim. ammonium, metyyliamiini, jne.

Jos tämän keksinnön mukainen hGPIIb-loyptinen determinanttipolypeptidianalogi on kytketty kantajaan liittäjän kautta sen muodostamiseksi, mikä on tunnettu alalla kantaja-hapteenikonjugaattina, se kykenee indusoimaan vasta-aineita, jotka immu- 20 noreagoivat hGPIIb:n kanssa, kun hGPIIb:tä on läsnä verihiutaleeseen liittyneenä GPIIb-IHa/fibrinogeenikompleksina. Immunologisen ristireaktiivisuuden hyvin to- i ’ ·.. teennäytetyn periaatteen suhteen esillä oleva keksintö tarkastelee polypeptidin p 129- 149 antigeenisesti samankaltaisia variantteja. Termi "antigeenisesti samankaltainen variantti" on polypeptidi, joka kykenee indusoimaan vasta-ainemolekyylejä, jotka ..... 25 immunoreagoivat polypeptidin p 129-145 ja hGPIIbin kanssa, kun hGPIIb:tä on läs- • · · _ I . nä verihiutaleeseen liittyneenä GPIIb-ffla/fibrinogeenikompleksina.

9 · · • · 2. IGPIIb-poIypeptidit • · · • · « · _ I”. Toisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö tarkastelee IGPIIb-polypeptidiä, jo- *·.··* ka käsittää vähintään seuraavan aminohapposekvenssin: • · • · · .·. 30 -RQIFLPEPEQPSR-, :':': joka edustaa aminohappotähteitä 144-156, kuten kuviossa 1 on esitetty.

« · · ' · ': lGPIIb-polypeptidille on lisäksi tunnusomaista sen kyky indusoida vasta-ainemole kyylejä, jotka immunoreagoivat lGPIIb:n kanssa, mutteivät immunoreagoi hGPIIb:n 22 105276 kanssa. Edullisella lGPIIb-polypeptidillä, joka on nimetty pl44-156:ksi, on amino-happotähdesekvenssi, jota esittää kaava: RQIFLPEPQPSR.

Esillä olevan keksinnön mukainen sekä hGPIIb- että lGPIIb-polypeptidi voidaan 5 syntetoida millä tahansa tekniikalla, jonka polypeptidialan asiantuntijat tuntevat. Erinomainen yhteenveto monista saatavissa olevista tekniikoista on löydettävissä J.M. Stewardin ja J.D. Youngin teoksesta, "Solid Phase Peptide Syntesis", W.H Freeman Co., San Francisco, 1969 ja kiintoainesynteesistä J. Meienhoferin teoksesta "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983 10 sekä klassisesta liuossynteesistä E. Schroderin ja K. Kubken teoksesta "The Peptides", Voi. 1, Academic Press (Newyork), 1965.

G. Istutteet

Toisessa suoritusmuodossa tämän keksinnön mukaista polypeptidiä tai sen antigee-nisesti samankaltaista varianttia käytetään farmaseuttisesti hyväksyttävänä vesipitoi-15 sena laimennuskoostumuksena istutteen muodostamiseksi, joka, kun sitä annetaan vaikuttavana määränä, kykenee indusoimaan vasta-aineita, jotka immunoreagoivat hGPIIb:n kanssa.

Sanaa "istute" erilaisissa kieliopillisissa muodoissaan käytetään tässä kuvaamaan :V: koostumusta, joka sisältää tämän keksinnön mukaista polypeptidiä aktiviisena aine- 20 osana, jota käytetään GPIIb:n raskaan ketjun tai kevyen ketjun vastaisten vasta-ai-neiden valmistukseen.

• · *

Jos polypeptidiä käytetään indusoimaan vasta-aineita, on ymmärrettävä, että poly-: peptidiä voidaan käyttää yksin tai kantajaan, kuten konjugaattiin tai polypeptidipo- • · lymeeriin, kytkettynä, mutta tämän keksinnön mukaisten polypeptidien erilaisten 25 suoritusmuotojen ilmaisemisen helpottamiseksi niitä kutsutaan tässä kollektiivisesti : | ’ ]: termillä "polypeptidi" ja sen erilaisilla kieliopillisilla muodoilla.

• · · • · * *:' ’ Polypeptidiin, joka sisältää vähemmän kuin noin 3 5 aminohappoa, on edullista käyt- • * * * * tää peptidiä kantajaan sidottuna vasta-aineiden tuotannon indusoimista varten, kuten : aikaisemmin jo mainittiin.

:: : 30 Kuten jo mainittiin, voidaan polypeptidin amino- tai karboksiterminaaliin lisätä yksi tai useampia lisäaminohappotähteitä, jotka osallistuvat polypeptidin kantajaan sitoutumiseen. Polypeptidin amino- tai karboksiterminaaliin lisättyjen kysteiinitähteiden 23 105276 on havaittu olevan erityisen käyttökelppoisia muodostettaessa konjugaatteja disulfi-disidosten kautta. Kuitenkin voidaan käyttää myös muita alalla hyvin tunnettuja menetelmiä konjugaattien valmistamiseksi. Esimerkit lisäliittämismenetelmistä käsittävät Michael-additioreaktiotuotteiden, dialdehydien, käytön, kuten glutaraldehydi, 5 Klipstein et ai., J. Infect. Dis.,147, 318-326 (1983) ja niiden kaltaisten käytön tai karbodi-imiditeknologian käytön, kuten vesiliuokoisen karbodi-imidin käytön, ami-disidosten muodostamiseksi kantajaan. Katsauksena proteiinikonjugaatioon tai -kytkemiseen aktivoitujen funktionaalisten ryhmien kautta katso Aurameas et ai., Scand.

J. Immunol., Voi. 8, Supp-1. 7, 7-23 (1978).

10 Käyttökelpoiset kantajat ovat alalla hyvin tunnettuja ja ne ovat yleisesti itse proteiineja. Esimerkkejä tällaisista kantajista ovat Fissurella-suvun maljakotilon hemosy-aniini (KLH), edestiini, tyroglobuliini, albumiinit, kuten naudan seerumialbumiini (BSA) tai ihmisen seerumialbumiini (HSA), punaiset verisolut, kuten lampaan eryt-rosyytit (SRBC), tetanustoksoidi, koleratoksoidi samoin kuin polyaminohapot, kuten 15 poly-(D-lysiini: D-glutaamihappo) ja niiden kaltaiset.

Kantajan valinta riippuu enemmän istutteen lopullisesta käytöstä ja perustuu kriteereihin, jotka eivät liity erityisesti esillä olevaan keksintöön. Esimerkiksi kantaja, joka ei generoi ikäviä reaktiota erityisessä istutettavassa eläimessä, pitäisi valita.

Esillä oleva istute sisältää tehokkaan immunogeenisen määrän tämän keksinnön mu-20 kaista polypeptidiä tavallisesti konjugaattina, joka on kytketty kantajaan. Polypep- • · · tidin tai proteiinin tehokas määrä yksikköannosta kohti riippuu muun muassa istu-

» M

tettavan eläimen lajista, eläimen ruumiinpainosta ja valitusta istutusjärjestelmästä, " ' kuten alalla on hyvin tunnettua. Istutteet sisältävät tavallisesti polypeptidi- tai prote- | * iinipitoisuuksia noin 10 mikrogrammasta noin 500 milligrammaan istutusta (annos) v : 25 kohti, edullisesti noin 50 mikrogrammasta noin 50 milligrammaan annosta kohti.

• · • · « • · · • · _

Termi "yksikköannos", silloin kun liittyy esillä olevan keksinnön mukaisiin istut- .···. teisiin, tarkoittaa fyysisesti erillisiä yksikköjä, jotka sopivat yksikköannostuksiin • · eläimille, kunkin yksikön sisältäessä ennalta määritellyn määrän aktiivista ainetta '·:* laskettuna halutun immunogeenisen tehon tuottamiseksi liittyneenä tarvittavaan lai- • · * ' ’ 30 mentimeen; so. kantaja tai välitysaine. Tämän keksinnön mukaisen istutteen uuden : yksikköannoksen erittelyt määrittyvät ja riippuvat suoraan (a) aktiivisen aineen ai- , nutlaatuisista piirteistä ja saavutettavasta erityisestä immunologisesta tehosta, ja (b) ! . rajoituksista, jotka ovat luontaisia seostuksen alalla, kuten aktiivisesta aineesta, jota ' ' käytetään immunologisesti eläimissä, kuten tässä selostetaan yksityiskohtaisesti näi- 35 den ollessa esillä olevan keksinnön piirteitä.

24 105276

Istutteet valmistetaan tavallisesti kuivasta kiinteästä polypeptidikonjugaatista dis-pergoimalla polypeptidikonjugaatti fysiologisesti siedettävään (hyväksyttävään) laimentuneen tai välitysaineeseen, kuten veteen, suolaliuokseen tai fosfaattipuskuroi-tuun suolaliuokseen vesipitoisen koostumuksen muodostamiseksi. Tällaiset laimen-5 timet ovat ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä on selostettu esimerkiksi teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) sivuilla 1465-1467.

Istutteet voivat sisältää apuainetta laimentunen osana. Apuaineet, kuten täydellinen Freundin apuaine (CFA), epätäydellinen Freundin apuaine (IFA) ja aluna, ovat 10 alalla hyvin tunnettuja materiaaleja ja niitä on saatavissa kaupallisesti useista lähteistä.

H. Vasta-aineet ja vasta-ainekoostumukset I. Vasta-ainekoostumukset

Termiä "vasta-aine" käytetään tässä useissa kieliopillisissa muodoissaan tarkoitta-15 maan immunoglobuliinimolekyylejä ja immunologisesti aktiivisia immunoglubulii-nimolekyylien osia, so. molekyylejä, jotka sisältävät vasta-ainetta sitovan paikan tai paratoopin. Esimerkkejä vasta-ainemolekyyleistä ovat intaktit immunoglobuliinimo-lekyylit, oleellisesti intaktit immunoglobuliinimolekyylit ja ne immunoglobuliinimo-lekyylin osat, jotka sisältävät paratoopin mukaan lukien ne osat, jotka tunnetaan I;'·’ 20 alalla Fab:na, Fab':na, F(ab')2:na ja F(v):nä · t «· •"': "Vasta-ainetta kombinoiva paikka" on se vasta-ainemolekyylin rakenteellinen osa, • Il ....: joka koostuu raskas ja kevyt ketju -vaihtelevasta ja hypervaihtelevasta alueesta, joka sitoo spesifisesti antigeenin (immunoreagoi sen kanssa). Termi "immunoreagoida" * * * erilaisissa muodoissaan tarkoittaa antigeenideterminanttia sisältävän molekyylin ja • * 25 molekyylin, joka sisältää vasta-ainetta sitovan paikan, kuten koko vasta-ainemole- kyyli tai sen osa, välistä sitoutumista.

• · • · • Il "Antigeenideterminantti" tarkoittaa antigeenin varsinaista rakenteellista osaa, joka · · . on immunologisesti vasta-ainetta kombinoivan paikan sitoma. Termiä käytetään ; myös vaihtelevasti "epitoopin" kanssa.

30 Esillä olevan keksinnön mukaiselle koostumukselle on tunnusomaista, että se sisäl-

i f I

! < . tää vasta-ainemolekyylejä, jotka immunoreagoivat a) hGPIIbin tai lHGPIIb:n ja b) ' ' vähintään yhden tämän keksinnön mukaisen spesifisen polypeptidin kanssa. Edul lisessa suoritusmuodossa tämän keksinnön mukainen vasta-ainekoostumus sisältää 25 105276 enemmän kuin yhden paratooppilajin, joka kykenee immunoreagoimaan GPIIb:n kanssa.

Esimerkiksi esillä olevan keksinnön mukainen vasta-ainekoostumus, joka sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka immunoreagoivat verihiutaleisiin yhdistyneiden GPIIb-5 nia/fibrinogeenikompleksien ja hGPIIb-kryptisen determinanttipolypeptidianalogin kanssa, mutteivät immunoreagoi oleellisesti polypeptidin p53-64 kanssa, jonka ami-nohappotähdesekvenssi on esitetty taulukossa 2, kykenee erottamaan fibrinogeeniin sitoutuneet verihiutaleet verihiutaleista, jotka eivät ole sitoutuneet fibrinogeeniin.

Täten edullisia vasta-ainekoostumuksia ovat ne, jotka sisältävät vasta-ainemolekyy-10 lejä, jotka immunoreagoivat a) hGPIIb:n kanssa, kun sitä on läsnä verihiutaleisiin yhdistyneenä GPIIb-IIIa/fibrinogeenikompleksina, ja b) polypeptidin p 129-145 kanssa, ja jotka ovat oleellisesti vapaita immunoreaktiosta polypeptidin p53-64 kanssa.

Esillä olevan keksinnön mukainen vasta-ainekoostumus valmistetaan tavallisesti im-15 munoimalla nisäkäs esillä olevan keksinnön mukaisella istutteella ja indusoimalla siten nisäkkäässä vasta-ainemolekyylejä, joilla on sopiva polypeptidi-immunospesi-fisyys. Sitten vasta-ainemolekyylit kerätään nisäkkäästä ja eristetään haluttuun laajuuteen hyvin tunnetuilla tekniikoilla, kuten esimerkiksi immunoaffiniteettikroma-tografialla. Täten tuotettua vasta-ainekoostumusta voidaan käyttää muun muassa 20 esillä olevan keksinnön mukaisissa diagnostisissa menetelmissä ja järjestelmissä : V: fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden havaitsemiseksi ruumiin näytteestä.

« « 2. Monoklonaaliset vasta-ainekoostumukset t · • · «· · ""i Esillä oleva keksintö tarkastelee myös anti-LIBS-monoklonaalista vasta-ainekoos- tumusta. Ilmaus "monoklonaalinen vasta-ainekoostumus" erilaisissa kieliopillisissa 25 muodoissaan tarkoittaa vasta-ainemolekyylien populaatiota, jotka molekyylit sisäl- • · tävät vain yhden vasta-ainetta kombinoivan paikan lajin, joka kykenee immunorea- .···. goimaan erityisen antigeenin kanssa. Monoklonaalisella vasta-ainekoostumuksella • · y.'.' on täten tavallisesti yksi sitova affiniteetti mitä tahansa antigeeniä varten, jonka ’*:* kanssa se immunoreagoi. Monoklonaalinen vasta-ainekoostumus voi sisältää siten • · ‘ 30 vasta-ainemolekyylin, jossa on useita vasta-ainetta kombinoivia paikkoja, joista ku- : “: kin on immunospesifinen eri antigeenille, esim. bispesifinen monoklonaalinen vasta- I aine.

e i i « « I

:: Monoklonaalinen vasta-ainekoostumus koostuu tavallisesti vasta-aineista, joita on tuotettu yksittäisen hybridoomaksi kutsutun solun klooneilla, joka erittää (tuottaa) 26 105276 pelkästään yhdenlaista vasta-ainemolekyyliä. Hybridoomasolu muodostetaan fuusioimalla vasta-ainetta tuottava soluja myelooma tai muu itsepysyvä solulinja. Kohler ja Milstein, Nature 256:495-497 (1975) kuvasivat ensimmäisen kerran tällaisia vasta-aineita ja tämä selostus on sisällytetty viitteeksi.

5 Eräässä suoritusmuodossa esillä olevalle monoklonaaliselle vasta-ainekoostumukselle on tunnusomaista, että se sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka immunoreagoi-vat LIBS:n kanssa, joka on ilmennetty solun pintareseptori-ligandikompleksilla, edullisesti kompleksissa olevalla reseptorin antigeenisellä determinantilla.

Toisessa suoritusmuodossa monoklonaalinen vasta-ainekoostumus sisältää vasta-ai-10 nemolekyylejä, jotka immunoreagoivat hGPIIb:n ja hGPIIb-kryptisen determinantti-polypeptidianalogin, edullisesti p 129-145:n, kanssa. Näihin koostumuksiin sisältyvät vasta-ainemolekyylit immunoreagoivat hGPIIbin kanssa GPIIb-funktionaalisessa paikassa tai lähellä sitä, mutteivät inhiboi verihiutaleisiin yhdistyneen GPIIb-IIIa:n fibrinogeenin sitomista ja ne voivat reagoida immunologisesti verihiutaleisiin yhdis-15 tyneen GPIIb-IIIa:n kanssa, kun se on sitonut fibrinogeeniä. Edullinen tämän tyyppinen monoklonaalinen vasta-ainekoostumus sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka kyetään tuottamaan hybridoomalla PMI-1 (ATCC HB 9476), so. PMI-l-vasta-ainemolekyylit.

3. Menetelmät monoklonaalisten vasta-ainekompositioiden tuottamiseksi • t 20 Esillä oleva keksintö tarkastelee menetelmää monoklonaalisen vasta-aineen tuotta- • '· miseksi, joka vasta-aine (a) immunoreagoi ligandilla indusoidun sitomispaikan :'": (LIBS), joka on ilmennetty solun pintareseptori-ligandikompleksilla, kanssa ja (b) ei immunoreagoi reseptori-ligandikompleksin joko ei-varatun reseptorin tai ei-sitoutu- : * · *: neen ligandin kanssa. Menetelmä käsittää vaiheet: • « • · · *·’·* 25 (a) Eläimen immunoimisen solun pinta-reseptorikompleksilla tai hGPIIb-kryptisellä determinanttipolypeptidianalogilla. Tämä suoritetaan tavallisesti antamalla immuno-logisesti tehokas määrä, so. määrä, joka on riittävä saamaan aikaan immuunivasteen, • · · immunogeeniä immunologisesti kelpaavalle nisäkkäälle. Nisäkäs on edullisesti jyrsi-: jä, kuten kani, rotta tai hiiri. Nisäkästä ylläpidetään ajanjakso, joka on riittävä nisäk- 30 käälle solujen tuottamiseksi, jotka erittävät vasta-ainemolekyylejä, jotka immunoreagoivat reseptori-ligandikompleksin kanssa.

c , . : (b) Sitten valmistetaan immunoidusta nisäkkäästä poistettujen vasta-ainetta tuottavi en solujen suspensio. Tämä suoritetaan tavallisesti poistamalla nisäkkään perna ja 27 105276 erottamalla mekaanisesti yksittäisest pernasolut fysiologisesti siedettävässä väliaineessa käyttäen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä.

(c) Suspendoidut vasta-ainetta tuottavat solut käsitellään transformoivalla aineella, joka kykenee tuottamaan transformoidun ("immortaloidun") solulinjan. Transfor- 5 moivat aineet ja niiden käyttö immortaloitujen solulinjojen tuottamiseen ovat alalla hyvin tunnettuja ja käsittävät DNA-virukset, kuten Epstein Barr -virus (EBV), Simi-anvirus 40 (SV40), Polyoomavirus ja niiden kaltaiset, RNA-virukset, kuten Moloney -hiiren leukemiavirus (MoMuLV), Rous -sarkoomavirus ja niiden kaltaiset, myeloomasolut, kuten P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 ja niiden kaltaiset.

10 Edullisissa suoritusmuodoissa transformoivilla aineilla käsittely saa aikaan hybri-dooman tuottamisen fuusioimalla suspendoidut pernasolut hiiren myeloomasoluihin, jotka ovat sopivasta solulinjasta, käyttämällä sopivaa fuusiopromoottoria. Edullinen suhde on noin 5 pernasolua myeloomasolua kohti. Kokonaispitoisuus on noin 10^ splenosyyttiä.

15 Käytetyn solulinjan pitäisi olla edullisesti niin kutsuttua "lääkeresistenttiä" tyyppiä siten, että fuusioitumattomat myeloomasolut eivät säily selektiivisessä väliaineessa, kun taas hybridit säilyvät. Yleisin luokka on 8-atsaguaniiniresistentit solulinjat, joista puuttuu entsyymi-hypoksantiini-guaniini-fosforibosyylitransferaasi ja mistä johtuen sitä ei tue HAT- (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini) väliaine. On 20 myös yleisesti edullista, että käytetty myeloomasolulinja on niin kutsuttua "ei-erittä- • « · vää" tyyppiä siten, ettei se itse tuota mitään vasta-ainetta, vaikkakin erittäviä tyyppe-’.., jä voidaan käyttää. Tietyissä tapauksissa voivat erittävät myeloomalinjat olla edulli- '•"I siä. Joskin edullinen fuusiopromoottori on polyetyleeniglykoli, jonka keskimääräi- ] ’ nen molekyylipaino on noin 1000 -noin 4000 (kaupallisesti saatavissa PEG 1000:na, : 25 jne.), voidaan muita alalla tunnettuja fuusiopromoottoreita käyttää.

t · · • · · (d) Sitten transformoidut solut kloonataan, edullisesti monokloonisuuteen. Kloo- .···. naaminen suoritetaan edullisesti kudosviljelyväliaineessa, joka ei tue ei-transformoi- • · tuneita soluja. Jos transformoidut solut ovat hybridoomia, suoritetaan tämä taval-lisesti laimentamalla ja viljelemällä erillisissä säiliöissä fuusioitumattomien pema-*,*” 30 solujen, fuusioitumattomien myeloomasolujen ja fuusioituneiden solujen (hybridoo- :' ”: mien) seosta valikoivassa väliaineessa, joka ei tue fuusioitumattomia myeloomaso- r | , luja, ajanjakson, joka on riittävä mahdollistamaan fuusioitumattomien solujen kuo- I I » . lema (noin yksi viikko). Laimennus voi olla rajoittavaa tyyppiä, jolloin laimentunen ' ' tilavuus lasketaan tilastollisesti tietyn määrän soluja (esim. 1-4) eristämiseksi kus- 35 takin erillisestä säiliöstä (esim. kustakin mikrotiitterilevyn kolosta). Väliaine on 28 105276 sellaista (esim. HAT- väliaine), joka ei tue lääkeresitenttiä (esim. 8-atsaguaniini-resistenttiä) fuusioitumatonta solulinjaa.

(e) Kloonattujen transformanttien kudosviljelyväliaine arvioidaan erittyneiden anti-LIBS-vasta-ainemolekyylien läsnäolon toteamiseksi käyttämällä hyvin tunnettuja 5 immunologisia tekniikoita.

(f) Kun haluttu transformantti on identifioitu vaiheesssa (e), se valikoidaan ja sitä viljellään sopivassa kudosviljelyväliaineessa sopivan pituinen aika, mitä seuraa halutun vasta-aineen talteenottaminen viljelysupematantista. Viljelyn sopiva väliaine ja sopivan pituinen aika ovat tunnettuja tai helposti määritettäviä.

10 Paljon suuremman hieman vähemmän puhtaan monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuuden tuottamiseksi haluttu hybridooma voidaan injektoida hiiriin, edullisesti syn-geenisiin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridooma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvaimien muodostumisen sopivan inkubaatioajan jälkeen, mikä saa aikaan halutun vasta-aineen suuren pitoisuuden (noin 5-20 mg/ml) isäntähiiren verivirrassa ja peri-15 toneaalisessa tulehdusnesteessä (vesivatsa).

Näiden koostumuksien valmistukseen käyttökelpoiset väliaineet ovat sekä hyvin tunnettuja alalla että niitä on kaupallisesti saatavissa ja ne käsittävät synteettiset viljelyväliaineet, luontaiset hiiret ja niiden kaltaiset. Esimerkki synteettisestä väliaineesta on Dulbeccon minimaalinen oleellinen väliaine [DMEM; Dulbecco et ai., Vi-*·*.* 20 rol. 8:396 (1959)] täydennettynä 4,5 g:lla/l glukoosia, 20 mm:llä glutamiinia ja i ’· 20 % sikiökautista vasikan seerumia. Esimerkki luontaisesta hiirilajista on Balb/c.

• « I 4 « «

Edellä mainitulla menetelmällä tuotettuja monoklonaalisia vasta-ainekoostumuksia voidaan käyttää esimerkiksi diagnostisissa ja terapeuttisissa tarkoituksissa, joissa • · · *. . halutaan LIBS:ä sisältävän immuunireaktiotuotteen muodostumista. Esimerkki reak- • · · ’**·* 25 tiotuotteista käsittää GPIIb:tä tai GPIIIa:ta sisältävän immuunireaktiotuotteen.

I. Hybridoomat ja valmistusmenetelmät • · • « **:·' Esillä olevan keksinnön mukaiset hybridoonat ovat niitä, joille on tunnusomaista, • · _ •, * j että niillä on kyky tuottaa anti-LIBS- monoklonaalisia vasta-ainekoostumusta.

Ill

I I

II

Esillä olevan keksinnön mukaiselle edulliselle hybridoomalle on tunnusomaista, että :: 30 se tuottaa vasta-ainemolekyylejä, jotka immunoreagoivat solun pintareseptori -kryp- < · :.' · tisen antigeenideterminantin kanssa.

29 105276

Menetelmät hybridoomien tuottamiseksi, jotka hybridoomat tuottavat (erittävät) vasta-ainemolekyylejä, joilla on haluttu immunospesifisyys, so. joilla on kyky im-munoreagoida erityisen proteiinin, identifioitavan epitoopin, joka on erityisessä proteiinissa ja/tai polypeptidissä, kanssa, ovat hyvin tunnettuja alalla. Erityisen so-5 piva on Niman et al.,:n, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:4949-4953 (1983) ja Galfre et al.:n, Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981), kuvaama hybridoomateknologia, jotka kuvaukset on sisällytetty tähän viitteenä.

Hybridoomaviljelmä PMI-1 on talletettuna Budapestin sopimuksen vaatimusten mukaisesti American Type Tissue Collectioniin (ATCC), Rockville, MD 20852, 10 U.S.A., Heinäkuun 7, 1987, ja sille on annettu talletusnumero HB 9476. Hybridoo maviljelmä PMI-2 on talletettu samalla tavalla ATCC:hen joulukuun 22, 1987, ja sille on annettu talletusnumero HB 9615.

K. Diagnostiset järjestelmät

Esillä olevan keksinnön mukainen välinesarjamuodossa oleva diagnostinen järjes-15 telmä käsittää määränä, joka on ainakin yhteen testiin riittävä, esillä olevan keksinnön mukaista ilmennettyä proteiinia, polypeptidiä, vasta-ainekoostumusta tai mo-noklonaalista vasta-ainekoostumusta. Pakatun reagenssin käyttöohjeet on sisällytetty tavallisesti mukaan.

"Käyttöohjeet" käsittävät tavallisesti reaalisen ilmauksen, joka kuvaa reagenssikon- '·’·* 20 sensaatiota tai vähintään yhtä testausmenetelmäparametria, kuten reagenssin suh- *. ’· teellisiä määriä ja sekoitettavaa näytettä, reagenssi/näyteseosten ylläpitoaikoja, läm- • · :: pötilaa, puskurointiolosuhteita ja niiden kaltaisia.

« • v ..... Eräässä suoritusmuodossa käsittää diagnostinen järjestelmä fibrinogeeniin sitounei- · · I .. den verihiutaleiden testaamiseksi verihiutaleita sisältävästä vaskulaarinestenäyttees- *·"* 25 tä, kuten verestä tai plasmasta, pakkauksen, joka sisältää molekyylejä, jotka immu- noreagoivat hGPIIb-kiyptisen determinanttipolypeptidianalogin, edullisesti pl29-145, kanssa. Edullisemmin vasta-ainemolekyylit ovat hybridoomalla PMI-1 tuotettu- • * ♦ •ja molekyylejä, jotka immunoreagoivat hGPIIbin kanssa. Edullisesti vasta-ainemole-.·. : kyylit ovat läsnä monoklonaalisena vasta-ainekoostumuksena. Lisäksi ovat edullisia ' /··, 30 välinesarjat, joissa vasta- ainemolekyylit ovat liitettyinä radionuklidimerkitsimiin, edullisesti 125{_merkittyihin PMI-1 -vasta-ainemolekyyleihin.

• i » <

Eräässä toisessa suoritusmuodossa esillä olevan keksinnön mukainen diagnostinen ( « järjestelmä on käyttökelpoinen veritulpan läsnäolon testaamiseksi in vitro. Järjestelmä käsittää pakkauksen, joka sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka immunorea- 30 105276 goivat hGPIIb-kryptisen determinanttipolypeptidianalogin, edullisesti pl29-145:n, kanssa. Edullisemmin vasta-ainemolekyylit ovat läsnä monoklonaalisena vasta-ainekoostumuksena, joka koostuu oleellisesti PMI-l-vasta-ainemolekyyleistä, jotka im-munoreagoivat hGPIIb:n kanssa.

5 Täten edellä olevan keksinnön mukainen diagnostinen järjestelmä käsittää edullisissa suoritusmuodoissa lisäksi merkitsimen tai indikoivat välineet, jotka kykenevät signaloimaan kompleksin, joka sisältää esillä olevan keksinnön mukaisen vasta-ai-nemolekyylin tai polypeptidiä, muodostumisen.

Kuten tässä käytetään, termit "merkitsin" ja "indikoivat välineet" erilaisissa kieli-10 opillisissa muodoissaan tarkoittavat erillisiä atomeita ja molekyylejä, jotka osallistuvat suoraan tai epäsuorasti havaittavissa olevan signaalin tuottamiseen kompleksin läsnäolon osoittamiseksi. Mikä tahansa merkitsin tai mitkä tahansa indikoivat välineet voidaan liittää tai sisällyttää ilmennettyyn proteiiniin, polypeptidiin tai vasta-ainemolekyyliin, joka on esillä olevan keksinnön mukaisen vasta-aine- tai mono-15 klonaalisen vasta-ainekoostumuksen osa, tai käyttää erikseen ja näitä atomeja tai molekyylejä voidaan käyttää yksin tai yhdessä lisäreagenssien kanssa. Tällaiset merkitsimet ovat itsessään tunnettuja kliinisessä diagnostisessa kemiassa ja ne muodostavat tämän keksinnön osan pelkästään silloin, kun niitä käytetään muuten uusien proteiinimenetelmien ja/tai järjestelmien kanssa.

20 Merkitsimien liittäminen, so. polypeptidien ja proteiinien merkitseminen, on alalla hyvin tunnettua. Esimerkiksi hybridoomalla tuotetut vasta-ainemolekyylit voidaan i · merkitä sisällyttämällä metabolisesti radioisotooppia sisältäviä aminohappoja, jotka on varustettu komponenttina viljelyväliaineeseen. Katso esimerkiksi Galfre et ai., )#>* Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Tekniikat proteiinien konjugoimiseksi tai kytkemi- *·* * 25 seksi aktivoitujen funktionaalisten ryhmien kautta ovat erityisen sopivia. Katso esi- :.v merkiksi Aurameas et ai., Scand. J. Immunol., Voi. 8 Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et ai., Biotech., 3:889-894 (1984) ja US-patentti no 4 493 795.

» 9 9 » · • ·

Diagnostiset järjestelmät voivat käsittää myös edullisesti erillisenä pakkauksena • i "* spesifisen sideaineen. "Spesifinen sideaine" on molekyylikokonaisuus, joka kykenee V’! 30 selektiivisesti sitomaan esillä olevan keksinnön mukaiset reagenssilajit, mutta joka t r i f,,,' ei itsessään ole esillä olevan keksinnön mukainen proteiinin ilmentymistuote, poly- peptidi tai vasta-aine. Esimerkkejä spesifisistä sideaineista ovat vasta-ainemolekyy-

f ( I

. lit, komplementtiproteiinit tai niiden fragmentit, proteiini A ja näiden kaltaiset.

' ' Edullisesti spesifinen sideaine voi sitoa tämän keksinnön mukaisen vasta-ainemole- 35 kyylin tai polypeptidin, jos se on läsnä keksinnön osana.

31 105276

Edullisissa suoritusmuodoissa spesifinen sideaine on merkitty. Kuitenkin jos diagnostinen järjestelmä käsittää spesifisen sideaineen, jota ei ole merkitty, ainetta on käytetty tavallisesti vahvistusvälineenä tai reagenssina. Näissä suoritusmuodoissa merkitty spesifinen sideaine kykenee sitoutumaan spesifisesti vahvistus välineisiin, 5 kun vahvistusvälineet ovat sitoutuneena reagenssilajia sisältävään kompleksiin.

Esillä olevan keksinnön mukaisia diagnnostisia välinesarjoja voidaan käyttää "ELISA"-muodossa fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden läsnäolon tai määrän toteamiseksi ruumiinnestenäytteestä, kuten seerumista, plasmasta tai virtsasta. "ELISA" tarkoittaa entsyymikytkettyä immuunisorbenttitestiä, jossa käytetään vasta-10 ainetta tai antigeeniä sidottuna kiinteään faasiin ja entsyymi-antigeeniin tai entsyy-mi-vasta-ainekonjugaattiiin näytteessä olevan antigeenin tai vasta-aineen toteamiseksi tai määrittämiseksi. ELISA-tekniikan kuvaus on löydettävissä D.P Sitesin Basic and Clinical Immunology'n 4. painoksen kappaleesta 22, julkaisija Lange Medical Publications of Los Altos, CA, vuonna 1982 ja US-patenteista 3 654 090, 15 3 850 752 ja 4 016 043, jotka kaikki on liitetty tähän viitteenä.

Täten edullisissa suoritusmuodoissa esillä olevan keksinnön mukainen ilmennetty proteiini, polypeptidi tai vasta-ainemolekyyli voidaan kiinnittää kiinteään matriksiin kiinteän kannattimen muodostamiseksi, joka on pakattu erikseen kohteena oleviin diagnostisiin j ärj estelmiin.

20 Reagenssi on tavallisesti kiinnitetty kiinteään matriksiin adsorptiolla vesipitoisesta väliaineesta, vaikkakin muita kiinnitystapoj a, jotka ovat alan asiantuntijoiden hyvin ; / tuntemia, voidaan käyttää.

• f ·

tM

Käyttökelpoiset kiinteät matriksit ovat alalla hyvin tunnettuja. Tällaiset materiaalit käsittävät ristikytketyn dekstraanin, jota on saatavissa tavaramerkillä SEPHADEX 25 Pharmacia Fine Chemicalsilta (Piscataway, NJ); agaroosi; polystyreenipalloset, joi-den halkaisija on noin 1 mikroni - noin 5 millimetriä ja joita on saatavissa Abbott • t

Laboratories of North Chicagolta, IL; polyvinyylikloridi, polystyreeni, ristikytketty .···. polyakryyliamidi, nitroselluloosaan tai nailoniin perustuvat rainat, kuten levyt, • · '•V'm kaistaleet tai siivekkeet; tai mikrotiitterilevyn putket, levyt tai kolot, kuten ne, jotka • · 30 on tehty polystyreenistä tai polyvinyylikloridista.

•it t % I « i f « I

Minkä tahansa tässä kuvatun diagnostisen järjestelmän reagenssilajit, merkitty spe-sifmen sideaine tai vahvistusreagenssi voidaan tehdä liuokseksi, kuten nestemäiseksi ’ dispersioksi tai oleellisesti kuivaksi jauheeksi, esim. lyofiloidussa muodossa. Silloin kun indikoivat välineet on entsyymi, voidaan entsyymin substraatti sovittaa myös 32 105276 järjestelmän erilliseen pakkaukseen. Kiinteä kannatin, kuten edellä kuvattu mikrotiit-terilevy, sekä yksi tai useampia puskuroita voi olla myös sisällytettynä erikseen pakattuina elementteinä tässä diagnostisessa testijärjestelmässä.

Tässä diagnostisten järjestelmien suhteen keskustellut pakkaukset ovat niitä, joita 5 käytetään tavanomaisesti diagnostisissa järjestelmissä. Tällaiset pakkaukset käsittävät lasi- ja muovi- (esim. polyetyleeni-, polypropyleeni- ja polykarbonaatti-) pullot, -ampullit, muovi- ja muovikalvolla laminoidut päällysteet ja niiden kaltaiset.

L. Testausmenetelmät

Esillä oleva keksintö tarkastelee mitä tahansa menetelmää, joka saa aikaan GPIIbin 10 havaitsemisen ja erityisesti kompleksin havaitsemisen, joka sisältää fibrinogeeniin sitoutunutta GPIIb:tä, jollaista on havaittu veritulpassa tai fibrinogeeniin sitoutuneissa verihiutaleissa, tuottamalla kompleksi, joka sisältää ilmennettyä proteiinia, poly-peptidiä tai vasta- ainemolekyylin, sisällytettynä esillä olevan keksinnön mukaiseen vasta-aine- tai monoklonaaliseen vasta-ainekoostumukseen. Alan asiantuntijat ym-15 märtävät, että on olemassa lukuisia hyvin tunnettuja kliinisiä diagnostisia kemiallisia menetelmiä, joita voidaan käyttää näiden kompleksien muodostamiseen. Täten vaikka tässä on kuvattu esimerkkejä testausmenetelmistä, keksintö ei ole niihin rajoitettu.

2. Fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden havaitseminen ruumiinnäyt- 20 teestä • « » · · • · · : . # # Voidaan käyttää erilaisia heterogeenisiä ja homogeenisiä järjestelmiä, joko kompe- .··*. titiivisiä tai ei-kompetitiivisiä, fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden läsnä- ///,: olon ja edullisesti määrän havaitsemiseksi verihiutaleita sisältävästä ruumiinnäyt- i · ... teestä, edullisesti ruumiinnestenäytteestä, kuten veri tai veren hiutaleita sisältävä 25 osa. Esimerkiksi hepariinisäilötty (ei-hyytynyt) verinäyte ja 125i_meriätyt vasta- • · · ’·*·’ ainemolekyylit sekoitetaan. Täten muodostunutta immuunireaktiotuotetta ylläpide tään biologisissa testausolosuhteissa ajanjakson, joka on riittävä minkä tahansa fib- • « · rinogeeniin sitoutuneen verihiutaleen reagoimiselle merkittyjen vasta-aineiden kans- • · · sa ja merkityn immuumreaktiotuotteen muodostumiselle. Sitten merkityt immuuni-: 30 reaktiotuotteet erotetaan reagoimattomista merkityistä vasta-aineista, tavallisesti 1.sentrifugoinnilla, joka on riittävä pelletoimaan kaikki näytteessä olevat verihiutaleet.

I

Muodostuneen immuumreaktiotuotteen määrä testataan sitten.

«M • I I

I i · . ·. : Biologiset testausolosuhteet ovat niitä, jotka ylläpitävät tämän keksinnön mukaisten vasta-ainemolekyylien ja polypeptidimolekyylien biologista toimintaa sekä fibrino- 33 105276 geeniin sitoutuneita verihiutaleita, jotka halutaan tutkia. Nämä olosuhteet käsittävät lämpötilan alueella noin 4 °C - noin 45 °C, edullisesti noin 37 °C, ja pH-arvon alueella noin 5 - noin 9, edullisesti noin 7 ja ionilujuuden, joka vaihtelee tislatun veden lujuudesta noin yksimoolisen natriumkloridin, edullisesti noin fysiologisen suolaliu-5 oksen, ionilujuuteen. Menetelmät tällaisten olosuhteiden optimoimiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja.

Esimerkit

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu selventämään, muttei rajoittamaan, esillä olevaa keksintöä.

10 1. GPnb-ffla:n eristäminen A. Verihiutale-eristäminen

Kuusikymmentä millilitraa (ml) ihmisen täysverta koottiin 5 ml:aan ACD:tä (0,065 M siruunahappoa, 0,085 M natriumsitraattia, 2 % dekstroosia), joka sisälsi hirudiiniä (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,06 yksikön millilitraa kohti 15 (U/ml) lopuupitoisuuteen ja sitä sentrifugoitiin 15 minuuttia 120xg:ssä. Tuloksek-seksi saatu supematantti, joka on nimetty runsasverihiutaleiseksi plasmaksi (PRP), otettiin talteen, eristettiin ja sitä sentrifugoitiin lisäksi 15 minuuttia 12000xg:ssä eristettyjen verihiutaleiden pelletin muodostamiseksi.

34 105276 tiin olevan alueella 10-25 mg/ml käyttämällä tavanomaisesti Bio Rad Protein Assay Kit -välinesarjaa (BioRad, Richmond, CA) valmistajan käyttöohjeiden mukaisesti.

Verihiutalekalvoliuos sentrifugoitiin uudelleen SW50.1-sentrifugiroottorissa, kuten edellä ja tulokseksi saatu pelletti suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan uutepuskuria 5 (0,03 M tris, pH 7.4, lxl0'5 M leupeptiini, 200 mM n-oktyyli-beta-D-glukopyrano- sidi; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA). Täten muodostunut verihiutalekalvouute sekoitettiin kauttaaltaan pyörresekoittamalla ja sitten sitä pidettiin huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Sen jälkeen uutetta sentrifugoitiin 45 000 rpm:ssä SW50.1-sentrifugiroottorissa 1 tunti 4 C-asteessa ja täten muodostunut verihiutalekalvouute-10 supematantti otettiin talteen.

Talteenotettu supematantti levitettiin LKB Ultrogel Aca 34 -suodatuspylvääseen (3x97 cm, LKB Instruments, Gaithersburg, MD), joka oli tasapainotettu 1 litralla pylväspuskuria (0,03 M Tris, pH 7,4, 0,1 mM CaCl2, 0,1 % n-oktyyli-beta-D-gluko-pyranosidi) ja 5 ml.n fraktiot kerättiin tulokseksi saadusta pylväseffluentista. Kunkin 15 fraktion optinen tiheys määritettiin 280 nanometrissä ja useiden huippujen ympärillä olevat fraktiot yhdistettiin keräymän muodostamiseksi kutakin huippua varten. Kustakin keräymästä peräisin olevat näytteet analysoitiin elektroforeesilla 6 % po-lyakryyliamidilevygeeleissä käyttäen pelkistyspuskureita ja Laemmlin, Nature (London), 227:680-685 (1970), kuvaamia menetelmiä ja alhaisen molekyylipainon 20 proteiinistandardeja, joiden koko vaihtelee 14,4 kilodaltonista (KDa) 92,5 KDa:iin (Bio-Rad, Richmond, CA). Keräymä, joka sisälsi pääasiallisesti kahta proteiinilajia, :V: joiden molekyylipainot vastaavat GPIIb:tä ja GPIIIa:ta, so. 120 KDa ja 100 KDa : ‘ . vastaavasti, otettiin talteen. Täten valmistetun eristetyn GPIIb-IIIa-valmisteen prote- iinipitoisuuden määritettiin olevan alueella 0,3-0,8 mg/ml käyttämällä tavanomai- • · 25 sesti Bio-Rad Protein Assay Kit'ejä.

• · · • 1 · v 1 2. Polyklonaalisen anti-GPIIb-IIIa-vastaseerumin valmistaminen • · • · • · • ·

Kanin anti-GPIIb-IIIa-vasta-aineet valmistettiin immunoimalla koostumuksella, joka .···. sisälsi täydellistä Freundin apuainetta ja 100 mikrogrammaa (pg) eristettyä GPIIb- IHa-proteiinia, joka valmistettiin kuten esimerkissä 1. GPIIb-ffla-tehosteinjektioita • · 30 annettiin useisiin ihonsisäisiin paikkoihin (tavallisesti 100 pg jaettuna 4 paikkaan) täydellisessä Freundin apuaineessa kolmen viikon viikko-ohjelmassa, mitä seurasi kaksiviikkoinen ohjelma kolme lisäkuukautta.

fit I « « I 4 · · * · 1 · 35 105276 3. cDNA-kirjaston konstruktio, vasta-aineseulonta ja cDNA-kloonien identifiointi

Kokonaissolu-RNA valmistettiin HEL-soluista guanidinium-isotiosyanaatti/kesium-kloridimenetelmällä. Poly-(A+)RNA puhdistettiin kokonais-RNA-fraktiosta kahdel-5 la kromatografiajaksolla oligo-(dT)-selluloosalla. Kaksijuosteinen cDNA syntetoi-tiin 10 pgista HEL-poly-(A+)RNA:tä käyttämällä AMV-käänteistranskriptaasia (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, FL) ja satunnaisia oligonukdeonukleotidi-aloit-teita standardimenetelmien mukaisesti. Kooltaan valikoitu cDNA ligatoitiin faagin gtl 1 EcoRI-paikkaan, joka oli pakattu faagiin valmistajan ohjeen mukaisesti käyttä-10 mällä Gigapack-pakkausuutetta, jota on saatavissa Stratagene Cloning Systemsiltä, San Diego, CA) ja sitten se levitettiin ja vahvistettiin E. colilla Y1088. Faagin levittäminen E. colille Y1090, fuusioproteiinisynteesin suorittaminen, siirtäminen nitro-selluloosasuodattimiin ja suodattimien seulominen kanin polyklonaalisella GPIIb-nia-vastaseerumilla, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 2, suoritettiin kuten 15 Young et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA: 80:1194- 1198 (1983) käyttämällä im-muuniperoksidaasia, joka perustuu Vectastein ABC -menetelmään (Vector Laboratories, Burlingame, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Positiiviset kloonit plak-kipuhdistettiin, vahvistettiin ja kerättiin levylysaattina.

200000 rekombinantin alkuseulonta kanin polyklonaalisella GPIIb-IIIa-vasta-aineel-20 la identifioi kuusi immuunireaktiivista kloonia. Positiivisten kloonien beta-galakto-sidaasi-cDNA-fuusioproteiinin immuunireaktiivisuuden monoklonaalisen vasta-ai-neen PMI-1 kanssa toteamiseksi, tuotettiin faagilysogeenejä E. coli -lajissa Y1089, kuten Young et ai., Science, 222:778- 782 (1983) ovat kuvanneet. IPTG:llä indusoi- a .··. duista viljelmistä peräisin olevat lysaatit valmistettiin suspendoimalla uudelleen 25 bakteerisolupelletit pelkistävässä geelinäytepuskurissa, minkä jälkeen näytteet ajet- • · 4..., tiin 6 % SDS-geeleille, siirrettiin nitroselluloosaan, kuten Towbin et ai., Proc. Natl.

. Acad. Sei. USA, 26:4350-4354 (1979) ovat kuvanneet ja ne tutkittiin PMI- l:llä ♦ · · *·’·’ käyttäen Vecastein ABC -menetelmää.

Yhden näistä klooneista, HEL41:n, joka sisälsi 1,1 kiloemäksen (ke) insertin, ha- « · a .···. 30 valttiin säätävän 140 KDa:n bakteerifuusioproteiinin synteesiä, ja sillä on ominais piirteitä, joita on GPIIb-epitoopeilla. Nämä ominaispiirteet käsittävät: (1) poly-': klonaalisen anti-GPIIb-IIIa-vasta-ainekoostumuksen estettävissä oleva reaktiivisuus HEL41-kloonilla kooditetun fuusioproteiinin kanssa estettiin absorboimalla ensin ; eristettyyn GPIIb-IIIa:han; (2) vasta-aineiden, jotka on affmiteettipuhdistettuja fuu- , t; 35 sioproteiinissa GPIIb:llä, spesifinen reaktio verihiutalelysaattien ja puhdistetun I I _ GPIIb-IIa:n immuunitäplissä ja (3) GPIIb-IIIa:n immuunipresipitaation pintamerki- 36 105276 tyistä verihiutaleista affiniteettipuhdistetulla vastaseerumilla. Affiniteettipuhdistettu vasta-aine ei reagoinut vitronektiinireseptorin (VnR) alfa-alayksikön kanssa Wes-tem-täplittämällä ja se ei immunopresipitoinut liittyvää endoteelisolusytoadhesiiniä. Lisäksi HEL41:n koodittama fuusioproteiini oli immuunireaktiivinen monoklonaali-5 sen vasta-aineen PMI-1 kanssa antaen lisätodisteen siitä, että tämä klooni kooditti epitooppeja, joita on saatavissa GPIIb:stä.

4. DNA-sekvennointi ja sekvenssianalyysi HEL41 :stä peräisin oleva yhdistelmäfaagi-DNA puhdistettiin nesteviljelytekniikalla, hajotettiin EcoRLllä ja subkloonattiin M13mpl8:ssa. DNA-sekvenssi kutakin juos-10 tetta varten määritettiin Sanger et al.:n, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467 (1977) dideoksi-ketjuterminaatiomenetelmällä käyttäen 35s-dATP- ja puskurigradi-enttigeelejä, jotka Biggin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:3963-3965 (1983), ovat kuvanneet. cDNA-sekvenssi pidennettiin käyttämällä spesifistä aloittajaohjattua DNA-sekvennointimenetelmää, kuten Strauss et ai., Anal. Biochem. 154:353-360 15 (1986) ovat kuvanneet. Oligonukleotidi-20-meeri-sekvennointialoittajat syntetoitiin

Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer -syntetoijassa. Kumpikin juoste sekvennoitiin epäselvyyksien ratkaisemiseksi.

Kloonin HEL41 nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa 1 ja sillä on seuraavat piirteet. Insertti koostuu 681 emäksen avoimesta luentajaksosta, jossa on TAG-ter-20 minaatiokodoni alkaen asemasta 682, mitä seuraa 3'-translatoitumattoman sekvens-sin 420 emästä. Kloonin 5'-päässä olevalla ensimmäisellä 120 nukleotidillä on kon- • · · ' sensus-Alu-kertautuvan sekvenssin tunnusmerkkejä, jotka osoittavat, että tämä kloo ni voi olla johdettu epätäydellisesti käsitellystä mRNA:sta.

• • · · ·:··: Kloonin HEL41 cDNA-sekvenssi koodittaa avointa luentaa lähtien 227 aminohapos- :T: 25 ta (kuvio 1). Määritetty N-terminaalinen sekvenssi GPIIb:n kevyttä ketjua varten, ♦Y: kuten Charo et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:8351-8356 (1976), ovat rapor- • toineet, voidaan identifioida kloonissa aminohappotähteiksi 157-171. Konsensus- .···. Alu-kertautuva sekvenssi translatoi jaksossa ja selittää HEL41:n koodittamat en- • · \Y*m simmäiset 40 aminohappotähdettä.

• t p · · /; 30 GPIIb:n johdettujen aminohapposekvenssien ja VnR-alfayksiköiden [Suzuki et ai., , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:8614-8618 (1986)] vertailussa matriksianalyysillä ';' [George et ai., PIR Report #REL-0286, National Biomedical Research Foundation 11 (1986)] havaittiin kaksi samanlaista aluetta, jotka ovat mahdollisia konservatiivisille < · substituutioille. Toinen alue, joka käsittää noin 50 aminohappotähdettä, sijaitsee lä- 37 105276 hellä raskaiden ketjujen karboksyyliterminaalia. Toinen noin 15 tähteen alue sijaitsee lähellä kevyiden ketjujen aminoterminaaleja ja käsittää kysteiinitähteitä, jotka voidaan sisällyttää muodostettaessa disulfidisidoksia kummankin proteiinin raskaiden ja kevyiden ketjujen välille. Arvioitaessa GPIIb:n sekvenssin ja VnR-alfa-5 alayksikköjen välisen suhteen tilastollista merkitystä Relate-ohjelmalla käyttäen mutaatiotietomatriksia osoittautui todennäköisyydeltä vähäiseksi löytää sattumalta tällaista samankaltaisuutta läsnäolevaksi kahdessa sekvenssissä (pO.OOOl). GPIIbin sekvenssin ja FnR-alfa-alayksiköiden [Argraves et ai., J. Biol. Chem., 261:12922-12924 (1986)] välisen suhteen analysointi osoitti samanlaista vähäistä mahdolli-10 suutta löytää sattumalta samankaltaisuuden tasoa kahdessa sekvenssissä (P0.0005).

Tietokonehaku ei ilmaissut muita ilmeisiä samankaltaisuuksia tämän GPIIb:n osan ja muiden sekvenssien välillä, joita on läsnä NBRF-proteiinitietokannassa. Lisäksi ei havaittu merkittäviä identtisyyksiä suorassa verrattaessa julkaistuun osittaiseen sekvenssiin hermosoluadheesimolekyyliä, N-CAM, varten.

15 5. Polypeptidisynteesi

Nukleotidisekvenssistä johdettuun aminohappotähdesekvenssiin perustuen synte-toitiin kemiallisesti Applied Biosystems Model 43 OA Peptide Synthesizerillä käyttämällä Hagenmaier et al.:n, Hoppe-Seyler's Z. Phisiol. Chem., 353:1973 (1982) symmetristä anhydridimenetelmää polypeptideitä, jotka vastaavat erilaisia tässä käy-20 tettyjä GPIIb-alueita.

• ·

Syntetoitujen polypeptidien aminohappotähdesekvenssit ja niiden sijainti GPIIb:n « « *. '· johdetuissa aminohappotähdesekvensseissä, kuten taulukossa 1 on esitetty, on lue- teltu taulukossa 2.

• · ... Taulukko 2 • · · • · · • · i.v 25 Nimitys Aminohappotähdesekvenssi

p 19-34 WEAKAGRSPEVRSSRS

• p53-65 REQNSLDSWGPKV

p 129-145 PSPSPIHPAHHKRDRRQ

pl36-145 PAHHKRDRRQ

.J 30 p 144-156 RQIFLPEPEQPSR

« t I

« · · · • · 38 105276 6. Monoklonaalisten vasta-ainekoostumusten valmistaminen

Monoklonaaliset vasta-ainekoostumukset, jotka koostuvat eristetystä immunoglobu-liini-IgG: stä (IgG) eristettiin hiiren vesivatsanesteestä, joka sisälsi hiiren hybridoo-masolulinjaa PMI-1 (ATCC-numero HB 9476), käyttämällä tavanomaisesti proteiini 5 A - Sepharosea, joka saatiin Pharmacia Inc.:stä (Piscataway, NJ) ja sitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetyn IgG:n proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-RAD Protein Assay Kit'ä (Bio-Rad, Richmond, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

PMI-1-monoklonaalisen vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, joka koostumus 10 sisältää 1251-merkittyjä vasta-ainemolekyylejä, 350 mikrolitraan (μΐ) PBS:ää (0,15 MNaCl, 0,01 M natriumfosfaattia, pH 7,09), joka sisälsi 1 milligramma kohti millilitra (mg/ml) edellä mainittua eristettyä PMI-l-IgG:tä, sekoitetttiin 40 mikro-grammaa (pg) kloramiini-T:tä ja 1 milliCurie (mCi) kantajatonta Na^itä (Amers-ham, Arlington Heights, IL). Tulokseksi saatua seosta ylläpidettiin 5 minuuttia noin 15 20 C-asteessa ja sitten siihen sekoitettiin 20 μΐ 2mg/ml-natrium-metabisulfaatti- liuosta (2 mg/ml) ja 20 μΐ kaliumjodidiliuosta. Sen jälkeen sekoitettiin 800 ml PBS:ää, joka sisälsi 1 % BSA:ta, mitä seurasi di-isopropyylifluorifosfaatin lisä-sekoittaminen 10 mM:n loppupitoisuuteen. Tulokseksi saatua seosta ylläpidettiin noin 60 minuuttia 22 C-asteessa, sitten se dialysoitiin vasten PBS:ää. Tulokseksi 20 saadun 125I-merkityn PMI-1 :n spesifinen aktiivisuus oli noin 4,5 mikroCurieta (pCi) per pg.

• « « « « 1 «

Koostumuksia, jotka sisältävät Fab-fragmentteja, jotka ovat edellä mainitusta eriste-tystä IgG:stä, valmistettiin hajottamalla papaiinilla (200:1 painoa IgG:n painosuhde • · '···] papaiiniin) 6 tuntia 37 C-asteessa, mitä seurasi Mage et al.:n, Methods in Enzymo- 25 logy, 70:142-150 (1980) menetelmät. Hajoamaton IgG ja Fc-fragmentti poistettiin • · · : kromatografialla proteiini A - Sepharosella. Tulokseksi saadut Fab-fragmentit, jotka v.: sisälsivät koostumuksia, olivat sitten valmiita käytettäviksi, tai ne l^I-merkittiin tarvittaessa käyttämällä samoja menetelmiä, kuin edellä kuvattiin monoklonaalisia ·1; vasta-ainekoostumuksia varten.

• · · • M • · '"1 30 Esillä olevan keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-ainekoostumukset, joilla on : erilainen immunospesifisyys kuin PMI-1 :llä, valmistetaan myös, kuten edellä ku- vattiin PMI-1 :n yhteydessä. Tällaisia koostumuksia valmistettiin esimerkiksi käyt-. ,. _ tämällä hiiren hybridoomasolulinjaa PMI-2 (ATCC-numero HB 9615).

< 1 1

I I I

39 105276 7. Elisa-testit

A. Polypeptidi-ELISA

Vasta-ainemolekyylit, jotka sisältyivät PMI-1- ja Tab-monoklonaalisiin vasta-ainekoostumuksiin, tutkittiin kyvyltään immunoreagoida polypeptidien p 129-145 ja 5 p144-156 kanssa. (Tab on aivan muu monoklonaalinen vasta-aine, jota on käytetty kontrollina.) Viisikymmentä mikrolitraa (μΐ) päällystysliuosta (0,1 M NaHC03, pH 8,5, 0,1% NaN3), joka sisälsi 20 μΜ polypeptidiä, sekoitettiin tasapohjaisten 96-koloisten mikrotiitterilevyjen koloihin (Immunolon 2; Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Levyjä ylläpidettiin sitten 60 minuuttia 37 C-asteessa polypeptidin 10 sallimiseksi adsorboitua kolojen seinään. Päällystysliuos poistettiin ravistamalla, kolot huuhdeltiin kahdesti pesupuskurilla (0,01 M Tris, pH 7,4, 0,05 % Tween 20, 0,15 M NaCl, 200 mg/ml mertiolaattia) ja 50 pl:aa estoliuosta [5 % naudan seeru-mialbumiinia (BSA; paino/til.) päällystysliuoksessa] sekoitettiin kuhunkin koloon (kiinteä kannatin) ylimääräisten proteiinipaikkojen estämiseksi.

15 Koloja ylläpidettiin 60 minuuttia noin 37 C-asteessa ja sitten estoliuos poistettiin. Kuhunkin koloon sekoitettiin 50 μΐ liuosta, joka sisälsi (a) kanin antipolypeptidivas-ta-ainetta, joka valmistettiin esimerkissä 8 ja laimennettiin 1:200 laimennuspusku-rissa (pesupuskuri, joka sisältää 5 mM EDTA ja 1 mg/ml BSA), (b) 1,5 nanomoolis-ta (nM) PMI-1 monoklonaalista vasta-aine-IgG:tä, joka valmistettiin, kuten esimer-20 kissä 6 kuvattiin, tai (c) TAB-hybridoomavesivatsanestettä ( Dr. R. McEverin, Uni-versity of Texas, San Antonio, TX, valmistama) laimennettuna 1:320000 laimen- • · ' nuspuskuriin. Tulokseksi saatuja kiinto/nestefaasiseoksia ylläpidettiin huoneenläm- pötilassa 60 minuuttia ensimmäisen kiintofaasiin sitoutuneen immuunireaktiotuot- *···* teen muodostumisen mahdollistamiseksi kiintofaasiin sitoutuneen polypeptidin ja • · · • ’ 25 sekoitettujen vasta-aineiden välille. Sitten kiinto- ja nestefaasi erotettiin, kolot huuh- ··« : deltiin kahdesti pesupuskurilla ja ylimääräinen neste poistettiin ravistamalla.

• · I I I • · ·

Viisikymmentä μΐ liuosta, joka sisältää piparjuuriperoksidaasilla merkittyä vuohen .... antihiiri-IgG.tä (Tago Inc., Burlingame, CA), laimennettuna 1:2000 laimennuspus- I”. kuriin, tai vuohen anti-kani-IgG:tä (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA), **··* 30 laimennettuna 1:2000 laimennuspuskuriin, sekoitettiin kuhunkin koloon toisen ; kiinto/nestefaasi-immuunireaktioseoksen (merkitsevä immuunireaktioseos) muodos- ' ' : tamiseksi. Koloja ylläpidettiin 50 minuuttia huoneenlämpötilassa toisen immuuni- . \. f reaktiotuottteen muodostumisen sallimiseksi merkityn vasta-aineen ja ensimmäisen ; . immuunireaktiotuotteen minkä tahansa kiinteään faasiin sitoutuneen vasta-aineen r I « '· [ 35 välille ja sitten ne pestiin kahdesti pesupuskurilla kiintofaasiin sitoutuneiden mer- 40 105276 kitsintä sisältävien immuunireaktiotuotteiden eristämiseksi. Sitten ylimääräinen neste poistettiin koloista.

Viisikymmentä μΐ kromogeenista substraattiliuosta, joka sisälsi 0,4 mg/ml o-fenyyli-diamiinia ja 0,012 % (til/til.) vetyperoksidia CP-puskurissa (243 ml 0,1 M sitruuna-5 happoa ja 250 ml 0,2 M kahdenarvoista natriumfosfaattia H20-litraa kohti), sekoitettiin sitten kuhunkin koloon väriä kehittävän reaktiosekoituksen muodostamiseksi. Sen jälkeen kun väriä kehittävää reaktiosekoitusta oli ylläpidetty kehittyvässä reaktiosekoituksessa 10 minuuttia noin 20 C-asteessa, sekoitettiin kuhunkin koloon 50 μΐ 2 N H2SO:a kehittymisreaktion pysäyttämiseksi, ja tulokseksi saadut liuokset 10 testattiin adsorbanssiltaan 490 nanometrin (nm) valoaallonpituudessa käyttäen mallin 310 ELISA-levylukijaa (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT).

Tämän tutkimuksen tulokset, jotka on esitetty taulukossa 3, osoittavat, että mono-klonaalinen vasta-aine PMI-1 immunoreagoi polypeptidin p 129-145 kanssa, muttei immunoreagoi polypeptidin pl44-156 kanssa. Koska PMI-1, kuten jäljempänä selos-15 tetaan, immunoreagoi kryptisen determinantin kanssa, jonka hGPIIb muodostaa (paljastaa), kun GPIIb-IIIa sitoo fibrinogeenin, osoittaa tämä, että pl29-145:llä on kyky jäljitellä tätä hGPIIb- kryptistä determinanttia.

Taulukko 3

Polypeptidi Monoklonaalinen vasta-aine 20 Antigeeni PMI-1 Tab :.v p 129-145 1,310+0,132 0,068+0,009 I''·· pl44-156 0,069+0,005 0,061+0,005 O BSA1 0,068+0,005 0,060+0,004 • · ·*:*: 25 1 BSA = naudan seerumin albumiinilla päällystettyjä koloja käytettiin negatiivisena kontrollina.

• · · • · 2 Keskimääräiset optiset tiheysarvot + standasrdipoikkeama saatiin triplikaattites-teistä.

··· • · • · I € '

( < I

1 ( < 4 a « i i 41 105276

B. Kilpailu-ELISA

Polypeptidit ja eristetty GPIIb-IIIa tutkittiin kyvyltään kilpailla antigeeninä kiinto-faasi-GPIIb-IIIa:n kanssa immuunireagoinnista vasta-ainemolekyylien kanssa, jotka sisältyivät PMI-1-ja Tab- monoklonaalisiin vasta-ainekoostumuksiin.

5 Kilpailu-ELISA suoritettiin kuten esimerkissä 7A kuvataan paitsi, että 1) polypepti-din sijasta käytettiin GPIIb-IHa:ta, joka eristettiin, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, 20 pg/ml päällystysliuoksessa mikrotiitterilevyn kolojen peittämiseksi ja 2) GPIIb-IIIa:ta tai polypeptidiä sekoitettiin 0,73 μΜ:η, tai vastaavasti 0,25 μΜ:η pitoisuudessa, koloihin välittömästi ennen kuin vasta-aine sekoitettiin immuunireaktiosekoi-10 tuksen muodostamiseksi.

Tämän tutkimuksen tulokset, jotka on esitetty taulukossa 4, esittävät, että kun pl29-145 ja GPIIb-IIIa inhiboivat kompetitiivisesti PMI-1-vasta-ainemolekyylien immunologisen sitoutumisen kiintofaasi-GPIIb-ΙΠΑ, pl44-156 ei tee sitä. Lisäksi ei myöskään polypeptidillä havaittu olevan merkittävää vaikutusta Tab-vasta-ainemo-15 lekyylien kykyyn immunoreagoida GPIIb-IIIa:n kanssa. Nämä tulokset osoittavat, että polypeptidillä p 129-145 on kyky jäljitellä hGPIIb-alueen, joka sisältää pl29-145 aminohappotähdesekvenssin, sekundaarirakennetta ja antigeenidetermi-nantteja.

Taulukko 4 20 Monoklonaaliset vasta-aineet

Kilpailija PMI-1 Tab !···. p 129-145 0,067+0,0021 1,002+0,026 ///.: p 144-156 0,814+0,012 1,117+0,024 ... ei mikään 0,804+0,002 1,040+0,05 25 GPIIb-IIIa 0,433-0,013 0,134+0,010 • « · • « · • · 1 Keskimääräiset optiset tiheysarvot + standardipoikkeama saatiin triplikaattitesteis-tä.

IM • « • · 8. Anti-peptidivastaseerumien valmistus 30 Anti-peptidivasta-aineet tuotettiin immunoimalla kanit esimerkissä 5 valmistetuilla | · r peptideillä. Peptidien kytkeminen glutaraldehydin kanssa tyroglobuliiniin, joka on ( f ! . antigeenikantaja (Bovine Type I, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suoritettiin, ’ · ’ ’ kuten J.G. Dockray, Regulatory Peptides, 1:169-186 (1980) on kuvannut, joka viite 42 105276 on liitetty tähän viitteenä. Sen jälkeen immunointi suoritettiin kuten esimerkissä 2 paitsi, että 400 pg tyroglobuliiniin kytkettyä peptidiä käytettiin primääri-immu-noinnissa.

9. Vasta-aineen sitoutumisen verihiutaleisiin yhdistyneeseen GPIIb:hen inhi-5 bointi polypeptideillä A. Verihiutaleiden valmistus

Eristetyt verihiutaleet, jotka valmistettiin kuten esimerkissä 1, suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan kalsiumitonta Tyrodes-puskuria (0,13 M NaCl, 0,0026 M KC1, 0,002 M MgCl2-6H20, 5 mM Hepes, 0,012 M NaCHC>3, pH 7,2), joka sisälsi 1 mg/ml 10 BSA:ta ja 1 mg/ml dekstroosia. Sitten verihiutalesuspensio levitettiin Sepharose CL2B-pylvääseen (40 ml kokonaiskerrostilavuus, Pharmacia Inc., Piscataway, NJ), joka oli tasapainotettu samalla Tyrodes-puskurilla. Verihiutaleet otettiin talteen CL2B-pylvään tyhjästä tilavuudesta noin 4-5 ml:n lopputilavuudessa, nimettiin pestyiksi verihiutaleiksi ja tulokseksi saatujen pestyjen verihiutaleiden suspensioiksi ja 15 ne laskettiin Coulter Model II -laskijalla (Coulter Electronics, Inc., Hialeh, FL). Koko verihiutalevalmistusmenetelmä suoritettiin muovisissa säiliöissä ja tehtiin huoneenlämpötilassa.

B. Verihiutalekilpailutesti

Pestyihin verihiutaleisiin (2xl0^/ml), jotka valmistettiin Tyrode's-puskurissa, kuten 20 esimerkissä 9A kuvattiin, sekoitettiin etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) si-ten, että saatiin 5 mM:n loppupitoisuus ja sitä ylläpidettiin 30 minuuttia 37 C- # asteessa PMI-1-sitovan epitoopin esiintulemisen mahdollistamiseksi. Sitten verihiu- l«· taleisiin sekoitettiin polypeptidiä pl29-145 kuviossa 2 esityissä pitoisuuksissa, ja • t .... sitten edelleen siihen sekoitettiin esimerkissä 6 valmistettua 125j_ merkittyä PMI-1 :ä • · · I . 25 1 μΜ:η merkittyä vasta-ainetta tuottamiseksi tulokseksi saatavaan immuunireaktio- *·*·* sekoitukseen. Tätä sekoitusta ylläpidettiin 30 minuuttia 22 C-asteessa immuunire- aktiotuotteiden muodostumisen sallimiseksi. Sen jälkeen 125j.pMI- 1/verihiutale-immuunireaktiotuotteet eristettiin sitoutumattomasta 125j_p^jj_i;s^ koko ylläpide- • •f v..: tyn sekoituksen sentrifugoinnilla 0,3 ml:n 20 % sakkaroosia läpi Beckman Microfii- 30 ge B:ssä (Beckman Instruments Inc. Fullerton, CA) verihiutalepelletin muodostamiseksi. Verihiutalepellettiin yhdistyneen radioaktiivisen 125i_pfy[j_i;n määrä määritettiin tuikespektrometrialla.

i < ,· l » i » « .'.,; Tämän tutukimuksen tulokset, jotka on esitetty kuviossa 2, osoittavat, että polypep- « » tidi p 129-145 voi inhiboida kompetitiivisesti PMI-l-vasta-ainemolekyylien sitoutu- 43 105276 misen verihiutalekalvoon yhdistyneeseen GPIIbihen kaksiarvoisten kationien puuttuessa. Kuvio 2 osoittaa myös, että noin Kd pl29-145/PMI-l-vuorovaikutuksesta on 1,2 pm, koska 50 %:n inhibitio saavutettiin 1,6 μΜ polypeptidipitoisuudessa, kun vasta-ainemolekyylejä oli läsnä 1 μΜ:η pitoisuudessa.

5 10. hGPIIb-kryptisen determinantin ilmentäminen fibrinogeeniin sitoutuneilla verihiutaleilla

Runsasverihiutaleinen plasma (PRP) valmistettiin, kuten esimerkissä la, ja se jaettiin kolmeen alikvoottiin. Yhdessä alikvootissa verihiutaleet stimuloitiin ilmentämään funktionaalista GPIIb-IIIa:ta (fibrinogeenireseptorit) adenosiinidifosfaatin 10 (ADP) sekoituksella 50 μΜ loppupitoisuuteen saakka ADP-stimuloitujen verihiutaleiden tuottamiseksi. Toisessa alikvootissa stimuloitiin GPIIb-IIIa-ilmentyminen epinefriinin sekoituksella 50 μΜ loppupitoisuuteen. Kummassakin tapauksessa GPIIb-ffla-fibrinogeenireseptorit, jotka ilmentyivät stimuloituihin verihiutaleisiin, sitoivat fibrinogeenin, jota oli läsnä plasmassa tuottaen fibrinogeeniin sitoutuneita 15 verihiutaleita. Negatiivisena konrollina kolmas alikvootti ei saanut stimulusta ei-stimuloitujen verihiutaleiden tuottamiseksi.

l^.i-merkittyjä PMI-l-Fab-fragmentteja, jotka valmistettiin tavanomaisilla tekniikoilla esimerkissä 6 kuvatuista ^5j.merjcjtyjstg vasta-aineista, sekoitettiin sitten 0,8 μΜ loppupitoisuuteen kuhunkin PRP-alikvooteista. Täten muodostuneita im-20 muunireaktiosekoituksia ylläpidettiin 37 C-asteessa 30 minuuttia merkittyjen im-muunireaktiotuotteiden, so. fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutale/^I-komplek- • ' sien, muodostumisen sallimiseksi. Merkitsintä sisältävät immuunireaktiotuotteet ero- : t,,: tettiin sitten sitoutumattomasta 125i_pMI-l;stä sentrifugoimalla verihiutaleet sakka- ·:*·: roosikerroksen läpi kuten esimerkissä 9B kuvattiin.

• · · • · · • * · I . 25 Kuvio 3 esittää tämän tutkimuksen tuloksia ja osoittaa, että PMI-l-vasta-ainemole- • · « *·*·' kyylit immunoreagivat stimuloitujen, fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden kanssa, mutteivät immunoreagoi oleellisesti ei-stimuloitujen verihiutaleiden kanssa.

·...'· Uskotaan, että 1^5j_p^fj_ j^ j0ta havaittiin "sitoutuneena" stimuloimattomassa PRP- ··« alikvootissa, johtui ei-spesifisestä sitoutumisesta ("takertumisesta") ja/tai stimuloitu-: 30 jen fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden tai käsittelyn tuloksena stimuloitu jen ja sitoutuneiden verihiutaleiden luonnollisena esiintyvän taustatason läsnäolosta.

Täten nämä tulokset osoittavat, että kun GPIIb-IIIa-sytoadhesiini sitoo fibrinogee- v : nin, arg-gly-asp-(RGD)-aminohappotähdesekvenssin sisältävä ligandin, saa se ai- « · kaan muuten kryptisen antigeenideterminantin ilmentymisen. Täten PMI-l-vasta-35 ainemolekyylejä, joilla on samankaltainen immuuni spesifisyys, voidaan käyttää sti- 44 105276 muloitujen fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden vaskulaarinestenäytteessä läsnäolon testaamiseen.

11. Verihiutaleaggregaation inhibointi polypeptideillä

Kahteen sataan pl:aan runsasverihiutaleista plasmaa (PRP), joka valmistettiin, kuten 5 esimerkissä 1 kuvattiin, sekoitettiin 190 μΐ Tyrode's-puskuria, joka sisältää BSA:ta ja dekstroosia (kutakin 1 mg/ml) ja erilaisia määriä polypeptideitä p 129-145 tai p 144-156, jotka on osoitettu kuviossa 4. Sitten sekoitettiin kymmenen μΐ ADP:tä (80 μΜ Tyrode's-puskurissa) verihiutaleaggregaation stimuloimiseksi. Sekoitusta ylläpidettiin 37 C-asteessa samalla kun sekoituksen valonläpäisyn muutoksia tarkkailtiin 10 yli ajan käyttämällä Dual Sample Aggregation Meteriä (Model DP-247E, Sienco Inc., Morrison, CO).

Aggregaatiomittari kalibroitiin käyttämällä liuosta, joka sisälsi 200 μΐ PRP:tä ja 200 μΐ Tyrode's-puskuria valonläpäisyn alhaisen peruslinjan asettamiseksi 5 prosenttiin kontrolliaggregaatioita varten ja 10 prosenttiin aggregaatioita varten poly-15 peptidin läsnäollessa. 100 prosentin valonläpäisyn yläraja asetettiin tasaiseksi käyttämällä 100 ml:n PRP:tä ja 300 μ1:η Tyrode's-puskurin sekoitusta.

12. GPIIb-kevyen ketjun immunireaktio käyttämällä anti-peptidi-vastaseerumia

Noin yksi biljoona verihiutaletta, jotka valmistettiin, kuten esimerkissä IA, suspen-doitiin uudelleen yhteen millilitraan kylmää (so., 4 C-astetta) PBS:ää ja siihen sekoi-20 tettiin 200 pg laktoperoksidaasia (Sigma) ja 2 mCi kantajatonta Nal25i:tä • · ·// (16 mCi/pg, Amersham, Arlington Heights, IL) verihiutaleita merkitsevän suspensi- '··' on muodostamiseksi. Sitten peroksidiin lisättiin tätä suspensiota kahtena 5 pl:n lisä- yksenä 0,06 % varastoliuoksesta 5 minuutin välein ja sitä ylläpidettiin kauttaaltaan * * * : 4 C-asteessa merkitsemisreaktion tapahtumisen sallimiseksi. Sen jälkeen reaktio py- 25 säytettiin sekoittamalla 200 pg tyrosiiniä ja se pestiin viidessä erässä toistetulla sentrifugoinnilla 1200xg:ssä 15 minuuttia, mitä seurasi uudelleensuspendointi kyl- .*··· mässä PBS:ssä merkityn verihiutalesuspension muodostamiseksi. Viidennen sentri- ··· .···. fugointivaiheen jälkeen merkityt verihiutaleet lysoitiin suspendoimalla uudelleen ’** 40ml:ssa lyysipuskuria (0,5 % Triton X-100 [til./til], 10 mM EDTA, 10 pg/ml 30 bentsamidiinia ja 100 yksikköä/ml Trasylol; kaikki Sigmasta) merkityn verihiutale-lysaatin muodostamiseksi.

f < K

; . Yhteen ml:aan merkittyä verihiutalelysaattia sekoitettiin 15 μΐ lämmöllä inaktivoitua • · · '· normaalia kanin seerumia (NRS) ja sitä ylläpidettiin 30 minuuttia 22° C:ssa, mitä seurasi 100 pl:n 10-%:isen (til./til.) Pansorbin (Behring Diagnostics, La Jolla, CA) 45 105276

liuoksen, joka on valmistettu immuunireaktiopuskuriin (IPB: 0,02 M Tris-Cl, pH

7,4, 0,156 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM bentsamidiini-HCl, 10 pg/ml soijapaput-rypsiini-inhibiittoria, 0,2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 % [til./til.] Triton X-100, 0,05 % [til-/til-] Tween 20, 0,02 % [paino/til.] NaN, 5 yksikköä/ml Trasylol, 5 kaikki Sigmasta), lisäsekoittaminen, 1 minuutin sentrifugointi Beckman Microfuge B:ssä ja tulokseksi saadun supematantin eristäminen selkeytetyn lysaatin muodostamiseksi. Tämä lisätyn NRS:n, ylläpidon, lisätyn Pansorbiinin ja sentrifugoinnin selkeytysmenettely toistettiin kahdesti ja sitten seurasi sama menettely uudelleen Pansorbinia käyttäen, mutta jättäen NRS- ja ylläpitovaiheet pois, kolmasti selkeyte-10 tyn lysaatin muodostamiseksi.

Kolmasti selkeytettyyn lysaattiin lisättiin sitten 250 μΐ IPB:tä, 4 μΐ esimerkissä 8 valmistettua anti-polypeptidi-pl44- 156-vasta-seerumia, esimerkissä 2 valmistettua anti-GPIIb- Iliaita tai NRS:ää ja naudan seerumialbumiinia (BSA) 1 % BSA:n lop-pupitoisuuteen tulokseksi saatavassa sekoituksessa. Sitten tätä tulokseksi saatua se-15 koitusta ylläpidettiin 12-18 tuntia 4° C:ssa, siihen sekoitettiin lisäksi 100 μΐ 10 % Pansorbinia ja sitten sitä ylläpidettiin 1 tunti 22°C:ssa. Sen jälkeen sekoitusta sentri-fugoitiin Microfuge B:ssä yksi minuutti ja tulokseksi saatu pelletti eristettiin. Sitten eristetty pelletti pestiin kahdesti IPBissä, kerran 0,5 M LiClissa ja taas kerran IPBissä, jolloin peseminen käsittää uudelleensuspendoinnin noin 1 ml:aan haluttua 20 puskuria, mitä seurasi sentrifugointi yhden minuutin ajan Microfuge B:ssä ja tulokseksi saadun pelletin eristäminen. Sitten pestyt pelletit liuotettiin minkä tahansa läs-nä olevan immuunikompleksin vapauttamiseksi kuumentamalla 3 minuuttia 100° • * ;·.„ C:ssa noin 100 mkssa Laemmlin kuvaamaa näytepuskuria. Katso esimerkiksi La- .···. emmli, U.K., Nature (London), 227:680-685 (1970). Sitten liuotettuja immmuni- • * 25 komplekseja sentrifugoitiin yhden minuutin ajan Microfuge B:ssä ja tulokseksi saatu • · ... supematantti, joka sisältää immuunipresipitoituja proteiineja, analysoitiin elektrofo- . reesilla 15 % polyakryyliamidilevygeelissä käyttäen Laemmli-puskureita, jotka si- • · · *·** sältävät 5 % 2-merkaptoetanolia. Sen jälkeen geelit kuivattiin ja niiden sisältämät proteiinit visualisoitiin autoradiografivalotuksella Kodak X-Omat AR -filmille • · · 30 (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.). Tulokseksi saatujen visualisoitujen proteiinien molekyylipainot arvioitiin elektroforeettisen liikkuvuuden ^C-merkittyihin proteii-nistandardeihin suhteen, jotka standardit vaihtelevat alueella 12300-97400 daltonin molekyylipainoalueella, perusteella (New England Nuclear, Boston, MA).

. ; : Tällä tavalla analysoidut lysaatit antoivat proteiinin, joka visualisoitiin tulokseksi : 35 saaduilla geeleillä, molekyylipainon ollessa noin 20 KDa, mikä vastaa GPIIb- kevyen ketjun proteiinia (lGPIIb), kun käytettiin anti-polypeptidi-pl44-156-vasta- 46 105276 seerumia, jota ei oleellisesti havaittu, kun käytettiin polyklonaalista anti-GPIIb-Ma-vastaseerumia tai NRS:ää. Täten anti-polypeptidi-pl44-156-vasta-seerumia ja vasta-ainekoostumuksia, joilla on samanlainen immunospesifisyys, voidaan käyttää lGPIIb:n havaitsemiseen.

5 13. GPIIb-IIIa-kryptisten antigeenideterminanttien ilmentäminen ligandisitomi- sella A. Vasta-aineen verihiutaleisiin sitoutumisen, mikä ilmentää kryptisiä antigee-nideterminantteja sekoittamalla, testaaminen

Pestyjä verihiutaleita valmistettiin lxl()8:n per ml -pitoisuuteen, kuten esimerkissä 10 9A kuvattiin, paitsi että käytettyä Tyrode's-puskuria käsiteltiin ensin sekoittamalla siihen Chelex 100: a (200-400 meshin natriummuoto, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), niitä ylläpidettiin minkä tahansa Tyrode's-puskurissa olevan kaksiarvoisen kationin kompleksoitumiseksi ja suodatettiin kompleksoituneiden kaksiarvoisten kationien poistamiseksi puskurista.

15 Aiemmin valmistettu pestyjä verihiutaleita sisältävä liuos jaettiin kahteen alikvoot-tiin ja kussakin alikvootissa olevia verihiutaleita stimuloitiin sitten sekoittamalla ADP:tä 50 μΜ loppupitoisuuteen ADP-stimuloitujen verihiutaleiden muodostamiseksi tai niitä ei stimuloitu.

. . Monoklonaalisiin vasta-ainekoostumuksiin, jotka sisälsivät joko 125i_merkjttyjä ko- ‘ 20 konaisia vasta-ainemolekyylejä tai 125j_merkittyjä Fab-fragmentteja, ja jotka vai- « « _'' niistettiin kuten esimerkissä 6, sekoitettiin ensin erilaisia polypeptideitä ja joko 1 · · ‘ kaksiarvoisia kationeita tai EDTA:a. Sitten 125_i_merkjttyihin vasta-aine/polypepti- disekoituksiin sekoitettiin joko stimuloituja tai stimuloimattomia verihiutalealikvoot- • · · v ’· teja siten, että vasta-ainetta tai Fab-fragmentteja esiintyi noin 0,8 μΜ:η pitoisuu- :Y: 25 dessa. Sitten tulokseksi saatuja immuunireaktiosekoituksia ylläpidettiin 30 minuuttia 37° C:ssa kryptisen antigeenideterminantin ilmentymisen sallimiseksi ja 125j.mer. .··*· kittyjen immuunireaktiotuotteiden, so. ligandiin sitoutuneiden verihiutale/125i_vas_ .···. ta-aine- tai muodostumisen sallimiseksi. Sitten merkitsintä sisältävät immuunireaktiotuotteet erotetaan sitoutumattomasta 125j.mer.

30 kitystä vasta-aineesta tai Fab-fragmentista sentrifiigoimalla verihiutalealikvootti sak-karoosikerroksen läpi, kuten esimerkissä 9B kuvattiin.

; . Taulukko 5 osoittaa tulokset, jotka saatiin testattaessa merkityn vasta-aineen sitou-

i « I

'« tumista verihiutaleisiin ligandien läsnäollessa käyttämällä monoklonaalista vasta- ainetta PMI-1.

47 105276

Taulukko 5

Ligandista riippuva PMI-l-IgG:n tai Fab:n verihiutaleisiin sitoutumisen lisääntyminen PMI-l:n sitoutumisen lisäys^ 5 Vasta-ainelajit Ligandi^ Stimuloimaton Stimuloitu PMI-l-IgG KYGRGDS 6378+753 6000+714 GRGDSP 5313+522 5561+158 GRGESP 898+357 837+374 H-12 N.D.1 3663+878 10 EDTA 6064+593 5674+512 PMI-l-Fab KYGRGDS 7722+1189 5661+373 GRGDSP 4437+852 5250±300 GRGESP -279+281 147+165 15 H-12 N.D. 3014+430 EDTA 5299+225 6505+560 1 Sitoutuneen PMI-l:n määrän kasvu ilmaistaan PMI-l:n molekyylien sitoutumisena verihiutaletta kohti + havaittuna standardipoikkeamana, jolloin kasvu on määrä, joka 20 on sitoutunut ligandin läsnäollessa vähennettynä määrällä, joka on sitoutunut ligan- , v, din poissaollessa, mutta 2 mM CaCl2 ja 1 mM MgCl2 läsnäollessa. Määrä, joka si- « < « / toutui kaksiarvoisten kationien läsnäollessa, mutta ilman ligandia stimuloimattomil- le tai stimuloiduille verihiutaleille oli 6769+84 tai 6643+157 molekyyliä/verihiutale "i'm PMI-l-IgG:lle vastaavasti ja se oli 3917+212 tai 3785+150 molekyyliä/verihiutale 25 PMI-1-Fab:lle.

« · * · · • « « ^Käytetty ligandi oli eräs osoitetuista polypeptideistä, joka oli syntetoitu kuten esi- • · merkissä 5 ja lisätty 1 mM:n loppupitoisuuteen esimerkissä 13A selostettuun im-.···. muunireaktiosekoitukseen, tai se oli kontrollipolypeptidi H-12, jossa on amino- < happosekvenssi HHLGGAKQAGDV ja se oli johdettu 399-410 tähteissä olevasta ·;· 30 fibrinogeeni-gamma-ketjusta, siis 1 mM:ssa, tai se oli 4,5 mM EDTA:a, joka oli li sätty ligandipolypeptidin puuttuessa kontrollina. Kaikissa tapauksissa, joissa EDTA:a ei ollut sisällytetty, oli sisällytetty 2 mM CaCl2 ja 1 mM MgCl2.

I # 1

Ei määritetty.

48 105276

Taulukko 6 esittää tulokset siitä, kun tutkittiin vasta-aineen verihiutaleisiin sitoutumista ligandien läsnäollessa käyttäen monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää kokonaisia vasta-ainemolekyylejä tai Fab-fragmentteja, jotka on tuotettu hy-bridoomalla PMI-2 (so. PMI-2-monoklonaalinen vasta- aine).

5 Taulukko 6

Sitoutunut PMI-21

Kaksivalenttinen

Ligandi^ ionP Stimuloimaton Stimuloitu ei mikään CaCl2 1220 2480 10 RGDS CaCl2 2210 10780 SDGR CaCl2 I960 2360 GRGESP CaCl2 1560 4680 400-411 CaCl2 1840 9650

Fg CaCl2 2300 13800 15 ei mikään EDTA 8660 10670 RGDS EDTA 8540 10080 1 Sitoutuneen PMI-2-IgG:n määrä määritettiin, kuten esimerkissä 13 A kuvattiin ja se ilmaistaan sitoutuneina PMI-2-molekyyleinä verihiutaletta kohti osoitetuissa im-20 muunireaktio-olosuhteissa.

I r ::: ^Käytetty ligandi oli eräs osoitetuista polypeptideistä, joka valmistettiin kuten esi merkissä 5 ja lisättiin 0,5 mM:n loppupitoisuuteen tai se oli polypeptidi, jossa on sekvenssi, joka vastaa fibrinogeeni-gamma-ketjun sekvenssiä tähdeasemasta 400 ·:··· tähdeasemaan 411 (400-411) myös lisättynä 0,5 mM:iin, fibrinogeeniproteiini, joka 25 oli eristetty kuten Marguerie et ai., J. Biol. Chem., 254:5357-53563 (1979) kuvasi-vatja sitä käytettiin 15 μΜ:η loppupitoisuudessa tai kontrollina käytettiin ei lisättyä • · · ligandia.

·,./ ^Lisätty kaksiarvoinen ligandi oli joko 1 mM CaCl2 tai 5 mM EDTA.

··· • · • · r Taulukoissa 5 ja 6 esitetyt tulokset osoittavat fibrinogeenin (Fg), Fg:stä johdetun 30 peptidin, 400-411 :n ja RGD:tä sisältävien peptidien kykyä sitoa GPIIb-IIIa ja aiheut taa kryptisiä antigeenideterminantteja, jotka joko PMI-1 tai PMI-2 tunnistaa esiin-; tyviksi olosuhteisssa, joissa nämä antigeenideterminantit ovat tavallisesti tukahdutet- , ·, : tuja, nimittäin CaCl2:n fysiologisten pitoisuuksien läsnäollessa.

I « 49 105276

Tulokset osoittavat myös, että PMI-2:n tunnistama kryptinen antigeenideterminantti on indusoitavissa vain ligandin sitoutuessa stimuloituihin, muttei stimuloimattomiin, verihiutaleisiin. PMI-l:n tunnistama antigeenideterminantti on puolestaan indusoitavissa polypeptidiligandin sitoutuessa sekä stimuloituihin että stimuloimattomiin 5 verihiutaleisiin.

Lisäksi tulokset osoittavat, että ligandi on rakenteellisesti GPIIb-IIIa:lle spesifinen. Käänteispeptidi SDGR, ei indusoi PMI-2:n tunnistamaa antigeenideterminanttia ja konservatiivinen substituutio vaihtamalla glutaamihappo (E) normaalisti havaittavan aspartaamihappotähteen (D) tilalle saa aikaan peptidin, joka on huomattavasti vä-10 hemmän tehokas kryptistä antigeenideterminanttia indusoivana ligandina.

Kun polypeptidiligandin RGDS, pitoisuutta vaihdeltiin edellä mainitussa vasta-aineiden verihiutaleisiin sitoutumistestissä, generoitiin annos-vastekäyrä kryptisten antigeenideterminanttien ligandi-induktiota varten, jotka determinantit esiintyvät joko stimuloiduissa tai stimuloimattomissa verihiutaleissa. Annos-vastekäyrän tulokset 15 on esitetty kuviossa 5 käyttämällä joko PMI-1- tai PMI-2-IgG:tä kryptisen antigeeni-determinantin havaitsemiseksi ja ne on ilmaistu LIBS-induktion prosenttina. Poly-peptidin läsnäollessa sitoutuneen IgG:n määrä on ilmaistu sitoutuneen TgG:n maksimimäärän prosenttina täydellisen ligandilla indusoidun sitoutumispaikan (LIBS) induktiossa, jolloin IgG-sitoutumisen mitattuna IgG-molekyyliä per verihiutale 20 4,5 mM EDTA:n läsnäollessa ja peptidien poissaollessa todettiin olevan 100 % in-

, . duktion ja IgG-sitoutumisen todettiin olevan 0 % induktion 2 mM CaCl2 ja 1 mM

MgCl2 läsnäollessa ja peptidien puuttuessa.

Taulukossa 5 esitetyt tulokset osoittavat, että polypeptidiligandi indusoi kahta eri-·:·: laista kryptistä antigeenideterminanttia samanlaisissa noin 2 mM:n puolimaksimaa- 25 lisissä ligandipitoisuuksissa. Lisäksi tulokset osoittavat, että kun PMI- 2:n tunnista-ma determinantti oli indusoitavissa stimuloiduissa, muttei stimuloimattomissa veri- • « · hiutaleissa, PMI-l:n tunnistama kryptinen antigeenideterminantti oli indusoitavissa ... sekä stimuloiduissa että stimuloimattomissa verihiutaleissa käyttämällä RGDS- . polypeptidiä.

• t • · ··· 30 On huomattava, että vaikka sekä PMI-1- että PMI-2-monoklonaaliset vasta-aineet ovat anti-LIBS-monoklonaalisia vasta-aineita, näiden kahden vasta-aineen ominaisuudet ovat erotetttavissa. Täten reseptorin yhdistyminen ligandiin voi indusoida ; v : useamman kuin yhden LIBS .n. Tuloksena voidaan esillä olevan keksinnön menetel- miä käyttää tuottamaan enemmän kuin yksi erillinen monoklonaalinen vasta-aine-35 laji, joka immunoreagoi solun pintareseptori-ligandikompleksin kanssa.

50 105276 B. Vasta-aineen sitoumisen liukenevaan puhdistettuun GPIIb-IIIa, mikä ilmentää krytisiä antigeenideterminatteja, testaaminen

Erilaisten polypeptidiligandien kykyä indusoida kryptisen antigeenideterminantin ilmentymistä tutkittiin käyttämällä liukenevaa eristettyä GPIIb-IIIa:ta.

5 Tähän käytettiin esimerkissä 7 kuvattua kilpailu-ELISA:a seuraavin poikkeuksin. Mikrotiitterilevyt peitettiin käyttämällä päällystysliuosta, joka sisälsi GPIIb-IIIa:tä, joka oli eristetty kuten esimerkissä 1 kuvattiin, 10 pg per ml:n pitoisuudessa. Suojaamisen jälkeen kaikki käytetyt liuokset käsiteltiin Chelex 100:11a ennen käyttöä, kuten kuvattiin Tyrode's-puskurin yhteydessä esimerkissä 13A. Valmistettiin im-10 muunireaktiosekoitukset, jotka sisälsivät (1) 1,5 nanomoolista PMI- l-IgG:tä valmistettuna kuten esimerkissä 7A on kuvattu, (2) 2 mM CaCl2, (3) GPIIb-IIIa, eristettynä kuten esimerkissä 1 on kuvattuja lisättynä 40 pg/ml:n loppupitoisuuteen PMI-1-testiä varten, ja (4) polypeptidiä 1 mM:na. Immuunireaktiosekoituksia ylläpidettiin 22° C:ssa 16-20 tuntia ensimmäisen kiintofaasiin sitoutuneen immuunireaktiotuot-15 teen muodostumiseksi kiintofaasiin sitoutuneen GPIIb-IIIa:n ja lisättyjen vasta-aineiden välille.

Edellisten tutkimusten tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 7.

Taulukko 7 )V( PMI-l:llä määriteltyjen kryptisten antigeenideterminanttien ilmentäminen, jotka ,! ' 20 determinantit on indusoitu ligandisitomisella GPIIb-IIIa:han liuoksessa.

i i

Ilmentymisprosenttil ·:··: Ligandi2 PMI-1 Tab j·:·; KYGRGDS 65+22(3) 98+25(3) .γ. GRGDSP 53+22(5) 85+27(3) ” 25 RGDS 42+16(3) 92+11(3) GRGESP 18+13(3) 106+24(3) SDGR 18+13(3) 79+25(3)

Kontrolli 20+9(5) 84+13(4) 30 ^Ilmennetty prosentti on kryptisen antigeenideterminantin määrä, jota on GPIIb-IIIa:ssa indusoituna polypeptidisitomisella. Tiedot on esitetty maksimaalisen deter-',' > > minantti-ilmentymisen prosenttina käyttämällä GPHb-IIIa:ta 5 mM EDTA:n läsnä ollessa. Mittauksien lukumäärä, joita mittauksia tehtiin kussakin olosuhteessa, on 51 105276 osoitettu suluissa ja tulokset ovat näiden mittauksien keskiarvo + standardipoikkea-ma.

lisätty ligandi oli polypeptidi, joka oli syntetoitu, kuten esimerkissä 5 on kuvattu, ja jonka sekvenssi on esitetty osoitetulla yksikiijaimisella koodilla. "Kontrolli" tar-5 koittaa, ettei polypeptidiä lisätty.

Taulukon 7 tulokset osoittavat, että RGD:tä sisältävät polypeptidiligandit indusoivat kryptisen antigeenideterminantin ilmentymistä GPIIb-IIIa:lla tavalla, joka on analoginen sen kanssa, joka on havaittu käytettäessä intakteja verihiutaleita (katso esim. taulukko 6). Ligandilla indusoidun ilmentymisen spesifisyys varmennettiin käyttä-10 mällä polypeptideitä, joilla on käänteissekvenssit (SDGR) tai konservativiiset substituutiot (GRGSP) ja lisäksi se varmennettiin sillä, ettei havainnoitu mitään merkittävää ligandivaikutusta Tab-monoklonaaliseen vasta-ainesitoutumiseen. Nämä tulokset osoittavat, että monoklonaalisen vasta-aineen PMI-1 tunnistaman kryptisen antigeenideterminantin ligandilla indusoitu ilmentyminen on GPIIb- lila: n luontai-15 nen ominaisuus eikä riipu GPIIb-IIIa:n yhdistymisestä verihiutaleisiin.

Edellä oleva selitys, mukaan lukien erityisten suoritusmuotojen tarvitsemat esimerkit, on tarkoitettu selventämään keksintöä eikä sitä pidä ottaa sen rajoituksena. Lukuisia muunnelmia ja modifikaatioita voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön todellisesta hengestä ja piiristä.

• · • · * • · · « « • • « t r • · • · m • · · • « · · • · · • · · • « • · · • · • * • · · • · · • · • · • · t < « i r i « « · i ·

Claims (16)

1. 52 105276 1. hGPIIb-kiyptinen determinanttipolypeptidianalogi, tunnettu siitä, että se käsittää korkeintaan noin 50 aminohapporyhmää ja aminohappotähdesekvenssin, joka vastaa kaavan:
2. 5 -PSPSPIHPAHHKRDRRQ- esittämää sekvenssiä, jolloin mainittu polypeptidianalogi kykenee kompetitiivisesti inhiboimaan (a) fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden aggregoitumisen tai (b) PMI-l-vasta-ainemolekyylien (ATCC HB 9476) sitoutumisen hGPIIb.hen, kun hGPIIb on läsnä gPIIb-HIa-fibrinogeenikompleksina.
3. 2. Vasta-ainekoostumus, tunnettu siitä, että se koostuu oleellisesti vasta-aine- molekyyleistä, jotka: a) immunoreagoivat kaavan: PSPSPIHPAHHKRDRRQ esittämän polypeptidin kanssa; ja 15 b) eivät oleellisesti immunoreagoi kaavan: REQNSLDSWGPKV « « i « » I I « t I : , r esittämän polypeptidin kanssa. e f fis f 1 I ‘·'' 3. Hybridooma, joka on nimetty PMI-2:ksi, tunnettu siitä, että se tuottaa vasta- i"· ainemolekyylejä, jotka immunoreagoivat stimuloitujen, fibrinogeeniin sitoutuneiden Ml _ V : 20 verihiutaleiden kanssa, ja se on talletettu talletusnumerolla ATCC HB 9615. • « • · · « i ·
4. 4. Monoklonaalinen vasta-ainekoostumus, tunnettu siitä, että se käsittää hybri- ... doomalla PMI-2 (ATCC HB 9615) tuotettuja vasta-ainemolekyylejä, jotka immuno reagoivat stimuloitujen, fibrinogeeniin sitoutuneiden verihiutaleiden kanssa. • · • · IM
5. 5. Diagnostinen järjestelmä, joka on välinesarjamuodossa, vaskulaarinestenäyt-25 teen testaamiseksi, onko siinä verihiutaleita, ilmentämällä GPIIb-IIIa-ligandikomp- leksi, tunnettu siitä, että järjestelmä käsittää: I c c i I < 1 i r i I I 53 105276 pakkauksen, joka sisältää anti-GPIIb-IIIa:ta määränä, joka on riittävä vähintään yhden testin suorittamiseksi, anti-GPIIb-IIIa-vasta-ainemolekyylejä, jotka on tuotettu hybridoomalla PMI-2 (ATCC HB 9615).
6. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen diagnostinen järjestelmä, tunnettu siitä, että 5 sanotut vasta-ainemolekyylit on merkitty radionuklidilla ja ne ovat läsnä monoklo- naalisena vasta-ainekoostumuksena.
7. 7. Diagnostinen järjestelmä, joka on välinesarjamuodossa, veritulpan testaamiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää: pakkauksen, joka sisältää määränä, joka on riittävä vähintään yhden testin suoritta-10 miseen, monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää anti-GPIIb-IIIa-vasta-ainemolekyylejä, jotka on tuotettu hybridoomalla PMI-2 (ATCC HB 9615).
8. 8. Menetelmä verihiutaleita sisältävän vaskulaarinestenäytteen testaamiseksi, onko siinä läsnä verihiutaleita, ilmentämällä GPIIb-HIa-kompleksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: 15 a) immuunireaktiöseoksen muodostamisen sekoittamalla vaskulaarinestenäyttee-seen tehokas määrä monoklonaalista vasta-ainekoostumusta, joka sisältää anti-GPIIb-IIIa-vasta-ainemolekyylejä, jotka on tuotettu hybridoomalla PMI-2 (ATCC HB 9615); . v b) seoksen ylläpitämisen ajanjakson, joka on riittävä sanotuille vasta-aineille, jot- •« ' ' · 20 ta ne immunoreagoivat minkä tahansa fibrinogeeniin sitoutuneen verihiutaleen kans- :,,,: sa, joita on läsnä näytteessä, ja immuunireaktiotuotteen muodostumiseksi; ja • · ... c) minkä tahansa vaiheessa b muodostuneen immuunireaktiotuotteen havaitsemi- * · « : . sen. ♦ · * ♦ ♦ · • · 25 • · · .*·*. 1. hGPIIb-kryptisk determinantpolypeptidanalog, kännetecknad av att den inne- • häller högst ca 50 aminosyragrupper och en aminosyrarestsekvens som motsvarar en sekvens enligt formeln:
9. 30. PSPSPIHPAHHKRDRRQ - , ( 54 105276 varvid nämnda polypeptidanalog kompetitivt förmar inhibera (a) aggregation av trombocyter bundna vid fibrinogen eller (b) bindning av PMI-l-antikroppsmolekyler (ATCC HB 9476) vid hGBIIb, da hGBIIb är närvarande som gBIIb-IIIa-fibrino-genkomplex. 5
10. 2. Antikroppssammansättning, kännetecknad av att den bestär väsentligen av antikroppsmolekyler, som a) immunoreagerar med en polypeptid enligt formeln: 10 PSPSPIHPAHHKRDRRQ b) inte väsentligen immunoregarear med en polypeptid enligt formeln:
11. 15 REQNSLDSWGPKV
12. 3. Hybridom kallat PMI-2, kännetecknat av att den alstrar antikroppsmolekyler som immunoreagerar med stimulerade trombocyter bundna vid fibrinogen, och de-ponerats med depositionsnummer ATCC HB 9615. 20
13. 4. Monoklonal antikroppssammansättning, kännetecknad av att den innefattar antikroppsmolekyler alstrade med hybridom PMI-2 (ATCC HB 9615), vilka immu- . .; noreagerar med stimulerade trombocyter bundna vid fibrinogen. I « « »
14. 5. Diagnostiskt system i form av en instrumentuppsättning för att testa ifall vas- kulärvätskeprov innehäller trombocyter genom att yttrycka ett GPIIb-HIa-ligand-komplex, kännetecknat av att systemet innefattar: • · · « I · 55 105276 en förpackning innehallande en mängd monoklonal antikroppssammansättning inne-hällande anti-GP-IIb-ina-antikroppsmolekyler, som producerats med hybridom PMI-2 (ATCC HB 9615), som räcker för att utföra ätminstone ett test. 5
15. 8. Förfarande för att testa ifall ett vaskulärvätskeprov innehäller trombocyter genom att yttrycka ett GPIIb-lHa-komplex, kännetecknat av att förfarandet innefat-tar steg för att 10 a) bilda en immunreaktionsblandning genom att i vaskulärvätskeprovet blanda en effektiv mängd monoklonal antikroppssammansättning innehallande anti-GPIIb-IIIa-antikroppsmolekyler som producerats med PMI-2 (ATCC HB 9615); b) upprätthälla blandningen under en period som räcker för att nämnda antikrop-15 par skall immunoreagera med en eventuell trombocyt i provet bunden vid fibrinogen och för att bilda en immunreaktionsprodukt; och c) detektera en eventuell immunreaktionsprodukt som bildats i steg b. • · · m • m W9W « « · « · · « 1 • · · • · • · m I · m · • · · • · * • · * * · 1 · « · *
16. 1 M • I