JP2000095800A - エリトロポエチン受容体を活性化する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 エリトロポエチン受容体を活性化し且つ赤血
球形成を刺激する抗体とそのフラグメントを提供する。
更に、この抗体を産生するハイブリドーマ細胞系と、貧
血の治療のための方法と組成物を提供する。 【解決手段】 ヒトエリテトロポエチン受容体を認識す
る抗体のスクリーニングによって、エリトロポエチン依
存性細胞の増殖を刺激する抗体を得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エリトロポエチン
受容体を認識する抗体に係わる。具体的には、本発明
は、エリトロポエチン受容体を活性化し赤血球形成を促
進する抗体に係わる。

【０００２】

【従来の技術】エリトロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球
前駆細胞の増殖と、赤血球への赤血球前駆細胞の成熟と
に関与する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、胎
児生活中は肝臓で産生され、成人では腎臓によって産生
され、赤血球前駆体からの赤血球細胞の産生を促進す
る。成人において腎不全の結果として一般的に生じるＥ
ＰＯの産生減少は、貧血の原因となる。ＥＰＯは、エリ
トロポエチンをコードする遺伝子でトランスフェクトし
た宿主細胞からのこのタンパク質の発現と分泌を含む遺
伝子工学技術によって生産されている。組換えＥＰＯの
投与は貧血の治療に有効である。例えば、Ｅｓｃｈｂａ
ｃｈら（Ｎ．Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１６，７３（１
９８７））は、慢性腎不全による貧血を治療するために
ＥＰＯを使用することを記載している。

【０００３】ヒト尿ＥＰＯの精製は、Ｍｉｙａｋｅら
（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５２，５５５８（１９
７７））によって記載されている。エリトロポエチンを
コードする遺伝子の同定とクローニングと発現は、米国
特許第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）に開示されてい
る。細胞培地からの組換えＥＰＯの精製のための方法の
説明は、米国特許第４，６６７，０１６号（Ｌａｉら）
に含まれている。

【０００４】ＥＰＯが赤血球形成を促進するメカニズム
については、僅かな知識しか得られていない。ＥＰＯが
特異的な細胞表面受容体に結合することによって、細胞
を活性化し、その細胞の増殖及び／又は分化を促進する
ことは明らかであるが、この活性化の固有のメカニズム
と、上記受容体及びその個々の関連タンパク質の構造
は、完全には理解されていない。エリトロポエチン受容
体（ＥＰＯ−Ｒ）は、多量体複合体として存在すると考
えられている。沈降による研究は、その分子量が３３０
±４８ｋＤａであることを示唆した（Ｍａｙｅｕｘら，
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４，２７１（１９９
０））。架橋による研究から、上記受容体複合体が、少
なくとも２つの別々のポリペプチド、即ち、６６−７２
ｋＤａ種と８５、１００ｋＤａ種とから成ることが明ら
かになった（Ｍａｙｅｕｘら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６６，２３３８０（１９９１）；ＭｃＣａｆｆｅ
ｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１０５０７
（１９９０））。ＥＰＯ受容体の免疫沈降によって別の
９５ｋＤａタンパク質も検出された（Ｍｉｕｒａ及びＩ
ｈｌｅ， Ｂｌｏｏｄ ８１，１７３９（１９９
３））。別の架橋による研究によって、１１０ｋＤａ、
１３０ｋＤａ及び１４５ｋＤａの複合体を含む３つのＥ
ＰＯが明らかになった。１１０ｋＤａと１４５ｋＤａの
複合体は、ＥＰＯ受容体に対する抗体で免疫沈降させる
ことが可能だったので、ＥＰＯ受容体を含んでいた（Ｍ
ｉｕｒａ及びＩｈｌｅ，上記）。カルボキシ末端切断Ｅ
ＰＯ受容体の発現により、１４５ｋＤａ複合体ではな
く、１１０ｋＤａ複合体が検出された。このことは、分
子量１４５ｋＤａの複合体が、１１０ｋＤａ複合体と追
加分の３５ｋＤａタンパク質とに存在するポリペプチド
を含むことを示唆している。

【０００５】ＥＰＯ受容体複合体の構造と機能とに関す
る更に別の洞察が、マウスＥＰＯ受容体とヒトＥＰＯ受
容体のクローニングと発現とによって得られた（Ｄ’Ａ
ｎｄｒｅａら，Ｃｅｌｌ ５７，２７７（１９８９）；
Ｊｏｎｅｓら，Ｂｌｏｏｄ７６，３１（１９９０）；Ｗ
ｉｎｋｅｌｍａｎら，Ｂｌｏｏｄ ７６，２４（１９９
０）；ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０８８２２号；Ｄ’Ａｎ
ｄｒｅａらの米国特許第５，２７８，０６５号）。全長
ヒトＥＰＯ受容体は、約２２４アミノ酸の細胞外ドメイ
ンと２５アミノ酸のシグナルペプチドとを有する４８３
アミノ酸膜貫通タンパク質である。ヒトＥＰＯ受容体
は、マウス受容体と約８２％のアミノ酸配列相同性を示
す。哺乳動物細胞中で発現させたクローン化全長ＥＰＯ
受容体（６６−７２ｋＤａ）が、赤血球前駆細胞上の天
然型受容体に対するアフィニティーと同様のアフィニテ
ィー（１００−３００ｎＭ）でＥＰＯに結合することが
明らかになっている。従って、この形態は、主要なＥＰ
Ｏ結合決定基を含むと考えられ、ＥＰＯ受容体と呼ばれ
る。架橋複合体の一部と考えられる８５ｋＤａ及び１０
０ｋＤａタンパク質は、ＥＰＯ受容体とは異なっている
が、ＥＰＯをこれらのタンパク質に架橋することが可能
なので、ＥＰＯに極めて近いものであるはずである。８
５ｋＤａ及び１００ｋＤａタンパク質は互いに関連して
おり、８５ｋＤａタンパク質は、１００ｋＤａ種のタン
パク質分解切断生成物である可能性がある（Ｓａｗｙｅ
ｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１３３４３（１
９８９））。

【０００６】細胞外ドメインだけを含むＥＰＯ受容体の
可溶性（切断）形態を作製し、この形態の受容体が、約
１ｎＭのアフィニティーで、即ち、全長受容体の約１／
３から約１／１０の低さのアフィニティーで、ＥＰＯに
結合することが判明している（Ｈａｒｒｉｓら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１５２０５（１９９２）；
Ｙａｎｇ及びＪｏｎｅｓ，Ｂｌｏｏｄ ８２，１７１３
（１９９３））。全長タンパク質よりもアフィニティー
が低いことの原因は分かっていない。他のタンパク質種
がＥＰＯＲ複合体の一部分であって、ＥＰＯ結合に寄与
し、それによってアフィニティーを増大させている可能
性もある。この可能性は、低アフィニティーＥＰＯ受容
体を有する細胞系と、ＥＰＯに結合しないＣＨＯ細胞と
の融合の結果として、ＥＰＯに対する上記受容体の高い
ＥＰＯ結合アフィニティーを示すハイブリッド細胞系が
得られたというＤｏｎｇ及びＧｏｌｄｗａｓｓｅｒ（Ｅ
ｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１，４８３（１９９３））の
観察によって支持されている。これに加えて、全長ＥＰ
ＯＲをＣＨＯ細胞中にトランスフェクションした結果と
して、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって定量した場合に
高アフィニティー受容体と低アフィニティー受容体の両
方を有する細胞系が得られた。ＥＰＯＲコピー数の増幅
は低アフィニティー結合を増大させたが、高アフィニテ
ィー結合を増大させなかった。これらの結果は、低アフ
ィニティーＥＰＯＲを高アフィニティーに変換するＣＨ
Ｏ細胞中に存在するタンパク質の量が限られていること
に一致している。

【０００７】ＥＰＯ受容体の活性化は幾つかの生物学的
作用を生じさせる。この活性のうちの３つは、増殖の促
進と、分化の促進と、アポプトシスの阻害である（Ｌｉ
ｂｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９０，１１３５１（１９９３）；Ｋｏｕｒｙ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４８，３７８（１９９０））。増殖の
促進と分化の促進を起こすシグナル導入経路は互いに別
々のものであると考えられる（Ｎｏｇｕｃｈｉら，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，２６０４（１９８８）；
Ｐａｔｅｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２１
３００（１９９２）；Ｌｉｂｏｉら，同書）。幾つかの
結果は、分化シグナルを仲介するために補助タンパク質
が必要である可能性を示唆している（Ｃｈｉｂａら，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３６２，６４６（１９９３）；Ｃｈｉｂａ
ら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０，１１５９３（１９９３））。しかし、上記受容
体の構成的活性化形態が増殖と分化の両方を促進するこ
とが可能であるので、分化における補助タンパク質の役
割に関しては論争がある（Ｐｈａｒｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，９３８（１
９９３））。

【０００８】ＥＰＯ受容体の活性化は、その二量化に起
因する可能性がある。即ち、ＥＰＯは２つのＥＰＯ受容
体分子の間のクロスリンカーとして働く可能性がある。
この提案を支持する証拠がある。マウスＥＰＯ受容体の
１２９位におけるアルギニンからシステインへの突然変
異の結果として、おそらくは２つの受容体サブユニット
の間に形成されるジスルフィド結合のために、受容体の
構成的活性化が得られる（Ｙｏｓｉｍｕｒａら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４８，６４７（１９９０））。これに加え
て、細胞内の多量体複合体中にＥＰＯＲが発見されてい
る（Ｍｉｕｒａ及びＩｈｌｅ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０６，２００(１９９３))。し
かし、精製ＥＰＯ可溶性受容体の安定した多量体形態の
単離は現在まで報告されていない。これに加えて、ＥＰ
ＯＲの二量化が必要とされるが、この二量化だけでは細
胞の完全な活性化には不十分である可能性がある。例え
ば、二量化は増殖シグナルを生じさせるが、分化シグナ
ルは生じさせない。即ち、分化シグナルを送るために
は、補助タンパク質が必要である可能性がある。

【０００９】ＥＰＯ受容体の二量化と活性化との間の関
係を、ＥＰＯとは異なっているがＥＰＯ受容体を活性化
する化合物を同定するために、利用することが可能であ
る。例えば、抗体は、抗原に対する２つの同じ結合部位
を有する。抗ＥＰＯＲ抗体は２つの ＥＰＯＲ分子を結
合させることが可能であり、これらの分子を互いに非常
に接近させ、二量化を生じさせる。インビボで機能する
ためには、これらの抗体は細胞表面上のＥＰＯＲを認識
し、シグナル導入経路の活性化を可能にするように結合
しなければならない。これに加えて、赤血球前駆細胞の
増殖と分化の両方が活性化の結果として生じることが望
ましい。ヒト成長ホ ルモン受容体（Ｆｕｈら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５６，１６７７（１９９２））と上皮成
長因子受容体（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８，７５３５（１９
８１））の活性化を理解するための同様のアプローチが
報告されている。

【００１０】ＥＰＯ受容体を活性化し且つ赤血球形成を
刺激する特性を有する分子を同定することが望ましいだ
ろう。この同定を行うためには、ＥＰＯ受容体活性化と
シグナル導入とのメカニズムを理解することが重要であ
る。このメカニズムを解明するためのアプローチの１つ
は、ＥＰＯ受容体を活性化し且つ赤血球形成を刺激する
ように、ＥＰＯ受容体を認識する抗体を同定することで
あると考えられる。こうした抗体は、治療用途と診断用
途とに有効だろうし、ＥＰＯ受容体の機能を調べるため
にも有効だろう。

【００１１】次に示す幾つかの引例は、マウス又はヒト
ＥＰＯ受容体に結合する抗体を説明している。

【００１２】Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｆ Ｈｅｍｔａｏｐｏｉｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ
−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０） ｐｐ．１５３−１
５９）は、マウスＥＰＯ受容体のアミノ末端とカルボキ
シ末端ペプチドに対するポリクローナル抗ペプチド抗体
を作製した。この抗体がマウスＥＰＯ受容体と反応する
ことがウエスタンブロットによって実証された。

【００１３】Ｂａｉｌｅｙら（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．２１，１５３５−１５４３（１９９３））は、マウ
スＥＰＯ受容体の細胞外ドメインと細胞質ドメインに対
して相同性を有する合成ペプチドに対するポリクローナ
ル抗ペプチド抗体を作製した。これらの抗体による受容
体活性化は、フェニルヒドラジン処置マウスからの脾臓
細胞の中への ３Ｈチミジンの取り込みによって測定し
た場合には、検出されなかった。

【００１４】Ｂａｙｎｅｓら（Ｂｌｏｏｄ ８２，２０
８８−２０９５（１９９３））は、ヒトＥＰＯ受容体中
のアミノ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体を作
製した。この抗体は、ヒト血清中に存在する可溶形態の
ＥＰＯ受容体と反応することが明らかにされた。 Ｄ’
Ａｎｄｒｅａら（Ｂｌｏｏｄ ８２，４６−５２（１９
９３））は、ヒトＥＰＯ受容体に対するモノクローナル
抗体を作製した。これらの抗体は、ヒトＥＰＯ ｃＤＮ
ＡクローンでトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞に結
合し、その抗体の幾つかはＥＰＯ結合を阻害してＥＰＯ
依存性増殖を中和した。

【００１５】Ｆｉｓｈｅｒら（Ｂｌｏｏｄ ８２，１９
７Ａ（１９９３））は、ＥＰＯ非依存性の増殖及び成熟
を行う赤血球前駆細胞から、ＥＰＯ依存性の増殖及び成
熟を行う赤血球前駆細胞を区別するために、Ｄ’Ａｎｄ
ｒｅａの上記引例で示されたモノクローナル抗体と同じ
モノクローナル抗体を使用した。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】上記引例で説明されて
いる抗体のいずれにおいても、ＥＰＯ受容体を活性化す
ること、又は、赤血球前駆細胞の増殖及び／もしくは成
熟を刺激することは、報告されていない。

【００１７】従って、本発明の目的は、ＥＰＯ受容体が
活性化されるようにＥＰＯ受容体を認識し且つＥＰＯ受
容体に結合する、抗体を作製することである。本発明の
更に別の目的は、ＥＰＯ受容体に結合し、且つ、赤血球
前駆細胞の増殖及び／又は赤血球への分化を刺激するこ
とによって赤血球形成を促進する抗体を作製することで
ある。この抗体は、貧血の治療、又は、機能不全ＥＰＯ
受容体を特徴とする疾病の診断に有効である。更に、こ
の抗体は、貧血の治療のための治療薬剤の同定を可能に
するだろう。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は、エリトロポエ
チン受容体を活性化する抗体又はそのフラグメントに係
わる。ヒトＥＰＯ受容体を認識する抗体のスクリーニン
グによって、「Ｍａｂ７１」と「Ｍａｂ ７３」と名付
けた２つの抗体がＵＴ７−ＥＰＯ細胞（添加ＥＰＯが存
在しない場合には増殖しないＥＰＯ依存性細胞系）の増
殖を刺激したことが判明した。更に、Ｍａｂ ７１は、
ヒト血液中の赤血球前駆細胞からの赤血球コロニー形成
を刺激した。本発明の範囲内に含まれる抗体は、Ｍａｂ
７１又はＭａｂ ７３によって認識されるＥＰＯ受容
体の上のエピトープを認識しうる。本発明の抗体がモノ
クローナル抗体であることが好ましく、ヒト化抗体又は
ヒト抗体であることが可能である。更に、本発明の範囲
内には、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系
も含まれる。

【００１９】更に、本発明は、生物試料中のＥＰＯ受容
体を検出するための、本発明のＥＰＯ受容体抗体を含む
方法とキットとを提供する。本発明のＥＰＯ受容体抗体
と医薬上許容可能なアジュバントとを含む医薬組成物
も、本発明の範囲内に含まれる。こうした組成物を、低
赤血球レベルを特徴とする疾患を有する患者を治療する
ために使用することが可能である。

【００２０】

【発明の実施の形態】エリトロポエチン受容体を認識す
るモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を、精製した可溶性ヒ
トＥＰＯ受容体でマウスを免疫することによって産生し
た。実施例１と実施例２とで説明する通りに可溶性ヒト
ＥＰＯ受容体を発現させ精製した。酵素抗体法（ＥＬＩ
ＳＡ）において可溶性ヒトＥＰＯ受容体と反応したＭａ
ｂの中から、更にスクリーニングするために９６個のＭ
ａｂを選択した。これらのＭａｂを、ＢＩＡｃｏｒｅ分
析によってＥＰＯ受容体結合に関して試験し（実施例４
Ａ）、且つ、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上
のＥＰＯ受容体に対する結合をＦＡＣＳによって試験し
た（実施例４Ｃ）。このスクリーニングの結果を表１に
示す。ＥＰＯ受容体に結合した抗体の幾つかをＢＩＡｃ
ｏｒｅ分析によって調べたところ、試験した９６個のう
ちで５個の抗体だけが、ＦＡＣＳ走査法で測定した時
に、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上に現れる
ＥＰＯ受容体に結合したにすぎなかった。ＥＬＩＳＡア
ッセイで陽性だった２４個の抗体（ＦＡＣＳ走査法で陽
性だった５つの抗体を含む）を、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞増
殖の刺激に関して試験した。驚くべきことに、「Ｍａｂ
７１」と「Ｍａｂ ７３」と名付けた２つの抗体が、
ＥＰＯが存在しない状態でＵＴ７−ＥＰＯ細胞系（Ｋｏ
ｍａｔｓｕら，Ｂｌｏｏｄ ８２，４５６（１９９
３））中への^３Ｈチミジンの取り込みを刺激した（実施
例８Ａ）。このＵＴ７−ＥＰＯ細胞系の増殖のために
は、培地中にＥＰＯが存在することが必要である。従っ
て、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞増殖の刺激は、Ｍａｂ ７１と
Ｍａｂ ７３によるＥＰＯ受容体の活性化に起因する可
能性が高い。図２に示すように、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞の
応答は、Ｍａｂ７１が存在する場合の方が、Ｍａｂ ７
３が存在する場合よりも大きかった。更に、Ｍａｂ ７
１が、ヒト赤血球前駆体からの赤血球コロニー形成を促
進したことが判明した（実施例９を参照されたい）。こ
れは、ヒト赤血球前駆体からの赤血球コロニー形成を刺
激する抗体の最初の事例である。

【００２１】本発明は、エリトロポエチン受容体を活性
化する抗体又はそのフラグメントを提供する。本明細書
で使用する場合の用語「ＥＰＯ受容体の活性化」は、受
容体をもつ細胞の内部にシグナルを導入させる、ＥＰＯ
受容体が行う１つ以上の分子プロセスを意味し、このプ
ロセスではシグナルが最終的に１つ以上の細胞生理学的
変化を生じさせる。ＥＰＯ受容体活性化に対する細胞応
答は、典型的には、受容体をもつ細胞の増殖又は分化の
変化である。受容体をもつ細胞は一般には赤血球前駆細
胞（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅ
ｌｌｓ）である。現時点では、ＥＰＯ受容体によるシグ
ナル導入を生じさせる分子上の事象は、僅かしか解明さ
れていない。しかし、発明の背景に示したようにのＥＰ
Ｏ受容体の二量化が、活性化に必要とされる可能性があ
る少なくとも１つの事象であることを、幾つかの証拠が
示している。本発明の開示内容も、この考えに対する支
持を与える。図５に示すように、Ｆａｂ ７１と呼ばれ
る対応するＦａｂフラグメントでＭａｂ ７１を置き換
えた時には、Ｍａｂ ７１によるＵＴ７−ＥＰＯ細胞中
への^３Ｈ−チミジンの取り込みの刺激が無効化される。
従って、対応する一価フラグメントを有する完全な二価
抗体が、増殖応答を排除する。これに加えて、Ｍａｂ
７１は、高濃度においてＥＰＯ受容体の活性化を阻害す
る。これらの観察は両方とも、ＥＰＯ受容体の活性化の
二量化モデルを支持する．Ｍａｂ ７１がヒトＥＰＯ−
Ｒの残基４９−７８の合成ペプチドと相互作用すること
が明らかにされた（実施例６参照）。従って、このＥＰ
Ｏ−Ｒ領域は、Ｍａｂ ７１のようなクロスリンカーに
よって結合させられる場合に、ＥＰＯ−Ｒの活性化を生
じさせることが可能である。残基４９−７８に結合する
ことによって２つのＥＰＯ−Ｒ分子を架橋する分子も、
本発明の範囲内に含まれるということを理解されたい。
こうした分子は、残基４９と残基７８との間の領域内に
含まれる残基に結合することによって２つのＥＰＯ受容
体を架橋し、それによってＥＰＯ受容体の二量化と活性
化を生じさせるという特性を有する、抗体又は他の二価
の分子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）であ
ることが可能である。

【００２２】本発明のＥＰＯ受容体は哺乳動物ＥＰＯ受
容体であることが好ましく、特に好ましい実施様態で
は、ヒトＥＰＯ受容体である。ヒトＥＰＯ受容体の類似
体（ａｎａｌｏｇｓ）も本発明の範囲内に含まれること
を理解されたい。こうした類似体は、ヒトＥＰＯ受容体
配列中におけるアミノ酸の挿入、欠失、伸長（ｅｘｔｅ
ｎｓｉｏｎ）、又は、置換によって構築される。ＥＰＯ
−Ｒ類似体の例は、米国特許第５，２９２，６５４号
（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら）に開示されており、この文献
では、ＥＰＯ−Ｒアミノ酸配列の１２９位におけるシス
テイン残基の置換が、構成的に活性化されたＥＰＯ−Ｒ
をもたらす。一般的に、活性化に必要な抗体結合ドメイ
ン以外の領域内にアミノ酸の変化を有し且つヒトＥＰＯ
受容体の二次構造と三次構造を保持するＥＰＯ−Ｒ類似
体を、本発明の抗体によって認識することが可能であ
る。Ｍａｂ ７１がヒトＥＰＯ−Ｒの残基４９−７８の
合成ペプチドと相互作用することが明らかにされた（実
施例６参照）。従って、４９位から７８位のアミノ酸残
基以外のアミノ酸残基の変化を有し且つＥＰＯ受容体の
二次構造と三次構造を保持するＥＰＯ−Ｒ類似体は、Ｍ
ａｂ ７１によって認識されうる。本明細書で使用する
場合の、ヒトＥＰＯ−Ｒポリペプチドにおけるアミノ酸
残基の番号付けは、２５アミノ酸シグナルペプチドの切
断後のアミノ末端残基である１位のプロリンから開始す
る。

【００２３】本発明の抗体は、受容体活性化に関与する
ＥＰＯ受容体のエピトープに結合する。実施様態の１つ
では、抗体が、Ｍａｂ ７１によって認識されるＥＰＯ
受容体上のエピトープ、又は、Ｍａｂ ７３によって認
識されるエピトープを認識する。Ｍａｂ ７１は、ヒト
ＥＰＯ−Ｒ中のアミノ酸残基４９からアミノ酸残基７８
に及ぶ合成ペプチドを認識する。従って、Ｍａｂ ７１
が、この配列によって全体的に又は部分的に定義される
ＥＰＯ−Ｒ上のエピトープを認識しうる。本明細書で使
用する場合の用語「エピトープ」は、抗体がこの領域に
結合し且つこの結合がＥＰＯ−Ｒに対する第２抗体の結
合を妨げる、ＥＰＯ−Ｒの領域を表す。

【００２４】本発明は、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、及び、これらのフラグメントも提供する。
抗体フラグメントは、ＥＰＯ受容体を活性化する抗体フ
ラグメントを含む。典型的には組換え法によって生産さ
れるヒト化抗体も含み、ヒト化抗体では、ヒト配列が、
ＥＰＯ受容体を活性化する抗体の一部分又は全体を含
む。ヒト化抗体の例は、キメラ抗体又はＣＤＲグラフト
化抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号、及
び、同第５，２２５，５３９号）。遺伝子操作したマウ
スにおいて生産されるＥＰＯ受容体に対する完全ヒト抗
体も、本発明の抗体に含まれる（ＰＣＴ出願第９３／１
２２２７号）。本発明の抗体は、その抗体に結合させた
検出可能標識を有することも可能である。こうした標識
は、例えば蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオ
シアネート、ＦＩＴＣ）、酵素標識（例えば、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ）、アフィニティー標識（例えば、
ビオチン）、又は、同位体標識（例えば、^１２５Ｉ）で
ある。

【００２５】ＥＰＯ受容体を活性化するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も、本発明に含ま
れる。１つの実施様態では、ハイブリドーマ細胞系が、
Ｍａｂ ７１又はＭａｂ ７３によって認識されるＥＰ
Ｏ受容体上のエピトープを認識するモノクローナル抗体
を産生する。ヒトＥＰＯ−Ｒに対するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞系の作製は、実施例３
で説明する。Ｍａｂ７１を産生するハイブリドーマ細胞
系は、１９９４年７月２６日付けで、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号ＨＢ１１６８９と
して寄託されている。Ｍａｂ ７３を産生するハイブリ
ドーマ細胞系は、１９９４年７月２６日付けで、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号ＨＢ１
１６９０として寄託されている。

【００２６】本発明の抗体は、機能不全ＥＰＯ−Ｒによ
って特徴付けられる貧血及び他の疾病を診断する上で有
用である。実施様態の１つでは、活性化されることが可
能なＥＰＯ受容体を生物試料の中で検出する方法が、
（ａ）ＥＰＯ受容体を活性化する抗体に試料を接触させ
る段階と、（ｂ）上記抗体によるＥＰＯ受容体の活性化
を検出する段階とを含む。生物試料は、組織標本、完全
細胞、又は、その抽出物を含む。本発明の抗体を、生物
試料中のＥＰＯ受容体の存在を検出するための診断キッ
トの一部として使用することも可能である。このキット
は、検出を可能にする標識を結合した抗体を使用する。
本発明の抗体は、正常な又は異常な受容体を識別するた
めに有用である。生物試料中の異常受容体の存在は、Ｅ
ＰＯ受容体の機能不全であると考えられているダイアモ
ンド−ブラックファン貧血のような疾病の指標であって
もよい。

【００２７】本発明の抗体は、低赤血球レベルを特徴と
する疾病の治療に有用である。哺乳動物におけるＥＰＯ
受容体の内因性活性を調節する方法、好ましくはＥＰＯ
受容体の活性を増大させる方法が、本発明に含まれる。
一般的に、エリトロポエチンによって治療可能な症状
（例えば、貧血）はいずれも、本発明の抗体によって治
療可能である。治療用抗体は、治療対象の疾病の種類と
重症度とに適合した用量と経路によって投与され、こう
した用量と経路は当業者が適宜決定することが可能であ
る。皮下注射、筋肉内注射、又は、静脈注射による投与
が好ましい。

【００２８】本発明は、ＥＰＯ−Ｒを活性化する治療有
効量の抗体を、医薬上許容可能なアジュバントと共に含
む医薬組成物を提供し、上記アジュバントを１つ以上の
希釈剤、担体、保存料、乳化剤、酸化防止剤、及び／又
は、安定剤から選択することが可能である。本明細書で
使用する場合の術語「治療有効量」は、所与の疾病及び
投与養生法に関して治療効果をもたらす抗体の量を表
す。本発明では、治療効果は、治療対象の患者における
ヘマトクリットの増大によって実証されるような赤血球
産生の刺激である。好ましい実施様態では、本発明の抗
体は、当業者に公知の方法を使用して調製することが可
能なヒト化抗体又はヒト抗体である。医薬上許容可能な
アジュバントは当業者に公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ｓ，１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ，Ｅ
ａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に詳細に示されている。

【００２９】本発明を更に詳細に説明するために下記の
実施例を示すが、これらの実施例によって本発明の範囲
を限定することは意図していない。

【００３０】

【実施例】実施例１ 可溶性ヒトエリトロポエチン受容体の作製 Ａ．可溶性ヒトエリトロポエチン受容体の発現のための
クローンの単離 Ｊｏｎｅｓら（上記）によって記載されている通りにヒ
トエリトロポエチン受容体を含むクローンを使用し、Ｐ
ＣＲ法によって、可溶性ヒトエリトロポエチン受容体
（ｓＨｕＥＰＯＲ）の発現のためのクローンを得た。ヒ
トエリトロポエチン受容体のＰＣＲ増幅のためのプライ
マーは、 ５’プライマー：CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CC
A CCT CGG GGC GTC CCT（配列番号：１）、及び、 ３’プライマー：CAG GTC TAG ATT ACT AGG GAT CCA GG
T CGC TAG GC（配列番号：２） である。

【００３１】ヒトＥＰＯ−Ｒを含むプラスミド ２．５
ｎｇ、上記の各オリゴヌクレオチドプライマー ５ｐｍ
ｏｌ、トリス塩酸（ｐＨ８．３） １０ｍＭ、ＫＣｌ
５０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ １．５ｍＭ、各ｄＮＴＰ ２０
０μＭ、及び、Ｔａｑポリメラーゼ １単位を使用し
て、ＰＣＲ反応を生じさせた。５サイクルの「９４℃で
３０秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分間」と、その
後での、２０サイクルの「９４℃で３０秒間、５５℃で
１分間、７２℃で１分間」とによって、増幅を行った。
ＤＮＡをＧ−５０サイズ排除カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．）を通過させて精
製した後で、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＸｂａＩとで消化し、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＸｂａＩとで同様に消化しておいた
発現ベクターｐＤＳＲα２（ＤｅＣｌｅｒｃｋら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３８９３（１９９１））
に連結させた。所期の挿入体片を含むクローンをＤＮＡ
配列分析によって確認した。ｄ４０ＥＰＯＲクローン
を、全長ヒトＥＰＯＲクローンからＰＣＲによって作製
した（上記参照）。ｄ４０ＥＰＯＲのカルボキシ末端
は、上記プライマー内の停止コドンの付加の結果である
ｔｙｒ４６７である。ＰＣＲ増幅のためのプライマー
は、 ５’プライマー：5'-CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA
CCA CCT CGG GGC GTC CCT-3'（配列番号：１）、及
び、 ３’プライマー：5'-AGG TCG ACT ACT AGT AGT CAG TTG
AGA-3'（配列番号：３） であった。

【００３２】ＰＣＲ増幅は、ｐｆｕ緩衝液２（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中のｐｆｕ
ポリメラーゼを使用した。反応条件は、１サイクルの
「９６℃で３０秒間、４５℃で１分間、７２℃で１分
間」と、その後での、２５サイクルの「９６℃で１分
間、５５℃で１分間、７２℃で２分間」であった。その
後で、最終の７２℃インキュベーションを５分間行っ
た。反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約
１．３Ｋｂのバンドをｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ キット
（ＢＩＯ １０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して単離
した。精製フラグメントをＰＣＲ ＩＩ（ＴＡ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉ
ｅｇｏ，ＣＡ）中に結合させた。組換え体を制限分析で
同定し、配列決定し、所期の挿入体が存在することを確
認した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを上
記のように単離し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌＩとで予
め切断した単離ｐＤＳＲα２ベクターの中に連結した。
その結果得たベクターｐＤＳＲαＥＰＯＲｄ４０をＣＨ
Ｏ細胞中での発現のために使用した。

【００３３】Ｂ． ＣＨＯ細胞中での可溶性ヒトＥＰＯ
Ｒ及びｄ４０ ＥＰＯＲの発現 発現プラスミドｐＤＳＲα２−ＥＰＯＲ−Ｘは、Ｊｏｎ
ｅｓら（上記）に示されているようにヒトＥＰＯＲアミ
ノ酸Ｍｅｔ１−Ｐｒｏ２４９をコードする配列を含む。
プラスミドｐＤＳＲαＥＰＯＲｄ４０は、Ｍｅｔ１−Ｔ
ｙｒ４６７をコードする配列を含む。各プラスミド １
０マイクログラムを、リン酸カルシウム仲介トランスフ
ェクションによってＣＨＯ細胞中に別々に導入した（Ｗ
ｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ １１，２３３（１９７
７））。個々のコロニーを、上記ベクターからのジヒド
ロ葉酸レダクターゼ遺伝子の発現に基づいて選択した。
ヒトＥＰＯＲの発現を、ＲＮＡハイブリダイゼーション
（Ｈｕｎｔら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ，１９：７７９
（１９９１））と、アフィニティー精製抗体を使用した
ウエスタンイムノブロッティングとによって検出した。
これらのアッセイで陽性だった細胞系を、更に増殖させ
るために選択した。ＥＰＯ−Ｒ発現の増幅を促進するた
めに、細胞系を３０ｎＭメトトレキセート（Ｍｔｘ）に
適応させた。

【００３４】可溶性ヒトＥＰＯＲを含む順化培地の調製
を、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒｂｏｔｔｌｅ）と中
空ファイバーバイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏ
ｒ）の両方で行った。ローラーボトルに、増殖培地（Ｄ
ＭＥＭ：非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）と３０ｎＭ Ｍｔ
ｘと５％牛胎仔血清（ＦＢＳ）とを添加したＨａｍのＦ
１２（１：１）培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ製の試薬））２００ｍＬ中の２×１０^７個
の細胞を接種した。３−４日間で集密状態になった時
に、ＤＭＥＭ（ＨａｍのＦ１２培地、ＮＥＡＡ、３０ｎ
Ｍ Ｍｔｘ、無血清）２００ｍＬで置き換えた。６〜７
日後に順化培地を採集して、新鮮な無血清培地で置換し
た。２回目と３回目の採集物を集めた。

【００３５】Ｃｅｌｌ Ｐｈａｒｍ バイオリアクター
カートリッジに、５μｇ／ｍＬ ゲンタマイシンを添加
した増殖培地（上記の通り）中の５×１０^２個の細胞を
接種した。ｐＨを７．３に維持した。無血清順化培地を
調製するために、接種１２日後から開始して、細胞から
血清を取り除いた。順化培地の採集を１７日目に開始し
た。

【００３６】実施例２ 可溶性ヒトエリトロポエチン受容体の精製 可溶性組換えヒトＥＰＯＲの４つの異なった調製物を作
製した。第１の調製では、エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ，ＮＪ）を、製造者の指示に概ね従って組換えヒト
エリトロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）と結合させる。３２
ｍＭ ＺｎＣｌ_２ ４．５ｍＬ中のｒＨｕＥＰＯ ２１
８ｍｇを、予め水和し且つＨ_２Ｏで洗浄したエポキシ活
性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ ７．２ｇに加える。こ
のスラリーをｐＨ １０．８に滴定し、その後で室温で
一晩混合する。その後で、１Ｍの最終濃度にエタノール
アミンを加えることによって、残った反応性基を全てブ
ロックし、室温で４時間混合する。後続の段階を８℃±
２℃で行った。結合した樹脂（エポキシ−ＥＰＯ）をカ
ラム内に充填し、０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ ＨＯ
Ａｃ（ｐＨ ４）及び０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ
ホウ酸塩（ｐＨ ８）の代替サイクルで洗浄する。カラ
ムを１４０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ トリス ｐＨ
７．６（ＴＢＳ）で平衡化する。このカラムに、可溶性
ＥＰＯ−Ｒ（ｓＨｕＥＰＯ−Ｒ）を発現させるＣＨＯ細
胞からのローラーボトルで調製した順化培地１５６０ｍ
Ｌをロードする。ロード完了後に、カラムを、３００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ トリスｐＨ７．６（ＴＢＳ）
で洗浄し、その後で、結合ｓＨｕＥＰＯＲを１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ／３Ｍ 尿素／１０ｍＭ トリス ｐＨ７．６で溶
出する。２つのＵＶ_{２８ ０}吸収ピークが、この緩衝液に
よって溶出する。ｓＨｕＥＰＯＲを含む、溶出する第２
のピークをプールし、Ｈ_２Ｏで２０倍に希釈する。希釈
したプールを、Ｍｏｎｏ Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の
１ｍＬ予充填カラムにロードし、１０ｍＭトリス ｐＨ
７．６中のＮａＣｌ勾配で溶出させる。単一ピークの溶
出液をプールし、小分けし、−８０℃で凍結保存した。

【００３７】第２の調製では、より大きなエポキシ−Ｅ
ＰＯカラムを作製する。エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ６Ｂ ２０．４ｇを水和し、Ｈ_２Ｏで洗浄し、そ
の後でアセトンで洗浄し、最後にＨ_２Ｏ中の５０％ホル
ムアミド（ｐＨ １０．６）で洗浄する。Ｈ_２Ｏ １５
ｍＬ中のｒＨｕＥＰＯ ７２９ｍｇをｐＨ １０．６に
滴定し、上記樹脂に加え、室温で一晩混合する。その後
で、１Ｍの最終濃度にエタノールアミンを加えることに
よって、残った反応性基を全てブロックし、室温で１４
０分間混合する。後続の段階を８℃±２℃で行う。エポ
キシ−ＥＰＯをカラム内に充填し、３Ｍ 尿素／７５０
ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ ７．６で洗
浄し、その後でカラムをＴＢＳで平衡化する。ｓＨｕＥ
ＰＯＲを発現させるＣＨＯ細胞からのバイオリアクター
で調製した順化培地１００ｍＬを、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２ｍ
Ｌと混合する。この混合物を、頻繁に混合しながら８℃
±２℃で３０分間インキュベートし、その後で０．４５
ミクロン硝酸セルロースボトルトップフィルター（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ）を通して濾過する。炉液をエポキシ−ＥＰ
Ｏカラムにロードし、２５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ
トリス ｐＨ７．６で洗浄し、その後で、３Ｍ 尿素
／７５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ トリス ｐＨ７．
６で溶出する。溶出ピークをプールし、Ｈ_２Ｏで２０倍
に希釈する。希釈したプールを、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの１５ｍＬカラムに充填し、１０
ｍＭトリス ｐＨ７．６中のＮａＣｌ勾配で溶出させ
る。溶出した単一ピークをプールし、小分けし、−８０
℃で凍結保存した。

【００３８】第３の調製では、第２の調製で使用したの
と同じエポキシ−ＥＰＯカラムを使用する。ｓＥＰＯ−
Ｒを発現させるＣＨＯ細胞からのローラーボトル作製順
化培地８５０ｍＬを、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗ １．７ｍＬと混合する。この混合物を第
２の調製の処理方法と同じ方法で処理する。

【００３９】第４の調製では、ｓＨｕＥＰＯＲを発現さ
せるＣＨＯ細胞からのバイオリアクター作製順化培地
７．２５Ｌを、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆ
ｌｏｗ１１０ｍＬと混合する。この混合物を、頻繁に混
合しながら８℃±２℃で１時間インキュベートし、その
後で０．４５ミクロン硝酸セルロースボトルトップフィ
ルターを通して濾過する。

【００４０】濾液をＨ_２Ｏ ７．２５Ｌで希釈し、２０
ｍＭ トリス ｐＨ７．６で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの７７０ｍＬカラムにロ
ードする。２０ｍＭトリス ｐＨ７．６中のＮａＣｌ勾
配でカラムから溶出させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基
づく多量のｓＨｕＥＰＯＲを含むフラクションをプール
する。固体（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をそのプールに加えて最
終濃度１．２Ｍにした後で、０．４５ミクロン硝酸セル
ロースボトルトップフィルターを通して濾過する。濾液
をＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６（ｌｏｗ ｓ
ｕｂ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の６０ｍＬカラムにロー
ドし、２０ｍＭトリス ｐＨ７．６中の１．２Ｍ→０Ｍ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４減少勾配で溶出させる。主要溶出ピ
ークをプールし、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４中２．４Ｍにし、
ｓＨｕＥＰＯＲｔを沈殿させる。沈殿ｓＨｕＥＰＯＲを
遠心によって採集し、Ｈ_２Ｏで再懸濁させ、トリス塩酸
でｐＨ７．９に滴定する。その結果得た溶液を０．４５
ミクロン硝酸セルロースフィルターを通して濾過し、小
分けし、−８０℃で凍結保存した。

【００４１】実施例３ ハイブリドーマ細胞系の調製とスクリーニング Ａ． 酵素抗体アッセイ（ＥＩＡ） 最初に、個々の動物の血清抗体（Ａｂ）の力価を定量
し、その後で、使用可能なハイブリドーマをスクリーニ
ングするためにＥＩＡを行った。平底、高結合、９６穴
マイクロ滴定ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）
を、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．２）（０．０
１５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、０．０３５Ｍ ＮａＨＣＯ_３）
１ｍＬ当たり５μｇの精製ｓＨｕＥＰＯＲでコーティン
グした。上記Ａｂ ５０μＬを各穴に加えた。その後で
プレートをアセテートフィルム（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）
で覆い、ロッキング台（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏ
ｒｍ）上で、室温（ＲＴ）で２時間、又は、４℃で一
晩、インキュベートした。ｓＨｕＥＰＯＲのロット＃１
を第１と第２のブーストの後に使用し、ロット＃２を第
３のブーストの後に使用した。ｓＨｕＥＰＯＲのロット
＃３とロット＃４をハイブリドーマのスクリーニングの
ために使用した。ＢＳＡ希釈／ブロッキング液濃厚液
（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１部を脱イオン水（ｄ
Ｈ_２Ｏ）１部と混合することによって調製した５％ＢＳ
Ａ溶液を穴１個当たり２５０μＬ使用して、ＲＴで３０
分間ブロッキングした。ブロッキング液を除去したの
ち、血清２倍希釈液（１：４００から１：５１２０
０）、又は、ハイブリドーマ組織培養上清液を、各々の
穴に加えた。血清希釈液は１％ ＢＳＡ（Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏのリン酸緩衝塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に１：１０
に希釈した１０％ ＢＳＡ希釈／ブロッキング濃厚液）
であり、一方、ハイブリドーマ上清液を未希釈のまま試
験した。ハイブリドーマ試験の場合には、１つの穴を結
合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）対照とし、別の穴を陽性Ａ
ｂ対照とした。再びプレートをッキングさせながらＲＴ
で１時間インキュベートし、その後で、ｄＨ_２Ｏ中の洗
浄液２０ｘ濃厚液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄ Ｐｅ
ｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の１ｘ
調製物を使用して４回洗浄した。その後で、１％ＢＳＡ
で１：１０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ鎖及
びＬ鎖特異性西洋ワサビペルオキシダーゼ結合第二Ａｂ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）
を、各穴内で３０分間インキュベートした。上記のよう
にプレートを洗浄し、ブロッティングによって乾燥さ
せ、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ単一成分基質（Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を加えた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ
ＥＬ３１０読み取り装置（Ｂｉｏ−ｔｅｋ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して各々の穴毎に４
０５ｎｍで吸光度を読み取った。「血清希釈度」対「４
０５ｎｍでの光学密度」のｌｏｇ_１０をプロットし、そ
の血清によって得られる最大光学密度の５０％ポイント
で外挿することによって、血清抗体の半最大力価を計算
した。光学密度がバックグラウンドの５倍よりも大きい
場合にハイブリドーマを陽性として選択した。

【００４２】Ｂ． 免疫化 ４．５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ
ｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ）１０匹に対し、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジ
ュバント（ＣＦＡ；５０％ｖ／ｖ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中に乳
濁させたｓＨｕＥＰＯＲ（ロット＃１）（抗原）５０μ
ｇを皮下注射（ＳＱＩ）した。４週間後に、Ｆｒｅｕｎ
ｄ不完全アジュバント（ＩＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）を使用
して上記と同様に調製した抗原（Ａｇ；ロット＃１）２
５μｇでこれらの動物をブーストした（ＳＱＩ）。９日
後にマウスの血液を尾から採取し、血清抗体（Ａｂ）力
価を酵素抗体アッセイ（ＥＩＡ）によって定量した。各
々のマウスの半最大力価は約５０００に増大し、個々の
動物をハイブリドーマ調製のために選択した。目的のハ
イブリッド（＃７１Ａ及び７３Ａ）を作製するために使
用した３匹の動物（＃７、＃８、＃９）に対して、１
２．５μｇのＡｇ（ロット１）と２５μｇのＡｇ（ロッ
ト２）とを別々に使用して５週目と２９週目とに追加の
ブーストを行うことが必要だった。これらのブースト
を、最初のブーストと同様に、即ち、５０％ｖ／ｖ Ｉ
ＣＦＡ中の乳濁液を使用して行った。血清Ａｂ力価を、
各ブーストの９日後に、モニターし続けた。これらのマ
ウスの融合前の最終力価は、動物＃７では５０２６、動
物＃８では６８４２、動物＃９では１２、９４５であっ
た。

【００４３】Ｃ． 細胞融合 最終ブーストの８週間後に、ｓＨｕＥＰＯＲ（ロット＃
３）２５μｇを動物＃７、＃８、＃９に静脈内注射し
た。その４日後に、二酸化炭素でマウスを死亡させ、２
００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧと２００μｇ／ｍＬ 硫酸
ストレプトマイシンと４ｍＭ グルタミンとを含むＤｕ
ｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅｓ培地（２ｘ Ｐ／Ｓ／
Ｇ ＤＭＥＭ）２５ｍＬの中に、無菌条件下で脾臓を取
った。その脾臓から余分の脂肪組織を取り除き、清浄な
「２ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ ＤＭＥＭ」を入れた３つのディッ
シュを通して洗浄した。その次に、「２ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ
ＤＭＥＭ」１０ｍＬを含む無菌ストマッカーバッグ
（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ｂａｇ）（Ｔｅｋｍａｒ，Ｃｉ
ｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）に脾臓を移し、Ｓｔｏｍａｃ
ｈｅｒ Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ ８０（Ｓｅｗａｒｄ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＵＡＣ Ｈｏｕｓｅ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）によって破砕して単一細胞懸濁
液にした。細胞を脾臓包被から培地中に放出させた時に
は、細胞を上記バッグから取り出し、７０μｍナイロン
メッシュセルストレーナー（ｎｙｌｏｎｍｅｓｈ ｃｅ
ｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｌｉｎｃｏｌｎ
Ｐａｒｋ，ＮＪ）を通過させた。上記バッグ中の培地を
新鮮な培地と入れ替え、脾臓の細胞内容物全てが放出さ
れ終わるまで上記手順を続けた。これらの脾臓細胞を、
２２５ｘｇで１０分間遠心することによって３回洗浄し
た。第１の融合では、動物＃９からの脾臓細胞を使用し
た。第２の融合では、動物＃７と動物＃８からの脾臓細
胞をプールした。

【００４４】これと同時に、完全培地（ＤＭＥＭ、１０
％牛胎仔血清、２ｍＭ グルタミン、０．１ｍＭ 非必
須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ バッファ；Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ
Ｙ）中で増殖させたＳｐ２／０−Ａｇ１４マウス骨髄腫
細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから
受託番号ＣＲＬ １５８１として入手可能）の対数増殖
期培養物を、上記と同様に洗浄した。この骨髄腫細胞集
団から、４×１０^７個の細胞（融合１）又は８×１０^７
個の細胞（融合２）を採取し、脾臓細胞懸濁液と混合
し、再びペレット化した。この細胞ペレットから培地を
吸引し、「融合１」に関しては、３７℃のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ １５００ ＭＷｔ；Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）２ｍＬを、「融
合２」に関しては、同ＰＥＧ３．５ｍＬを、１分間に亙
って上記培地中に穏やかに混合した。その後で、等容量
の「２ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ ＤＭＥＭ」をゆっくりと加え
た。細胞を３７℃で２分間静置し、その後で追加の「２
ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ ＤＭＥＭ」９ｍＬを加えた。細胞を再
び４分間３７℃に置いた。

【００４５】最後に、「２ｘ Ｐ／Ｓ／Ｇ ＤＭＥＭ」
３０ｍＬを細胞懸濁液に加え、遠心分離によって細胞を
ペレット化した。ペレットから培地を吸引し、細胞を、
１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧと１００μｇ／ｍＬ 硫
酸ストレプトマイシンとを含む完全培地約５６ｍＬ（融
合１）又は約７４ｍＬ（融合２）の中に穏やかに再懸濁
させた。５ｍＬピペットからの一滴ずつの滴下によって
１０枚の９６穴平底組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ；Ｌｉｎｃｏｌｎ
Ｐａｒｋ，ＮＪ）上に分配した。プレートを、３７
℃、５％ＣＯ_２の条件下で、一晩に亙って加湿環境中で
インキュベートした。その翌日に、等容量の選択培地を
各々の穴に加えた。その選択培地は、完全培地中０．１
ｍＭ ヒポキサンチンと４×１０^−４ｍＭ アミノプテ
リンと１．６×１０^−２ｍＭ チミジンとから構成され
ていた。融合プレートを７−１０日間インキュベート
し、このインキュベート期間中に培地を２回交換した。
ＨＡＴ選択培地を各々の流体交換の後で使用した。ハイ
ブリッドを収容した個々の穴から組織培養上清液を採取
し、ｓＨｕ ＥＰＯＲに対する特異的抗体活性をＥＩＡ
で検査した。ＥＩＡで陽性だった９６穴に対して更にス
クリーニングを行った。

【００４６】Ｄ． ドットブロット 還元ｓＨｕＥＰＯＲ（ロット＃４）のドットブロット
を、ＥＩＡ陽性ハイブリドーマの二次スクリーニング方
法として使用した。Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ ＳＦ Ｍｉｃｒ
ｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃ
ｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を、そのインストラクションマニュ
アルに従って準備し、ニトロセルロース膜（９×１２ｃ
ｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用した。まず最初
に、トリス緩衝塩水液（ＴＢＳ；１０ｍＭトリス ｐＨ
７．５、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ｗ／ｖアジ
化ナトリウム）中の２−メルカプトエタノール（５％ｖ
／ｖ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）と共に還元条件下で
５分間沸騰させることによって、抗原を調製した。ｓＨ
ｕＥＰＯＲ（ロット＃４）２５ｎｇを各々の穴にロード
し、結合のためにニトロセルロース膜を通して吸引し
た。２５０μＬのＢｌｏｔｔｏ−Ｔｗｅｅｎ溶液（ブロ
ック液；２％ｗ／ｖ脱脂粉乳、５０ｍＭトリス ｐＨ
７．５、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．０９％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０１％ｖ／
ｖ消泡剤Ａ）を穴にロードし、ＲＴで３０分間インキュ
ベートした。ブロック液を穴から吸引し、この手順を２
度繰り返して、ニトロセルロース膜上の非特異的部位を
完全にブロッキングした。その後で、０．１％ｖ／ｖポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅ
ｎ−２０；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を含むＤ−Ｐ
ＢＳを使用して上記膜を通して３回洗浄した。その次
に、ＥＩＡ陽性ハイブリドーマ順化培地９５μｌを各々
の穴に加え、ＲＴで４５分間インキュベートした。ＴＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭトリス ｐＨ７．５、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ ２０）を
１回の洗浄当たり２５０μＬ使用して穴を３回洗浄し、
更に、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭトリス ｐＨ７．
５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０９％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０）を１回の洗浄当たり２５０μＬ使用して穴を
２回洗浄し、各々の添加を行った後に膜を通して吸引し
た。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ鎖及びＬ鎖特異性ＨＲＰ結
合第二抗体（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：１０００に希
釈；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）
１００μＬを、各々の穴の中でＲＴで４５分間インキュ
ベートした。膜を上記のように洗浄し、ブロット装置か
ら取り除き、調製したＥｎｈａｎｃｅｄＣｈｅｍｉｌｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＣＬ試薬；Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔ
ｓ，ＩＬ）の中に浸し、Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルム
（Ｋｏｄａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎ
ｇ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に対し露
光した。１５秒後にフィルムをフィルムカセットから取
り出し現像した。個々のハイブリドーマ上清液のドット
の強度に基づいた各々の穴の評点は、３＋から０だっ
た。

【００４７】実施例４ ＥＰＯＲに結合する抗ＥＰＯＲ抗体 Ａ． ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるＥＰＯＲに結合する抗
体 表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｆｉａｇｅｒｓｔａｍ
ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ３，２０８
（１９９０）；Ｍａｌｍｂｏｒｙら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，６４３（１９９２）））に基づ
く実時間生物特異性相互作用分析（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ
ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅ
ｎ）を、ＥＬＩＳＡ陽性モノクローナル抗体のスクリー
ニングのために使用した。

【００４８】実施例１と実施例２で説明した通りに調製
した可溶性ＨｕＥＰＯＲを、第一アミン基を介してセン
サーチップＣＭ５に共有結合させた。ＨＢＳ（１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＢＩＡｃｏｒｅ界
面活性剤Ｐ−２０）中で５μＬ／分の流速で固定化を行
った。最初に、ＥＤＣ（水中の４００ｍＭ Ｎ−エチル
−Ｎ−（ジメチルアミン−プロピル）カルボジイミド、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）とＮ
ＨＳ（水中の１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）
との１：１混合物を４０μＬ注入することによって、セ
ンサーチップのカルボキシル化マトリックスを活性化し
た。可溶性ＥＰＯＲ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ
４．０中の５０μｇ／ｍＬ）６５μＬを注入し、センサ
ーチップ上に固定化した。センサーチップの余分の反応
性基をエタノールアミン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）５０μＬの注入によって不活性化
した。

【００４９】各々の分析サイクルは、上記チップの再生
のための、ハイブリドーマ上清液２０μＬの注入と、そ
の後の、１０ｍＭ ＨＣｌ １０μＬの注入とを含ん
だ。ＳＰＲ応答を共鳴単位（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎ
ｉｔ）（ＲＵ）で測定する。殆どのタンパク質では、１
０００ＲＵが、約１ｎｇ／ｍｍ^２の表面濃度に相当す
る。ＥＩＡで陽性だった９６個の穴をスクリーニングし
た結果を表１に示す。これらの実験では、バックグラウ
ンドは典型的には約２０ＲＵである。ＥＰＯＲへの結合
は５０ＲＵ以上で有意である。

【００５０】

【表１】

【００５１】

【表２】

【００５２】

【表３】

【００５３】表に示した抗体を分泌するハイブリドーマ
で順化した組織培養培地を、表に示すアッセイで試験し
た。表に示す抗体全てを含む上清液が、ＥＬＩＳＡアッ
セイで陽性シグナルを示した。＋＋＋、＋＋、＋は、陽
性応答を示し、＋＋＋は最大の効果を示す応答を表す。
−は対照培地の応答より小さいか又はそれに等しい応答
を表す。ＮＴは、試料を試験しなかったことを示す。？
は、応答を示すことが不可能だった試料を示す。

【００５４】（１）抗体１−６１は、マウス＃７と＃８
からの抗体である。抗体６２−９６はマウス＃９からの
抗体である。

【００５５】（２）ｓＨｕＥＰＯＲが付着したバイアコ
アチップ（ｂｉａｃｏｒｅ ｃｈｉｐ）を使用するＭａ
ｂによる応答単位。

【００５６】（３）ＢＩＡＣＯＲＥ上における競合は抗
ｓＨｕＥＰＯＲ Ｍａｂ １Ｇ２に対するものだった。
センサーチップに結合させたｓＨｕＥＰＯＲを１Ｇ２と
共にインキュベートした後に、１Ｇ２と共に予めインキ
ュベートすることがなかったＥＰＯＲに対する結合に比
較してＭａｂ結合に対する効果を定量した。結合が完全
に（８０−１００％）ブロックされた抗体がＡである。
結合が５０−８０％ブロックされた抗体がＣである。結
合が５０％未満ブロックされた抗体がＢである。

【００５７】（４）対照（１２、７３）よりも高い平均
蛍光を細胞に与えた抗体の値を示す。「−」は、対照よ
りも低いか又はそれに等しい平均蛍光を有する抗体を示
す。

【００５８】（５）ＵＴ７−ＥＰＯ細胞による^３Ｈ取り
込みの阻害。３０ ｍｕｎｉｔｓのＥＰＯと様々な量の
抗体をＵＴ７−ＥＰＯ細胞と共にインキュベートした。
一晩インキュベートした後に、細胞を^３Ｈチミジンでパ
ルス標識し、取り込まれたカウントの量を定量した。陽
性応答を、「抗体量の増加につれて取り込みが漸進的に
減少する応答」と定義した。

【００５９】（６）ＵＴ７−ＥＰＯ細胞による^３Ｈ取り
込みの刺激。様々な量の抗体をＵＴ７−ＥＰＯ細胞と共
にインキュベートした。一晩インキュベートした後に、
細胞を^３Ｈチミジンでパルス標識し、取り込まれたカウ
ントの量を定量した。陽性応答を、「抗体量の増加につ
れて取り込みが漸進的に増加する応答」と定義した。

【００６０】（７）阻害は、活性化に必要な濃度よりも
高い濃度で確認された。

【００６１】Ｂ． エピトープ競合分析 ｓＨｕＥＰＯＲで固定化したセンサーチップをハイブリ
ドーマ上清液１Ｇ２６５μＬの注入によって飽和させる
ことが可能だった。１Ｇ２は、実施例３で説明した手順
を使用してｓＨｕＥＰＯＲに対して生じさせたモノクロ
ーナル抗体である。各々の分析サイクルは、１Ｇ２ ６
５μＬの注入によるエピトープの飽和を伴う、又は、こ
の飽和を伴わない、ハイブリドーマ上清液２０μＬの注
入を含んでいた。「１Ｇ２飽和後にハイブリドーマ上清
液２０μＬを注入した場合の結合シグナル（ＲＵ）」対
「ハイブリドーマ上清液２０μＬを注入しただけの場合
の結合シグナル（ＲＵ）」の比率を、１Ｇ２によるブロ
ッキング％として定義する。ブロッキング８０−１００
％の抗体を「グループＡ」と表し、ブロッキング５０％
以下の抗体を「グループＢ」と表し、ブロッキング５０
−８０％の抗体を「グループＣ」と表す。分析結果を表
１に示す。

【００６２】Ｃ． 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分
析による、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞上のｄ４０
ＥＰＯＲに結合する抗体 ＥＰＯＲに対して生じさせたハイブリドーマ上清液を、
ＦＡＣＳ分析によって、ｐＤＳＲαＥＰＯＲｄ４０でト
ランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上のＥＰＯ受容体
に対する結合に関して試験した。ｄ４０ ＥＰＯ受容体
をコードするＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞
を、実施例１で説明した通りに構築した。ＣＨＯ／ＥＰ
ＯＲ細胞を組織培養ディッシュから擦り取り、ＰＢＳ／
０．５％ＢＳＡの溶液中に単一細胞として再懸濁させ、
その後で、細胞約３×１０^５個／穴の割合で９６穴丸底
プレートの中に分配した。このプレートを１０００ｘｇ
の遠心機の中に５分間置いた。遠心後にＰＢＳ／ＢＳＡ
上清液を取り除き、ペレット化した細胞の各々を、対照
培地、又は、ＥＰＯＲハイブリドーマ上清液の１つの中
に再懸濁させた。細胞を４℃で１時間インキュベートし
た。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで
洗浄し、その後で、フルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウスモノクローナル抗体（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａ
ｍ Ａｌａ．）中に再懸濁させた。細胞を再び４℃で１
時間インキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。
試験した９６種の上清液の中で、５つの上清液が対照培
地よりも大きい平均細胞蛍光を有した（表１を参照され
たい）。Ｍａｂ７１は、最高レベルの蛍光を示し、その
次に、Ｍａｂ ７４、Ｍａｂ ５８、Ｍａｂ ７３、Ｍ
ａｂ ８７が続いた。試験した他の上清液はいずれも、
対照培地の値を上回る蛍光を示さなかった。

【００６３】実施例５ 抗ＥＰＯＲ抗体とＦａｂフラグメントの精製 Ａ． 腹水の生産 ５週齢以上のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ
ｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ）を、細胞系の注入を行う７から１０日
前に、２，４，１０，１４−テトラメチル−ペンタデカ
ン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ）で初回感作した。各々のマウスに対して０．
５ｍＬの腹腔内注入を１回行った。腹水がその細胞系各
々に関して調製されることになっている個々の細胞系
を、各細胞系毎に１０匹から２０匹の動物に注入した。

【００６４】集密状態が得られるまで完全培地中で増殖
させたハイブリドーマ細胞系を、Ｄ−ＰＢＳで１回洗浄
した後に、Ｎｅｕｂａｕｅｒ Ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔ
ｅｒを使用してカウントした。各々のマウスに１０^７個
の細胞を腹腔内注入し、その後で、腹水が発生するま
で、Ｒｏｄｅｎｔ Ｌａｂ Ｃｈｏｗと水を任意に摂取
させて生存させた。最大腹水形成に関してマウスを観察
し、ＣＯ_２で死亡させ、腹水で満たされた腹腔内に挿入
した１８Ｇ注射針を使用して穿刺し、腹水を収集した。
マイクロ遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で２２５ｘｇ
で１５分間又は３分間遠心することによって清澄化し
た。その後で、４ｍＬアリコートを−２０℃で貯蔵し、
その後、プロテインＡカラムクロマトグラフィーで精製
した。

【００６５】Ｂ． モノクローナル抗体のプロテインＡ
精製 腹水４ｍＬ又はハイブリドーマ順化培地１０ｍＬからの
免疫グロブリンを、プロテインＡカラムクロマトグラフ
ィーで精製した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍ ＩＩ（ＭＡＰＳ ＩＩ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）
を使用した。簡潔に説明すると、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ−Ａ懸濁液５ｍＬを、１×１０ｃｍ使い捨
てガラスカラムの中にロードした。プロテインＡゲルを
約３０ｍＬのＤ−ＰＢＳでロードし、その後で、結合緩
衝液（ＭＡＰＳ ＩＩ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅ
ｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をカラムに通すことによって調製
した。その後で、結合緩衝液で１：１に希釈した腹水又
は順化培地を上記カラムの頂部に加え、カラム内を素通
りさせた。免疫グロブリンをプロテインＡに結合させた
後に、非結合フラクションを取り除いた。その次に、カ
ラムを結合緩衝液３０ｍＬで洗浄して非結合タンパク質
をカラムから取り除き、２８０ｎｍで０．０１未満の吸
光度を得た。その後で、免疫グロブリンを含むフラクシ
ョンをＢｉｏ−Ｒａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
約３０ｍＬで溶出させた。このフラクションを、Ｄ−Ｐ
ＢＳ ４Ｌに対し透析することによって、４℃で一晩、
緩衝液交換を行った。その結果得たＰＢＳ平衡化免疫グ
ロブリンを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｏｒ Ｕｎｉｔ（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ，ＭＡ）中で１７００ｘｇで遠心することによっ
て濃縮した。

【００６６】Ｃ． 抗体結合ドメインの分画 Ｐｉｅｒｃｅ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａｂ Ｐｒｅ
ｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を
使用して、プロテインＡで精製した免疫グロブリンを、
その２つの成分部分、即ち、結晶化可能フラクション
（Ｆｃ）と抗体結合フラクション（Ｆａｂ）とに更に分
画した。プロテインＡ精製免疫グロブリンを２０ｍＭリ
ン酸／１０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）の中に
透析し、その後で、約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。１０
ｍｇの免疫グロブリンを分画した。固定化パパインゲル
を、供給されたままのリン酸緩衝液１２ｍＬ中にシステ
イン４２ｍｇを含む消化緩衝液で２回洗浄した。その後
で、免疫グロブリン試料を上記ゲルに加え、回転振とう
装置上で３７℃で一晩インキュベートした。プロテイン
Ａ精製によって、可溶化Ｆａｂを、Ｆｃと未消化免疫グ
ロブリンとから分離させた。非結合フラクションをこの
時点でＦａｂ試料として収集した。この非結合部分を４
℃で一晩に亙ってＤ−ＰＢＳ ４リットルで透析し、上
記のように濃縮した。

【００６７】実施例６ ＥＰＯＲ上のＭａｂ ７１エピトープのマッピング ヒトＥＰＯ受容体の残基１〜残基２２４（ここで、残基
１がプロリンであり残基２２４がアスパラギン酸であ
る）において長さ１７−３０アミノ酸の重複する合成ペ
プチドを作製した。１０個の異なるのペプチドは、両端
の６個のアミノ酸が重複していた。これらのペプチドの
配列と、そのヒトＥＰＯ−Ｒアミノ酸配列中での各ペプ
チドの位置は、次の通りである。

【００６８】SE-1 PPPNLPDPKFESKAALLAARGPEELCFTE （残基 1-30 ） SE-2A LLCFTERLEDLVCFWEEA （残基 25-42） SE-2B CFWEEAASAGVGPGNYSF （残基 37-54） SE-3 PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV （残基 49-78） SE-4 TARGAVRFWCSLPTADTSSFVPLELRVTAA （残基 73-102 ） SE-5 LRVTAASGAPRYHRVIHINEVVLLDAPVGL （残基 97-126 ） SE-6 DAPVGLVARLADESGHVVLRVLPPPETPMT （残基 121-150） SE-7 PETPMTSHIRYEVDVSAGNGAGSVQRVEIL （残基 145-174） SE-8 QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRYTFAVRAR （残基 169-198） SE-9 FAVRARMEAPSFGGFWSAWSEPVSLLTPSDLD （残基 193-224） ポリスチレン穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ，ＭＡ）を、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（０．０
１５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、０．０３５Ｍ ＮａＨＣＯ_３
ｐＨ９．２）中に濃度１００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍ
Ｌ、及び、０．８μｇ／ｍＬの上記ＥＰＯ−Ｒペプチド
でコートした。このプレートを室温（ＲＴ）で２時間イ
ンキュベートし、その後で４℃で一晩インキュベートし
た。可溶性ＨｕＥＰＯＲを、同一条件下で、濃度１０μ
ｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、及び、
０．０８μｇ／ｍＬにおいて陽性対照としてコートし
た。ＰＢＳ中の５％ＢＳＡによってＲＴでプレートを３
０分間ブロッキングした後に、１％ＢＳＡ中の５μｇ／
ｍＬの濃度の、実施例５で説明した通りに精製したＭａ
ｂ ７１と共に、ＲＴで２時間、上記プレートをインキ
ュベートした。洗浄緩衝液（Ｋｉｒｋｅｇａｒｄ ａｎ
ｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）で洗浄した後
に、そのプレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を結合させた
ヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０００希釈液と共に、ＲＴ
で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＡＢ
ＴＳ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒ
ｙ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で発色させた。４０５ｎｍで
比色分析を行った。上記合成ペプチドに結合するＭａｂ
の結果を図１に示し、この結果は、Ｍａｂ ７１が、試
験したその他のペプチドに対して結合する場合に比べ
て、有意量のペプチドＳＥ−３（ヒトＥＰＯ−Ｒのアミ
ノ酸残基４９−７８）に結合することを示している。こ
のことは、残基４９−７８を含む又は残基４９−７８を
重複して含むヒトＥＰＯ−Ｒの領域に対して、Ｍａｂ
７１が結合することを示している。

【００６９】実施例７ 細胞増殖アッセイにおける抗ＥＰＯＲ抗体の活性 上記の通りに調製した順化培地中の抗体を、ＵＴ７−Ｅ
ＰＯ細胞（Ｋｏｍａｔｓｕら，上記）による^３Ｈ−チミ
ジンの取り込みを刺激する能力に関してアッセイした。
ＵＴ７−ＥＰＯ細胞はＥＰＯに応答し、その細胞表面上
でヒトＥＰＯ受容体を発現させる。ＵＴ７−ＥＰＯ細胞
を、増殖培地（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液、及び、３０２４ｍｇ／Ｌ 炭素水素ナトリウム
を含み、且つ、アルファ−チオグリセロール又はベータ
−メルカプトエタノールを含まない、１ｘ Ｉｓｃｏｖ
ｅの改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＧＩＢＣＯ）／１０％
ｖ／ｖ牛胎仔血清／１％ｖ／ｖ Ｌ−グルタミン−ペニ
シリン−ストレプトマイシン溶液（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）／１単位／ｍＬ ｒＨｕＥＰＯ）中
で、約３×１０^５細胞／ｍＬに増殖させた。細胞を遠心
（約５００ｘｇ）によって収集し、リン酸緩衝塩水液で
２回洗浄し、アッセイ培地（Ｌ−グルタミンなしの１ｘ
ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）／１％ Ｌ−グ
ルタミン／４％ 牛胎仔血清）中に５×１０^４細胞／ｍ
Ｌに再懸濁させた。アッセイ培地で５倍以上に希釈した
試験試料又はＥＰＯ標準（ｒＨｕＥＰＯ）１００μＬを
９６穴マイクロタイタープレートの穴に加えた。その後
で、細胞５０μＬを加え（５０００細胞／穴）、プレー
トを、加湿インキュベーター内で３７℃で５％ＣＯ_２に
おいてインキュベートした。７２時間後に、アッセイ培
地中に１：１００に希釈したメチル−^３Ｈ−チミジン
（１ｍＣｉ／ｍＬ；２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）５０μＬを加
えた。細胞を更に３７℃で５％ＣＯ_２において４時間イ
ンキュベートした。標識した細胞を、ＰＨＤ細胞ハーベ
スター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｃ．）と脱イオン水（洗浄水として）を使用してガ
ラス繊維フィルターマット上に収集した。フィルターを
２−プロパノールで最終的に洗浄し、その後で脱水し、
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ ＬＳ６０００ＩＣシンチ
レーション計数器でカウントした。

【００７０】抗ＥＰＯＲ Ｍａｂを含む組織培養プレー
トからの順化培地を、増殖刺激能力に関して上記の通り
に試験した。試料を幾つかの濃度で試験した。陽性応答
を、「チミジン取り込みをバックグラウンドレベルの２
倍以上に刺激し、且つ、試料を希釈した時には刺激の減
少も生じる」ものと定義した。表１に示すように、試験
した２４個の試料のうちの２個の試料は陽性応答を示し
た（Ｍａｂ ７１、Ｍａｂ ７３）。４個の試料は、弱
い刺激活性を有するかもしれない（表１の「？」）。残
りの試料は、バックグラウンドを上回る大きなチミジン
取り込みの増加をもたらさなかった。モノクローナル抗
体を作製するために使用したマウスからのポリクローナ
ル血清も、チミジン取り込みを刺激した。このことは、
この血清中のポリクローナル抗体もＵＴ７−ＥＰＯ細胞
の増殖を刺激することが可能であったことを示唆してい
る。

【００７１】ＵＴ７−ＥＰＯ細胞によるチミジン取り込
みのＥＰＯ誘導刺激を阻害する能力に関して上清液も試
験した。２５ｍｕｎｉｔｓ／ｍＬのｒＨｕＥＰＯと、順
化培地を含む様々な量の抗体と共に、細胞をインキュベ
ートした。チミジン取り込みを上記のように測定した。
その結果を表１に示す。大半の抗体は、対照培地とそれ
ほど大きくは相違しなかった。チミジン取り込みの阻害
を示した抗体の中で、２つの試料（Ｍａｂ ５８、及
び、Ｍａｂ ７３）は明確な阻害を示したが、一方、３
つの試料（Ｍａｂ ６５、Ｍａｂ ８８、Ｍａｂ ８
９）は可能な阻害を示した。Ｍａｂ ７３は最大用量に
おいて阻害を示したが、それよりも少ない用量では、対
照値を上回るチミジン取り込みを刺激した。

【００７２】実施例８ 抗ＥＰＯＲ抗体とフラグメントとによるＥＰＯＲの活性
化 Ａ． ＵＴ７−ＥＰＯ増殖アッセイ Ｍａｂ ７１とＭａｂ ７３とを実施例５で説明した通
りに精製した。増殖活性を、実施例７で説明したＵＴ７
−ＥＰＯチミジン取り込みアッセイで定量した。Ｍａｂ
７１とＭａｂ ７３の両方が、ｒＨｕＥＰＯの場合と
同様に用量に依存した形で、ＵＴ７−ＥＰＯによるチミ
ジン取り込みを刺激した（実施例２を参照されたい）。
高用量のＭａｂ ７１では活性が減少した。刺激活性の
ピークは、Ｍａｂ ７１の場合には１−２μｇ／ｍＬの
用量で、Ｍａｂ ７３の場合には１００μｇ／ｍＬより
多い用量で観察それた。非中和対照抗体（抗ＥＰＯ Ｍ
ａｂ Ｆ１２）はチミジン取り込みを刺激しなかった
が、このことは、チミジン取り込みの刺激がＥＰＯ受容
体抗体に特異的であることを示している。

【００７３】Ｂ． ＥＰＯ低温置換アッセイ ＥＰＯ受容体に対する抗体は、ＥＰＯが結合する領域と
同一の領域に結合しうる。この可能性を確かめるため
に、ＯＣＩＭ１細胞を使用して低温置換アッセイを行っ
た。ＯＣＩＭ１細胞はヒト起源の細胞であり、その細胞
表面上にＥＰＯ受容体を含むことが知られている（Ｂｒ
ｏｕｄｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８５，６５１７（１９８８））。細胞を、ＯＣＩ
Ｍ１細胞培地（Ｉｓｃｏｖｅの改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培
地（ＩＭＤＭ）／１０％ 牛胎仔血清／１％ ｐｅｎ−
ｓｔｒｅｐ−ｆｕｎｇｉｓｏｎｅ）中で、約２−５×１
０^５細胞／ｍＬに増殖させた。細胞を遠心によって収集
し、結合緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０／１％ ＢＳＡ／２
５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３）中で２回洗浄し、そ
の後で、０．１％アジドと１０μｇ／ｍＬ サイトカリ
シンＢを含む結合緩衝液中に１−２×１０^７細胞／ｍＬ
に再懸濁させた。その後で、９６穴組織培養プレート中
の細胞（１００μＬ）を、試料１０μＬと^１２５Ｉ−Ｅ
ＰＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ高比活性；３０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ、２μＣｉ／ｍＬ）と共に、加湿組織培養インキュ
ベーター中で３７℃でインキュベートした。３時間後
に、細胞をタイターチューブ中のフタレート油（６０：
４０（ｖ／ｖ）ジブチル／ジノニルフタレート）を通し
て遠心した。細胞を収容したチューブをドライアイス−
エタノール浴中で迅速に凍結させ、細胞ペレットを採取
した後で、ＬＫＢ １２７７ ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒ
自動ガンマカウンターで計数した。

【００７４】図３は、低温置換実験の結果を示す。非標
識ｒＨｕＥＰＯの添加量の増大に応じて、ＥＰＯ受容体
から置換された^１２５Ｉ−ＥＰＯの量が増加した。同様
に、実施例５で説明した通りに精製したＭａｂ ７１が
^１２５Ｉ−ＥＰＯを置換した量が、抗 体量の増加に
応じて増加した。この場合には、同量の^１２５Ｉ−ＥＰ
Ｏを置換するのにｒＨｕＥＰＯの約４，０００倍の量の
Ｍａｂ ７１が必要だった。これとは対照的に、Ｍａ
ｂ ７３は、最大用量において置換の徴候を示したが、
非中和抗ｒＨｕＥＰＯ Ｍａｂ（Ｆ１２）は有意の置換
を示さなかった。こうした結果は、Ｍａｂ Ｆ１２が、
ＥＰＯ受容体に対するＥＰＯの結合を妨げないが、Ｍａ
ｂ ７１及びＭａｂ ７３はこの結合を妨げるというこ
とを示している。この結果は、更に、Ｍａｂ ７１がＥ
ＰＯ受容体に結合し、ＥＰＯ結合部位において又はその
付近で結合することによって、ＥＰＯ受容体を活性化す
ることを示している。

【００７５】Ｃ． Ｍａｂ ７１とＦａｂ ７１の活性
の比較 Ｍａｂ ７１のＥＰＯ受容体フラグメントを、実施例５
で説明した通りに調製した。図４に示すように、ＳＤＳ
ゲル電 気泳動（Ｌａｅｍｍｍｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ
２２７，６８０（１９７０））によって、試料を特性
化した。ＳＤＳを２％含む試料緩衝液中で０．７Ｍ ２
−メルカプトエタノールと共に又はそれなしに試料を沸
騰させ、非還元（無２−メルカプトエタノール）タンパ
ク質と還元（２−メルカプトエタノール）タンパク質を
個々に調製し、１２．５％ アクリルアミドＳＤＳゲル
上で泳動させた。そのゲルをクーマシーブルーで染色
し、タンパク質を可視化した。タンパク質標準の移動度
に対して当該タンパク質の移動度を比較することによっ
て、タンパク質のサイズを推定した。Ｍａｂ ７１とＭ
ａｂ ７３が、還元条件下で泳動させた時に、Ｌ鎖とＨ
鎖とに分離した。Ｈ鎖は約５２ｋＤＡであった。Ｍａｂ
７３の場合のＬ鎖はＭａｂ ７１ （２８．５ｋＤ
ａ）の場合よりも僅かに小さかった（２８ｋＤａ）。Ｆ
ａｂフラグメントも２つの鎖を有していた。すなわち、
Ｆａｂ ７１の場合には、２８．３ｋＤａと２７．３ｋ
Ｄａであり、Ｆａｂ ７３の場合には、２７．５ｋＤａ
と２６．５ｋＤａだった。これらのＦａｂフラグメント
を非還元条件下で泳動させた時には、Ｆａｂ ７１のサ
イズは約４８ｋＤａであり、Ｆａｂ ７３のサイズは約
４７ｋＤａだった。このことは、Ｆａｂフラグメントが
一価であり、その複合体がＬ鎖とＨ鎖を１つずつ有する
ことを示している。これとは対照的に、非還元ＳＤＳゲ
ル上でのＭａｂ ７１とＭａｂ ７３の移動度は、これ
らのサイズが約２００ｋＤａであることを示した。この
ことは、これらのＭａｂが二価であり、Ｈ鎖とＬ鎖が２
つずつあることを示している。

【００７６】一価のＦａｂ ７１フラグメントがＥＰＯ
受容体を活性化するかどうかを調べるために、Ｍａｂ
７１とＦａｂ ７１フラグメントをＵＴ７−ＥＰＯ細胞
と共にインキュベートし、チミジン取り込みを実施例７
で説明した通りに測定した。図５に示すように、ｒＨｕ
ＥＰＯとＭａｂ ７１の両方がチミジン取り込みを刺激
した。しかし、一価Ｆａｂ ７１フラグメントは、チミ
ジン取り込みを刺激しなかった。無関係の受容体（Ｈｅ
ｒ２／ｎｅｕ）に対する対照モノクローナル抗体も、チ
ミジン取り込みを刺激しなかった。このことは、受容体
を活性化するためには上記抗体が２価でなければならな
いことを示している。

【００７７】Ｄ． ｒＨｕＥＰＯの存在下でのＭａｂ
７１とＦａｂ ７１によるチミジン取り込みの刺激 ＥＰＯがＥＰＯ受容体に結合することをＭａｂ ７１が
阻害するという事実は、ＥＰＯの存在下ではＭａｂ ７
１がＥＰＯ受容体を活性化しない可能性があることを示
唆した。この可能性を確かめるために、３０ｍｕｎｉｔ
ｓ／ｍＬのｒＨｕＥＰＯと、様々な量の精製Ｍａｂ ７
１、Ｆａｂ ７１、又は、Ｍａｂ対照（Ｈｅｒ２／ｎｅ
ｕに対する抗体）と共に、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞をインキ
ュベートした。チミジン取り込みを上記の通りに測定し
た。図６に示すように、Ｍａｂ７１とＦａｂ ７１の両
方が高用量でチミジン取り込みを阻害した。しかし、約
３０μｇ／ｍＬから約３０００μｇ／ｍＬの間の用量で
は、Ｍａｂ ７１は、ｒＨｕＥＰＯだけによって刺激さ
れたチミジンの取り込みレベルを上回るレベルにチミジ
ン取り込みを刺激した。Ｆａｂ ７１と対照抗体は、こ
の作用を示さなかった。このことは、Ｍａｂ ７１とｒ
ＨｕＥＰＯとがＥＰＯ受容体活性化において追加の効果
を有することを示している。

【００７８】実施例９ 抗ＥＰＯＲ抗体による赤血球コロニー形成の刺激 末梢血液中の前駆体からの赤血球細胞の形成を精製Ｍａ
ｂ ７１が刺激するかどうかを調べるために、ＢＦＵｅ
アッセイを行った。赤血球前駆細胞を精製するために、
正常なヒトドナーを標準的なプロトコルに従ってリンホ
フェレーゼ（ｌｙｍｐｈｏｐｈｅｒｅｓｅ）した。リン
ホフェレーゼした細胞（２５０ｍＬ）をＨａｎｋ’ｓ
Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢ
ＳＳ）２５０ｍＬで洗浄した。細胞をＨＢＳＳ中に再懸
濁させ、勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）上で、５０
０ｘｇで３０分間、密度遠心分離によって分離した。低
密度細胞（ＬＤ）を勾配から収集し、ＨＢＳＳ ５００
ｍＬで洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミンと５ｍＭ
ＥＤＴＡとを添加したＰＢＳ中に、５×１０^８細胞／ｍ
Ｌの濃度に再懸濁させた。その後で、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
ＢｉｏｔｅｃｈＧｍｂＨによって製造されたＣＤ３４
前駆細胞Ｃｅｌｌ ＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＢｅ
ｎｄ／１０）を使用して、ＬＤ細胞を精製した。短時間
の内に、細胞を抗ＣＤ３４モノクローナル抗体で標識
し、その後で、プロトコルに従って、細胞を磁性微小球
に結合させた。その次に、予め充填したＭｉｎｉＭａｃ
ｓ分離カラムの中を、標識した細胞を通過させ、カラム
を洗浄し、ＣＤ３４^＋細胞をカラムから溶出させた。こ
の手順を再び繰り返し、より高純度のＣＤ３４^＋細胞を
得た。Ｉｓｃｏｖｅら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ
８３，３０９（１９７４））の説明の通りに、次に述
べる変更を加えて、インビトロアッセイを行った。培養
培地をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（ヒト骨髄幹細胞増殖キッ
ト；ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）から得た。３５×
１００ｍｍ組織培養プレート上に二重に試料１ｍＬをプ
レーティングするために、過剰の３ｍＬを１７×１００
無菌ポリスチレンチューブ内で調製した。各々のチュー
ブに、幹細胞増殖培地２．５ｍＬ、ＣＤ３４^＋細胞（９
０，０００細胞／ｍＬに再懸濁）０．１ｍＬ、幹細胞因
子（２０μｇ／ｍＬ）０．０１５ｍＬ、及び、試料と幹
細胞希釈培地の組み合わせ０．３８５ｍＬ相当を入れ
た。そのチューブを激しく撹拌し、沈静させ、発泡する
ままにした。その後で、１７×１−１／２注射針の付い
た３ｍＬ注射器を使用して、内容物を小分けした。加湿
組織培養インキュベーター内でプレートを３７℃で１０
％ＣＯ_２下でインキュベートした。赤血球コロニー（オ
レンジ色から赤色）を２１日後に評点した。ＥＰＯ又は
Ｍａｂ ７１が欠如したプレートには、赤血球コロニー
は見られなかった。ｒＨｕＥＰＯ（３０ｍｕｎｉｔｓ／
プレート）は、プレート１枚当たり４００個のコロニー
の過剰を生じさせた。Ｍａｂ ７１も赤血球コロニーを
生じさせた。ピーク活性は２−６μｇ／ｍＬで認められ
た。この結果は、Ｍａｂ ７１が赤血球コロニーの形成
を刺激することを示している。

【００７９】精製Ｍａｂ ７１の活性を、メチルセルロ
ース中の無血清増殖条件を使用して、赤血球コロニー形
成能力に関しても試験した。ＣＤ３４^＋細胞を上記の通
りに単離し、本明細書に参考として組み入れる同時係属
中で且つ共通の所有者によって所有されている米国特許
出願第０８／０７９，７１９号に説明されている無血清
増殖培地を使用して、下記の変更を加えて、インキュベ
ートした。細胞外マトリックス分子、ヒドロコルチゾ
ン、及び、増殖因子ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦを使用せ
ずに、アッセイチューブを準備した。上記のように、二
重の１ｍＬ試料をプレート上にプレーティングするため
に、試料３ｍＬを調製した。１００ｘストック溶液（２
−メルカプトエタノール、ヌクレオシド、コレステロー
ル、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｕ−トランスフェリン、
脂質、Ｈｕ−インスリン）各０．０３０ｍＬ、脱イオン
化ＢＳＡ（１５％）０．４ｍＬ、ＳＣＦ（２０μｇ／ｍ
Ｌ）０．０１５ｍＬ、ＣＤ３４^＋細胞（３００，０００
細胞／ｍＬに再懸濁）０．１ｍＬ、メチルセルロース
（２．３％）１．０８０ｍＬ、及び、１．１９５ｍＬに
相当する試料とＩＭＤＭの組み合わせ（試料は１５０μ
Ｌを越えない）を、上記チューブの各々に入れた。その
後で、プレートを上記に通りにインキュベートし、２１
日後にコロニーを評点した。ＥＰＯ又はＭａｂ ７１の
存在下で増殖させた時に赤血球コロニーを認めたが、こ
れら２つの因子が存在しなかった時には、赤血球コロニ
ーが認められなかった。赤血球コロニータイプの一例を
図７に示す。２５ｍｕｎｉｔｓのｒＨｕＥＰＯと共にイ
ンキュベートしたコロニーは、２．１μｇ／ｍＬの精製
Ｍａｂ ７１と共に増殖させたコロニーと類似した外観
を有した。ｒＨｕＥＰＯの用量が多けば多いほど、コロ
ニーが大きくなった。用量応答曲線を図８に示す。Ｍａ
ｂ ７１は、１μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬの範囲内の
用量で活性のピークを示した。これより少ない又は多い
用量の場合は、赤血球コロニーの数が減少した。Ｈｅｒ
２／Ｎｅｕに対する対照モノクローナル抗体は、この用
量範囲では全くコロニーを生じさせなかった。この結果
は、Ｍａｂ ７１が赤血球前駆体からの赤血球コロニー
の形成を刺激するだろうということと、血清を追加する
必要がないということを示している。従って、Ｍａｂ
７１は、赤血球前駆体の赤血球細胞への分化を刺激する
ことが可能である。

【００８０】本発明を好ましい実施様態に関して説明し
てきたが、こうした実施様態に対して当業者が変形と変
更とを行うことが可能であるということを理解された
い。従って、添付の請求範囲は、請求する本発明の範囲
内に含まれる均等の変形例の全てを、その範囲内に含む
ことが意図されている。

【００８１】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ： ４２ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ 配列 CTCCAAGCTT GCCGTCACCA TGGACCACCT CGGGGCGTCC CT 42 配列番号 配列の長さ： ３５ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ 配列 CAGGTCTAGA TTACTAGGGA TCCAGGTCGC TAGGC 35 配列番号 配列の特性 配列の長さ： ２７ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ 配列 AGGTCGACTA CTAGTAGTCA GTTGAGA 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図に示した濃度の合成ペプチドに対するＭａｂ
７１の結合を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示
す。ペプチドは、図に示したヒトＥＰＯ受容体のアミノ
酸残基に対応する。残基１は、リーダー配列の切断時に
分泌されたＥＰＯＲ中に見出されアミノ末端プロリンで
ある。

【図２】ＵＴ７−ＥＰＯ細胞の^３Ｈチミジン取り込みに
対する、様々な量のｒＨｕＥＰＯタンパク質と精製Ｍａ
ｂ ７１及び７３の作用を示す。

【図３】ＯＣＩＭ１細胞の表面上のＥＰＯ受容体に対す
る^１２５Ｉ ＥＰＯ結合の阻害に関する、様々な量のｒ
ＨｕＥＰＯタンパク質、Ｍａｂ ７１、Ｍａｂ ７３、
又は、ＥＰＯに対する非中和対照Ｍａｂ（Ｍａｂ Ｆ１
２）の作用を示す。

【図４】モノクローナル抗体Ｍａｂ ７１及び７３精製
試料と、これらの抗体に由来するモノクローナル抗体フ
ラグメント（Ｆａｂ）精製試料の、クーマシー染色ＳＤ
Ｓゲルを示す。還元（２−メルカプトエタノールを加え
た）条件、又は、非還元（２−メルカプトエタノールを
除いた）条件下で、試料を泳動させた。

【図５】ＵＴ７−ＥＰＯ細胞の^３Ｈチミジン取り込みに
対する、様々な量の精製ｒＨｕＥＰＯタンパク質、Ｍａ
ｂ ７１又はＦａｂ ７１の作用を示す。

【図６】組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）３０ｍｕｎ
ｉｔｓ／ｍｌも加えたＵＴ７−ＥＰＯ細胞の^３Ｈチミジ
ン取り込みに対する、様々な量の精製Ｍａｂ ７１又は
Ｆａｂ ７１の作用を示す。

【図７】無血清増殖条件下においてＥＰＯ又はＭａｂ
７１の存在下でメチルセルロース中で２１日間増殖させ
た、末梢血液からの精製ＣＤ３４^＋＋ 細胞の写真を示
す。写真は、５００ ｍｕｎｉｔｓ／ｍｌ ＥＰＯ
（Ａ）、２５ｍｕｎｉｔｓ／ｍｌＥＰＯ（Ｂ）、又は、
２．１μｇ／ｍｌ Ｍａｂ ７１（Ｃ）でインキュベー
トした細胞である。

【図８】軟質寒天中において無血清増殖条件下で増殖さ
せた場合の、赤血球前駆体からの赤血球コロニーの形成
に対する、様々な量の精製ｒＨｕＥＰＯタンパク質、Ｍ
ａｂ ７１、及びＨｅｒ２／ｎｅｕに対する対照モノク
ローナル抗体の作用を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エリトロポエチン受容体を活性化する抗
   体又はそのフラグメント。
2. 【請求項２】 前記エリトロポエチン受容体が哺乳動物
   エリトロポエチン受容体である請求項１に記載の抗体。
3. 【請求項３】 前記エリトロポエチン受容体がヒトエリ
   トロポエチン受容体である請求項１に記載の抗体。
4. 【請求項４】 モノクローナル抗体である請求項１に記
   載の抗体。
5. 【請求項５】 ヒト化抗体である請求項１に記載の抗
   体。
6. 【請求項６】 ヒト抗体である請求項１に記載の抗体。
7. 【請求項７】 検出可能な標識を有する請求項１に記載
   の抗体。
8. 【請求項８】 請求項４に記載の前記モノクローナル抗
   体を産生することが可能なハイブリドーマ細胞系。
9. 【請求項９】 ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ Ｎｏ．
   ＨＢ１１６８９又はＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１１６９０に
   よって産生されるモノクローナル抗体によって認識され
   る、エリトロポエチン受容体上のエピトープを認識する
   抗体又はそのフラグメント。
10. 【請求項１０】 エリトロポエチン受容体を活性化する
    請求項９に記載の抗体。
11. 【請求項１１】 前記エリトロポエチン受容体がヒトエ
    リトロポエチン受容体である請求項９に記載の抗体。
12. 【請求項１２】 モノクローナル抗体である請求項９に
    記載の抗体。
13. 【請求項１３】 ヒト化抗体である請求項９に記載の抗
    体。
14. 【請求項１４】 検出可能な標識を有する請求項９に記
    載の抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の前記モノクローナ
    ル抗体を産生することが可能なハイブリドーマ細胞系。
16. 【請求項１６】 ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ Ｎ
    ｏ．ＨＢ１１６８９又はＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１１６９
    ０によって産生される抗体。
17. 【請求項１７】 ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ Ｎ
    ｏ．ＨＢ１１６８９又はＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１１６９
    ０。
18. 【請求項１８】 活性化されることが可能なエリトロポ
    エチン受容体を生物試料中に検出する方法であって、 （ａ）請求項１又は９に記載の抗体に前記試料を接触さ
    せる段階、及び、 （ｂ）前記抗体による前記受容体の活性化を検出する段
    階を含み、それによって活性化可能なエリトロポエチン
    受容体の存在を決定すること、を含む前記方法。
19. 【請求項１９】 請求項１又は９に記載の抗体を含む、
    活性化可能なエリトロポエチン受容体を生物試料中に検
    出するためのキット。
20. 【請求項２０】 エリトロポエチン受容体の活性を調節
    するために有効な請求項１又は９に記載の抗体を有効量
    投与することを含む、哺乳動物におけるエリトロポエチ
    ン受容体の内因性活性を調節する方法。
21. 【請求項２１】 エリトロポエチン受容体活性の調節
    が、赤血球前駆細胞の増殖又は分化を制御する請求項２
    ０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 請求項１又は９に記載の抗体を治療有
    効量投与することを含む、患者の貧血を治療するための
    方法。
23. 【請求項２３】 医薬上許容可能なアジュバント中に治
    療有効量の請求項１又は９に記載の抗体を含む医薬組成
    物。
24. 【請求項２４】 前記抗体がモノクローナル抗体である
    請求項２３に記載の組成物。
25. 【請求項２５】 前記抗体がヒト化抗体である請求項２
    ４に記載の組成物。
26. 【請求項２６】 前記抗体がヒト抗体である請求項２４
    に記載の組成物。