CN117567625A - 一种抗Claudin18.2单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术及生物医药技术领域，具体涉及一种抗Claudin18.2单克隆抗体及其应用。本发明所述单克隆抗体的重链可变区包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区包括如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。本发明所述抗Claudin18.2单克隆抗体具有优于现有商用IMB362抗体更高的亲和力，且所述抗Claudin18.2单克隆抗体可以与肿瘤细胞特异性结合，小鼠体内能够靶向结合于Claudin18.2高表达的肿瘤。

Description

一种抗Claudin18.2单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术及生物医药技术领域，具体涉及一种抗Claudin18.2单克隆抗体及其应用。
背景技术
Claudin18是由人类CLDN18基因编码的一种组成紧密连接的膜蛋白，属于Claudins家族成员。Claudin-18在肺和胃组织特异性表达，在肺和胃上皮细胞上有完整膜定位，电子显微镜显示其主要集中在这些细胞的边界上。这些特征说明Claudin-18在肺和胃的紧密连接的结构和功能方面有潜在的重要作用。
Claudin18有两种亚型，Claudin18.1和Claudin18.2。Claudin18.2亚型是一种胃特异性亚型，Claudin18.2是一种高度选择性的分子，并且只在癌细胞中广泛表达，它就成为一种理想的靶点。Claudin18.2通常埋藏在胃粘膜中，正常组织中的单克隆抗体基本上接触不到，恶性肿瘤的发生会导致紧密连接的破坏，使肿瘤细胞表面的Claudin18.2表位暴露出来，成为特定的靶点。因此，Claudin18.2赋予靶向治疗特异性。且近期研究发现Claudin18.2在胰腺癌(50％)、食管癌和肺癌中的表达也显示了诊断和治疗其他肿瘤的潜力。
基于Claudin18.2在肿瘤上的诊断和治疗优势，抗Claudin18.2抗体的研究逐渐热门和广泛，且产生了一系列抗Claudin18.2的鼠源抗体和人源抗体，尤其基于鼠源抗体改造得到的人源抗体具有较好的肿瘤结合力和抑制活性，但是，较多鼠源抗体在进行人源化后存在亲和力较低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗Claudin18.2单克隆抗体及其应用，所述抗Claudin18.2单克隆抗体较现有的抗Claudin18.2单克隆抗体具有更高的亲和力。
本发明提供了一种抗Claudin18.2单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；
所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述重链可变区包括重链高变区和重链骨架区，所述重链骨架区序列来源于鼠源抗体或人源抗体；
所述轻链可变区包括轻链高变区和轻链骨架区，所述轻链骨架区序列来源于鼠源抗体或人源抗体；
优选的，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10所示；
优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13或SEQ ID NO.14所示。
优选的，所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的重链可变区，和SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13或SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的轻链可变区。
优选的，所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括如下1)～4)的重链可变区和轻链可变区的组合：
1)SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.11所示的轻链可变区；
2)SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.12所示的轻链可变区；
3)SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.13所示的轻链可变区；
4)SEQ ID NO.10所示的重链可变区和SEQ ID NO.14所示的轻链可变区；
优选的，当所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括1)所述组合时，所述抗Claudin18.2单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
优选的，当所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括2)、3)或4)所述组合时，所述抗Claudin18.2单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
优选的，所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括单链抗体、嵌合抗体、多聚体抗体或CDR移植抗体。
本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括由核苷酸序列或氨基酸序列构建的表达盒、重组载体、重组工程菌或重组细胞系；
所述氨基酸序列包括上述技术方案所述抗Claudin18.2单克隆抗体的氨基酸序列；
所述核苷酸序列包括编码上述技术方案所述抗Claudin18.2单克隆抗体的核苷酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗Claudin18.2单克隆抗体或上述技术方案所述的生物材料在制备肿瘤相关产品中的应用；
优选的，所述肿瘤相关产品包括具备肿瘤的诊断、预防、治疗和预后中的一种或多种功能的产品。
优选的，所述肿瘤包括胃癌。
本发明还提供了一种生物产品，所述生物产品中的有效成分包括上述技术方案所述的抗Claudin18.2单克隆抗体或上述技术方案所述的生物材料。
有益效果：
本发明提供了一种抗Claudin18.2单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示。含有本发明所述重链可变区和轻链可变区的抗Claudin18.2单克隆抗体具有优于现有商用IMB362抗体更高的亲和力，且所述抗Claudin18.2单克隆抗体可以与肿瘤细胞特异性结合，且与肿瘤的结合力均较高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2中不同稀释比例的m1D6对于Claudin18.2-CHO细胞的特异性检测结果图；
图2为实施例2中m1D6对于NUGC4细胞的特异性检测结果；
图3为实施例2中m1D6对于NUGC4细胞膜表面结合力检测结果；
图4为实施例2中m1D6注射小鼠后的活体成像结果；
图5为实施例3中流式细胞仪检测人源化抗体h1D6-1，h1D6-2，h1D6-3的亲和力结果；
图6为实施例3中ELISA法人源化抗体h1D6-1，h1D6-2，h1D6-3的亲和力结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗Claudin18.2单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；
所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示。
在本发明中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3组成所述重链可变区中的重链高变区。本发明所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具体为GYTFTSYR，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具体为IDPSNSYT，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具体为ARLGRGNTLGY。
在本发明中，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3组成所述轻链可变区中的轻链高变区。本发明所述SEQ ID NO.4的氨基酸序列具体为QSLLNSGNQKNY，所述SEQ ID NO.5的氨基酸序列具体为WAS，所述SEQ ID NO.6的氨基酸序列具体为QNGYSYPFT。
在本发明中，所述重链可变区优选包括重链高变区和重链骨架区，所述重链骨架区序列优选来源于鼠源抗体或人源抗体。在此基础上，本发明所述重链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
本发明SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具体为 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQ ID NO.7所示的重链可变区中的四段重链骨架区序列，所述四段重链骨架区序列来源于鼠源抗体。
本发明SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具体为： 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQID NO.8所示的重链可变区中的四段重链骨架区序列，所述四段重链骨架区序列来源于人源抗体。本发明用于编码SEQ ID NO.8所示重链可变区的氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示，具体为5’-CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCGACCCCAGCAACAGCTACACCAACTACAACCAGAACTTCAGGGGCAGGAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCTGGGCAGGGGCAACACCCTGGGCTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC-3’。
本发明SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具体为： 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQID NO.9所示的重链可变区中的四段重链骨架区序列，所述四段重链骨架区序列来源于人源抗体。本发明用于编码SEQ ID NO.9所示重链可变区的氨基酸的核苷酸序列分别如SEQID NO.23所示，具体为5’-CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCGACCCCAGCAACAGCTACACCAACTACAACCAGAACTTCAGGGGCAGGAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCTGGGCAGGGGCAACACCCTGGGCTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC-3’。
本发明SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列具体为： 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQID NO.10所示的重链可变区中的四段重链骨架区序列，所述四段重链骨架区序列来源于人源抗体。本发明用于编码SEQ ID NO.10所示重链可变区的氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.24所示，具体为5’-CAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCGACCCCAGCAACAGCTACACCAACTACAACCAGAACTTCAGGGGCAGGAGCACCCTGAGCGTGGACAAGGCCAAGAGCAGCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCTGGGCAGGGGCAACACCCTGGGCTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC-3’。
在本发明中，所述轻链可变区包括轻链高变区和轻链骨架区，所述轻链骨架区序列来源于鼠源抗体或人源抗体。在此基础上，本发明所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示。
本发明所述SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列具体为： 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQ ID NO.11所示的轻链可变区中的四段轻链骨架区序列，所述四段轻链骨架区序列来源于鼠源抗体。
本发明所述SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具体为： 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQ IDNO.12所示的轻链可变区中的四段轻链骨架区序列，所述四段轻链骨架区序列来源于人源抗体。本发明用于编码SEQ ID NO.12所示轻链可变区的氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.25所示，具体为5’-GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGGCTACAGCTACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAGGCTGGAGATCAAG-3’。
本发明所述SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列具体为： 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQ IDNO.13所示的轻链可变区中的四段轻链骨架区序列，所述四段轻链骨架区序列来源于人源抗体。本发明用于编码SEQ ID NO.13所示轻链可变区的氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，具体为5’-GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGAACGGCTACAGCTACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAGGCTGGAGATCAAG-3’。
本发明所述SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列具体为： 从左到右的三段下划线加粗的氨基酸序列依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；从左到右的四段未标有下划线的内容，表示SEQ IDNO.14所示的轻链可变区中的四段轻链骨架区序列，所述四段轻链骨架区序列来源于人源抗体。本发明用于编码SEQ ID NO.14所示轻链可变区的氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示，具体为5’-GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGAACGGCTACAGCTACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAGGCTGGAGATCAAG-3’。
在本发明中，所述抗Claudin18.2单克隆抗体优选包括SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的重链可变区，和SEQ ID NO.11、SEQID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的轻链可变区，更优选包括如下1)～4)的重链可变区和轻链可变区的组合：1)SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ IDNO.11所示的轻链可变区；2)SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列轻链可变区；3)SEQ ID NO.9所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ IDNO.13所示氨基酸序列的轻链可变区；4)SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的重链可变区和SEQID NO.14所示氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明中，所述抗Claudin18.2单克隆抗体优选包括单链抗体、嵌合抗体、多聚体抗体或CDR移植抗体，进一步优选包括单链抗体或嵌合抗体，更优选为嵌合抗体。
在本发明中，当所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括1)所述组合时，所述抗Claudin18.2单克隆抗体优选还包括重链恒定区和轻链恒定区；由所述重链恒定区与重链可变区组成抗Claudin18.2单克隆抗体的重链；由所述轻链恒定区与轻链可变区组成抗Claudin18.2单克隆抗体的轻链；组成的所述抗Claudin18.2单克隆抗体的重链和抗Claudin18.2单克隆抗体的轻链分别为鼠源抗Claudin18.2单克隆抗体的重链和轻链。
本发明所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为AKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEVLHNHLTTKTISRSLGK：轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC，即SEQ ID NO.7所示的重链可变区与SEQ ID NO.15所示的重链恒定区组成重链，所述重链的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.18所示，具体为：MGWSCIILFLVSTATGVHSQVQLQQPGPELVMPGASVKLSCKASGYTFTSYRMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSNSYTNYNQNFRGRSTLTVDKSSSTAYMQLSSLTSGDSAVYYCARLGRGNTLGYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEVLHNHLTTKTISRSLGK*；编码所述重链的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.19所示，具体为 加粗下划线部分为编码SEQ ID NO.15所示重链恒定区的核苷酸序列，剩余部分为编码SEQ IDNO.7所示重链可变区的核苷酸序列；SEQ ID NO.11所示的轻链可变区与SEQ ID NO.16所示的轻链恒定区组成轻链，所述轻链的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.20所示，具体为MESQTQVLMSLLFWVSGTCGDIVMTQSPSSLTVTAGEKVTVGCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIRSVQAEDLAVYYCQNGYSYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*；编码轻链的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.21所示，具体为 加粗下划线部分为编码轻链恒定区的核苷酸序列，剩余部分为编码SEQ ID NO.8所示轻链可变区的核苷酸序列。
当所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括2)、3)或4)所述组合时，所述抗Claudin18.2单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，由所述重链恒定区与重链可变区组成抗Claudin18.2单克隆抗体的重链；由所述轻链恒定区与轻链可变区组成抗Claudin18.2单克隆抗体的轻链；组成的所述抗Claudin18.2单克隆抗体的重链和抗Claudin18.2单克隆抗体的轻链分别为人源抗Claudin18.2单克隆抗体的重链和轻链。本发明所述重链恒定区(H-GAMMA-1)的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.28所示，具体为ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，编码SEQ ID NO.28所示重链恒定区的氨基酸的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.30所示，具体为5’-GCCTCTACAAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCACTGGCCCCCTCTAGCAAGTCTACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAACAGCGGCGCCCTGACCTCCGGGGTGCACACATTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCTCCCTGGGCACCCAGACATACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAATACAAAGGTGGACAAGAAGGTCGAGCCCAAGAGCTGTGATAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCAGAGCTGCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTATAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCCGCCCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTATACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCAGAGAACAATTATAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCTTTCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAAGCCCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGAAAG-3’。
本发明所述轻链恒定区(L-KAPPA)的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，具体为TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；编码SEQ ID NO.29所示的轻链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.31所示，具体为5’-ACAGTGGCCGCCCCATCCGTGTTCATCTTTCCACCCTCTGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCTACATATAGCCTGTCTAGCACCCTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACTCATCAGGGGCTGTCATCACCTGTCACTAAGTCATTCAATAGAGGCGAATGC-3’。
本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括由核苷酸序列或氨基酸序列构建的表达盒、重组载体、重组工程菌或重组细胞系；所述氨基酸序列包括上述技术方案所述抗Claudin18.2单克隆抗体的氨基酸序列；所述核苷酸序列包括编码上述技术方案所述抗Claudin18.2单克隆抗体的核苷酸序列。
本发明所述重组载体中的初始载体优选包括质粒载体或慢病毒，更优选为质粒载体。本发明对所述生物材料的构建方法没有特殊限定，采用本领域中常规基因工程手段即可。
含有本发明所述重链可变区和轻链可变区的抗Claudin18.2单克隆抗体具有优于现有商用IMB362抗体更高的亲和力，且所述抗Claudin18.2单克隆抗体可以与肿瘤细胞特异性结合，肿瘤活性和结合力均较高。
基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的抗Claudin18.2单克隆抗体或上述技术方案所述的生物材料在制备肿瘤相关产品中的应用。本发明所述肿瘤相关产品优选包括具备肿瘤的诊断、预防、治疗和预后中的一种或多种功能的产品，进一步优选为具备肿瘤的诊断、预防和治疗中的一种或多种的产品，更优选为具备肿瘤的诊断和/或治疗的产品。本发明所述肿瘤优选包括胃癌、胰腺癌或结肠癌，更优选为胃癌。
本发明还提供了一种生物产品，所述生物产品中的有效成分包括上述技术方案所述的抗Claudin18.2单克隆抗体或上述技术方案所述的生物材料。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
抗Claudin18.2单克隆抗体的制备及筛选，步骤如下：
1、小鼠免疫及鼠单抗序列获取：
使用含有hClaudin18.2全长基因的pCDNA3.4质粒免疫Claudin18.2基因敲除C57小鼠(来源是北京市维通利华有限公司)，按照60μg质粒/只/次进行小鼠皮下多点注射免疫，每周一次，经过4周免疫后，对血液抗体效价达到1k以上小鼠处死，取脾脏细胞与SP2.0细胞融合。对融合细胞进行效价检测，筛选阳性融合细胞使用有限稀释法挑取单克隆。
采用流式细胞仪检测单克隆细胞上清中抗体的特异性，对最终筛选到的鼠单抗提取基因并构建抗体轻重链表达质粒发酵纯化抗体，具体步骤为：将构建好的抗体轻重链表达质粒配对，使用PEI试剂作为转染试剂，同时将一对轻重链表达质粒瞬时转染293T细胞进行抗体蛋白发酵，抗体轻重链在发酵过程中天然配对，并收集培养液。使用0.22μm无菌滤膜过滤培养液，得培养上清后进行亲和色谱纯化。
纯化方法为：(1)20mM PB，pH 7.0平衡1mL-ProteinA亲和柱，1.0mL/min；(2)上样培养液50mL，1mL/min，使用平衡液平衡；(3)0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7洗脱，1mL/min，收集280nm吸收峰；(4)20-50mM PB，150mM NaCl，pH 6.7平衡Superdex 200Increase 10/300GL柱，1mL/min；(5)上样，收集280nm吸收峰2mL。
对纯化样品进行HPLC分析，对接收峰进行检测，检测纯化接出峰浓度，并计算蛋白量。
得到的抗Claudin18.2小鼠单克隆抗体m1D6的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，其中重链可变区和重链恒定区的氨基酸分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，其中轻链可变区和重链恒定区的氨基酸分别如SEQID NO.11和SEQ ID NO.16所示。
2、人源化抗体改造及人源化抗体制备：
将小鼠抗体序列的可变区的框架区进行人源化设计，得到重链可变区SEQ IDNO.8～10及轻链可变区SEQ ID NO.12～14。将设计好的人源化抗体轻链可变区和重链可变区核苷酸序列，与人IgG1恒定区序列进行拼接，IgG1的重链恒定区SEQ ID NO.28和轻链恒定区SEQ ID NO.29。通过全基因合成法合成抗体完整序列，分别连接至表达载体pcDNA3.4中，转染至HEK293F细胞中进行表达，分别得到本申请人源化抗体h1D6-1，h1D6-2，h1D6-3；其中人源化抗体h1D6-1，h1D6-2，h1D6-3依次对应的是含有由SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.12所示的轻链可变区组成的可变区的人源化抗体1，含有由SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.13所示的轻链可变区组成的可变区的人源化抗体，含有由SEQ ID NO.10所示的重链可变区和SEQ ID NO.14所示的轻链可变区组成的可变区的人源化抗体3。
实施例2
1.实施例1中抗Claudin18.2小鼠单克隆抗体m1D6活性鉴定
1.1流式细胞仪检测m1D6单克隆抗体与细胞的亲和力：
Claudin18.2-CHO高表达细胞株和Claudin18.1-CHO高表达细胞株由本实验室构建表达培养，Claudin18.2-CHO高表达细胞株和Claudin18.1-CHO高表达细胞株构建和培养方法如下：
将表达mClaudin18.1及mClaudin18.2的碱基序列克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-mClaudin18.1及PHBLV-EF1α-mClaudin18.2，将PHBLV-EF1α-mClaudin 18.1及PHBLV-EF1α-mClaudin18.2质粒使用Lipofectamine3000转入CHO细胞中瞬时表达；在72h后检测细胞阳性率，最终得到瞬时表达mClaudin18.1或mClaudin18.2的CHO细胞，命名为CHO-mClaudin18.1和CHO-mClaudin18.2用于抗体种属特异性检测。上述所有细胞培养基：使用DMEM培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清。
实验时，分别收集处于对数期生长的Claudin18.2-CHO高表达细胞株细胞，每个测试管准备1E+06个细胞。300g离心5min后收集细胞使用染色液(含有1％BSA的预冷PBS)等体积洗涤离心3次后，每种细胞按照每管100μL的量分装到流式检测管中。加入按不同比例稀释的抗Claudin18.2小鼠单克隆抗体m1D6，4℃孵育30min，染色液洗3次后，使用抗小鼠IgGFc-FITC标记二抗4℃孵育30min，染色液洗3次后用于流式细胞仪检测荧光强度。流式结果显示不同稀释比例的m1D6对于Claudin18.2-CHO细胞具有很好的特异性反应，结果如图1所示。
收集处于对数期生长的人胃癌NUGC4细胞，准备2E+06个细胞。300g离心5min后收集细胞使用染色液(含有1％BSA的预冷PBS)等体积洗涤离心3次后，细胞按照每管100μL的量分装到两个流式检测管中。加入同型对照(重组mIgG，购买自义翘神州)和m1D6抗体，4℃孵育30min，染色液洗3次后，使用抗小鼠IgGFc-FITC标记二抗4℃孵育30min，染色液洗3次后用于流式细胞仪检测荧光强度。流式结果显示m1D6对于NUGC4细胞具有很好的特异性反应，结果如图2所示，在图2中Isotopy表示小鼠同型对照抗体、anti-CLDN18.2表示m1D6、unstaining表示未染色样品(不添加检测抗体)。
1.2免疫荧光法检测抗Claudin18.2单克隆抗体m1D6的亲和力：
用胰酶消化处于细胞培养瓶中对数期生长的NUGC4细胞，按1E+04个细胞接种于玻璃底激光共聚焦小皿进行培养。待其贴壁后，加入4％多聚甲醛进行固定。PBS冲洗3次后，分别加入同型对照和m1D6抗体，室温孵育30min，PBS洗3次后，使用抗小鼠IgGFc-FITC标记二抗室温避光孵育30min，PBS洗1次后，加入Hoest33342复染核，PBS洗3次，用荧光显微镜观察。结果如图3所示，m1D6对于NUGC4细胞膜表面具有较强的结合能力。
1.3小动物活体成像法检测抗Claudin18.2单克隆抗体m1D6的体内肿瘤结合活性
收集Claudin18.2-CHO高表达细胞和Claudin18.1-CHO高表达细胞各5E+06个细胞，重悬在200μL的无血清培养基，将Claudin18.1-CHO细胞接种于裸小鼠右腋窝下，将Claudin18.2-CHO细胞接种于同只裸小鼠左腋窝下。待肿瘤生长至大约200-500mm3大小时，将事先用Dylight680染料标记的m1D6注射于小鼠尾静脉。分别于抗体注射后30min，1天，2天，5天，7天，用小动物活体成像仪拍摄抗体摄取情况。结果如图4所示，抗体注射1天后，荧光标记的抗体可富集到Claudin18.2-CHO接种的肿瘤侧，而对侧的Claudin18.1-CHO肿瘤测未看到有荧光抗体的富集，进而说明m1D6仅特异性结合与Claudin18.2-CHO肿瘤，而不与Claudin18.1-CHO肿瘤结合，体现出抗体的特异性。
实施例3
嵌合抗体CH1D6和人源化抗体h1D6-1，h1D6-2，h1D6-3的亲和力测定，步骤如下：
其中嵌合抗体CH1D6是将抗Claudin18.2小鼠单克隆抗体m1D6的可变区，和人IgG1恒定区序列进行拼接进行拼接，重组表达而来，重组表达的表达体系和方法同实施例2.
3.1Biacore测定嵌合抗体和人源化抗体与Claudin18.2抗原的亲和力
合成参比抗体IMAB362质粒(IMAB362根据专利申请WO2014/146672A1中公开的氨基酸序列合成)，转染至HEK293细胞中，表达纯化IMAB362抗体。采用BIACORET200测定抗体和抗原的亲合常数。首先将Human Claudin-18.2Full Length Protein-VLP(购买自ACROBiosystems)蛋白偶联至CM-5传感芯片，然后注入不同浓度梯度的IMAB362抗体、嵌合抗体CH1D6、人源化抗体1(h1D6-1)、人源化抗体2(h1D6-2)、人源化抗体3(h1D6-3)(嵌合抗体CH1D6、人源化抗体1(h1D6-1)、人源化抗体2(h1D6-2)、人源化抗体3(h1D6-3)四种抗体的质粒委托奈斯特生物技术(杭州)有限公司公司合成)，通过芯片表面直接监测抗体-抗原结合过程，通过结合曲线快速半定量不同抗体的动力学参数，样品注射完毕后，抗体被缓冲液代替时，可观察到复合物的解离状态，结合量可反映出抗体浓度及结合的亲和力，得到分析软件提供的反应动力学常数及亲和力数据。将原始数据代入GraphPad 9.0软件作图并计算，KD值见表1。
表1各抗体的KD值
由表1可以得出：嵌合抗体及人源化抗体的KD值均显著高于参比抗体IMAB362。
3.2流式细胞仪检测嵌合抗体和人源化抗体与Claudin18.2-CHO细胞的亲和力
收集处于对数期生长的Claudin18.2-CHO高表达细胞，每个测试管准备1E+06个细胞。300g离心5min后收集细胞使用染色液(含有1％BSA的预冷PBS)等体积洗涤离心3次后，细胞按照每管100μL的量分装到流式检测管中。加入按10倍比例稀释的待检测抗体，4℃孵育30min，染色液洗3次后，使用抗人IgG-FITC标记二抗4℃孵育30min，染色液洗3次后用于流式细胞仪检测荧光强度。结果如图5所示；将平均荧光值作为原始数据，采用GraphPad9.0软件计算各抗体EC50，见表2。
表2各抗体的EC50值
结合表2和图5可以得出：各待测抗体对Claudin18.2-CHO细胞具有良好的量效反应。
3.3ELISA法检测嵌合抗体和人源化抗体与Claudin18.2-CHO细胞的亲和力
将Human Claudin-18.2Full Length Protein-VLP用包被液(pH 9.6)稀释至含量为5μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，每孔300μL洗涤液洗4次(以下简称洗涤)。每孔300μL封闭液，37℃孵育1.5h，洗涤。每孔加入各浓度梯度抗体，用PBS将嵌合抗体、人源化抗体1、人源化抗体2、人源化抗体3分别稀释到终浓度300ng/mL、250ng/mL、200ng/mL、150ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL和0ng/mL，37℃孵育1h，洗涤。加入稀释液1：10000稀释的山羊抗人IgG/辣根酶标记(中杉金桥)，37℃孵育1h，洗涤。每孔加入100μL TMB Solution(北京全式金生物)，室温避光30min，加入100μL 0.5M硫酸终止，酶标仪OD450读数。数据处理：将原始数据代入GraphPad 9.0软件作图并计算。结果图6，EC50值见表3。
表3各抗体的EC50值
由表3和图6可以得出：嵌合抗体和人源化抗体与细胞的亲和力均在纳摩尔级别。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种抗Claudin18.2单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；
所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的抗Claudin18.2单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区包括重链高变区和重链骨架区，所述重链骨架区序列来源于鼠源抗体或人源抗体；
所述轻链可变区包括轻链高变区和轻链骨架区，所述轻链骨架区序列来源于鼠源抗体或人源抗体。
3.根据权利要求2所述的抗Claudin18.2单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQID NO.14所示。
4.根据权利要求3所述抗Claudin18.2单克隆抗体，其特征在于，所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的重链可变区，和SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的轻链可变区。
5.根据权利要求3或4所述的抗Claudin18.2单克隆抗体，其特征在于，所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括如下1)～4)的重链可变区和轻链可变区的组合：
1)SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.11所示的轻链可变区；
2)SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.12所示的轻链可变区；
3)SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.13所示的轻链可变区；
4)SEQ ID NO.10所示的重链可变区和SEQ ID NO.14所示的轻链可变区；
优选的，当所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括1)所述组合时，所述抗Claudin18.2单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
优选的，当所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括2)、3)或4)所述组合时，所述抗Claudin18.2单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
6.根据权利要求1所述的抗Claudin18.2单克隆抗体，其特征在于，所述抗Claudin18.2单克隆抗体包括单链抗体、嵌合抗体、多聚体抗体或CDR移植抗体。
7.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子用于编码权利要求1～10任一项所述的抗Claudin18.2单克隆抗体。
8.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括由核苷酸序列或氨基酸序列构建的表达盒、重组载体或重组细胞系；
所述氨基酸序列包括权利要求1～6任一项所述抗Claudin18.2单克隆抗体的氨基酸序列；
所述核苷酸序列包括编码权利要求1～6任一项所述抗Claudin18.2单克隆抗体的核苷酸序列。
9.权利要求1～6任一项所述的抗Claudin18.2单克隆抗体或权利要求7或8所述的生物材料在制备肿瘤相关产品中的应用；
优选的，所述肿瘤相关产品包括具备肿瘤的诊断、预防、治疗和预后中的一种或多种功能的产品；
优选的，所述肿瘤包括胃癌。
10.一种生物产品，其特征在于，所述生物产品中的有效成分包括权利要求1～6任一项所述的抗Claudin18.2单克隆抗体或权利要求8所述的生物材料。
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