CN111440239B

CN111440239B - 抗人转化生长因子β1的纳米抗体B3及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111440239B
Application number: CN202010227938.2A
Authority: CN
Inventors: 张建民; 王玥; 陈慧; 胡瑜; 许依; 何维
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: CN111440239A

Abstract

本发明公开了一种抗人转化生长因子β1的纳米抗体B3及其制备方法和应用，属于生物制药领域。提供的制备方法采用噬菌体展示技术和生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的抗人转化生长因子β1的纳米抗体。该纳米抗体能够特异性地和天然TGF‑β1蛋白的三种形式：LAP前体、TGF‑β1单体及二聚体进行结合，并且具有特异性强和亲和力高的特点，能够有效中和肿瘤微环境中自分泌或旁分泌TGF‑β1，为肿瘤的免疫治疗、促进伤口愈合以及促进组织修复和胚胎发育等方面提供一种基因工具。

Description

抗人转化生长因子β1的纳米抗体B3及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种抗人转化生长因子β1的纳米抗体及其制备方法应用，具体涉及一种对人转化生长因子β1具有高特异性识别和高亲和力的抗人转化生长因子β1的纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术

转化生长因子β(TGF-β)是调节细胞生长、分化和免疫功能的细胞因子之一。目前人类TGF-β超家族有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2四个成员，其中TGF-β1兼具调节细胞增殖分化、控制细胞外基质蛋白的合成与降解等功能，其还可参与胚胎与骨骼的发生、组织重塑和伤口愈合等过程。然而，在肿瘤恶性进展期间，几乎所有肿瘤细胞内可监测到TGF-β1的高度活化表达，其作用由抑癌转为促癌。临床上，肿瘤患者血清中TGF-β1的水平与肿瘤恶性程度及预后也密切相关。TGF-β1与其受体结合后，能通过加速血管生成和上皮-间充质转化、增强基质修饰等方式促进肿瘤的生长及侵袭转移；TGF-β1信号通路还可阻止T细胞分化成细胞毒性T淋巴细胞、降低树突状细胞的抗原呈递能力、抑制IFN-γ和TNF-α的产生等。由此可见，TGF-β1能抑制抗肿瘤免疫应答，在肿瘤免疫逃逸过程中扮演着重要角色，故通过中和抗体封闭TGF-β1是肿瘤免疫治疗的关键点之一。

已有研究表明，靶向TGF-β1信号通路的封闭抗体，如抗TGF-β1抗体Fresolimumab(GC1008)、抗TGF-β1受体抗体Lapatimab(AB0213)等，可以显著减少肿瘤基质蛋白的合成和成纤维细胞的数量，进而抑制肿瘤的生长和迁移；然而现有大部分完整抗体存在免疫原性高、溶解性差、易沾粘聚集和易被蛋白酶降解等缺点，限制了这类蛋白抗体在封闭TGF-β1进而抑制肿瘤生长和迁移中的应用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种对人转化生长因子β1具有高特异性和高亲和力的抗人转化生长因子β1的纳米抗体，所述纳米抗体B3的氨基酸序列包含序列表中SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且所述纳米抗体能够特异性识别并结合TGF-β1的三种形式：LAP前体、TGF-β1单体及二聚体。

本发明另一方面提供了编码上述的纳米抗体的氨基酸序列的核苷酸编码序列。

上述核苷酸编码序列如序列表中SEQ ID NO：11所示或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：11所示的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

本发明又一方面提供一种含有上述的核苷酸编码序列的表达载体。

上述表达载体为将上述的核苷酸编码序列插入pGEX6P.1原核表达载体中获得。

含有上述的表达载体的宿主细胞也属于本发明的内容，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

本发明再一方面提供一种肿瘤治疗药物，其包含上述的纳米抗体和/或上述的核苷酸编码序列和/或上述的表达载体和/或上述的宿主细胞；

优选地，所述肿瘤治疗药物还包含药学上可接受的载剂，所述药学上可接受的载剂包括但不限于：细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、化学治疗剂或治疗性核酸的治疗剂。

上述肿瘤包括但不限于：肺癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、肝癌、胃癌、胶质瘤。

本发明再一方面还提供了上述的纳米抗体的制备方法，其包括以下步骤：

1)构建表达融合蛋白TGF-β1的重组质粒，表达并纯化获得经纯化的融合蛋白TGF-β1；

2)使用步骤1)获得经纯化的融合蛋白TGF-β1作为抗原免疫羊驼；

3)筛选能够与经纯化的融合蛋白TGF-β1具有高结合力的基因序列；

4)将步骤3)获得的基因序列进行蛋白诱导表达。

上述步骤3)中所述筛选采用亲和淘筛的方法。

基于以上技术方案提供的纳米抗体TGF-β1-VHH的制备方法采用噬菌体展示技术对纳米抗体TGF-β1-VHH进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体。数据表明，本发明获得的纳米抗体TGF-β1-VHH能够特异性地和天然TGF-β1蛋白的三种形式：LAP前体、TGF-β1单体及二聚体进行结合，并且具有特异性强和亲和力高的特点，能够有效中和肿瘤微环境中自分泌或旁分泌TGF-β1，为肿瘤的免疫治疗提供一种新的有效手段。

附图说明

图1为真核表达质粒cFUGW-TGF-β1的构建与鉴定的琼脂糖凝胶电泳图像；

图2为重组TGF-β1蛋白在HEK-293T细胞中的瞬时表达图像，其中A和B幅表示绿色荧光蛋白表达荧光检测图像，C幅和D幅表示聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组TGF-β1蛋白表达图像；

图3为重组TGF-β1的亲和层析纯化蛋白的凝胶电泳考马斯亮蓝鉴定图像；

图4为噬菌体VHH展示文库的构建中琼脂糖凝胶电泳检测图像和噬菌体库菌板照片；

图5为纳米抗体TGF-β1-VHH与重组TGF-β1蛋白的ELLSA结合检测柱状图及序列结构图；

图6为纳米抗体TGF-β1-VHH的原核诱导表达与纯化的凝胶电泳图像；

图7为纳米抗体TGF-β1-VHH与肿瘤细胞TGF-β1结合特异性检测图像；

图8为纳米抗体TGF-β1-VHH与重组TGF-β1的亲和力检测曲线图。

具体实施方式

纳米抗体是羊驼外周血中存在一种天然缺失轻链的特殊抗体，该抗体为目前已知的天然来源的最小抗原结合单位，被称之为纳米抗体，其仅由VHH重链可变区和CH2、CH3恒定区组成，且单独的VHH区具有同样特异的抗原结合能力。此外它还兼具小分子药物与传抗抗体的优势，具有溶解性好、免疫原性低、穿透力强和人源化简单等优点，适用于多种表达系统。针对临床应用中靶向TGF-β1信号通路的封闭抗体多为完整抗体，存在免疫原性高、溶解性差、易沾粘聚集和易被蛋白酶降解等缺陷，本发明以该种纳米抗体为基础，制备一种羊驼来源的抗TGF-β1纳米抗体。

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的公开内容不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

本发明实施例中使用的细胞系：

NCI-H520肺癌细胞：以含10％FCS的RPMI-1640培养基进行贴壁培养；HEK-293T人胚肾上皮细胞系：以含10％胎牛血清的DMEM培养基进行贴壁培养；上述细胞系均购自中国医学科学院细胞中心。

本发明实施例中使用的实验动物羊驼为3岁成年健康羊驼，购自内蒙古养殖场。

本发明实施例中使用的菌株和质粒载体：

大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌TG1细胞，购自宝生物工程有限公司。基因型为：supE44ΔlacU169

hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1 relA1。

M13K07辅助噬菌体购自北京全式金生物技术有限公司。

cFUGW真核表达载体(Lois等.Science 2002 Feb 1:295(5556):868-72 Germlinetransmission and tissue-specific expression of transgenes delivered bylentiviral vectors)、pGEX6P.1原核表达载体、噬菌体pMECS载体均为国典(北京)医药科技有限公司实验室保存。

本发明实施例中使用的主要工具酶和试剂：

FastStart Taq DNA聚合酶(瑞士罗氏生物有限公司)；Phusion高保DNA聚合酶、Nde I、Xho I、No tI、EcoR I、Age I、T4 DNA连接酶(美国New England Biolabs生物工程有限公司)；IPTG、蛋白酶抑制剂、TaqMix(日本Toyobo公司)；甘氨酸、溴酚蓝(美国Amresco公司)；过硫酸铵、丙烯酰胺、甲醇、蛋白膜印迹再生液(中国康为世纪有限公司)；封闭专用脱脂奶粉(中国普利莱公司)。

本发明实施例中使用的主要仪器：

OptimaL-100XP超速冷冻离心机(美国Beckman)；LSM780激光共聚焦显微镜(德国Zeiss)；AccuriC6流式细胞仪(美国BD)；热循环仪、紫外线透射仪、Transblot SD半干转膜仪、电泳仪(美国BioRad)；ECL自显影仪(CLiNx Science Instruments)；电穿孔仪和0.1cm电穿孔比色皿(Gene Pulser)。

实施例1、真核表达质粒cFUGW-TGF-β1的构建与蛋白表达纯化

该实施例中使用的人TGF-β1标准全长DNA序列(包含N端信号肽(signalpeptides,1～39aa)、LAP前体结构(30～278aa)和C端TGF-β单体(279～390aa)三部分，编码核苷酸序列长度为1173bp，如序列表中SEQ ID NO：1所示)保存于Gateway Cloning载体(通过常规Gateway基因克隆技术获得)内。

该实施例具体包括以下步骤：

1.1、首先利用Snapgene程序设计用于扩增获得TGF-β1标准全长DNA序列的上游引物F和下游引物R，并分别引入Age I和EcoR I酶切位点(下述上游引物F和下游引物R序列中下划线部分)及其保护碱基；此外目的序列起始密码子前添加了Kozak序列(上游引物F序列中黑色加粗部分)，且在下游引入6His序列(下游引物R中黑色加粗部分)用于后续目的蛋白的纯化。

上游引物F：

下游引物R：

1.2、以Gateway Cloning载体中的人TGF-β1标准全长DNA序列为模板，以2×Phusion Master PCR酶、上游引物F及下游引物R为体系进行聚合酶链式反应，退火温度为70℃/65℃。收集上述PCR产物，并对产物进行凝胶电泳试验，如图1中A幅所示，其中lane1～2分别表示退火温度为70℃和65℃时的PCR产物的电泳结果，M表示为Marker，可见在退火温度70℃和65℃条件下均获得了片段大小为1188bp左右(如图中箭头指示)的目的PCR产物条带。使用柱式DNA回收试剂盒(购自生工生物工程有限公司)纯化上述PCR产物，并利用限制性内切酶Age I和EcoR I分别对cFUGW空载载体及PCR纯化产物进行双酶切反应，得到两条具有相同粘性末端的线性化片段，在T4连接酶存在下，将二者酶切产物于16℃过夜连接并转化后得到重组质粒，命名为cFUGW-TGF-β1重组质粒，其中在cFUGW载体中的原始GFP片段被TGF-β1片段替换。对得到的cFUGW-TGF-β1重组质粒进行Pac I和Ahd I双酶切鉴定，如图1中B幅所示，其中lane1～3表示为cFUGW-TGF-β1/PacI+AhdI(3518bp+6895bp)，lane4表示为cFUGW-TGF-β1未酶切阴性对照，M表示1kb DNA Ladder。可见与上述设计引物时Snapgene软件预测结果相同；进一步测序结果显示cFUGW-TGF-β1重组质粒构建成功。

1.3、按照jetPRIME Polyplus转染试剂盒的要求，利用HEK-293T细胞瞬时转染上述cFUGW-TGF-β1重组质粒作为试验组，并在37℃、5％CO₂条件下继续培养细胞，同时设置cFUGW空载质粒作为阴性对照组。培养24小时后对试验组和对照组的绿色荧光蛋白(GFP)进行观察，如图2所示，可见在cFUGW-TGF-β1重组质粒中，由于cFUGW载体的原始GFP已被TGF-β1片段替换，故无荧光出现(图2中B幅)，而cFUGW空载质粒可以正常检测到绿色荧光(图2中A幅)。

培养48～72h后，无菌收集细胞培养上清并用0.45μm滤膜过滤，获得带有6His标签的重组融合蛋白粗样。由于获得的融合蛋白TGF-β1末端引入的6His标签分子量极小，且具备免疫原性低、不改变自身可溶性、不影响蛋白折叠、亲和层析操作简易等优点，故可使用HisTrap-Ni SephaorseExcel系列填料纯化该重组融合蛋白，可最大限度保持该重组融合蛋白的免疫学活性。该实施例中使用HisTrap Column对上述获得的带有6His标签的融合蛋白粗样进行上机纯化。其中，平衡缓冲液为pH 7.2的20mM磷酸钠溶液，洗涤缓冲液为含20mM咪唑的磷酸钠溶液，洗脱缓冲液为含500mM咪唑的磷酸钠溶液；上样及洗脱流速分别设置为2mL/min和4mL/min。收集上述纯化前后蛋白样本及流穿液，分别用考马斯亮蓝染色检测蛋白纯度，Western Blot检测蛋白表达。其中配制12％SDS-PAGE凝胶，电泳，加入一抗(CST/兔源His-Tag，D3I10XPO)及相应种属二抗(羊抗兔IgG-HRP(购自北京三联博悦生物技术有限公司))(1：2000稀释)孵育1h后置入ECL自显影仪中曝光成像。

如图2中C幅和D幅所示，为Western blot检测蛋白表达结果，其中Lane1/2表示未转染重组质粒的细胞培养上清/细胞裂解液，lane3/4～5/6表示转染重组质粒的细胞培养上清/细胞裂解液，M表示蛋白分子量标准，GAPDH作为内参。结果显示重组质粒转染HEK-293T细胞后的培养上清中可以成功检测到LAP前体(55kDa)、TGF-β1单体(12kDa)及少量二聚体(25kDa)；而细胞裂解液中仅检测到LAP前体。由于TGF-β1是绝大多数细胞均可分泌的多能效细胞因子，故未转染HEK-293T细胞上清也可检测到少量LAP前体的表达。

如图3(A幅和B幅)所示，为考马斯亮蓝染色检测亲和层析蛋白纯化效果的结果，其中lane1表示纯化前上清，2表示流穿液，3～7表示不同纯化洗脱孔，M表示蛋白分子标准。结果显示Lane3/4孔内三种形式的TGF-β1均得到较好的纯化。

根据上述融合蛋白检测结果，证明该实施例获得纯度良好的末端引入有6His标签的融合蛋白，命名为TGF-β1纯化蛋白，其中包含TGF-β1的三种形式：LAP前体、TGF-β1单体及其二聚体。

实施例2：羊驼噬菌体VHH展示文库的构建

该实施例使用上述实施例1获得的TGF-β1纯化蛋白对羊驼进行免疫，构建VHH基因文库，具体包括以下步骤：

2.1、初次免疫将1mg TGF-β1纯化蛋白(实施例1获得)与完全弗氏佐剂1：1等体积混匀并充分乳化，采用皮下注射的方式免疫羊驼；其后用0.5mg TGF-β1纯化蛋白1：1等体积混合不完全弗氏佐剂进行4次加强免疫；共免疫5次，单次间隔为20天。抽取少量羊驼外周血进行效价检测，待免疫效价大于1：60000时，再次进行加强免疫，24h后，在被免疫羊驼颈静脉处采集100mL抗凝血。从该抗凝血中提取外周血淋巴细胞，并使用TRIZOL试剂分离总RNA，在SuperScript^TMII反转录酶及oligo-dT引物的作用下获得其cDNA。

2.2、以上述获得的cDNA为模板，利用下表1所示的CALL001引物、CALL002引物和FastStart Taq DNA聚合酶进行第一次PCR扩增，反应体系均为50μL，在95℃下孵育7分钟，然后进行30～35个PCR循环，使cDNA变性并激活聚合酶，每个循环包括94℃-60s，55℃-60s和72℃-60s。在最后一个PCR循环后，在72℃下进行10分钟的最终DNA延伸步骤。随后将第一次PCR产物进行琼脂糖电泳，如图4中A幅所示，为电泳结果，将700bp处的条带进行回收合并，用作第二次PCR(巢式PCR)的模板；随后利用下表1所示的VHH-BACK引物、PMCF引物进行第二次PCR扩增，反应体系同第一次PCR扩增，通过在95℃下孵育7分钟使DNA模板变性并激活聚合酶，然后进行17～20个PCR循环，每个循环包括94℃-45s，55℃-45s和72℃-45s。在最后一个PCR循环后，在72℃进行10分钟的DNA延伸步骤。随后将获得的PCR产物进行琼脂糖电泳，如图4中B幅所示，为电泳结果，收集并纯化400bp的预估扩增条带，即得到羊驼外周血液中天然缺失轻链的抗体的重链可变区(VHH)片段。

表1：羊驼噬菌体VHH展示文库的构建所用引物

2.3、将纯化的巢式PCR产物(400bp的扩增条带)和噬菌体pMECS载体经Pst I、NotI双酶切后，以摩尔比1：3将二者的酶切产物在T4连接酶的存在下，16℃连接后电转化至大肠杆菌TG1感受态细胞。将电转化后的菌液在LB液体培养基中于37℃摇床培养1小时，取1微升稀释10³、10⁶、10⁹倍后涂布LB固体培养皿表面用于库容量测定，其余菌液涂布在LB固体培养皿表面，过夜于37℃培养箱中培养TG1细胞，次日收集所有菌落为VHH抗体文库。用菌落PCR方法鉴定VHH片段的阳性克隆效率(即VHH片段插入率)，其中菌落PCR使用的引物为：MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG(SEQ ID NO：8)；GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG(SEQ ID NO：9)，终浓度均为0.4m M，图4中C幅结果显示VHH片段的阳性克隆率在70％左右，证明获得VHH抗体文库。根据PCR阳性克隆率利用以下公式：库容量＝测定培养皿上克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性克隆率×菌液体积(单位：微升)推算羊驼噬菌体VHH展示文库的库容量为1.2×10⁸。

2.4、在2YT固体培养基上划线接种M13K07辅助噬菌体。挑取相隔良好的噬菌斑进行扩繁，获得滴度为1×10¹²cfu/mL的辅助噬菌体M13K07。用该辅助噬菌体M13K07感染上述步骤2.3获得的VHH抗体文库，过夜培养后上清用PEG/NaCl(20％，2.5M)溶液进行沉淀，无菌PBS悬浮沉淀，分离重组噬菌体颗粒，即为羊驼噬菌体VHH展示文库。

测定羊驼噬菌体VHH展示文库滴度：将获得的重组噬菌体颗粒原液进行按照1：10⁶、1：10⁷、1：10⁸等进行梯度稀释，随后各取1微升感染TG1细胞15分钟，涂布氨苄抗性LB固体培养皿表面，次日观察培养板中菌落形成情况，根据公式(菌落数×稀释倍数×10³)计算噬菌体滴度(pfu)。如图4中D幅所示，左右两幅图分别为1：10000000和1：1000000稀释倍数下的噬菌斑数，因此估算羊驼噬菌体VHH展示文库的滴度可达1.2×10¹³pfu。

实施例3：表达纳米抗体TGF-β1-VHH的阳性克隆株的筛选

3.1：亲和淘选的简化步骤：

(1)用实施例1获得的TGF-β1纯化蛋白包被免疫管，4℃过夜。

(2)PBS洗管3次，拍干。

(3)3％MPBS(3％脱脂牛奶加入PBS中)封闭，37℃孵育2h，倾去封闭液，用PBS洗管3次，拍干。

(4)向封闭好的免疫管加入上述实施例2制备的羊驼噬菌体VHH展示文库(噬菌体文库)，2ml/管，轻摇温育30min后，再静置温育1.5h。

(5)弃管内噬菌体文库，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干。

(6)加入宿主菌TG1对结合噬菌体文库进行洗脱。此即完成第一轮淘筛，获得一级筛选抗体库。

(7)重复上述淘筛步骤4)、5)和6)，进行循环淘筛，最终经过4轮淘筛，即获得四级筛选抗体库。

3.2、间接Phage Elisa初步筛选抗原阳性纳米抗体：

(1)挑取4轮淘筛后涂布在2YTAG平板上长出的单个菌落，接种至72孔培养板中，该板标记为MasterPlate，30℃，振荡培养过夜。

(2)次日，另取72孔培养板，取400μL含辅助M13K07至每孔，此板标为P1Plate。

(3)从过夜培养的MasterPlate上每孔取40μL培养液至P1Plate，37℃振荡培养过夜；1500g离心20min，小心留上清待用，即为重组表达抗体。

(4)用TGF-β1纯化蛋白包被96孔酶标板。

(5)提前将上述重组表达抗体160μL与40μLMPBS混匀，室温孵育20min。加入封闭好的酶标孔中，37℃结合反应2小时。

(6)洗涤及加酶标二抗：将酶标抗M13K07抗体用PBS做1：4000稀释，200μL/孔，37℃孵育反应1小时。

(7)加入200μL/孔TMB显色液，37℃孵育显色45min左右显色及用100μL/孔终止液，终止显色，在405nm处读值。读数大于阴性对照至少2倍视为阳性克隆株。

经间接Phage Elisa初筛，与阴性对照比较，结果如图5中A幅所示，在随机挑选的6株克隆中共筛选得到编号为B3的1株阳性克隆，其可以表达与TGF-β1纯化蛋白高度特异性结合的纳米抗体，命名为纳米抗体TGF-β1-VHH(B3阳性克隆株表达的纳米抗体TGF-β1-VHH命名为B3纳米抗体)。对上述1株阳性克隆表达的纳米抗体TGF-β1-VHH(即VHH区域)进行测序，该株阳性克隆表达的纳米抗体TGF-β1-VHH(即B3纳米抗体)的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：10所示，对应的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：11所示。对该氨基酸序列进行结构分析，如图5中B幅所示，该氨基酸序列长度为110个氨基酸残基，其结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDRl、CDR2和CDR3为互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)；CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR1、FR2、FR3和FR4为骨架区(framework region，FR)。

实施例4：纳米抗体TGF-β1-VHH的原核诱导表达与纯化

该实施例首先利用上述实施例3筛选获得的1株阳性克隆，使用GenElute PlasmidMiniprep Kit按照说明书要求制备重组pMECS噬菌粒。利用该重组pMECS噬菌粒构建纳米抗体TGF-β1-VHH的表达质粒，转入大肠杆菌中进行诱导表达获得B3纳米抗体，具体包括以下步骤：

4.1、将重组pMECS噬菌粒与pGEX6P.1-GST原核表达载体分别经BamH I、EcoR I双酶切后，获得VHH目的片段和pGEX6P.1线性化载体，在T4连接酶存在下进行连接，连接后构建得到pGEX6P.1-VHH原核表达载体。将该pGEX6P.1-VHH原核表达载体转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行表达，筛选获得阳性菌株，命名为B3阳性菌株。

4.2、对B3阳性菌株进行1mM IPTG，22℃的过夜原核诱导，高速离心富集菌体，反复冻融4至6次后超声彻底裂解菌体(工作2s、间歇6s，功率为40％)。随后将相对澄清的裂解液进行12000rpm高速离心，收获上清液，沉淀使用8M尿素复溶，分别得到上清及包涵体中的纳米抗体，使用考马斯亮蓝染色方法和Western blot方法(电泳及抗GST-Western blot)检测纳米抗体表达(CST/鼠源GST单克隆抗体；中杉金桥/山羊抗小鼠二抗)。

结果如图6中A幅和B幅所示，其中A幅表示考马斯亮蓝染色结果，B幅表示Westernblot检测结果，A和B中的Lane1/2均表示B3阳性菌株的上清/包涵体中纳米抗体的检测结果，M表示蛋白分子标准。可见B3纳米抗体与GST融合蛋白(分子量为36kDa)在B3阳性菌株的培养上清和包涵体中均得到了表达，其中上清表达效果更好。

4.3、对B3阳性菌株处理之后的细菌裂解液上清和包涵体复溶液进行GSTrap^TM FF1mL色谱柱纯化，色谱柱由生物相容性聚丙烯制成，赋予其与GST标签阳性蛋白和其他谷胱甘肽结合蛋白的强结合能力。其中，洗脱缓冲液为含10mM还原型谷胱甘肽的Tris-HCl溶液(pH8.0)。使用

Advantage 25纯化仪，上样和洗脱流速分别设定为0.5mL/min和1mL/min。收集纯化后的蛋白样(上清/包涵体)与纯化前的蛋白样(上清/包涵体)进行考马斯亮蓝染色和SDS-PAGE电泳检测。

结果如图6中C幅和D幅所示，其中C幅表示考马斯亮蓝染色结果，D幅表示SDS-PAGE电泳检测结果，在C幅和D幅中，Lane1/2均表示为纯化前上清/包涵体中的纳米抗体检测结果，Lane3/4均表示为纯化后上清/包涵体中的纳米抗体检测结果，M表示蛋白分子标准。可见纯化后上清中表达的纳米抗体得到了有效的富集。

实施例5：纳米抗体TGF-β1-VHH的结合特异性检测

该实施例收集上述实施例4经纯化后上清中的B3纳米抗体，以市售TGF-β1抗体作为对照，检测与天然TGF-β1蛋白的结合特异性。

5.1、Western Blot检测纳米抗体对TGF-β1的结合特异性

在RPMI-1640培养基中扩增培养人肺癌细胞系NCI-H520，用RIPA裂解液充分释放细胞全蛋白，每孔定量10μg上样至预先配制的12％SDS-PAGE胶内。分别用一抗(分别为B3纳米抗体(B3-VHH)、市售兔源TGF-β1单抗(阳性对照))进行孵育，4℃过夜，随后用HRP标记的相应种属来源二抗(Alexa Fluor^R555)(1：2000稀释)进行二抗孵育，室温孵育时间1h，随后放入ECL自显影仪(CLinX公司)中曝光成像。

结果如图7中A幅所示，样本为NCI-H520肿瘤细胞裂解液/10μg，其中Lane1～2分别为实验组B3纳米抗体、阳性对照组市售TGF-β1单抗；M：蛋白分子量标准。显示两者对不同形式的TGF-β1(前体、单体和二聚体)均有较好的结合，市售抗体组非特异性条带较少。

5.2、免疫荧光检测纳米抗体对TGF-β1的结合特异性

制备NCI-H520细胞爬片，37℃，5％CO₂孵箱内过夜贴壁，4％多聚甲醛固定后进行抗原特异性反应：一抗分别为B3纳米抗体(B3-VHH)、市售TGF-β1单抗(阳性对照)，室温孵育4h；其后分别使用同种属荧光二抗(Alexa Fluor^R555)再次进行特异性结合；两组爬片经DAPI染核15min后封片，于Zeiss共聚焦显微镜上采集图像。

结果如图7中B幅所示，其中由上至下一抗分别为阳性对照组市售TGF-β1单抗、实验组B3纳米抗体，显示两者均能够特异性识别NCI-H520细胞表面TGF-β1。

5.3、Fortebio实验检测纳米抗体与TGF-β1蛋白的结合亲和性

Fortebio Octet实验利用生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry)，预装GST传感器与纳米抗体TGF-β1-VHH非共价结合，检测与目标蛋白TGF-β1的相互作用。上样稀释液为含0.02％Tween-20及0.1％BSA的PBST溶液，平衡/固化缓冲液与上样缓冲液保持一致。将TGF-β1纯化蛋白(实施例1获得)由1000nM梯度稀释6个单位，同时设置缓冲液组作为背景扣除。样品板(Greiner PN655209)中分别加入上样缓冲液、固化样品(B3纳米抗体)、结合样品(梯度稀释的TGF-β1纯化蛋白)；程序设置包括固化、结合、解离三个步骤，时间分别为5min、10min、20min。亲和力判断依据如下：KD>10^-8M属于结合能力较弱；10^-9M<KD<10^-8M属于结合能力较强；10^-11M<KD<10^-9M属于结合能力强；KD<10^-11M属于结合能力很强。

结果如图8所示，结果显示B3纳米抗体属于慢结合和慢解离模式，亲和力常数KD(M)为9×10^-9mol/L，属于较强结合。

综上所述，本发明制备获得的抗TGF-β1纳米抗体(B3纳米抗体)具有高特异性识别能力和高亲和力结合能力，能够有效中和肿瘤微环境中自分泌或旁分泌TGF-β1(包含LAP前体(LAP原基和TGF-β1单体以非共价键接合)、TGF-β1单体及二聚体)，弥补传统TGF-β1抗体的固有缺陷，可在抵消肿瘤免疫逃逸、抑制肿瘤的发生发展中发挥重要作用。因此，制备得到的抗TGF-β1纳米抗体可以用于制备肿瘤治疗药物，在该肿瘤治疗药物中还可以包含药学上可接受的载剂，例如细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、化学治疗剂或治疗性核酸的治疗剂等。利用该肿瘤治疗药物可以治疗包括但不限于肺癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、肝癌、胃癌、胶质瘤等肿瘤，并能够促进伤口愈合以及促进组织修复和胚胎发育等。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> 抗人转化生长因子β1的纳米抗体B3及其制备方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccgccct ccgggctgcg gctgctgccg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60

ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120

gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180

agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240

tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300

gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360

tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420

cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480

aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540

tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600

accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660

gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720

accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780

atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840

gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900

gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960

ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020

gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080

ctggagccgc tgcccatcgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140

aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaccggtgc caccatgccg ccctccgggc tg 32

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattct agagtcgcgg ccgcttcagt ggtgatggtg atgatggctg cacttgcag 59

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttatgcttcc ggctcgtatg 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccacagacag ccctcatag 19

<210> 10

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr

20 25 30

Arg Thr Val Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser

35 40 45

Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

65 70 75 80

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Ser Lys Gly Ile Gly

85 90 95

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 11

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagtctgggg gaggcttggc gcaggctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60

ggaagcacct tcagtatcaa taccatgggc tggtaccgca cggttccagg gaagcagcgc 120

gagttggtcg cacttattag tagtggtggt agtacattat atgcagactt cgcgaagggc 180

cgattcacca tctccagaga caacgccaag aacacagtgt atctgcaaat gaacagcctg 240

aaacctgagg acacggccgt ctattactgc cgctcgaagg gcataggtta tgactactgg 300

ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 330

Claims

1.抗人转化生长因子β1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且所述纳米抗体能够特异性识别并结合TGF-β1的三种形式：LAP前体、TGF-β1单体及二聚体。

2.编码权利要求1所述的纳米抗体的氨基酸序列的核苷酸编码序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸编码序列，其特征在于，所述核苷酸编码序列如序列表中SEQ ID NO：11所示或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：11所示的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

4.一种含有权利要求2或3所述的核苷酸编码序列的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为将权利要求2或3所述的核苷酸编码序列插入pGEX6P.1原核表达载体中获得。

6.一种含有权利要求4或5所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。