CN111349159A - 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111349159A
CN111349159A CN202010186768.8A CN202010186768A CN111349159A CN 111349159 A CN111349159 A CN 111349159A CN 202010186768 A CN202010186768 A CN 202010186768A CN 111349159 A CN111349159 A CN 111349159A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hsa
antibody
serum albumin
human serum
plate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010186768.8A
Other languages
English (en)
Inventor
熊盛
谢秋玲
赵辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan Hanteng Biotechnology Co ltd
Jinan University
Original Assignee
Foshan Hanteng Biotechnology Co ltd
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan Hanteng Biotechnology Co ltd, Jinan University filed Critical Foshan Hanteng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010186768.8A priority Critical patent/CN111349159A/zh
Publication of CN111349159A publication Critical patent/CN111349159A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用，所述抗人血清白蛋白的纳米抗体是：抗体NbHSA‑B3或抗体NbHSA‑B5；抗体NbHSA‑B3的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，抗体NbHSA‑B5的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。通过构建噬菌体文库，从中筛选获得HSA的抗体，这个纳米抗体分子量只有传统抗体的1/10，且特异性强，与HSA的结合能力强。通过构建NbHSA与蛋白质/多肽药物的融合蛋白，使纳米与HSA相结合，可以显著增长HSA半衰期和稳定性。

Description

一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用。
背景技术
小分子纳米抗体由于具有分子质量小，体积小，无Fc段等性质，使它们在很多方面的表现优于单克隆抗体，小分子纳米抗体具有免疫原性低、不易产生自身免疫反应、很强的组织渗透性、易于结合隐蔽的抗原表位、可用微生物进行生产且生产成本低等优势。目前纳米抗体可以被应用于治疗性抗体，诊断试剂，CAR的靶头。
蛋白质药物例如胰高血糖素样肽-1(GLP1)作为胰岛素治疗药物，在生物体内半衰期仅1～1.5min，影响其治疗效果。一些生物制品和药物都存在稳定性差的情况，为了增强它们的稳定性，通常会加入一些稳定剂在药物中，而大量的研究表明人血清白蛋白(HSA)具有延长药物半衰期的作用，HSA蛋白内部存在17个二硫键，使得整个蛋白具有很好的稳定性，HSA具有延长半衰期、促进药物透过血脑屏障等优点。有研究将蛋白质药物与HSA相结合的方式，延长蛋白质药物的半衰期。但一方面天然的HSA获得比较困难，通过血液提取得到的很容易受到病原体的污染。另一方面HAS抗体均是单抗，由于单抗其有制备成本高，生产纯化工艺难，渗透性较低和分子量大等缺点，可能会影响所连接的蛋白质的功能，因此，还有改善的空间。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种抗人血清白蛋白的纳米抗体，制备成本较低，通过抽取骆驼外周血构建噬菌体文库，从中筛选获得HSA的抗体，可以在大肠杆菌和酵母中进行表达。这个纳米抗体分子量只有传统抗体的1/10，且特异性强，与HSA的结合能力强。通过构建NbHSA与蛋白质/多肽药物的融合蛋白，使其与HSA相结合，可以显著增长其半衰期和稳定性。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种抗人血清白蛋白的纳米抗体，所述抗人血清白蛋白的纳米抗体是：抗体NbHSA-B3或抗体NbHSA-B5；
所述抗体NbHSA-B3的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述抗体 NbHSA-B5的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
所述抗体NbHSA-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述抗体 NbHSA-B5的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种抗人血清白蛋白的纳米抗体的筛选方法，所述以下步骤：
S1.构建噬菌体纳米抗体文库：收集骆驼科动物的血液，提取血液中淋巴细胞的总RNA并逆转录为DNA，以其作为模板PCR扩增VHH 基因，将VHH基因进行酶切和连接得VHH基因片段，将VHH基因片段克隆至宿主细胞，得噬菌体纳米抗体文库；
S2.筛选人血清白蛋白纳米抗体：稀释、偶联人血清白蛋白，淘洗富集噬菌体纳米抗体文库得单菌落，将单菌落接种于培养基得人血清白蛋白，人血清白蛋白稀释、偶联、洗板、离心，吸去上清，沉淀重悬孵育得阳性转化子；
S3.HSA纳米抗体表达纯化：将步骤S2得到的阳性转化子电转至菌株中涂布于平板上，收集菌体，洗脱杂蛋白，得纯化后的人血清白蛋白纳米抗体B3和纳米抗体B5。
进一步地，所述步骤S1中PCR扩增引物为：F-primer:
5′ -GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′； R-primer-1:5′ -GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′或R-primer-2:5′ -GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3 ′。
进一步地，所述纳米抗体噬菌体文库淘洗包括以下步骤：取制备的纳米抗体噬菌体文库与等体积的2％脱脂奶粉混匀，每孔加入稀释、偶联后的人血清白蛋白37℃孵育1h；每孔加入0.1％PBST溶液洗板 5～15次，每次静置3～10min，进行2～3次淘洗；每孔加入100mM 三乙胺溶液孵育；将上清中解离的噬菌体继续感染TG1菌株，富集噬菌体纳米抗体。
进一步地，所述步骤S2中的单菌落接种于1～3mL/孔2×YT培养基的96孔深孔板。
进一步地，所述步骤S3中的电转为1800V的电压。
进一步地，步骤S2中人血清白蛋白洗板的具体步骤包括：用 0.1％PBST洗板，静置3～5min，加入2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，用 0.1％PBST溶液洗板一次，吸去上清，每孔的沉淀各用TES溶液200 μL重悬，4℃，150rpm，孵育2h。
本发明还提供一种抗人血清白蛋白的纳米抗体在制备延长GLP1 半衰期药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种抗人血清白蛋白的纳米抗体，分子量只有传统抗体的1/10，且特异性强，与人血清白蛋白的结合能力强。
2.本发明提供了通过构建抗人血清白蛋白的纳米抗体与蛋白质 /多肽药物的融合蛋白，使得纳米抗体与人血清白蛋白相结合，可以显著增长人血清白蛋白半衰期和稳定性。
附图说明
图1为纳米抗体噬菌体文库三轮淘洗的菌落图；
图2为纯化特异性NbHSA-B3纳米抗体的电泳图；
图3为纯化特异性NbHSA-B5纳米抗体的电泳图；
图4为纳米抗体NbHSA特异性检测图；
图5为纳米抗体NbHSA-B3和NbHSA-B5亲和力检测图；
图6为NbHSA-B3-GLP1融合蛋白的表达纯化的电泳图；
图7为NbHSA-B3-GLP1蛋白、NbHSA-B5-GLP1蛋白与HSA结合数量图。
图8为NbHSA-GLP1的药动学分析示意图。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J·萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述制剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、噬菌体纳米抗体文库的制备
(1)取两只双峰驼的血液，每只取100mL，将收集的血液与等体积的生理盐去离子水混匀，将稀释后的血液缓慢加入到淋巴细胞分离液的表面，室温2000rpm离心20min。吸取第二层的淋巴细胞，加入五倍体积的PBS，室温2000rpm离心20min，重复三次。将收集下来的淋巴细胞加入1mL的Trizol(购于Invitrogen，15596026)试剂，重复混匀，于12000rpm、4℃离心15min。再向离心后上清中加入0.2mL 的氯仿，充分混匀后静置3min，于12000rpm、4℃离心15min。吸取最上层去离子水相与等体积的异丙醇混匀，静置10min，于 12000rpm、4℃离心10min。去上清，再加入1mL预冷的75％乙醇，洗涤沉淀，于12000rpm、4℃离心10min。再加入100μL的DEPC去离子水溶解，收集淋巴细胞总RNA，用紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度，并于1％琼脂糖凝胶中电泳检测，120V恒压电泳15min，检测总RNA的完整性；
(2)使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(购于 NEB,E6550S)反转录试剂盒进行实验，加入步骤(1)提取的血液中淋巴细胞的总RNA 1μg，上述合成的正反链引物2μL、加去离子水5μL 混合，在70℃孵育5min，然后再加入AMV Reaction Mix10μL、AMV EnzymeMix2μL，42℃孵育1h，然后80℃加热5min失活AMV Reaction Mix和AMV Enzyme Mix；
(3)利用KAPA HiFiHotStartReadyMix PCR Kit(购于KAPA，KK2611) 通过PCR的方法扩增目的基因，根据合成的目的基因设计引物12μL (F-primer:5′ -GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′； R-primer-1:5′ -GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′或 R-primer-2:5′ -GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3) 用于扩增VHH基因，将扩增的PCR产物纯化回收；
(4)先将10×buffer5μL、pComb-3X载体(购于Allele Biotechnology andPharmaceuticals)1μg、步骤(3)PCR纯化产物 1μg、加去离子水混合放入37℃去离子水浴锅去离子水浴1h，然后加入SfiⅠ(购于Takara，1244A)内切酶1μL，加去离子水至50 μL，将酶切后获得的VHH基因片段使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收VHH基因片段；
(5)用T4 DNA Ligase对pComb-3X载体和步骤(4)VHH基因片段进行连接，反应体系条件(10×T4 DNA Ligase buffer 2μL；T4 DNA Ligase 1μL；pComb-3X 50ng；VHH基因37.5ng；add water to 20 μL)混合，在16℃过夜连接；
(6)将0.2μL的上述步骤(5)得到的连接产物与90μL TG1感受态菌液中，混匀加入电转杯，1900V电转5ms后，加入1mL SOC培养基(购于Sangon Biotech，A507009)，37℃摇床中，250rpm培养 1h。再加入10mL SOC培养基，继续培养1h。向其中加入2mL VCSM13 辅助噬菌体(购于Biovector)的同时，加入含终浓度为10μg/mL 氨苄青霉素(Amp，购于SangonBiotech，A610028)抗性的200mL SOC 培养基，继续培养2h。之后加入终浓度为10μg/mL卡那霉素(Kana，购于Sangon Biotech，A600286)培养过夜；
(7)将上述培养过夜的TG1菌液于4℃，3000g离心15min。将离心后的上清和PEG6000(购于Biosharp，BY0027)/NaCl(购于 Macklin，S805275)溶液以6：1的比例混匀，冰上静置30min。2200 ×g离心30min，沉淀再用2mL PBS溶液重悬。再4℃，13200rpm离心5min。再用0.22μm滤膜(购于Merck Millipore，SLGP033RB) 过滤上清得纳米抗体噬菌体文库；
实施例2、纳米抗体噬菌体文库淘洗
(1)用NaHCO3包被液(购于Sigma，s6297)稀释人血清白蛋白HSA 蛋白(购自Sigma，70024-90-7)，每孔20μg偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置阴性对照。
(2)次日，吸取酶标板中未偶联的人血清白蛋白HSA蛋白，再加入 0.1％PBST 300μL，静置3min(洗板一次)，再向酶标板中加入含2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，再用0.1％PBST溶液300μL洗板一次，静置3min。
(3)取300L实施例1制备的纳米抗体噬菌体文库于等体积的2％脱脂奶粉混匀，每孔加入100L的上述混合液，37℃孵育1h。
每孔加入0.1％PBST溶液300L洗板5至15次，每次静置3min (根据淘洗轮数的递增，洗板次数也相应递增，最后一次淘洗，偶联抗原的浓度减半)，进行三轮淘洗实验。
(4)每孔加入100mM三乙胺(TES，购于aladdin)溶液100L，放置于室温孵育10min。将上清中解离的噬菌体继续感染TG1菌株，在多轮淘洗的过程中不断富集，以便筛选出特异性好、亲和力高的纳米抗体序列，图1显示三轮淘洗的菌落图。
实施例3、噬菌体纳米抗体文库筛选HSA纳米抗体
(1)随机挑选淘洗的最后一轮平板上的不同单菌落接种含1mL/孔2 ×YT培养基(购于Sangon Biotech，A507016)的96孔深孔板(购于NUNC，95040452)中，并在平板上做好标记。37℃，150rpm培养 3h，之后加入1mM IPTG(购于Solarbio，I8070)，28℃、150rpm 过夜诱导。
(2)用NaHCO3包被液稀释HSA蛋白，以100ngHSA蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置相应的阴性对照。
(3)次日，用0.1％PBST洗板，静置3min，再向酶标板中加入2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，用0.1％PBST溶液洗板一次，同时将过夜诱导的深孔板于4℃，4000rpm，离心30min。吸去上清，每孔的沉淀各用 TES溶液200μL重悬，4℃，150rpm，孵育2h。
(4)继续向每孔加入TES/4溶液300μL，放置于4℃，150rpm孵育2h。再将深孔板放置于4℃，4000rpm，离心30min。将上述上清以 100μL分别加入到相应的含有目的蛋白的孔中以及阴性对照孔中， 37℃孵育1h。
(5)每孔加入0.1％PBST溶液300L洗板，洗板三次，每次静置3min，去掉未结合的抗体，每孔加入100L1：5000稀释的anti-HA-HRP(购于GNI，GNI4310-HA-S)，37℃孵育1h。
(6)每孔加入0.1％PBST溶液300L洗板，洗板三次，每次静置3min，以去掉未结合的抗体，每孔再加入TMB100L(购于湖州英创，TMB-S-004) 显色剂，37℃避光孵育10min，每孔再加入2.29％硫酸100L(购于广州化学试剂厂)终止反应。
(7)用酶标仪测OD450nm波长处的值，抗原孔是空白孔吸光值的两倍，则视为阳性。
(8)阳性转化子接种到LB培养基10mL(购于Sangon Biotech， A507002)中，37℃，150rpm培养8h，收集菌液并送测序(Sangon Biotech)。筛选有两株为阳性克隆，该阳性菌经测序，其氨基酸序列如下序列表所示，该纳米抗体命名为NbHSA-B3和NbHSA-B5。NbHSA-B3和NbHSA-B5的DNA序列和氨基酸序列见序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
实施例4、纳米抗体NbHSA的表达纯化
(1)将实施例3得到的阳性转化子以1800V的电压电转至WK6(购于BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)菌株中，涂布在Amp抗性的LB平板上，过夜培养，第二天，挑取平板上的单菌落接种到10mL含有Amp抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养8h。
(2)将上述菌液接种到330mL含有Amp抗性的TB培养基(购于 ELITE-MEDIA，M201-02)中，37℃，220rpm培养至OD＝0.7-0.8。再加入终浓度为1mMIPTG，28℃、220rpm诱导过夜。
(3)第二天，收集菌体，PBS重悬再离心。最后用菌体质量比TES 溶液体积比1：10的比列重悬菌体，利用渗透压法破碎菌体。10000rpm 离心30min，收集上清提取物。再用0.45m滤膜进行过滤除菌体碎片。
(4)使用AKTA纯化仪(购于GE)进行镍柱亲和层析，首先，用流速为1mL/min的PBS溶液对镍柱(购于GE，10230759)进行平衡，直到UV280值保持不变，再以1mL/min的流速上样，再用流速为 1mL/min的PBS溶液对镍柱进行平衡，直到UV280值保持不变，分别用20mM、100mM、150mM、200mM、250mM和500mM咪唑以1mL/min的流速的对杂蛋白以及目的蛋白进行洗脱。
(5)使用预制胶(购于invitrogen，EC6025BOX)进行电泳，取制备好的样品20L加入到预制胶中，80V电压30min使样品电泳至分离胶，然后120V电压电泳直到指示剂到底部停止电泳。将胶浸泡在考马斯亮兰溶液(购于Solarbio，P1305)中1h，再用脱色液脱色(购于Solarbio，P1305)直到可以看到清晰的蛋白条带，最终获得纯化后的纳米抗体B3、B5。图4为表达纯化特异性HSA纳米抗体。最终获得纯化后的纳米抗体NbHSA，经Image J软件分析，其纯度为均为 95％，图2为表达纯化特异性NbHSA-B3纳米抗体，图3为表达纯化特异性NbHSA-B5纳米抗体。
实施例5、纳米抗体NbHSA特异性检测
(1)将人血清白蛋白，大鼠血清白蛋白(购自Equitech-Bio， RTSA-0050)，小鼠血清白蛋白(购自Equitech-Bio，MSA-1000)， BSA(购自SIGMA，A7030-100G)稀释为1μg/mL溶液，加入酶标板中，100ng/孔，4℃孵育过夜。同时设置对照。
(2)用0.1％PBST300μL洗板，洗板一次，静置3min，每孔再加入5％脱脂奶粉300μL，37℃封闭1h。
(3)用0.1％PBST300μL洗板，洗板一次，静置3min，将阳性对照anti-his mAb(购于Abmart，M30111)、空白对照PBS以及实验组纳米抗体NbHSA加入到酶标板，每孔100μL，100ng/孔，37℃孵育1h。
(4)每孔加入0.1％PBST溶液300μL洗板，洗板三次，每次静置 3min，去掉未结合的抗体，再向每孔加入100μL 1：5000稀释的Mouse anti-HA mAb，37℃孵育1h。
(5)每孔加入0.1％PBST溶液300μL洗板，洗板三次，每次静置 3min，去掉未结合的抗体，再向每孔加入100μL1：5000稀释的HRP- Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(购于proteintech，SA00001-1)，37℃孵育1h。
(6)每孔加入0.1％PBST溶液300μL洗板，洗板五次，每次静置3min，每孔100μL的TMB溶液加入到酶标板中，37℃避光孵育 10min。
(7)再向酶标板中每孔加入2.29％硫酸100μL终止反应，用酶标仪在450nm和630nm处测量OD值，计算OD450-OD630的差值即为所得的OD值。通过特异性检测发现，发现NbHSA与商业化HSA抗体均能够与HSA特异性结合，但NbHSA还能够与大鼠和小鼠的HSA特异性结合，参考图4。
实施例6、NbHSA纳米抗体亲和力检测
(1)用NaHCO3包被液稀释HSA蛋白，以100ngHSA蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置相应的阴性对照。
(2)用300μL 0.1％PBST洗板，洗板一次，静置3min，每孔再加入300μL 5％脱脂奶粉，37℃封闭2h。
(3)用300μL 0.1％PBST洗板，洗板一次，静置3min，将纯化的纳米抗体NbHSA以起始浓度40μg/mL，以1:2的比列倍比稀释8个浓度梯度，以100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h。
(4)后续步骤与参照实施例5。
图5为NbHSA亲和常数分析，图A指代为NbHSA-B3，图B指代为NbHSA-B5，根据计算所得，两个NbHSA的亲和常数分别为(1.94±1.82)× 107L/mol和(1.83±1.54)×107L/mol，均有较好的亲和力。
实施例7、NbHSA-B3延长蛋白质体内半衰期测试
选择GLP-1蛋白和NbHSA-B3构建NbHSA-GLP1融合蛋白，验证NbHSA-B3延长蛋白质体内半衰期的功能。
(1)pCDNA3.4-NbHSA-GLP1重组质粒的构建：使用pCDNA3.4 (Invitrogen公司)构建重组pCDNA3.4-NbHSA-GLP1。
GLP1序列如下：
5′-AAGGAACCTTTACCAGCGACGTGTCTAGCTACCTGGAGGGACAGGCCGCCAAA GAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGCAGGGGATAG-3′；
采用重叠PCR方法构建pCDNA3.4-NbHSA-GLP1重组质粒，第一步利用下列primerF1、primerR1合成NbHSA、primerF2和primerR2合成 GLP1(含有His Tag)片段。
primerF1:5′-GGATCATGCAGGTGCAGCTGCA-3′
primerF2:5′-GTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGAAGC-3′
primerR1:5′ -TCCTTCGGCGTGGCTTCCTCCTCCTCCGCTAGACACTGTCACCTGGGT-3′
primerR2:5′-CCTAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCCCCTGCCCTTCAC-3′
反应体系如下：
PRIMERSTAR MAX DNA POLYMERASE(R045A)25μL；primerF1或 primerF2 2μL；primerR1或primerR2 2μL；NbHSA或GLP1 Template 10ng；加去离子水至50μL；反应程序参考实施例1的步骤(3)，其中第4中72℃1min变成72℃15s；
第一步中PCR产物分别为NbHSA Template和GLP1 Template 接着反应，反应体系如下：PRIMERSTAR MAX DNA POLYMERASE(R045A) 25μL；primerF1 2μL；primerR2 2μL；NbHSA Template 25ng； GLP1 Template 25ng；加去离子水至50μL，反应程序步骤同实施例1的步骤(3)一样；
(2)使用限制性内切酶ECORⅠ(购于Takara，D1040A)和Xhol Ⅰ(购于Takara，D1094A)双酶切酶切pCDNA3.4载体以及上述两个NbHSA-GLP1基因，反应体系和条件同实施例1的步骤(4)一样；
(3)用T4 DNA Ligase对双酶切后pCDNA3.4载体和NbHSA-GLP1 基因进行连接。反应体系条件同实施例1的步骤(5)一样；
(4)将上述连接产物10μL加入90μL DH5α感受态菌液(购于 Takara，9057)中，冰上孵育40min后，42℃热激90s，之后再放于冰上5min。加入再加入SOC培养基10mL，37℃摇床中，220rpm培养 1h。吸取200μL上述菌液，涂布在含有Amp抗性的LB固体平板上。过夜培养。随机挑起单菌落并送测序(Sangon Biotech测序)；
(5)将上述测序正确的单菌落接种至400mL含有Amp抗性的LB 培养基中，37℃摇床中，220rpm培养1h，离心收集菌体。使用 NucleoBondXtra Maxi(购于基因生物技术国际贸易(上海)有限公司，740414.50)试剂盒提取质粒。使用RES溶液15mL重悬菌体，再加入LYS溶液15mL，缓慢震荡裂解菌体(不超过5min)，再加入NEU 溶液15mL终止裂解，10000rpm离心10min去蛋白，同时用EQU溶液 25mL平衡DNA结合内外柱，将离心后上清滴加到DNA柱中，用WASH 溶液25mL洗内外柱，然后去内柱，再用WASH溶液25mL洗DNA结合外柱，接着ELU溶液15mL洗脱DNA，用新的离心管收集。同时加入异丙醇溶液10.5mL，混匀。4℃、10000rpm离心30min后去上清，用 70％乙醇溶液洗涤一次。4℃、10000rpm离心30min后去上清，收集的DNA在超净工作台中吹干，最后加去离子水溶解DNA并测浓度；
(6)293F细胞瞬时转染表达NbHSA-GLP1：将 pCDNA3.4-NbHSA-GLP1重组质粒分别和和聚乙烯亚胺(PEI，购于polysciences，64738)以质量比为1:5的比列混匀，分别取200μg重组质粒和1000g PEI用5mL无血清RPMI1640培养基(购于Gibco， 2053126)稀释，轻轻吹打，然后将稀释的质粒和PEI混合均匀，同时取4×108个293F细胞(购于北纳创联，BNCC102036)到50mL tubespin管(购于SIGMA，Z761036-26EA)中，800rpm离心5min，去上清再用25mL无血清RPMI1640培养基重悬细胞并转移到125mL三角摇瓶中，将质粒和PEI混合缓慢的滴加到293F细胞中，37℃、5％CO2、 150rpm环境下培养，4h后，补加293F无血清培养基(购于Sigma， 14571C)到200mL，继续培养到细胞活率降到70％，800rpm离心收集细胞上清，再用0.45m滤膜过滤，收集上清；
(7)收集细胞上清，使用AKTA纯化仪(购于GE)进行镍柱亲和层析，首先，用流速为1mL/min的PBS溶液对镍柱(购于GE， 10230759)进行平衡，直到UV280值保持不变，再以1mL/min的流速上样，再用流速为1mL/min的PBS溶液对镍柱进行平衡，直到UV280 值保持不变，分别用20mM、100mM、150mM、200mM、250mM和500mM 咪唑以1mL/min的流速的对杂蛋白以及目的蛋白进行洗脱。之后用电泳检测。电泳方法同实施例4.
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗人血清白蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述抗人血清白蛋白的纳米抗体是：抗体NbHSA-B3或抗体NbHSA-B5；
所述抗体NbHSA-B3的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述抗体NbHSA-B5的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述抗体NbHSA-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述抗体NbHSA-B5的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，所述以下步骤：
S1.构建噬菌体纳米抗体文库：收集骆驼科动物的血液，提取血液中淋巴细胞的总RNA并逆转录为DNA，以其作为模板PCR扩增VHH基因，将VHH基因进行酶切和连接得VHH基因片段，将VHH基因片段克隆至宿主细胞，得噬菌体纳米抗体文库；
S2.筛选人血清白蛋白纳米抗体：稀释、偶联人血清白蛋白，淘洗富集噬菌体纳米抗体文库得单菌落，将单菌落接种于培养基得人血清白蛋白，人血清白蛋白稀释、偶联、洗板、离心，吸去上清，沉淀重悬孵育得阳性转化子；
S3.HSA纳米抗体表达纯化：将步骤S2得到的阳性转化子电转至菌株中涂布于平板上，收集菌体，洗脱杂蛋白，得纯化后的人血清白蛋白NbHSA-B3和NbHSA-B5。
4.根据权利要求3所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中PCR扩增引物为：
F-primer:5′-GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′；
R-primer-1:5′-GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′或R-primer-2:5′-GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3′。
5.根据权利要求3所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，所述纳米抗体噬菌体文库淘洗包括以下步骤：取制备的纳米抗体噬菌体文库与等体积的2％脱脂奶粉混匀，每孔加入稀释、偶联后的人血清白蛋白37℃孵育1h；每孔加入0.1％PBST溶液洗板5～15次，每次静置3～10min，进行2～3次淘洗；每孔加入100mM三乙胺溶液孵育；将上清中解离的噬菌体继续感染TG1菌株，富集噬菌体纳米抗体。
6.根据权利要求3所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中的单菌落接种于1～3mL/孔2×YT培养基的96孔深孔板。
7.根据权利要求3所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，所述步骤S3中的电转为1800V的电压。
8.根据权利要求3所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，步骤S2中人血清白蛋白洗板的具体步骤包括：用0.1％PBST洗板，静置3～5min，加入2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，用0.1％PBST溶液洗板一次，吸去上清，每孔的沉淀各用TES溶液200μL重悬，4℃，150rpm，孵育2h。
9.根据权利要求1所述的抗人血清白蛋白的纳米抗体在制备延长GLP1半衰期药物中的应用。
CN202010186768.8A 2020-03-17 2020-03-17 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用 Pending CN111349159A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010186768.8A CN111349159A (zh) 2020-03-17 2020-03-17 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010186768.8A CN111349159A (zh) 2020-03-17 2020-03-17 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111349159A true CN111349159A (zh) 2020-06-30

Family

ID=71191452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010186768.8A Pending CN111349159A (zh) 2020-03-17 2020-03-17 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111349159A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022206900A1 (zh) * 2021-04-01 2022-10-06 江苏先声药业有限公司 抗人血清白蛋白(hsa)的纳米抗体及其应用
CN116355092A (zh) * 2023-05-19 2023-06-30 广州明药科技有限公司 抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用
CN117088975A (zh) * 2022-05-11 2023-11-21 东莞市朋志生物科技有限公司 抗白蛋白抗体、检测白蛋白的试剂和试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010077422A2 (en) * 2008-10-29 2010-07-08 Wyeth Llc Formulations of single domain antigen binding molecules
CN104233474A (zh) * 2014-09-17 2014-12-24 东南大学 一种合成的噬菌体展示纳米抗体文库及其应用
CN104404630A (zh) * 2014-12-11 2015-03-11 东南大学 一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库、构建方法及用途
CN105646643A (zh) * 2008-10-29 2016-06-08 阿布林克斯公司 单域抗原结合性分子的纯化方法
CN107365732A (zh) * 2017-04-28 2017-11-21 天津丽迪森生物科技有限公司 一种抗TNF‑α纳米抗体及其基因工程表达
CN109678962A (zh) * 2019-01-22 2019-04-26 山西农业大学 一种Cdk5纳米抗体和筛选方法
CN109762835A (zh) * 2018-09-21 2019-05-17 宁夏大学 驼源纳米抗体基因库的构建方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010077422A2 (en) * 2008-10-29 2010-07-08 Wyeth Llc Formulations of single domain antigen binding molecules
CN105646643A (zh) * 2008-10-29 2016-06-08 阿布林克斯公司 单域抗原结合性分子的纯化方法
CN104233474A (zh) * 2014-09-17 2014-12-24 东南大学 一种合成的噬菌体展示纳米抗体文库及其应用
CN104404630A (zh) * 2014-12-11 2015-03-11 东南大学 一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库、构建方法及用途
CN107365732A (zh) * 2017-04-28 2017-11-21 天津丽迪森生物科技有限公司 一种抗TNF‑α纳米抗体及其基因工程表达
CN109762835A (zh) * 2018-09-21 2019-05-17 宁夏大学 驼源纳米抗体基因库的构建方法
CN109678962A (zh) * 2019-01-22 2019-04-26 山西农业大学 一种Cdk5纳米抗体和筛选方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022206900A1 (zh) * 2021-04-01 2022-10-06 江苏先声药业有限公司 抗人血清白蛋白(hsa)的纳米抗体及其应用
CN117088975A (zh) * 2022-05-11 2023-11-21 东莞市朋志生物科技有限公司 抗白蛋白抗体、检测白蛋白的试剂和试剂盒
CN116355092A (zh) * 2023-05-19 2023-06-30 广州明药科技有限公司 抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用
CN116355092B (zh) * 2023-05-19 2023-07-21 广州明药科技有限公司 抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113150136B (zh) 新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的制备
KR101732552B1 (ko) 안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용
CN111349159A (zh) 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用
CN110590952B (zh) 一种抗ca125糖类抗原的高亲和力纳米抗体及其应用
CN113121692B (zh) 结合人rage胞外域的羊驼源抗体
CN111171151B (zh) 抗egfr纳米抗体及其应用
CN114835810B (zh) 一种抗pd-1纳米抗体及其应用
CN110423277B (zh) Pd-1的纳米抗体及其临床应用
CN112500479B (zh) 一种犬ⅱ型腺病毒重组蛋白单克隆抗体的制备
CN112521497B (zh) 肌红蛋白单克隆抗体的制备和应用
CN111606994A (zh) 非融合型抗桥粒芯糖蛋白dsg3兔源单克隆抗体的制备方法
CN114213543B (zh) 抗犬胰脂肪酶特异性单链抗体、质粒载体及方法
CN106928358B (zh) 一种CD105纳米抗体Nb168
CN106928355B (zh) 一种CD105纳米抗体Nb184
CN109762065B (zh) 针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72
CN112250765A (zh) 一种针对her2的纳米抗体及其应用
CN113461816A (zh) 一种针对绿色荧光蛋白gfp的纳米抗体及其应用
CN106928359B (zh) 一种CD105纳米抗体Nb59
CN106928360B (zh) 一种CD105纳米抗体Nb68
CN111153997A (zh) 抗ctla-4纳米抗体及其在肿瘤治疗中的应用
CN106928364B (zh) 一种FAP纳米抗体Nb26
CN114369163B (zh) 与人血小板衍生生长因子受体β结合的羊驼源纳米抗体
CN113912729B (zh) 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用
CN113201069B (zh) mcherry或mEOS纳米抗体及其制备方法和应用
CN109762063B (zh) 针对河流弧菌的单域重链抗体Nb75

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination