CN107365732A

CN107365732A - 一种抗TNF‑α纳米抗体及其基因工程表达

Info

Publication number: CN107365732A
Application number: CN201710293926.8A
Authority: CN
Inventors: 罗学刚; 李潜; 苗峙; 赵涧; 张同存
Original assignee: Tianjin Lidison Biological Technology Co Ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin Lidison Biological Technology Co Ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2017-11-21

Abstract

本发明将来源于骆驼的抗TNF‑α与抗人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，形成具有更强生物学活性的抗TNF‑α纳米抗体(TNF60)，将其编码基因连接到大肠杆菌表达质粒中，构建获得了TNF60的原核表达质粒，转化大肠杆菌后，筛选得到了TNF60的两种基因工程表达菌，通过响应面法优化确定TNF60的最佳表达条件，利用固相亲和层析建立纯度工艺，所获得的目的蛋白纯度可达到95％，经质谱、免疫印迹(Western blot)、小鼠足肿胀炎症模型实验等方法分析显示重组TNF60蛋白序列正确且具有良好的抗原结合及体内抗炎活性。本发明的抗体可用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等疾病的治疗。

Description

一种抗TNF-α纳米抗体及其基因工程表达

技术领域

本发明属于生物医药领域，是一种抗TNF-α纳米抗体及其基因工程表达。

背景技术

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)是一种多功能细胞因子，参与细胞的凋亡和存活、炎症反应、免疫反应等重要的生理过程，在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、克罗恩病(Crohn’s disease)和银屑病(psoriatic)等疾病的发生发展中扮演重要角色。因此，TNFα被视为是治疗上述相关疾病的十分重要的药物研发靶点。英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)等便是治疗性抗TNFα抗体，在治疗RA等疾病上表现出显著疗效和安全性，均已成为全球最畅销的重磅药物之一，而且其他治疗性抗TNFα抗体的研究与开发也依然炙手可热。

20世纪90年代早期，Hamers研究小组发现驼科生物能同时加工两种不同类型的免疫球蛋白，一种是含有两个结构域的轻链和四个结构域的重链组成的经典抗体，另一种则是一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。

发明内容

将来源于骆驼的抗TNF-α与抗人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，形成具有更强生物学活性的抗TNF-α纳米抗体(TNF60)。将TNF60的编码基因连接到大肠杆菌表达质粒中，构建获得TNF60的原核表达质粒，转化大肠杆菌中，筛选得到TNF60的基因工程表达菌，通过响应面法优化确定TNF60的最佳培养及表达条件，建立纯化工艺，能到高纯度的TNF60的重组蛋白。

本发明的技术方案如下：

一种抗TNF-α纳米抗体及其基因工程表达，其特征在于：将来源于骆驼的抗TNF-α与抗人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，形成具有更强生物学活性的抗TNF-α纳米抗体(TNF60)。构建获得TNF60的原核表达质粒，转化宿主菌株中，筛选得到TNF60的两种基因工程表达菌。

一种抗TNF-α纳米抗体及其基因工程表达，其特征在于：构建方法如下：

(1)合成TNF60核酸编码序列，将TNF60的编码基因连接到大肠杆菌表达质粒中，构建获得TNF60的原核表达质粒。

(2)将TNF60的原核表达质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中，筛选得到TNF60的两种基因工程表达菌

(3)通过响应面法优化确定TNF60的最佳培养条件为：SB培养基，0.1mM IPTG，培养温度为22℃，诱导后培养时间为14h。经过固相Co²⁺亲和纯化之后得到纯度为95％的TNF60重组蛋白。

一种如权利要求1所述的一种抗TNF-α纳米抗体及其基因工程表达与生物医药领域中的应用。

本发明的有益效果和优点是：

1、设计了一种抗TNF-α纳米抗体。

2、成功构建了纳米抗体TNF60的2个大肠杆菌表达体系，可分别定位于周质空间和胞质空间。

3、优化了重组TNF60纳米抗体在大肠杆菌中的培养条件为：0.1mM IPTG，培养14小时，培养温度为22℃，表达产量为20mg/L。经亲和纯化后得到的目的蛋白的纯度为95％。

附图说明

图1为本发明构建的pET22-tnf60和pET28-tnf60两种表达质粒。分别随机挑取了pET22-tnf60转化平皿中的10个转化子和pET28-tnf60转化平皿中的30个转化子进行PCR验证，并以转化子附近空白琼脂做阴性对照的模板，结果30个转化子均扩增出了同目的条带大小一致的片段，而阴性没有改片段(图1a)。进一步，选取PCR验证的5个pET22-tnf60的转化子和5个pET28-tnf60的转化子进行培养和质粒提取，然后用EcoRI和EcoRV两种限制酶做限制性图谱分析，结果显示来自10转化子的质粒均切出了属于阳性克隆的目标条带。最后，我们没类转化子中选取三个进行DNA测序，结果显示序列与目标序列一致(图1b图)。

图2为本发明TNF60的表达验证。由于我们的序列没有按照大肠杆菌密码子的偏好进行优化，所以我们用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为TNF60的表达宿主。把构建好的质粒pET22-tnf60和pET28-tnf60转化到Rosetta(DE3)后，我们对其分别进行了诱导培养，并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目标蛋白的表达。结果显示两种质粒在其表达宿主中均成功表达(图2a、图2b)。

图3为本发明TNF60蛋白序列的验证。为了进一步确定序列的正确性，我们进行了质谱鉴定。通过固相金属亲和纯化与SDS-PAGE获得目标序列的单一条带。然后，将该条带切下送至国际生物医药联合研究院分析测试中心(中国.天津)进行蛋白质谱分析。结果共检测出六条与目标序列相匹配的肽段，覆盖率达64％)，基本证明所检测的蛋白即为目标蛋白。

图4为本发明TNF60蛋白的纯化与定量。由于TNF60的N端带有His tag，所以我们通过固相Co²⁺亲和层析纯化。通过漂洗条件优化，最终确定漂洗液中的咪唑最佳浓度为70mM(图4a)，我们将收集到的洗脱峰用超滤管进行了缓冲液置换和浓缩，并进行SDS-PAGE电泳，检测到其纯度为95％，通过Bradford与BCA试剂盒定量确定浓缩后的蛋白浓度为10mg/mL(图4b、图4c、图4d)。

图5为本发明培养基的优化。我们选取了9种大肠杆菌培养基培养TNF60表达宿主菌，以选取相对最适培养基。在9种培养基中接种相同的初始菌液，然后在相同条件下培养。然后，收集1mL各培养液中的菌体进行裂解和SDS-PAGE。结果显示M9中几乎检测不到TNF60的存在(图5a)，因此后续数据处理将之舍弃。数据处理时，我们以最常用大肠杆菌培养基(即High-salt LB)中所得到TNF60的绝对表达量和单位菌体的相对表达量为参考，其余个培养基中所得到的两种结果将分别除以High-salt LB中所得到的相应结果。结果显示SB培养基在两项指标比较中均是最优的(图5b、图5c)，所以在接下来培养条件的优化中我们使用SB培养基

图6为本发明培养条件的优化。诱导剂的浓度、诱导后的培养时间和培养温度是外源基因在大肠杆菌中表达的三个重要因素。我们选取这三个对TNF60的表达进行优化，其中温度图6a、时间图6b、温度图6c。首先采用专业的设计软件Design-Expert 8.5进行了三因素、三水平实的验设计。然后，按软件给出的方案对TNF60进行了表达。接着每瓶取样5mL做超声破碎和蛋白纯化。将纯化后的样品进行了SDS-PAGE分析，通过标品的灰度分析比较计算出了每组样品中目标蛋白的浓度，并换算成每升摇瓶发酵的产量。最后将计算的结果带入软件Design-Expert 8.5进行响应面分析。软件给出的最佳培养条件为IPTG的浓度为0.1mM，诱导后培养时间14小时，培养温度22℃，TNF60最优产量为19.2mg/L。这个结果与我们最后验证的TNF60产量20.2mg/L相近，说明响应面回归正确。

图7为本发明TNF60活性检测。首先，我们通过免疫印迹实验检测了在体外TNF60与人TNFα的结合活性；然后，通过λ卡拉胶致小鼠足踝肿胀检测在体内TNF60与小鼠TNFα的拮抗活性。

免疫印迹时我们通过SDS-PAGE在三条泳道中展开了人TNFα。接下来，我们将这三条蛋白条带转移到NC膜上。之后将膜上的三条带裁剪开来，分别处理：条带1.封闭后与anti-His tag一抗孵育，后与二抗孵育；条带2.封闭后与TNF60孵育，接着同anti-His tag一抗孵育，最后与二抗孵育；条带3.用盐酸胍梯度漂洗(这样做能够蛋白在膜上再折叠，是的肽链线性远离的氨基酸在三维空间中彼此靠近，以防止抗原表位在SDS-PAGE电泳时遭到破坏)，盐酸胍浓度从6M降低至0M，每次降低一半的浓度，直至降低到0.5以下，改用PBS漂洗，后封闭，接着与TNF60孵育，然后同anti-His tag一抗孵育，最后与二抗孵育。最后，将三条处理好的膜同时进行红外扫描。结果显示条带1无显色条带，条带2和3均有显色条带(图7a)，说明在体外TNF60与人TNFα能发生结合。

在进行动物实验时，我们腹腔给药与腿部给药两种方式。第1组(pbs+pbs)：小鼠腹腔注射无菌pbs 200μL，半小时后后右腿注射无菌pbs 25μL；第2组(pbs+pbs)：小鼠腹腔注射无菌pbs200μL，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μL；第3组(pbs+pbs)：小鼠腹腔注射无菌低剂量的TNF60(5mg/mL)200μL，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μL；第4组(pbs+pbs)：小鼠腹腔注射无菌高剂量的TNF60(10mg/mL)200μL，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μL；第5组(pbs+pbs)：小鼠腹腔注射无菌阿司匹林溶液(ASP，120mg/mL)50μL，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μL。各组给药后每隔1小时测量一次腿部肿胀部位的直径，然后处理实验结果最终得到相应的统计表与统计图(图7b、图7c)。结果表明TNF60能够在体内拮抗小鼠TNFα的活性。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明提供一种抗TNF-α纳米抗体及其基因工程表达与应用，具体内容包括：

将来源于骆驼的抗TNF-α与抗人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，形成具有更强生物学活性的抗TNF-α纳米抗体(TNF60)。将TNF60的编码基因连接到pET-22b和pET-28a质粒中，构建获得TNF60的原核表达质粒，转化大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)Rosetta(DE3)中，筛选得到TNF60的两种基因工程表达菌通过响应面法优化确定TNF60的最佳培养条件，能到高纯度的TNF60的重组蛋白。

一、设计并构建抗TNFα纳米抗体及其基因工程表达菌，步骤如下：

1.TNF60核酸编码序列的获得

(1)将来源于骆驼的抗TNF-α与抗人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，获得具有更强生物学活性的抗TNF-α纳米抗体(TNF60)序列；

(2)将获得的序列按照标准氨基酸密码子表^[54]翻译成核苷酸序列；

(3)合成TNF60的编码核苷酸序列。

2.引物的合成

为了课题需要，共须设计合成4条引物，见下表：

3.TNF60原核表达载体的构建

为了构建TNF60原核表达质粒pET22-tnf60和pET28-tnf60，我们先合成了所须的引物，分别命名Primer EC01、Primer EC02、Primer EC03和Primer EC04，其中Primer EC01和Primer EC04含有同源序列Xa。

(1)以质粒pET28a为模板，通过引物Primer EC03和Primer EC04扩增出片段PT7-Xa；反应体系如下：

PCR反应体系

PCR反应条件

(2)以合成的tnf60核苷酸序列为模板，通过引物Primer EC01和Primer EC02扩增出片段Xa-tnf60；

(3)以片段PT7-Xa和Xa-tnf60为共同模板，通过引物Primer EC02和Primer EC04扩增出片段PT7-tnf60；

(PT7-tnf60包含6个重要的原件—重要启动子PT7、NcoⅠ的限制酶识别位点、6xHistag标签序列、蛋白酶Xa识别位点、目的基因序列tnf60、SacⅠ限制酶识别位点)

(4)用限制酶NcoI制和SacⅠ分别处理片段PT7-tnf60、质粒pET22b和pET28a 1小时；酶切反应体系如下：

酶切反应体系

(5)通过琼脂糖凝胶纯化处理后的片段与线性质粒，并通过thermo紫外核酸蛋白定量仪进行定量

(6)按照摩尔比片段：质粒＝1:1和3:1的方式配比连接反应混合液，将混合液置于16式反应，过夜；连接反应体系如下：

连接反应体系

(7)将连接后的连接混合物转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中

(8)从长有白色菌落的转化平皿中挑取数十个单克隆进行菌落PCR，反应体系和条件如下表所示；

PCR反应体系

PCR反应条件

(9)选取步骤(8)中的到部分阳性克隆接种到含有5mL LB培养基的试管中，并加入5μL氨苄氨苄青霉素钠盐溶液(pET22b)或硫酸卡纳霉素溶液(pET28a)，置于摇床中培养，37℃，220rpm，过夜；

(10)提取质粒；

(11)按照下表所示的酶切反应体系，用限制酶EcoRⅠ和EcoRⅤ处理提取到的各管质粒并进行核酸电泳；

酶切反应体系

(12)选取步骤(11)所得到的部分阳性克隆，送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序；将测序正确的质粒转入到大肠杆菌Rosetta(DE3)中；

(测序反应所使用的引物为通用引物—T7promoter和T7terminator)

(13)两种表达质粒各选取一株阳性克隆按照步骤(9)接菌，待OD600为0.6时，加入诱导剂(IPTG)至终浓度为1mM，然后置于摇床继续培养7小时，30℃，220rpm；

(14)收集两种含表达质粒的菌体个1mL到1.5mL EP管中，12000rpm，常温离心2min；

(15)弃去上清，加入1mL PBS，轻轻吹悬，重复步骤(14)的离心操作；

(16)重复步骤(15)的漂洗操作；

(17)小心吸尽上清，加入45μL PBS和5μL 5X蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮沸10分钟；

(18)将步骤(17)中的样品取20μL加载到事先配制好的15％聚丙烯酰胺凝胶中，开始电泳；

(跑两块胶，一块用考马斯亮蓝显色，另一块进行western-blot检测；电泳条件：70V跑浓缩胶，140跑分离胶)

(19)停止电泳，切取分离胶，一块胶按2.2.1.2.2中的步骤(11)和(12)进行处理；另一块按下述步骤进行western-blot检测分析；

4、TNF60的纯化与定量。由于目的蛋白带有His标签，因此可以用固相金属离子亲和层析的方法纯化。

5、TNF60与人TNFα的相互作用。通过免疫印迹法可以检测TNF60与其靶点—人TNFα的相互作用。

6、TNF 60250mL摇瓶培养优化

(1)培养基的选着

大肠杆菌可以用多种培养基培养，不同培养基中的碳源、氮源以及无机盐的成分与浓度不同，这将直接影响的宿主细胞对重组蛋白的分泌表达能力，我们选取下表中的9种培养基进行了测试。

进行了测九种大肠杆菌培养基及其组成

(2)培养条件的优化

在用大肠杆菌表达外源重组蛋白时，诱导剂的用量、诱导后的培养时间和培养温度是影响蛋白表达的三个重要参数，本发明中我们采用专业的实验设计软件Design-Expert 8.5中的Box-Behnken响应面模型对TNF60表达的上述三个培养条件进行进行了优化。其操作如下：

优化条件的变量与水平

7、TNF60的生物活性检测。卡拉胶是红藻细胞壁中的一种黏多糖，是由1,3α-1,4β-半乳糖组成的阴离子线性多聚体分子，按照每个单体中所含硫的不同分为κ(1)、ι(2)和λ(3)三种构型，其中前两种会聚集成螺旋结构从而分别形成硬或软的胶状物，而λ构型的卡拉胶不会聚集成螺旋结构，在溶液中是非凝结的状态^[57]。向动物皮下注射卡拉胶之后会立即出现水肿、疼痛和红斑这样的炎症症状。其分子机理为卡拉胶诱导细胞产生组胺、缓激肽、速激肽、活性氧和一氧化氮等应激分子，这分子能够招募嗜中性粒细胞到被注射部位，然后该细胞能分泌包括TNFα在内的促炎因子，从而诱导炎症的发生^[58]。本课题通过λ卡拉胶致小鼠足踝肿胀，并通过测量足踝肿胀程度来评价所制备TNF60的生物学活性。其具体方法为：

(1)40只SPF级KM小鼠，每只大约30克，组雌雄各半，分开饲养；

(2)适应环境一周后，将这些小鼠按重量均匀分成5组，每组雌雄各半；

(3)给第1、2小鼠腹腔注射200μL的PBS，第3小组注射50μL的120mg/mL的阿司匹林溶液，第4小鼠注射200μL的含5mg/mL的TNF60PBS溶液，第5小鼠注射200μL的含10mg/mL的TNF60PBS溶液；

(由于阿司匹林须用0.1M的氢氧化钠溶液配制，我们在预实验时发现50μL是比较耐受的体积，所以实验时我们用了50μL的注射体积)

(3)半小时后，给第一组小鼠右后腿足踝注射25μL的PBS溶液，给其余每只小鼠的右后腿足踝注射25μL的含1％λ卡拉胶的PBS溶液；

(4)注射后每隔1小时用游标卡尺测测量小鼠后腿足踝的直径，每次测量重复两次；

(5)以以下公式计算每次测量的小鼠足趾肿胀程度，并将每组的变化情况统一绘制到同一“肿胀度—时间”表中。实验结束后取实验部位进行切片分析。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津丽迪森生物科技有限公司

天津科技大学

<120> 一种抗TNF-α纳米抗体及其基因工程表达

<130> 2017-04-28

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> 本发明的抗TNF-α纳米抗体的蛋白质序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu

130 135 140

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser

165 170 175

Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly

210 215 220

Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 本发明的抗TNF-α纳米抗体的核苷酸序列

<400> 2

gaagttcaac ttgttgaatc aggtggtggt cttgttcaac caggtggttc acttcgtctt 60

tcatgtgctg cttcaggttt tactttttca gattattgga tgtattgggt tcgtcaagct 120

ccaggtaaag gtcttgaatg ggtttcagaa attaatacta atggtcttat tactaaatat 180

ccagattcag ttaaaggtcg ttttactatt tcacgtgata atgctaaaaa tactctttat 240

cttcaaatga attcacttcg tccagaagat actgctgttt attattgtgc tcgttcacca 300

tcaggtttta atcgtggtca aggtactctt gttactgttt catcaggtgg tggtggttca 360

ggtggtggtt cagaagttca acttgttgaa tcaggtggtg gtcttgttca accaggtaat 420

tcacttcgtc tttcatgtgc tgcttcaggt tttacttttt catcatttgg tatgtcatgg 480

gttcgtcaag ctccaggtaa aggtcttgaa tgggtttcat caatttcagg ttcaggttca 540

gatactcttt atgctgattc agttaaaggt cgttttacta tttcacgtga taatgctaaa 600

actactcttt atcttcaaat gaattcactt cgtccagaag atactgctgt ttattattgt 660

actattggtg gttcactttc acgttcatca caaggtactc ttgttactgt ttcatca 717

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Primer EC01

<400> 3

atcgaaggtc gtgaagttca acttgttgaa tcagg 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Primer EC02

<400> 4

gcgaggagct cattatgatg aaacagtaac aagag 35

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> Primer EC03

<400> 5

aacttcacga ccttcgatgc cgctgctgtg atgatg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Primer EC04

<400> 6

agctacatca ctcagacttc agcaaccgca cctgtg 36

Claims

1.一种抗TNFα纳米抗体的基因工程表达菌，其特征在于：构建获得TNF60的原核表达质粒，转化宿主菌株中，筛选得到TNF60的两种基因工程表达菌。

2.根据权利要求1所述的抗TNFα纳米抗体，其特征在于将骆驼源抗TNF-α与抗人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，构成融合抗体，其序列详见附录所示。

3.根据权利要求1所述的抗TNFα纳米抗体的基因工程表达菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)Rosetta(DE3)。

4.根据权利要求1所述的抗TNFα纳米抗体的基因工程表达菌的构建方法，其特征在于：将TNF60的编码基因连接到pET-22b、pET-28a等大肠杆菌表达质粒中，构建获得TNF60的原核表达质粒，转化大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)Rosetta(DE3)中，筛选得到TNF60的两种基因工程表达菌通过响应面法优化确定TNF60的最佳培养条件，能到高纯度的TNF60的重组蛋白。

5.根据权利要求3所述的抗TNFα纳米抗体的基因工程表达菌的构建方法，其特征在于：通过响应面法优化确定TNF60的最佳培养条件为SB培养基，0.1mM IPTG，培养温度为22℃，诱导后培养时间为14h。

6.一种如权利要求1所述的抗TNFα纳米抗体的基因工程表达菌的表达体系在抗TNF60纳米抗体的生产等生物医药领域中的应用。