CN109627334B - 一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种纳米抗体、以及以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途，其中，该纳米抗体的氨基酸序列包含互补决定区和框架区，在该互补决定区中，互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明的纳米抗体、以及以该纳米抗体为配基的吸附剂，对抗原有特异性识别，从而有效去除血液中不良炎症介质，实现良好的血液净化效果。

Description

一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于纳米抗体的免疫亲和材料，特别是涉及一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途。该吸附剂包括载体基质和作为配基的纳米抗体，该材料以特异性识别例如TNF-α的纳米抗体为配基，可以通过血液净化方式降低患者体内过量的TNF-α水平，从而缓解和/或治疗脓毒血症等疾病。

背景技术

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一种能够诱导人体肿瘤细胞发生坏死的细胞因子。它是由3条相同多肽链组成的三聚物结构，可与TNF受体(TNF-R)相结合，从而介导多种生物学过程。其中，TNF-R存在于多种正常及肿瘤细胞表面，与TNF结合后介导下游信号传递的机理尚不清楚，可能与活化蛋白激酶C(PKC)，催化受体蛋白磷酸化有关。

由于产生的细胞不同，TNF可分为TNF-α和TNF-β两种。其中，TNF-α主要来源于单核细胞和巨噬细胞，其组成同源三聚体的每个亚基分子量为17kDa。

TNF-α作为一种炎症介质，对人体的作用具有双重性：在正常情况下，TNF-α对机体呈现保护性反应，可以参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染过程，促进组织修复，引起肿瘤细胞凋亡，通过炎症反应清除体内致病因子，对于维持体内环境的稳定及组织的更新起着重要的调节作用。但在某些疾病(如脓毒症、类风湿关节炎)发生发展的过程中，其过高的血液浓度会导致激化的炎症反应，对病人机体组织造成不可逆的损伤。研究人员发现尿毒症患者体内TNF-α的最大浓度可达408ng/L，约为正常人体内TNF-α水平的40倍。此外，TNF-α在动物和人体脓毒症发病过程中，会增强巨噬细胞的激活和分化，释放其他促炎因子(如IL-6,IL-8和MIF)、脂质分子、反应性氧自由基和氮自由基，从而放大炎症级联反应，诱发器官功能障碍。

在类风湿关节炎(RA)患者体内，TNF-α可增加机体分泌和合成趋化因子及细胞黏附分子的表达，从而使淋巴细胞和单核细胞募集速率增加。TNF-α也可刺激抗原表达肌球蛋白重链(MHC)族Ⅱ型受体的表达，诱导滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生前列腺素E2(PGE2)和基质金属蛋白酶(MMP)(胶原酶和基质蛋白酶)，从而导致滑膜炎症和增生，软骨组织破坏(参照非专利文献1)。

除了上述疾病，TNF-α还被发现与多种恶性肿瘤、炎性肠病(IBD)、2型糖尿病(T2D)、克罗恩疾病、免疫抑制性疾病和多发硬化性疾病的发病机制关系密切。因此，通过不同途径降低患者血液循环中过量的TNF-α或中和其活性对于相关疾病的预防、缓解、治疗以及减少并发症具有重要意义。

针对TNF-α进行治疗的方式主要有以下两种：一种是通过抗体药物抑制机体内TNF-α或者TNF-α受体的活性，阻断TNF-α发挥作用；另一种是采用血液净化的方式直接吸附去除患者血液中的TNF-α。

目前，相关抗体类药物的开发已经取得了重要进展，多种单抗药物已成功获得批准上市，如戈利木单抗、英夫利西单抗、阿达木单抗等。例如，Ablynx公司利用纳米抗体技术开发了一系列针对TNF-α的单域抗体(参见专利文献1和专利文献2)作为自身免疫性疾病的治疗药物。这些抗体分子被证明可有效干预TNF-α相关的疾病，诸如炎症、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、克罗恩病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、炎性肠综合征(inflammatory bowel syndrome)、多发性硬化(multiplesclerosis)、艾迪生病(Addison's disease)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)等。实验结果证明，药物治疗可以使患者体内的TNF-α水平明显下降，病情得到有效缓解，进一步证实控制TNF-α水平是治疗相关疾病的有效措施。

然而，基于单克隆抗体药物的治疗手段在临床使用中往往存在以下问题：(1)虽然患者体内的TNF-α血液水平很低，但为了达到必要的血药浓度以获得药效，需要较大的药物使用剂量，如托珠单抗的单次剂量为8mg/kg，每次治疗需要注射400mg左右，这使得高昂的治疗费用难以避免，如艾伯维的阿达木单抗，售价高达195元/mg，每年治疗费用平均为20.2万元。(2)大剂量的抗体药物输注同时也存在较高的安全风险。在抗TNF-α单抗药物的临床试验中，患者易产生多种不良反应，严重可引起多种细菌感染，影响神经功能，增加淋巴系统及免疫疾病患癌风险(参见非专利文献2)。

血液净化是另一种干预血液组分的有效手段，可用于清除血液中有毒或致病物质。临床中常用的血液净化技术包括血液灌流、血液滤过、血液透析等，临床中已成功应用于肾衰、肝衰、药物中毒以及自身免疫性疾病的治疗。近年来，针对炎症因子的血液净化治疗手段和医学材料也得到快速发展，并已用于脓毒症、类风湿关节炎、多器官衰竭、重症胰腺炎等疾病的治疗。

美国的CytoSorbTM吸附剂(CytoSorbents Corporation,Monmouth Junction,NJ)是一种典型的树脂型疏水吸附剂，被报道可用于炎症因子的吸附去除。该吸附介质采用聚苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物微粒，当应用于血液灌流时，对于血液中大部分的细胞因子，120分钟内的总清除率可达到80％以上。但是CytoSorbTM是否在治疗过程中也过滤了病人血液中的关键血液成分、营养物质和药物，以及由此引起的安全风险仍需进一步评价。珠海健帆生物科技股份有限公司发明了一种应用于血液灌流的吸附剂，以亲水性凝胶介质，如纤维素、琼脂糖、或聚乙烯醇球，作为载体，以疏水性的对烷基苯胺及其衍生物为配基，据报道也可有效清除患者体内的IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子，其中对IL-6的清除率可达90％以上(参见专利文献3)。南开大学发明了一种能够去除患者体内炎症因子的纳米复合微球吸附剂，其中以纳米碳酸钙-苯乙烯-二乙烯苯为基本骨架，以甲苯、汽油和多碳醇混合物为致孔剂，以过氧化苯甲酰为引发剂，这种吸附剂具有发达的介孔结构和高比表面积(参见专利文献4)。这两种吸附剂虽然取得了不错的体外吸附效果，但是通过疏水作用非特异性吸附TNF-α仍存在选择性低、安全风险高的缺点。因为其结合其他血液成分的吸附量远超过对TNF-α的吸附载量，且可结合的其他血浆组分种类及其吸附去除的比例不明确，因此使用过程中的安全风险难以在材料设计环节有效规避。

免疫吸附(immunoadsorption,IA)疗法的技术原理是基于特定分子之间的特异性识别作用。一般采用高度特异性的抗原、抗体或有特定物理化学亲和力的分子作为吸附功能基(配基)，将其通过共价键偶联于血液相容性良好的载体介质，从而获得对目标物具有高度选择性的吸附材料。1979年，Terman等将免疫吸附剂用于治疗狼疮性肾炎，为免疫吸附技术开辟了一个新的应用领域。基于特异性分子识别的原理，IA对血液中内源性或外源性致病因子清除的选择性、安全性、特异性更高。

龙海波等将TNF-α单克隆抗体偶联到凝胶微球上，用于控制动物内毒素血症中TNF-α介导的炎症反应，实验结果表明治疗2小时后，免疫吸附组的TNF-α活性明显降低(参见非专利文献3)。王勤等设计了一种TNF-α免疫吸附剂，载体是包被了多聚赖氨酸的聚苯乙烯微球，通过西弗碱反应，将抗TNF-α单克隆抗体(Z20)牢固结合于载体上，并制成特异性TNF-α免疫吸附柱，体外实验也获得了较理想的效果(参见非专利文献4)。

现有研究发展的针对TNF-α的免疫吸附剂均采用常规的IgG型单克隆抗体作为亲和配基，由于其需要采用动物细胞制备，生产成本高昂，此外IgG型抗体存在着结构不稳定、易聚集变性的问题。上述问题是困扰免疫亲和技术走向产业化，成功应用于临床的关键。因此，虽然体外实验普遍效果理想，但目前仍没有针对TNF-α的免疫吸附剂被应用于临床。而解决该问题的有效途径是发展新型的结构稳定、成本相对低廉的亲和配基。

1993年Hamers等偶然发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体(Heavy-chain antibodies，HCAbs)。这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variable domainof the heavy chain of HCAbs,VHH)单结构域形成，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量为15kD，仅为常规抗体的1/10，称为单域抗体(single domain antibody,sdAb)，也被称为纳米抗体。纳米抗体与传统抗体相比，具有水溶性好、耐酸碱、耐高温、稳定性高，易表达，免疫原性弱，灵敏度高、组织穿透性好等优点；此外，多种试验结果证明，对纳米抗体进行多种改性不会破坏其结构的完整性，能够与高通量的筛选平台兼容，具有成本低、制备方便等优点。

近年来，纳米抗体技术已被用于免疫吸附材料的制备，主要用于生物分离、分析领域。专利文献5中公开了一种黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，并成功以硅胶微球或琼脂糖凝胶为固相载体，制备了免疫吸附剂和免疫亲和吸附柱，用于农产品和食品中黄曲霉毒素样品前处理的纯化阶段。专利文献6公开了一种针对c-Myc高度特异性的纳米抗体，可以对含有c-Myc标签的重组蛋白进行纯化。Thermo Fisher旗下的Capture Select系列色谱分离介质以纳米抗体为配基，通过亲和解决方案对抗体、抗体片段和蛋白进行纯化。大连理工大学首次将基于纳米抗体的免疫吸附材料应用于血液净化领域，开发了针对肾衰患者体内β2微球蛋白的特异性血液净化吸附剂(参见专利文献7)。

因此，本发明的基于纳米抗体的高选择性TNF-α免疫吸附剂，将进一步扩展纳米抗体在血液净化治疗领域的应用。

专利文献1：国际公开WO2004/041862

专利文献2：国际公开WO2006/122786

专利文献3：CN103585977B

专利文献4：CN106334541A

专利文献5：CN103869065A

专利文献6：CN106890622A

专利文献7：CN104098694B

非专利文献1：Kalden JR.Emerging role of anti-tumor necrosis factortherapy in rheumatic diseases.Arthritis Res,2002,4(Suppl 2):S34-S40.

非专利文献2：胡雪,刘洋.肿瘤坏死因子-α抑制剂的研究进展及不良反应.河北医药,2012,11,34:3477-3480.

非专利文献3：龙海波、张训、侯凡凡，免疫吸附抗介质治疗内毒素休克的实验研究.中华创伤杂志，1998，14(2)：92-95

非专利文献4：王勤、吴雄飞、王军霞等，特异性肿瘤坏死因子-α免疫吸附柱的研制及其吸附率的实验研究.第三军医大学学报，2003,25(24):2220-2222

发明内容

本发明是基于解决现有的技术问题而完成的，其目的在于，提供一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂，以及前述纳米抗体或前述吸附剂在制备去除TNF-α试剂和/或医疗器械中的用途，以及，这些在免疫检测、富集和/或纯化中的用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明第一方面：

1、提供一种纳米抗体，前所述纳米抗体的氨基酸序列包含互补决定区和框架区，前述互补决定区包括互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，

前述互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，

前述互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，

前述互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2、前述1记载的纳米抗体，其中，前述框架区包括框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)，

前述框架区1(FR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，

前述框架区2(FR2)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，

前述框架区3(FR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，

前述框架区4(FR4)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

3、前述1或2记载的纳米抗体，其中，前述纳米抗体还进一步包括铰链区，前述铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

4、前述1或2记载的纳米抗体，其中，前述纳米抗体是通过将基因导入大肠杆菌或者酵母菌内，利用大肠杆菌或酵母菌表达产生的。

本发明第二方面：

5、提供一种吸附剂，前述吸附剂包括载体基质和前述1～4记载的纳米抗体。

6、前述5记载的吸附剂，其中，前述载体基质为多孔材料，前述多孔材料选自琼脂糖凝胶微球、纤维素球、磁珠、硅胶微球、活性炭、树脂微球中的一种。

7、前述5或6记载的吸附剂，其中，前述吸附剂的固载量为18mg/mL以上。

8、前述5或6记载的吸附剂，其中，前述吸附剂用来特异性识别TNF-α。

本发明第三方面：

9、提供一种将前述1～4记载的纳米抗体或前述5～8记载的吸附剂在制备去除TNF-α试剂和/或医疗器械中的用途。

10、提供一种将前述1～4记载的纳米抗体或前述5～8记载的吸附剂在免疫检测、富集和/或纯化中的用途。

有益的效果

本发明的吸附剂由于具有特殊结构的纳米抗体和载体基质，该纳米抗体能够特异性识别并结合TNF-α，从而有效去除血液中不良炎症介质，又因为纳米抗体本身具有免疫原性低、安全性高等优点，因此将该吸附剂应用于血液净化领域，十分安全有效，有助于缓解和治疗肾衰、脓毒血症、类风湿关节炎等病症。此外，本发明的吸附剂吸附载量大，加上纳米抗体本身还具有耐酸碱、耐高盐、耐高温等性质，使得该免疫亲和吸附剂可应用于TNF-α的富集、纯化。

附图说明

图1是TNF-α纳米抗体全菌表达电泳图；

图2是纯化后TNF-α纳米抗体电泳图。

附图标记说明：

M:蛋白Marker；

1:诱导前全菌电泳；

2、3:诱导后全菌电泳；

4：纯化后样品

具体实施方式

以下，举出实施例来说明本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。

为了使本发明更容易理解，所使用的术语用以下来定义。

术语“配基”是指，在亲和色谱法中，常将偶联于载体上，用于分离与之特异结合物质的生物分子称为配基。

术语“固载量”是指，单位体积亲和介质(吸附剂)所偶联的配基的总量。

以下结合附图给出本发明的具体实施方式，用来对本发明做进一步的说明。

本发明的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列包含互补决定区和框架区，前述互补决定区包括互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，前述互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，前述互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为SEQID NO:2，前述互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

对于纳米抗体，不同的纳米抗体的互补决定区的差异较大，只要纳米抗体中的互补决定区满足为上述的氨基酸序列，则均可以实现本发明的效果。

对于框架区，其相对更保守，本领域技术人员会根据纳米抗体的实际用途和功能来对框架区具体的序列结构进行合理的筛选。优选序列同源性为50％以上的氨基酸序列，更优选序列同源性为70％以上的氨基酸序列，最优选序列同源性为95％以上的氨基酸序列。进而优选为，前述纳米抗体的框架区包括框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)，前述框架区1(FR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，前述框架区2(FR2)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，前述框架区3(FR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，前述框架区4(FR4)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，但本发明的这些框架区的氨基酸序列并不限于此，还可根据与互补决定区的搭配来适当选择。

进而，该纳米抗体还进一步包括铰链区，所述铰链区的氨基酸序列优选为SEQ IDNO:8，但该氨基酸序列并不限于此。通过含有铰链区，增加纳米抗体的灵活性。

进而，纳米抗体是通过将基因导入大肠杆菌或者酵母菌内，利用大肠杆菌或酵母菌表达产生的。

本发明的纳米抗体，其作为载体基质的配基，可通过本领域公知的方法来制备，只要是能够获得本发明的纳米抗体，则可例如通过如下方法制备得到的：首先，构建纳米抗体的非免疫文库，并通过筛选技术，获得纳米抗体基因，其次，将纳米抗体基因通过基因工程重组的方式导入大肠杆菌或者酵母菌内，获得用于表达纳米抗体的基因工程菌，接着用该基因工程菌诱导表达纳米抗体，最后通过金属螯合层析的方式对其进行纯化，得到符合要求的纳米抗体纯品。

本发明的载体基质优选为多孔材料，所述多孔材料优选选自琼脂糖凝胶微球、纤维素球、磁珠、硅胶微球、活性炭、树脂微球中的一种或多种。

用于前述吸附剂的载体可通过商业来购买，作为具体例产品，例如，琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B(GE Healthcare，US)，树脂微球Nanomicro系列(苏州纳微科技有限公司)，但并不限于这些产品。

在使用上述载体时，优选预先将载体进行活化。该活化例如可以使用但不限于如下方法：首先进行环氧活化，其次再二胺丙基亚胺(DADPA)活化，最后碘乙酸活化，等。

前述吸附剂通过将纳米抗体偶联到经过活化的载体上而得到，具体的方法没有特别限定，例如，可通过将纯化的纳米抗体进行还原，得到纳米抗体溶液，然后将该纳米抗体溶液与载体混合，并通过离心分离，最终通过对凝胶进行清洗、过滤而得到最终的吸附剂。

前述纳米抗体在前述吸附剂的固载量越多越好，为18mg/mL以上，优选为19mg/mL以上，更优选为20mg/mL以上。通过在该范围，可以在载体上固载更多的纳米抗体，从而可更多地特异性识别例如血液中的TNF-α。

本发明的吸附剂优选可用来特异性识别TNF-α。

本发明的纳米抗体或吸附剂可用于制备去除TNF-α试剂，还可用于制备去除TNF-α的医疗器械。此外，本发明的纳米抗体或吸附剂还可用在免疫检测、富集和/或纯化等用途中。

实施例

实施例1

抗TNF-α纳米抗体文库的构建

本发明使用的噬菌体展示库是以T7噬菌体为载体的非免疫库，建立步骤如下：

(1)采取2岁雄性羊驼颈静脉血，分离外周血淋巴细胞，并提取总RNA(PuerLinkTMRNA Mini Kit，Life Technologies：12183018A)；

(2)将总RNA反转录为cDNA，并用采用两轮巢式PCR进行扩增VHH基因。其中第一轮巢式PCR以cDNA为模版，以上游引物1和下游引物1分别为上游和下游引物，扩增后回收大小为650～750bp的条带，并以此为第二轮PCR的模板，上、下游引物分别为上游引物2，下游引物2，回收450～500bp的PCR产物；

上游引物1:5’-GGTACGTGCT GTTGAACTGT TCC-3’

下游引物1:5’-CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT-3’

上游引物2:5’-AAGCTTTTGT GGTTTTGGTG TCTTGGGTTC-3’

下游引物2:5’-AAGCTTGGGG TCTTCGCTGT GGTGCG-3’

(3)用EcoRI和HindIII双酶切PCR产物，并进行琼脂糖电泳，回收350-500bp的基因条带，即为VHH基因片段；

(4)用T4连接酶连接T7载体(

10-3Cloning Kit,Merck Millipore

70550-3)和VHH基因片段；

(5)将连接产物与包装蛋白混合，组成完整的T7噬菌体，将混合物进行扩增，得到噬菌体原始文库；

(6)该原始库滴度为1.5×1010pfu/mL，多样性为2.0×107。

实施例2

纳米抗体的筛选

首先将抗原用TBS稀释为10μg/mL，取100μL加入96孔板中，4℃孵育12h。将孔中的抗原稀释液吸出，用TBS洗板3次，拍干，加入1％无蛋白封闭液(购自生工生物工程有限公司)，300μL/孔，室温孵育2h(筛选时1％无蛋白封闭液和1％BSA交替使用)。将孔中封闭剂吸出，用TBST洗板6次，拍干，加入扩增的噬菌体，100μL/孔，室温孵育30min。用TBST洗板10次，加入T7洗脱缓冲液(1％SDS)洗脱噬菌体，室温孵育30min，并将洗脱液扩增，用于下一轮筛选。

实施例3

基因工程菌的构建

(1)经过四轮筛选之后，将筛选洗脱液进行固体扩增，挑取噬菌斑，以噬菌斑扩增液为模板，以UP primer3和DOWN primer3为上、下游引物，进行PCR扩增；

上游引物3：5’-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3’

下游引物3：5’-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3’；

(2)将一部分PCR产物委外测序，即得到所述纳米抗体序列信息；

(3)将另一部分PCR产物，用NdeI和XhoI进行双酶切，并回收酶切产物。同时用相同的方法酶切并回收pET23a载体，用T4连接酶连接酶切产物及载体，将连接产物转入大肠杆菌，得到表达TNF-α特异性纳米抗体的基因工程菌，取1mL菌液，委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果显示CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，FR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，FR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，FR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，FR4的氨基酸序列为SEQ IDNO:7。

实施例4

TNF-α纳米抗体的制备

(1)将菌种按照1％的接种量接种到摇瓶中，37℃170r/min震荡培养过夜。将活化的种子按照1％的接种量接种到大的培养瓶中继续培养，待菌体生长至对数期的中后期时，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行过夜诱导。诱导结束后，在3900r/min条件下离心20分钟，获得含有TNF-α纳米抗体的湿菌。对全菌进行SDS-PAGE，电泳结果如附图1所示，其中，2的上样量为20μL，3的上样量为30μL。

(2)向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解缓冲液(10mM咪唑,500mM NaCl,0.02M PB，pH7.4)，充分悬浮菌体，然后使用高压匀浆机进行细胞破碎，破碎压力为700bar。

(3)将破碎液在4℃、10000r/min的条件下离心20分钟，取上清。

(4)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过金属螯合层析(GE Healthcare，US)进行TNF-α纳米抗体的分离纯化，层析填料为Ni Sepharose High Perfomance。

(5)将层析洗脱液进行SDS-PAGE判断纯度，电泳结果如附图2所示，纯化后蛋白纯度在90％以上，可以用于后续吸附剂的合成以及吸附剂的评价。

(6)用BCA法进行蛋白浓度的测定。经检测，纳米抗体产量约为252mg/L。

实施例5

琼脂糖凝胶的活化

(1)环氧活化

①向2mL(1.6g)Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶中加入2mL 2mol/L的NaOH溶液，1mL的环氧氯丙烷，6mL的DMSO，将反应体系在40℃，175r/min的条件下反应15分钟；

②反应结束后，依次使用不同浓度的丙酮溶液(30％、70％、100％、70％、30％)对凝胶进行清洗，之后使用大量水清洗，每步清洗三次；

③凝胶抽滤成湿饼后立即进行下一步试验。

(2)DADPA活化

①将环氧活化后的琼脂糖凝胶与等体积的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(0.1mol/L，pH＝11)相混合；

②向混合体系中加入DADPA，30℃条件下，反应4小时；

③反应结束后，依次用1mol/L的NaCl溶液、水对琼脂糖凝胶进行充分清洗，可置于20％的乙醇中于4℃保存。

(3)碘乙酸活化

①对步骤(2)反应后制得的氨基琼脂糖凝胶依次用水、PBS缓冲液进行清洗，抽滤；

②向碘乙酸中加入PBS缓冲液(pH＝7.2)并配制浓度为5mg/mL的溶液，与琼脂糖凝胶按照1:1的体积比混合均匀；

③按照1mL琼脂糖凝胶加入2mmoL EDC与5mmoL NHS的比例，于室温下反应2.5小时；

④反应结束后依次用水、1mol/L的NaCl溶液、水大量清洗，抽滤。

实施例6

TNF-α纳米抗体的偶联

(1)将上述纯化出的TNF-α纳米抗体溶液通过超滤置于浓度为7.9mg/mL的缓冲体系中(0.02mol/L pH7.4的PB与1mmol/L的乙二胺四乙酸)，并加入适量的三(2-羧乙基)膦进行还原；

(2)在三角瓶中加入一定质量的活化后的琼脂糖凝胶，并加入15倍凝胶体积的纳米抗体溶液，在37℃摇床中反应4h；

(3)反应结束后，10000转/分离心5分钟，取上清液测定反应前后的蛋白浓度变化；

(4)向初步固载了TNF-α纳米抗体的吸附剂中加入少量的巯基甘油，于37℃摇床中过夜反应，封闭吸附剂其余位点；

(5)使用水多次清洗凝胶，抽滤，制得终产品，并置于含有0.02％叠氮钠的20％乙醇溶液中于4℃保存。

实施例7

吸附剂的溶血性能评价

实验方法参照2015年版《中华人民共和国药典》及《医疗器械生物学评价》第十一章《与血液相互作用试验选择》

(1)健康家兔心脏采血10mL，加入1mL质量浓度2％(20g/L)的草酸钾溶液，轻轻混匀，制备成新鲜抗凝兔血。取新鲜抗凝兔血8mL，加质量浓度0.9％(9g/L)的氯化钠注射液10mL进行稀释，制得新鲜稀释抗凝兔血。

(2)称取吸附剂5g，加入试管内，再加入10mL生理盐水使吸附剂完全浸没，阴性对照为10mL生理盐水，阳性对照为10mL蒸馏水，均为10mL。样品、阴性对照和阳性对照各准备3管。将上述试管放入至恒温水浴锅中，37±1℃恒温水浴30min，每支试管分别加入0.2mL稀释抗凝兔血(A液)，再继续水浴60min。

(3)倒出上述管中试样，放入离心机中，800g离心5min。吸取上清液移入比色皿中，用分光光度计在545nm处测定吸光值。供试品组与对照组吸光度均取三管平均值。阴性对照吸光值应不大于0.03，阳性对照管的吸光度应为0.8±0.3，否则应重新进行试验。用生理盐水调零。

(4)供试品溶血率计算公式：n＝(A1-A2)*100％/(A3-A2)，其中n为溶血率(％)，A1为供试品组吸光度，A2为阴性对照组吸光度，A3为阳性对照组吸光度。

经实验验证，用规定的静态接触溶血法测得的该吸附剂溶血率几乎为0，低于5％(合格品的判定指标一般应小于5％)，符合要求。

实施例8

在非血液体系中吸附剂吸附容量的评价

(1)向实施例6制得的TNF-α吸附剂中加入已知浓度的TNF-α蛋白溶液，缓冲液为pH8.0的PBS溶液，胶水比为1：15；

(2)在室温条件下，使用翻转混匀仪静态吸附2小时；

(3)通过BCA法测定反应前后的蛋白浓度，确定对TNF-α的吸附情况。

表1TNF-α吸附剂在非血液体系中吸附性能结果

如附表1所示，当TNF-α的初始浓度为1.603mg/mL时，固载量为18.0mg/mL的吸附剂对TNF-α吸附量为19.43mg/mL，对应的吸附摩尔比为0.98，接近1，此时吸附率为75.8％。

实施例9

吸附剂对血液中TNF-α的吸附效果测定

(1)向血清中加入一定量的TNF-α，测定其终浓度为1.219ng/mL，接近肝癌病人血液中TNF-α浓度(曾颖玲,叶晓光.乙肝患者血清TNF的含量与肝损伤程度与病毒复制的关系.广州医学院学报,2002(30)3:40-41)。

(2)向吸附剂中按照胶水比1:10加入含有TNF-α的血清溶液，计算得到该混合体系中TNF-α浓度为1.108ng/ml。

(3)室温条件下，使用翻转混匀仪吸附2小时。

(4)使用TNF-α试剂盒(Solarbio，SEKH-0047)进行吸附前后浓度的测定，确定血液中的吸附情况。

表2TNF-α吸附剂在血液体系中吸附性能结果

如附表2所示，吸附剂在血清中对TNF-α的去除率可以达到55.2％，能够将模拟肝癌病人血液中TNF-α水平降至健康人水平(健康人血液中TNF-α水平为0.39±0.16ng/mL，参考文献《急性脑梗赛患者血浆肿瘤坏死因子-含量的变化》)，可见，本发明的吸附剂在血液净化治疗领域具有重要意义。

产业上的可利用性

本发明的纳米抗体，以及具有特殊结构纳米抗体和载体基质的吸附剂，能够特异性识别并结合TNF-α，从而有效去除血液中不良炎症介质，又因为纳米抗体本身具有免疫原性低、安全性高等优点，因此将该吸附剂应用于血液净化领域，十分安全有效，有助于缓解和治疗肾衰、脓毒血症、类风湿关节炎等病症。此外，本发明的吸附剂吸附载量大，加上纳米抗体本身还具有耐酸碱、耐高盐、耐高温等性质，使得该免疫亲和吸附剂可应用于TNF-α的富集、纯化。

SEQUENCE LISTING

<110> 康元医疗科技（大连）有限公司

<120> 一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途

<141>

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 27

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<211> 30

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<210> 5

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<210> 8

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<213> 人工序列

<400> 8

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Claims (9)

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包含互补决定区和框架区，所述互补决定区包括互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，

所述互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，

所述互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，

所述互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，

所述框架区包括框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)，

所述框架区1(FR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，

所述框架区2(FR2)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，

所述框架区3(FR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，

所述框架区4(FR4)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还进一步包括铰链区，所述铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体是通过将基因导入大肠杆菌或者酵母菌内，利用大肠杆菌或酵母菌表达产生的。

4.一种吸附剂，其特征在于，所述吸附剂包括载体基质和权利要求1～3所述的纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的吸附剂，其特征在于，所述载体基质为多孔材料，所述多孔材料选自琼脂糖凝胶微球、纤维素球、磁珠、硅胶微球、活性炭、树脂微球中的一种。

6.根据权利要求4或5所述的吸附剂，其特征在于，所述吸附剂的固载量为18mg/mL以上。

7.根据权利要求4或5所述的吸附剂，其特征在于，所述吸附剂用来特异性识别TNF-α。

8.一种将权利要求1～3所述的纳米抗体或权利要求4～7所述的吸附剂在制备去除TNF-α试剂或医疗器械中的用途。

9.一种将权利要求1～3所述的纳米抗体或权利要求4～7所述的吸附剂在免疫检测、富集或纯化中的用途。

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