CN104004093B - 一种抗人甲状旁腺激素的纳米抗体及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人甲状旁腺激素(PTH)的纳米抗体及其制备方法和应用。本发明采用定点固载抗原后用于筛选抗体的方法，即在人甲状旁腺激素基因的碳末端加上一个半胱氨酸，进行原核表达纯化，并通过该半胱氨酸与马来酰亚胺的反应固定到ELISA板上，解决了传统筛选过程中亲水性抗原不易结合的问题，也解决了小分子抗原结构容易改变这一问题，更有利于筛选到针对正确结构的抗体，筛选出的抗体更具竞争力。本发明的纳米抗体对PTH具有很高的特异性亲和活性，其亲和常数在109M‑1以上，可应用于纯化蛋白、制备吸附剂材料、制备血液净化吸附材料、进行蛋白浓度检测等方面。
Description
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种抗人甲状旁腺激素(PTH)的纳米抗体及其应用。还涉及利用定点固载的方法包被抗原，从羊驼纳米抗体展示库中筛选出具有高活性的抗人PTH纳米抗体的方法。
背景技术
我国慢性肾脏病(CKD)患者逐年增加，至2014年初，发病率已增至11.5％左右，已成为影响人们生活质量的主要病症之一。当各种肾脏疾病或其他疾病引起的肾脏损伤发展到晚期就会进入慢性肾衰竭阶段，最后发展为尿毒症(Ong A C,et al.KidneyInternational,1994,45:345-351.)。尿毒症患者由于绝大部分肾实质破坏，肾功能几乎消失，导致多种代谢废物难以排泄和某些内分泌激素不能降解，在体内蓄积进而产生毒性，即尿毒症毒素。这些毒素可进一步导致代谢紊乱，多脏器损坏。甲状旁腺激素(PTH)就是最主要的尿毒症毒素之一。
PTH是甲状旁腺主细胞分泌的含84个氨基酸的碱性单链多肽类激素，分子量9425Da，等电点约为9.1，分子中不含半胱氨酸，亲水性氨基酸居多，二级结构中富含α-螺旋。PTH分子有较强的柔性，在不同溶剂中其结构有很大差别(Strickland L A,etal..Biochemistry,1993,32:6050-6057.)。
在正常人体内PTH的含量特别低，主要用于调节钙磷代谢。在肾衰竭患者体内，往往伴随有较高水平的PTH产生，高水平的PTH对人体多器官有害，是一种毒素。首先表现在损坏肾脏，PTH过高会造成肾脏及其他组织中的钙降低、磷沉积增加，从而损坏肾单位，直至肾功能消失；同时表现为对骨的破坏，PTH增加必然会促进溶骨作用以增加血钙含量，会造成肾性骨营养不良、骨痛骨折等；还会造成肾性贫血和心脏衰竭(Gruson D,et al.ClinicaChimica Acta,2014,doi:10.1016/j.cca.2014.03.029.)。据调查，维持性血液透析患者中很大一部分伴有继发性甲状旁腺功能亢进，严重影响患者的治疗和生活质量，因此寻找有效治疗甲状旁腺功能亢进去除过多的PTH的方法十分重要。
降低肾衰竭病人体内过多的PTH可以缓解肾衰病人病情恶化。目前临床上的治疗方法主要包括：药物治疗、血液净化治疗以及手术治疗。药物治疗用于初期或者辅助性治疗，而切除甲状旁腺的手术治疗副作用很大，所以血液净化治疗被认为是最有发展前景的治疗方法。目前研究的血液净化方式主要包括血液透析、血液灌流等。由于血液中有很多与PTH分子性质相似的蛋白，现有的非特异性配基的血液灌流对PTH去除能力差，还会存在大量非特异性吸附。因此开发一种新的吸附材料对推动血液净化方法的发展十分必要。PTH在血液中含量相对较低，肾衰竭患者PTH浓度1200±600ng/L，这种吸附材料需要具备较高的亲和性。
有些研究者将抗体技术引入临床，其在诊断、治疗方面表现出良好的发展前景。比如利用卵黄抗体吸附PTH，取得了很好的效果，但是由于卵黄抗体分子结构复杂，只能从卵黄蛋白中提取，得到特异性卵黄抗体的量很低，不利于大规模应用。
1993年，Hamers-casteman等发现骆驼血清中存在一种天然缺失轻链却具有完整功能的重链抗体(Hamers-Casterman C,et al.Nature,1993,363(3):446-448.)，说明重链抗体的重链可变区(VHH)能够单独形成完整的抗原结合位点，克隆该部分便得到了纳米抗体。纳米抗体分子量低，免疫原性弱，稳定性高，亲和力高，而且易表达，基于这些优势，纳米抗体成为去除PTH材料的最佳选择之一。
目前获得纳米抗体的方法主要是从噬菌体库中进行筛选。筛选时首先包被抗原，封闭未反应的位点，然后将噬菌体库与抗原进行结合，反复清洗去除未结合的噬菌体，最后洗脱结合的噬菌体，完成后进行下一轮筛选，一般需要经过三到四轮的连续筛选。在该过程中，抗原的包被是很重要的一环，传统的抗原包被方法是利用疏水作用将蛋白吸附到96孔板等基质上，是非共价键结合，但是这种包被方法对于亲水性蛋白或者小分子蛋白并不适用。亲水性蛋白疏水位点比较少，而且大都在蛋白的内部或者活性部位，如果利用疏水作用其结合效果并不好，而且有可能破坏蛋白的活性。对于小分子蛋白，疏水固定会使小分子蛋白的结构变化比较大，增加活性改变的可能(Reulen S W,et al.BMC Biotechnology,2009,9:66.)，比如PTH，它会尽可能暴露出疏水位点以舒展状态吸附于材料表面，形态与在血液中的状态完全不一样，这样筛选到的抗体并不能保证与血液中的PTH有良好的结合能力。基于以上情况，将定点固载技术引入抗体的筛选十分必要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种针对亲水性小分子毒素甲状旁腺激素(PTH)的高亲和性纳米抗体。
一种抗甲状旁腺激素(PTH)的纳米抗体，所述纳米抗体包括框架区、互补决定区和铰链区，所述框架区由四个区域组成，分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其中所述FR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO.15、19、23、27、30、33、36、41、46、48、51、55中的一种，所述FR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO.16、20、24、28、31、34、37、42、43、49、52、56中的一种，所述FR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO.17、21、25、29、32、35、38、39、44、47、50、53、57中的一种，所述FR4的氨基酸序列选自SEQ ID NO.18、22、26、40、45、54、58中的一种；
所述互补决定区由三个区域组成，分别为CDR1、CDR2、CDR3，其中所述CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO.62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101中的一种，所述CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO.63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102中的一种，所述CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO.64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103中的一种；
所述铰链区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.59、60、61中的一种。
进一步地，所述的一种抗甲状旁腺激素的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示；
其中：
SEQ ID NO.1包括由SEQ ID NO.15～18组成的框架区、由SEQ ID NO.62～64组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.2包括由SEQ ID NO.19～22组成的框架区、由SEQ ID NO.65～67组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.3包括由SEQ ID NO.23～26组成的框架区、由SEQ ID NO.68～70组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.4包括由SEQ ID NO.27～29和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.71～73组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.5包括由SEQ ID NO.30～32和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.74～76组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.6包括由SEQ ID NO.33～35和和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQID NO.77～79组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.7包括由SEQ ID NO.36～38和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.80～82组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.8包括由SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40组成的框架区、由SEQ ID NO.83～85组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.9包括由SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ ID NO.86～88组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.10包括由SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ IDNO.45组成的框架区、由SEQ ID NO.89～91组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.11包括由SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.18组成的框架区、由SEQ ID NO.92～94组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.12包括由SEQ ID NO.48～50和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.95～97组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.13包括由SEQ ID NO.51～54组成的框架区、由SEQ ID NO.98～100组成的互补决定区和SEQ ID NO.60所示的铰链区；
SEQ ID NO.14包括由SEQ ID NO.55～58组成的框架区、由SEQ ID NO.101～103组成的互补决定区和SEQ ID NO.61所示的铰链区。
本发明的目的之二是，提供一种上述所述的纳米抗体的筛选方法，该方法包括，利用PCR技术在人甲状旁腺激素目的基因片段的碳末端引入巯基标签，利用该巯基定点固载抗原进行筛选的步骤。
进一步，所述的巯基为半胱氨酸携带。
进一步，所述的纳米抗体的筛选方法，包括如下步骤：
(1)在人甲状旁腺激素目的基因片段的碳末端引入巯基标签，获得融合蛋白PTH-C的基因；(2)利用酶切位点将PTH-C的基因构建到载体pET-23a中，构建重组质粒pET-23a-PTH-C；(3)重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中，阳性菌落经培养、IPTG诱导后，收集菌体，提取总蛋白；(4)总蛋白经分离和纯化，获得带有巯基的PTH-C融合蛋白；(5)以PTH-C融合蛋白为抗原，对羊驼噬菌体抗体库进行多轮富集筛选，获得对PTH-C融合蛋白具有特异性结合能力的噬菌体。
在上述纳米抗体的筛选方法中，步骤(4)中，总蛋白经过0.12％的PEI沉淀、50％饱和硫酸铵沉淀、pH3.5的柠檬酸重悬、透析换液除盐、阳离子交换层析等分离纯化步骤获得纯度在95％以上的带有巯基的PTH-C融合蛋白。
在上述纳米抗体的筛选方法中，步骤(5)中，首先将PTH-C融合蛋白利用定点固载方法固定到ELISA板上，经封闭后用于羊驼噬菌体抗体库的筛选。所述定点固载可以采用能够实现本发明技术方案的本领域常规的固载方法，本发明优选利用PTH-C融合蛋白(抗原)上的巯基标签将抗原固定到修饰有马来酰亚胺基团的ELISA板上。
目前，获得纳米抗体的方法主要是从噬菌体库中进行筛选。筛选时首先包被抗原，抗原的包被是很重要的一环，传统的抗原包被方法是利用疏水作用将蛋白吸附到96孔板等基质上，是非共价键结合，但是这种包被方法对于亲水性蛋白或者小分子蛋白并不适用，不能得到高亲和性的纳米抗体，而本发明中利用巯基和马来酰亚胺的反应对蛋白进行定点定向固载进行筛选，该方法更有利于得到高亲和性的抗体。
本发明的目的之三是，提供上述所述的纳米抗体在检测或去除甲状旁腺激素试剂中的应用。
进一步，所述去除甲状旁腺激素试剂为甲状旁腺激素吸附剂、吸附血液中甲状旁腺激素的吸附剂。
本发明所述纳米抗体也可应用于治疗高表达甲状旁腺激素的疾病药物的制备。
进一步，上述所述的甲状旁腺激素为人甲状旁腺激素。
本发明的有益效果：
首先，本发明提供了一种特异性的抗PTH的纳米抗体，可以将其对应的基因克隆至质粒，转入到宿主细胞，宿主细胞可以是原核的，也可以是真核的。然后在多表达体系中进行表达，获得的抗体可以应用在纯化蛋白、制备吸附剂材料、制备血液净化吸附材料、进行蛋白浓度检测等方面。再次，本发明中筛选纳米抗体的方法将定点固载技术引入抗体的筛选过程，解决了传统筛选过程中亲水性抗原不易结合的问题，也解决了小分子抗原容易形变的问题，筛选出的抗体更具竞争力，也为抗体筛选提供了一种新思路。通过这种新方法得到的展示有特异性抗体的噬菌体是多价抗体，也可以用来进行蛋白纯化以及高效检测。
附图说明
图1～14分别是SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示的纳米抗体氨基酸序列示意图；
图15为本发明构建的重组质粒pET-23a-PTH-C的质粒图谱，利用酶切位点NdeI和Bam HI，将目的基因片段PTH-C连接到pET-23a载体上；
图16为质粒pET-23a-PTH-C在E.coli BL21(DE3)中的表达情况SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M是低分子量蛋白marker，泳道1是菌株在IPTG诱导前的全菌蛋白，泳道2-5分别是随机挑取的四株阳性菌(依次命名为1-4号菌株)IPTG诱导后的全菌蛋白；
图17为带巯基标签的目的蛋白PTH-C经粗分离以及精分离后的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M是低分子量蛋白marker，泳道1是粗分离之后的目的蛋白；泳道2是阳离子交换层析-精分离过程中出现第一个目标峰(肩峰)时对应的蛋白；泳道3-5是出现第二个目标峰(主峰)时对应的蛋白；泳道6是出现第三个目标峰(肩峰)时对应的蛋白；
图18噬菌斑图；
图19是鉴定单克隆噬菌体活性ELISA结果图；其中，横坐标中SEQ1～14分别是SEQID NO.1～SEQ ID NO.14所示纳米抗体的单克隆噬菌体；
图20是投入不同量的T7噬菌体计算得到的亲和常数值的比较，双对数作图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域技术人员更全面理解本发明，本申请公开的DNA序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法获得。而且可以将本申请获得的新的氨基酸序列对应的基因构建到任何合适的载体，用任何合适的表达体系进行表达。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，一些根据所公开的内容做出的改变和修饰，也应当属于本申请要求保护的范围。
本文实施例中所使用的药品及试剂若无特殊说明均按常规途径获得，带巯基标签的PTH简写PTH-C。
实施例1 重组质粒pET-23a-PTH-C的构建及鉴定
(1)目的基因的获得
通过PCR的方法获得带巯基标签的目的蛋白。以质粒pET-23a-PTH(大连理工大学生命科学与技术学院生物材料课题组保存)为模板，在此基础上合理设计引物，在PTH基因的末端引入半胱氨酸的密码子，酶切位点为Nde I和Bam HI。
上游引物(UP)：
5’-CTACACGGAAATTCCATATGTCTGTTTCTGAAATCCAGC-3’
下游引物(DOWN)：
5’-GACTATGTCCGGGATCCTTAGCACTGAGATTTAGCTTTGGTCAGAACG-3’
(2)PCR产物的纯化
反应结束后进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，电泳结果显示，扩增基因片段在270bp附近呈现亮带。用TaKaRa公司生产的胶回收试剂盒(TaKaRa Code:9762)回收目的基因条带，得目的基因片段。试剂盒回收基因条带的具体步骤参考试剂盒说明书。
(3)质粒及PCR产物的双酶切
用Nde I和Bam HI两种限制性内切酶分别消化质粒pET23a及PCR产物(步骤(2)得到的目的基因片段)，使其产生互补的粘性末端。
(4)酶切产物的链接
将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段及载体片段，使用T4连接酶将二者进行连接。
(5)重组质粒的转化及其鉴定
用CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，-80℃保存。
采用热激法将连接产物转化到DH5α中，并将得到的转化菌株在培养皿上进行涂布。待培养皿中长出菌落之后，挑取一株单菌落，接种到20mL Amp-LB液体培养基中(氨苄青霉素浓度为0.1mg/mL)，170r/min、37℃培养过夜，使用TaKaRa公司生产的质粒提取试剂盒(TaKaRa Code:9760)提取质粒。将提取的质粒进行Nde I和Bam HI的双酶切验证，琼脂糖电泳显示在略高于250bp的位置存在目的条带。再将该种质粒送交旭冠生物科技有限公司测序，用clustal X2.0软件进行比对，结果表明PTH-C基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.104)成功构建到pET-23a载体上，将该重组质粒命名为pET-23a-PTH-C，其质粒图谱如图15所示。
实施例2 融合蛋白PTH-C的摇瓶培养及表达
按照实施例1的方法将构建的质粒pET-23a-PTH-C转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，过夜培养后，培养皿上长出阳性菌落。挑取4株单菌落分别接种到20mL Amp-LB液体培养基中，170r/min、37℃活化过夜。
将活化的菌种1％接种到LB培养基中，培养3-4h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，4h后停止诱导，离心收集菌体。对全菌进行SDS-PAGE，结果如图16所示，其中泳道M为蛋白低分量marker，泳道1是IPTG诱导前的全菌蛋白，泳道2-5分别是随机挑取的菌株四株阳性菌(依次命名为1-4号菌株)IPTG诱导后的全菌蛋白，可见四株菌在9600Da处均有目的蛋白PTH-C的表达，通过灰度扫描，表达量占总蛋白25％-30％，4号菌株的表达量最高，保存该株菌的菌保方便后续实验使用。
实施例3 融合蛋白PTH-C的分离纯化及巯基检测
(1)重组蛋白可溶性考察
首先将培养的4号菌体利用超声波破碎仪进行破碎，在4℃、10,000rpm下离心，分别取上清和沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，大部分表达的目的蛋白(9600Da)分布在上清液中，呈现可溶性表达。
(2)蛋白预处理-粗分离
在破碎离心得到的上清中加入终浓度为0.12％(w/v)的PEI，去除溶液中的核酸。4℃静置30min，10000r/min，4℃离心15min。取出上清，等体积加入饱和硫酸铵，4℃静置30min，离心。保留沉淀并用pH3.5的柠檬酸缓冲液溶解，搅拌均匀，离心。取上清液放入透析袋(截留分子量3000Da)中，用20mM、pH8.0的PBS作为透析缓冲液，过夜透析，中间换液两次。将透析好的溶液离心，收集上清，过0.22μm滤膜，进入下一步精分离。
(3)SP强阳离子交换层析-精分离
实验中层析系统选用purifier100。由于PTH理论等电点为9.1，引入半胱氨酸后pI值变化不会太大，用pH8.0的缓冲体系、SP阳离子交换层析介质对蛋白进行精分离，紫外检测波长选择214nm。采用线性洗脱方式，洗脱液(20mM PBS，1M NaCl，pH8.0)线性范围0-30％，210min，出峰时收集洗脱液，直到出峰完全。
将洗脱得到的蛋白溶液进行SDS-PAGE，图17所示为不同峰时蛋白的电泳情况，泳道M为蛋白低分量marker，泳道1是粗分离之后的目的蛋白；泳道2是阳离子交换层析过程中出现第一个目标峰(肩峰)时对应的蛋白；泳道3-5是出现第二个目标峰(主峰)时对应的蛋白；泳道6是出现第三个目标峰(肩峰)时对应的蛋白。可见主峰和第三个峰对应的蛋白纯度已经很高，基本看不到杂质条带。用BandScan软件进行灰度扫描，纯度在95％以上，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，最高可达到0.16mg/mL。
(4)自由巯基的定性检测
取100μL洗脱蛋白的浓缩液，加入100μL Ellman试剂，室温反应15min，溶液变为黄色，证明纯化的PTH-C中存在自由巯基。
实施例4 纳米抗体库的建立
本发明使用的噬菌体展示库是以T7噬菌体为载体的非免疫库，建立步骤如下：
(1)采取2岁雄性羊驼颈静脉血，提取外周血淋巴细胞，并提取其中的总RNA(PuerLinkTM RNA Mini Kit，Life Technologies：12183018A)；
(2)以UP primer1为引物将提取的总RNA反转录为cDNA，并用采用两轮巢式PCR进行扩增VHH基因；
其中第一轮PCR为以转录的cDNA为模版，以UP primer1和DOWN primer1为上游和下游引物，PCR扩增，回收得到大小为650～750bp的条带作为模版，进行第二轮PCR扩增，上游和下游引物分别为UP primer2，DOWN primer2，回收得到450～500bp的PCR产物；
UP primer1:5’-GGTACGTGCT GTTGAACTGT TCC-3’
DOWN primer1:5’-CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT-3’
UP primer2:5’-AAGCTTTTGT GGTTTTGGTG TCTTGGGTTC-3’
DOWN primer2：5’-AAGCTTGGGG TCTTCGCTGT GGTGCG-3’
(3)用EcoRI和HindIII双酶切VHH基因，并进行琼脂糖电泳，回收其中350-500bp的基因条带，即为VHH基因片段；
(4)用T4连接酶连接T7载体(10-3Cloning Kit,Merck Millipore70550-3)和VHH基因片段；
(5)将连接产物进行包装，然后进行扩增(方法见实施例5)，得噬菌体原始文库；
(6)该原始库滴度为1.5×1010pfu/mL(方法见实施例6)，多样性为2.0×107。
实施例5 T7噬菌体的液体扩增
(1)活化宿主菌：在50ml Carb-LB培养基(羧苄青霉素含量0.1mg/mL)中，接种大肠杆菌BLT5403单菌落或菌保，37℃170r/min摇床过夜。此菌液简称一代宿主菌；
(2)在Carb-LB液体培养基中接种1％的一代菌，摇床培养，到OD600为0.5-1.0；
(3)用T7噬菌体感染二代宿主菌，37℃200r/min摇床培养2-3h，观察溶菌情况，溶菌完全立即停止培养。将溶菌产物立即离心：8000g，10min。回收上清，上清即为扩增的噬菌体。测定滴度。
实施例6 T7噬菌体滴度的测定
(1)倒平板：在培养皿中倒入Carb-LB底层培养基，冷却、凝固；
(2)溶解顶层培养基，冷却，加入Carb后45℃保温；
(3)用无菌LB液体培养基梯度稀释扩增的噬菌体；
(4)在一系列5mL无菌离心管中加入300μL二代宿主菌、50μL不同梯度稀释的噬菌体，混匀，加入4mL Carb-顶层培养基，迅速倒入已预热的倒有底层培养基的平皿中，晃动平皿使之分布均匀；
(5)37℃倒置培养3-4h，直到看到大小适中的噬菌斑(如图18所示)；
(6)挑选噬菌斑数量为50-500间的平板进行噬菌斑计数，计算噬菌体滴度。
实施例7 纳米抗体的筛选
首先在巯基结合板(Sulfhydryl-BINDTM surface plate，美国康宁公司)上包被抗原，将实施例3得到的PTH-C蛋白用TBS稀释成10μg/mL，调pH至7.0，100μL/孔进行包被，室温摇床反应2h；用TBS洗板3次，拍干；用1mM的巯基乙醇封闭2h；再用TBS清洗3次，拍干；用足量的1％无蛋白封闭液(购自生工生物工程有限公司)进行封闭，室温摇床1.5h(筛选时不同轮之间1％无蛋白封闭液和1％BSA交叉使用)；用TBST洗板6次，拍干；加入扩增的噬菌体，100μL/孔，室温摇床孵育30min；用TBST洗板10次，充分去除未结合的噬菌体；最后加入T7洗脱缓冲液(1％SDS)洗脱噬菌体，室温摇床30min，并将洗脱液扩增，得下一轮筛选用噬菌体，进入下一轮筛选。经过四轮筛选之后，特异性的噬菌体得到富集。
实施例8 单克隆噬菌体的序列分析
经第四轮筛选后，按照实施例6的方法得到单克隆噬菌斑。采用PCR法扩增后进行序列分析，方法如下：
(1)PCR扩增
①用灭菌牙签挑取100个噬菌斑，同一噬菌斑一部分放入EDTA溶胶缓冲液中用于PCR，另一部分进行扩增，用于后续ELISA；
②放入EDTA溶胶缓冲液中的部分65℃处理10min；
③冷却至室温，14000g离心5min，取上清98℃热击处理5min；
④取2μL作为模板进行PCR扩增；
UP primer3：5’-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3’
DOWN primer3：5’-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3’
反应条件为：94℃预变性5min后，98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸7min；
(2)将PCR产物送交生工生物工程有限公司测序；
(3)利用MEGA4.0软件将得到的核酸序列转化为氨基酸序列进行比对，CDR区不同的视为不同的克隆株，最后得到14株结构类似的抗体，其氨基酸为SEQ ID NO.1～14，均由4个框架区(FR)、3个互补决定区(CDR)以及1个铰链区组成，它们的FR区以及铰链区高度同源。所述纳米抗体的氨基酸序列以及其组成序列为如下。
序列1：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.15～18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.62～64所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.1中位置关系如图1所示。
序列2：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.19～22所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.65～67所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.2中位置关系如图2所示。
序列3：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.23～26所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.68～70所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.3中位置关系如图3所示。
序列4：氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.27～29和SEQ ID NO.18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.71～73所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.4中位置关系如图4所示。
序列5：氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.30～32和SEQ ID NO.18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.74～76所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.5中位置关系如图5所示。
序列6：氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.33～35和SEQ ID NO.18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.77～79所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.6中位置关系如图6所示
序列7：氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.36～38和SEQ ID NO.18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.80～82所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.7中位置关系如图7所示。
序列8：氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.83～85所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.8中位置关系如图8所示。
序列9：氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.86～88所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.9中位置关系如图9所示。
序列10：氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.43～45所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.89～91所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.10中位置关系如图10所示。
序列11：氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.92～94所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.11中位置关系如图11所示。
序列12：氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.48～50和SEQ ID NO.18所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.95～97所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.12中位置关系如图12所示。
序列13：氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.51～54所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.98～100所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.13中位置关系如图13所示。
序列14：氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，其中4个框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.55～58所示；3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.101～103所示；铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示。所述框架区、互补决定区和铰链区在SEQ ID NO.14中位置关系如图14所示。
实施例9 ELISA鉴定单克隆噬菌体活性
将由实施例8确定的纳米抗体(SEQ ID NO.1～14)对应的单克隆噬菌体分别进行扩增，然后利用ELISA鉴定其和抗原的结合活性。
用巯基结合板作为基质，固载抗原PTH-C，0.01μg/mL，100μL/孔，室温慢摇2h，TBS洗板3次，拍干；依次用1mM的巯基乙醇和1％无蛋白封闭液封闭；分别加入等量的待测单克隆噬菌体(实施例8中扩增的噬菌体)，用干净的LB培养基作阴性对照，37℃慢摇孵育1h，用TBST清洗；加入稀释10000倍的一抗(抗T7尾丝的鼠源抗体，购自Merck Millipore)，100μL/孔，37℃孵育1h，用TBST清洗；加入稀释1000倍的带有辣根过氧化物酶的二抗(羊抗鼠抗体，购自ThermoFisher)，100μL/孔，37℃孵育2h，用TBST清洗；加入100μL/孔TMB工作液，暗处静置20min后，加入50μL/孔2M的硫酸终止反应，450nm检测吸光值。图19是不同单克隆噬菌体的ELISA结果，SEQ ID NO.1～14所示抗体对抗原PTH都具有较好的结合活性，其中SEQ ID NO.1、3、4、5、7、9、10、11、12、13、14这11种具有较高的结合活性。
实施例10 亲和常数的估算
T7噬菌体表面展示的纳米抗体数量并不一致，不是单分子层吸附，不符合朗缪尔吸附，因此纳米抗体以噬菌体状态存在时测其亲和常数难度相当大，本实施例用ELISA的方法结合统计学的思路进行估算，得到亲和常数的数量级。
(1)提出模型假设：
①由于空间位阻以及尽可能使模型简单化，可以假设抗原及噬菌体1:1反应。②抗原全部被固载至巯基结合板上。因为包被抗原浓度很低，已经超出了一般试剂盒的检测范围，试图用差量法或者直接检测包被抗原量很难，因此只能是尽量降低抗原浓度，认为其全部被固载至板上。本小节包被抗原分子个数6.4×109个/孔，巯基结合板上马来酰亚胺亚胺活性位点3.2×1013个/孔，而且半胱氨酸和马来酰亚胺反应极易进行，因此该假设可以成立。③假设固载的抗原表现出自由抗原一样的活性，亲和常数公式同样适用于固载的抗原。④假设反应达到平衡之后，结合上的T7噬菌体不因后续清洗而脱落。
(2)实施步骤：
与实施例9中ELISA加入一抗之前的步骤一样，只是抗原包被浓度为0.001μg/mL。封闭完成后加入噬菌体的浓度依次为6.5×1010、3.25×1010、1.3×1010、6.5×109、3.25×109、1.3×109、8.71×108、6.5×108、1.3×108、1.3×106、1.3×104个/mL，100μL/孔。噬菌体结合完成后，要收集残留液测滴度，利用差量法计算噬菌体的结合量。
(3)计算方法：
由反应得到
其中，a：加入T7的个数
c：固定化抗原的个数，根据假设，该值近似于最初投入抗原的个数
b：反应平衡后，生成结合物的个数，即结合的T7个数，可由差量法测得
Ka：亲和常数，单位M-1
固定抗原浓度不变即c不变，改变T7的加入量，可以得到一系列的a和b值，代入公式1，就可以得到一系列的Ka值(图20)。由图20可见，不管T7的投入量是多少，计算得到的亲和常数都在1010M-1上下波动，没有低于109M-1。
Claims (5)
1.一种抗甲状旁腺激素的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示；
其中：
SEQ ID NO.1包括由SEQ ID NO.15～18组成的框架区、由SEQ ID NO.62～64组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.2包括由SEQ ID NO.19～22组成的框架区、由SEQ ID NO.65～67组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.3包括由SEQ ID NO.23～26组成的框架区、由SEQ ID NO.68～70组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.4包括由SEQ ID NO.27～29和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.71～73组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.5包括由SEQ ID NO.30～32和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.74～76组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.6包括由SEQ ID NO.33～35和和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.77～79组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.7包括由SEQ ID NO.36～38和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.80～82组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.8包括由SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40组成的框架区、由SEQ ID NO.83～85组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.9包括由SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ ID NO.86～88组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.10包括由SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45组成的框架区、由SEQ ID NO.89～91组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.11包括由SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ ID NO.92～94组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.12包括由SEQ ID NO.48～50和SEQ ID NO.18组成的框架区、由SEQ IDNO.95～97组成的互补决定区和SEQ ID NO.59所示的铰链区；
SEQ ID NO.13包括由SEQ ID NO.51～54组成的框架区、由SEQ ID NO.98～100组成的互补决定区和SEQ ID NO.60所示的铰链区；
SEQ ID NO.14包括由SEQ ID NO.55～58组成的框架区、由SEQ ID NO.101～103组成的互补决定区和SEQ ID NO.61所示的铰链区。
2.权利要求1所述的纳米抗体在制备检测甲状旁腺激素的试剂或去除甲状旁腺激素的试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述去除甲状旁腺激素的试剂为甲状旁腺激素吸附剂。
4.权利要求1所述的纳米抗体在制备治疗高表达甲状旁腺激素的疾病药物中的应用。
5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，甲状旁腺激素为人甲状旁腺激素。
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