CN115028719A - 血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用，其中，血清白蛋白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8，其氨基酸序列如Seq.ID No.1所示，纳米抗体Nb8不仅对牛血清白蛋白具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白和人血清白蛋白均有较好的结合活性，具有较好的广谱使用范围，能够有效应用于制备增强药物半衰期的药物中以及制备肿瘤细胞成像的试剂中。

Description

血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米抗体技术领域，尤其涉及一种血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用。
背景技术
增加药物在血液循环的时间，是发挥药物的作用的一个重要前提，各种纳米抗体偶联药物的一个重要缺陷就是较短的半衰期，这主要是由于纳米抗体相关药物较小的分子量导致的肾脏的快速清除。通过使用与血清白蛋白偶联或与血清白蛋白结合蛋白偶联进行修饰，可以直接增加药物整体分子量，使其超过肾脏对蛋白滤过的阈值（＞40-50kDa，2-6nm），同时实现通过新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor, FcRn）进行再循环，从而整体导致药物半衰期延长，同时也增加药物效率，并减少药物的使用量。各种通过与血清白蛋白结合多肽、蛋白甚至抗体对药物进行修饰，已经被大量使用。
纳米抗体(nanobody, Nb)是在重链抗体可变区片段 (variable domain of theheavy chain of heavychain antibody, VHH) 基础上改造成一种仅由重链可变区组成的单域抗体 (single domain antibody, sdAb)，即重链单域抗体；其相对分子量约为15KD,只有普通抗体的1/10左右。纳米抗体天然存在于羊驼和鲨鱼等血液中。纳米抗体虽然小，相对于普通抗体，纳米抗体仅有3个互补决定区(complementarity determining region,CDR)，但是却具备较好的特异抗原结合能力和高亲合力，是具有完整生物学功能的最小单位抗体。这种特殊结构不仅具有普通纳米抗体的优势，而且还具备一些独特性。首先，纳米抗体只有一个结构域，没有普通抗体的Fc段，不会出现由Fc段引起的补体效应。其次是纳米抗体的VHH中的部分疏水基团被亲水基团取代，使得纳米抗体的水溶性大大增加，可以大大提高作为药物的利用率；纳米抗体能够识别独特的构造表位，比常规抗体有更广泛的抗原识别能力，同时纳米抗体有着较长的CDR3, 可形成稳定的暴露的凸环结构，能够深入抗原内部以更好的结合抗原从而提高了其抗原特异性和亲和力,因此纳米抗体VHH单域具有更加广泛的抗原结合力。最后，由于纳米抗体分子质量小，且纳米抗体于与人类抗体的VH序列高度同源，所以纳米抗体对人体的免疫原性较弱，纳米抗体重复给药一般不会引起任何体液和细胞的免疫应答。
同时纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入实体肿瘤而发挥作用，纳米抗体也可以透过血脑屏障，可以开发出一系列诊断和治疗脑部疾病的显影剂和新药；纳米抗体分子质量小，结构简单，由单一基因编码，很容易在大肠杆菌和酵母等微生物中大量表达，其制作成本低，简单方便，可以在短时间内获得功能性抗体制剂。
通过与血清白蛋白结合的纳米抗体对药物进行修饰，也正逐渐被用于各种药物修饰，尤其是纳米抗体偶联药物，通过与血清白蛋白纳米抗体进行融合，再将细胞毒性药物进行偶联，不仅可以增强半衰期，同时可以极大减少药物使用量，同时可增强药物的吸收，最大程度发挥药物的药效。由于人、牛、鼠的血清蛋白基因具有高度同源性，因此通过筛选其中任何一种血清白蛋白结合的纳米抗体，均有可能拓展应用到各种动物模型和人体。
因此，迫切需要开发出新的可以与牛血清白蛋白同时也与小鼠和人血清白蛋白均结合的纳米抗体，用于增强各种药物的半衰期。
发明内容
本申请的目的在于提供一种血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏与牛血清白蛋白同时也与小鼠和人血清白蛋白均结合的用于增强各种药物的半衰期纳米抗体的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请公开了一种血清白蛋白结合纳米抗体，所述血清白蛋白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8，且，所述纳米抗体Nb8的氨基酸序列如Seq.ID No.1所示。
第二方面，本申请公开了一种血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
采用免疫管法对羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行富集筛选，得到噬菌体文库；
将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增，并进行测序，根据测序结果合成丰度占比前10的纳米抗体的基因序列；
将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化、筛选，得到血清白蛋白结合纳米抗体。
第三方面，本申请公开了血清白蛋白结合纳米抗体在制备增强药物半衰期的药物中的应用。
第四方面，本申请公开了血清白蛋白结合纳米抗体在制备肿瘤细胞成像的试剂中的应用。
本申请第一方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8，其氨基酸序列如Seq.ID No.1所示，纳米抗体Nb8不仅对BSA具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin, MSA）和人血清白蛋白（human serum albumin,HAS）均有较好的结合活性，具有较好的广谱使用范围，能够有效应用于制备增强药物半衰期的药物中以及制备肿瘤细胞成像的试剂中。
本申请第二方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，该制备方法基于噬菌体纳米抗体文库，完成三轮对牛血清白蛋白的筛选（Bovine serum albumin，BSA）蛋白，通过深度测序、序列合成、克隆、表达、纯化，得血清白蛋白结合纳米抗体；该制备方法利用噬菌体在宿主菌中快速复制的生物特性，能够快速、高通量地筛选与特定蛋白结核的纳米抗体，制备方法快速、简便，有利于大量筛选，提高了筛选效率。
本申请第三方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体在制备增强药物半衰期的药物中的应用，由于得到的纳米抗体Nb8不仅对BSA具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin, MSA）和人血清白蛋白（human serum albumin,HAS）均有较好的结合活性，因此，适用于制备增强药物半衰期的药物。
本申请第四方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体在在制备肿瘤细胞成像的试剂中的应用，由于得到的纳米抗体Nb8不仅对BSA具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin, MSA）和人血清白蛋白（human serum albumin,HAS）均有较好的结合活性，因此，适用于制备肿瘤细胞成像的试剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1为实施例1的血清白蛋白纳米抗体的筛选分析图。
图2为实施例1的BSA结合纳米抗体深度测序分析图。
图3为实施例1的BSA Nb8纳米抗体与对照纳米抗体SDS-PAGE 电泳结果分析图。
图4为实施例1的BSANb8纳米抗体与对照纳米抗体His 抗体鉴定分析图。
图5为实施例1的BSANb8纳米抗体与对照纳米抗体HA 抗体鉴定分析图。
图6为实施例1的Nb8号纳米抗体与三种来源血清白蛋白的ELISA结合验证分析图。
图7为实施例1的Nb8号纳米抗体与牛血清白蛋白的亲和力测定分析图。
图8为实施例1的Nb8号纳米抗体与人血清白蛋白的亲和力测定分析图。
图9为实施例1的Nb8号纳米抗体与鼠血清白蛋白的亲和力测定分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例第一方面提供了一种血清白蛋白结合纳米抗体，所述血清白蛋白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8，且，所述纳米抗体Nb8的氨基酸序列如Seq.ID No.1所示。
本申请第一方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8，其氨基酸序列如Seq.ID No.1所示，纳米抗体Nb8不仅对BSA具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin, MSA）和人血清白蛋白（human serum albumin,HAS）均有较好的结合活性，具有较好的广谱使用范围，能够有效应用于制备增强药物半衰期的药物中以及制备肿瘤细胞成像的试剂中。
在一些实施例中，血清白蛋白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8，其氨基酸序列如Seq.ID No.1所示，Seq.ID No.1具体如下：
MAVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIIFRFRTISWYRQAPGKQRELVASISGGSSTSYADTVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYFCHMSRYRSGWYDSWGQGTQVTVSS。
在一些实施例中，所述纳米抗体Nb8的碱基序列如SEQ ID NO.9所示，Seq.ID No.9具体如下：
ATGGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCATCTTCAGATTCAGAACCATATCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAAGTATTAGTGGCGGCAGTAGCACGTCCTATGCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATCTATTTCTGTCACATGTCCAGGTACCGTAGTGGCTGGTACGACTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
在一些实施例中，所述纳米抗体Nb8包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。
其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2具体如下：AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS。
FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3具体如下：WYRQAPGKQRELVASI。
FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4具体如下：ADTVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYFCH。
FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5具体如下：WGQGTQVTVSS。
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6具体如下：GIIFRFRTIS。
CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，SEQ ID NO.7具体如下：SGGSSTSY。
CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，SEQ ID NO.8具体如下：MSRYRSGWYDS。
本申请实施例第二方面提供了一种血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
S01. 采用免疫管法对羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行富集筛选，得到噬菌体文库；
S02. 将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增，并进行测序，根据测序结果合成丰度占比前10的纳米抗体的基因序列；
S03. 将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化、筛选，得到血清白蛋白结合纳米抗体。
本申请第二方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，该制备方法基于噬菌体纳米抗体文库，完成三轮对牛血清白蛋白的筛选（Bovine serum albumin，BSA）蛋白，通过深度测序、序列合成、克隆、表达、纯化，得血清白蛋白结合纳米抗体；该制备方法利用噬菌体在宿主菌中快速复制的生物特性，能够快速、高通量地筛选与特定蛋白结核的纳米抗体，制备方法快速、简便，有利于大量筛选，提高了筛选效率。
步骤S01中，采用免疫管法对羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行富集筛选，得到噬菌体文库。
在一些实施例中，采用免疫管法对羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行富集筛选的步骤中，包括：提供目的蛋白，将所述目的蛋白包被在免疫管上，进行2~3轮富集筛选。经过多轮富集，确保得到的文库容量大，更有利于进行阳性克隆子的筛选。
在一些实施例中，所述目的蛋白的浓度为25~30 ug/ml。
步骤S02中，将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增，并进行测序，根据测序结果合成丰度占比前10的纳米抗体的基因序列。
步骤S03中，将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化、筛选，得到血清白蛋白结合纳米抗体。
在一些实施例中，所述表达载体选自PET-14B载体。将纳米抗体的基因序列克隆至pColdII载体中得到重组质粒；进一步的，在克隆过程中同时融合表达血凝素标签（hemagglutinin HA tag）用于后续检测。
在一些实施例中，所述宿主细胞选自大肠杆菌，将重组质粒转入大肠杆菌细胞中诱导表达并进行纯化。
在一些实施例中，将重组质粒转入大肠杆菌细胞中诱导表达并进行纯化，步骤如下：a），使用0.2mM浓度的IPTG在16℃低温进行诱导；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000 W进行破菌；c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5 mL流速/分钟，每1mL收集一次。
本申请实施例第三方面提供了血清白蛋白结合纳米抗体在制备增强药物半衰期的药物中的应用。
本申请第三方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体在制备增强药物半衰期的药物中的应用，由于得到的纳米抗体Nb8不仅对BSA具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin, MSA）和人血清白蛋白（human serum albumin,HAS）均有较好的结合活性，因此，适用于制备增强药物半衰期的药物。
本申请实施例第四方面提供了血清白蛋白结合纳米抗体在制备肿瘤细胞成像的试剂中的应用。
本申请第四方面提供的血清白蛋白结合纳米抗体在在制备肿瘤细胞成像的试剂中的应用，由于得到的纳米抗体Nb8不仅对BSA具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin, MSA）和人血清白蛋白（human serum albumin,HAS）均有较好的结合活性，因此，适用于制备肿瘤细胞成像的试剂。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
血清白蛋白结合纳米抗体Nb8及其制备方法
试验步骤：
（1）BSA纳米抗体的筛选
采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2X109。筛选步骤如下：a)，将目的蛋白按25ug/ml浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；b)，使用第三轮噬菌体洗脱液进行PCR扩增；d)，将PCR产物进行深度测序，进行生物信息学分析，将丰度前十的纳米抗体序列进行排序。
（2）BSA纳米抗体的表达纯化
将纳米抗体基因序列克隆入PET-14B载体，同时融合表达血凝素标签（hemagglutinin HA tag）用于后续检测。表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，使用0.2mM浓度的IPTG在16℃低温进行诱导；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000 W进行破菌；c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5 mL流速/分钟，每1mL收集一次，得到血清白蛋白结合纳米抗体Nb8。
（3）纳米抗体的ELISA实验
将HA标签融合到纳米抗体基因编码序列里，表达具有HA标签的纳米抗体，ELISA板分别包被牛、鼠和人血清白蛋白蛋白，封闭，之后加入各种浓度的纳米抗体在室温孵育1小时，PBS漂洗3次，anti-HA抗体室温孵育1小时后，辣根过氧化物酶标记的抗HA抗体放大信号，TMB显色，同时做无关纳米抗体的对照和无关蛋白抗原的空白对照。
（4）表面等离子共振实验（surface plasmon resonance，SPR）
此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白直接相互作用，并计算二者的平衡常数。纯化抗原蛋白被固定在芯片上，不同浓度的纳米抗体按顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力，记录360秒内的反应信号，制作动力学曲线，计算各相关参数。
结果分析：
1. BSA/HSA/MSA结构域的纯化和纳米抗体的筛选
三种BSA/HSA/MSA分子量均为65kDa左右（图1的A），经过以BSA为靶点，三轮天然羊驼纳米抗体文库的筛选，三轮筛选后，噬菌体滴度结果显示文库被富集超过200倍，提示有与BSA结合的纳米抗体被扩增（图1的B）。
2. BSA结合纳米抗体的深度测序分析
对第三轮筛选的文库进行了PCR扩增，之后进行深度测序，通过对20M数据的生信分析，提取所有编码纳米抗体的基因序列，共获得超过六百万条特异性序列，按照出现频率进行排序，将前Top10的序列进行重点分析（如图2）。
3. BSA纳米抗体的纯化与鉴定
通过原核表达纯化对深度测序第8号纳米抗体进行了表达纯化，并通过HA-tag和His-tag的抗体进行western-blot鉴定。SDS-PAGE表明8号纳米抗体大小约为15 kDa（图3），纯化的8号纳米抗体进行HA-tag（图4）和His-tag（图5）的免疫印迹检查，确认纳米抗体表达正确。
4.BSA Nb8 纳米抗体的ELISA结合验证
通过ELISA检测发现Nb8号纳米抗体同时与BSA/HAS/MSA具有结合活性，而对照抗体与BSA/MSA/HAS均不显示结合活性（图6）。
5. Nb8号纳米抗体进一步通过SPR决定其与三种来源的血清白蛋白的亲和常熟，如图7~9所示，结果表明Nb8与BSA/HSA /MSA的结合亲和常数分别为6.08nM、14.5nM、5.59nM。
综上，本申请提供的纳米抗体Nb8不仅对BSA具有较高的亲和力，同时对小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin, MSA）和人血清白蛋白（human serum albumin,HAS）均有较好的结合活性，具有较好的广谱使用范围，能够有效应用于制备增强药物半衰期的药物中以及制备肿瘤细胞成像的试剂中。

Claims (10)

1. 一种血清白蛋白结合纳米抗体，其特征在于，所述血清白蛋白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8，且，所述纳米抗体Nb8的氨基酸序列如Seq.ID No.1所示。
2. 根据权利要求1所述的血清白蛋白结合纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体Nb8包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3. 根据权利要求1所述的血清白蛋白结合纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体Nb8的碱基序列如SEQ ID NO.9所示。
4.一种权利要求1~3任一所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用免疫管法对羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行富集筛选，得到噬菌体文库；
将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增，并进行测序，根据测序结果合成丰度占比前10的纳米抗体的基因序列；
将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化、筛选，得到血清白蛋白结合纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，其特征在于，采用免疫管法对羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行富集筛选的步骤中，包括：提供目的蛋白，将所述目的蛋白包被在免疫管上，进行2~3轮富集筛选。
6. 根据权利要求5所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白的浓度为25~30 ug/ml。
7.根据权利要求4所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述表达载体选自PET-14B载体。
8.根据权利要求4所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌。
9.权利要求1~3任一所述的血清白蛋白结合纳米抗体在制备增强药物半衰期的药物中的应用。
10.权利要求1~3任一所述的血清白蛋白结合纳米抗体在制备肿瘤细胞成像的试剂中的应用。
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