CN115917061A - 用于生成纳米抗体的快速单步梯度法 - Google Patents
用于生成纳米抗体的快速单步梯度法 Download PDFInfo
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Abstract
公开了一种用于快速生成针对任何抗原的纳米抗体(VHH)的快速单步梯度方法，其中该方法包括通过以下步骤从纳米抗体表达文库中分离针对特定抗原的纳米抗体：(a)将目的抗原结合由允许蛋白质结合的聚合物制成的珠粒上；(b)将表达文库的微生物与步骤(a)中的珠粒一起温育；(c)将步骤(b)中的珠粒放在具有密度大于或等于1g/mL的惰性介质的管上，并以150‑250g的速度离心45秒至2分钟；(d)丢弃具有游离微生物的上清液部分，并获得带有结合微生物的珠粒，这些微生物对应于表达识别抗原的VHH的那些。
Description
技术领域
本发明涉及用于快速分离针对任何抗原的纳米抗体的新的一步快速梯度法。
现有技术
一些天然存在的抗体缺乏轻链，称为单域抗体(HCAb)。它们来源于IgG，并且被发现遍布于骆驼科。骆驼科包括骆驼、单峰骆驼、美洲驼、骆马
原驼(guanaco)和羊驼。HCAb的抗原结合片段包含由3个高变区(CDR)组成的单可变VHH结构域。被分离后，VHH结构域也称为纳米抗体。来源于骆驼科HCAb的靶向特异性纳米抗体是在用抗原加佐剂免疫后获得的。我们的平台开发了一种改进的程序，用于通过使用羊驼作为供体物种获得纳米抗体。
为了分离免疫后产生的靶向特异性纳米抗体的基因序列，我们必须首先分离外周B细胞以获得总RNA，然后进行cDNA制备以最终扩增纳米抗体区。编码纳米抗体的cDNA片段短至360nt，并且从免疫的羊驼的120ml血液中可以获得多达～3x106个个体克隆。细菌或酵母可视化系统用于克隆各种完整的个体纳米抗体，产生称为的纳米抗体或VHH文库。
微生物展示技术允许纳米抗体在微生物表面表达，并且因此研究人员可以借助于亲和纯化来分离和富集在它们的表面上表达目标纳米抗体的细菌或酵母。最终分离的纳米抗体在细菌中重组表达，并且其结合能力可以通过ELISA和定量生化参数诸如ITC进行表征。除了靶向免疫外，还可以使用非常大的纳米抗体文库(1x109)来使用随机法找到结合纳米抗体。然后以可再生和经济的方式生产纳米抗体。
事实上，发明人证明，通过使用普通试剂和常规离心机，可以用本发明的方案以快速和经济的方式选择针对来自细菌展示文库的特定抗原的特异性纳米抗体。此过程可能也适用于酵母展示文库。
今天，比现代历史上任何时候都更迫切需要诊断和中和措施来控制全球大流行。重组抗体，包括羊驼纳米抗体，是应对这一挑战的绝佳候选者。然而，生产经典的纳米抗体的过程需要几个月的时间，例如，完全免疫平均需要8周，然后建立纳米抗体文库并选择克隆的亲和力，即使通过使用先进的组合测序和质谱技术，也需要大约6个月的时间(Pardon,Els,et al."A general protocol for the generation of Nanobodies for structuralbiology."Nature protocols 9.3(2014):674-693)or classical phage presentationtechniques(Verheesen,P.,&Laeremans,T.(2012).Selection by phage display ofsingle domain antibodies specific to antigens in their native conformation.InSingle Domain Antibodies(pp.81-104).Humana Press,Totowa,NJ.)。
在这里，我们优化了一种简单、快速且廉价的密度梯度方法，用于选择与目的抗原结合的纳米抗体。
纳米抗体
在自然界中，存在一些例外的功能抗体，其没有轻链，被称为单域抗体(HCAb)。它们来源于真正的IgG2和IgG3型IgG，在整个骆驼科中都有发现，也存在于护士鲨、须鲨科(orectolobid)以及或许斑点鼠鱼(spotted ratfish)中。骆驼科包括骆驼、单峰骆驼、美洲驼、骆马
原驼(guanaco)和羊驼。HCAb的抗原结合片段包含由3个高变区组成的单可变VHH结构域。被分离后，VHH结构域也称为纳米抗体。来源于骆驼科HCAb的靶标特异性纳米抗体通常是在用最辅助的靶蛋白免疫后获得的。对纳米抗体结构的分析揭示了高变区如何在细胞核结构之外的环中突出。
我们发现在纳米抗体的优点中有它们的体积小、它们可以被人源化、它们在水性溶液中结构和行为稳定、它们与单个靶蛋白的特异性的结合和高亲和力以及它们的通过骆驼科的自然产生。因此，纳米抗体是当今可用于基于亲和力的诊断和治疗的最佳工具。
这里详细总结了纳米抗体的优点和用途。
纳米抗体的优点
纯化
与任何其他抗体来源相比，纳米抗体的纯化简单。它们通常表达附着在亲和标签诸如6x组氨酸标签，以允许亲和纯化。富集通常在细菌周质中建立，其中氧化环境允许形成适当的二硫键。可以在一升培养物中分离几毫克，并使用标准生化技术对重组的分离的纳米抗体进行进一步分离。
稳定性
纳米抗体是小而紧凑的多肽，并且通常在细菌的周质中表达。与人VH相比，它们从6℃开始在高温下非常稳定，并且还可以抵抗变性化学剂。此外，纳米抗体结构的分子工程化表明，当在位置54和78处引入半胱氨酸以形成额外的二硫键时，稳定性会增加。有趣的是，由此产生的超稳定纳米抗体对蛋白酶诸如胃蛋白酶或糜蛋白酶也更具抗性。
免疫的隐蔽性
纳米抗体可以用作针对肿瘤、病原体和慢性疾病的治疗子弹，但是，作为外来蛋白质，它们本身可以触发针对它们自己的免疫应答。幸运的是，体积小、从血液中快速清除以及与VH重链的人类可变区的高度同源性使它们免疫原性小。在纳米抗体和人OAB之间只有少数氨基酸不同，用人氨基酸代替骆驼氨基酸已被用于人源化骆驼科纳米抗体，并使它们在治疗中更加安全。
可及性
纳米抗体是严格的单体，它们对底物的亲和力取决于三个高变环的突出。因此，纳米抗体趋于与多肽的空间结构腔相互作用，但不能有效地与肽相互作用。例如，几个已经鉴定的纳米抗体直接阻断活性酶位点。一些FC5纳米抗体甚至可以通过转胞吞作用穿过血脑屏障和部分地形成用于治疗方法的双特异性抗体。52.53.最后，分子可及性会影响对大分子复合物的接近。
纳米抗体的用途
细胞生物学和分子生物学工具
在基因组测序之后，新的领域开始获得版图：蛋白质组和相互作用物组。蛋白质的相互作用伙伴定义了它的几种调节功能和机制。今天，基于蛋白质组学方法的现代工具可以准确地识别相互作用体，即使它们处于低浓度。然而，限制步骤是，如何选择性地富集特定蛋白质及其相互作用物。纳米抗体已被用于以特定方式通过蛋白质的亲和力来纯化，并且甚至用于检测翻译后修饰。然而，可用的纳米抗体数量非常有限，并且需要更多。纳米抗体可用于各种实验环境诸如ELISA、免疫沉淀、CHIP-seq、免疫染色、通过募集降解机制以及阻断和激活细胞途径来诱导特定蛋白质的降解。从羊驼获得的纳米抗体特异性地识别绿色荧光蛋白，称为GFP陷阱系统，基于其非凡的亲和力和结合GFP融合蛋白的能力，成为相互作用和蛋白质组学研究的一线工具。今天，它甚至可以与CRISPR/Cas9组合使用，用于从内源性标记的蛋白质中提取GFP。GFP纳米抗体也可以与荧光染料偶联，在GFP水平非常低时，通过显微术方法检测GFP。
结构研究
当纳米抗体结合三维结构时，靶蛋白的某些性质会发生变化。共同特征之一是纳米抗体通过促进独特的构象步骤来限制靶蛋白的构象变化。令人惊讶的是，这些现象对结晶的可能性产生了积极影响，因此，已经使用纳米抗体作为促进蛋白质结晶的辅助剂。
诊断学
纳米抗体是用于诊断的优质工具。其无限的体外生产能力使纳米抗体比传统抗体更可靠，并且不受批次制备或动物血清限制的影响。可以生产纳米抗体作为与用于染色或直接可视化的信息肽或蛋白质融合的蛋白质，包括亲和标签(Flag、HA、V5和cMyc)、荧光蛋白(GFP、RFP等)和用于比色测量的酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)。例如，通过使用纳米抗体进行特异性固定或使用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的特异性纳米抗体进行检测，可以改进ELISA测定。
纳米抗体满足成功的分子成像的理想探针的大多数要求。通过使用体内纳米抗体，已经成功地将几种成像技术诸如SPECT、PET、光学成像和超声应用于分子成像。在SPECT中，将特异性靶向纳米抗体偶联至全身施用的辐照源γ。然后在全身扫描仪中检测纳米抗体。PET策略类似于SPECT，但使用正电子发射放射性核素标记的纳米抗体。这些成像技术用于动物模型中的各种肿瘤诊断技术：例如，抗EGFR纳米抗体可以用于检测人鳞状细胞癌和人前列腺癌。在另一个特殊案例中，他们已经使用靶向碳酸酐酶IX(CAIX)的纳米抗体和与不同荧光团偶联的人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的组合。作者在此得出结论，同时检测多种临床相关肿瘤标志物的表达状态可以更好地检测原发性肿瘤以及它们的转移。
今天，癌症生存的最佳机会是早期发现和及时手术。因此，基于纳米抗体的体内检测是未来最有前途的抗癌技术之一。
治疗
在针对不同病毒的不同实验性治疗应用的背景下，已经开发了几种纳米抗体：HIV、乙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒和PERV。令人惊奇的是，纳米抗体可以中和HIV感染；使用从患者身上分离的HIV抑制了细胞至细胞的传播。由于纳米抗体在人体中的免疫反应性低，它们可以注射到患者中，几乎没有或没有副作用。为了使它们更有效和更具特异性，可以连接纳米抗体以产生二价、多价和/或多特异性纳米抗体，或与其他纳米抗体或循环蛋白诸如白蛋白组合以增加它们的周转和治疗效果。狂犬病毒在人中引起致命的脑部感染。暴露后不久，施用免疫球蛋白和血浆来源的疫苗预防狂犬病。通常，这在被可能感染的动物攻击之后立即进行。抗狂犬病纳米抗体可以在动物模型中显著延长生存期或者甚至完全治愈疾病。呼吸道合胞病毒(RSV)是儿童住院的主要原因之一，每年有超过190万的1岁以下的儿童被感染，有超过30万的5岁以下儿童住院。目前尚无RSV治疗。然而，基于三价纳米抗体的治疗正处于II期临床试验中。由Ablynx开发的RSV疗法ALX-0171的绝对新颖之处在于直接中和受感染实验动物肺中的病毒。纳米抗体通过雾化给药，并且将病毒滴度降低10000倍。纳米抗体也用于癌症的免疫治疗。
根据上述，允许快速选择与目的抗原具有亲和力的VHH的方法诸如本发明的方法，在产生这些纳米抗体的工业中具有很大的应用，用于已经描述的所有用途。
附图说明
图1使用密度梯度分离进行VHH分离的方案示意图：将表达细菌表面上的VHH的细菌展示文库(I)与被目的抗原包被的常规琼脂糖珠短暂温育(II)。在将混合物沉积在Ficoll密度梯度锥形管(III)中并以200g离心1min之后，具有表达特定VHH的细菌的珠粒立即通过顺序密度梯度选择移动到管底部，而未结合的细菌保留在梯度表面上。接下来，将珠粒重悬，并且(IV)在琼脂平板中分离温育的细菌克隆。
图2在孔径为0.2μm的硝酸纤维素膜中刺突SARS-CoV2的免疫检测，以本发明的VHH为一抗，然后是小鼠抗Myc和偶联HRP的山羊抗小鼠IgG。它包括用本发明方法选择的不同纳米抗体的每个反应的照片，以及定性评估(+，++，+++)。
图3通过使用Nb No.34、小鼠抗myc和偶联HRP的抗小鼠，针对重组和合成的多聚泛素链的点印迹。Nb No.34在具有标签6xHis和Myc的质粒pNae2(与紧密黏附素(intimin)融合)中表达。
图4通过使用Nb No.34、小鼠抗myc和小鼠抗HRP，针对重组和合成的多聚泛素链的蛋白质印迹。通过使用具有在6xHis和Myc之间的Nb编码序列的pNae2(没有紧密黏附素)，在BL21细胞中表达Nb No.34。
具体实施方式
本发明允许针对任何类型的抗原诸如通常是蛋白质或分子等的病毒、细菌或微生物，快速、容易地获得纳米抗体。但由于其速度快，本发明的方法对于针对新出现的疾病的病原体诸如COVID产生纳米抗体非常有效。
本发明涉及从纳米抗体表达文库中分离针对特定抗原的纳米抗体(VHH)的方法，其中该方法包括以下步骤：
(a)将目的抗原结合允许蛋白质结合的聚合物珠粒
(b)将所述表达文库的微生物与步骤(a)的所述珠粒温育，其中所述表达文库对应于用对应于先前用所述目的抗原免疫的产生VHH的动物的VHH结构域的cDNA片段，或合成文库转化的微生物；
(C)将步骤(b)的珠粒放入具有密度大于或等于1g/mL的惰性介质的管中，并以150至250g之间的速率离心45s至2分钟；
d)将具有游离微生物的上层部分和上清液丢弃，并且获得带有连接的微生物的珠粒，所述微生物对应于表达识别抗原的VHH的那些微生物。
其中使用的珠粒是琼脂糖、纤维素、乳胶、琼脂糖或镍，并且可以被修饰以结合蛋白质，并且具有大于在(c)中使用的培养基的密度。这些珠粒在2至12小时之间的时间内以稳定的方式与目的抗原结合，然后通过该技术中可用的任何方式阻断未与抗原反应的位点。
珠粒和抗原之间的键可以是非共价共价的。
其中阶段(c)的这种惰性介质优选选择Ficol、percol或蔗糖。
为确保表达文库中的微生物是在表达VHH，应在步骤(b)之前用蛋白质表达诱导剂对它们进行2至4小时的处理。在一种实施方式中，蛋白质表达诱导剂是浓度在20至100μM之间的IPTG。随后在步骤(b)中，将表达文库的微生物与附着抗原的珠粒一起在室温下温育20至60分钟。
最后，在密度梯度中分离后，在步骤(d)中，用PBS洗涤珠粒并接种在具有培养基的琼脂平板上以获得分离的菌落。其中每个菌落对应于表达能够结合目的抗原的VHH的微生物。
首先，你必须有纳米抗体或VHH文库。
如果你想自己生成此文库，则需要纯化的抗原，该抗原可以通过杆状病毒、细菌、酵母的表达系统获得或直接从其天然来源获得。接下来，产生纳米抗体的动物，诸如羊驼或美洲驼，用50至500μg的抗原免疫一到四次。免疫后针对抗原的羊驼血清的免疫应答可以通过斑点印迹分析快速地和定性地观察，斑点印迹分析通过将表位固定在硝酸纤维素膜上以及通过使用羊驼血清作为一抗的来源来进行；或通过使用固定在ELISA板的完全抗原和羊驼血清作为一抗来源的ELISA分析地和比较地观察。因此，快速建立个体纳米抗体克隆的细菌展示文库。
一旦获得文库，将本发明的方法应用于基于密度梯度的纳米抗体的选择，例如简单地使用Ficoll、percol或蔗糖。Ficoll是在世界范围内可用的廉价的试剂，通常用于血液样本的破碎。本发明人开发的本发明的方法，其灵感来自主要的观察：红细胞积聚在Ficoll密度梯度的底部，而PBMC保留在上层部分中。
本发明人使用由聚合物诸如常规琼脂糖凝胶(sepharose)或琼脂糖制成的珠粒创造了一种方法，该方法在密度梯度中，诸如通过Ficoll试剂获得的密度梯度表明所选珠粒的密度适合于在15ml管的底部沉淀。同时，本发明人表明，当对游离细菌进行相同的测试时，细菌保留在上层部分中。揭示了在密度梯度中将游离细菌与表达VHH并结合具有抗原的珠粒的细菌分离的可能性。
为了获得VHH或纳米抗体的特异性克隆，通常使用细菌展示系统，其中每个细菌在IPTG诱导后在其外部细菌膜中表达单一类型的纳米抗体。因此，发明人获得了包被有目的抗原的sefarose珠粒，以结合在它们的表面上表达针对所述抗原的特异性纳米抗体的个体细菌。因此，表达与抗原结合的VHH或纳米抗体的细菌会沉入密度梯度的底部，而未结合的细菌将保留在上层部分中(图1)。
实施例
实施例1本发明的简单密度梯度法及其在获得针对SARS-CoV-2刺突蛋白的纳米抗体中的用途
首先，本发明人获得了在杆状病毒表达系统中产生的冻干SARS-CoV-2刺突蛋白。在免疫之前，通过SDS-Page和考马斯染色测试刺突的蛋白完整性(图1a)。用100μg的完整的刺突蛋白对叫做Buddha(图1b)的羊驼免疫两次。免疫前羊驼血清的免疫应答揭示了针对刺突蛋白幸运的基础交叉反应。然后，在第二次免疫后，通过将表位固定在硝酸纤维素膜上并使用羊驼血清作为一抗的来源，通过Dotblot分析快速定性地观察到羊驼血清中IgG抗体的显著增加(图1c)。此外，本发明人通过使用固定在ELISA板上的完整刺突蛋白并且通过使用羊驼血清作为一抗来源，通过ELISA(分析地和比较地)验证了IgG抗体的增加(图1d)。因此，本发明人快速建立了细菌展示文库，该文库由2.3x106个具有0.7％载体连接的个体纳米抗体克隆组成。
建立免疫和VHH文库
羊驼免疫过程遵循智利南方大学生物伦理委员会制定的“研究中的动物使用”协议。免疫前一天，收集5ml的血液进行免疫前血清检测。使用100μg的全长SARS-CoV2刺突蛋白(SINOBiological)进行免疫(第1天)。将冷的冻干蛋白溶解在无菌水中以1:1稀释的2ml的佐剂(兽用疫苗佐剂，GERBU FAMA)中，并在雄性羊驼(Vicugna pacos)中皮下注射。在羊驼的四个不同位置注射4ml的总体积。在第一次免疫后七天收集5ml血液样本。在第14天，再次用100μg刺突免疫羊驼，并且在第15天在含有3.8％柠檬酸钠作为抗凝剂的管中收集来自颈静脉的120ml血液样本。将未凝血样与相同体积的不含钙的HBSS培养基(Gibco)混合，分成10ml的等分试样，并在15ml无菌Falcon管中的每个等分试样的顶部加入5ml的Ficoll-Paque Premium(GE Healthcare)。离心(1,200×rpm、80min、室温)之后，从相间回收PBMC部分，通过离心(3,500×rpm，10min)在HBSS中洗涤两次，重悬于4ml的无菌PBS 1x(Gibco)中。RNA提取和cDNA生产分别使用商业RNeasy Mini(Qiagen)试剂盒和QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)进行。在具有寡核苷酸CALL001(5'-GTC CTG GCT CTC TTC TAC AAG G-3')和CALL002(5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3')的50μl的总PCR反应体积中，将大约2μl的每个合成的cDNA用作模板(Conrath et al.,2001)。在1.2％(w/v)低熔点琼脂糖凝胶中，将对应于VHH-CH2结构域的～0.6kb的扩增片段和对应于常规VH-CH1-CH2结构域的～0.9kb的扩增片段进行分离，并纯化～0.6kb带(QIAEX II凝胶提取试剂盒，Qiagen)。将该片段用作具有寡核苷酸VHH-Sfi2(5'-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCGGCC ATG GCT CAG GTG GA-3')和VHH-Not2(5'-GGA CTA GTG CGG CCG CTG AGAG AGA CGG TGA CCT GG T-3')的第二次PCR反应中的模板，以最终获得～0.4kb的扩增片段，对应于VHH结构域。将扩增的VHH片段用SfiI和NotI(Thermo Scientific)限制性酶消化，并在纯化的pNeae2载体的相同位点结合(Salema等人，2016)。连接在大肠杆菌DH10B-T1 R细胞中经受电穿孔，达到2.3×106个个体克隆的文库大小，如通过接种在30℃下温育的具有2％w/v葡萄糖的LB-氯霉素琼脂平板上所确定的。在没有DNA插入的情况下平行进行的对照连接估计，再连接载体少于0.7％。从平板上刮下转化的细菌，并在-80度下储存在含有30％甘油的LB肉汤中。
获得文库后，本发明人应用本发明方法使用Ficoll基于简单的密度梯度进行纳米抗体选择。(图1e)。
将表位与珠粒偶联
使用前立即用2mL的冷的1mM HCI洗涤1ml NHS活化的琼脂糖4快速流动(FastFlow)珠粒(General Electric)，然后用1X冷的无菌PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤5次。将在PBS1X中的200μg的纯化蛋白加入到珠粒中，并旋转温育到第二天。通过加入终浓度为0.5M的乙醇胺来阻断在培养基中未反应的基团。用PBS 1X洗涤珠粒5次，并在4℃下储存。
密度梯度分离
将文库中的1mL的甘油原液接种在含有20ml的具有25μg/mL氯霉素和2％葡萄糖的LB培养基的烧瓶中。将烧瓶在37℃下以200rpm搅拌温育(预接种)过夜。用卡那霉素抗性质粒(对照)转化的对照细菌重复相同的程序。将预接种物沉淀并重悬于具有25μg/mL氯霉素的LB培养基中，并且然后在具有25μg/mL氯霉素且没有葡萄糖的100ml的新鲜LB培养基中稀释至在600nm处的0.02光密度，在37℃下以200rpm搅拌温育直至达到600nm的0.45至0.6的光密度。加入IPTG至终浓度为50μM，以在30℃和200rpm下诱导蛋白质表达3小时。对文库和对照细菌培养物的OD600 nm的吸光度进行测量。用10mL的1X过滤的PBS洗涤50mL的两种培养物三次。始终在3000x g下离心5分钟。将两种培养物重悬于10ml的PBS 1X的最终体积中。将2ml的文库培养物和2ml的对照培养物混合(如果最终600nm光密度相同，如果不同，则根据OD调整对照细菌的体积以确保等数量的细菌)，并在环境温下在摇摆平台上的15mL锥形管中与偶联表位的300μL珠粒温育30min。将混合物加入在15ml锥形管中的6ml Ficoll(Ficoll-PaqueTM PLUS GE医疗保健)中，并以200xg离心1min。将未结合的部分被丢弃(上层部分)。
可见的珠粒沉积物含有表达结合抗原的VHH的细菌，在本例中是Sars-CoV2刺突。将该沉淀物重悬于4ml的PBS 1X中，并在室温下旋转5min。将该步骤重复六次，以消除未附着至珠粒的任何细菌。
为了扩增附接珠粒的细菌，加入1mL的LB培养基并在室温下温育5min，然后将50μL接种在具有25μg/mL氯霉素和2％葡萄糖的LB琼脂平板上，在37℃下温育直到第二天(推荐>20小时)。
其中获得的每个菌落对应于包含特异性地结合目的抗原的纳米抗体或VHH的细菌。
选定的VHH与SARS-CoV-2刺突的结合测试
为了验证本发明的纳米抗体是否结合刺突蛋白，对22种纳米抗体进行了免疫印迹，这些纳米抗体面对在人类细胞中在天然病毒条件下表达的刺突GFP(图2)。
据观察，通过本发明的方法选择的所有纳米抗体都附接在SARS-CoV-2的刺突抗原上。结果表明，本发明的方法允许快速有效地选择与目的抗原诸如SARS-CoV2刺突特异性结合的纳米抗体。
泛素
泛素是UBL家族的创始成员。它参与许多生物过程，但其研究最多的效应是它与其他蛋白质的共价结合，其靶向用于蛋白酶体介导的降解的修饰的蛋白质。泛素是真核生物中最保守的蛋白质之一，然而，它既不存在于细菌中，也不存在于古细菌中。在人类中，泛素的14个拷贝从不同的基因座表达。泛素转化为无活性的前体，其通过由负责泛素底物去泛素化的相同的酶对在其氨基酸甘氨酸76之后立即进行蛋白酶切而被激活。成熟且活跃的泛素是一种由76个氨基酸(～8KDa)组成的小球状蛋白质[107]。泛素对蛋白质的共价修饰(泛素化)定义为在靶蛋白中赖氨酸的ε-氨基基团与泛素的C端甘氨酸(G76)之间形成异肽键。泛素化以调节生物过程的不同方式发生。它改变了靶蛋白的特异性性质，这取决于i)靶蛋白本身和ii)泛素结合的方式。蛋白质与单个泛素分子的泛素化(单泛素化)已被描述为调节生物过程诸如胞吞作用、运输和基因表达调节。
为了举例说明本发明的方法，开发了针对泛素的VHH。
实施例2本发明的简单密度梯度法及其在获得针对泛素的纳米抗体中的用途
首先，发明人获得了各种多聚泛素链(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)。用100μg的K48多聚泛素链对叫做Nick的羊驼免疫四次。然后，在第三次免疫后，通过将表位固定在硝酸纤维素膜上并使用羊驼血清作为一抗的来源，通过斑点印迹分析快速定性地观察到羊驼血清中IgG抗体的显著增加。因此，本发明人快速建立了细菌展示文库，该文库由1x106个具有1.2％载体连接的个体纳米抗体克隆组成。
建立免疫和VHH文库
羊驼免疫过程遵循智利南方大学生物伦理委员会制定的“研究中的动物使用”协议。免疫前一天，收集5ml的血液进行免疫前血清检测。对于免疫(第1天)，使用了100μg的多聚泛素k48链。将冷的冻干蛋白溶解在无菌水中以1:1稀释的2ml的佐剂(兽用疫苗佐剂，GERBU FAMA)中，并在雄性羊驼(Vicugna pacos)中皮下注射。在羊驼的四个不同位置注射4ml的总体积。在第一次免疫后七天收集5ml血液样本。在第14天，再次用100μg的多聚泛素k48链免疫羊驼并且在第四次免疫之前进行了另外两次免疫，在第四次免疫后的第二天在含有3.8％柠檬酸钠作为抗凝剂的管中收集来自颈静脉的120ml的血液样本。文库的生成方式与实施例1所示相同。
一旦获得文库，本发明人应用本发明的方法基于简单的密度梯度进行纳米抗体选择。
将表位与珠粒偶联
使用前立即用2mL的冷的1mM HCI洗涤1ml的NHS活化的琼脂糖4快速流动(FastFlow)珠粒(General Electric)，然后用冷的无菌PBS洗涤5次。将在PBS1X中的200μg的多聚泛素k48链加入到珠粒中，并旋转温育到第二天。通过加入终浓度为0.5M的乙醇胺来阻断在培养基中未反应的基团。用PBS 1X洗涤珠粒5次，并在4℃下储存。
密度梯度分离
将文库中的1mL的甘油原液接种在含有20ml的具有25μg/mL氯霉素和2％葡萄糖的LB培养基的烧瓶中。将烧瓶在37℃下以200rpm搅拌温育(预接种)过夜。用卡那霉素抗性质粒(对照)转化的对照细菌重复相同的程序。将预接种物沉淀并重悬于具有25μg mL-1氯霉素的LB培养基中，并且然后在具有25μg mL-1氯霉素且不具有葡萄糖的100ml的新鲜LB培养基中稀释至0.02OD 600nm，在37℃下以200rpm搅拌温育直至达到OD 600nm的0.45至0.6。加入IPTG至终浓度为50μM，以在30℃和200rpm下诱导蛋白质表达3小时。对文库和对照细菌培养物的OD600 nm的吸光度进行测量。用10mL的过滤的PBS 1C洗涤50mL的两种培养物三次。始终在3000x g下离心5min。将两种培养物重悬于10ml的PBS1X的最终体积中。将2ml的文库培养物和2ml的对照培养物混合(如果最终600nm光密度相同，如果不同，则根据光密度调整对照细菌的体积以确保等数量的细菌)，并与在旋转平台上的15mL锥形管中偶联至表位的300μL的NHS珠粒在室温下温育30min。将混合物加入在15ml锥形管中的6ml Ficoll(Ficoll-PaqueTM PLUS GE医疗保健)中，并以200xg离心1min。将未结合的部分丢弃(上层部分)。
可见的珠粒沉积物含有表达结合抗原——在本例中是泛素——的VHH的细菌。将该沉淀物重悬于4ml的PBS1X中，并在室温下旋转5min。将该步骤重复六次，以消除未附着至珠粒的任何细菌。
为了扩增附接珠粒的细菌，加入1mL的LB培养基并在室温下温育5min，然后将50μL接种在装有25μg/mL氯霉素和2％葡萄糖的LB琼脂平板上，在37℃下温育直到第二天(推荐>20小时)。
其中获得的每个菌落对应于包含特异性地结合目的抗原的纳米抗体或VHH的细菌。
抗原结合的确认。
细菌展示系统在融合内含肽(intein)蛋白和myc标签的细菌表面上表达纳米抗体。优化缓冲条件以从细菌膜中提取纳米抗体-内含肽融合物，直接使用细菌提取物通过斑点印记来确认与多聚泛素链的结合。在使用我们的简单密度梯度方案选择纳米抗体之后，使用100个菌落接种液体LB培养基并且另外诱导内含肽纳米抗体的表达。在优化条件下裂解细胞，并且将提取物用作纳米抗体的来源，作为一抗用于通过在硝酸纤维素膜中固定的各种多聚泛素链的斑点印迹进行有效结合抗体的筛选。
通过用小鼠抗myc抗体和偶联抗小鼠HRP的抗体顺序温育揭示了它们。
通过这种方式，能够鉴定出Nb.No.34，其能够识别通过斑点印迹(图3)和还通过蛋白质印迹(图4)测试的所有泛素链。这在具有6xHis和Myc标签的质粒pNae2(与紧密黏附素(intimin)融合)中表达，并且然后通过镍亲和色谱纯化。为了进行蛋白质印迹，将不同的多聚泛素链在12％聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，以及然后通过电转移转移到硝酸纤维素膜上，该膜与Nb.No.34的提取物一起温育，并且依次与抗myc抗体和偶联HRP的抗小鼠抗体温育。
因此，本发明证明了可用于快速有效地选择与目的抗原特异性结合的纳米抗体。
Claims (11)
1.-一种从纳米抗体表达文库中分离针对特定抗原的纳米抗体(VHH)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)将目的抗原结合由结合蛋白质的聚合物制成的珠粒
(b)将所述表达文库的微生物与步骤(a)的所述珠粒温育，其中所述表达文库对应于用对应于先前用所述目的抗原免疫的产生VHH的动物的VHH结构域的cDNA片段，或合成文库转化的微生物；
(c)将步骤(b)的所述珠粒放入具有密度大于或等于1g/mL的惰性介质的管中，并以150至250g之间的速率离心45s至2分钟；
d)将具有游离微生物的上层部分和上清液丢弃，并且获得带有连接的微生物的珠粒，所述微生物对应于表达识别抗原的VHH的那些微生物。
2.-根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述珠粒是琼脂糖、纤维素、胶乳、琼脂糖或镍并且被修饰以结合蛋白质。
3.-根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述珠粒中具有大于在(c)中使用的所述介质的密度。
4.-根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中所述惰性介质是反应性Ficol、percol或蔗糖。
5.-根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述珠粒或等价物在2至12小时之间的时间里稳定结合所述目的抗原。
6.-根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将不与所述抗原反应的位点阻断。
7.-根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)之前用蛋白质表达诱导剂处理所述表达文库的微生物2至4小时。
8.-根据权利要求书6所述的方法，其特征在于，所述蛋白质表达诱导剂是浓度在20至100μM之间的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)。
9.-根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中在室温下温育20至60分钟。
10.-根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，用PBS洗涤所述珠粒并接种在具有培养基的琼脂平板上以获得分离的菌落。
11.-根据权利要求9所述的方法，其特征在于，每个菌落对应于表达能够结合所述目的抗原的VHH的微生物。
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