JP5770092B2 - ヒトhig1ポリペプチドに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
配列番号7のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
配列番号8のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
配列番号10のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
配列番号11のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
配列番号12のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトHIG1ポリペプチドに対するモノクローナル抗体であって、ヒトHIG1ポリペプチドの1-19位のアミノ酸配列に含まれる少なくとも一つのエピトープに結合することを特徴とする。
本発明の細胞株は、上記モノクローナル抗体を産生することを特徴とする。
本発明のDNAは、上記モノクローナル抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードする塩基配列からなることを特徴とする。
本発明の試薬は、ヒトHIG1ポリペプチドを検出するための試薬であって、上記モノクローナル抗体又は抗体断片を含むことを特徴とする。
本発明の方法は、ヒトHIG1ポリペプチドを検出する方法であって、上記モノクローナル抗体又は抗体断片を使用することを特徴とする。
本発明の検査試薬は、低酸素状態、低グルコース状態又は虚血状態の検査試薬であって、上記モノクローナル抗体又は抗体断片を含むことを特徴とする。
(1)抗原の調製
1-1) ヒトHIG1部分ペプチド(20アミノ酸)の合成
ヒトHIG1ポリペプチドの1-19位のアミノ酸配列のN末に、キャリアタンパク質複合体形成用にシステインを付加した部分ペプチドCMSTDTGVSLPSYEEDQGSK(配列番号13)(20アミノ酸)(以後、HIG1p20と略す)を、株式会社東レリサーチセンター(東京)にペプチド合成を委託し作製した(純度98%)。
ハプテン−キャリアタンパク質複合体作製キット(PIEERCE Biotechnology社、No.77607、MBS法)を用いて、HIG1p20とキャリアタンパク質との複合体作製を行った。即ち、10 mg/mLのマレイミド活性化キャリアタンパク質0.2 mLと1 mg/mLのHIG1p20合成ペプチド0.2 mLを混合し、室温で2時間静置し反応した。その後、10 mMリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4(PBS)で4℃、24時間透析を行った。キャリアタンパク質としてキーホールリンペット・ヘモシアニン(KLH)あるいは牛血清アルブミン(BSA)を用いた。
2 mg/mLの抗原(HIG1p20-KLH)を、等量のフロイント完全アジュバント(CFA)(SIGMA社製、F-5881)と混合してエマルジョンを作製したのち、0.1 mL(抗原0.1 mg)/匹ずつ、BALB/cマウス(雌、6〜8週齡)の尾根部皮内に免疫した。2週間後、0.1 mg/mLの抗原と等量のAlumアジュバント(PIERCE社製、77140)との混合液を0.2 mL(抗原0.01 mg)/匹ずつ腹腔内に追加免疫を行った。初回免疫時から1〜2週間間隔で尾静脈より採血を行い、抗体価の確認を行った。
抗体価は酵素免疫測定法(ELISA)を用いて測定した。すなわち、抗原としてHIG1p20-BSAを10μg/mL(50 mM炭酸緩衝液、pH9.6、SIGMA、No.C3041)の濃度で50μL/wellずつ、室温で96ウェルプレート(IWAKI、No.3801-096)にコーティングした。0.05w/v% Tween20を含むPBS(PBS-T)で3回洗浄後、10v/v% Fetal Bovine Serum(10%FBS)を含むPBSで1時間ブロッキングした。ブロッキング液を吸入除去後、10% FBSを含むPBS-T(10% FBS-PBS-T)で段階(2百倍、2千倍、2万倍)希釈したマウス血清を50μL/wellずつ入れて室温で1時間静置した。
抗体価の上昇が確認されたマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞X-63-Ag8.653とを、5:1の割合でセンダイウイルス・エンベロープ(Hemagglutinating virus of Japan envelope; HVJ-E)法(石原産業株式会社製、GenomONE-CF細胞融合用キット, No.CF004)により細胞融合し、HAT(Gibco、No.21060-017)およびHT(Gibco、No.11067-030)を含む10% FBS含有RPMI-1640培地(SIGMA、No.R8785)でハイブリドーマの選択培養を行った。細胞融合10〜12日目にハイブリドーマ培養上清を回収し、抗体価の測定(前記(3)参照)と同様の手法でELISAによるスクリーニングを行った。
(1)形質転換体の作製
本実施例において、HIG1は特に言及しない限りヒトHIG1を示す。
プレートに出現した1コロニーを100 mLのLB培地に添加し、フラスコ内37℃、300 rpmで一晩培養を行った。上記の培養液全量を1.5LのLB培地に混合し、37℃、150 rpmでOD600=0.6まで培養した。15℃にて30分静置後、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)(ナカライテスク社)を終濃度0.5 mMとなるよう添加し15℃で約16時間フラスコ内で振とう培養した。遠心分離した菌体の湿重量を測定し、湿菌体1 gあたり5 mLの超音波破砕用バッファー(50 mM Tris-HCl(pH8.0)、0.15 M NaCl、1 mM EDTA)に懸濁した。氷冷下で超音波破砕(15秒、インターバル30秒、5セット)後、TritonX-100を0.2w/v%となるように添加し、4℃で30分間転倒混和した。菌体破砕液を4℃、10000gで 30分遠心後、その遠心上清を0.45μmフィルターをパスさせた。GST-HIG1-FlagのGSTとHIG1-Flagの間には、PreScission Protease認識配列が存在するので、以下の手順でGSTの切断を行い、HIG1-Flagを調製した。即ち、GSTカラム(GSTrap FF、GE Healthcare社 No.17-5130-01)に、フィルターでパスした菌体破砕液、PreScission Protease反応溶液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.15 M NaCl、1mM EDTA、1mM DTT)、PreScission Protease(GE Healthcare社No.27-0843-01)溶液を順次通し、カラムを4℃で一晩静置しGSTを切断した後、GSTカラムにPreScission Protease反応溶液を加え、HIG1-Flag溶液を回収した。この溶液を透析膜(Spectra/Por6 MWCO:1000、Spectrum Laboratories Inc.、No.132636)を用いてPBSに置換することによってHIG1-Flag溶液を得た。
本実施例では、モノクローナル抗体のHIG1ポリペプチドに対する特異性をELISA競合反応試験により確認した。
本実施例では、モノクローナル抗体のウエスタンブロッティングでの反応性を確認した。
本実施例では、細胞に遺伝子導入し発現させたHIG1分子への反応性を確認した。
ISK-MMH-TK1およびISK-MMH-TK2の可変領域の遺伝子配列を以下の方法により解析した。
L鎖(ISK-MMH-TK1, ISK-MMH-TK2共通) cgactagtcgactggtgggaagatggatacag(配列番号14)
ISK-MMH-TK1のH鎖 cgacaagtcgactagcccttgaccaggcatcc(配列番号15)
ISK-MMH-TK2のH鎖 cgactagtcgactagcctttgacaaggcatcc(配列番号16)
L鎖(ISK-MMH-TK1,ISK-MMH-TK2共通) ctgwtgttctggattcctg(配列番号17) 及び cgactagtcgactggtgggaagatggatacag(配列番号14、逆転写にも使用)
ISK-MMH-TK1のH鎖 ctcctgtcaktaactkcaggt(配列番号18) 及び cgacaagtcgactagcccttgaccaggcatcc(配列番号15、逆転写にも使用)
ISK-MMH-TK2のH鎖 tgttgacagycvttcckggt(配列番号19) 及び cgactagtcgactagcctttgacaaggcatcc(配列番号16、逆転写にも使用)
※w=a又はt, k=t又はg, y=t又はc, v=a, c又はg
L鎖(ISK-MMH-TK1,ISK-MMH-TK2共通) ctgwtgttctggattcctg(配列番号17) あるいは cgactagtcgactggtgggaagatggatacag(配列番号14)
ISK-MMH-TK1のH鎖 ctcctgtcaktaactkcaggt(配列番号18) あるいは cgacaagtcgactagcccttgaccaggcatcc(配列番号15)
ISK-MMH-TK2のH鎖 tgttgacagycvttcckggt(配列番号19) あるいは cgactagtcgactagcctttgacaaggcatcc(配列番号16)
ctgwtgttctggattcctgCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAActgtatccatcttcccaccagtcgactagtcg(配列番号20)
ctcctgtcaktaactkcaggtGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTAAATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTAGTAGGTATGACCAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGTTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGACTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGggatgcctggtcaagggctagtcgacttgtcg(配列番号21)
ctgwtgttctggattcctgCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAATTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTACTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTTCCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCCGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTAAATATGTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAActgtatccatcttcccaccagtcgactagtcg(配列番号22)
tgttgacagycvttcckggtATCCTGTCTGATGTGCAGCTTCAGGACTCAGGACCTGGTCTGGTGAAACCTTCTCAGACAGTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCATCTCCATCACCACTGGAAATTTCAGATGGAGCTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATAGGGTACATATACTACAGTGGTACCATTACCTACAATCCATCTCTCACAAGTCGAACCACCATCACTAGAGACACTTCCAAGAACCAATTCTTCCTGGAAATGAACTCTTTGACTGCTGAAGACACAGCCACATACTACTGTGCACGAGAACTCTACGGCTACGGGTACTTCGATGTCTGGGCCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTACAACAACAGCCCCATCTGTCTATCCCTTGGTCCCTGGCTGCAGTGACACATCTGGATCCTCGGTGACACTGggatgccttgtcaaaggctagtcgactagtcg(配列番号23)
LXFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPVD*S(配列番号24)
LLSXTXGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTKYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGSRYDQKFRGKATLTVDKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYYCARDFVYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKG*STC(配列番号25)
LXFWIPASSSDVVMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSTQSLVHSNGNTYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSKYVPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPVD*S(配列番号26)
LTXXXGILSDVQLQDSGPGLVKPSQTVSLTCTVTGISITTGNFRWSWIRQFPGNKLEWIGYIYYSGTITYNPSLTSRTTITRDTSKNQFFLEMNSLTAEDTATYYCARELYGYGYFDVWAAGTTVTVSSATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKG*STS(配列番号27)
※Xは混合プライマーの2種類以上の塩基(w=a又はt, k=t又はg, y=t又はc, v=a, c又はg)に相当する部分である。
※ *は終止コドンである。
重鎖CDR1:KYTMHG(配列番号1)
重鎖CDR2:INPNNGGSRYDQKFRG(配列番号2)
重鎖CDR3:DFVY(配列番号3)
軽鎖CDR1:RSSQSIVHSNGNTYLE(配列番号4)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号5)
軽鎖CDR3:FQGSHVP(配列番号6)
重鎖CDR1:TGNFRWS(配列番号7)
重鎖CDR2:YIYYS GTITYNPSLTS(配列番号8)
重鎖CDR3:RELYGYGYFDV(配列番号9)
軽鎖CDR1:RSTQSLVHSNGNTYLH(配列番号10)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号11)
軽鎖CDR3:SQSKYVP(配列番号12)
Claims (14)
- ヒトHIG1ポリペプチドに対するモノクローナル抗体であって、ヒトHIG1ポリペプチドの1-19位のアミノ酸配列に含まれる少なくとも一つのエピトープに結合し、全長ヒトHIG1ポリペプチドに対する解離定数(Kd)が9×10 -10 M以下である抗体。
- 重鎖及び軽鎖の可変領域が以下のCDRを有する、請求項1に記載の抗体:
配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。 - 重鎖及び軽鎖の可変領域が以下のCDRを有する、請求項1に記載の抗体:
配列番号7のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
配列番号8のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
配列番号10のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
配列番号11のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
配列番号12のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体から得られる抗原結合性の抗体断片。
- 標識化又はタグ化された請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
- 標識化又はタグ化された請求項4に記載の抗体断片。
- 請求項2又は3に記載の抗体をコードする塩基配列からなるDNA。
- 請求項7に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
- 受託番号FERM BP-11266又はFERM BP-11267のハイブリドーマ。
- 請求項1〜3及び5のいずれか一項に記載の抗体又は請求項4若しくは6に記載の抗体断片を含むヒトHIG1ポリペプチドを検出するための試薬。
- 請求項11に記載の試薬を含む測定キット。
- 請求項1〜3及び5のいずれか一項に記載の抗体又は請求項4若しくは6に記載の抗体断片を用いたヒトHIG1ポリペプチドの検出方法。
- 請求項1〜3及び5のいずれか一項に記載の抗体又は請求項4若しくは6に記載の抗体断片を含む低酸素状態、低グルコース状態又は虚血状態の検査試薬。
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