JP5683466B2 - 抗psk抗体 - Google Patents
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(2)前記配列番号38で表されるアミノ酸配列、配列番号42で表されるアミノ酸配列、配列番号46で表されるアミノ酸配列、配列番号54で表されるアミノ酸配列、配列番号58で表されるアミノ酸配列、及び配列番号62で表されるアミノ酸配列の少なくとも1以上のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたそれぞれのアミノ酸配列からなる、重鎖相補性決定領域1のポリペプチド、重鎖相補性決定領域2のポリペプチド、及び重鎖相補性決定領域3のポリペプチドを含む重鎖可変領域ドメイン、並びに軽鎖相補性決定領域1のポリペプチド、軽鎖相補性決定領域2のポリペプチド、及び軽鎖相補性決定領域3のポリペプチドを含む軽鎖可変領域ドメインを有する。すなわち、前記(2)の態様においては、前記(1)の態様の抗体を構成するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたものである。
本発明に係る抗PSK抗体の一実施形態を説明するに先立って、本発明の理解を容易にするために、抗体についての一般的な説明を以下に記載する。
(抗PSK抗体の概要)
続いて、本発明の抗PSK抗体の一実施形態を実施形態1として以下に説明する。抗PSK抗体は、PSKを認識する。PSKは、カワラタケ菌CM101株〔FERM−P2412(ATCC20547)〕の菌糸体を水系溶媒、例えば、熱水又はアルカリ溶液(例えば、アルカリ金属の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液)で抽出し、精製した後に乾燥して得ることができる。主要画分の糖部分はβ−D−グルカンで、このグルカン部分の構造はβ1→3、β1→4及びβ1→6結合を含む分枝構造であり、主な構成単糖はグルコースやマンノースであり、約18〜38%のタンパク質を含む。タンパク質の構成アミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の酸性アミノ酸と、バリンやロイシン等の中性アミノ酸が多く、リジンやアルギニン等の塩基性アミノ酸は少ない。水に可溶であるが、メタノール、ピリジン、クロロホルム、ベンゼン又はヘキサンには殆ど溶けない。
PSKは、抗腫瘍作用を有しており、腫瘍の化学療法において抗腫瘍剤として用いることができる。PSKの抗腫瘍作用には、PSKの「細胞障害活性」、「TGF−β1阻害活性」、「PDGF阻害活性」、又は「サイトカイン産生誘導活性」が含まれ、それらの少なくとも1つの活性、又はそれらの組み合わせにより、PSKの抗腫瘍作用が発揮される。
続いて、抗PSK抗体の構造について以下に説明する。
例えば、抗PSK抗体の第1の実施態様(以下、実施態様(A)と称する)として、以下の重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインを有する抗体を挙げることができる。この実施態様(A)の抗体は、後述の実施例に記載の2G9抗体に代表されるものである。その重鎖可変領域ドメインは、好ましくは配列番号6で表されるアミノ酸配列(SYGMS)からなるH−CDR1のポリペプチド、配列番号10で表されるアミノ酸配列(TISSGGSYTYYPDSVKG)からなるH−CDR2のポリペプチド、配列番号14で表されるアミノ酸配列(RITTVVARSFYFDY)からなるH−CDR3のポリペプチドを含む。また、この抗体の軽鎖可変領域ドメインは、好ましくは配列番号22で表されるアミノ酸配列(RASKSVSTSGYSYMH)からなるL−CDR1のポリペプチド、配列番号26で表されるアミノ酸配列(LVSNLES)からなるL−CDR2のポリペプチド、配列番号30で表されるアミノ酸配列(QHIRELTRS)からなるL−CDR3のポリペプチドを含む。
更に、抗PSK抗体の第2の実施態様(以下、実施態様(B)と称する)として、以下の重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインを有する抗体を挙げることができる。この実施態様(B)の抗体は、後述の実施例に記載の5G5抗体に代表されるものである。その重鎖可変領域ドメインは、好ましくは配列番号38で表されるアミノ酸配列(GYTMN)からなるH−CDR1のポリペプチド、配列番号42で表されるアミノ酸配列(LINPYNGGTSYNQKFKG)からなるH−CDR2のポリペプチド、配列番号46で表されるアミノ酸配列(GGKFATGTSY)からなるH−CDR3のポリペプチドを含む。また、この抗体の軽鎖可変領域ドメインは、好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列(RSSTGAVTTSNYAN)からなるL−CDR1のポリペプチド、配列番号58で表されるアミノ酸配列(GTNNRAP)からなるL−CDR2のポリペプチド、配列番号62で表されるアミノ酸配列(ALWYSNHWV)からなるL−CDR3のポリペプチドを含む。
抗PSK抗体の第3の実施態様〔以下、実施態様(C)と称する〕として、実施態様(A)の抗PSK抗体(例えば、2G9抗体)とエピトープへの結合が競合する抗体を挙げることができ、特には、実施態様(A)の抗PSK抗体(例えば、2G9抗体)が、結合するPSKのエピトープと同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。
抗PSK抗体の第4の実施態様(以下、実施態様(D)と称する)として、実施態様(B)の抗PSK抗体(例えば、5G5抗体)とエピトープへの結合が競合する抗体を挙げることができ、特には、実施態様(B)の抗PSK抗体(例えば、5G5抗体)が、結合するPSKのエピトープと同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。
抗PSK抗体は、ポリクローナル抗体、モノスペシフィック抗体、モノクローナル抗体を含むが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、抗PSK抗体を産生する動物種も限定されるものではなく、哺乳類(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ラクダ、ブタ、イヌ、及びネコなど)、両生類(例えば、アフリカツメガル)、鳥類(例えば、ニワトリ)、軟骨魚類、及び硬骨魚類などを挙げることができる。
抗PSK抗体は、免疫抗原としてPSKを用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、KoehlerとMilsteinの方法(Nature 256:495−497,1975)に従って、作製することができる。抗PSK抗体を取得するための免疫抗原は、カワラタケ菌CM101株〔FERM−P2412(ATCC20547)〕の菌糸体を水系溶媒、例えば、熱水又はアルカリ溶液(例えば、アルカリ金属の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液)で抽出し、精製した後に乾燥して得たものであり、抗腫瘍活性を有するものであれば、特に限定せずに用いることができる。
キメラ抗体は、抗PSK抗体の重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインを、ヒト抗体以外の哺乳類の定常領域のポリペプチドと結合させることによって作製することもできる。更には、抗PSK抗体の重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインを、IgW、IgNAR、IgX、又はIgYの定常領域のポリペプチドと結合することによっても作製することができる。また、CDRグラフト化抗体は、抗PSK抗体の3つの重鎖相補性決定領域及び3つの軽鎖相補性決定領域を、ヒト抗体以外の哺乳類のフレームワーク領域と結合させることによって作製することもできる。更には、抗PSK抗体の重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインを、IgW、IgNAR、IgX、又はIgYのフレームワーク領域のポリペプチドと結合することによっても作製することができる。
本発明の抗原結合性断片は、前記の各抗PSK抗体のFab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片を意味する。これらの抗原結合性断片は、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素(例えば、ペプシン又はパパイン等)によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。なお、本明細書において、「抗原結合性断片」とは、PSKのエピトープに結合することのできる抗体の断片を意味する。また、遺伝子組換えにより調製される、前記ディアボディー、単一鎖抗体分子、及び抗体断片から形成されたマルチ特異性抗体も、抗原結合性断片に分類されることがある。
[2]PSKの分析方法
本発明のPSKの分析方法および分析キットについて、実施形態2として以下に説明する。なお、本実施形態において用いられる用語は、特に断りのない限り、実施形態1において用いた意味と同様の意味で用いられている。まず、PSKの分析方法について以下に説明する。
本実施形態のPSKの分析キットは、実施形態1において説明した抗PSK抗体又はそれらの抗体の抗原結合性断片を含むことを特徴とする分析キットである。PSKの分析キットは、特に、生理活性を示すPSKを分析することができる。また、PSKの分析キットは、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法(SPR法:Biacore法)、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、又はウエスタンブロット法などに用いるキットが含まれる。
抗体の作製は、(1)抗原の免疫、(2)抗血清の抗体価の測定、(3)抗PSKモノクローナル抗体の作製の順に行った。以下、順に手順の概要を説明する。
(1)抗原の免疫:第1回免疫として、PSKのリン酸緩衝化生理食塩水(phosphate buffered saline;以下、「PBS」とする。)溶液とFreund’s Complete Adjuvant(シグマ−アルドリッチ社製)とを等量混合し、超音波発生器を用いて高粘性のエマルジョン液を調製した。6週齢の雌性Balb/cマウス(オリエンタル酵母株式会社)に、このエマルジョン液をPSK量が0.1mg/匹となるように、皮下注射した。1週間後に第2回目の免疫を行った。PSKのPBS溶液とFreund’s Incomplete Adjuvant(シグマ−アルドリッチ社製)とを混合してエマルジョン液を調製した。PSK量が0.1mg/匹となるように腹腔内注射した。1週間ごとに同じ手順で免疫を行い、第8回目の免疫後、尾静脈より採血して力価の測定を行った。抗体価の上昇が認められた個体について、PSKを腹腔内注射することによりブーストを行った後に、ハイブリドーマ取得のために細胞融合を行った。
2G9抗体及び5G5抗体の特異性を調べるために、多糖類であるラミナリン、イーストグルカン、及びデキストラン、並びにPSK及びカワラタケ熱水・アルカリ抽出物を用いて競合ELISAを行った。なお、ラミナリン、イーストグルカン、及びデキストランはシグマ社から購入したものを用いた。
2G9抗体及び5G5抗体のエピトープの競合試験を行った。PSKを1μg/wellの濃度で、96ウエルプレートに4℃で一晩コート後、1%BSAでブロッキングしてPSKを固相化したプレートを作製した。0.1、0.5、1、5μg/mLの2G9抗体を添加して、25℃で3時間インキュベートした。TBSTで各ウエルを3回洗浄した後、0.5μg/mL濃度に調製したHRP標識5G5抗体溶液を添加して、25℃で1時間インキュベートした。TBSTで各ウエルを3回洗浄した後、基質であるABSTを加え、15分間程度発色させた。Peroxidase Stop Solutionで発色反応を停止させた後、プレートリーダーを用いて、405nmの吸光度を測定した。その結果、図5に示すように、5G5抗体の結合は2G9抗体により抑制されなかったことから、2G9抗体と5G5抗体のエピトープは近傍に存在しないことが分かった。
2G9抗体又は5G5抗体を産生するハイブリドーマから、定法によりtotal RNAを抽出し、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反を行いcDNAを作製した。得られたcDNAから、可変領域遺伝子を増幅するためにmouse Ig primer set(Novagen社)を用いて、そのプロトコールに従いPCRを行った。得られた抗体可変領域遺伝子はpCR2.1ベクターにTAクローニングしてシーケンスの決定を行った。2G9抗体の重鎖可変領域ドメイン、及び軽鎖可変領域ドメインのヌクレオチドの塩基配列、及び5G5抗体の重鎖可変領域ドメイン、及び軽鎖可変領域ドメインのヌクレオチドの塩基配列を図6に示す。また、それぞれの抗体のH−FR1、H−CDR1、H−FR2、H−CDR2、H−FR3、H−CDR3、及びH−FR4、並びにL−FR1、L−CDR1、L−FR2、L−CDR2、L−FR3、L−CDR3、及びL−FR4のアミノ酸配列を以下に示す。
H−FR1 :GVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(配列番号4)
H−CDR1:SYGMS(配列番号6)
H−FR2 :WVRQTPDKRLEWVA(配列番号8)
H−CDR2:TISSGGSYTYYPDSVKG(配列番号10)
H−FR3 :RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR(配列番号12)
H−CDR3:RITTVVARSFYFDY(配列番号14)
H−FR4 :WGQG(配列番号16)
L−FR1 :GSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISY(配列番号20)
L−CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号22)
L−FR2 :WNQQKPGQPPRLLIY(配列番号24)
L−CDR2:LVSNLES(配列番号26)
L−FR3 :GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(配列番号28)
L−CDR3:QHIRELTRS(配列番号30)
L−FR4 :EGGP(配列番号32)
H−FR1 :GVHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFT(配列番号36)
H−CDR1:GYTMN(配列番号38)
H−FR2 :WVKQSHGKNLEWIG(配列番号40)
H−CDR2:LINPYNGGTSYNQKFKG(配列番号42)
H−FR3 :KATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAR(配列番号44)
H−CDR3:GGKFATGTSY(配列番号46)
H−FR4 :WGQG(配列番号48)
L−FR1 :GAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTC(配列番号52)
L−CDR1:RSSTGAVTTSNYAN(配列番号54)
L−FR2 :WVQEKPDHLFTGLIG(配列番号56)
L−CDR2:GTNNRAP(配列番号58)
L−FR3 :GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC(配列番号60)
L−CDR3:ALWYSNHWV(配列番号62)
L−FR4 :FGGG(配列番号64)
PSKは、直接的に癌細胞を傷害する作用を有する。本実施例では、2G9抗体及び5G5抗体のPSK細胞障害活性の中和活性について検討した。PSK感受性の癌細胞株Colon26(1×103/well)を96ウエルプレートで一晩培養した後、PSK(0、10、又は100μg/mL)と、2G9抗体又は5G5抗体(0、10、又は100μg/mL)とを加えて更に3日間培養した。培養後の細胞数を、MTTアッセイにより評価した。その結果、Colon26細胞の増殖は、PSKの濃度依存的に抑制されたが、2G9抗体又は5G5抗体の添加により濃度依存的に回復した。この結果は、2G9抗体及び5G5抗体に、PSKの生理活性(細胞障害活性)を抑制する作用があることを示している。図7に2G9抗体での結果を示す。
実施例1で作製した2G9抗体及び5G5抗体のビオチンで標識した。ビオチン標識は、Sulfo−OSu Biotinylation Kit(株式会社同仁化学研究所)を用い、付属のプロトコールに従い行った。具体的には、サンプルチューブに、実施例1で得られた抗体液を入れ、炭酸水素ナトリウム緩衝液を加え、塩濃度が50mM、タンパク質濃度が5.0mg/0.5mLになるように調製した後、ボルテックミキサーを用いてよく混和した。次に、Biotin−(AC5)2Sulfo−OSuを10mg/750μLに調製し、その溶液17.5μLを抗体溶液に添加し、ボルテックスミキサーを用いてよく混和した後、25℃で2時間、反応させた。その後、反応液をゲルろ過カラムで精製してビオチン標識抗体溶液を回収した。
PSKは、免疫抑制物質であるTGF−β1に結合して、その活性を中和することが報告されている。本実施例では、PSKのTGF−β1阻害活性を、2G9抗体又は5G5抗体が抑制するかを調べた。TGF−β1感受性株でTGF−β1により増殖が抑制されるMv1Lu細胞を用いて検討した。
Claims (13)
- (1)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1のポリペプチド、配列番号10で表されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2のポリペプチド、及び配列番号14で表されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3のポリペプチドを含む重鎖可変領域ドメイン、並びに配列番号22で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1のポリペプチド、配列番号26で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2のポリペプチド、及び配列番号30で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3のポリペプチドを含む軽鎖可変領域ドメイン、又は
(2)配列番号38で表されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1のポリペプチド、配列番号42で表されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2のポリペプチド、及び配列番号46で表されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3のポリペプチドを含む重鎖可変領域ドメイン、並びに配列番号54で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1のポリペプチド、配列番号58で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2のポリペプチド、及び配列番号62で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3のポリペプチドを含む軽鎖可変領域ドメイン
を有し、PSKを認識し、PSKの抗腫瘍作用を抑制することを特徴とする抗体。 - 前記抗腫瘍作用がPSKの細胞障害活性である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗腫瘍作用がTGF−β1阻害活性である、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体と、エピトープへの結合が競合し、且つPSKの抗腫瘍作用を抑制する抗体。
- IgM抗体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- キメラ抗体、CDRグラフト化抗体、又はヒト型抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記キメラ抗体がヒト抗体とのキメラ抗体であり、CDRグラフト化抗体がヒト抗体とのCDRグラフト化抗体である、請求項6に記載の抗体。
- 前記キメラ抗体が、IgW、IgNAR、IgX、又はIgYとのキメラ抗体であり、CDRグラフト化抗体がIgW、IgNAR、IgX、又はIgYとのCDRグラフト化抗体である請求項6に記載の抗体。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体のFab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、ディアボディー、単一鎖抗体分子、及びマルチ特異性抗体からなる群から選択される抗原結合性断片。
- 請求項1〜9に記載の抗体又は抗原結合性断片を用いるPSKの分析方法。
- 請求項1〜9に記載の抗体又は抗原結合性断片を含むPSK分析用キット。
- 請求項1〜9に記載の抗体又は抗原結合性断片のPSKの分析のための使用。
- 請求項1〜9に記載の抗体又は抗原結合性断片のPSK分析用キットの製造のための使用。
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