EA037032B1

EA037032B1 - Применение и способ для профилактики или лечения рака пищевода с использованием композиции, содержащей прогастрин-связывающее антитело

Info

Publication number: EA037032B1
Application number: EA201891527A
Authority: EA
Inventors: Александр Приёр
Original assignee: Прогастрин Э Кансер С.А Р.Л.
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2017-01-02
Publication date: 2021-01-28
Also published as: KR102430893B1; AU2017204686B2; US20240085423A1; EP3397967B1; PL3397967T3; CN108700589A; JP7018885B2; EP3397967A1; CA3193481A1; BR112018013272A2; JP2022064969A; AU2017204686A1; KR102197478B1; ES2861587T3; AU2020202296A1; EA201891527A1; JP2019505785A; CA3009785A1; SG11201805263TA; ZA201804142B

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения рака пищевода, а также к способу профилактики или лечения рака пищевода с использованием композиции, содержащей прогастрин-связывающее антитело.

Description

Настоящее изобретение относится к диагностике in vitro, профилактике и лечению рака, более конкретно оно относится к способам диагностики in vitro рака пищевода и к способам и композициям профилактики или лечения рака пищевода. Композиции в соответствии с изобретением содержат прогастрин-связывающую молекулу, в частности антитело к прогастрину человека (hPG, от англ. human progastrin), при этом способы в соответствии с изобретением включают применение прогастрин-связывающей молекулы и, в частности антитела к hPG.

Рак пищевода возникает из клеток пищевода в тракте, находящемся между горлом и желудком, и его описывают как рак, находящийся на восьмом месте по распространенности, которым чаще заболевают мужчины, чем женщины, при этом его частота широко варьирует между странами.

Двумя чаще всего встречающимися типами рака пищевода являются плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома пищевода. Также известен ряд более редких подтипов. Плоскоклеточная карцинома возникает из эпителиальных клеток пищевода, тогда как аденокарцинома возникает из железистых клеток, находящихся в нижнем отделе пищевода.

Клиническая диагностика основана на биопсии, которую обычно проводят под эндоскопией. Неблагоприятный исход этого заболевания связан, в частности, с поздней диагностикой, в частности, из-за отсутствия ранних признаков и симптомов. В настоящее время отсутствуют молекулярные биомаркеры, которые были бы переведены в широкую клиническую практику лечения рака пищевода (Kaz et al., Cancer Letters, 2014). Виды лечения зависят от развития рака и обычно включают хирургическое вмешательство для узколокализованных опухолей или химиотерапию, возможно в комбинации с радиотерапией.

Поэтому сохраняется потребность в способах, позволяющих осуществлять быструю, надежную и экономически эффективную диагностику рака пищевода, поскольку сохраняется потребность в новых композициях и способах предупреждения или лечения рака пищевода.

Все это составляет объект изобретения.

В настоящем изобретении теперь предложены способы диагностики in vitro рака пищевода, включающие обнаружение прогастрина в биологическом образце от субъекта. Предпочтительно определяют количество прогастрина в указанном образце, что, таким образом, позволяет количественно определить прогастрин. В настоящем изобретении также предложена композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода, содержащая связывающееся с прогастрином антитело, и способы профилактики или лечения рака пищевода, включающие применение композиции, содержащей связывающееся с прогастрином антитело, отдельно или в комбинации с любыми другими известными профилактическими или терапевтическими способами против рака пищевода.

Препрогастрин человека, представляющий собой 101-аминокислотный пептид (ссылка на аминокислотную последовательность: AAB19304.1), является первичным продуктом трансляции гена гастрина. Прогастрин образуется путем отщепления первой 21 аминокислоты (сигнального пептида) от препрогастрина. Далее 80-аминокислотная цепь прогастрина претерпевает процессинг под действием расщепляющих и модифицирующих ферментов с образованием нескольких биологически активных форм гормона гастрина: гастрин 34 (G34) и удлиненный гастрин 34, содержащий дополнительный глицин (G34Gly), содержащий аминокислоты 38-71 прогастрина, гастрин 17 (G17) и удлиненный гастрин 17, содержащий дополнительный глицин (G17-Gly), содержащий аминокислоты 55-71 прогастрина.

Моноклональные антитела к прогастрину человека (антитела к hPG) и их применение для диагностики или терапии описаны в следующих документах: WO 2011/083088 для колоректального рака, WO 2011/083090 для рака молочной железы, WO 2011/083091 для рака поджелудочной железы, WO 2011/116954 для колоректального и желудочно-кишечного рака и WO 2012/013609 и WO 2011/083089 для патологий печени.

Настоящее изобретение будет более полно понято из приведенного в настоящем документе подробного описания и сопроводительных графических материалов, которые приведены только для иллюстрации и не ограничивают заданный объем изобретения.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки in vitro риска присутствия рака пищевода, где указанный способ включает стадию обнаружения прогастрина в биологическом образце от субъекта. Присутствие прогастрина в образце указывает на риск присутствия рака пищевода.

Таким образом, в первом воплощении изобретение относится к способу in vitro оценки риска присутствия рака пищевода у субъекта, где указанный способ включает стадии:

a) приведение в контакт биологического образца от указанного субъекта по меньшей мере с одной прогастрин-связывающей молекулой;

b) обнаружение связывания этой прогастрин-связывающей молекулы с прогастрином в образце, где это связывание указывает на риск присутствия рака пищевода.

Связывание прогастрин-связывающей молекулы может быть обнаружено с помощью различных методик анализа, доступных специалистам в данной области техники. Хотя в объем изобретения включены любые подходящие методики проведения анализов, можно упомянуть, в частности, сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунологический анализ (РИА), Вестерн-блоттинг и иммуногистохимический анализ (ИГХ).

В предпочтительном воплощении изобретения способ оценки in vitro риска присутствия рака пище- 1 037032 вода у субъекта в соответствии с изобретением включает стадии:

а) приведение в контакт указанного биологического образца по меньшей мере с одной прогастринсвязывающей молекулой;

b) определение концентрации прогастрина в указанном биологическом образце, где концентрация прогастрина в биологическом образце по меньшей мере 10 пмоль/л указывает на риск присутствия рака пищевода.

Как только определена концентрация прогастрина, присутствующего в образце, этот результат можно сравнивать с результатом для контрольного(ых) образца(ов), который(ые) получают таким же образом, как исследуемые образцы, но от индивида(ов), у которого(ых) известно отсутствие рака пищевода. Если концентрация прогастрина в исследуемом образце статистически значимо повышена, можно сделать вывод о наличии повышенной вероятности, что субъект, от которого получен образец, страдает раком пищевода.

Таким образом, в более предпочтительном воплощении изобретения способ по изобретению включает дополнительные стадии:

с) определение референсной концентрации прогастрина в контрольном образце;

d) сравнение концентрации прогастрина в указанном биологическом образце с референсной концентрацией прогастрина;

e) оценка на основании сравнения стадии d) риска присутствия рака пищевода.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу in vitro для диагностики рака пищевода у субъекта, где указанный способ включает стадии:

b) обнаружение связывания этой прогастрин-связывающей молекулы с прогастрином в образце, где это связывание указывает на присутствие рака пищевода у субъекта.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro рака пищевода у субъекта, включающий стадии:

a) приведение в контакт указанного биологического образца по меньшей мере с одной прогастринсвязывающей молекулой;

b) определение уровня или концентрации прогастрина в указанном биологическом образце, где концентрация прогастрина в биологическом образце по меньшей мере 10 пмоль/л является показателем присутствия рака пищевода у данного субъекта.

В более конкретном воплощении способа в соответствии с изобретением концентрация прогастрина по меньшей мере 10 пмоль/л, по меньшей мере 20 пмоль/л, по меньшей мере 30 пмоль/л в данном биологическом образце является показателем присутствия рака пищевода у данного субъекта.

В более предпочтительном воплощении изобретения способ по изобретению включает дополнительные стадии:

c) определение референсной концентрации прогастрина в контрольном образце;

d) сравнение концентрации прогастрина в указанном биологическом образце с референсным уровнем или концентрацией прогастрина;

e) диагностика на основании сравнения стадии d) присутствия рака пищевода.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу диагностики in vitro метастазированного рака пищевода у субъекта, где указанный способ включает стадии:

b) обнаружение связывания этой прогастрин-связывающей молекулы с прогастрином в образце, где это связывание указывает на присутствие метастазированного рака пищевода у субъекта.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro метастазированного рака пищевода у субъекта из биологического образца данного субъекта, включающему стадии:

b) определение с помощью биохимического анализа уровня или концентрации прогастрина в указанном биологическом образце, где концентрация прогастрина в биологическом образце по меньшей мере на 10 пмоль/л выше является показателем присутствия метастазированного рака пищевода у данного субъекта.

В более конкретном воплощении способа в соответствии с изобретением концентрация прогастрина по меньшей мере 10 пмоль/л, по меньшей мере 20 пмоль/л, по меньшей мере 30 пмоль/л, по меньшей мере 40 пмоль/л или по меньшей мере 50 пмоль/л в данном биологическом образце является показателем метастазированного рака пищевода у данного субъекта.

- 2 037032

e) диагностика на основании сравнения стадии d) присутствия метастазированного рака пищевода.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro рака пищевода у субъекта, включающему определение концентрации прогастрина в биологическом образце и сравнение полученного значения с концентрацией прогастрина в контрольном образце.

В более конкретном воплощении изобретения в способе диагностики рака пищевода в соответствии с настоящим изобретением биологический образец от субъекта приводят в контакт по меньшей мере с одной прогастрин-связывающей молекулой, представляющей собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Выражение оценка риска присутствия рака пищевода у субъекта означает определение относительной вероятности того, что данный субъект страдает раком пищевода по сравнению с контрольным субъектом или значением. Способ в соответствии с изобретением представляет собой средство оценки указанного риска в комбинации с другими способами или показателями, такими как клиническое обследование, биопсия и определение уровня известного биомаркера рака пищевода.

В соответствии с конкретным воплощением настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro рака пищевода, включающему определение концентрации прогастрина в биологическом образце от субъекта, где у данного субъекта проявляется по меньшей мере один клинический симптом рака пищевода. Клинические симптомы рака пищевода включают потерю массы тела, болезненное или затрудненное глотание, кашель, расстройство пищеварения и изжогу.

В соответствии с другим конкретным воплощением настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro рака пищевода, включающему определение концентрации прогастрина в биологическом образце от субъекта, где у данного субъекта проявляется по меньшей мере один клинический симптом рака и/или метастаза.

Таким образом, способ диагностики in vitro рака пищевода в соответствии с настоящим изобретением можно рассматривать как средство в рамках процесса диагностики.

В более конкретном воплощении настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro рака пищевода у субъекта, включающему определение концентрации прогастрина в биологическом образце и определение известного биомаркера рака пищевода.

Термин прогастрин означает пептид прогастрин млекопитающего, и в частности прогастрин (PG) человека. Во избежание сомнений, без какого-либо уточнения выражение прогастрин человека относится к PG человека последовательности SEQ ID NO: 1. Прогастрин человека конкретно содержит Nконцевой и C-концевой домены, которые отсутствуют в упомянутых выше биологически активных формах гормона гастрина. Предпочтительно последовательность этого N-концевого домена представлена последовательностью SEQ ID NO: 2. В другом предпочтительном воплощении изобретения последовательность этого C-концевого домена представлена SEQ ID NO: 3.

Определение концентрации прогастрина в способе в соответствии с изобретением выполняют любым методом, известным специалистам в области биохимии.

Предпочтительно определение уровней прогастрина в образце включает приведение в контакт этого образца с прогастрин-связывающей молекулой и измерение связывания указанной прогастринсвязывающей молекулы с прогастрином.

При измерении уровней экспрессии на уровне белка это определение можно, в частности, выполнять с использованием специфичных прогастрин-связывающих молекул, таких как, например, антитела, в частности с помощью хорошо известных технологий, таких как окрашивание клеточной мембраны с использованием биотинилирования, или других эквивалентных методов с последующей иммунопреципитацией специфичными антителами, Вестерн-блоттинга, ИФА или метода иммуноферментных пятен (ELISPOT), твердофазных иммуносорбентных ферментных анализов (ELISA), радиоиммунологических анализов (РИА), иммуногистохимии (ИГХ), иммунофлуоресценции (ИФ), микрочипов антител или тканевых микрочипов в сочетании с иммуногистохимией. Другие приемлемые методики включают метод резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) или метод резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET), микроскопические или иммуногистохимические методики с использованием отдельных клеток и одной или нескольких длин волны возбуждения и с применением любого из адаптированных оптических методов, таких как электрохимические методы (вольтметрические и амперометрические методики), атомно-силовая микроскопия и радиочастотные методы, например конфокальная или неконфокальная многополюсная резонансная спектроскопия, обнаружение флуоресценции, люминесценции, хемилюминесценции, оптической плотности, отражающей способности, пропускающей способности и двойного лучепреломления или индекса рефракции (например, поверхностный плазмонный резонанс, эллипсометрия, резонансный зеркальный метод или интерферометрия); клеточный ИФА; проточную цитометрию; радиоизотопный метод; магнитно-резонансную томографию; анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ДНС-ПААГ-электрофореза, англ. SDS-PAGE); ВЭЖХ-массспектроскопию; жидкостную хроматографию/масс-спектроскопию/масс-спектрометрию (ЖХ-МС/МС)). Все эти методы хорошо известны в данной области техники и не нуждаются в дополнительной детализа- 3 037032 ции в настоящем документе. Эти различные методы можно использовать для измерения уровней прогастрина.

Указанный метод может быть, в частности, выбран из метода на основе иммунологического детектирования, метода на основе Вестерн-блоттинга, метода на основе масс-спектрометрии, метода на основе хроматографии и метода на основе проточной цитометрии. Хотя в объем изобретения включены любые приемлемые методы проведения анализов, особенно полезными для осуществления способа по изобретению являются такие методы как FACS, ИФА, РИА, Вестерн-блоттинг и ИГХ.

В более конкретном воплощении изобретения способ диагностики in vitro рака пищевода в соответствии с изобретением включает приведение в контакт биологического образца от субъекта с прогастринсвязывающей молекулой с использованием иммуноферментного анализа, предпочтительно на основе методик, выбранных из РИА и ИФА.

Биологический образец при использовании в настоящем документе представляет собой образец биологической ткани или текучей среды, содержащий нуклеиновые кислоты или полипептиды, например белок рака пищевода, полинуклеотид или транскрипт. В таком образце должно быть возможно определение уровней экспрессии прогастрина. Показано, что прогастрин является секретируемым белком. Предпочтительные биологические образцы для определения уровня белка прогастрина, таким образом, включают биологические текучие среды. Биологическая текучая среда при использовании в настоящем документе означает любую текучую среду, включающую материал биологического происхождения. Предпочтительные биологические текучие среды для использования в настоящем изобретении включают текучие среды организма животного, например млекопитающего, предпочтительно субъекта-человека. Текучая среда организма может представлять собой любую текучую среду организма, включающую без ограничений кровь, плазму крови, сыворотку крови, лимфу, спинномозговую жидкость (СМЖ), слюну, пот и мочу. Предпочтительно указанные жидкие биологические образцы включают такие образцы как образец крови, образец плазмы крови или образец сыворотки крови. Более предпочтительно биологический образец представляет собой образец крови. Действительно, такой образец крови может быть получен путем абсолютно безвредного забора крови у пациента и, следовательно, позволяет провести неинвазивную оценку рисков развития опухоли у субъекта.

Биологический образец при использовании в настоящем документе также включает образец солидного рака исследуемого пациента, когда рак представляет собой солидный рак. Такой образец солидного рака позволяет специалисту проводить измерение уровня биомаркера по изобретению любого типа. В некоторых случаях способы в соответствии с изобретением могут дополнительно включать предварительную стадию взятия образца солидного рака у пациента. Под образцом солидного рака подразумевают образец опухолевой ткани. Даже у пациента, страдающего раком, ткань, являющаяся местом расположения опухоли, все же содержит неопухолевую здоровую ткань. Поэтому образец рака следует ограничивать опухолевой тканью, взятой у пациента. Указанный образец рака может представлять собой образец биоптата или образец, полученный после хирургической резекционной терапии.

Биологический образец в характерном случае получают от эукариотического организма, наиболее предпочтительно млекопитающего или птицы, рептилии или рыбы. Действительно, субъект, которого можно подвергать описанному в настоящем документе способу, может представлять собой любое из животных класса млекопитающих, включая человека, собаку, кошку, крупный рогатый скот, козу, поросенка, свинью, овцу и обезьяну; либо птицу, рептилию или рыбу. Предпочтительно субъект представляет собой человека; субъект-человек может быть известен как пациент.

Под получением биологического образца в настоящем документе подразумевают получение биологического образца для использования в способах, описанных в данном изобретении. Чаще всего это осуществляют путем извлечения образца клеток у млекопитающего, но также можно осуществлять путем использования ранее выделенных клеток (например, выделенных другим лицом, в другое время и/или для другой цели) или выполнения способов по изобретению in vivo. Особенно полезными будут архивные ткани, для которых известна история лечения или исхода.

Этот образец может быть получен и при необходимости подготовлен в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники. В частности, в данной области техники хорошо известно, что образец следует брать у пациента натощак.

Определение концентрации прогастрина относится к определению количества прогастрина в известном объеме образца. Концентрация прогастрина может быть выражена относительно контрольного образца, например в виде отношения или доли в процентах. Концентрация может быть также выражена в виде интенсивности или локализации сигнала в зависимости от метода, используемого для определения указанной концентрации. Предпочтительно концентрацию соединения в образце выражают после нормализации относительно общей концентрации родственных соединений в указанном образце, например, уровень или концентрацию белка выражают после нормализации относительно общей концентрации белков в образце.

Предпочтительно риск того, что данный субъект страдает раком пищевода, определяют путем сравнения уровня прогастрина, измеренного в данном биологическом образце, с референсным уровнем.

Термин референсный уровень при использовании в настоящем документе относится к уровню

- 4 037032 экспрессии рассматриваемого маркера рака пищевода, т.е. прогастрина, в контрольном образце. Контрольный образец при использовании в настоящем документе означает образец, полученный от субъектов, предпочтительно двух или более субъектов, у которых известно отсутствие заболевания, или альтернативно из общей популяции. Приемлемые уровни экспрессии прогастрина можно определить пуем измерения уровней экспрессии указанного маркера у нескольких приемлемых субъектов, и такие референсные уровни можно скорректировать для конкретных популяций субъектов. Референсное значение или референсный уровень может представлять собой абсолютное значение; относительное значение; значение, имеющее верхний или нижний предел; диапазон значений; среднее значение; медианное значение, среднее арифметическое значение или значение по сравнению с конкретным контрольным или исходным значением. Референсное значение может быть получено на основании значения для отдельного образца, такого как, например, значение, полученное для образца от исследуемого субъекта, но в более ранний момент времени. Референсное значение может быть получено на основании большого количества образцов, например, из популяции субъектов из группы соответствующего хронологического возраста, или на основании пула образцов, включающего или исключающего исследуемый образец.

Предпочтительно референсный уровень представляет собой заранее определенный уровень прогастрина, полученного из биологического образца от субъекта с известным конкретным статусом в отношении рака. В конкретных воплощениях изобретения референсный уровень, используемый для сравнения с исследуемым образцом на стадии (b), может быть получен из биологического образца от здорового субъекта или из биологического образца от субъекта, страдающего раком; понятно, что референсный профиль экспрессии может быть также получен из пула биологических образцов от здоровых субъектов или из пула образцов от субъектов, страдающих раком.

В конкретном воплощении способа по изобретению контрольный образец собирают у субъектов, у которых исключен любой рак и предпочтительно любая патология. Должно быть понятно, что в соответствии с природой биологического образца, собранного у пациента, контрольный образец будет представлять собой биологический образец той же природы, что и указанный биологический образец.

Уровень прогастрина определяют настоящим способом путем определения количества прогастрина, связанного прогастрин-связывающей молекулой, предпочтительно антителом, распознающим прогастрин.

Под прогастрин-связывающей молекулой в настоящем документе подразумевают любую молекулу, которая связывает прогастрин, но не связывает гастрин-17 (G17), гастрин-34 (G34), удлиненный гастрин17, содержащий дополнительный глицин (G17-Gly), или удлиненный гастрин-34, содержащий дополнительный глицин (G34-Gly). Прогастрин-связывающая молекула по настоящему изобретению может представлять собой любую прогастрин-связывающую молекулу, такую как, например, молекула антитела или молекула рецептора. Предпочтительно прогастрин-связывающая молекула представляет собой антитело к прогастрину или его антигенсвязывающий фрагмент.

В соответствии с конкретным воплощением настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro рака пищевода, включающему определение концентрации прогастрина в биологическом образце от субъекта, где у данного субъекта проявляется по меньшей мере один клинический симптом рака пищевода.

Под терминами связывающий, связывает и т.п. подразумевают, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует с антигеном комплекс, который в физиологических условиях относительно стабилен. Способы определения того, связываются ли две молекулы, хорошо известны в данной области техники и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. В конкретном воплощении изобретения указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с прогастрином с по меньшей мере в два раза более высокой аффинностью по сравнению с аффиностью его связывания с неспецифической молекулой, такой как бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин. В более конкретном воплощении указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается только с прогастрином.

В конкретном воплощении изобретения в способе диагностики рака пищевода в соответствии с изобретением биологический образец от субъекта приводят в контакт по меньшей мере с одной прогастрин-связывающей молекулой, где аффинность указанной молекулы к прогастрину, определяемая таким способом, как описано выше, составляет по меньшей мере 100 нМ, по меньшей мере 90 нМ, по меньшей мере 80 нМ, по меньшей мере 70 нМ, по меньшей мере 60 нМ, по меньшей мере 50 нМ, по меньшей мере 40 нМ, по меньшей мере 30 нМ, по меньшей мере 20 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5 нМ, по меньшей мере 100 пМ, по меньшей мере 10 пМ или по меньшей мере 1 пМ.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к способу диагностики рака пищевода, включающему определение концентрации прогастрина в биологическом образце от субъекта, где указанный биологический образец приводят в контакт с антителом к hPG или его антигенсвязывающим

- 5 037032 фрагментом.

Используемый в настоящем документе термин антитело подразумевают как включающий в себя поликлональные и моноклональные антитела. Антитело (или иммуноглобулин) состоит из гликопротеина, содержащего по меньшей мере две тяжелые (H) и две легкие (L) цепи, взаимно связанные дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (или домен) тяжелой цепи (сокращенное обозначение в настоящем документе HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенное обозначение в настоящем документе LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен CL. Области VH и VL можно дополниельно подразделить на области гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (complementarity determining regions, CDR) или гипервариабельными областями, которые в первую очередь ответственны за связывание эпитопа антигена и чередуются с областями, являющимися более консервативными, называемыми каркасными областями (framework regions, FR). Способ идентификации CDR в пределах легких и тяжелых цепей антитела и определение их последовательности хорошо известно специалисту в данной области техники. Во избежание сомнений, в отсутствие каких-либо указаний в тексте на противоположное выражение CDR означает гипервариабельные области тяжелых и легких цепей антитела по определению Международной базы данных по иммуногенетике (International Immuno-Genetics Database, IMGT), где уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизованное определение границ каркасных областей и областей, определяющих комплементарность, CDR1-IMGT: 27 до 38, CDR2.

Уникальная нумерация IMGT определена для сравнения вариабельных доменов для любого рецептора антигена, типа цепи или биологического вида (Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L, Thouvenin-Contet, V. и Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одно и то же положение, например цистеин 23 (1-й CYS), триптофан 41 (КОНСЕРВАТИВНЫЙ TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-й CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизованное определение границ каркасных областей (FR1-IMGT: положения 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-IMGT: 118-128) и областей, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Поскольку гэпы представляют собой незанятые положения, информация о длинах CDR-IMGT (показанные между скобками и разделенные точками, например [8.8.13]) приобретает критическое значение. Уникальную нумерацию IMGT используют в 2D-графических представлениях, обозначаемых как ожерелья IMGT [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)), и в 3D-структурах в IMGT/3D-структура-DB (Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)).

Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организмахозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Антитела могут относиться к различным изотипам (а именно IgA, IgD, IgE, IgG или IgM).

В более конкретном воплощении изобретения указанное прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из поликлональных антител, моноклональных антител, химерных антител, одноцепочечных антител, камелизированных антител, lgA1 антител, lgA2 антител, IgD антител, IgE антител, lgG1 антител, lgG2 антител, lgG3 антител, lgG4 антител и IgM антител.

Поликлональное антитело представляет собой антитело, продуцируемое среди одного или более других неидентичных антител или в их присутствии. Как правило, поликлональные антитела продуцирует B-лимфоцит в присутствии нескольких других B-лимфоцитов, продуцирующих неидентичные антитела. Обычно поликлональные антитела получают непосредственно от иммунизированного животного.

Термин моноклональное антитело обозначает антитело, образующееся из почти однородной популяции антител, где популяция содержит идентичные антитела, за исключением нескольких возможных стречающихся в природе мутации, которые могут быть обнаружены в минимальных соотношениях. Моноклональное антитело образуется в результате роста отдельного клона клеток, такого как гибридома, и характеризуется тяжелыми цепями одного класса или подкласса и легкими цепями одного типа.

Под выражением антигенсвязывающий фрагмент антитела подразумевают как указывающее на любой пептид, полипептид или белок, сохраняющий способность к связыванию мишени (также в целом обозначаемой как антиген) указанного антитела, обычно одного и того же эпитопа, и содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по

- 6 037032 меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности антитела.

В конкретном воплощении изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну CDR антитела, из которого он получен. Еще в одном предпочтительном воплощении изобретения указанный антигенсвязывающий фрагмент содержит 2, 3, 4 или 5 CDR, более предпочтительно 6 CDR антитела, из которого он получен.

Антигенсвязывающие фрагменты могут быть выбраны без ограничений из группы, состоящей из Fv, scFv (sc для одной цепи), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc фрагментов или диател, либо гибридных белков с разупорядоченными пептидами, таких как XTEN (удлиненный рекомбинантный полипептид) или мотив транскрипционного фактора семейства PAS, или любого фрагмента, период полувыведения которого мог бы быть увеличен путем химической модификации, такой как присоединение поли(алкилен)гликоля, такого как поли(этилен)гликоль (пэгилирование) (пэгилированные фрагменты, называемые Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG или Fab'-PEG) (PEG обозначает поли(этилен)гликоль), или путем встраивания в липосому, где указанные фрагменты имеют по меньшей мере один из характеристических CDR антитела в соответствии с изобретением. Предпочтительно указанные антигенсвязывающие фрагменты будут состоять из или содержать частичную последовательность тяжелой или легкой вариабельной цепи антитела, из которой они получены, где указанная частичная последовательность будет достаточной для сохранения такой же специфичности связывания, как у антитела, от которого она имеет происхождение, и обладать достаточной аффинностью, предпочтительно по меньшей мере равной 1/100, более предпочтительным образом по меньшей мере равной 1/10 аффинности антитела, от которого она имеет происхождение, по отношению к мишени.

В другом конкретном воплощении изобретения в способе диагностики рака пищевода в соответствии с изобретением биологический образец от субъекта приводят в контакт с антителом, связывающимся с прогастрином, где указанное антитело получено методом иммунизации, известным специалисту в данной области техники, при котором в качестве иммуногена используют пептид с аминокислотной последовательностью, содержащей полную аминокислотную последовательность прогастрина или ее участок. Более конкретно указанный иммуноген содержит пептид, выбранный из пептида, аминокислотная последовательность которого содержит или состоит из аминокислотной последовательности полноразмерного прогастрина, и в частности полноразмерного прогастрина человека SEQ ID NO: 1, пептида, аминокислотная последовательность которого соответствует участку аминокислотной последовательности прогастрина, и в частности полноразмерного прогастрина человека SEQ ID NO: 1, пептида, аминокислотная последовательность которого соответствует участку аминокислотной последовательности или полной аминокислотной последовательности N-концевого участка прогастрина, и в частности пептидов, содержащих или состоящих из аминокислотной последовательности SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO: 2), пептида, аминокислотная последовательность которого соответствует участку аминокислотной последовательности или полной аминокислотной последовательности C-концевого участка прогастрина, и в частности пептидов, содержащих или состоящих из аминокислотной последовательности QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID NO: 3), пептида, аминокислотная последовательность которого соответствует участку аминокислотной последовательности или полной аминокислотной последовательности C-концевого участка прогастрина, и в частности пептидов, содержащих аминокислотную последовательность FGRRSAEDEN (SEQ ID NO: 40), соответствующую аминокислотам 71-80 прогастрина.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что такую иммунизацию можно использовать для получения поликлональных или моноклональных антител по мере желания. Способы получения каждого из типов антител хорошо известны в данной области техники. Специалист в данной области техники, таким образом, легко выберет и применит способ получения поликлональных и/или моноклональных антител к любому определенному антигену.

Примеры моноклональных антител, которые были получены путем использования иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность SWKPRSQQPDAPLG, соответствующую аминокислотной последовательности 1-14 прогастрина человека (N-концевой последовательности), включают без ограничений моноклональные антитела, обозначенные как mAb3, mAb4, mAb16, mAb19 и mAb20, как описано в следующих табл. 1-4. Описаны другие моноклональные антитела, хотя неясно, действительно ли эти антитела связывают прогастрин (WO 2006/032980). Экспериментальные результаты эпитопного картирования показывают, что mAb3, mAb4, mAb16, mAb19 и mAb20 действительно связывают эпитоп в

- 7 037032 пределах указанной N-концевой аминокислотной последовательности hPG. Поликлональные антитела, специфично распознающие эпитоп в пределах N-конца прогастрина, представленного SEQ ID NO: 2, описаны на уровне техники (см., например, WO 2011/083088).

Таблица 1

Депозит гибридом	mAb	Аминокислотные последовательности		SEQ ID NO
6В5В11С10	гпАЬЗ	VH CDR 1	GYIFTSYW	SEQ ID NO 4
		VH CDR 2	FYPGNSDS	SEQ ID NO 5
		VH CDR 3	TRRDSPQY	SEQ ID NO 6
		VL CDR 1	QSIVHSNGNTY	SEQ ID NO 7
		VL CDR 2	KVS	SEQ ID NO 8
		VL CDR 3	FQGSHVPFT	SEQ ID NO 9

Таблица 2

Депозит гибридом	mAb	Аминокислотные последовательности		SEQ ID NO
20D2C3G2	mAb4	VH CDR 1	GYTFSSW	SEQ ID NO 10
		VH CDR 2	FLPGSGST	SEQ ID NO 11
		VH CDR 3	ATDGNYDWFAY	SEQ ID NO 12
		VLCDR 1	QSLVHSSGVTY	SEQ ID NO 13
		VLCDR2	KVS	SEQ ID NO 14
		VLCDR3	SQSTHVPPT	SEQ ID NO 15

Таблица 3

Депозит гибридом	mAb	Аминокислотные последовательности		SEQ ID NO
1E9D9B6	mAb16	VH CDR 1	GYTFTSYY	SEQ ID NO 16
		VH CDR 2	INPSNGGT	SEQ ID NO 17
		VH CDR 3	TRGGYYPFDY	SEQ ID NO 18
		VLCDR1	QSLLDSDGKTY	SEQ ID NO 19
		VLCDR2	LVS	SEQ ID NO 20
		VLCDR 3	WQGTHSPYT	SEQ ID NO 21

- 8 037032

Таблица 4

Депозит гибридом	mAb	Аминокислотные последовательности		SEQ ID NO
1B3B4F11	тАЬ19	VH CDR 1	GYSITSDYA	SEQ ID NO 22
		VH CDR 2	ISFSGYT	SEQ ID NO 23
		VH CDR 3	AREVNYGDSYHFDY	SEQ ID NO 24
		VL CDR 1	SQHRTYT	SEQ ID NO 25
		VL CDR 2	VKKDGSH	SEQ ID NO 26
		VL CDR 3	GVGDAIKGQSVFV	SEQ ID NO 27

Примеры моноклональных антител, которые были получены путем использования иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (С-концевой участок прогастрина), соответствующую аминокислотной последовательности 55-80 прогастрина человека, включают без ограничений антитела, обозначенные как: mAb8 и mAb13 в приведенных ниже табл. 5 и 6. Экспериментальные результаты эпитопного картирования показывают, что mAb13 действительно связывает эпитоп в пределах указанной C-концевой аминокислотной последовательности hPG.

Таблица 5

Депозит гибридом	mAb	Аминокислотные последовательности		SEQ ID NO
1C10D3B9	mAb8	VH CDR 1	GFTFTTYA	SEQ ID NO 28
		VH CDR 2 VH CDR 3 VLCDR 1 VLCDR2	ISSGGTYT ATQGNYSLDF KSLRHTKGITF QMS	SEQ ID NO 29 SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 32
		VLCDR 3	AQNLELPLT	SEQ ID NO 33

- 9 037032

Таблица 6

Депозит гибридом	mAb	Аминокислотные последовательности		SEQ ID NO
2С6СЗС7	тАЫЗ	VH CDR 1	GFIFSSYG	SEQ ID NO 34
		VH CDR 2	INTFGDRT	SEQ ID NO 35
		VH CDR 3	ARGTGTY	SEQ ID NO 36
		VLCDR 1	QSLLDSDGKTY	SEQ ID NO 37
		VLCDR2	LVS	SEQ ID NO 38
		VLCDR 3	WQGTHFPQT	SEQ ID NO 39

Другие примеры включают моноклональные и/или поликлональные антитела к hPG, полученные путем использования иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

В более конкретном воплощении изобретения в способе в соответствии с изобретением указанный биологический образец приводят в контакт с антителом к hPG или его антигенсвязывающим фрагментом, где указанное антитело к hPG выбрано из N-концевых антител к hPG и C-концевых антител к hPG.

Термины N-концевые антитела к hPG и С-концевые антитела к hPG обозначают антитела, связывающиеся с эпитопом, содержащим аминокислоты, локализованные в N-концевом участке hPG, или с эпитопом, содержащим аминокислоты, локализованные в C-концевом участке hPG, соответственно. Предпочтительно термин N-концевые антитела к hPG относятся к антителам, связывающимся с эпитопом, локализованным в домене прогастрина, последовательность которого представлена SEQ ID NO: 2. В другом предпочтительном воплощении изобретения термин С-концевые антитела к hPG относятся к антителам, связывающимся с эпитопом, локализованным в домене прогастрина, последовательность которого представлена SEQ ID NO: 3.

Термин эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, по существу, представляют собой подгруппу структурных эпитопов и содержат аминокислоты, которые вносят непосредственный вклад в аффинность взаимодействия. Эпитопы могут быть также конформационными. В некоторых воплощениях изобретения эпитопы могут включать детерминанты, представляющие собой химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в некоторых воплощениях могут обладать определенными характеристиками трехмерной структуры и/или определенными характеристиками заряда. Определение эпитопа, связываемого антителом, может быть выполнено в помощью любой методики эпитопного картирования, известной специалисту в данной области техники. Эпитоп может содержать различные аминокислоты, локализованные последовательно в пределах аминокислотной последовательности белка. Эпитоп может также содержать аминокислоты, не локализованные последовательно в пределах аминокислотной последовательности белка.

В конкретном воплощении изобретения указанное антитело представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из моноклонального антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 8 и 9 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9 соответственно, моноклонального антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравни- 10 037032 вания с последовательностями SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14 и 15 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 13, 14 и 15 соответственно, моноклонального антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 и 18 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 16, 17 и 18 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно, моноклонального антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно, моноклонального антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 28, 29 и 30 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 31, 32 и 33 соответственно, моноклонального антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 34, 35 и 36 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно.

При использовании в настоящем документе идентичность в процентах или % идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот означает процентное содержание идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя сравниваемыми последовательностями, полученными после оптимального выравнивания, где данное процентное содержание является исключительно статистическим, и различия между двумя последовательностями распределены вдоль их длины случайным образом. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот традиционно осуществляют путем сравнения последовательностей после их оптимального выравнивания, где указанное сравнение может быть проведено последовательно по сегментам или с использованием окна выравнивания. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществлять, помимо сравнения вручную, посредством способов, известных специалисту в данной области техники.

Для аминокислотной последовательности, проявляющей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичность с референсной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают последовательности, содержащие референсную последовательность с некоторыми модификациями, в частности делецией, присоединением или заменой по меньшей мере одной аминокислоты, укорочением или удлинением. В случае замены одной или более последовательных или непоследовательных аминокислот предпочтительными являются замены, при которых заменяемые аминокислоты заменяются эквивалентными аминокислотами. В данном случае выражение эквивалентные аминокислоты подразумевают как обозначающее аминокислоты, которые вероятно замещаются одной или более структурных аминокислот, при этом, однако, не модифицирующих биологическую активность соответствующих антител, и их конкретные примеры, определенные ниже.

- 11 037032

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которыми они заменяются, либо по результатам сравнительных исследований биологической активности между различными антителами, образование которых вероятно.

В другом конкретном воплощении изобретения антитело, используемое в способе по изобретению, представляет собой гуманизированное антитело.

При использовании в настоящем документе выражение гуманизированное антитело означает антитело, которое содержит участки CDR, полученные из антитела не человеческого происхождеия, а остальные участки молекулы антитела получены из одного или нескольких человеческих антител. Кроме того, некоторые из остатков скелетных сегментов (называемых FR или каркасными) могут быть модифицированы с сохранением аффинности связывания в соответствии с методиками, известными специалисту в данной области техники (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986). Цель гуманизации состоит в снижении иммуногенности ксеногенного антитела, такого как мышиное антитело, для введения человеку с сохранением при этом полной аффинности связывания с антигеном и специфичности антитела.

Гуманизированные антитела по изобретению или их фрагменты могут быть получены с помощью методик, известных специалисту в данной области техники (такие методики, например, описаны в документах Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992). Такие гуманизированные антитела предпочтительны для применения в способах, вовлеченных в диагностику in vitro или в превентивное и/или терапевтическое лечение in vivo. Специалисту в данной области техники также известны другие методики гуманизации. Действительно, антитела могут быть гуманизированы с помощью разнообразных методик, включая прививание CDR (EP 0451261; EP 0682040; EP 0939127; EP 0566647; US 5530101; US 6180370; US 5585089; US 5693761; US 5639641; US 6054297; US 5886152 и US 5877293), венирование или рекомбинацию поверхностных остатков (ЕР 0592106; EP 0519596; Padlan Е.А., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G.M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973), и перестановку цепей (патент США. № 5565332). Человеческие антитела могут быть получены разнообразными способами, известными в данной области техники, включая методы фагового дисплея. См. также патенты США №№ 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318; и публикации международных заявок на патенты WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741.

В более конкретном воплощении изобретения указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, выбранное из группы, состоящей из гуманизированного антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 8 и 9 соответственно или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9 соответственно;

гуманизированного антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDRL2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14 и 15 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 13, 14 и 15 соответственно;

гуманизированного антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 и 18 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 16, 17 и 18 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDRL2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно;

гуманизированного антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно, и легкую цепь, содержащую

- 12 037032 по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDRL2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно;

гуманизированного антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 28, 29 и 30 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDRL2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 31, 32 и 33 соответственно;

гуманизированного антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 34, 35 и 36 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три из CDR-L1, CDRL2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно, или последовательностей по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно;

где указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из человеческого антитела.

В первом воплощении изобретения способ в соответствии с изобретением включает приведение в контакт биологического образца с антителом к hPG, связывающимся с эпитопом hPG, где указанный эпитоп локализован внутри C-концевого участка hPG, или с эпитопом, локализованным внутри Nконцевого участка hPG.

В более конкретном воплощении избретения способ в соответствии с изобретением включает приведение в контакт биологического образца с антителом к hPG, связывающимся с эпитопом hPG, где указанный эпитоп включает в себя аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности N-концевого участка прогастрина, выбранную из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 10-14 hPG, аминокислотам 9-14 hPG, аминокислотам 4-10 hPG, аминокислотам 2-10 hPG и аминокислотам 2-14 hPG, где аминокислотная последовательность hPG представляет собой SEQ ID NO: 1.

В более конкретном воплощении избретения способ в соответствии с изобретением включает приведение в контакт биологического образца с антителом к hPG, связывающимся с эпитопом hPG, где указанный эпитоп включает в себя аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности C-концевого участка прогастрина, выбранную из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 71-14 hPG, аминокислотам 69-73 hPG, аминокислотам 71-80 hPG (SEQ ID NO: 40), аминокислотам 76-80 hPG и аминокислотам 67-74 hPG, где аминокислотная последовательность hPG представляет собой SEQ ID NO: 1.

В первом воплощении изобретения композиция в соответствии с изобретением содержит антитело, распознающее эпитоп, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности прогастрина.

В более конкретном воплощении избретения композиция в соответствии с изобретением содержит антитело, распознающее эпитоп прогастрина, где указанный эпитоп включает в себя аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности N-концевого участка прогастрина, где указанная аминокислотная последовательность может включать в себя остатки 10-14 hPG, остатки 9-14 hPG, остатки 4-10 hPG, остатки 2-10 hPG или остатки 2-14 hPG, где аминокислотная последовательность hPG представляет собой SEQ ID NO: 1.

В более конкретном воплощении избретения композиция в соответствии с изобретением содержит антитело, распознающее эпитоп прогастрина, где указанный эпитоп включает в себя аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности C-концевого участка прогастрина, где указанная аминокислотная последовательность может включать в себя остатки 71-74 hPG, остатки 69-73 hPG, остатки 71-80 hPG (SEQ ID NO: 40), остатки 76-80 hPG или остатки 67-74 hPG, где аминокислотная последовательность hPG представляет собой SEQ ID NO: 1.

В конкретном воплощении способа диагностики рака пищевода in vitro в соответствии с изобретением указанный способ включает стадию приведения в контакт биологического образца от субъекта с первой молекулой, которая связывается с первым участком прогастрина, и со второй молекулой, которая связывается со вторым участком прогастрина. В более конкретном воплощении изобретения, где указанная прогастрин-связывающая молекула представляет собой антитело, биологический образец от субъекта

- 13 037032 приводят в контакт с антителом, которое связывается с первым эпитопом прогастрина, и со вторым антителом, которое связывается со вторым эпитопом прогастрина.

В предпочтительном воплощении изобретения способ диагностики рака пищевода по настоящему изобретению включает обнаружение прогастрина в биологическом образце от субъекта-человека.

В более предпочтительном воплощении изобретения способ диагностики рака пищевода по настоящему изобретению включает определение концентрации прогастрина в биологическом образце от субъекта-человека.

В другом конкретном воплощении изобретения способ диагностики рака пищевода по настоящему изобретению включает определение концентрации прогастрина в биологическом образце от субъектачеловека, где указанный биологический образец выбран из образца крови, сыворотки крови и плазмы крови.

В дополнительном предпочтительном воплощении изобретения способ по настоящему изобретению включает приведение в контакт образца от указанного субъекта с антителом к hPG, как описано выше, где связывание указанного антитела к hPG в образце указывает на присутствие рака пищевода у субъекта.

В более конкретном воплощении изобретения способ по настоящему изобретению включает приведение в контакт образца от указанного субъекта с антителом к hPG, как описано выше, где концентрация прогастрина, превышающая 10 пмоль/л, в указанном образце указывает на присутствие рака пищевода у субъекта.

Более предпочтительно способ по настоящему изобретению включает приведение в контакт образца от указанного субъекта с антителом к hPG, как описано выше, где концентрация прогастрина, превышающая 10, 20, 30 или 40 пмоль/л в указанном образце указывает на присутствие рака пищевода у субъекта.

Еще более предпочтительно способ по настоящему изобретению включает приведение в контакт образца от указанного субъекта с антителом к hPG, как описано выше, где концентрация прогастрина, превышающая 10, 20, 30, 40 пмоль/л в указанном образце указывает на присутствие метастазированного рака пищевода у субъекта.

Настоящее изобретение также относится к способам мониторинга эффективности лечения рака пищевода у пациента, такого как химиотерапия, биологическая терапия, иммунотерапия или антителотерапия, путем определения концентрации прогастрина в первом образце, таком как текучая среда организма или биоптат рака пищвода, полученного от пациента до лечения рака пищевода, и последующего сравнения концентрации прогастрина в первом образце с концентрацией во втором образце, полученном от того же пациента после лечения, где снижение концентрации прогастрина во втором образце по сравнению с первым образцом указывает на то, что лечение было эффективным.

В конкретном воплощении изобретения способ в соответствии с изобретением включает сравнение концентрации прогастрина в биологическом образце, полученном от пациента с заранее определенным значением концентрации прогастрина в образце, где в более конкретном воплощении это заранее определенное значение выбрано из: среднего арифметического, среднего, значений образца в расчете на среднее арифметическое или среднее, определения значения в популяции, не страдающей раком пищевода, значения концентрации прогастрина, полученного от пациента, если известно, что пациент не страдает раком пищевода.

В конкретном воплощении изобретения способ диагностики рака пищевода in vitro в соответствии с изобретением включает определение концентрации прогастрина в образце от пациента и второй диагностический тест для определения рака пищевода. В более конкретном воплощении изобретения способ диагностики рака пищевода in vitro в соответствии с изобретением включает определение концентрации прогастрина в образце от пациента и второй диагностический тест для определения рака пищевода.

В конкретном воплощении изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением включает определение уровня прогастрина со временем в образцах от пациента, который получил или получает лечение рака пищевода.

В другом аспекте сущность настоящего изобретения относится к композиции для применения в профилактике или лечении рака пищевода, где указанная композиция содержит прогастринсвязывающее антитело или его антиген-связывающий фрагмент.

Композиции антитела для применения в способах по изобретению можно готовить в виде различных лекарственных форм, включающих без ограничений водную суспензию, для введения посредством различных путей, включающих без ограничений парентеральный, подоболочечный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный, инфузию или болюсное введение. В некоторых воплощениях изобретения композицию включают в лекарственную форму для парентерального введения, и в некоторых конкретных воплощениях - для внутривенной инъекции путем инфузии.

В конкретном воплощении изобретения композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением содержит эффективную дозу антител к прогастрину по изобретению, диапазон которой составляет от 0,001 до около 250 мг/кг, которую можно вводить за одно введение или в виде множественных, разделенных по времени введений.

- 14 037032

В конкретном воплощении изобретения композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением содержит прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранные из поликлональных антител, моноклональных антител, химерных антител, одноцепочечных антител, камелизированных антител, lgA1 антител, lgA2 антител, IgD антител, IgE антител, lgG1 антител, lgG2 антител, lgG3 антител, lgG4 антител и IgM антител. Предпочтительно указанные антитела являются такими, как описано выше. Более предпочтительно указанные антитела представляют собой гуманизированные антитела.

В более конкретном воплощении изобретения композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением содержит прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий аффинностью к прогастрину, определенной описанным выше способом, составляющей по меньшей мере 5000 нМ, по меньшей мере 500, 100, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 7, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1 нМ; 50, 10, 5, 1 или по меньшей мере 0,1 пМ.

В даже более предпочтительном воплощении изобретения композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода содержит прогастрин-связывающее антитело, где указанная прогастрин-связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент представляет собой нейтрализующее антитело.

Выражение нейтрализующее антитело к PG обозначает антитело, связывающее PG и блокирующее PG-зависимую передачу сигнала, что приводит в результате к ингибированию PG-индуцированных ответов в опухолевых клетках, и в частности в опухолевых клетках пищевода. Ингибирование PGиндуцированных ответов клеток пищевода может быть опосредовано подавлением дифференцировки клеток, подавлением клеточной гибели и/или стимуляцией пролиферации клеток.

В другом конкретном воплощении изобретения композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода содержит прогастрин-связывающее антитело, где указанная прогастринсвязывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело.

В конкретном воплощении изобретения композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода содержит прогастрин-связывающее антитело, где указанная прогастрин-связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с цитотоксической молекулой.

В другом конкретном воплощении изобретения композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода для пациента содержит прогастрин-связывающее антитело, где у указанного пациента диагностирован рак пищевода способом в соответствии с настоящим изобретением, где концентрация прогастрина в биологическим образце от пациента выше, чем в контрольном образце.

В более конкретном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением, где указанное прогастринсвязывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбран из N-концевых антител к прогастрину и C-концевых антител к прогастрину.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей композицию для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением, и фармацевтически приемлемый носитель. Более конкретно фармацевтическая композиция для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением содержит антитело, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель.

В более конкретном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей композицию для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель, где указанное антитело к прогастрину вводят в дозе от 0,001 до 250 мг/кг и предпочтительно в дозе по меньшей мере 0,005, по меньшей мере 0,01, по меньшей мере 0,05, по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 1, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 100 мг/кг. В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору из частей, содержащему композицию для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением и противораковую терапевтическую молекулу.

Действительно, лечение моноклональными антителами к PG, как описано в настоящем документе, можно комбинировать с другой терапией или дополнять ею. Неограничивающие примеры другой терапии включают химиотерапевтическое лечение, радиотерапию, хирургическую резекцию и антителотерапию.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору из частей, содержащему композицию для применения в профилактике или лечении рака пищевода в соответствии с изобретением и противораковую терапевтическую молекулу, выбранную из химиотерапевтической молекулы, молекулы таргетной терапии.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к набору из частей, содержащему для одновременного, последовательного или отдельного введения композицию для лечения рака пищевода и химиотерапевтическую молекулу. Полезные химиотерапевтические молекулы для этой цели включают без ограничений антагонисты фолатов, антагонисты пуринов, антагонисты пиримидинов, ДНКалкилирующие молекулы, ДНК-сшивающие лекарственные препараты, антибиотики, комплексы платины, ингибиторы протеасом, токсические соединения для митотического веретена, ингибиторы топоизо

- 15 037032 меразы, ингибиторы тирозинкиназы и другое.

В другом конкретном воплощении настоящее изобретение относится к набору из частей, содержащему для одновременного, последовательного или раздельного введения композицию в соответствии с настоящим изобретением и другую молекулу таргетной терапии. Такая молекула таргетной терапии включает без ограничений антитела, направленные против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), такие как цетуксимаб или панитумумаб, антитела, направленные против фактора роста эпителия сосудов (VEGF), такие как бевацизумаб, антитела, направленные против рецептора человеческого эпидермального фактора роста 2 типа (HER2), такие как трастузумаб или пертузумаб, антитела, направленные против рецептора иммунной контрольной точки PD-1 и его лиганда PDL-1, такие как пембролизумаб, антитела, направленные против антигена 4 цитотоксических Т лимфоцитов (CTLA-4), такие как ипилимумаб, низкомолекулярные таргетные препараты против EGFR, такие как эрлотиниб, низкомолекулярные таргетные препараты против протоонкогена B-Raf (BRAF), такие как вемурафениб или дабрафениб, рекомбинантный гибридный белок, направленный против VEGF, такой как Афлиберцепт.

В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к применению прогастринсвязывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для диагностики рака пищевода.

В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к применению прогастринсвязывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для профилактики или лечения рака пищевода.

В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к применению прогастринсвязывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для профилактики или лечения рака пищевода для пациента, у которого определена концентрация прогастрина в биологическом образце и повышена по сравнению с концентрацией прогастрина в контрольном биологическом образце.

В более конкретном аспекте настоящее изобретение относится к применению прогастринсвязывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для профилактики или лечения рака пищевода для пациента, у которого присутствует метастаз.

В еще более конкретном аспекте настоящее изобретение относится к применению прогастринсвязывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для профилактики или лечения рака пищевода для пациента, у которого присутствует метастаз, определена концентрация прогастрина в биологическом образце и повышена по сравнению с концентрацией прогастрина в контрольном биологическом образце.

Компоненты, из которых состоит комбинация, можно вводить одновременно, отдельно или последовательно так, чтобы получить максимальную эффективности коминации; возможно, что продолжительность каждого введения будет различаться по продолжительности от быстрого введения до непрерывной перфузии.

При использовании в настоящем документе одновременное введение относится к введению двух соединений композиции соответственно в единой и уникальной фармацевтической форме. При использовании в настоящем документе раздельное введение относится к введению двух соединений композиции в соответствии с изобретением в одно и то же время в отдельных фармацевтических формах. При использовании в настоящем документе последовательное введение относится к последовательному введению двух соединений композиции в соответствии с изобретением в отдельных фармацевтических формах.

Терапевтически эффективное количество при использовании в настоящем документе относится к минимальной концентрации или количеству соединения (или соединений), которое является эффективным для предотвращения, ослабления, уменьшения или улучшения течения симптомов заболевания или для продления выживания пациента, получающего лечение.

Характеристики воплощений изобретения станут более очевидными на основании приведенного ниже подробного описания примеров.

Подписи к фигурам

Фиг. 1: медианная плазматическая концентрация прогастрина у пациентов с раком пищевода (n=12) и у контрольных пациентов (n=103) - двухсторонний критерий Манна-Уитни, *** p<0,001.

Фиг. 2: количество сфер OE33, образующихся после введения контрольного (CT Hz) или гуманизированного антитела к PG (PG Hz) в условиях сверхнизкого прикрепления - двухсторонний tкритерий, * p<0,05.

Примеры

Пример 1. Определение плазматической концентрации прогастрина с использованием поликлональных антител.

Уровни прогастрина в плазме крови определяли количественно методом ИФА посредством использования двух специфичных антител к прогастрину: антитела захвата наносят в виде покрытия в лунки планшета, при этом проявляющие антитела, используемые для определения прогастрина, опосредуют проявление сигнала.

В настоящем примере количественное определение основано на методе ИФА, который позволяет посредством использования субстрата, взаимодействие с которым вызывает испускание света, устано- 16 037032 вить значение, пропорциональное количеству люминесценции антител, связанных с антигеном, удерживаемым антителами захвата.

Материал.

Список реактивов и приборов приведен в табл. 7.

Таблица 7

Обозначение	Поставщик	Номер no каталогу
Планшеты MaxiSORP белые Nunc, 96луночные	Dutscher	#055221
Карбонат/бикарбонат натрия	Sigma	#21851
ДФСБ 1х	Lonza	# P04-36500
Tween-20	Biosolve	# 20452335
БСА	Euromedex	#04-100-810-C
Стрептавидин-HRP	Pierce (Thermo)	#21130
Субстрат для ИФА максимальной чувствительности SuperSignal Femto	Pierce (Thermo)	# 37074
Поликлональное антитело к прогастрину	Eurogentec	/

Поликлональные антитела получали путем иммунизации кроликов N-концевым прогастрином (SEQ ID NO: 2) или C-концевым прогастрином, соответствующим аминокислотам 71-80 hPG и имеющим последовательность FGRRSAEDEN (SEQ ID NO: 40), в соответствии со стандартными протоколами.

Поликлональные антитела к прогастрину, используемые в данной тест-системе, имеют следующие характеристики связывания: отсутствие связывания с G34-Gly, G34, G17-Gly, G17, связывание с полноразмерным прогастрином.

В лунки 96-луночных планшетов вносят в качестве покрытия раствор карбоната-бикарбоната натрия, 50 ммоль/л, pH 9,6, приготовленный путем растворения содержимого одной капсулы в 100 мл воды MilliQ. Раствор антитела захвата (3 мкг/мл), соответствующего поликлональным антителам, полученным путем использования C-концевого участка прогастрина FGRRSAEDEN (SEQ ID NO: 40), готовят в карбонатном буфере. В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора антител и инкубируют при 4°C в течение 16 ч (1 ночь). Впоследствии планшеты блокируют путем удаления раствора антител и промывания 3 раза по 300 мкл 1-кратного фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ)/0,1% Tween-20 с последующим добавлением 200 мкл блокирующего буфера (1-кратный ФСБ/0,1% Tween-20/0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА)) на лунку и инкубируют 2 ч при 22°C. Впоследствии блокирующий буфер удаляют, лунки промывают 3 раза 300 мкл 1-кратного ФСБ/0,1% Tween-20.

Разведение плазмы крови выполняют, как описано ниже: плазму крови используют в чистом виде и в разведенном виде 1/2, 1/5 и 1/10. Разведения готовят из чистой плазмы крови в 1-кратном ФСБ/0,1% Tween-20/0,1% бычий сывороточный альбумин.

Для контрольного теста ИФА в присутствии известной концентрации прогастрина разведение прогастрина готовят, как описано ниже: исходный раствор рекомбинантного PG (полноразмерный человеческий прогастрин, продуцируемый в E. coli и очищенный аффинной хроматографией с глутатионсодержащей агарозой/удалением метки (Tev)/очисткой противоточной афинной хроматографией на иммобилизованных ионах металла (IMAC)/диализом, из Института Пастера, г. Париж, Франция) готовят в концентрации 0,45 мг/мл (45 мкмоль/л) в трех повторностях. Для приготовления растворов прогастрина использовали следующие диапазоны концентраций.

Раствор A: предварительное разведение 1/10, 2 мкл исходного раствора плюс 18 мкл буфера.

Раствор B: предварительное разведение 1/100, 10 мкл раствора A плюс 90 мкл буфера.

Раствор C: предварительное разведение 1/1000, 10 мкл раствора B плюс 90 мкл буфера.

Раствор D: 500 пмоль/л, 5,55 мкл раствора C плюс 494,5 мкл разбавителя.

Раствор E: 250 пмоль/л, 250 мкл раствора D плюс 250 мкл разбавителя.

Раствор F: 100 пмоль/л, 200 мкл раствора E плюс 300 мкл разбавителя.

Раствор G: 50 пмоль/л, 250 мкл раствора F плюс 250 мкл разбавителя.

Раствор H: 25 пмоль/л, 200 мкл раствора G плюс 200 мкл разбавителя.

Раствор I: 10 пмоль/л, 100 мкл раствора H плюс 150 мкл разбавителя.

Диапазон концентраций рекомбинантного PG является линейным и, следовательно, может быть в большей или в меньшей степени широким, в зависимости от используемого антитела.

Для приготовления исследуемых образцов приблизительно 500 мкл каждого образца помещают от- 17 037032 дельно и хранят до анализа (и подтверждения при необходимости) результатов. 100 мкл раствора каждой точки диапазона и/или образцы плазмы крови помещают в анализ в чистом виде, в разведенном виде до

1/2, 1/5 и 1/10 и инкубируют в течение 2 ч при 22°C на планшетах.

Для проявления теста планшеты промывают 3 раза 300 мкл 1-кратного ФСБ/0,1% Tween-20. Раствор поликлональных кроличьих антител к прогастрину, полученных при использовании в качестве иммуногена N-концевого участка прогастрина, связанного с биотином до 0,5 мкг/мл, готовят путем разведения в 1-кратном ФСБ/0,1% Tween-20/0,1% БСА. В каждую лунку добавляют 100 мкл этого раствора. Инкубацию проводят в течение 1 ч при 22°C. Проявление стрептавидином-HRP проводят путем удаления детектирующего антитела и промывания 3 раза по 300 мкл 1-кратного ФСБ/0,1% Tween-20, впоследствии готовят раствор стрептавидина-HRP в концентрации 20 нг/мкл в 1-кратном ФСБ/0,1% Tween-20/0,1% БСА. Добавляют 100 мкл этого раствора в каждую лунку с последующей инкубацией в течение 1 ч при 22°C.

Определение состоит в удалении стрептавидина-HRP и промывании 3 раза 300 мкл 1-кратного ФСБ/0,1% Tween-20 с последующим добавлением 100 мкл раствора хемилюминесцентного субстрата на лунку. Раствор субстрата готовят путем смешивания равных объемов двух растворов набора для ИФА SuperSignal Femto, 20 мл и 20 мл, за 30 мин до использования и хранят при комнатной температуре в темном месте. Люминесценцию регистрируют после инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре в темном месте.

Для каждого вида условий тест проводят в трех повторностях, и результаты диапазонов будут представлены в виде графика, показывающего изменение люминесценции в зависимости от концентрации прогастрина. Для каждого разведения плазмы концентрацию прогастрина определяют с использованием уравнения кривой линейной регрессии соответствующего диапазона (диапазон 1/10-го для образца, разведенного с 1/10-го).

Методы и результаты.

Медианная плазматическая концентрация прогастрина составляет 42,3 пмоль/л у пациентов, страдающих раком пищевода (n=12), при этом у контрольных пациентов медианная плазматическая концентрация прогастрина составляет 0 пмоль/л (n=103) (фиг. 1). Эти данные демонстрируют, что пациенты с раком пищевода характеризуются повышенными концентрациями прогастрина в плазме крови по сравнению со здоровыми контрольными индивидами.

Эти данные демонстрируют, что пациенты с раком пищевода характеризуются повышенными концентрациями прогастрина в плазме крови по сравнению со здоровыми контрольными индивидами.

Пример 2. Определение концентрации прогастрина с использованием моноклональных антител к прогастрину.

В лунки 96-луночных планшетов Nunc MaxiSORP вносят в виде покрытия первое прогастринспецифичное антитело, как описано ниже. Моноклональные антитела к прогастрину, специфичные к карбокси-концевому участку прогастрина, разводят до концентрации 3 мкг/мл в буферном растворе 50 ммоль/л, pH 9,6, карбоната/бикарбоната натрия в воде MilliQ.

Впоследствии в каждую лунку 96-луночных планшетов добавляют суммарно 100 мкл раствора антитела и инкубировали в течение ночи при 4°C. После связывания раствор антитела удаляют из лунок, которые впоследствии промывают три раза 100 мкл отмывочного буфера (1-кратный ФСБ/0,1% Tween20). Впоследствии в каждую лунку добавляют суммарно 100 мкл блокирующего буфера (1-кратный ФСБ/0,1% Tween-20/0,1% БСА) и инкубируют в течение 2 ч при 22°C. Впоследствии блокирующий буфер удаляют и лунки промывают три раза отмывочным буфером. Впоследствии в лунки добавляют образцы плазмы или сыворотки крови, выделенные у пациентов, в объеме 100 мкл в серийных разведениях, обычно в разведениях 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10, и впоследствии инкубируют в течение 2 ч при 22°C. Образцы плазмы или сыворотки крови анализируют в двух повторностях.

В анализы также включают построение двух стандартных кривых. Первую стандартную кривую строят, используя разведения рекомбинантного прогастрина до конечного количества 1, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01 и 0 нг на лунку. Вторую стандартную кривую, которая служит в качестве отрицательного контроля, строят по результатам прогастрин-отрицательной сыворотки крови человека, разведенной в блокирующем буфере при таких же разведениях, как и для исследуемых образцов, т.е. 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10. Альтернативно в случае анализа образцов плазмы крови вторую стандартную кривую, которая служит в качестве отрицательного контроля, строят по результатам прогастрин-отрицательной плазмы крови человека, разведенной в блокирующем буфере при таких же разведениях, как и для исследуемых образцов, т.е. 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10.

После завершения инкубации с образцами плазмы или сыворотки крови содержимое лунок удаляют, и лунки промывают три раза отмывочным буфером по 100 мкл/лунка, после чего обнаружение прогастрина, связанного с первым антителом, выполняют, используя второе антитело, специфичное к прогастрину, как описано ниже.

Связанные с биотином моноклональные антитела к прогастрину, специфичные к амино-концевой области прогастрина, разводят в блокирующем буфере до концентрации от 0,1 до 10 мкг/мл в зависимо- 18 037032 сти от антитела.

Впоследствии в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора антитела и инкубируют в течение 1 ч при 22°C.

После завершения связывания второго антитела планшеты промывают три раза отмывочным буфером, 100 мкл/лунка, после чего в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора стрептавидин-HRP (25 нг/мл в блокирующем буфере) и инкубируют в течение 1 ч при 22°C. После завершения инкубации с раствором стрептавидин-HRP планшеты промывают три раза отмывочным буфером, 100 мкл/лунка. После этого добавляют 100 мкл на лунку хемилюминесцентного субстрата, приготовленного с использованием набора реактивов для ИФА с хемилюминесцентным субстратом максимальной чувствительности Pierce SuperSignal Femto, инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре в темном месте и впоследствии считывают показания на люминометре.

На основании показаний люминометра используют анализ линейной регрессии с получением уравнения кривых, соответствующих данных стандартной кривой. Используя это уравнение, впоследствии рассчитывают концентрацию прогастрина в различных образцах от пациентов.

Медианную плазматическую концентрацию прогастрина рассчитывают у пациентов, страдающих раком пищевода, и сравнивают с медианной плазматической концентрацией прогастрина в плазме крови контрольных пациентов. Эти данные демонстрируют, что пациенты с раком пищевода характеризуются повышенными уровнями прогастрина в плазме крови по сравнению со здоровыми контрольными индивидами.

Пример 3. Нейтрализующая активность антител к hPG в отношении линий раковых клеток.

3.1. Нейтрализующая активность антител к hPG.

Линии клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33, которые продуцируют и секретируют прогастрин, часто используют для исследования рака пищевода. В этих различных линиях клеток исследуют способность моноклональных антител к PG ингибировать пролиферацию. Используя различные моноклональные антитела к hPG, исследуют выживание клеток из каждой линии TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33.

Для каждого эксперимента в 6-луночные планшеты высевают 50000 клеток в питательной среде, содержащей фетальную телячью сыворотку, и инкубируют в течение 8 ч. Клетки подвергают сывороточному голоданию в течение ночи и начиная с 24 ч после посева (время TO) клетки обрабатывают в шести повторностях, один раз в 12 ч в течение 48 ч в отсутствие фетальной телячьей сыворотки моноклональными контрольными антителами в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (моноклональное антитело к пуромицину) (CT mAb) или от 1 до 20 мкг/мл mAb к hPG, где указанное mAb представляет собой C-концевое моноклональное антитело к hPG или N-концевое моноклональное антитело к hPG.

Указанное mAb представляет собой C-концевое антитело к hPG, выбранное из антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36, и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39;

или N-концевое антитело к hPG, выбранное из моноклонального антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6, и легкую цепь, содержащую CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 8 и 9;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10, 11 и 12, и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14 и 15;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 и 18, и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 19, 20 и 21;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23 и 24, и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27.

Для каждого эксперимента считают количество клеток в TO в контрольной лунке.

Конкретно количество живых клеток в лунках, обработанных как контрольным mAb, так и mAb к hPG, считают через 48 ч, после чего рассчитывают разность между каждым количеством клеток и количеством клеток, определенным в TO. Впоследствии полученное в результате количество клеток, обработанных mAb к hPG, выражают в процентах от количества клеток, обработанных контрольным mAb.

Обработка моноклональными антителами к hPG приводит к уменьшению количества клеток по сравнению с обработкой контрольным антителом. Статистическую значимость определяют с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки: * соот- 19 037032 ветствует p<0,05, ** соответствует p<0,01 и *** соответствует p<0,001. Антитела к hPG приводят к снижению выживания клеток в каждой линии клеток.

3.2. Нейтрализующая активность гуманизированных антител к hPG в отношении выживания клеток.

Исследуют способность гуманизированных антител к PG к ингибированию пролиферации линий клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33. Используя различные гуманизированные антитела к hPG, исследуют выживание клеток из каждой линии TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33.

Для каждого эксперимента в 6-луночные планшеты высевают 50000 клеток в питательной среде, содержащей фетальную телячью сыворотку, и инкубируют в течение 8 ч. Клетки подвергают сывороточному голоданию в течение ночи и начиная с 24 ч после посева (время TO) клетки обрабатывают в шести повторностях один раз в 12 ч в течение 48 ч в отсутствие фетальной телячьей сыворотки гуманизированными контрольными антителами в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (антитело к FcG1 человека от компании BioXCell) (CT Hz) или от 1 до 20 мкг/мл Hz к hPG, где указанное Hz представляет собой C-концевое гуманизированное антитело к hPG или N-концевое гуманизированное антитело к hPG. Для каждого эксперимента считают количество клеток в TO в контрольной лунке.

Конкретно количество живых клеток в лунках, обработанных как контрольным Hz, так и Hz к hPG, считают через 48 ч, после чего рассчитывают разность между каждым количеством клеток и количеством клеток, определенным в TO.

Впоследствии полученное в результате количество клеток, обработанных Hz к hPG, выражают в процентах от количества клеток, обработанных контрольным Hz.

Обработка антителами Hz к hPG приводит к уменьшению количества клеток по сравнению с обработкой контрольным антителом. Статистическую значимость определяют с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки: * соответствует p<0,05, ** соответствует p<0,01 и *** соответствует p<0,001. Антитела к hPG приводят к снижению выживания клеток в каждой линии клеток.

3.3. Нейтрализующая активность моноклональных антител к hPG в отношении частоты стволовых раковых клеток.

Способность моноклональных антител к PG к снижению частоты раковых стволовых клеток (CSC) в линиях клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33 исследуют с использованием метода крайних значений предельного разведения (Extreme Limiting Dilution Assay, ELDA). Используя различные моноклональные антитела к hPG, исследуют частоту CSC в каждой линии клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33.

Для каждого эксперимента клетки высевают в 96-луночные планшеты со сверхнизкой прикрепляющей способностью (ULA) P96 в фиксированных концентрациях клеток в лунке, используя проточный цитометр для сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) Aria и используя диапазон концентраций от одной до 500 клеток на лунку. Клетки выращивают в течение вплоть до 11 дней в планшетах ULA с питательной средой M11 (Macari et al., Oncogene, 2015) и обрабатывают один раз в 3 или 4 дня контрольными моноклональными антителами в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (моноклональное антитело к пуромицину) (CT mAb) или mAb к hPG в концентрации от 1 до 20 мкг/мл, где указанное mAb представляет собой C-концевое моноклональное антитело к hPG или N-концевое моноклональное антитело к hPG, как описано в примере 3.1.

Конкретно по окончании фазы инкубации планшеты наблюдают в фазово-контрастном микроскопе и проводят оценку количества положительных лунок на одну концентрацию клеток. Наконец, для расчета частоты CSC в каждой экспериментальной группе и определения статистически значимой разности между группами (модифицированный критерий Хи-квадрат) используют авторский инструмент Web ELDA (http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

Обработка моноклональными антителами к hPG приводит к уменьшению частоты CSC по сравнению с обработкой контрольным антителом.

3.4. Нейтрализующая активность гуманизированных антител к hPG в отношении частоты стволовых раковых клеток.

Анализ методом образования сфер.

Способность гуманизированных антител к PG к снижению частоты раковых стволовых клеток (CSC) в линиях клеток FLO-1, OE19 и OE33 исследуют с использованием метода образования сфер.

Для каждого эксперимента высевают 200 клеток в 24-луночные планшеты со сверхнизкой прикрепляющей способностью (ULA). Клетки выращивают в течение вплоть до 10 дней в планшетах ULA с питательной средой M11 (Macari et al., Oncogene, 2015) и обрабатывают один раз в 3 или 4 дня контрольными гуманизированными антителами в концентрации 20 мкг/мл (антитело к FcG1 человека от компании BioXCell) (CT Hz) или Hz к hPG в концентрации от 20 мкг/мл, где указанное Hz представляет собой C-концевое гуманизированное антитело к hPG или N-концевое гуманизированное антитело к hPG.

Конкретно по окончании фазы инкубации лунки фотографируют посредством светлопольной микроскопии, проводят анализ изображений и считают сферы со средним диаметром 25 мкм.

Обработка гуманизированными антителами к hPG приводит к уменьшению частоты CSC по срав- 20 037032 нению с обработкой контрольным антителом. Метод крайних значений предельного разведения

Способность гуманизированных антител к PG к снижению частоты раковых стволовых клеток (CSC) в линиях клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33 исследуют с использованием метода крайних значений предельного разведения (Extreme Limiting Dilution Assay, ELDA). Используя различные гуманизированные антитела к hPG, исследуют частоту CSC в каждой линии клеток TE-1, TE4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33.

Для каждого эксперимента клетки высевают в 96-луночные планшеты со сверхнизкой прикрепляющей способностью (ULA) P96 в фиксированных концентрациях клеток в лунке, используя проточный цитометр для сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) Aria и используя диапазон концентраций от одной до 500 клеток на лунку. Клетки выращивают в течение вплоть до 11 дней в планшетах ULA с питательной средой M11 (Macari et al., Oncogene, 2015) и обрабатывают один раз в 3 или 4 дня контрольными гуманизированными антителами в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (антитело к FcG1 человека от компании BioXCell) (CT Hz) или Hz к hPG в концентрации от 1 до 20 мкг/мл, где указанное Hz представляет собой C-концевое гуманизированное антитело к hPG или N-концевое гуманизированное антитело к hPG.

Обработка гуманизированными антителами к hPG приводит к уменьшению частоты CSC по сравнению с обработкой контрольным антителом.

3.5. Нейтрализующая активность моноклональных антител к hPG в отношении метаболического пути WNT/B-катенина.

Линии клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33, которые продуцируют и секретируют прогастрин, часто используют для исследования рака пищевода. Исследовали способность моноклональных антител к PG к ингибированию пути WNT/B-катенина в этих различных линиях клеток, используя в качестве показателя экспрессию белка сурвивина, являющегося хорошо известным геном-мишенью пути WNT/B-катенина. Используя различные моноклональные антитела к hPG, исследуют экспрессию сурвивина в каждой линии клеток TE-1, TE-4, TE-6 и KYSE30.

Для каждого эксперимента в 6-луночные планшеты высевают 50000 клеток в питательной среде, содержащей фетальную телячью сыворотку, и инкубируют в течение 8 ч. Клетки подвергают сывороточному голоданию в течение ночи и начиная с 24 ч после посева (время TO) клетки обрабатывают в четырех повторностях один раз в 12 ч в течение 72 ч в отсутствие фетальной телячьей сыворотки моноклональными контрольными антителами в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (моноклональное антитело к пуромицину) (CT mAb) или от 1 до 20 мкг/мл mAb к hPG, где указанное mAb представляет собой Cконцевое моноклональное антитело к hPG или N-концевое моноклональное антитело к hPG.

В частности, после 72 ч обработки клетки собирают и экстрагируют суммарный белок, используя буфер для анализа радиоиммунопреципитации (РИП). Впоследствии проводят Вестерн-блоттинг равных количеств белка из клеток, обработанных CT mAb или mAb к hPG, используя антитело к сурвивину (моноклональное антитело, #2802 от компании Cell Signaling) и антитело к актину в качестве контроля нанесения (моноклональное антитело, #A4700 от компании SIGMA). Количественное определение выполняют, используя полностью автоматизированную систему гель-документирования GBOX Chemi от компании Syngene.

Обработка моноклональными антителами к hPG приводит к уменьшению экспрессии сурвивина по сравнению с обработкой контрольным антителом. Статистическую значимость определяют с использованию непарного T-критерия Стьюдента: * соответствует p<0,05, ** соответствует p<0,01 и *** соответствует p<0,001.

3.6. Нейтрализующая активность гуманизированных антител к hPG в отношении метаболического пути WNT/B-катенина.

Исследовали способность гуманизированных антител к PG к ингибированию пути WNT/B-катенина в линиях клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33, используя в качестве показателя экспрессию белка сурвивина, являющегося хорошо известным геном-мишенью пути WNT/B-катенина. Используя различные гуманизированные антитела к hPG, исследуют экспрессию сурвивина в каждой линии клеток TE-1, TE-4, TE-6, KYSE30, FLO-1, OE19 и OE33.

Для каждого эксперимента в 6-луночные планшеты высевают 50000 клеток в питательной среде, содержащей фетальную телячью сыворотку, и инкубируют в течение 8 ч. Клетки подвергают сывороточному голоданию в течение ночи и начиная с 24 ч после посева (время TO) клетки обрабатывают в четырех повторностях один раз в 12 ч в течение 72 ч в отсутствие фетальной телячьей сыворотки гуманизированными контрольными антителами в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (антитело к FcG1 человека от компании BioXCell) (CT Hz) или от 1 до 20 мкг/мл Hz к hPG, где указанное Hz представляет собой Cконцевое гуманизированное антитело к hPG или N-концевое гуманизированное антитело к hPG.

- 21 037032

В частности, после 72 ч обработки клетки собирают и экстрагируют суммарный белок, используя буфер для анализа радиоиммунопреципитации (РИП). Впоследствии проводят Вестерн-блоттинг равных количеств белка из клеток, обработанных СТ Hz или Hz к hPG, используя антитело к сурвивину (моноклональное антитело, #2802 от компании Cell Signaling) и антитело к актину в качестве контроля нанесения (моноклональное антитело, #A4700 от компании SIGMA). Количественное определение выполняют, используя полностью автоматизированную систему гель-документирования GBOX Chemi от компании Syngene.

Обработка гуманизированными антителами к hPG приводит к уменьшению экспрессии сурвивина по сравнению с обработкой контрольным антителом. Статистическую значимость определяют с использованию непарного T-критерия Стьюдента: * соответствует p<0,05, ** соответствует p<0,01 и *** соответствует p<0,001.

Библиографическая ссылка.

Kaz et al., Cancer Letters, 2014 Jan 28;342(2): 193-9. Epigenetic biomarkers in esophageal cancer.

Claims

1. Применение композиции, содержащей прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения рака пищевода.

2. Применение по п.1, где прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из гуманизированных антител, химерных антител, одноцепочечных антител, камелизированных антител, lgA1 антител, lgA2 антител, IgD антител, IgE антител, lgG1 антител, lgG2 антител, lgG3 антител, lgG4 антител и IgM антител.

3. Применение по п.1 или 2, где прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывает прогастрин, но не связывает гастрин-17 (G17), гастрин-34 (G34), удлиненный гастрин-17, содержащий дополнительный глицин (G17-Gly), или удлиненный гастрин-34, содержащий дополнительный глицин (G34-Gly).

4. Применение по любому из пп.1-3, где прогастрин-связывающее антитело представляет собой моноклональное антитело.

5. Применение по любому из пп.1-4, где прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из N-концевых антител к прогастрину и C-концевых антител к прогастрину.

6. Применение по любому из пп.1-5, где прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой нейтрализующее антитело.

7. Применение по любому из пп.1-6, где прогастрин-связывающее антитело представляет собой гуманизированное антитело, выбранное из антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 8 и 9 соответственно;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14 и 15 соответственно;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 и 18 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30 соответственно, и

- 22 037032 легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33 соответственно;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно.

8. Применение по любому из пп.1-7, где рак пищевода является метастатическим.

9. Способ профилактики или лечения рака пищевода у пациента, нуждающегося в этом, где указанный способ включает введение пациенту композиции, содержащей прогастрин-связывающее антитело или его антиген-связывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Способ по п.9, где прогастрин-связывающее антитело или его антиген-связывающий фрагмент выбраны из гуманизированных антител, химерных антител, одноцепочечных антител, камелизированных антител, lgA1 антител, lgA2 антител, IgD антител, IgE антител, lgG1 антител, lgG2 антител, lgG3 антител, lgG4 антител и IgM антител.

11. Способ по п.9 или 10, где прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывает прогастрин, но не связывает гастрин-17 (G17), гастрин-34 (G34), удлиненный гастрин-17, содержащий дополнительный глицин (G17-Gly), или удлиненный гастрин-34, содержащий дополнительный глицин (G34-Gly).

12. Способ по любому из пп.9-11, где прогастрин-связывающее антитело представляет собой моноклональное антитело.

13. Способ по любому из пп.9-12, где прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из N-концевых антител к прогастрину и C-концевых антител к прогастрину.

14. Способ по любому из пп.9-13, где прогастрин-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой нейтрализующее антитело.

15. Способ по любому из пп.9-14, где прогастрин-связывающее антитело представляет собой гуманизированное антитело, выбранное из антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 8 и 9 соответственно;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30 соответственно, и легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33 соответственно;

антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36 соответственно, и

- 23 037032 легкую цепь, содержащую по меньшей мере один, преимущественно по меньшей мере два, преимущественно три определяющих комплементарность участка CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно.

16. Способ по любому из пп.9-15, где рак пищевода является метастатическим.

17. Способ по любому из пп.9-16, где композиция подлежит введению с противораковой терапевтической молекулой, выбранной из химиотерапевтической молекулы и молекулы таргетной терапии.

18. Способ по п.17, где композицию и противораковую терапевтическую молекулу вводят одновременно, последовательно или отдельно.

19. Способ по п.17 или 18, где химиотерапевтическая молекула выбрана из антагонистов фолатов, антагонистов пуринов, антагонистов пиримидинов, ДНК-алкилирующих молекул, ДНК-сшивающих лекарственных препаратов, антибиотиков, комплексов платины, ингибиторов протеасом, токсических соединений для митотического веретена, ингибиторов топоизомеразы и ингибиторов тирозинкиназы.

20. Способ по любому из пп.17-19, где молекула таргетной терапии выбрана из антител, направленных против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), таких как цетуксимаб или панитумумаб, антител, направленных против фактора роста эпителия сосудов (VEGF), таких как бевацизумаб, антител, направленных против рецептора человеческого эпидермального фактора роста 2 типа (HER2), таких как трастузумаб или пертузумаб, антител, направленных против рецептора иммунной контрольной точки PD-1 и его лиганда PDL-1, таких как пембролизумаб, антител, направленных против антигена 4 цитотоксических T лимфоцитов (CTLA-4), таких как ипилимумаб, низкомолекулярных таргетных препаратов против EGFR, таких как эрлотиниб, низкомолекулярных таргетных препаратов против протоонкогена BRaf (BRAF), таких как вемурафениб или дабрафениб, и рекомбинантного гибридного белка, направленного против VEGF, такого как Афлиберцепт.