JPH05244982A - 擬人化ｂ−ｂ１０ - Google Patents
擬人化ｂ−ｂ１０Info
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- JPH05244982A JPH05244982A JP3323319A JP32331991A JPH05244982A JP H05244982 A JPH05244982 A JP H05244982A JP 3323319 A JP3323319 A JP 3323319A JP 32331991 A JP32331991 A JP 32331991A JP H05244982 A JPH05244982 A JP H05244982A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
- C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
- C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトＩＬ−２リセプターに対するマウスモノ
クローナル抗体Ｂ−Ｂ１０の相補性決定領域をヒト抗体
に移植することによって得られる擬人化抗体を提供す
る。 【効果】 上記抗体は、ヒトに対する抗原性が非常に低
く、例えばＩＬ−２リセプターを発現しているような腫
瘍の治療に有効に利用できる。
クローナル抗体Ｂ−Ｂ１０の相補性決定領域をヒト抗体
に移植することによって得られる擬人化抗体を提供す
る。 【効果】 上記抗体は、ヒトに対する抗原性が非常に低
く、例えばＩＬ−２リセプターを発現しているような腫
瘍の治療に有効に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトＩＬ−２リセプター
に対する擬人化抗体に関する。さらに具体的にはヒトＩ
Ｌ−２リセプターに対するマウスモノクローナル抗体Ｂ
−Ｂ１０の相補性決定領域をヒト抗体に移植する事によ
って得られる擬人化抗体およびそれを有効成分とする製
剤に関する。
に対する擬人化抗体に関する。さらに具体的にはヒトＩ
Ｌ−２リセプターに対するマウスモノクローナル抗体Ｂ
−Ｂ１０の相補性決定領域をヒト抗体に移植する事によ
って得られる擬人化抗体およびそれを有効成分とする製
剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明に関わる抗体の構造と機能につい
て最初に述べる。これについては、例えばKabatら（Seq
uences of proteins of immunological interest, ４
版, 1987年, NIH, USA）あるいはRoittら（Immunology,
２版, 1989年, Gower MedicalPublishing, USA & UK）
の成書に詳しい。
て最初に述べる。これについては、例えばKabatら（Seq
uences of proteins of immunological interest, ４
版, 1987年, NIH, USA）あるいはRoittら（Immunology,
２版, 1989年, Gower MedicalPublishing, USA & UK）
の成書に詳しい。
【０００３】抗体（免疫グロブリン）は、外来からの異
物である抗原の感作によって、Ｂリンパ球によって産生
される抗原特異的な糖蛋白である。ヒトの免疫グロブリ
ンにはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５
種類のクラスがある。免疫グロブリンを例にとると、分
子量約２５、０００のポリペプチドの軽鎖（Ｌ鎖）２本
及び分子量約５１、０００のポリペプチドの重鎖（Ｈ
鎖）２本から構成される。Ｈ−Ｌ鎖間およびＨ−Ｈ鎖間
は、通常ジスルフィド結合によって連結されている。Ｈ
及びＬ鎖のＮ末端から約１００コのアミノ酸配列は、抗
原特異的であり、抗原結合部位を形成する。これを可変
（Ｖ）領域と言う。また、それに続くそれぞれ約４００
コ及び１５０コのアミノ酸配列は、ＩｇＧあるいはＩｇ
Ｍなどのクラス間、ＩｇＧ1 、ＩｇＧ2 等のサブクラス
間で一定であり、定常（Ｃ）領域と呼ばれる。ヒトＩｇ
Ｇでは、Ｌ鎖由来のＣｋ，Ｃλ、及びＨ鎖由来のＣγ
１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４が知られている。これらに
よって規定されるＬ鎖，及びＨ鎖はそれぞれ、ｋ鎖、λ
鎖、γ１鎖、γ２鎖、 γ３鎖、γ４鎖と呼ばれる。Ｈ
鎖、Ｌ鎖はそれぞれドメイン構造をとっており、Ｈ鎖の
場合、ＶＨ、ＣＨ１，ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ
１ドメインとＣＨ２ドメインをつなぐヒンジ領域よりな
る。
物である抗原の感作によって、Ｂリンパ球によって産生
される抗原特異的な糖蛋白である。ヒトの免疫グロブリ
ンにはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５
種類のクラスがある。免疫グロブリンを例にとると、分
子量約２５、０００のポリペプチドの軽鎖（Ｌ鎖）２本
及び分子量約５１、０００のポリペプチドの重鎖（Ｈ
鎖）２本から構成される。Ｈ−Ｌ鎖間およびＨ−Ｈ鎖間
は、通常ジスルフィド結合によって連結されている。Ｈ
及びＬ鎖のＮ末端から約１００コのアミノ酸配列は、抗
原特異的であり、抗原結合部位を形成する。これを可変
（Ｖ）領域と言う。また、それに続くそれぞれ約４００
コ及び１５０コのアミノ酸配列は、ＩｇＧあるいはＩｇ
Ｍなどのクラス間、ＩｇＧ1 、ＩｇＧ2 等のサブクラス
間で一定であり、定常（Ｃ）領域と呼ばれる。ヒトＩｇ
Ｇでは、Ｌ鎖由来のＣｋ，Ｃλ、及びＨ鎖由来のＣγ
１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４が知られている。これらに
よって規定されるＬ鎖，及びＨ鎖はそれぞれ、ｋ鎖、λ
鎖、γ１鎖、γ２鎖、 γ３鎖、γ４鎖と呼ばれる。Ｈ
鎖、Ｌ鎖はそれぞれドメイン構造をとっており、Ｈ鎖の
場合、ＶＨ、ＣＨ１，ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ
１ドメインとＣＨ２ドメインをつなぐヒンジ領域よりな
る。
【０００４】Ｖ領域は各抗体間で比較的アミノ酸配列が
保存されている４コのフレームワーク領域と各抗体間で
アミノ酸配列が比較的多様な３コの相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）から成る。２本のＨ鎖と２本のＬ鎖からなる１分
子の抗体にはＶＨ、ＶＬ領域に由来する６コのＣＤＲが
存在し、近接した立体配置をとり、抗原結合部位を形成
する。以上が抗体の構造と機能についての概要である。
保存されている４コのフレームワーク領域と各抗体間で
アミノ酸配列が比較的多様な３コの相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）から成る。２本のＨ鎖と２本のＬ鎖からなる１分
子の抗体にはＶＨ、ＶＬ領域に由来する６コのＣＤＲが
存在し、近接した立体配置をとり、抗原結合部位を形成
する。以上が抗体の構造と機能についての概要である。
【０００５】モノクローナル抗体（以下ＭＡｂ）は、医
学的分野において診断、治療への応用、工業的分野にお
いて研究用試薬、アフィニティーカラム基材として広く
産業的に利用される。マウスＭＡｂ抗体は、マウス／マ
ウスハイブリドーマ法により容易に生産できる。
学的分野において診断、治療への応用、工業的分野にお
いて研究用試薬、アフィニティーカラム基材として広く
産業的に利用される。マウスＭＡｂ抗体は、マウス／マ
ウスハイブリドーマ法により容易に生産できる。
【０００６】しかしながら、ヒト治療用としてマウスＭ
Ａｂに比べより産業的利用価値の高いヒトＭＡｂの作製
に関しては、今までに各種の改良が加えられたにもかか
わらず、再現性良くかつ効率良くその産生株を樹立する
方法が確立されていない。そのため、臨床応用可能なヒ
トＭＡｂは現在でも非常に限られている。また、ヒトに
由来する抗原に対するヒト抗体をハイブリドーマ法で生
産する事は、特殊な場合を除き一般に不可能である。
Ａｂに比べより産業的利用価値の高いヒトＭＡｂの作製
に関しては、今までに各種の改良が加えられたにもかか
わらず、再現性良くかつ効率良くその産生株を樹立する
方法が確立されていない。そのため、臨床応用可能なヒ
トＭＡｂは現在でも非常に限られている。また、ヒトに
由来する抗原に対するヒト抗体をハイブリドーマ法で生
産する事は、特殊な場合を除き一般に不可能である。
【０００７】マウスではヒト由来抗原を含め様々な抗原
に対するＭＡｂが容易に得られるが、反面ヒトに投与す
る場合にはその抗原性が問題となる。そこで、マウスＭ
Ａｂをもとに、ヒトに対する抗原性を可能な限り低めた
抗体をつくる試みがいくつかなされている。具体的に
は、マウスＭＡｂＶ領域の抗原結合部位を形成すると言
われている相補性決定領域（ＣＤＲ）のみ残し、後の領
域を全てヒトに置き換えたいわゆる擬人化（humanize
d）抗体を作製する試みである。
に対するＭＡｂが容易に得られるが、反面ヒトに投与す
る場合にはその抗原性が問題となる。そこで、マウスＭ
Ａｂをもとに、ヒトに対する抗原性を可能な限り低めた
抗体をつくる試みがいくつかなされている。具体的に
は、マウスＭＡｂＶ領域の抗原結合部位を形成すると言
われている相補性決定領域（ＣＤＲ）のみ残し、後の領
域を全てヒトに置き換えたいわゆる擬人化（humanize
d）抗体を作製する試みである。
【０００８】例えば欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）８７３０
２６２０号に開示された方法では、マウスＭＡｂのＣＤ
Ｒが、長いオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突
然変異を使用して、ヒトＭＡｂＶ領域に移植されてい
る。このような方法で擬人化抗体を得ている初期の例と
して、ヒトＴ細胞上のＣＤｗ５２抗原を認識するラット
ＭＡｂＣａｍｐａｔｈ−１の擬人化の試みがある（ＥＰ
−Ａ ８９３０１２９１）。
２６２０号に開示された方法では、マウスＭＡｂのＣＤ
Ｒが、長いオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突
然変異を使用して、ヒトＭＡｂＶ領域に移植されてい
る。このような方法で擬人化抗体を得ている初期の例と
して、ヒトＴ細胞上のＣＤｗ５２抗原を認識するラット
ＭＡｂＣａｍｐａｔｈ−１の擬人化の試みがある（ＥＰ
−Ａ ８９３０１２９１）。
【０００９】擬人化が有効と思われるマウスＭＡｂのひ
とつに抗ヒトＩＬ−２リセプター抗体Ｂ−Ｂ１０がある
（特開平２−１３３７１）。この抗体は、ヒトＴ細胞上
のインターロイキン−２（ＩＬ−２）リセプターへのＩ
Ｌ−２の結合と拮抗し、そして活性化Ｔ細胞のＩＬ−２
依存性増殖を阻害する。またヒト混合リンパ球反応も阻
害する。従って、このＭＡｂは対宿主移植片反応、対移
植片宿主反応に伴う疾患の治療及び予防に、骨髄、腎、
心臓、肺、すい臓、皮膚、肝臓等を移植する際の拒絶反
応の抑制に、Ｔ細胞依存性のアレルギーあるいは自己免
疫疾患（心筋炎、糖尿病、重症筋無力症、エリテマトー
デス、クローン病、多発性硬化症、エイズ、脳脊髄炎、
関節炎等）の治療、またＴ細胞白血病のようにＩＬ−２
リセプターを発現しているような腫瘍の治療に適当であ
る。実際、Ｂ−Ｂ１０は骨髄移植後に起こる対宿主移植
片反応に対する投与あるいは肝臓移植の拒絶に対する予
防的投与を行い、効果を上げている（Blood, 75 巻(199
0年),1017頁； Lancet, 335巻(1990年), 1596頁）。
とつに抗ヒトＩＬ−２リセプター抗体Ｂ−Ｂ１０がある
（特開平２−１３３７１）。この抗体は、ヒトＴ細胞上
のインターロイキン−２（ＩＬ−２）リセプターへのＩ
Ｌ−２の結合と拮抗し、そして活性化Ｔ細胞のＩＬ−２
依存性増殖を阻害する。またヒト混合リンパ球反応も阻
害する。従って、このＭＡｂは対宿主移植片反応、対移
植片宿主反応に伴う疾患の治療及び予防に、骨髄、腎、
心臓、肺、すい臓、皮膚、肝臓等を移植する際の拒絶反
応の抑制に、Ｔ細胞依存性のアレルギーあるいは自己免
疫疾患（心筋炎、糖尿病、重症筋無力症、エリテマトー
デス、クローン病、多発性硬化症、エイズ、脳脊髄炎、
関節炎等）の治療、またＴ細胞白血病のようにＩＬ−２
リセプターを発現しているような腫瘍の治療に適当であ
る。実際、Ｂ−Ｂ１０は骨髄移植後に起こる対宿主移植
片反応に対する投与あるいは肝臓移植の拒絶に対する予
防的投与を行い、効果を上げている（Blood, 75 巻(199
0年),1017頁； Lancet, 335巻(1990年), 1596頁）。
【００１０】
【発明が解決すべき課題】しかしながら、実際の治療に
おけるＢ−Ｂ１０の投与は、マウスＭＡｂの抗原性に対
する懸念から短期投与にとどまっている。また、投与患
者の中にはマウス抗体に対する抗体の検出される例もあ
り、長期投与は実際上極めて困難である。このように、
Ｂ−Ｂ１０がマウスＭＡｂであるために投与が制限さ
れ、その結果治療効果も制限されている面がある。
おけるＢ−Ｂ１０の投与は、マウスＭＡｂの抗原性に対
する懸念から短期投与にとどまっている。また、投与患
者の中にはマウス抗体に対する抗体の検出される例もあ
り、長期投与は実際上極めて困難である。このように、
Ｂ−Ｂ１０がマウスＭＡｂであるために投与が制限さ
れ、その結果治療効果も制限されている面がある。
【００１１】マウスＢ−Ｂ１０の使用に伴うこのような
問題を解消するためには先に述べた擬人化によりマウス
抗体に由来する抗原性を低減することが必要である。擬
人化抗体の例は先に述べた以外にも存在する。たとえば
抗Ｔａｃ抗体の例では、擬人化に際してＣＤＲの他にフ
レームワーク上の９個所のアミノ酸残基が移植されてい
る。擬人化によって活性が１／３に低下している（Pro
c.Natl.Aca.Sci.USA, 86 巻(1989 年),10029 頁）。ま
た、単純ヘルペスウィルスのｇＢグライコプロテインに
対する擬人化抗体ではフレームワーク上の２個所のアミ
ノ酸残基が、またｇＤグライコプロテインに対する擬人
化抗体ではフレームワーク上の８個所のアミノ酸残基が
ＣＤＲとともに移植されており、マウス抗体に比較し活
性はそれぞれ１／２、１である（Proc.Natl.Aca.Sci.US
A, 88巻(1991年), 2869頁）。またＲＳウィルスのＦ蛋
白に対する擬人化抗体ではフレームワーク上の３個所の
アミノ酸残基がＣＤＲとともに移植されており、マウス
抗体に比較し活性は２／３となっている（Biotechnolog
y, 9巻(1991 年), 266頁）。またヒトＣＤ４に対する擬
人化抗体ではフレームワーク上の１個所のアミノ酸残基
がＣＤＲとともに移植されており、マウス抗体に比較し
活性は１／３となっている（Proc.Natl.Aca.Sci.USA, 8
8 巻(1991 年), 4181頁）。
問題を解消するためには先に述べた擬人化によりマウス
抗体に由来する抗原性を低減することが必要である。擬
人化抗体の例は先に述べた以外にも存在する。たとえば
抗Ｔａｃ抗体の例では、擬人化に際してＣＤＲの他にフ
レームワーク上の９個所のアミノ酸残基が移植されてい
る。擬人化によって活性が１／３に低下している（Pro
c.Natl.Aca.Sci.USA, 86 巻(1989 年),10029 頁）。ま
た、単純ヘルペスウィルスのｇＢグライコプロテインに
対する擬人化抗体ではフレームワーク上の２個所のアミ
ノ酸残基が、またｇＤグライコプロテインに対する擬人
化抗体ではフレームワーク上の８個所のアミノ酸残基が
ＣＤＲとともに移植されており、マウス抗体に比較し活
性はそれぞれ１／２、１である（Proc.Natl.Aca.Sci.US
A, 88巻(1991年), 2869頁）。またＲＳウィルスのＦ蛋
白に対する擬人化抗体ではフレームワーク上の３個所の
アミノ酸残基がＣＤＲとともに移植されており、マウス
抗体に比較し活性は２／３となっている（Biotechnolog
y, 9巻(1991 年), 266頁）。またヒトＣＤ４に対する擬
人化抗体ではフレームワーク上の１個所のアミノ酸残基
がＣＤＲとともに移植されており、マウス抗体に比較し
活性は１／３となっている（Proc.Natl.Aca.Sci.USA, 8
8 巻(1991 年), 4181頁）。
【００１２】以上先行事例で見た如く、マウス抗体に近
い活性を有する擬人化抗体を得るには、たんにマウスＭ
ＡｂのＣＤＲをヒト抗体に移植するだけではなく、マウ
スＭＡｂのフレームワークのうち抗原抗体結合に重要な
影響を与えると思われるアミノ酸残基も併せて移植する
必要がある。しかしながら、そのようなアミノ酸残基は
抗体の種類によって異なると思われる。事実、先に述べ
た擬人化抗体の例でも、各擬人化抗体で共通するものも
あるが、異なるものもある。従って、抗体毎にそのよう
なアミノ酸残基を同定する必要がある。単純ヘルペスウ
ィルスのｇＤグライコプロテインに対する擬人化抗体の
如く、抗原抗体結合に関与すると予想されるフレームワ
ーク上のアミノ酸配列をすべてマウスＭＡｂのままにし
ておくと言うアプローチも考えられるが、そうするとマ
ウスＭＡｂと同じアミノ酸残基が多くなり、マウスＭＡ
ｂの抗原性が増加する可能性がある。この例では、ヒト
抗体では希なフレームワーク上のアミノ酸残基があれば
これらもヒト抗体で共通性の高いアミノ酸残基に変換し
ており、全部で１６個所のフレームワーク上のアミノ酸
残基を変換している。このように、ある抗体を擬人化す
る場合には、高活性維持のために最低限必要なフレーム
ワーク上のアミノ酸残基を同定し、ＣＤＲとあわせてヒ
ト抗体に移植する必要があるが、あらかじめそのような
アミノ酸残基を予想することは難しい。従って、抗原結
合活性に関与する可能性があるフレームワーク上のアミ
ノ酸残基は、擬人化に際し全て残しておくのが、高活性
維持のためには望ましい。しかしながら、そのようにし
てつくった擬人化抗体は必然的にマウス抗体由来のアミ
ノ酸残基が多くなり、ヒトに対する抗原性が大きくなる
ものと思われる。
い活性を有する擬人化抗体を得るには、たんにマウスＭ
ＡｂのＣＤＲをヒト抗体に移植するだけではなく、マウ
スＭＡｂのフレームワークのうち抗原抗体結合に重要な
影響を与えると思われるアミノ酸残基も併せて移植する
必要がある。しかしながら、そのようなアミノ酸残基は
抗体の種類によって異なると思われる。事実、先に述べ
た擬人化抗体の例でも、各擬人化抗体で共通するものも
あるが、異なるものもある。従って、抗体毎にそのよう
なアミノ酸残基を同定する必要がある。単純ヘルペスウ
ィルスのｇＤグライコプロテインに対する擬人化抗体の
如く、抗原抗体結合に関与すると予想されるフレームワ
ーク上のアミノ酸配列をすべてマウスＭＡｂのままにし
ておくと言うアプローチも考えられるが、そうするとマ
ウスＭＡｂと同じアミノ酸残基が多くなり、マウスＭＡ
ｂの抗原性が増加する可能性がある。この例では、ヒト
抗体では希なフレームワーク上のアミノ酸残基があれば
これらもヒト抗体で共通性の高いアミノ酸残基に変換し
ており、全部で１６個所のフレームワーク上のアミノ酸
残基を変換している。このように、ある抗体を擬人化す
る場合には、高活性維持のために最低限必要なフレーム
ワーク上のアミノ酸残基を同定し、ＣＤＲとあわせてヒ
ト抗体に移植する必要があるが、あらかじめそのような
アミノ酸残基を予想することは難しい。従って、抗原結
合活性に関与する可能性があるフレームワーク上のアミ
ノ酸残基は、擬人化に際し全て残しておくのが、高活性
維持のためには望ましい。しかしながら、そのようにし
てつくった擬人化抗体は必然的にマウス抗体由来のアミ
ノ酸残基が多くなり、ヒトに対する抗原性が大きくなる
ものと思われる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】このような状況におい
て、発明者らはマウスＢ−Ｂ１０の擬人化を試み、フレ
ームワークのアミノ酸残基の移植を最小限にとどめ、か
つマウスＢ−Ｂ１０に近い活性を有する擬人化Ｂ−Ｂ１
０の作製に成功した。すなはち、本発明者はマウスＢ−
Ｂ１０産生ハイブリドーマ細胞株から、Polymerase Cha
in Reaction ( ＰＣＲ）法等公知の方法を駆使して抗体
Ｖ領域のｃＤＮＡをクローニングし、そのアミノ酸配列
を明らかにした。そのアミノ酸配列にホモロジーの高い
ヒト抗体のＶ領域を選択し、このヒト抗体のフレームワ
ークとＢ−Ｂ１０Ｖ領域ＣＤＲおよび一部のフレームワ
ークを組み合わせて擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域を数種類デ
ザインした。これらの擬人化Ｂ−Ｂ１０はマウスＢ−Ｂ
１０より一部を移植したフレームワークのアミノ酸残基
が異なる。これらをコードするＤＮＡ配列を合成し、さ
らに擬人化Ｂ−Ｂ１０発現プラスミドを構築した。この
プラスミドをマウス骨髄腫細胞株に導入し、擬人化Ｂ−
Ｂ１０産生細胞を得た。さらに抗体遺伝子増幅により抗
体発現量を高めた後、数種の擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体を精
製し、得られた数種の擬人化Ｂ−Ｂ１０の活性評価を行
った。以上の過程で、Ｂ−Ｂ１０の活性に強い影響を及
ぼすフレームワーク上のアミノ酸残基（Ｍ５と呼ぶ）も
明らかにされた。最も活性の高い擬人化Ｂ−Ｂ１０は、
マウスＢ−Ｂ１０のフレームワーク上のアミノ酸残基を
Ｍ５も含んで最も多く移植した擬人化抗体と予想された
が、予想に反し、活性評価の結果ではむしろＭ５を含ん
で最小限の移植をした擬人化Ｂ−Ｂ１０の方がより高い
活性を示した。この擬人化抗体（Ｍ５）は、抗原性の点
からも有利と予想されるが、マウスＢ−Ｂ１０とほぼ同
等の活性を示すことが判明し、本特許を完成するに至っ
た。
て、発明者らはマウスＢ−Ｂ１０の擬人化を試み、フレ
ームワークのアミノ酸残基の移植を最小限にとどめ、か
つマウスＢ−Ｂ１０に近い活性を有する擬人化Ｂ−Ｂ１
０の作製に成功した。すなはち、本発明者はマウスＢ−
Ｂ１０産生ハイブリドーマ細胞株から、Polymerase Cha
in Reaction ( ＰＣＲ）法等公知の方法を駆使して抗体
Ｖ領域のｃＤＮＡをクローニングし、そのアミノ酸配列
を明らかにした。そのアミノ酸配列にホモロジーの高い
ヒト抗体のＶ領域を選択し、このヒト抗体のフレームワ
ークとＢ−Ｂ１０Ｖ領域ＣＤＲおよび一部のフレームワ
ークを組み合わせて擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域を数種類デ
ザインした。これらの擬人化Ｂ−Ｂ１０はマウスＢ−Ｂ
１０より一部を移植したフレームワークのアミノ酸残基
が異なる。これらをコードするＤＮＡ配列を合成し、さ
らに擬人化Ｂ−Ｂ１０発現プラスミドを構築した。この
プラスミドをマウス骨髄腫細胞株に導入し、擬人化Ｂ−
Ｂ１０産生細胞を得た。さらに抗体遺伝子増幅により抗
体発現量を高めた後、数種の擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体を精
製し、得られた数種の擬人化Ｂ−Ｂ１０の活性評価を行
った。以上の過程で、Ｂ−Ｂ１０の活性に強い影響を及
ぼすフレームワーク上のアミノ酸残基（Ｍ５と呼ぶ）も
明らかにされた。最も活性の高い擬人化Ｂ−Ｂ１０は、
マウスＢ−Ｂ１０のフレームワーク上のアミノ酸残基を
Ｍ５も含んで最も多く移植した擬人化抗体と予想された
が、予想に反し、活性評価の結果ではむしろＭ５を含ん
で最小限の移植をした擬人化Ｂ−Ｂ１０の方がより高い
活性を示した。この擬人化抗体（Ｍ５）は、抗原性の点
からも有利と予想されるが、マウスＢ−Ｂ１０とほぼ同
等の活性を示すことが判明し、本特許を完成するに至っ
た。
【００１４】また擬人化Ｂ−Ｂ１０の遺伝子が明らかに
なった事で、組換えＤＮＡ技術によって、様々な擬人化
Ｂ−Ｂ１０の誘導体を作製することが可能となった。こ
のようなものの中には、Ｆｖ、Ｆａｂ等の他に、例え
ば、ある種の蛋白毒素、酵素などと擬人化Ｂ−Ｂ１０の
融合蛋白が含まれる。
なった事で、組換えＤＮＡ技術によって、様々な擬人化
Ｂ−Ｂ１０の誘導体を作製することが可能となった。こ
のようなものの中には、Ｆｖ、Ｆａｂ等の他に、例え
ば、ある種の蛋白毒素、酵素などと擬人化Ｂ−Ｂ１０の
融合蛋白が含まれる。
【００１５】以下、さらに本発明を詳細に説明する。本
発明は、マウス抗ヒトＩＬ−２リセプター抗体Ｂ−Ｂ１
０ＭＡｂの擬人化抗体を提供する。その一例として、以
下に示したＶ領域のＣＤＲ及び一部のフレームワーク上
のアミノ酸配列によって定義される擬人化抗体を提供す
る。 Ｈ鎖Ｖ領域（ＶＨ）ＣＤＲ１
発明は、マウス抗ヒトＩＬ−２リセプター抗体Ｂ−Ｂ１
０ＭＡｂの擬人化抗体を提供する。その一例として、以
下に示したＶ領域のＣＤＲ及び一部のフレームワーク上
のアミノ酸配列によって定義される擬人化抗体を提供す
る。 Ｈ鎖Ｖ領域（ＶＨ）ＣＤＲ１
【化１０】 配列番号１ ＣＤＲ２
【化１１】 配列番号２
【００１６】ＣＤＲ３
【化１２】 配列番号３ Ｌ鎖Ｖ領域（ＶＬ）ＣＤＲ１
【化１３】 配列番号４
【００１７】ＣＤＲ２
【化１４】 配列番号５ ＣＤＲ３
【化１５】 配列番号６ ＶＨ２７−３０番目のアミノ酸
【化１６】 配列番号７ ＶＨ９４番目のアミノ酸 Arg ＶＬ４９番目のアミノ酸 Lys
【００１８】さらに本発明はＶ領域が以下のアミノ酸配
列で定義される擬人化抗体を提供する。 ＶＨ
列で定義される擬人化抗体を提供する。 ＶＨ
【化１７】 配列番号８
【００１９】ＶＬ
【化１８】 配列番号９
【００２０】本発明はさらに、擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体と
して、完全なる抗体分子、あるいはその断片、例えば、
Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）’2 をも含む。あるいは、本
発明の擬人化Ｂ−Ｂ１０またはその断片は、抗体以外の
機能性分子を有する事ができる。例えば、擬人化Ｂ−Ｂ
１０またはその断片は架橋構造によりあるいは組換えＤ
ＮＡ技術を使用して、リシンなどの毒素や酵素、ある種
のサイトカインなどの機能性分子と結合する事ができ
る。本発明によれば擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体は、以下のよ
うに製造する事ができる。
して、完全なる抗体分子、あるいはその断片、例えば、
Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）’2 をも含む。あるいは、本
発明の擬人化Ｂ−Ｂ１０またはその断片は、抗体以外の
機能性分子を有する事ができる。例えば、擬人化Ｂ−Ｂ
１０またはその断片は架橋構造によりあるいは組換えＤ
ＮＡ技術を使用して、リシンなどの毒素や酵素、ある種
のサイトカインなどの機能性分子と結合する事ができ
る。本発明によれば擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体は、以下のよ
うに製造する事ができる。
【００２１】１）Ｖ領域の少なくともＣＤＲがマウスＢ
−Ｂ１０ＭＡｂに由来し、他の部分がヒト抗体に由来す
る擬人化抗体をコードする遺伝子を構築し、 ２）宿主細胞で安定に存在する発現ベクターに擬人化抗
体遺伝子を挿入して発現プラスミドを構築し、 ３）宿主細胞を前記プラスミドにてトランスフェクショ
ンして擬人化Ｂ−Ｂ１０ＭＡｂ産生細胞を樹立し、 ４）前記産生細胞を培養して擬人化Ｂ−Ｂ１０ＭＡｂを
産生せしめる。
−Ｂ１０ＭＡｂに由来し、他の部分がヒト抗体に由来す
る擬人化抗体をコードする遺伝子を構築し、 ２）宿主細胞で安定に存在する発現ベクターに擬人化抗
体遺伝子を挿入して発現プラスミドを構築し、 ３）宿主細胞を前記プラスミドにてトランスフェクショ
ンして擬人化Ｂ−Ｂ１０ＭＡｂ産生細胞を樹立し、 ４）前記産生細胞を培養して擬人化Ｂ−Ｂ１０ＭＡｂを
産生せしめる。
【００２２】本発明の擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体は、通常用
いられる組換えＤＮＡ技術により取得することができ
る。以下、段階的に説明する。 （ｉ）マウスＢ−Ｂ１０抗体産生ハイブリドーマからの
ＲＮＡの単離 マウスＢ−Ｂ１０抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡの
単離をする方法はいくつかあるが、基本的には蛋白変性
剤（グアニジンチオシアネート）の存在下、細胞を溶
し、フェノール抽出、もしくは塩化セシウムにより密度
勾配遠心によりＲＮＡを分離するものである。さらにｍ
ＲＮＡを精製したい場合はオリゴｄＴセルロースカラム
を通す。方法については、J. Sambrookらの成書（Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, 1989年, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, USA）に標準的な
プロトコールが示されている。具体例を実施例１に示
す。
いられる組換えＤＮＡ技術により取得することができ
る。以下、段階的に説明する。 （ｉ）マウスＢ−Ｂ１０抗体産生ハイブリドーマからの
ＲＮＡの単離 マウスＢ−Ｂ１０抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡの
単離をする方法はいくつかあるが、基本的には蛋白変性
剤（グアニジンチオシアネート）の存在下、細胞を溶
し、フェノール抽出、もしくは塩化セシウムにより密度
勾配遠心によりＲＮＡを分離するものである。さらにｍ
ＲＮＡを精製したい場合はオリゴｄＴセルロースカラム
を通す。方法については、J. Sambrookらの成書（Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, 1989年, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, USA）に標準的な
プロトコールが示されている。具体例を実施例１に示
す。
【００２３】（ｉｉ）Ｖ領域ｃＤＮＡの単離・同定 Ｖ領域ｃＤＮＡはマウスＶ領域に特異的なプライマーを
使って、（ｉ）のＲＮＡより逆転写酵素を使って合成す
る事ができる。また得られたＶ領域ｃＤＮＡは特異的プ
ライマーを使ったPolymerase Chain Reaction（ＰＣ
Ｒ）により増幅されうる。マウスＶ領域特異的なプライ
マーについては、M.J.Colomaら（BioTechniques, 11
巻,(1991年), 152頁）、R.Orlandiら（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８６巻（１９８９
年), 3833頁）、L. Sastryら（Proc.Natl.Aca.Sci.USA,
86巻(1989年), 5728 頁）に基づいて合成できる。また
ＰＣＲはJ. Sambrook らの成書（Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2 版, 1989年, Cold Spring Harb
or Laboratory Press, USA, 特に14章）等に詳しい。得
られたＶ領域ｃＤＮＡは適当なプラスミドあるいはファ
ージベクターを用いてクローニングする事ができる。ク
ローニングされたＶ領域ｃＤＮＡの塩基配列はダイデオ
キシシーケンシング法（J. Messing, "Methods in Enzy
mology", 101巻, 1983年, 20頁）あるいはマグザム−ギ
ルバート法（A.M.Maxam &W. Gilbert, Proc.Natl.Aca.S
ci.USA, 74巻,1977年, 560頁）によって決定する事がで
きる。決定されたＤＮＡ配列よりコードされているアミ
ノ酸配列を予測する事ができる。このようにして同定さ
れたアミノ酸配列の一部を実際にプロテインシーケンサ
ーにより確認する事ができる。このようにして同定され
たマウスＢ−Ｂ１０Ｖ領域のアミノ酸配列を図１および
２に示す。
使って、（ｉ）のＲＮＡより逆転写酵素を使って合成す
る事ができる。また得られたＶ領域ｃＤＮＡは特異的プ
ライマーを使ったPolymerase Chain Reaction（ＰＣ
Ｒ）により増幅されうる。マウスＶ領域特異的なプライ
マーについては、M.J.Colomaら（BioTechniques, 11
巻,(1991年), 152頁）、R.Orlandiら（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８６巻（１９８９
年), 3833頁）、L. Sastryら（Proc.Natl.Aca.Sci.USA,
86巻(1989年), 5728 頁）に基づいて合成できる。また
ＰＣＲはJ. Sambrook らの成書（Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2 版, 1989年, Cold Spring Harb
or Laboratory Press, USA, 特に14章）等に詳しい。得
られたＶ領域ｃＤＮＡは適当なプラスミドあるいはファ
ージベクターを用いてクローニングする事ができる。ク
ローニングされたＶ領域ｃＤＮＡの塩基配列はダイデオ
キシシーケンシング法（J. Messing, "Methods in Enzy
mology", 101巻, 1983年, 20頁）あるいはマグザム−ギ
ルバート法（A.M.Maxam &W. Gilbert, Proc.Natl.Aca.S
ci.USA, 74巻,1977年, 560頁）によって決定する事がで
きる。決定されたＤＮＡ配列よりコードされているアミ
ノ酸配列を予測する事ができる。このようにして同定さ
れたアミノ酸配列の一部を実際にプロテインシーケンサ
ーにより確認する事ができる。このようにして同定され
たマウスＢ−Ｂ１０Ｖ領域のアミノ酸配列を図１および
２に示す。
【００２４】（ｉｉｉ）擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域のアミ
ノ酸配列のデザイン マウスＢ−Ｂ１０ＣＤＲを移植すべきヒト抗体はＧｅｎ
ｂａｎｋ、ＥＭＢＬ等のｄａｔａｂａｓｅを用いて任意
に選ぶことができる。これらを用いて、マウスＢ−Ｂ１
０Ｖ領域アミノ酸配列にホモロジーの高いヒト抗体Ｖ領
域を選ぶ。具体的な一例として、ＶＨについてはＫＡＳ
抗体、ＶｋについてはＰＡＹ抗体が挙げられる。ＣＤＲ
以外に移植すべきフレームワーク上のアミノ酸残基につ
いては、立体構造のわかっている抗体の解析によりＣＤ
Ｒの立体構造形成に影響を及ぼすアミノ酸残基がある程
度予想されており（canonical structure model; Natur
e,342巻(1989年), 877頁）、これを参考にする一方、Ｃ
ＤＲに近接したフレームワーク上のアミノ酸残基はＣＤ
Ｒの立体構造に影響すると考えられるのでこれらも適当
に選択する事ができる。デザインされた擬人化Ｂ−Ｂ１
０Ｖ領域の立体構造は適当なコンピュータープログラ
ム、好ましくはＢＩＯＣＥＳ（住友化学・住友製薬）に
より予測される。擬人化抗体のデザインの一例を図３及
び実施例５に示す。
ノ酸配列のデザイン マウスＢ−Ｂ１０ＣＤＲを移植すべきヒト抗体はＧｅｎ
ｂａｎｋ、ＥＭＢＬ等のｄａｔａｂａｓｅを用いて任意
に選ぶことができる。これらを用いて、マウスＢ−Ｂ１
０Ｖ領域アミノ酸配列にホモロジーの高いヒト抗体Ｖ領
域を選ぶ。具体的な一例として、ＶＨについてはＫＡＳ
抗体、ＶｋについてはＰＡＹ抗体が挙げられる。ＣＤＲ
以外に移植すべきフレームワーク上のアミノ酸残基につ
いては、立体構造のわかっている抗体の解析によりＣＤ
Ｒの立体構造形成に影響を及ぼすアミノ酸残基がある程
度予想されており（canonical structure model; Natur
e,342巻(1989年), 877頁）、これを参考にする一方、Ｃ
ＤＲに近接したフレームワーク上のアミノ酸残基はＣＤ
Ｒの立体構造に影響すると考えられるのでこれらも適当
に選択する事ができる。デザインされた擬人化Ｂ−Ｂ１
０Ｖ領域の立体構造は適当なコンピュータープログラ
ム、好ましくはＢＩＯＣＥＳ（住友化学・住友製薬）に
より予測される。擬人化抗体のデザインの一例を図３及
び実施例５に示す。
【００２５】（ｉｖ）擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡの
構築 擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡは全合成あるいはマウス
Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡまたはヒト抗体Ｖ領域ＤＮＡを
鋳型としたＰＣＲを繰り返すことで構築できる。この
際、擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡにシグナル配列、イ
ントロン等発現に必要なＤＮＡ配列をその５’あるいは
３’端に連結することができる。マウスＢ−Ｂ１０Ｖ領
域ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ
領域ＤＮＡを合成し、これをヒト抗体ＦＫ−００１（特
開昭６３−２６７２９５）Ｖ領域ＤＮＡの５’あるいは
３’端のＤＮＡ断片に連結した一具体例を実施例６に示
す。また、Ｖ領域上の特定アミノ酸配列をin vitro部位
特異的突然変異により任意のアミノ酸配列に換えること
ができる。このようにして様々な擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領
域遺伝子を取得した具体例を実施例７に示す。
構築 擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡは全合成あるいはマウス
Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡまたはヒト抗体Ｖ領域ＤＮＡを
鋳型としたＰＣＲを繰り返すことで構築できる。この
際、擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡにシグナル配列、イ
ントロン等発現に必要なＤＮＡ配列をその５’あるいは
３’端に連結することができる。マウスＢ−Ｂ１０Ｖ領
域ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ
領域ＤＮＡを合成し、これをヒト抗体ＦＫ−００１（特
開昭６３−２６７２９５）Ｖ領域ＤＮＡの５’あるいは
３’端のＤＮＡ断片に連結した一具体例を実施例６に示
す。また、Ｖ領域上の特定アミノ酸配列をin vitro部位
特異的突然変異により任意のアミノ酸配列に換えること
ができる。このようにして様々な擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領
域遺伝子を取得した具体例を実施例７に示す。
【００２６】（ｖ）擬人化Ｂ−Ｂ１０発現プラスミドの
構築 擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡに必要ならば翻訳開始シ
グナル、転写開始シグナル（プロモーター）、エンハン
サー等を付加する事ができる。プロモーター、エンハン
サーの例としてＳＶ４０（J.Mol.Appl.Genet., 1巻(198
2年), 327頁）あるいはサイトメガロウィルス由来のプ
ロモーター／エンハンサー（Cell, 41巻(1985 年),521
頁）、ラウス腫瘍ウィルスのＬＴＲ（Proc.Natl.Aca.Sc
i.USA, 76 巻(1982 年), 6777 頁）等がある。ヒトＦＫ
−００１抗体遺伝子のプロモーター／エンハンサーを使
用した具体例を実施例６に示す。擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領
域の下流に定常（Ｃ）領域の遺伝子を連結し、擬人化抗
体遺伝子を構築する。Ｃ領域遺伝子はＪＣＲＢ等より入
手できる。擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子は別
々かあるいは同一のベクターに連結して発現プラスミド
を構築することができる。発現ベクターとしてはＳＶ４
０由来ベクター（J.Mol.Appl.Genet., 1巻(1982年), 32
7頁）、牛パピローマウィルスベクター（Proc.Natl.Ac
a.Sci.USA, 79巻(1982年), 7147 頁）等が使用できる。
ベクターとしてｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Mol.Cell.Biol., 1
巻(1981 年),854 頁）、ｐＵＣ１１８（Methods Enzymo
l.,153巻(1987 年),3 頁）を使った具体例を実施例８、
９に示す。
構築 擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ＤＮＡに必要ならば翻訳開始シ
グナル、転写開始シグナル（プロモーター）、エンハン
サー等を付加する事ができる。プロモーター、エンハン
サーの例としてＳＶ４０（J.Mol.Appl.Genet., 1巻(198
2年), 327頁）あるいはサイトメガロウィルス由来のプ
ロモーター／エンハンサー（Cell, 41巻(1985 年),521
頁）、ラウス腫瘍ウィルスのＬＴＲ（Proc.Natl.Aca.Sc
i.USA, 76 巻(1982 年), 6777 頁）等がある。ヒトＦＫ
−００１抗体遺伝子のプロモーター／エンハンサーを使
用した具体例を実施例６に示す。擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領
域の下流に定常（Ｃ）領域の遺伝子を連結し、擬人化抗
体遺伝子を構築する。Ｃ領域遺伝子はＪＣＲＢ等より入
手できる。擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子は別
々かあるいは同一のベクターに連結して発現プラスミド
を構築することができる。発現ベクターとしてはＳＶ４
０由来ベクター（J.Mol.Appl.Genet., 1巻(1982年), 32
7頁）、牛パピローマウィルスベクター（Proc.Natl.Ac
a.Sci.USA, 79巻(1982年), 7147 頁）等が使用できる。
ベクターとしてｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Mol.Cell.Biol., 1
巻(1981 年),854 頁）、ｐＵＣ１１８（Methods Enzymo
l.,153巻(1987 年),3 頁）を使った具体例を実施例８、
９に示す。
【００２７】（ｖｉ）擬人化Ｂ−Ｂ１０発現プラスミド
のトランスフェクション 抗体非産生の動物細胞株好ましくはマウス骨髄腫細胞を
宿主として用い、通常のＤＮＡ導入法により擬人化Ｂ−
Ｂ１０抗体遺伝子を発現させ擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体産生
細胞株を取得することができる。擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体
遺伝子発現プラスミドは、必要に応じてマーカープラス
ミドとともに赤血球ゴースト法（Proc.Natl.Acid.Sci.U
SA, 77巻(1980 年), 2163 頁）、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法（Nature, 293 巻(1981 年), 79 頁）、燐酸カルシ
ュウム法（Virology, 52巻(1973年), 456頁）、プロト
プラスト融合法（Cell, 33巻(1981 年), 717頁）、エレ
クトロポーレーション法（Proc.Natl.Aca.Sci.USA, 81
巻(1984 年), 7161 頁）、リポフェクション法（Proc.N
atl.Acid.Sci.USA, 84巻(1987), 7413頁）等により宿主
細胞に導入できる。ＤＮＡ導入後、Ｇ−４１８或いはミ
コフェノール酸等の薬剤を含む選択培地で培養し、ＤＮ
Ａ導入細胞を選択できる。培養上清中の擬人化Ｂ−Ｂ１
０を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等により検出し、薬
剤耐性細胞株から擬人化Ｂ−Ｂ１０産生細胞株を選択す
ることができる。擬人化Ｂ−Ｂ１０産生細胞株を培養
し、その培養上清から通常のクロマトグラフィーで擬人
化Ｂ−Ｂ１０を精製、取得することができる。遺伝子増
幅が可能なマーカーを使用した場合は、選択薬剤を加え
ることにより、抗体遺伝子の遺伝子増幅を誘発させ、抗
体産生量を増加させることができる。ＦＫ−００１抗体
遺伝子の発現ユニットを使用して擬人化Ｂ−Ｂ１０発現
プラスミドを構築し、マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａ
ｇ１４（ＡＴＣＣより入手可能）を宿主細胞としてトラ
ンスフェクトして擬人化Ｂ−Ｂ１０産生細胞を樹立し、
擬人化Ｂ−Ｂ１０を回収した具体例を実施例１０、１
２、１３に示す。精製された擬人化Ｂ−Ｂ１０は、生物
学的製剤の製剤化に通常用いられる方法によって製剤化
される。基本的には、メンブレンフィルター等による瀘
過除菌操作の後に、安定化剤を加えて、製剤化を行う。
のトランスフェクション 抗体非産生の動物細胞株好ましくはマウス骨髄腫細胞を
宿主として用い、通常のＤＮＡ導入法により擬人化Ｂ−
Ｂ１０抗体遺伝子を発現させ擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体産生
細胞株を取得することができる。擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体
遺伝子発現プラスミドは、必要に応じてマーカープラス
ミドとともに赤血球ゴースト法（Proc.Natl.Acid.Sci.U
SA, 77巻(1980 年), 2163 頁）、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法（Nature, 293 巻(1981 年), 79 頁）、燐酸カルシ
ュウム法（Virology, 52巻(1973年), 456頁）、プロト
プラスト融合法（Cell, 33巻(1981 年), 717頁）、エレ
クトロポーレーション法（Proc.Natl.Aca.Sci.USA, 81
巻(1984 年), 7161 頁）、リポフェクション法（Proc.N
atl.Acid.Sci.USA, 84巻(1987), 7413頁）等により宿主
細胞に導入できる。ＤＮＡ導入後、Ｇ−４１８或いはミ
コフェノール酸等の薬剤を含む選択培地で培養し、ＤＮ
Ａ導入細胞を選択できる。培養上清中の擬人化Ｂ−Ｂ１
０を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等により検出し、薬
剤耐性細胞株から擬人化Ｂ−Ｂ１０産生細胞株を選択す
ることができる。擬人化Ｂ−Ｂ１０産生細胞株を培養
し、その培養上清から通常のクロマトグラフィーで擬人
化Ｂ−Ｂ１０を精製、取得することができる。遺伝子増
幅が可能なマーカーを使用した場合は、選択薬剤を加え
ることにより、抗体遺伝子の遺伝子増幅を誘発させ、抗
体産生量を増加させることができる。ＦＫ−００１抗体
遺伝子の発現ユニットを使用して擬人化Ｂ−Ｂ１０発現
プラスミドを構築し、マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａ
ｇ１４（ＡＴＣＣより入手可能）を宿主細胞としてトラ
ンスフェクトして擬人化Ｂ−Ｂ１０産生細胞を樹立し、
擬人化Ｂ−Ｂ１０を回収した具体例を実施例１０、１
２、１３に示す。精製された擬人化Ｂ−Ｂ１０は、生物
学的製剤の製剤化に通常用いられる方法によって製剤化
される。基本的には、メンブレンフィルター等による瀘
過除菌操作の後に、安定化剤を加えて、製剤化を行う。
【００２８】（ｖｉｉ）擬人化Ｂ−Ｂ１０の評価 擬人化Ｂ−Ｂ１０を評価する効果的な手段として酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（E.HarlowとD.Lane, Antibodi
es: A Laboratory Manual, 1988年, Cold Spring Harbo
r Laboratory, USA, 特に14章）を用いることができ
る。Ｈ鎖Ｃ領域に対する抗体を吸着させたプレートを用
いたＥＬＩＳＡにより培養上清中の抗体量を求める事が
できる。擬人化Ｂ−Ｂ１０の生物活性は活性化ヒトＴ細
胞のＩＬ−２依存性増殖の抑制を検出する事で測定でき
る。具体例を実施例１１、１４に示す。対宿主移植片反
応、対移植片宿主反応に伴う疾患の治療及び予防に、骨
髄、腎、心臓、肺、すい臓、皮膚、肝臓等を移植する際
の拒絶反応の抑制に、Ｔ細胞依存性のアレルギーあるい
は自己免疫疾患（心筋炎、糖尿病、重症筋無力症、エリ
テマトーデス、クローン病、多発性硬化症、エイズ、脳
脊髄炎、関節炎等）の治療、またＴ細胞白血病のように
ＩＬ−２リセプターを発現しているような腫瘍の治療に
用いられる時、本擬人化Ｂ−Ｂ１０は、通常約０.０５
〜５００mg非経口的に投与される。
疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（E.HarlowとD.Lane, Antibodi
es: A Laboratory Manual, 1988年, Cold Spring Harbo
r Laboratory, USA, 特に14章）を用いることができ
る。Ｈ鎖Ｃ領域に対する抗体を吸着させたプレートを用
いたＥＬＩＳＡにより培養上清中の抗体量を求める事が
できる。擬人化Ｂ−Ｂ１０の生物活性は活性化ヒトＴ細
胞のＩＬ−２依存性増殖の抑制を検出する事で測定でき
る。具体例を実施例１１、１４に示す。対宿主移植片反
応、対移植片宿主反応に伴う疾患の治療及び予防に、骨
髄、腎、心臓、肺、すい臓、皮膚、肝臓等を移植する際
の拒絶反応の抑制に、Ｔ細胞依存性のアレルギーあるい
は自己免疫疾患（心筋炎、糖尿病、重症筋無力症、エリ
テマトーデス、クローン病、多発性硬化症、エイズ、脳
脊髄炎、関節炎等）の治療、またＴ細胞白血病のように
ＩＬ−２リセプターを発現しているような腫瘍の治療に
用いられる時、本擬人化Ｂ−Ｂ１０は、通常約０.０５
〜５００mg非経口的に投与される。
【００２９】
１）ヒトに投与された場合、マウスＭａｂの血中半減期
は１５時間程度である（J.Natl.Cancer Inst.,80巻(198
8年), 937頁）。それに対しヒトＩｇＧ１の場合は３週
間程度である。擬人化抗体は、ヒト抗体に非常に近い
為、ヒト抗体並の血中半減期が期待される。従って、マ
ウスＢ−Ｂ１０よりも擬人化Ｂ−Ｂ１０は、血中半減期
がかなり長いと予想され、効果がより長期に及ぶと予想
される。
は１５時間程度である（J.Natl.Cancer Inst.,80巻(198
8年), 937頁）。それに対しヒトＩｇＧ１の場合は３週
間程度である。擬人化抗体は、ヒト抗体に非常に近い
為、ヒト抗体並の血中半減期が期待される。従って、マ
ウスＢ−Ｂ１０よりも擬人化Ｂ−Ｂ１０は、血中半減期
がかなり長いと予想され、効果がより長期に及ぶと予想
される。
【００３０】２）１)によって、投与回数が低減され、
かつ投与量も減らすことができる。 ３）擬人化Ｂ−Ｂ１０は、マウスＢ−Ｂ１０に比べヒト
に対する抗原性がかなり小さい。実際擬人化抗体Ｃａｍ
ｐａｔｈ−１Ｈの投与例（２例）では抗Ｃａｍｐａｔｈ
−１Ｈ抗体が誘起されていない（Lancet, 2巻(1988年),
1394頁）。従って、擬人化Ｂ−Ｂ１０でも、マウスＢ−
Ｂ１０に比べ、ヒトに投与した場合に心配されるような
中和抗体ができにくいと思われる。これによって、長期
頻回投与が可能となり治療効果が増大し、適応症例が拡
大する。
かつ投与量も減らすことができる。 ３）擬人化Ｂ−Ｂ１０は、マウスＢ−Ｂ１０に比べヒト
に対する抗原性がかなり小さい。実際擬人化抗体Ｃａｍ
ｐａｔｈ−１Ｈの投与例（２例）では抗Ｃａｍｐａｔｈ
−１Ｈ抗体が誘起されていない（Lancet, 2巻(1988年),
1394頁）。従って、擬人化Ｂ−Ｂ１０でも、マウスＢ−
Ｂ１０に比べ、ヒトに投与した場合に心配されるような
中和抗体ができにくいと思われる。これによって、長期
頻回投与が可能となり治療効果が増大し、適応症例が拡
大する。
【００３１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されない
ことは言うまでもない。実施例１ Ｂ−Ｂ１０産生ハイブリドーマからのＲＮＡ
の抽出精製 Ｂ−Ｂ１０産生ハイブリドーマを４Ｍグアニジンチオシ
アネート（６０℃）に懸濁し、１８Ｇ注射針を通して粘
度を下げた後、当量のフェノール（６０℃）を加え、激
しく振盪した。１／４容の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．２）／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）／１ｍ
ＭＥＤＴＡ、さらに１／２容のクロロホルム／イソアミ
ルアルコール混液（２４：１）を加え、６０℃で激しく
振盪し、氷中で冷やした後、遠心分離で水相を得た後、
エタノール沈澱によりＲＮＡを回収した。
に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されない
ことは言うまでもない。実施例１ Ｂ−Ｂ１０産生ハイブリドーマからのＲＮＡ
の抽出精製 Ｂ−Ｂ１０産生ハイブリドーマを４Ｍグアニジンチオシ
アネート（６０℃）に懸濁し、１８Ｇ注射針を通して粘
度を下げた後、当量のフェノール（６０℃）を加え、激
しく振盪した。１／４容の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．２）／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）／１ｍ
ＭＥＤＴＡ、さらに１／２容のクロロホルム／イソアミ
ルアルコール混液（２４：１）を加え、６０℃で激しく
振盪し、氷中で冷やした後、遠心分離で水相を得た後、
エタノール沈澱によりＲＮＡを回収した。
【００３２】実施例２ Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域ｃＤＮＡのク
ローニング マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域およびＶｋ領域のｃＤＮＡを
Ｖ領域特異的プライマーを用いて合成し、ＰＣＲにて増
幅し、クローニング後、ＤＮＡ配列をシーケンシングし
た。まずＶＨＮ末端にアニーリングするプライマーＶＨ
ｂａｃｋ、ＶＨＣ末端にアニーリングするプライマーＶ
Ｈｆｏｒ、ＶｋＮ末端にアニーリングするプライマーＶ
ｋｂａｃｋ、ＶｋＣ末端にアニーリングするプライマー
Ｖｋｆｏｒを合成した（Applied Biosystems Inc., モ
デル３８０Ａ使用）。これらのプライマーのＤＮＡ配列
を以下に示す。
ローニング マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域およびＶｋ領域のｃＤＮＡを
Ｖ領域特異的プライマーを用いて合成し、ＰＣＲにて増
幅し、クローニング後、ＤＮＡ配列をシーケンシングし
た。まずＶＨＮ末端にアニーリングするプライマーＶＨ
ｂａｃｋ、ＶＨＣ末端にアニーリングするプライマーＶ
Ｈｆｏｒ、ＶｋＮ末端にアニーリングするプライマーＶ
ｋｂａｃｋ、ＶｋＣ末端にアニーリングするプライマー
Ｖｋｆｏｒを合成した（Applied Biosystems Inc., モ
デル３８０Ａ使用）。これらのプライマーのＤＮＡ配列
を以下に示す。
【００３３】ＶＨｂａｃｋ
【化１９】 配列番号１０
【化２０】 配列番号１１
【００３４】ＶＨｆｏｒ
【化２１】 配列番号１２
【化２２】 配列番号１３
【００３５】Ｖｋｂａｃｋ
【化２３】 配列番号１４
【化２４】 配列番号１５
【００３６】Ｖｋｆｏｒ
【化２５】 配列番号１６
【００３７】まずＶＨｆｏｒプライマーを使いＢ−Ｂ１
０ＲＮＡよりＢ−Ｂ１０ＶＨｃＤＮＡを合成し、続けて
ＶＨｆｏｒ、ＶＨｂａｃｋプライマーによりＰＣＲを行
った。またＶｋｆｏｒプライマーを使いＢ−Ｂ１０ＲＮ
ＡよりＢ−Ｂ１０ＶｋｃＤＮＡを合成し、続けてプライ
マーＶｋｆｏｒ、ＶｋｂａｃｋプライマーによりＰＣＲ
を行った。ｃＤＮＡ合成は５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８．３）／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／０．
００１％ゼラチン／各０．８ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ／２μｌＲＮＡ／１μＭプライマー
／２０ユニット逆転写酵素（ＲＡＶ−２、宝酒造）の反
応組成にて２０μｌで、４２℃、３０分反応して行っ
た。９５℃、５分処理した後、２０μｌ使ってＰＣＲを
行った。ＰＣＲは１００μｌで５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．３）／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／
０．００１％ゼラチン／各０．４ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ／１μＭプライマーの反応組成
で行った。反応温度、時間は９５℃、３０秒／５５℃、
３０秒／７２℃、１分であり、これを４０回繰り返し
た。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分離した後、ゲルから
抽出精製した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造）処理して５’端を燐酸化した後、フ
ァージベクターＭ１３ｍｐ１９またはプラスミドベクタ
ーｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングし
た。クローニングされたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をダイ
デオキシ法にてシーケンシングした。シーケンシングに
はｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト近傍の市販の
プライマー（宝酒造）を、また反応にはSequenase Vers
ion 2.0 DNA Sewquencing Kit（Unite states Biochemi
cal Corporation, USA）を用い、実験操作は添付のプロ
トコールに従った。この時同定されたＤＮＡ配列及び予
想されるアミノ酸配列のうちＮ末端、Ｃ末端の配列は混
合プライマーによるものなので正確でない可能性があ
る。実施例３、４によって確実な配列を決定し、図１お
よび２に示した。尚、ＶｋＮ末端配列については、Ｖｋ
ｂａｃｋプライマーが実際にはＶｋのさらに５’上流側
にアニーリングしたため、プライマーによらない正確な
Ｎ末端配列がこの時点で判明した。
０ＲＮＡよりＢ−Ｂ１０ＶＨｃＤＮＡを合成し、続けて
ＶＨｆｏｒ、ＶＨｂａｃｋプライマーによりＰＣＲを行
った。またＶｋｆｏｒプライマーを使いＢ−Ｂ１０ＲＮ
ＡよりＢ−Ｂ１０ＶｋｃＤＮＡを合成し、続けてプライ
マーＶｋｆｏｒ、ＶｋｂａｃｋプライマーによりＰＣＲ
を行った。ｃＤＮＡ合成は５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８．３）／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／０．
００１％ゼラチン／各０．８ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ／２μｌＲＮＡ／１μＭプライマー
／２０ユニット逆転写酵素（ＲＡＶ−２、宝酒造）の反
応組成にて２０μｌで、４２℃、３０分反応して行っ
た。９５℃、５分処理した後、２０μｌ使ってＰＣＲを
行った。ＰＣＲは１００μｌで５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．３）／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／
０．００１％ゼラチン／各０．４ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ／１μＭプライマーの反応組成
で行った。反応温度、時間は９５℃、３０秒／５５℃、
３０秒／７２℃、１分であり、これを４０回繰り返し
た。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分離した後、ゲルから
抽出精製した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造）処理して５’端を燐酸化した後、フ
ァージベクターＭ１３ｍｐ１９またはプラスミドベクタ
ーｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングし
た。クローニングされたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をダイ
デオキシ法にてシーケンシングした。シーケンシングに
はｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト近傍の市販の
プライマー（宝酒造）を、また反応にはSequenase Vers
ion 2.0 DNA Sewquencing Kit（Unite states Biochemi
cal Corporation, USA）を用い、実験操作は添付のプロ
トコールに従った。この時同定されたＤＮＡ配列及び予
想されるアミノ酸配列のうちＮ末端、Ｃ末端の配列は混
合プライマーによるものなので正確でない可能性があ
る。実施例３、４によって確実な配列を決定し、図１お
よび２に示した。尚、ＶｋＮ末端配列については、Ｖｋ
ｂａｃｋプライマーが実際にはＶｋのさらに５’上流側
にアニーリングしたため、プライマーによらない正確な
Ｎ末端配列がこの時点で判明した。
【００３８】実施例３ 気相プロテインシーケンサーに
よるマウスＢ−Ｂ１０ＶＨＮ末端側アミノ酸配列の確認 精製マウスＢ−Ｂ１０抗体を当量のloading buffer（１
２５ｍＭＴｒｉｓ塩酸ｐＨ６．８／４％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）／１０％２−メルカプトエタノール
／０．０１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ））と混
合し、１００℃、５分処理した後、Laemmliの方法（Nat
ure、1970年、277巻、680頁）に従って、１２．５％ポ
リアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を用いて泳動を行っ
た（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。泳動後、１０％メタノールを
含む１０ｍＭＣＡＰＳ（3-cyclohexylaminopopanesulfa
te、同仁化学）緩衝液ｐＨ１１．０中でＰＶＤＦ膜（Mi
llipore, USA）にエレクトロブロッティングした。Coom
assie Brilliant Blue R 250（和光）で染色後、Ｈ鎖の
バンドを切り出し、プロテインシークエンサーモデル４
７０Ａ／１２０Ａ（Applied Biosystems, USA）にてＮ
末端のアミノ酸配列の決定を行った（J.Biol.Chem.、19
87年、262巻、10035頁）。
よるマウスＢ−Ｂ１０ＶＨＮ末端側アミノ酸配列の確認 精製マウスＢ−Ｂ１０抗体を当量のloading buffer（１
２５ｍＭＴｒｉｓ塩酸ｐＨ６．８／４％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）／１０％２−メルカプトエタノール
／０．０１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ））と混
合し、１００℃、５分処理した後、Laemmliの方法（Nat
ure、1970年、277巻、680頁）に従って、１２．５％ポ
リアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を用いて泳動を行っ
た（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。泳動後、１０％メタノールを
含む１０ｍＭＣＡＰＳ（3-cyclohexylaminopopanesulfa
te、同仁化学）緩衝液ｐＨ１１．０中でＰＶＤＦ膜（Mi
llipore, USA）にエレクトロブロッティングした。Coom
assie Brilliant Blue R 250（和光）で染色後、Ｈ鎖の
バンドを切り出し、プロテインシークエンサーモデル４
７０Ａ／１２０Ａ（Applied Biosystems, USA）にてＮ
末端のアミノ酸配列の決定を行った（J.Biol.Chem.、19
87年、262巻、10035頁）。
【００３９】結果を以下に示す。 ＶＨＮ末端側アミノ酸配列
【化２６】 配列番号１７
【００４０】実施例４ ＰＣＲ産物を使用したマウスＢ
−Ｂ１０ＶＨ，ＶｋＣ末端側アミノ酸配列の確認 マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域およびＶｋ領域のＣ末端側の
アミノ酸配列の確認をするためにこの領域をコードする
ＤＮＡ配列をＰＣＲにて増幅し、クローニング後、ＤＮ
Ａ配列をシーケンシングした。まずＶＨＣＤＲ１にアニ
ーリングするプライマーＶＨ２、ＣＨ１のＮ末端側にア
ニーリングするプライマーＭＩＧ−１、ＶｋＣＤＲ１に
アニーリングするプライマーＶｋ２、およびＣｋのＮ末
端側にアニーリングするプライマーＭＩＫ−１を合成し
た。これらのプライマーのＤＮＡ配列を以下に示す。
−Ｂ１０ＶＨ，ＶｋＣ末端側アミノ酸配列の確認 マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域およびＶｋ領域のＣ末端側の
アミノ酸配列の確認をするためにこの領域をコードする
ＤＮＡ配列をＰＣＲにて増幅し、クローニング後、ＤＮ
Ａ配列をシーケンシングした。まずＶＨＣＤＲ１にアニ
ーリングするプライマーＶＨ２、ＣＨ１のＮ末端側にア
ニーリングするプライマーＭＩＧ−１、ＶｋＣＤＲ１に
アニーリングするプライマーＶｋ２、およびＣｋのＮ末
端側にアニーリングするプライマーＭＩＫ−１を合成し
た。これらのプライマーのＤＮＡ配列を以下に示す。
【００４１】ＶＨ２
【化２７】 配列番号１８
【００４２】Ｖｋ２
【化２８】 配列番号１９
【００４３】ＭＩＧ−１
【化２９】 配列番号２０
【００４４】ＭＩＫ−１
【化３０】 配列番号２１
【００４５】まずＭＩＧ−１プライマーを使いＢ−Ｂ１
０ＲＮＡよりＢ−Ｂ１０ＶＨｃＤＮＡを合成し、続けて
プライマーＶＨ２，ＭＩＧ−１によりＰＣＲを行った。
またＭＩＫ−１プライマーを使いＢ−Ｂ１０ＲＮＡより
Ｂ−Ｂ１０ＶｋｃＤＮＡを合成し、続けてプライマーＶ
ｋ２，ＭＩＫ−１によりＰＣＲを行った。ｃＤＮＡ合成
は５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）
／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／０．００１％ゼラチン／各２
ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ／２μｌ
ＲＮＡ／１μＭプライマー／２０ユニット逆転写酵素
（ＲＡＶ−２、宝酒造）の反応組成にて５０μｌで、４
２℃、１時間反応して行った。９５℃、１０分処理した
後、１０μｌ使ってＰＣＲを行った。ＰＣＲは１００μ
ｌで５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
３）／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／０．００１％ゼラチン／
各０．４ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
／１μＭプライマーの反応組成で行った。反応温度、時
間は９５℃、１分／５０℃、１分／７２℃、２分であ
り、これを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物をゲル電気泳
動で分離した後、ゲルから抽出精製した。このＰＣＲ産
物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）処理して
５’端を燐酸化した後、プラスミドベクターｐＵＣ１９
のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。クローニン
グされたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をダイデオキシ法にて
シーケンシングした。シーケンシングにはｐＵＣ１９の
マルチクローニングサイト近傍の市販のプライマー（宝
酒造）を、また反応にはSequenase Version 2.0 DNA Se
quencing Kit（Unite states Biochemical Corporatio
n, USA）を用い、実験操作は添付のプロトコールに従っ
た。この時同定されたＤＮＡ配列及び予想されるアミノ
酸配列は図１および２に含まれている。
０ＲＮＡよりＢ−Ｂ１０ＶＨｃＤＮＡを合成し、続けて
プライマーＶＨ２，ＭＩＧ−１によりＰＣＲを行った。
またＭＩＫ−１プライマーを使いＢ−Ｂ１０ＲＮＡより
Ｂ−Ｂ１０ＶｋｃＤＮＡを合成し、続けてプライマーＶ
ｋ２，ＭＩＫ−１によりＰＣＲを行った。ｃＤＮＡ合成
は５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）
／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／０．００１％ゼラチン／各２
ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ／２μｌ
ＲＮＡ／１μＭプライマー／２０ユニット逆転写酵素
（ＲＡＶ−２、宝酒造）の反応組成にて５０μｌで、４
２℃、１時間反応して行った。９５℃、１０分処理した
後、１０μｌ使ってＰＣＲを行った。ＰＣＲは１００μ
ｌで５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
３）／１．５ｍＭＭｇＣｌ2／０．００１％ゼラチン／
各０．４ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
／１μＭプライマーの反応組成で行った。反応温度、時
間は９５℃、１分／５０℃、１分／７２℃、２分であ
り、これを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物をゲル電気泳
動で分離した後、ゲルから抽出精製した。このＰＣＲ産
物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）処理して
５’端を燐酸化した後、プラスミドベクターｐＵＣ１９
のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。クローニン
グされたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をダイデオキシ法にて
シーケンシングした。シーケンシングにはｐＵＣ１９の
マルチクローニングサイト近傍の市販のプライマー（宝
酒造）を、また反応にはSequenase Version 2.0 DNA Se
quencing Kit（Unite states Biochemical Corporatio
n, USA）を用い、実験操作は添付のプロトコールに従っ
た。この時同定されたＤＮＡ配列及び予想されるアミノ
酸配列は図１および２に含まれている。
【００４６】実施例５ 擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ、Ｖｋ領
域のアミノ酸配列のデザイン マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域のアミノ酸配列に最もホモロ
ジーの高いヒト抗体ＶＨ領域をPrinas Data Baseより検
索し、ヒト抗体ＫＡＳＶＨ領域を選別した。ホモロジー
は６３％だった。Ｖｋ領域についても同様の検索を行
い、ヒト抗体ＰＡＹＶｋ領域を選別した（ホモロジー５
７．０％）。これらヒト抗体のフレームワークをマウス
Ｂ−Ｂ１０ＣＤＲと組み合わせて、擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ
領域とした。ただし、ＶＨの２７−３０番目、９４番目
のアミノ酸はフレームワーク内にあるが、マウスＢ−Ｂ
１０の配列のままとした。これは、canonical structur
e modelに基づき、ＣＤＲの立体構造に影響を与えるフ
レームワークにアミノ酸残基を選択した結果である。こ
のようにしてデザインした擬人化Ｂ−Ｂ１０をＭ０とし
た。さらに擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ領域の４８番目のアミ
ノ酸残基をマウス型に戻したものをＭ１、６６、６７番
目のアミノ酸残基を戻したものをＭ２、１０５番目のア
ミノ酸残基を戻したものをＭ３、Ｖｋ領域の１、３番目
のアミノ酸残基を戻したものをＭ４、４９番目のアミノ
酸残基を戻したものをＭ５とした。Ｍ１、２、３、５の
アミノ酸残基はＣＤＲに近接しており、ＣＤＲの構造に
影響を与える可能性があるため選択した。ＢＩＯＣＥＳ
により予測された立体構造をマウスＢ−Ｂ１０とＭＯで
比較し、両者で差が大きいアミノ酸は活性に悪影響を与
えると考え、これをマウスＢ−Ｂ１０に戻した。このよ
うにして選択されたのがＭ４、Ｍ５である。またＭ１、
Ｍ２、Ｍ３を合わせ持つものをＭ１２３とし、Ｍ４、Ｍ
５を合わせ持つものをＭ４５とし、さらにＭ１、Ｍ２、
Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５を合わせ持つものをＭ１２３４５とし
た。これらの名称はこれらのアミノ酸残基の変異自体、
あるいはそれらを持つ抗体、それらの抗体を産生する細
胞株に共通に使用した。以上のアミノ酸配列の関係を図
３に示す。尚、アミノ酸残基番号はKabatら（Squences
of proteins of immunologicalinterest, ４版, 1987
年, NIH,USA）によった。
域のアミノ酸配列のデザイン マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域のアミノ酸配列に最もホモロ
ジーの高いヒト抗体ＶＨ領域をPrinas Data Baseより検
索し、ヒト抗体ＫＡＳＶＨ領域を選別した。ホモロジー
は６３％だった。Ｖｋ領域についても同様の検索を行
い、ヒト抗体ＰＡＹＶｋ領域を選別した（ホモロジー５
７．０％）。これらヒト抗体のフレームワークをマウス
Ｂ−Ｂ１０ＣＤＲと組み合わせて、擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ
領域とした。ただし、ＶＨの２７−３０番目、９４番目
のアミノ酸はフレームワーク内にあるが、マウスＢ−Ｂ
１０の配列のままとした。これは、canonical structur
e modelに基づき、ＣＤＲの立体構造に影響を与えるフ
レームワークにアミノ酸残基を選択した結果である。こ
のようにしてデザインした擬人化Ｂ−Ｂ１０をＭ０とし
た。さらに擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ領域の４８番目のアミ
ノ酸残基をマウス型に戻したものをＭ１、６６、６７番
目のアミノ酸残基を戻したものをＭ２、１０５番目のア
ミノ酸残基を戻したものをＭ３、Ｖｋ領域の１、３番目
のアミノ酸残基を戻したものをＭ４、４９番目のアミノ
酸残基を戻したものをＭ５とした。Ｍ１、２、３、５の
アミノ酸残基はＣＤＲに近接しており、ＣＤＲの構造に
影響を与える可能性があるため選択した。ＢＩＯＣＥＳ
により予測された立体構造をマウスＢ−Ｂ１０とＭＯで
比較し、両者で差が大きいアミノ酸は活性に悪影響を与
えると考え、これをマウスＢ−Ｂ１０に戻した。このよ
うにして選択されたのがＭ４、Ｍ５である。またＭ１、
Ｍ２、Ｍ３を合わせ持つものをＭ１２３とし、Ｍ４、Ｍ
５を合わせ持つものをＭ４５とし、さらにＭ１、Ｍ２、
Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５を合わせ持つものをＭ１２３４５とし
た。これらの名称はこれらのアミノ酸残基の変異自体、
あるいはそれらを持つ抗体、それらの抗体を産生する細
胞株に共通に使用した。以上のアミノ酸配列の関係を図
３に示す。尚、アミノ酸残基番号はKabatら（Squences
of proteins of immunologicalinterest, ４版, 1987
年, NIH,USA）によった。
【００４７】実施例６ ＰＣＲによる擬人化Ｂ−Ｂ１０
Ｍ０の合成 マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域およびＶｋ領域のｃＤＮＡ、
ならびにＦＫ−００１由来ヒト抗体遺伝子（Biotechnol
ogy、７巻、（1989）、 805-810頁）を用いて、ＰＣＲ
にて擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ、Ｖｋ遺伝子を合成した。ま
ず擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域遺伝子のＤＮＡ配列を図４お
よび５のようにデザインした。すなわち、擬人化Ｂ−Ｂ
１０Ｖ領域をコードする領域の５’側、３’側にＦＫ−
００１抗体遺伝子由来のシグナルペプチド、あるいはイ
ントロンがつながるようデザインした。これらのＤＮＡ
はＶＨはＳａｃＩ−ＢａｌＩ断片として、ＶｋはＢａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として後でクローニングでき
るようにした。図４および５に示したプライマーにてマ
ウスＶＨ、ＶｋＤＮＡを、さらにＦＫ−００１抗体遺伝
子を鋳型にして、ＰＣＲを逐次行った。Ｖ領域内のプラ
イマーはＣＤＲの領域でマウスＶ領域遺伝子とアニーリ
ングする事ができる。ＰＣＲの条件は実施例３と同様に
した。短いＰＣＲ産物をまず合成し、となりあう２つの
ＰＣＲ産物をあわせてこれを鋳型として、さらにＰＣＲ
を行い、これを繰り返すことによって、最終的に目的の
擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域遺伝子を含むＰＣＲ産物を得
た。これらをファージベクターＭ１３ｍｐ１９またはプ
ラスミドベクターｐＵＣ１８にクローニングした。クロ
ーニングされたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をダイデオキシ
法にてシーケンシングし確認した。シーケンシングには
ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト近傍の市販のプ
ライマー（宝酒造）を、また反応にはSequenase Versio
n 2.0 DNA Sequencing Kit（Unite states Biochemical
Corporation, USA）を用い、実験操作は添付のプロト
コールに従った。
Ｍ０の合成 マウスＢ−Ｂ１０ＶＨ領域およびＶｋ領域のｃＤＮＡ、
ならびにＦＫ−００１由来ヒト抗体遺伝子（Biotechnol
ogy、７巻、（1989）、 805-810頁）を用いて、ＰＣＲ
にて擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ、Ｖｋ遺伝子を合成した。ま
ず擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域遺伝子のＤＮＡ配列を図４お
よび５のようにデザインした。すなわち、擬人化Ｂ−Ｂ
１０Ｖ領域をコードする領域の５’側、３’側にＦＫ−
００１抗体遺伝子由来のシグナルペプチド、あるいはイ
ントロンがつながるようデザインした。これらのＤＮＡ
はＶＨはＳａｃＩ−ＢａｌＩ断片として、ＶｋはＢａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として後でクローニングでき
るようにした。図４および５に示したプライマーにてマ
ウスＶＨ、ＶｋＤＮＡを、さらにＦＫ−００１抗体遺伝
子を鋳型にして、ＰＣＲを逐次行った。Ｖ領域内のプラ
イマーはＣＤＲの領域でマウスＶ領域遺伝子とアニーリ
ングする事ができる。ＰＣＲの条件は実施例３と同様に
した。短いＰＣＲ産物をまず合成し、となりあう２つの
ＰＣＲ産物をあわせてこれを鋳型として、さらにＰＣＲ
を行い、これを繰り返すことによって、最終的に目的の
擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖ領域遺伝子を含むＰＣＲ産物を得
た。これらをファージベクターＭ１３ｍｐ１９またはプ
ラスミドベクターｐＵＣ１８にクローニングした。クロ
ーニングされたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列をダイデオキシ
法にてシーケンシングし確認した。シーケンシングには
ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト近傍の市販のプ
ライマー（宝酒造）を、また反応にはSequenase Versio
n 2.0 DNA Sequencing Kit（Unite states Biochemical
Corporation, USA）を用い、実験操作は添付のプロト
コールに従った。
【００４８】合成された擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ領域遺伝
子は、ＳａｃＩ−ＢａｌＩ断片として切り出され、ＦＫ
−００１抗体ＶＨ遺伝子断片のＳａｃＩ−ＢａｌＩサイ
トに挿入され、最終的に、ＦＫ−００１ＶＨプロモータ
ー、擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ領域遺伝子、ＩｇＨエンハン
サーを含む５．２−ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片として、ｐＵＣ１８にクローニングされた。このプ
ラスミドをｐｈＢ−Ｂ１０ＶＨＥＭ０とした。
子は、ＳａｃＩ−ＢａｌＩ断片として切り出され、ＦＫ
−００１抗体ＶＨ遺伝子断片のＳａｃＩ−ＢａｌＩサイ
トに挿入され、最終的に、ＦＫ−００１ＶＨプロモータ
ー、擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ領域遺伝子、ＩｇＨエンハン
サーを含む５．２−ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片として、ｐＵＣ１８にクローニングされた。このプ
ラスミドをｐｈＢ−Ｂ１０ＶＨＥＭ０とした。
【００４９】合成された擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｖk領域遺伝
子はプラスミドｐＵＣ１８のＢamＨＩ−ＨindIIIサイト
にクローニングされているが、このプラスミドのＢamＨ
ＩサイトにＦＫ−００１Ｖｋ遺伝子プロモーターを含む
１.５−kb ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片を挿入し、プラスミ
ドｐｈＢ−Ｂ１０ＶｋＭ０を構築した。
子はプラスミドｐＵＣ１８のＢamＨＩ−ＨindIIIサイト
にクローニングされているが、このプラスミドのＢamＨ
ＩサイトにＦＫ−００１Ｖｋ遺伝子プロモーターを含む
１.５−kb ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片を挿入し、プラスミ
ドｐｈＢ−Ｂ１０ＶｋＭ０を構築した。
【００５０】実施例７ In vitro部位特異的突然変異に
よる擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ及びＶｋ遺伝子へのＭ１、Ｍ
２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５変異の導入 プラスミドphＢ−Ｂ１０ＶＨＥＭ０を制限酵素ＢamＨ
Ｉ、ＨindIII消化後、アガロ−スゲル電気泳動すること
によりＢ−Ｂ１０のＶＨ遺伝子、Ｈ鎖プロモーター、Ｈ
鎖エンハンサーがコードされたＢamＨＩ−ＨindIII５.
２ｋｂ断片を分離し、さらにＧenecleanIIでこのＤＮＡ
断片を抽出精製した。
よる擬人化Ｂ−Ｂ１０ＶＨ及びＶｋ遺伝子へのＭ１、Ｍ
２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５変異の導入 プラスミドphＢ−Ｂ１０ＶＨＥＭ０を制限酵素ＢamＨ
Ｉ、ＨindIII消化後、アガロ−スゲル電気泳動すること
によりＢ−Ｂ１０のＶＨ遺伝子、Ｈ鎖プロモーター、Ｈ
鎖エンハンサーがコードされたＢamＨＩ−ＨindIII５.
２ｋｂ断片を分離し、さらにＧenecleanIIでこのＤＮＡ
断片を抽出精製した。
【００５１】この断片をシャロミドｐＵＣ１１８（宝酒
造）のＢamＨＩ−ＨindIIIサイトに挿入し、プラスミド
ｐｈＢ−Ｂ１０ＶＨＥ（１１８）を得た。また、プラス
ミドphＢ−Ｂ１０ＶｋＭ０より同様にしてＶｋ遺伝子を
含むＳacＩ−ＨindIII２.１ｋｂ断片をｐＵＣ１１８に
移し換え、プラスミドｐｈＢ−Ｂ１０Ｖｋ（１１８）を
得た。これらのプラスミドを大腸菌ＭＶ１１８４（日本
ジーン）に形質転換した。これらの形質転換体にヘルパ
ーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造）を感染後、培養し、
環状一本鎖ＤＮＡを含むファージ様粒子を得た。さらに
このファージ様粒子を精製後、中に含まれる環状一本鎖
ＤＮＡを抽出精製した。これらのＤＮＡは、in vitro部
位特異的突然変異を導入する際の鋳型として使用した。
以上の環状一本鎖ＤＮＡの調製はｐＵＣ１１８購入時に
添付されたプロトコールに従った。次にin vitro部位特
異的突然変異を導入する際のプライマーとして使用する
ＤＮＡを合成、精製した。これらのプライマーのＤＮＡ
配列を以下に示す。
造）のＢamＨＩ−ＨindIIIサイトに挿入し、プラスミド
ｐｈＢ−Ｂ１０ＶＨＥ（１１８）を得た。また、プラス
ミドphＢ−Ｂ１０ＶｋＭ０より同様にしてＶｋ遺伝子を
含むＳacＩ−ＨindIII２.１ｋｂ断片をｐＵＣ１１８に
移し換え、プラスミドｐｈＢ−Ｂ１０Ｖｋ（１１８）を
得た。これらのプラスミドを大腸菌ＭＶ１１８４（日本
ジーン）に形質転換した。これらの形質転換体にヘルパ
ーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造）を感染後、培養し、
環状一本鎖ＤＮＡを含むファージ様粒子を得た。さらに
このファージ様粒子を精製後、中に含まれる環状一本鎖
ＤＮＡを抽出精製した。これらのＤＮＡは、in vitro部
位特異的突然変異を導入する際の鋳型として使用した。
以上の環状一本鎖ＤＮＡの調製はｐＵＣ１１８購入時に
添付されたプロトコールに従った。次にin vitro部位特
異的突然変異を導入する際のプライマーとして使用する
ＤＮＡを合成、精製した。これらのプライマーのＤＮＡ
配列を以下に示す。
【００５２】Ｍ１用
【化３１】 配列番号２２
【００５３】Ｍ２用
【化３２】 配列番号２３
【００５４】Ｍ３用
【化３３】 配列番号２４
【００５５】Ｍ４用
【化３４】 配列番号２５
【００５６】Ｍ５用
【化３５】 配列番号２６
【００５７】鋳型がｐｈＢ−Ｂ１０ＶＨＥ（１１８）の
場合はプライマーＭ１、Ｍ２、またはＭ３を、鋳型がｐ
ｈＢ−Ｂ１０Ｖｋ（１１８）の場合はプライマーＭ４ま
たはＭ５を使ってin vitro部位特異的突然変異の反応を
行った。まず、鋳型とプライマーを混合し、７０℃、３
分、ついで３７℃、３０分インキュベートしてアニーリ
ングした。次にｄＣＴＰαＳ、６ユニットＫlenow frag
ment、６ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下、１６℃、
１５時間反応させ、伸長および連結反応をおこなったあ
と、未反応の鋳型ＤＮＡを除去した。５ユニットの制限
酵素ＮciＩで３７℃、９０分反応させ、鋳型ＤＮＡに切
れ目をいれた。５０ユニットＥxoIIIヌクレアーゼ存在
下３７℃、３０分反応させて、鋳型ＤＮＡの大部分を除
去した。最後に３ユニット大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、２ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下、１６℃、３
時間反応させて変異導入処理された環状２本鎖ＤＮＡを
得た。以上の操作に必要な試薬、緩衝液、精製用カラム
はＡmersham社（ＵＫ）のOligonucleotide-directed in
vitro mutagenesis system version 2のものを用い、
操作自体も添付のプロトコールに従った。変異導入され
たＤＮＡを含む反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換し、プラスミドＤＮＡを調製した。このＤＮＡを
用いて変異導入部位のＤＮＡ配列をダイデオキシシーケ
ンシング法にて確認した。シーケンシングに用いるプラ
イマーには前記合成Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５プラ
イマーまたはｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト近
傍の市販のプライマー（宝酒造）を、また反応にはSequ
enase Version 2.0 DNA Sequencing Kit（Unite states
Biochemical Corporation，USA）を用い、実験操作は
添付のプロトコールに従った。Ｍ１２３，Ｍ４５の多重
変異の導入は以上の操作を繰り返すことで行った。これ
らの変異の位置を図３に示す。
場合はプライマーＭ１、Ｍ２、またはＭ３を、鋳型がｐ
ｈＢ−Ｂ１０Ｖｋ（１１８）の場合はプライマーＭ４ま
たはＭ５を使ってin vitro部位特異的突然変異の反応を
行った。まず、鋳型とプライマーを混合し、７０℃、３
分、ついで３７℃、３０分インキュベートしてアニーリ
ングした。次にｄＣＴＰαＳ、６ユニットＫlenow frag
ment、６ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下、１６℃、
１５時間反応させ、伸長および連結反応をおこなったあ
と、未反応の鋳型ＤＮＡを除去した。５ユニットの制限
酵素ＮciＩで３７℃、９０分反応させ、鋳型ＤＮＡに切
れ目をいれた。５０ユニットＥxoIIIヌクレアーゼ存在
下３７℃、３０分反応させて、鋳型ＤＮＡの大部分を除
去した。最後に３ユニット大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、２ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下、１６℃、３
時間反応させて変異導入処理された環状２本鎖ＤＮＡを
得た。以上の操作に必要な試薬、緩衝液、精製用カラム
はＡmersham社（ＵＫ）のOligonucleotide-directed in
vitro mutagenesis system version 2のものを用い、
操作自体も添付のプロトコールに従った。変異導入され
たＤＮＡを含む反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換し、プラスミドＤＮＡを調製した。このＤＮＡを
用いて変異導入部位のＤＮＡ配列をダイデオキシシーケ
ンシング法にて確認した。シーケンシングに用いるプラ
イマーには前記合成Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５プラ
イマーまたはｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト近
傍の市販のプライマー（宝酒造）を、また反応にはSequ
enase Version 2.0 DNA Sequencing Kit（Unite states
Biochemical Corporation，USA）を用い、実験操作は
添付のプロトコールに従った。Ｍ１２３，Ｍ４５の多重
変異の導入は以上の操作を繰り返すことで行った。これ
らの変異の位置を図３に示す。
【００５８】実施例８ Ｈ鎖発現プラスミドの構築 各種Ｂ−Ｂ１０のＶＨ遺伝子、Ｈ鎖プロモーター、Ｈ鎖
エンハンサーがコードされたＢamＨＩ−ＨindIII５.２
ｋｂ断片を含むプラスミドｐｈＢ−Ｂ１０ＶＨＥＭ０，
Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ１２３を制限酵素ＢamＨＩ、Ｈin
dIII消化後、アガロースゲル電気泳動することで前記Ｄ
ＮＡ断片を分離し、さらにＧenecleanIIでこのＤＮＡ断
片を抽出精製した。別にクローン化されたヒトγ１鎖定
常領域（Ｃγ１）遺伝子を含むプラスミドを制限酵素Ｈ
indIII，ＥcoＲＩ消化後、アガロース電気泳動すること
でＣγ１遺伝子を含むＨindIII−ＥcoＲＩ６.９kb断片
を分離し、さらにＧenecleanIIによりこのＤＮＡ断片を
抽出精製した。また、プラスミドｐＳＶ２dhfrよりＢam
ＨＩ−ＥcoＲＩ４.２kb断片を上と同様にして分離精製
した。これら３種のＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで処理して連結し、各種Ｂ−Ｂ１０Ｈ鎖発現プラ
スミドphＢ−Ｂ１０dhfrＨＧ１Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ
３、Ｍ１２３を得た。
エンハンサーがコードされたＢamＨＩ−ＨindIII５.２
ｋｂ断片を含むプラスミドｐｈＢ−Ｂ１０ＶＨＥＭ０，
Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ１２３を制限酵素ＢamＨＩ、Ｈin
dIII消化後、アガロースゲル電気泳動することで前記Ｄ
ＮＡ断片を分離し、さらにＧenecleanIIでこのＤＮＡ断
片を抽出精製した。別にクローン化されたヒトγ１鎖定
常領域（Ｃγ１）遺伝子を含むプラスミドを制限酵素Ｈ
indIII，ＥcoＲＩ消化後、アガロース電気泳動すること
でＣγ１遺伝子を含むＨindIII−ＥcoＲＩ６.９kb断片
を分離し、さらにＧenecleanIIによりこのＤＮＡ断片を
抽出精製した。また、プラスミドｐＳＶ２dhfrよりＢam
ＨＩ−ＥcoＲＩ４.２kb断片を上と同様にして分離精製
した。これら３種のＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで処理して連結し、各種Ｂ−Ｂ１０Ｈ鎖発現プラ
スミドphＢ−Ｂ１０dhfrＨＧ１Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ
３、Ｍ１２３を得た。
【００５９】実施例９ ｋ鎖発現プラスミドの構築 クローン化されたＦＫ−００１ｋ鎖遺伝子を含むプラス
ミド（Biotechnology、７巻、（1989）、805-810頁）よ
りｋ鎖定常領域（Ｃk）の遺伝子を含むＨindIII−Ｈind
III５.６kb断片を、制限酵素ＨindIII消化後、アガロー
スゲル電気泳動することで分離し、ＧenecleanIIにより
抽出精製した。別に各種Ｂ−Ｂ１０のＶｋ遺伝子を含む
プラスミドphＢ−Ｂ１０ＶｋＭ０、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ４５
を制限酵素ＨindIII消化後、ＢＡＰ処理し、これを前記
ＨindIII−ＨindIII５.６kb断片とともにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで処理し、これらのプラスミドのＨindIIIサイト
にこのＨindIII−ＨindIII５.６kb断片を挿入し、各種
Ｂ−Ｂ１０Ｋ鎖の発現プラスミドｐｈＢ−Ｂ１０ＨＫＭ
０、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ４５を得た。
ミド（Biotechnology、７巻、（1989）、805-810頁）よ
りｋ鎖定常領域（Ｃk）の遺伝子を含むＨindIII−Ｈind
III５.６kb断片を、制限酵素ＨindIII消化後、アガロー
スゲル電気泳動することで分離し、ＧenecleanIIにより
抽出精製した。別に各種Ｂ−Ｂ１０のＶｋ遺伝子を含む
プラスミドphＢ−Ｂ１０ＶｋＭ０、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ４５
を制限酵素ＨindIII消化後、ＢＡＰ処理し、これを前記
ＨindIII−ＨindIII５.６kb断片とともにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで処理し、これらのプラスミドのＨindIIIサイト
にこのＨindIII−ＨindIII５.６kb断片を挿入し、各種
Ｂ−Ｂ１０Ｋ鎖の発現プラスミドｐｈＢ−Ｂ１０ＨＫＭ
０、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ４５を得た。
【００６０】実施例１０ リポフェクチン法による各種
Ｂ−Ｂ１０抗体産生細胞株の樹立 マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／
０、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）を１０％牛胎児血清
（ＦＣＳ，Hyclone，USA）含有ダルベッコ変法イーグル
培地（ＤＭＥＭ、日水、日本）にて対数増殖期まで培養
した。遠心分離により５×１０6の細胞を集め０.５ｍｌ
の無血清培地（セルグロッサ−Ｈ、住友製薬）に懸濁し
６ウエルプレートの１ウェルにいれた。各種Ｂ−Ｂ１０
のＨ鎖発現プラスミド１０μｇ、Ｌ鎖発現プラスミド１
０μｇ、およびｐＳＶ２neo５μｇを制限酵素ＰｖｕＩ
（宝酒造）で消化し直鎖状ＤＮＡとした後、混合してエ
タノ−ル沈澱し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを２５
０μｌのセルグロッサ−Ｈに懸濁した。リポフェクチン
（Bethesda Research Laboratory，USA）５０μｌをセ
ルグロッサ−Ｈ２００μｌで希釈し、先のＤＮＡ溶液と
混合し、ＤＮＡ／リポフェクチン複合体を作った。６ウ
エルプレート上の細胞にＤＮＡ／リポフェクチン複合体
を滴下し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で７時間培養し
た。細胞を回収し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに５−１
０×１０4／ｍｌの細胞密度で懸濁し、９６ウエルプレ
ートへ１００μｌずつ入れた。１−２日後，８００μｇ
／ｍｌＧ−４１８（Gibco，USA）および１０％ＦＣＳを
含有したＤＭＥＭを１００μｌ追加した。その後は、２
−３日毎に４００μｇ／ｍｌＧ−４１８および１０％Ｆ
ＣＳ含有ＤＭＥＭで培地を半量ずつ交換し培養を続け
た。培養２週間目頃にはＧ−４１８耐性コロニーが確認
された。各ウェルの培養上清の抗体量を以下の実施例で
示す酵素免疫測定法（Enzyme-linked immunosorbent as
say，ＥＬＩＳＡ）にて算定し、比較的高濃度に抗体を
蓄積しているウェルを選別してそれらに含まれる細胞を
混合し、抗体産生細胞とした。
Ｂ−Ｂ１０抗体産生細胞株の樹立 マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／
０、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）を１０％牛胎児血清
（ＦＣＳ，Hyclone，USA）含有ダルベッコ変法イーグル
培地（ＤＭＥＭ、日水、日本）にて対数増殖期まで培養
した。遠心分離により５×１０6の細胞を集め０.５ｍｌ
の無血清培地（セルグロッサ−Ｈ、住友製薬）に懸濁し
６ウエルプレートの１ウェルにいれた。各種Ｂ−Ｂ１０
のＨ鎖発現プラスミド１０μｇ、Ｌ鎖発現プラスミド１
０μｇ、およびｐＳＶ２neo５μｇを制限酵素ＰｖｕＩ
（宝酒造）で消化し直鎖状ＤＮＡとした後、混合してエ
タノ−ル沈澱し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを２５
０μｌのセルグロッサ−Ｈに懸濁した。リポフェクチン
（Bethesda Research Laboratory，USA）５０μｌをセ
ルグロッサ−Ｈ２００μｌで希釈し、先のＤＮＡ溶液と
混合し、ＤＮＡ／リポフェクチン複合体を作った。６ウ
エルプレート上の細胞にＤＮＡ／リポフェクチン複合体
を滴下し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で７時間培養し
た。細胞を回収し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに５−１
０×１０4／ｍｌの細胞密度で懸濁し、９６ウエルプレ
ートへ１００μｌずつ入れた。１−２日後，８００μｇ
／ｍｌＧ−４１８（Gibco，USA）および１０％ＦＣＳを
含有したＤＭＥＭを１００μｌ追加した。その後は、２
−３日毎に４００μｇ／ｍｌＧ−４１８および１０％Ｆ
ＣＳ含有ＤＭＥＭで培地を半量ずつ交換し培養を続け
た。培養２週間目頃にはＧ−４１８耐性コロニーが確認
された。各ウェルの培養上清の抗体量を以下の実施例で
示す酵素免疫測定法（Enzyme-linked immunosorbent as
say，ＥＬＩＳＡ）にて算定し、比較的高濃度に抗体を
蓄積しているウェルを選別してそれらに含まれる細胞を
混合し、抗体産生細胞とした。
【００６１】実施例１１ 酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）による擬人化Ｂ−Ｂ１０（ヒトＩｇＧ（γ、ｋ））
量の測定 擬人化Ｂ−Ｂ１０（ヒトＩｇＧ（γ、ｋ））量の測定は
以下の方法で行った。抗ヒトＩｇＧ（γ鎖）抗体（Capp
el，USA）燐酸緩衝液（ｐＨ７.２、組成ＮａＣｌ（８ｇ
／ｌ）、ＫＣｌ（０.２ｇ／ｌ）、ＮａＨＰＯ4１２Ｈ2
Ｏ（２.９９ｇ／ｌ）およびＫＨ2ＰＯ4（０.２ｇ／
ｌ））（以下ＰＢＳと略記）に１０μｇ／ｍｌの濃度に
溶かし、９６ウェルマイクロプレート（Falcon, USA）
（以下マイクロプレートと略記）に１ウェル当たり１０
０μｌずつ分注し、３７℃にて２時間保温した。１％ウ
シ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記）含有ＰＢＳ溶液
を１ウェルあたり１２０μｌずつ分注し３７℃にて２時
間保温することによりマイクロプレート上の蛋白未吸着
部分をブロッキングした。抗体量を測定したい試料を
０．０５％Ｔween２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴと略
記）で適宜希釈し１ウェルあたり１００μｌ加え、３７
℃で２時間保温した。その後試料を除去し、ＰＢＳＴで
３回洗浄した。続いて第２抗体液を１ウエルあたり１０
０μｌずつ加え、３７℃で２時間保温した。第２抗体と
してＰＢＳＴで５００〜１,０００倍希釈したホスファ
ターゼ標識アフィニティ精製抗ヒト免疫グロブリンｋ鎖
抗体（Tago，USA）を用いた。 第２抗体を除去し、ＰＢ
ＳＴで３回洗浄後発色基質溶液（Ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸−２−ナトリウム塩を１ｍｇ／ｍｌにてＮａＮ
3（０.２ｍｇ／ｍｌ）ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０.１ｍｇ
／ｍｌ）を含む１０％ジエタノールアミン緩衝液ｐＨ
９.１に溶解したもの）を１ウェルあたり１００μｌず
つ加え、３７℃で反応させた。反応後の各ウェル中の反
応液のＯＤ405をマルチスキャン（Ｔitertek）を用いて
測定した。このアッセイでは、γ鎖とｋ鎖が会合した正
常のヒトＩｇＧのみが測定される。
Ａ）による擬人化Ｂ−Ｂ１０（ヒトＩｇＧ（γ、ｋ））
量の測定 擬人化Ｂ−Ｂ１０（ヒトＩｇＧ（γ、ｋ））量の測定は
以下の方法で行った。抗ヒトＩｇＧ（γ鎖）抗体（Capp
el，USA）燐酸緩衝液（ｐＨ７.２、組成ＮａＣｌ（８ｇ
／ｌ）、ＫＣｌ（０.２ｇ／ｌ）、ＮａＨＰＯ4１２Ｈ2
Ｏ（２.９９ｇ／ｌ）およびＫＨ2ＰＯ4（０.２ｇ／
ｌ））（以下ＰＢＳと略記）に１０μｇ／ｍｌの濃度に
溶かし、９６ウェルマイクロプレート（Falcon, USA）
（以下マイクロプレートと略記）に１ウェル当たり１０
０μｌずつ分注し、３７℃にて２時間保温した。１％ウ
シ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記）含有ＰＢＳ溶液
を１ウェルあたり１２０μｌずつ分注し３７℃にて２時
間保温することによりマイクロプレート上の蛋白未吸着
部分をブロッキングした。抗体量を測定したい試料を
０．０５％Ｔween２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴと略
記）で適宜希釈し１ウェルあたり１００μｌ加え、３７
℃で２時間保温した。その後試料を除去し、ＰＢＳＴで
３回洗浄した。続いて第２抗体液を１ウエルあたり１０
０μｌずつ加え、３７℃で２時間保温した。第２抗体と
してＰＢＳＴで５００〜１,０００倍希釈したホスファ
ターゼ標識アフィニティ精製抗ヒト免疫グロブリンｋ鎖
抗体（Tago，USA）を用いた。 第２抗体を除去し、ＰＢ
ＳＴで３回洗浄後発色基質溶液（Ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸−２−ナトリウム塩を１ｍｇ／ｍｌにてＮａＮ
3（０.２ｍｇ／ｍｌ）ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０.１ｍｇ
／ｍｌ）を含む１０％ジエタノールアミン緩衝液ｐＨ
９.１に溶解したもの）を１ウェルあたり１００μｌず
つ加え、３７℃で反応させた。反応後の各ウェル中の反
応液のＯＤ405をマルチスキャン（Ｔitertek）を用いて
測定した。このアッセイでは、γ鎖とｋ鎖が会合した正
常のヒトＩｇＧのみが測定される。
【００６２】実施例１２ ＭＴＸによる抗体遺伝子の増
幅及び抗体産生量の増大 先の実施例で示した抗体産生細胞を５０nMＭＴＸ（meth
otrexate，Gibco，USA）含有ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに
懸濁し１−５Ｘ１０5cells／ｍｌとし、９６ウェルマル
チプレートに各ウェル１００−２００μｌで分注し、３
７℃、５％ＣＯ2 存在下て培養した。培養開始から約２
週間後に各ウェルの培養上清中の抗体量を実施例１１従
ってＥＬＩＳＡにて算定した。高いＯＤ値すなはち高い
抗体産生量を示すウェルのみから細胞を集め、拡大培養
し、５０ｎＭＭＴＸ耐性株を樹立した。さらにこの５０
ｎＭＭＴＸ耐性株より同様にして１００ｎＭ、２００ｎ
Ｍあるいは４００ｎＭ耐性株を樹立した。こうして得ら
れた細胞株の培養上清中の抗体濃度を精製Ｍ０抗体をス
タンダードとしたＥＬＩＳＡにて算定した。この精製Ｍ
０抗体は後の実施例のようにプロテインＡカラムにより
アフィニティ精製したものである。結果を以下の表１に
示す。
幅及び抗体産生量の増大 先の実施例で示した抗体産生細胞を５０nMＭＴＸ（meth
otrexate，Gibco，USA）含有ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに
懸濁し１−５Ｘ１０5cells／ｍｌとし、９６ウェルマル
チプレートに各ウェル１００−２００μｌで分注し、３
７℃、５％ＣＯ2 存在下て培養した。培養開始から約２
週間後に各ウェルの培養上清中の抗体量を実施例１１従
ってＥＬＩＳＡにて算定した。高いＯＤ値すなはち高い
抗体産生量を示すウェルのみから細胞を集め、拡大培養
し、５０ｎＭＭＴＸ耐性株を樹立した。さらにこの５０
ｎＭＭＴＸ耐性株より同様にして１００ｎＭ、２００ｎ
Ｍあるいは４００ｎＭ耐性株を樹立した。こうして得ら
れた細胞株の培養上清中の抗体濃度を精製Ｍ０抗体をス
タンダードとしたＥＬＩＳＡにて算定した。この精製Ｍ
０抗体は後の実施例のようにプロテインＡカラムにより
アフィニティ精製したものである。結果を以下の表１に
示す。
【００６３】
【表１】 産生抗体 抗体濃度（μｇ／ｍｌ） ０ ５０ １００ ２００ ４００(nＭＭＴＸ) Ｍ０ ０.８ ７.４ ８.７ １４.７ − Ｍ１ 未算定 ２.６ − − ３.６ Ｍ２ ０.１ ２.７ − ９.０ − Ｍ３ ０.１ ０.３ − １.０ − Ｍ４ ０.３ ３.５ − − ９.５ Ｍ５ ０.２ ３.４ − − ５.３ Ｍ１２３ １.１ ４.０ − ８.０ − Ｍ４５ ０.２ １.８ − １.７ −Ｍ１２３４５ ０.７ １.８ − − ４.５
【００６４】これらの細胞株では、ＭＴＸ耐性度があが
るにつれ抗体産生量の増大が見られた。これらのＭＴＸ
耐性細胞株を拡大培養し、最終的に無血清培地（セルグ
ロッサ−Ｈ、住友製薬）にて一代継代する事で、血清不
含培養上清を得た。
るにつれ抗体産生量の増大が見られた。これらのＭＴＸ
耐性細胞株を拡大培養し、最終的に無血清培地（セルグ
ロッサ−Ｈ、住友製薬）にて一代継代する事で、血清不
含培養上清を得た。
【００６５】実施例１３ 抗体の精製 各種Ｂ−Ｂ１０抗体を含む血清不含培養上清をポアサイ
ズ０.２２μｍのフィルターユニット（Nalge, USA）に
て濾過した後、０.５ｍｌのプロテインＡ−セルロファ
イン（生化学工業）カラムに１−２ｍｌ／分の流速でア
プライした。１０ｍｌのImmunoPureTM Binding Buffer
(Pierce，USA)にてカラムを洗浄後、２ｍｌのImmunoPur
eTM Elution Buffer(Pierce，USA)にてカラムに結合し
ていた抗体を溶出した。溶出液を直ちに０.２ｍｌの１
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８.０）にて中和し、その後ＰＢＳ
に対して透析した。透析後、ポアサイズ０.２２μｍの
フィルターにて濾過滅菌し、精製Ｂ−Ｂ１０標品とし
た。得られた精製Ｂ−Ｂ１０の蛋白定量は精製牛ＩｇＧ
（BioRad，USA）をスタンダードとし、BCATM Protein A
ssay Reagent（Pierce，USA）を使用した比色定量法に
よった。定量結果を以下の表２にまとめる。
ズ０.２２μｍのフィルターユニット（Nalge, USA）に
て濾過した後、０.５ｍｌのプロテインＡ−セルロファ
イン（生化学工業）カラムに１−２ｍｌ／分の流速でア
プライした。１０ｍｌのImmunoPureTM Binding Buffer
(Pierce，USA)にてカラムを洗浄後、２ｍｌのImmunoPur
eTM Elution Buffer(Pierce，USA)にてカラムに結合し
ていた抗体を溶出した。溶出液を直ちに０.２ｍｌの１
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８.０）にて中和し、その後ＰＢＳ
に対して透析した。透析後、ポアサイズ０.２２μｍの
フィルターにて濾過滅菌し、精製Ｂ−Ｂ１０標品とし
た。得られた精製Ｂ−Ｂ１０の蛋白定量は精製牛ＩｇＧ
（BioRad，USA）をスタンダードとし、BCATM Protein A
ssay Reagent（Pierce，USA）を使用した比色定量法に
よった。定量結果を以下の表２にまとめる。
【００６６】
【表２】 抗体 培養上清量 最終液量 蛋白濃度 蛋白量 （ｍｌ） （ｍｌ） （μｇ／ｍｌ） （μｇ） Ｍ０ ７０ ２.８ １０５ ２９４ Ｍ１ １３０ ２.８ ７６ １９３ Ｍ２ １３０ １.０ ３７０ ３７０ Ｍ３ ２７０ ２.８ ９９ ２７７ Ｍ４ １３０ ２.８ ４７０ １３１６ Ｍ５ １３０ ２.８ １２９ ３６１ Ｍ１２３ １５０ ２.８ ９２ ２５８ Ｍ４５ ３１０ ２.８ １８３ ５１２ Ｍ１２３４５ １４０ ２.８ １１９ ３３３
【００６７】これらのサンプルを実施例３に示された方
法に従いＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて検討し
た（図７）。Ｍ１２３をのぞくすべてのサンプルでＨ
鎖、Ｌ鎖以外のバンドが観察されず、これらのサンプル
が充分精製されていると判断した。Ｍ１２３に見られる
不純物のバンドも量が少なく、活性評価に問題ないと判
断した。
法に従いＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて検討し
た（図７）。Ｍ１２３をのぞくすべてのサンプルでＨ
鎖、Ｌ鎖以外のバンドが観察されず、これらのサンプル
が充分精製されていると判断した。Ｍ１２３に見られる
不純物のバンドも量が少なく、活性評価に問題ないと判
断した。
【００６８】実施例１４ 各種変異Ｂ−Ｂ１０抗体の生
物活性の評価 先の実施例にて得られた各種精製Ｂ−Ｂ１０の生物活性
を検討した。生物活性の評価は各種Ｂ−Ｂ１０のＩＬ−
２依存性活性化ヒトＴ細胞増殖の阻害効果を比較するこ
とによった。 細胞培養用９６ウェルマルチプレート（F
alcon, USA）にフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により
活性化したヒトＴ細胞を最終４−１０Ｘ１０4 cells／
１００μｌ／ウェル、組換えヒトＩＬ−２（Colaborati
ve Research，USA）を最終０.２５ｎｇ／１００μｌ／
ウェル、さらに各種濃度のＢ−Ｂ１０標品を加えて１０
０μｌ／ウェルとし、３７℃、５％ＣＯ2存在下３日間
培養した。各ウェルに２０μｌの２.５ｍｇ／ｍｌＭＴ
Ｔ（3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra
zolium bromide，ＰＢＳに懸濁）を加え、３７℃、５％
ＣＯ2存在下４時間培養した。生細胞に生じたフォルマ
ザンを４０ｍＭ塩酸／イソプロパノールをウェル当たり
１００μｌ添加して溶解した。各ウェルのＯＤ５７０を
ＯＤ６３０を対照にして測定し、生細胞数の指標とし
た。結果を図８に示す。各種Ｂ−Ｂ１０の濃度依存的に
Ｔ細胞増殖が阻害されている。擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体の
中では、Ｍ５が最も阻害活性が高く、作用濃度を比較す
る事により、その活性はマウス型Ｂ−Ｂ１０とほぼ同等
と算定された。この活性はＭ５を含む多重変異Ｍ４５、
Ｍ１２３４５よりも高かった。
物活性の評価 先の実施例にて得られた各種精製Ｂ−Ｂ１０の生物活性
を検討した。生物活性の評価は各種Ｂ−Ｂ１０のＩＬ−
２依存性活性化ヒトＴ細胞増殖の阻害効果を比較するこ
とによった。 細胞培養用９６ウェルマルチプレート（F
alcon, USA）にフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により
活性化したヒトＴ細胞を最終４−１０Ｘ１０4 cells／
１００μｌ／ウェル、組換えヒトＩＬ−２（Colaborati
ve Research，USA）を最終０.２５ｎｇ／１００μｌ／
ウェル、さらに各種濃度のＢ−Ｂ１０標品を加えて１０
０μｌ／ウェルとし、３７℃、５％ＣＯ2存在下３日間
培養した。各ウェルに２０μｌの２.５ｍｇ／ｍｌＭＴ
Ｔ（3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra
zolium bromide，ＰＢＳに懸濁）を加え、３７℃、５％
ＣＯ2存在下４時間培養した。生細胞に生じたフォルマ
ザンを４０ｍＭ塩酸／イソプロパノールをウェル当たり
１００μｌ添加して溶解した。各ウェルのＯＤ５７０を
ＯＤ６３０を対照にして測定し、生細胞数の指標とし
た。結果を図８に示す。各種Ｂ−Ｂ１０の濃度依存的に
Ｔ細胞増殖が阻害されている。擬人化Ｂ−Ｂ１０抗体の
中では、Ｍ５が最も阻害活性が高く、作用濃度を比較す
る事により、その活性はマウス型Ｂ−Ｂ１０とほぼ同等
と算定された。この活性はＭ５を含む多重変異Ｍ４５、
Ｍ１２３４５よりも高かった。
配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly 5 10 15 配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Gly Asp Ala Met Tyr Phe Asp Val 9 5 配列番号：４ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Ser Ile His 11 5 10 配列番号：５ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 7 5 配列番号：６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Gln Ser Ser Ser Trp Pro Leu Thr 9 5 配列番号：７ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Asn Ile Lys 4 配列番号：８ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 5 10 15 Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Asp Thr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Met Gly Arg Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr 50 55 60 Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser 65 70 75 Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp 80 85 90 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asp Ala Met Tyr Phe 95 100 105 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 118 110 115 配列番号：９ 配列の長さ：１０７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly 20 25 30 Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Ser Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys 107 配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGTCAAACT GCAGCAGTCA GG 22 配列番号：１１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGTGCAGCT TCTCGAGTCT GG 22 配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACGGTGACCG TGGCGCCTTG 20 配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧ ＡＧＧＡＧＣＣＴＴＧ
２０ 配列番号：１４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧ ＴＣＴＣＣＡ
１６ 配列番号：１５ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCACCCAG ACTCCA 16 配列番号：１６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTCCAGCTTG GTCCC 15 配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu 20 20 配列番号：１８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AACATTAAAG ACACCTATAT GCAC 24 配列番号：１９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGTCAGACC ATTGGCACAA GCATACAC 28 配列番号：２０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGGAAATAG CCCTTGACCA GGCA 24 配列番号：２１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACATTGATG TCTTTGGGGT AGAA 24 配列番号：２２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＴＴＡＡＴＴＣＴ ＴＣＣＴＡＴＣＣＡＣ ＴＣＣＡＧＧＣＣ
２８ 配列番号：２３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＧＴＡＡＴＡＧ ＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣ ＣＴＧＧＡＡＣＴ
２８ 配列番号：２４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACCAGGGTG CCTGCGCCCC AGACATCG 28 配列番号：２５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTGAGTCAG GAGGATGTCC CCGTAGGC 28 配列番号：２６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTCAGAAGCA TATTTTATGA GAAGCCTT 28
２０ 配列番号：１４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧ ＴＣＴＣＣＡ
１６ 配列番号：１５ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCACCCAG ACTCCA 16 配列番号：１６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTCCAGCTTG GTCCC 15 配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu 20 20 配列番号：１８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AACATTAAAG ACACCTATAT GCAC 24 配列番号：１９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGTCAGACC ATTGGCACAA GCATACAC 28 配列番号：２０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGGAAATAG CCCTTGACCA GGCA 24 配列番号：２１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACATTGATG TCTTTGGGGT AGAA 24 配列番号：２２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＴＴＡＡＴＴＣＴ ＴＣＣＴＡＴＣＣＡＣ ＴＣＣＡＧＧＣＣ
２８ 配列番号：２３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＧＴＡＡＴＡＧ ＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣ ＣＴＧＧＡＡＣＴ
２８ 配列番号：２４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACCAGGGTG CCTGCGCCCC AGACATCG 28 配列番号：２５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTGAGTCAG GAGGATGTCC CCGTAGGC 28 配列番号：２６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTCAGAAGCA TATTTTATGA GAAGCCTT 28
【図１】 マウスＢ−Ｂ１０Ｖ領域（Ｈ鎖）のＤＮＡ配
列、およびそれがコードするアミノ酸配列を示す。
列、およびそれがコードするアミノ酸配列を示す。
【図２】 マウスＢ−Ｂ１０Ｖ領域（Ｌ鎖）のＤＮＡ配
列、およびそれがコードするアミノ酸配列を示す。
列、およびそれがコードするアミノ酸配列を示す。
【図３】 擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｍ０のアミノ酸配列をマウ
スＢ−Ｂ１０と鋳型として使用したヒト抗体ＫＡＳとＰ
ＡＹのアミノ酸配列と並列して示したものである。Ｍ１
−５の変異の位置も示した。Ｍ１−５ではここに示され
たアミノ酸残基がすべてマウスＢ−Ｂ１０のアミノ酸残
基に変換されている。ＦＲはフレームワークの略号であ
る。
スＢ−Ｂ１０と鋳型として使用したヒト抗体ＫＡＳとＰ
ＡＹのアミノ酸配列と並列して示したものである。Ｍ１
−５の変異の位置も示した。Ｍ１−５ではここに示され
たアミノ酸残基がすべてマウスＢ−Ｂ１０のアミノ酸残
基に変換されている。ＦＲはフレームワークの略号であ
る。
【図４】 合成擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｍ０Ｖ領域（Ｈ鎖）の
ＤＮＡ配列を示す。枠で囲まれた領域はＶ領域をコード
する領域、それ以外はＦＫ−００１抗体遺伝子由来の領
域を示す。また下線部は遺伝子合成に使用したプライマ
ーの位置を示す。
ＤＮＡ配列を示す。枠で囲まれた領域はＶ領域をコード
する領域、それ以外はＦＫ−００１抗体遺伝子由来の領
域を示す。また下線部は遺伝子合成に使用したプライマ
ーの位置を示す。
【図５】 合成擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｍ０Ｖ領域（Ｌ鎖）の
ＤＮＡ配列を示す。枠で囲まれた領域はＶ領域をコード
する領域、それ以外はＦＫ−００１抗体遺伝子由来の領
域を示す。また下線部は遺伝子合成に使用したプライマ
ーの位置を示す。
ＤＮＡ配列を示す。枠で囲まれた領域はＶ領域をコード
する領域、それ以外はＦＫ−００１抗体遺伝子由来の領
域を示す。また下線部は遺伝子合成に使用したプライマ
ーの位置を示す。
【図６】 （ａ）は擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｈ鎖発現プラスミ
ド、（ｂ）は擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｌ鎖発現プラスミドの構
造を示す。図中β−ｌａはβ−ラクタマーゼの、またdh
frは、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を示す。また、Ｖ
ＨはＨ鎖Ｖ領域遺伝子を、Ｖｋはｋ鎖Ｖ領域遺伝子を、
Ｃγ１はγ１鎖定常領域遺伝子を、またＣｋはｋ鎖定常
領域遺伝子を示す。
ド、（ｂ）は擬人化Ｂ−Ｂ１０Ｌ鎖発現プラスミドの構
造を示す。図中β−ｌａはβ−ラクタマーゼの、またdh
frは、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を示す。また、Ｖ
ＨはＨ鎖Ｖ領域遺伝子を、Ｖｋはｋ鎖Ｖ領域遺伝子を、
Ｃγ１はγ１鎖定常領域遺伝子を、またＣｋはｋ鎖定常
領域遺伝子を示す。
【図７】 擬人化Ｂ−Ｂ１０精製サンプルのＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動像を示す。左よりＭ０、Ｍ１、
Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ１２３、Ｍ４５、Ｍ１２３
４５、マウスＢ−Ｂ１０の泳動像である。Ｈ、ＬはＨ
鎖、Ｌ鎖の位置を示す。
アクリルアミド電気泳動像を示す。左よりＭ０、Ｍ１、
Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ１２３、Ｍ４５、Ｍ１２３
４５、マウスＢ−Ｂ１０の泳動像である。Ｈ、ＬはＨ
鎖、Ｌ鎖の位置を示す。
【図８】 擬人化Ｂ−Ｂ１０のＩＬ−２依存性Ｔ細胞増
殖の阻害活性をみたものである。縦軸のＯＤ値は細胞生
細胞数の指標である。
殖の阻害活性をみたものである。縦軸のＯＤ値は細胞生
細胞数の指標である。
【図９】 擬人化Ｂ−Ｂ１０のＩＬ−２依存性Ｔ細胞増
殖の阻害活性をみたものである。縦軸のＯＤ値は細胞生
細胞数の指標である。
殖の阻害活性をみたものである。縦軸のＯＤ値は細胞生
細胞数の指標である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/13 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (71)出願人 591273225 ビオテスト・ファルマ・ゲゼルシャフト・ ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ＢＩＯＴＥＳＴ ＰＨＡＲＭＡ ＧＥＳＥ ＬＬＳＣＨＡＦＴ ＭＩＴ ＢＥＳＣＨＲ ＡＮＫＴＥＲ ＨＡＦＴＵＮＧ ドイツ連邦共和国デー−6072ドライアイ ヒ、ラントシュタイネルシュトラーセ５番 (71)出願人 591273236 イノテラピー・ラボラトワール ＩＮＮＯＴＨＥＲＡＰＩＥ ＬＡＢＯＲＡ ＴＯＩＲＥＳ フランス25020ブサンソン・セデックス、 ブールバール・ア−フレマン１番 ボワッ ト・ポスタル1937 (72)発明者 中谷 知右 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内 (72)発明者 五味 英行 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内 (72)発明者 ジョン・ワイデネス フランス25020ブサンソン・セデックス、 ブールバール・ア−フレマン１番 ボワッ ト・ポスタル1937 イノテラピー・ラボラ トワール内 (72)発明者 野口 浩 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】 ヒトＩＬ−２リセプターに対する特異的
結合活性を有し、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）
および一部のフレームワークのアミノ酸配列が下に示す
ようである擬人化抗体。 Ｈ鎖Ｖ領域（ＶＨ）ＣＤＲ１ 【化１】 配列番号１ ＣＤＲ２ 【化２】 配列番号２ ＣＤＲ３ 【化３】 配列番号３ Ｌ鎖Ｖ領域（ＶＬ）ＣＤＲ１ 【化４】 配列番号４ ＣＤＲ２ 【化５】 配列番号５ ＣＤＲ３ 【化６】 配列番号６ ＶＨ２７−３０番目のアミノ酸 【化７】 配列番号７ ＶＨ９４番目のアミノ酸 Arg ＶＬ４９番目のアミノ酸 Lys - 【請求項２】 可変領域が以下のアミノ酸配列で表され
る請求項第１記載の擬人化抗体。 ＶＨ 【化８】 配列番号８ ＶＬ 【化９】 配列番号９ - 【請求項３】 完全抗体分子、（Ｆａｂ’）2 、Ｆａ
ｂ，またはＦｖからなる請求項１あるいは２記載の擬人
化抗体。 - 【請求項４】 抗体以外の機能性分子が結合している請
求項１、２あるいは３記載の擬人化抗体。 - 【請求項５】 請求項第１、２、３あるいは４記載の擬
人化抗体遺伝子を発現する発現プラスミドを作製し、そ
れらを宿主細胞に導入して擬人化抗体を生産する細胞を
得、その細胞を培養する事によって擬人化抗体を生産す
ることを特徴とする擬人化抗体の製造法。 - 【請求項６】 宿主細胞が動物細胞であることを特徴と
する請求項５記載の製造法。 - 【請求項７】 請求項第１〜４記載の擬人化抗体を主た
る成分とし、非経口薬としての剤形を有する治療薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3323319A JPH05244982A (ja) | 1991-12-06 | 1991-12-06 | 擬人化ｂ−ｂ１０ |
| AT92924875T ATE180511T1 (de) | 1991-12-06 | 1992-12-03 | Humanisierter b-b10, ein anti-il-2-rezeptor- antikörper |
| DE69229278T DE69229278T2 (de) | 1991-12-06 | 1992-12-03 | Humanisierter b-b10, ein anti-il-2-rezeptor-antikörper |
| US08/232,081 US5886152A (en) | 1991-12-06 | 1992-12-03 | Humanized B-B10 |
| EP92924875A EP0616641B1 (en) | 1991-12-06 | 1992-12-03 | Humanized b-b10, an anti-il2 receptor antibody |
| PCT/JP1992/001583 WO1993011238A1 (en) | 1991-12-06 | 1992-12-03 | Humanized b-b10, an anti-il2 receptor antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3323319A JPH05244982A (ja) | 1991-12-06 | 1991-12-06 | 擬人化ｂ−ｂ１０ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244982A true JPH05244982A (ja) | 1993-09-24 |
Family
ID=18153467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3323319A Pending JPH05244982A (ja) | 1991-12-06 | 1991-12-06 | 擬人化ｂ−ｂ１０ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5886152A (ja) |
| EP (1) | EP0616641B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05244982A (ja) |
| AT (1) | ATE180511T1 (ja) |
| DE (1) | DE69229278T2 (ja) |
| WO (1) | WO1993011238A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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