KR102439719B1 - 글루타민 합성효소 유전자내 상보성 벡터를 사용한 높은 수준의 헤테로머 단백질을 발현하는 세포의 직접적인 선택 - Google Patents

글루타민 합성효소 유전자내 상보성 벡터를 사용한 높은 수준의 헤테로머 단백질을 발현하는 세포의 직접적인 선택 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물 세포 배양물 중에서의 폴리펩타이드의 재조합 발현의 일반적인 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폴리펩타이드, 특히 이종다량체 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 재조합 방식으로 조작된 벡터로 형질주입된 세포의 개선된 선택에 관한 것이다.

Description

글루타민 합성효소 유전자내 상보성 벡터를 사용한 높은 수준의 헤테로머 단백질을 발현하는 세포의 직접적인 선택 {DIRECT SELECTION OF CELLS EXPRESSING HIGH LEVELS OF HETEROMERIC PROTEINS USING GLUTAMINE SYNTHETASE INTRAGENIC COMPLEMENTATION VECTORS}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2016년 5월 11일자로 출원된 미국 가출원 제62/334,966호의 이익을 주장하며, 이 출원은 본 명세서에 이의 전문이 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되고, 이의 전문이 참고로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2017년 5월 8일자로 생성된 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 카피는 명칭이 A-2011-WO-PCT_SEQ_ST25.txt이고, 크기가 79.1킬로바이트이다.
기술분야
본 발명은 포유동물 세포 배양물 중에서의 폴리펩타이드의 재조합 발현의 일반적인 분야에 관한 것이다. 보다 특별하게는, 본 발명은 헤테로머 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 재조합 방식으로 조작된 벡터의 세포 중에서의 개선된 선택에 관한 것이다.
헤테로머 재조합 단백질의 발현은 통상적으로 성숙 단백질 내에 혼입될 수 없는 쇄의 불필요한 합성을 회피하기 위해서 구성성분 쇄의 유사한 발현을 요구한다. 추가로, 대부분의 헤테로머 재조합 단백질의 생산 방법은, 높은 수준의 성숙 헤테로머 단백질의 각각의 쇄를 발현하는 드물게 높게 발현하는 클론을 식별하기 위해서 다수의 클론을 스크리닝하는 것이 필요하다. 분할된 선택 가능한 마커 시스템(여기서 선택 가능한 마커는 2개의 조각으로 분할되고, 각각의 단편은 헤테로머 단백질의 하나의 쇄의 발현에 관련됨)은 선택 가능한 마커 단편 둘 모두, 그리고 이에 따라서 헤테로머 단백질의 두 쇄 모두를 발현하는 세포를 식별하는 데 사용될 수 있다.
글루타민 합성효소(GS)는 암모니아와 글루타메이트의 축합에 의한 글루타민 생합성을 촉매작용한다. 포유동물 GS 효소는 2종의 적층된 오량체 고리로 구성되고, 소단위의 정션에 위치된 10개의 활성 부위를 갖는 십량체(decamer)이다. 각각의 활성 부위는 하나의 소단위의 N-말단 도메인(β-그래스프(grasp) 도메인, 잔기 25 내지 112로 구성됨)으로부터의 잔기 및 인접한 소단위의 C-말단 도메인(촉매작용 도메인, 잔기 113 내지 373으로 구성됨)으로부터의 잔기에 의해서 형성된다. 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 및 이. 콜라이(E. coli)에서의 유전 연구는, 특정 GS 돌연변이가 유전자내 상보성을 나타내었는데, 여기서 GS 유전자의 5' 단부에 맵핑된 일부 돌연변이가 3' 단부에서 상보적인 것일 수 있다는 것을 보여주었다(Mitchell, A. P. Genetics 111, 243-258 (1985); MacNeil, T., et al. Journal of Bacteriology 150, 1302-1313 (1982)). 따라서, 대사 효소를 기반으로 하는 선택 시스템, 예컨대, 글루타민 합성효소의 유전자내 상보성을 활용하는 것이 2개를 초과하는 독특한 폴리펩타이드 쇄를 갖는 분자(예를 들어, 단클론성 항체 및 재조합 단백질)를 발현하기에 유용하다고 증명되었다.
본 발명의 일 실시형태는,
a. 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산, 및
b. 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산(여기서 제2 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위이고,
여기서 제1 핵산의 전사는 제2 핵산의 전사에 작동 가능하게 연결됨)을 포함하고, 추가로
c. 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산(여기서 제3 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드와 회합하여 헤테로머 복합체를 형성할 수 있음), 및
d. 제4 폴리펩타이드를 암호화하는 제4 핵산(여기서 제4 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 상보성 돌연변이체 소단위이고,
여기서 제3 핵산의 전사는 제4 핵산의 전사에 작동 가능하게 연결됨)을 포함하는 벡터를 제공하며,
여기서 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위 및 상보성 돌연변이체 소단위는 상호작용하여 선택 가능한 활성도를 제공하고, 추가로 여기서 벡터는 포유동물 세포에 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는,
e. 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산, 및
f. 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산(여기서 제2 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 초기 단편이고,
여기서 제1 핵산의 전사는 제2 핵산의 전사에 작동 가능하게 연결됨)을 포함하고,
g. 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산(여기서 제3 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드와 회합하여 헤테로머 복합체를 형성할 수 있음), 및
h. 제4 폴리펩타이드를 암호화하는 제4 핵산(여기서 제4 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 상보성 단편이고,
여기서 제3 핵산의 전사는 제4 핵산의 전사에 작동 가능하게 연결됨)을 추가로 포함하는 벡터를 제공하며,
여기서 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위 및 상보성 돌연변이체 소단위는 상호작용하여 선택 가능한 활성도를 제공하고, 추가로 여기서 벡터는 포유동물 세포에 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
추가 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 면역글로불린이다. 일 실시형태에서, 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하며, 대안적인 실시형태에서, 제1 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화한다. 상기에 언급된 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 글루타민 합성효소, 트레오닌 데하이드레이타제, 아데닐로석시네이트 합성효소, 및 글루타메이트 데하이드로게나제로 이루어진 군으로부터 선택된 대사 효소이다.
본 발명은 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)를 포함할 수 있고; 일 실시형태에서, IRES는 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 부위; 제3 핵산과 제4 핵산 사이의 부위, 및 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 부위 및 제3 핵산과 제4 핵산 사이의 부위 둘 모두로 이루어진 군으로부터 선택된 부위에서 일어난다. 추가 실시형태에서, 내부 리보솜 유입 부위는 서열번호 23을 포함한다.
본 명세서에 기술된 실시형태 중 임의의 것의 경우, 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위가 글루타민 합성효소의 N-말단 돌연변이체(mutGS-NT)인 경우 선택 가능한 마커의 상보성 돌연변이체 소단위는 글루타민 합성효소의 C-말단 돌연변이체(mutGS-CT)이다. 본 발명의 이러한 일 양상에서, mutGS-NT는 W60A N61A D63A D63R S66A 및 D76A로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 돌연변이를 포함하고, mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A 및 R324A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, mutGS-NT는 W60A N61A D63A(mutGS-NT1; 서열번호 6), W60A N61A D63A S66A(mutGS-NT2; 서열번호 10), W60A N61A D63A S66A D76A(mutGS-NT3; 서열번호 25), 및 W60A N61A D63R S66A(mutGS-NT4; 서열번호 19)로 이루어진 군으로부터 선택되고; mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A(mutGS-CT1; 서열번호 21) 및 N248A H253A N255A(mutGS-CT2; 서열번호 22)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 및 C-말단 단편은 글루타민 합성효소 단백질의 하나 이상의 아미노산에서 단백질을 분할함으로써 생성된다. 본 발명의 이러한 일 양상에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편 및/또는 C-말단 단편은 E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127 및 N265로 이루어진 군으로부터 선택된 글루타민 합성효소의 아미노산에서 분할된다.
본 발명은 또한 상기에 기술된 바와 같은 벡터로 형질주입되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 단리된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 골수종 세포주 및 WI38 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 양상은 이러한 숙주 세포를 헤테로머 복합체가 숙주 세포에 의해서 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 헤테로머 복합체의 생산 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 항체이다. 청구범위의 본 발명의 방법은 헤테로머 복합체를 단리하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는,
a) 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물(bicistronic transcript)을 암호화하는 제1 벡터(여기서 제2 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위임), 및
b) 제4 폴리펩타이드를 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제2 벡터(여기서 제4 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위와 회합하여 선택 가능한 활성도를 제공할 수 있는 선택 가능한 마커의 상보성 돌연변이체 소단위임)을 포함하는 발현 시스템을 제공하며,
추가로 여기서 제3 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드와 회합하여 헤테로머 복합체를 형성할 수 있고;
추가로 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포에 형질주입되어 상기 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는,
c) 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제1 벡터(여기서 제2 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 초기 단편임), 및
d) 제4 폴리펩타이드를 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제2 벡터(여기서 제4 폴리펩타이드는 선택 가능한 마커의 초기 단편과 회합하여 선택 가능한 활성도를 제공할 수 있는 선택 가능한 마커의 상보성 단편이고,
추가로 여기서 제3 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드와 회합하여 헤테로머 복합체를 형성할 수 있음)를 포함하는 발현 시스템을 제공하며,
추가로 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포에 형질주입되어 상기 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
추가 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 면역글로불린이다. 일 실시형태에서, 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하며, 대안적인 실시형태에서, 제1 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화한다. 상기에 언급된 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 글루타민 합성효소, 트레오닌데하이드레이타제, 아데닐로석시네이트 합성효소, 및 글루타메이트 데하이드로게나제로 이루어진 군으로부터 선택된 대사 효소이다.
상기에 기술된 본 발명의 발현 시스템은 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함할 수 있고; 일 실시형태에서, IRES는 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 부위; 제3 핵산과 제4 핵산 사이의 부위, 및 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 부위 및 제3 핵산과 제4 핵산 사이의 부위 둘 모두로 이루어진 군으로부터 선택된 부위에서 일어난다. 추가 실시형태에서, 내부 리보솜 유입 부위는 서열번호 23을 포함한다.
본 명세서에 기술된 발현 시스템에서, 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위가 글루타민 합성효소의 N-말단 돌연변이체(mutGS-NT)인 경우 선택 가능한 마커의 상보성 돌연변이체 소단위는 글루타민 합성효소의 C-말단 돌연변이체(mutGS-CT)이다. 본 발명의 이러한 일 양상에서, mutGS-NT는 W60A N61A D63A D63R S66A 및 D76A로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 돌연변이를 포함하고, mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A 및 R324A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, mutGS-NT는 W60A N61A D63A(mutGS-NT1; 서열번호 6), W60A N61A D63A S66A(mutGS-NT2; 서열번호 10), W60A N61A D63A S66A D76A(mutGS-NT3; 서열번호 25), 및 W60A N61A D63R S66A(mutGS-NT4; 서열번호 19)로 이루어진 군으로부터 선택되고; mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A(mutGS-CT1; 서열번호 21) 및 N248A H253A N255A(mutGS-CT2; 서열번호 22)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 및 C-말단 단편은 글루타민 합성효소 단백질의 하나 이상의 아미노산에서 단백질을 분할함으로써 생성된다. 본 발명의 이러한 일 양상에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편 및/또는 C-말단 단편은 E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127 및 N265로 이루어진 군으로부터 선택된 글루타민 합성효소의 아미노산에서 분할된다.
본 발명은 또한 상기에 기술된 바와 같은 벡터로 형질주입되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 단리된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 골수종 세포주 및 WI38 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 양상은 이러한 숙주 세포를 헤테로머 복합체가 숙주 세포에 의해서 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 헤테로머 복합체의 생산 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 항체이다. 청구범위의 본 발명의 방법은 헤테로머 복합체를 단리하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 N-말단 돌연변이체 글루타민 합성효소(mutGS-NT)를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 C-말단 돌연변이체 글루타민 합성효소(mutGS-CT)를 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 경쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 발현 시스템을 제공하며, 여기서 글루타민 합성효소의 각각의 돌연변이체 소단위는 단독으로 발현되는 경우 선택 가능한 활성도를 갖지 않고, mutGS-NT와 mutGS-CT의 공동 발현이 글루타민 합성효소 활성도를 제공하고, 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포 내로 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 글루타민 합성효소의 N-말단 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 글루타민 합성효소의 C-말단 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 경쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 발현 시스템을 제공하며, 여기서 글루타민 합성효소의 각각의 돌연변이체 소단위는 단독으로 발현되는 경우 선택 가능한 활성도를 갖지 않고, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 C-말단 단편의 공동 발현이 글루타민 합성효소 활성도를 제공하고, 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포 내로 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 N-말단 돌연변이체 글루타민 합성효소(mutGS-NT)를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 경쇄를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 C-말단 돌연변이체 글루타민 합성효소(mutGS-CT)을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 중쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 발현 시스템을 제공하며, 여기서 글루타민 합성효소의 각각의 돌연변이체 소단위는 단독으로 발현되는 경우 선택 가능한 활성도를 갖지 않고, mutGS-NT와 mutGS-CT의 공동 발현이 글루타민 합성효소 활성도를 제공하고, 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포 내로 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 글루타민 합성효소의 N-말단 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 경쇄를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 글루타민 합성효소의 C-말단 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 중쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 발현 시스템을 제공하며, 여기서 글루타민 합성효소의 각각의 단편은 단독으로 발현되는 경우 선택 가능한 활성도를 갖지 않고, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 C-말단 단편의 공동 발현이 글루타민 합성효소 활성도를 제공하고, 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포 내로 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있다.
상기 실시형태 중 임의의 것의 경우, 본 발명의 일 일 양상에서, mutGS-NT는 W60A N61A D63A D63R S66A 및 D76A로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 돌연변이를 포함하고, mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A 및 R324A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, mutGS-NT는 W60A N61A D63A(mutGS-NT1; 서열번호 6), W60A N61A D63A S66A(mutGS-NT2; 서열번호 10), W60A N61A D63A S66A D76A(mutGS-NT3; 서열번호 25), 및 W60A N61A D63R S66A(mutGS-NT4; 서열번호 19)로 이루어진 군으로부터 선택되고; mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A(mutGS-CT1; 서열번호 21) 및 N248A H253A N255A(mutGS-CT2; 서열번호 22)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 및 C-말단 단편은 글루타민 합성효소 단백질의 하나 이상의 아미노산에서 단백질을 분할함으로써 생성된다. 본 발명의 이러한 일 양상에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편 및/또는 C-말단 단편은 E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127 및 N265로 이루어진 군으로부터 선택된 글루타민 합성효소의 아미노산에서 분할된다.
유사하게, 본 발명은 또한 상기에 기술된 바와 같은 벡터로 형질주입되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 단리된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 골수종 세포주 및 WI38 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 양상은 이러한 숙주 세포를 헤테로머 복합체가 숙주 세포에 의해서 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 헤테로머 복합체의 생산 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 항체이다. 청구범위의 본 발명의 방법은 헤테로머 복합체를 단리하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 더 추가의 양상은 선택 가능한 마커의 초기 돌연변이체 소단위를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제1 벡터, 및 선택 가능한 마커의 상보성 돌연변이체 소단위를 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된, 제3 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제2 벡터를 포함하는 발현 시스템을 포함하며, 여기서 선택 가능한 마커의 제1 돌연변이체 소단위와 상보성 돌연변이체 소단위는 회합하여 선택 가능한 활성도를 제공하고, 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포에 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있고, 추가로 여기서 제1 핵산은 항체 중쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 항체 경쇄를 암호화한다. 일 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 글루타민 합성효소이다.
본 발명의 더 추가의 양상은 선택 가능한 마커의 초기 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제1 벡터, 및 선택 가능한 마커의 상보성 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된, 제3 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제2 벡터를 포함하는 발현 시스템을 포함하며, 여기서 선택 가능한 마커의 제1 단편과 상보성 단편은 회합하여 선택 가능한 활성도를 제공하고, 여기서 발현 시스템은 포유동물 세포에 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있고, 추가로 여기서 제1 핵산은 항체 중쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 항체 경쇄를 암호화한다. 일 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 글루타민 합성효소이다.
본 발명의 이러한 일 양상에서, 글루타민 합성효소는 2종의 상보성 돌연변이를 포함하고; 따라서 mutGS-NT는 W60A N61A D63A D63R S66A 및 D76A로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 돌연변이를 포함하고, mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A 및 R324A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, mutGS-NT는 W60A N61A D63A(mutGS-NT1; 서열번호 6), W60A N61A D63A S66A(mutGS-NT2; 서열번호 10), W60A N61A D63A S66A D76A(mutGS-NT3; 서열번호 25), 및 W60A N61A D63R S66A(mutGS-NT4; 서열번호 19)로 이루어진 군으로부터 선택되고; mutGS-CT는 E134A E136A E196A E203A(mutGS-CT1; 서열번호 21) 및 N248A H253A N255A(mutGS-CT2; 서열번호 22)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 이러한 실시형태에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 및 C-말단 단편은 글루타민 합성효소 단백질의 하나 이상의 아미노산에서 단백질을 분할함으로써 생성된다. 본 발명의 이러한 일 양상에서, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편 및/또는 C-말단 단편은 E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127 및 N265로 이루어진 군으로부터 선택된 글루타민 합성효소의 아미노산에서 분할된다.
본 발명은 또한 상기에 기술된 바와 같은 벡터로 형질주입되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 단리된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 골수종 세포주 및 WI38 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 양상은 이러한 숙주 세포를 헤테로머 복합체가 숙주 세포에 의해서 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 헤테로머 복합체의 생산 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 항체이다. 청구범위의 본 발명의 방법은 헤테로머 복합체를 단리하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
도 1은 각각 선택 가능한 마커의 소단위를 포함하고, 회합하여 세포에서 헤테로머 복합체를 형성할 수 있는 상이한 폴리펩타이드를 발현하는, 실시예 1 내지 5에서 이용된 핵산 작제물의 개략도. 약어는 다음과 같다: muGS, 돌연변이체 글루타민 합성효소; Ampr, 암피실린 내성. 도 1(A)는 벡터 A(LC:mutGS-CT)를 도시하고, 도 1(B)는 벡터 B(HC:mutGS-NT)를 도시한다.
도 2는 구출 실험 1의 결과를 나타낸 그래프. 각각의 버전(1 내지 5)에 대한 작제물 A 및 B를 CHO-K1 GS 넉아웃 세포 내에 형질주입시켰고, 글루타민 무함유 배지에서 세포를 구조하는 이의 능력을 시험하였다. 전장 GS 효소를 발현하는 플라스미드를 대조군으로서 사용하였다.
도 3은 두 단편 모두가 GS 효소 활성도를 회복시키는 데 필요하다는 것을 확인해 주는, A 또는 B 단편 단독 중 어느 것도 KO 세포주를 구출할 수 없다는 것을 나타내는 그래프.
도 4는 각각 항체 경쇄 또는 중쇄, IRES 및 글루타민 합성효소 단편을 함유하는, 실시예 6에서 사용된 발현 벡터의 개략도.
도 5는 항체 LC 유전자 및 HC 유전자의 하류에서 GS 단편 벡터의 사용을 나타낸 그래프. 벡터 조합물 2A-LC 및 2B-HC는 GS 넉아웃 세포를 구출할 수 있었다.
도 6은 10D 유가식 생산성 검정에서 작제물 2 선택된 풀로부터의 세포의 생산성을 나타내고, 이것을 전장 글루타민 합성효소 효소를 발현하는 벡터를 사용하여 선택된 대조군 풀과 비교한 그래프.
세포에서 재조합 헤테로머 복합체의 효율적인 생산은, 복합체의 각각의 구성성분이 비례하게 높은 양으로 발현되는 경우 개선된다. 본 발명은 1종 초과의 이종 폴리펩타이드를 비례하는 양으로 발현하여, 폴리펩타이드가 효율적으로 회합하여 전통적으로 제조된 헤테로머 복합체보다 더 높은 발현 수준으로 헤테로머 복합체를 형성하는, 재조합 방식으로 조작된 세포를 선택하기 위한 방법 및 조성물을 제공함으로써 형질주입된 세포의 선택을 개선시킨다. 본 발명은 그것이 또한 높은 수준의 목적하는 재조합 헤테로머 폴리펩타이드 복합체를 발현하는 세포를 선택하는 데 필요한 시간을 감소시키고, 본 발명에 의해서 제공된 형질주입된 세포의 선택을 개선시키는 또 다른 양상이라는 점에서 또한 이롭다.
본 출원에서 사용되는 용어는 관련 기술 분야에서 표준이지만, 특정 용어의 정의는 청구범위의 의미의 분명함 및 명확함을 보장하기 위해 본 명세서에 제공된다. 단위, 접두사 및 기호는 그들의 SI(국제 단위 시스템) 허용 형태로 표시될 수 있다. 본 명세서에 인용되는 수치적 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함하며, 정해진 범위 내의 각각의 정수를 뒷받침한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 기법은 일반적으로 관련 기술 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 전체적으로 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] 참고).
개시된 방법은 교반 탱크 반응기(스핀 필터를 포함할 필요가 없을 수 있는 전통적인 회분식 및 유가식 세포 배양 포함), 관류 시스템(교대 접선 유동("ATF") 배양, 어쿠스틱 관류 시스템, 뎁쓰 필터(depth filter) 관류 시스템, 및 다른 시스템 포함), 중공 섬유 생물반응기(일부 경우에 관류 공정에서 사용될 수 있는 HFB)뿐만 아니라 다양한 다른 세포 배양 방법(예를 들어, 문헌[Tao et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 82:751-65; Kuystermans & Al-Rubeai, (2011) "Bioreactor Systems for Producing Antibody from Mammalian Cells" in Antibody Expression and Production, Cell Engineering 7:25-52, Al-Rubeai (ed) Springer; Catapano et al., (2009) "Bioreactor Design and Scale-Up" in Cell and Tissue Reaction Engineering: Principles and Practice, Eibl et al. (eds) Springer-Verlag] 참고, 본 명세서에 이들의 전문이 참고로 포함됨)으로 성장되는 접착 배양 또는 현탁 배양에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 달리 구체적으로 제시되지 않는 한 하나 이상을 의미한다. 추가로, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 일반적으로, 세포, 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 본 명세서에 기술된 혼성화와 관련하여 그리고 이의 기술에서 사용되는 명명법은 관련 기술 분야에서 널리 공지되고, 일반적으로 사용되는 것이다.
본 개시내용은 "관심 단백질"을 발현하는 세포 배양물의 특성을 조절하는 방법을 제공하며; "관심 단백질"은 자연 발생 단백질, 재조합 단백질, 및 조작된 단백질(예를 들어, 자연에서 발생하지 않고, 인간에 의해서 설계 및/또는 생성된 단백질)을 포함한다. 관심 단백질은 치료적으로 관련될 것이라고 공지되거나 의심되는 단백질일 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 관심 단백질의 특정 예는 항원 결합 단백질(본 명세서에 기술 및 정의된 바와 같음), 펩티바디(즉, 다른 분자, 예컨대, 항체(여기서 펩타이드 모이어티는 목적하는 표적에 특이적으로 결합하고; 펩타이드(들)는 Fc 영역에 융합되거나 또는 Fc-루프 내에 삽입됨)의 Fc 도메인, 또는 변형된 Fc 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 펩타이드(들)를 포함하는 분자, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제US2006/0140934호에 기술된 바와 같음), 융합 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질, 여기서 Fc 단편은 펩티바디를 비롯한 단백질 또는 펩타이드에 융합됨), 사이토카인, 성장 인자, 호르몬 및 다른 자연 발생 분비 단백질, 뿐만 아니라 자연 발생 단백질의 돌연변이체 형태를 포함한다.
용어 "헤테로머 복합체"는 적어도 2종의 상이한 분자의 회합에 의해서 형성된 분자 복합체를 포함하는 의미이다. 회합은 비공유 상호작용 또는 공유 부착, 예를 들어, 다이설파이드 결합일 수 있다. 2종의 상이한 분자는 전형적으로 2종의 상이한 폴리펩타이드이지만, 본 발명은 폴리펩타이드와 핵산, 및 상이한 핵산들 간의 헤테로머 복합체를 고려한다. 일 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 기능적 활성도, 예컨대, 기질(예를 들어, 상응하는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린)에 결합하는 능력, 효소 활성도 등을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 헤테로머 복합체는 그것이 생산될 숙주 세포의 배양 배지로 분비된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "회합하는" 또는 "상호작용하는"은 적어도 2종의 분자 간의 상호작용을 기술하는 의미이고, 여기서 하나의 분자는 나머지 분자에 결합하고/하거나 나머지 분자의 활성도에 영향을 미친다. 상호작용은 2종의 폴리펩타이드(또는 폴리펩타이드 및 핵산)의 직접 또는 간접 결합, 또는 또 다른 분자에 의한 분자의 활성도의 기능적 활성화 또는 저해를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 헤테로머 복합체는 면역글로불린 분자이다. 척추동물계에서 면역글로불린은 2종의 동일한 경쇄 및 2종의 동일한 중쇄로 구성된 항체이다. 4개의 쇄는 다이설파이드 결합에 의해서 합께 결합되어, 각각의 경쇄는 중쇄와 결합되고, 중쇄는 이의 테일을 통해서 연결되어 함께 Y-자형 헤테로머 복합체를 형성한다. DNA 암호화 면역글로불린 분자를 조정하여 재조합 단백질, 예컨대, 향상된 친화도를 갖는 항체, 또는 다른 항체-기반 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 DNA를 산출하는 다수의 기술이 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Larrick et al. (1989), Biotechnology 7:934-938; Reichmann et al. (1988), Nature 332:323-327; Roberts et al. (1987), Nature 328:731-734; Verhoeyen et al. (1988), Science 239:1534-1536; Chaudhary et al. (1989), Nature 339:394-397] 참고).
인간 항체(예컨대, 항체 라이브러리, 및/또는 트랜스제닉 동물을 사용하여 제조되고, 임의로 시험관내에서 추가로 변형됨), 뿐만 아니라 인간화된 항체를 생산하는 재조합 세포가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다(예를 들어, 카빌(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호; 카빌 등의 유럽 특허 제0,125,023 B1호; 보스(Boss) 등의 미국 특허 제4,816,397호; 보스 등의 유럽 특허 제0,120,694 B1호; 뉴버거(Neuberger) 등의 국제 특허 제WO 86/01533호; 뉴버거 등의 유럽 특허 제0,194,276 B1호; 윈터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호; 윈터의 유럽 특허 제0,239,400 B1호; 퀸(Queen) 등의 유럽 특허 제0,451,216 B1호; 및 파들란(Padlan) 등의 유럽 특허 0,519,596 A1호 참고). 예를 들어, 본 발명을 사용하여 특정 세포 표적, 몇몇 예로, 예를 들어, 인간 EGF 수용체, her-2/neu 항원, CEA 항원, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CD5, CD11a, CD18, NGF, CD20, CD45, Ep-cam, 다른 암 세포 표면 분자, TNF-알파, TGF-b 1, VEGF, 다른 사이토카인, 알파 4 베타 7 인테그린, IgEs, 바이러스 단백질(예를 들어, 거대세포바이러스) 등을 면역특이적으로 인식하는 인간 및/또는 인간화된 항체의 발현을 유도할 수 있다.
면역글로불린에 더하여, 헤테로머 복합체의 예는 임의의 이종이량체 또는 이종 올리고머 단백질, 예를 들어, BMP2/BMP7, 골원성 단백질, 인터류킨 1 전환 효소(ICE), 다양한 인터류킨 수용체(예를 들어, IL-18 수용체, IL-13 수용체, IL-4 수용체 및 IL-7 수용체), 핵의 수용체, 예컨대, 레티노이드 수용체, T-세포 수용체, 인테그린, 예컨대, 세포 접착 분자, 인테그린, 종양 괴사 인자 수용체 및 클래스 I 및 클래스 II 주조직적합 복합체 단백질(MHC)의 가용성 형태 및 막 결합 형태를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 수용체인 헤테로머 복합체의 경우, 본 발명은 폴리펩타이드의 가용성 형태 및 막 결합 형태 둘 모두를 포함한다. 본 발명에 따라서 생산될 수 있는 추가적인 헤테로머 단백질의 설명은 예를 들어, 문헌[Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Vol. II (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge Mass., 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, Eds. Oxford University Press Inc., New York, 1993) 및 The Cytokine Handbook (A W Thompson, ed.; Academic Press, San Diego Calif.; 1991)]에서 찾아볼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 이종 단백질 또는 펩타이드에 융합된 단백질, 또는 단백질의 도메인(예를 들어, 가용성 세포외 도메인)을 지칭한다. 이러한 융합 단백질의 예는 면역글로불린 분자의 일부분을 갖는 융합으로서 발현된 단백질, 지퍼 모이어티를 갖는 융합 단백질로서 발현된 단백질 및 신규 다작용성 단백질, 예컨대, 사이토카인 및 성장 인자의 융합 단백질(즉, GM-CSF 및 IL-3, MGF 및 IL-3)을 포함한다. 국제 특허 제WO 93/08207호 및 제WO 96/40918호에는 각각 면역글로불린 융합 단백질 및 지퍼 융합 단백질을 비롯한, CD40L이라 지칭되는 분자의 다양한 가용성 올리고머 형태의 제제가 기술되어 있고, 그것에 논의된 기술은 다른 단백질에 적용 가능하다. 본 명세서에 기술된 분자 중 임의의 것은 세포 수용체 분자의 세포외 도메인, 효소, 호르몬, 사이토카인, 면역글로불린 분자의 일부분, 지퍼 도메인, 및 에피토프를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
용어 "항원 결합 단백질"은 이의 가장 넓은 의미에서 사용되고, 항원 또는 표적에 결합하는 일부분, 임의로, 항원 결합 부분이 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 촉진시키는 입체 배치를 개작하도록 하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분을 포함하는 단백질을 의미한다. 항원 결합 단백질의 예는 인간 항체, 인간화된 항체; 키메라 항체; 재조합 항체; 단일 쇄 항체; 다이아바디; 트라이아바디; 테트라바디; Fab 단편; F(ab')2 단편; IgD 항체; IgE 항체; IgM 항체; gG1 항체; IgG2 항체; IgG3 항체; 또는 IgG4 항체, 이들의 단편을 포함한다. 항원 결합 단백질은 예를 들어, 그래프팅된 CDR 또는 CDR 유도체를 갖는 대안적인 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 스캐폴드는 예를 들어, 항원 결합 단백질의 3차원 구조를 안정화시키기 위해서 도입된 돌연변이를 포함하는 항체-유래 스캐폴드뿐만 아니라 예를 들어, 생체적합성 중합체를 포함하는 완전 합성 스캐폴드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004)] 참고) 또한, 펩타이드 항체 모방체("PAM"), 뿐만 아니라 스캐폴드로서 피브로넥틴 구성성분을 이용하는 항체 모방체를 기반으로 하는 스캐폴드가 사용될 수 있다.
항원 결합 단백질은 예를 들어, 자연 발생 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. "면역글로불린"은 사량체 분자이다. 자연 발생 면역글로불린에서, 각각의 사량체는 2종의 동일한 폴리펩타이드 쇄의 쌍으로 구성되는데, 이들 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25kDa) 및 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 한정한다. 인간 경쇄는 카파 경쇄 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 한정한다.
자연 발생 면역글로불린 쇄는 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해서 결합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. N-말단으로부터 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 문헌[Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, (1991)]의 정의에 따라서 수행될 수 있다. 바람직한 경우, CDR은 또한 대안적인 명명 규칙, 예컨대, 코티아(Chothia) 명명 규칙(문헌[Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883 or Honegger & Pluckthun, (2001) J . Mol. Biol. 309:657-670)] 참고)에 따라서 재정의될 수 있다.
본 개시내용의 문맥에서, 항원 결합 단백질은, 해리 상수(KD)가 10-8M 이하인 경우 이의 표적 항원에 "특이적으로 결합한다" 또는 "선택적으로 결합한다"라고 언급된다. 항체는, KD가 5x 10-9M 이하인 경우 "높은 친화도"로, 그리고 KD가 5x 10-10M 이하인 경우 "매우 높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다.
용어 "항체"는 달리 특정되지 않는 한, 특이적 결합에 대해서 무손상 항체와 경쟁하는 임의의 아이소타입 또는 하위부류의 글리코실화된 면역글로불로빈과 비글리코실화된 면역글로불린 둘 모두 또는 이들의 항원 결합 영역에 대한 언급을 포함한다. 추가로, 용어 "항체"는 달리 특정되지 않는 한, 특이적 결합에 대해서 무손상 항체와 경쟁하는 무손상 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해서 또는 무손상 항체의 효소 또는 화학 절단에 의해서 생산될 수 있고, 관심 단백질의 요소를 형성할 수 있다. 항원 결합 부분은 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체(dAb), 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 및 폴리펩타이드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 적어도 일부의 면역글로불린을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다.
용어 "항체"는 구조 및/또는 기능이 항체의, 예를 들어 전장 또는 전체 면역글로불린 분자의 구조 및/또는 기능에 기반하는 분자를 지칭한다. 따라서 항체 작제물은 그의 특이적 표적 또는 항원에 결합할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 항체 작제물의 결합 도메인은 표적 결합을 허용하는 항체의 최소 구조 요건을 포함한다. 이러한 최소 요건은 예를 들어, 적어도 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3), 바람직하게는 모두 6개의 CDR의 존재에 의해서 정의될 수 있다. 항체의 최소 구조 요건을 정의하기 위한 대안적인 접근법은 각각 특이적 표적의 구조 내의 항체의 에피토프, 에피토프 영역(에피토프 클러스터)을 구성하는 표적 단백질의 단백질 도메인의 정의 또는 정의된 항체의 에피토프와 경쟁하는 특이적 항체를 참고로 한다. 본 발명에 따른 작제물이 기반으로 하는 항체는 예를 들어 단클론성, 재조합, 키메라, 탈면역화, 인간화 및 인간 항체를 포함한다.
Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편이고; F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 다이설파이드 브릿지에 의해서 연결된 2종의 Fab 단편을 갖는 2가 단편이고; Fd 단편은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 갖고; Fv 단편은 항체의 단일 아암의 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖고; dAb 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인의 항원-결합 단편을 갖고; 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 단일 쇄 Fv(scFv)이다(미국 특허 제6,846,634호, 제6,696,245호, 미국 출원 공개 제05/0202512호, 제04/0202995, 제04/0038291호, 제04/0009507호, 제03/0039958호, 문헌[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)] 참고).
단일-쇄 항체(scFv)는 VL 영역 및 VH 영역이 링커(예를 들어, 아미노산 잔기의 합성 서열)를 통해서 연결되어 연속적인 단백질 쇄를 형성한 항체이며, 여기서 링커는 단백질 쇄가 그 자체 상에 다시 폴딩되어 1가 항원 결합 부위를 형성하도록 하기에 충분히 길다(예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423-26 (1988) 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83] 참고). 다이아바디는 2종의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 2가 항체인데, 여기서 각각의 폴리펩타이드 쇄는 동일한 쇄 상의 2종의 도메인 간의 짝지움을 허용하고, 따라서 각각의 도메인이 또 다른 폴리펩타이드 쇄 상의 상보성 도메인과의 짝지움을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해서 결합된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다(예를 들어, 문헌[Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48; 및 Poljak et al., (1994) Structure 2:1121-23] 참고). 다이아바디의 2종의 폴리펩타이드 쇄가 동일한 경우, 이러한 짝지움으로부터 초래한 다이아바디는 2종의 동일한 항원 결합 부위를 가질 것이다. 상이한 서열을 갖는 폴리펩타이드 쇄를 사용하여 2종의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 다이아바디를 제조할 수 있다. 유사하게, 트라이바디 및 테트라바디는 각각 3개 및 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하여, 각각 동일하거나 상이할 수 있는 3개 및 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 항체이다.
추가로, 용어 "항체"는 1가, 2가 및 다가/다중가 작제물을 포함하고, 따라서 단지 2종의 항원 구조에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 작제물, 뿐만 아니라 상이한 결합 도메인을 통해서 2종을 초과하는 항원 구조, 예를 들어 3, 4 또는 그 초과에 특이적으로 결합하는 다특이적/다중특이적 작제물을 포함한다. 게다가, 용어 "항체"는 단지 하나의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 분자뿐만 아니라 하나 초과의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 분자를 포함하며, 이 쇄는 동일하거나(동종이량체, 동종삼량체 또는 동종 올리고머) 또는 상이할 수 있다(이종이량체, 이종삼량체 또는 이종올리고머). 상기에 식별된 항체 및 이의 변이체 또는 유도체는 특히 문헌[Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) 및 Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Duebel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 및 [Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009]에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적"은 "적어도 이중특이적"인 항체를 지칭하며, 즉, 이는 적어도 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하되, 제1 결합 도메인은 하나의 항원 또는 표적(본 명세서에서, 표적 세포 표면 항원)에 결합하고, 제2 결합 도메인은 다른 항원 또는 표적에 결합한다. 따라서, 이중특이적 항체 작제물은 적어도 2종의 상이한 항원 또는 표적에 대해 특이성을 포함한다. 이중특이적 항체는 또한 다중 특이적 항체 작제물, 예컨대 삼중특이적 항체 작제물을 포함하며, 후자는 3개의 결합 도메인, 또는 3개 초과의(예를 들어, 4, 5개...) 특이성을 갖는 작제물을 포함할 수 있다.
하나 이상의 CDR이 공유 또는 비공유적으로 분자에 혼입되어 그것이 항원 결합 단백질을 만들게 할 수 있다. 항원 결합 단백질은 더 큰 폴리펩타이드 쇄의 부분으로서 CDR(들)을 혼입할 수 있거나, CDR(들)을 또 다른 폴리펩타이드 쇄에 공유 결합할 수 있거나, 또는 CDR(들)을 비공유적으로 혼입할 수 있다. CDR은 항원 결합 단백질이 특정 관심 항원에 특이적으로 결합하는 것을 허용한다.
항원 결합 단백질은 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나 초과의 결합 부위가 존재하는 경우, 그 결합 부위는 서로와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 인간 면역글로불린은 전형적으로 2종의 동일한 결합 부위를 갖는 반면, "이중특이적" 또는 "이작용성" 항체는 2종의 상이한 결합 부위를 갖는다.
명확성의 목적을 위해서, 그리고 본 명세서에 기술된 바와 같이, 항원 결합 단백질은 반드시 인간 기원(예를 들어, 인간 항체)일 수 있지만, 인간 기원일 필요는 없고, 일부 경우에 비-인간 단백질, 예를 들어 래트 또는 뮤린 단백질을 포함할 것이고, 다른 경우에 항원 결합 단백질은 인간과 비-인간 단백질(예를 들어, 인간화된 항체)의 혼성체를 포함할 수 있다.
관심 단백질은 인간 항체를 포함할 수 있다. 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 모든 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 가변 도메인 및 불변 도메인 모두는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다(완전 인간 항체). 이러한 항체는, 인간 중쇄 및/또는 경쇄-암호화 유전자로부터 유래된 항체를 발현하도록 유전자 조작된 마우스, 예컨대, 제노마우스(Xenomouse)(등록상표), 울티맵(UltiMab)(상표명), 또는 벨로시문(Velocimmune)(등록상표) 시스템으로부터 유래된 마우스의 관심 항원으로의 면역화를 통한 것을 비롯한 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 파지-기반 접근법이 또한 사용될 수 있다.
대안적으로, 관심 단백질은 인간화된 항체를 포함할 수 있다. "인간화된 항체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해서 비-인간 종으로부터 유래된 항체의 서열과 상이한 서열을 가져서, 인간화된 항체는 그것이 인간 대상체에 투여되는 경우, 비-인간 종 항체와 비교할 때, 면역 반응을 적게 유도하고/하거나 덜 심각한 면역을 유도한다. 일 실시형태에서, 비-인간 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 도메인 및 불변 도메인 내의 특정 아미노산은 돌연변이되어 인간화된 항체를 생산한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 항체로부터의 불변 도메인(들)은 비-인간 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 인간화된 항체를 제조하는 방법의 예는 미국 특허 제6,054,297호, 제5,886,152호 및 제5,877,293호에서 찾아볼 수 있다.
"Fc" 영역은 본 명세서에서 이 용어가 사용된 바와 같이 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2종의 중쇄 단편을 포함한다. 2종의 중쇄 단편은 2종 이상의 다이설파이드 결합에 의해서 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해서 함께 유지된다. 항원 결합 단백질 및 Fc 융합 단백질을 비롯한, Fc 영역을 포함하는 관심 단백질은 본 개시내용의 또 다른 양상을 형성한다.
"헤미바디"는 완전 중쇄, 완전 경쇄 및 완전 중쇄의 Fc 영역과 짝지워진 제2 중쇄 Fc 영역을 포함하는 면역학적으로 기능성인 면역글로불린 작제물이다. 링커는 중쇄 Fc 영역 및 제2 중쇄 Fc 영역을 연결하는 데 사용될 수 있지만, 필요하지 않을 수 있다. 특별한 실시형태에서 헤미바디는 본 명세서에 개시된 항원 결합 단백질의 1가 형태이다. 다른 실시형태에서, 하전된 잔기의 쌍을 사용하여 하나의 Fc 영역과 제2 Fc 영역을 회합시킬 수 있다. 헤미바디는 본 개시내용의 문맥에서 관심 단백질일 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 상업적 또는 과학적 관심 대상의 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 세포를 의미한다. 세포주의 유전자 조작은 세포를 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자("관심 유전자")를 암호화하는 핵산으로 형질주입, 형질전환 또는 형질도입시키는 것, 및/또는 (예를 들어, 동종 재조합 및 재조합 세포의 비-재조합 세포로의 유전자 활성화 또는 융합에 의해서) 숙주 세포가 목적하는 재조합 폴리펩타이드를 발현하게 하도록 달리 변경하는 것을 포함한다. 관심 폴리펩타이드를 발현하도록 세포 및/또는 세포주를 유전자 조작하는 방법 및 벡터는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있으며; 예를 들어, 다양한 기술이 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69]에 설명되어 있다. 이 용어는 자손이 본래 모체 세포와 모폴로지 또는 유전 구성이 동일한지의 여부와 관계 없이, 관심 유전자가 존재하는 한 모체 세포의 자손을 포함한다. 세포 배양물은 1종 이상의 숙주 세포를 포함할 수 있다.
용어 "하이브리도마"는 불멸화된 세포 및 항체-생산 세포의 융합으로부터 초래한 세포 또는 세포의 자손을 의미한다. 생성된 하이브리도마는 항체를 생산하는 불멸화된 세포이다. 하이브리도마를 생성하는 데 사용된 개별 세포는 햄스터, 래트, 돼지, 토끼, 양, 염소 및 인간을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 또한 트라이오마 세포주를 포함하는데, 이것은 인간 세포와 뮤린 골수종 세포주 간의 융합 생성물인 이종접합체 골수종 융합물의 자손이 후속하여 혈장 세포와 융합되는 경우 생성된다. 이 용어는 항체, 예컨대, 예를 들어, 쿼드로마를 생산하는 임의의 불멸화된 혼성체 세포주를 포함하는 의미이다(예를 들어, 문헌[Milstein et al., (1983) Nature, 537:3053] 참고).
용어 "배양물" 및 "세포 배양물"은 상호 교환 가능하게 사용되고, 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건 하에서 배지 중에서 유지되는 세포 집단을 지칭한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 이러한 용어는 또한 세포 집단 및 그 집단이 현탁된 배지를 포함하는 조합물을 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"(예를 들어, 관심 단백질 또는 관심 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 바와 같이)은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되어 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. 이 용어는 또한 예를 들어, 탄수화물 잔기의 첨가에 의해서 변형되어 당단백질을 형성하거나 또는 포스포릴화된 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 및 단백질은 자연 발생 비-재조합 세포에 의해서 생산될 수 있거나, 폴리펩타이드 및 단백질은 유전자 조작되거나 재조합된 세포에 의해서 생산될 수 있다. 폴리펩타이드 및 단백질은 네이티브 단백질, 또는 네이티브 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 이에 대한 첨가 및/또는 이의 치환을 갖는 분자의 아미노산 서열을 갖는 분자를 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 단지 자연 발생 아미노산을 포함하는 분자, 뿐만 아니라 비-자연 발생 아미노산을 포함하는 분자를 포함한다. 비-자연 발생 아미노산(바람직한 경우, 이것은 본 명세서에 개시된 임의의 서열에서 발견되는 임의의 자연-발생 아미노산에 대해서 치환될 수 있음)의 예는 (비제한적으로): 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트라이메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-폼일메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 폴리펩타이드 표기법에서, 표준 사용 및 관습에 따라서 왼손 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른손 방향은 카복실-말단 방향이다.
"세포 배양" 또는 "배양"은 다세포 유기체 또는 조직 밖의 세포 성장 및 증식을 의미한다. 포유동물 세포에 적합한 배양 조건은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 동물 세포 배양: 문헌[A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)] 참고). 포유동물 세포는 현탁액 중에서 배양될 수 있거나 또는 한편으로 고체 기질에 부착된다. 마이크로담체와 함께 또는 그것 없이, 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병, 진탕 플라스크 또는 교반 탱크 생물반응기가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서 500L 내지 2000L의 생물반응기가 사용된다. 일 실시형태에서, 1000L 내지 2000L의 생물반응기가 사용된다.
용어 "세포 배양 배지"(또한 "배양 배지", "세포 배양 배지", "조직 배양 배지"로 불림)는 성장하는 세포, 예를 들어, 동물 또는 포유류 세포에 대해 사용되는 임의의 영양소 용액을 지칭하며, 에너지 공급원(보통 탄수화물, 예컨대 글루코스 형태); 하나 이상의 모든 필수 아미노산, 및 일반적으로 20가지의 염기성 아미노산 + 시스테인; 비타민 및/또는 전형적으로 저농도로 필요한 다른 유기 화합물; 지질 또는 유리 지방산; 및 미량 원소, 예를 들어, 전형적으로 매우 저농도로(보통 마이크로몰 범위로) 필요한 무기 화합물 또는 자연 발생 원소로부터의 적어도 하나 이상의 성분을 제공한다.
영양소 용액은 임의로 배양될 세포 및/또는 목적으로 하는 세포 배양 파라미터의 요건에 따라서 세포 성장을 최적화하기 위해 추가적인 임의적인 성분, 예컨대 호르몬 및 다른 성장 인자, 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 혈청 등; 염, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘 및 인산염, 및 완충제, 예를 들어, HEPES; 뉴클레오사이드 및 염기, 예를 들어, 아데노신, 티미딘, 하이포크산틴; 및 단백질 및 조직 가수분해물, 예를 들어, 가수분해된 동물 또는 식물 단백질(동물 부산물, 정제 젤라틴 또는 식물 물질로부터 얻을 수 있는 펩톤 또는 펩톤 혼합물); 항생제, 예를 들어, 젠타마이신; 세포 보호제 또는 계면활성제, 예컨대, 플루로닉(Pluronic)(등록상표) F68(루트롤(Lutrol)(등록상표) F68 및 콜리포(Kolliphor)(등록상표) P188; 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2종의 친수성 쇄에 의해서 플랭킹된 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체; 폴리아민, 예를 들어, 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민(예를 들어, WIPO 공개 제WO 2008/154014호) 및 피루브산염(예를 들어, 미국 특허 제8053238호 참조)으로 보충될 수 있다.
세포 배양 배지는 임의의 세포 배양 공정, 예컨대 이하로 제한되는 것은 아니지만, 세포의 회분식, 확장 회분식, 유가식 및/또는 관류 또는 연속적 배양과 함께 전형적으로 사용되고/되거나 함께 사용을 위해 공지된 것을 포함한다.
"기본"(또는 회분식) 세포 배양 배지는 세포 배양을 개시하기 위해 전형적으로 사용되고, 세포 배양을 지원하는데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다.
"성장" 세포 배양 배지는 지수적 성장 기간인 "성장기" 동안 세포 배양에서 전형적으로 사용되고, 이 단계 동안 세포 배양을 지원하는 데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다. 성장 세포 배양 배지는 또한 숙주 세포주에 혼입된 저항성 또는 생존 내지 선택 마커를 부여하는 선택제를 함유할 수 있다. 이러한 선택제는 제네티신(G4118), 네오마이신, 하이그로마이신 B, 퓨로마이신, 제오신, 메티오닌 설폭시민, 메토트렉세이트, 무-글루타민 세포 배양 배지, 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘이 없는 세포 배양 배지, 또는 티미딘 단독을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"생산" 세포 배양 배지는 지수적 성장이 끝나고 단백질 생산이 우세해질 때 전이, "전이" 및/또는 "생성물" 단계 동안 세포 배양에서 전형적으로 사용되고, 이 단계 동안 목적으로 하는 세포 밀도, 생존도 및/또는 생성물 역가를 유지하는 데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다.
"관류" 세포 배양 배지는 관류 또는 연속적 배양 방법에 의해 유지되는 세포 배양에서 전형적으로 사용되고, 이 공정 동안 세포 배양을 지원하는 데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다. 관류 세포 배양 배지 제형은 소모 배지를 제거하기 위해 사용되는 방법을 수용하기 위해 기본 세포 배양 배지 제형보다 강화되거나 또는 더 농축될 수 있다. 관류 세포 배양 배지는 성장기와 생성기 둘 다 동안에 사용될 수 있다.
농축 세포 배양 배지는 세포 배양을 유지하는 데 필수적인 일부 또는 모든 영양소를 함유할 수 있고; 특히, 농축 배지는 세포 배양의 생성기 과정 동안 소모될 것으로 식별 또는 공지된 영양소를 함유할 수 있다. 농축 배지는 거의 임의의 세포 배양 배지 제형에 기반할 수 있다. 이러한 농축 공급 배지는 그들의 정상량의, 예를 들어, 약 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X 또는 심지어 약 1000X에서 세포 배양 배지의 일부 또는 모든 성분을 함유할 수 있다.
세포 배양 배지를 제조하는 데 사용되는 구성성분은 분말 배지 제형으로 완전히 분쇄되거나; 필요하다면 세포 배양 배지에 첨가된 액체 보충물과 함께 부분적으로 분쇄되거나; 또는 세포 배양 배지 성분은 세포 배양물에 완전히 액체 형태로 첨가될 수 있다.
세포 배양은 또한 제형화가 어렵거나 또는 세포 배양물에서 빠르게 고갈될 수 있는 특정 영양소의 독립적 농축 공급물로 보충될 수 있다. 이러한 영양소는 아미노산, 예컨대 타이로신, 시스테인 및/또는 시스틴일 수 있다(예를 들어, WIPO 공개 제2012/145682호). 일 실시형태에서, 타이로신의 농축 용액은 타이로신을 함유하는 세포 배양 배지 중에서 성장된 세포 배양물로 독립적으로 공급되어, 세포 배양물 중의 타이로신의 농도는 8mM를 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 타이로신 및 시스틴 농축 용액은 타이로신, 시스틴 또는 시스테인이 없는 세포 배양 배지에서 성장 중인 세포 배양물에 독립적으로 공급된다. 독립적 공급은 생성기 전에 또는 생성기의 시작 시 시작할 수 있다. 독립적 공급은 농축 공급 배지로서 동일 또는 상이한 날에 세포 배양 배지에 대해 유가식 배양에 의해 달성될 수 있다. 독립적 공급은 또한 관류 배지와 동일 또는 상이한 날에 관류될 수 있다.
"혈청-무함유"는 동물 혈청, 예컨대 우태아 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. 정의된 배양 배지를 비롯한, 다양한 조직 배양 배지가 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들어, 하기 세포 배양 배지 중 임의의 하나 또는 조합물이 사용될 수 있다: 특히 RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지 이글, F-12K 배지, 햄 F12 배지, 이스코브 변형 둘베코 배지, 맥코이 5A 배지, 레이보비츠 L-15 배지, 및 혈청-무함유 배지, 예컨대, EX-세포(상표명) 300 시리즈(JRH 바이오사이언시스(JRH Biosciences), 미국 캔서스주 레넥사 소재). 이러한 배양 배지의 혈청-무함유 버전이 또한 입수 가능하다. 세포 배양 배지는 배양될 세포 및/또는 목적하는 세포 배양 파라미터의 요건에 따라서, 추가적인 또는 증가된 농도의 구성성분, 예컨대, 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량 원소 등으로 보충될 수 있다.
용어 "생물반응기"는 세포 배양물의 성장에 유용한 임의의 용기를 의미한다. 본 개시내용의 세포 배양물은 생물반응기에서 성장될 수 있고, 이것은 생물반응기에서 성장하는 세포에 의해서 생산되는 관심 단백질의 적용을 기반으로 선택될 수 있다. 생물반응기는 그것이, 세포의 배양에 유용한 한 임의의 크기일 수 있고; 전형적으로, 생물반응기는 그것의 내부에서 성장될 세포 배양물의 체적에 적절한 크기이다. 전형적으로, 생물반응기는 적어도 1리터일 것이고, 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1,000, 1500, 2000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000리터 또는 그 초과 또는 그들 사이의 임의의 부피일 수 있다. pH 및 온도를 비롯한, 생물반응기의 내부 조건은 배양 기간 동안 제어될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 관련 고려사항을 기준으로 본 발명을 실시하는 데 사용하기 위한 적합한 생물반응기를 인식할 것이고, 이를 선택할 수 있을 것이다.
"세포 밀도"는 주어진 체적의 배양 배지에서 세포 수를 지칭한다. "생존 세포 밀도"는 표준 생존도 검정(예컨대, 트립판 블루 염료 배제 방법)에 의해 결정한 바와 같은 주어진 체적의 배양 배지에서의 생존 세포 수를 지칭한다.
용어 "세포 생존도"는 배양 조건 또는 실험 변동의 주어진 세트 하에서 살아남은 배양물 중의 세포의 능력을 의미한다. 이 용어는 또한 특정 시간에서 배양물 중의 생존 세포 및 죽은 세포의 총 수에 대한 그 시간에서 생존 세포의 비율을 지칭한다.
"충전 세포 체적 백분율"(PCV%)로도 지칭되는 용어 "충전 세포 체적"(PCV)은 백분율로서 표현되는 세포 배양물의 총 체적에 대한 세포에 의해 점유되는 체적의 비이다(문헌[Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6):1228-33] 참고). 충전 세포 체적은 세포 밀도 및 세포 직경의 함수이며; 충전 세포 체적의 증가는 세포 밀도 또는 세포 직경 중 하나 또는 둘 다의 증가로부터 생길 수 있었다. 충전 세포 체적은 세포 배양물 내 고체 수준의 측정이다. 고체는 수거 및 하류 정제 동안 제거된다. 보다 고체라는 것은 수거 및 하류 정제 단계 동안 목적하는 생성물로부터 고체 물질을 분리하는 데 더 많은 노력이 필요함을 의미한다. 또한, 목적하는 생성물은 고체 내에 포획되고, 수거 공정 동안 손실되어 생성물 수율을 감소시킬 수 있다. 숙주 세포는 크기가 다양하고, 세포 배양물은 또한 죽은 세포 및 죽어가는 세포 및 다른 세포 부스러기를 함유하기 때문에, 충전 세포 체적은 세포 밀도 또는 생존 세포 밀도보다 세포 배양물 내에서 고체 함량을 기술하기에 보다 정확한 방식이다. 예를 들어, 50 x 106개 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는 2000L의 배양물은 세포의 크기에 따라서 상당히 상이한 충전 세포 체적을 가질 것이다. 또한, 일부 세포는, 성장-정지 상태로 존재하는 경우, 크기가 증가할 것이어서, 세포 크기 증가의 결과로 인한 바이오매스의 증가로 인해서, 성장-정지 전 및 성장-정지 후 충전 세포 체적은 상이할 가능성이 있을 것이다.
"세포 성장-정지"라고도 지칭될 수 있는 "성장-정지"는 세포가 수의 증가를 중단하거나 세포 사이클이 더 이상 진행되지 않는 지점이다. 성장-정지는 세포 배양물의 생존 세포 밀도를 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 성장-정지 상태의 일부 세포는 크기가 증가할 수 있지만 수는 증가할 수 없어서, 성장-정지 배양물의 충전 세포 체적은 증가할 수 있다. 세포가 건강이 악화되지 않으면, 성장 정지로 이어지는 조건을 역전시킴으로써, 성장-정지를 어느 정도로 역전될 수 있다.
용어 "역가"는 주어진 양의 배지 체적에서 세포 배양물에 의해서 생산된 폴리펩타이드 또는 관심 단백질(이것은 자연 발생 또는 재조합 관심 단백질일 수 있음)의 총량을 의미한다. 역가는 배지 밀리리터(또는 다른 체적 측정치)당 폴리펩타이드 또는 단백질의 밀리그램 또는 마이크로그램의 단위로 표현될 수 있다. "누적 역가"는 배양 과정 동안 세포에 의해서 생성된 역가이고, 예를 들어, 매일 역가를 측정하고, 이들 값을 사용하여 누적 역가를 계산함으로써 결정될 수 있다.
용어 "유가식 배양"은 현탁 배양의 형태를 지칭하고, 추가적인 구성성분이 배양 공정의 시작 이후에 한번씩 또는 여러번 제공되는 세포를 배양하는 방법을 의미한다. 제공된 구성성분은 전형적으로 배양 공정 동안 고갈된 세포를 위한 영양 보충물을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 추가적인 구성성분은 보충 구성성분(예를 들어, 세포-사이클 저해 화합물)을 포함할 수 있다. 유가식 배양은 전형적으로 임의의 지점에서 중단되고, 배지 중의 세포 및/또는 구성성분이 수거되고, 임의로 정제된다.
용어 "적분 생존 세포 밀도" 또는 "IVCD"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 배양 과정에 걸쳐서 생존 세포의 평균 밀도를 배양이 실시되는 시간의 양으로 나눈 것을 의미한다.
"누적 생존 세포 밀도"(CVCD)는 두 지점 간의 평균 생존 세포 밀도(VCD)를 그러한 두 시간 지점 간의 시간 간격과 곱셈함으로써 계산된다. CVCD는 VCD 대 시간을 플롯팅함으로써 형성된 곡선하 면적이다.
본 발명은 2-벡터 시스템을 사용하여, 헤테로머 단백질, 예컨대, 항체를 암호화하는 발현 작제물을 직접 선택하기 위해서 유전자내 상보성에 적용될 수 있는 선택 가능한 마커를 이용한다. "유전자내 상보성"은 각각 동일한 유전자좌 내의 상이한 결함을 갖는, 유전 물질(즉, 핵산)의 조각들 간의 상보성을 지칭한다. 유전 물질에 의해서 암호화된 개별 단백질은 결함이 있고, 비-기능성이지만, 2종의 개별 결함 단백질은 회합하여 활성 단백질을 형성할 수 있다. 개별 결함 단백질이 회합하여 활성도를 나타낼 수 있으면, 개별 결합 단백질은 "상보성"이라고 언급된다. 다수의 동일한 소단위로 구성된 선택 가능한 마커 단백질(예컨대, GS)의 경우, 유전자내 상보성은 돌연변이체 소단위가 상보성인 경우에 일어날 수 있다.
"유전자내 상보성"은 또한 회합하여 활성 단백질을 형성한 유전 물질에 의해서 암호화된 개별 단백질의 단편들 사이에서 일어날 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 고등 진핵생물에서 성숙 GS 효소는 2종의 오량체 고리로 이루어진 십량체 복합체로서 존재한다. 본 발명은, GS의 유전자내 상보성이 재조합 단백질을 발현하는 세포주의 생성을 위한 선택 시스템의 일부로서 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 예증한다. 글루타민 합성효소가 결핍되도록 유전자 변형된 CHO 세포에서 재조합 항체의 높은 수준 발현을 위한 시스템의 유용성.
유전 물질에 의해서 암호화된 개별 단백질은 암호화 핵산에서 1종 이상의 돌연변이의 도입에 의해서 결함성이고, 비-기능성이 되는데, 이 돌연변이(들)는 그것이 비-기능성이 되도록 충분하게 단백질의 구조를 변경시킨다. 돌연변이 또는 돌연변이들은 분자 생물학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서 도입될 수 있다. 대안적으로, 결함성 및 비-기능성이 되도록 하는 단백질 단편이 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 2종의 단백질 단편이 회합하여 유전자내 상보성에 의해서 활성 단백질을 형성할 수 있다.
핵산 분자는, 돌연변이체 소단위의 발현이 폴리펩타이드의 발현과 상관관계가 있도록 하는 방식으로 배열된, 선택 가능한 마커의 폴리펩타이드 및 돌연변이체 소단위를 암호화하는 작제물이다. 따라서, 상보성 돌연변이체 소단위를 암호화하는 핵산 분자가 세포 내에 도입되어 선택적인 조건이 적용되는 경우, 상보성 돌연변이체 소단위 각각의 대략 동일한 높은 수준의 발현이 최고 선택 가능한 활성도를 제공할 것이다. 또한, 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드는 거의 동일한 많은 양으로 발현되고, 따라서 동일한 높은 수준의 목적하는 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 선택을 최적화할 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 글루타민 합성효소(GS)이고, 이의 활성 부위는 GS의 2종의 소단위의 정션에서 위치되어, 상보성인 기능적으로 손상된 돌연변이체 소단위의 공동 발현이 일부 무손상 기능 활성 부위를 생성해야 한다. 개별 돌연변이체 소단위 단독은 유의한 선택 가능한 활성도를 갖지 않지만, 이의 상보성 돌연변이체 소단위와 공동 발현되는 경우 선택 가능한 활성도를 제공한다. 소단위의 최적의 활성도는 이의 상호작용에 좌우될 수 있고, 이와 같이 상호작용 도메인에 의해서 촉진될 수 있다. 이러한 상호작용 도메인은 소단위에 대해서 내인성일 수 있거나, 또는 그것은 소단위에 대해서 이종일 수 있다. 본 발명에 유용한 추가적인 선택 가능한 마커는 아르기노석시네이트 리아제, 아데닐로석시네이트 합성효소, 및 글루타메이트 데하이드로게나제를 포함하고, 이에 대해서 상보성 돌연변이체가 식별될 수 있다. 예를 들어, 아르기노석시네이트 리아제 돌연변이체와의 유전자내 상보성은 아르기닌의 부재 하에서의 성장에 의해서 확인될 수 있는 반면, 아데닐로석시네이트 합성효소 돌연변이체와의 유전자내 상보성은 아데노신의 부재 하에서의 성장에 의해서 확인될 수 있다.
제한적인 일 실시형태에서, 본 발명은 각각이 상호작용 도메인에 대한 융합 단백질로서 발현될 수 있는, 선택 가능한 마커의 2종의 단편의 사용을 포함한다. 발현되는 경우, 상호작용 도메인은 두 단편의 회합 또는 이량체화를 촉진킴으로써, 소단위가 기능하게 하고, 선택 가능한 활성도를 제공한다(예를 들어, 문헌[Pelletier et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., 95:12141-12146]에 기술된 것에 제한되지 않음). 적합한 선택적인 마커는 GS 및 상기에 기술된 다른 선택 가능한 마커, 뿐만 아니라 선택 가능한 마커, 예컨대, 통상적으로 독성인 특정 약물 및 본 명세서에 개시된 바와 같이 소정의 조건 하에서 세포 생존을 부여하거나 또는 세포사를 유도하는 대사 효소에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다.
"상호작용 도메인"은 2종 이상의 동종 또는 이종 폴리펩타이드의 상호작용 또는 회합을 용이하게 할 수 있는 폴리펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 도메인이다. 일 실시형태에서, 상호작용 도메인은 이량체화 도메인이다. 이량체화 도메인은 2종의 폴리펩타이드의 상호작용 또는 회합을 유도할 수 있는 폴리펩타이드일 수 있다. 2가지 유형의 이량체, 즉, 동종이량체(동일한 서열을 가짐) 또는 이종이량체(또 다른 서열을 가짐)를 형성할 수 있는 것이 존재한다.
예시적이지만 비제한적인 일 실시형태에서, 상호작용 도메인은 류신 지퍼 코일드 코일 폴리펩타이드이다. 류신 지퍼는 전형적으로 반복부의 제1 잔기 및 제4 잔기에서 소수성 잔기를 갖는 특징적인 7개의 잔기 반복부를 함유하는 약 35개의 아미노산을 포함한다(Harbury et al. (1993), Science 262:1401). 따라서 류신 지퍼는 폴리펩타이드를 올리고머화시킬 목적으로 폴리펩타이드에 폴리펩타이드에 융합될 수 있는데, 그 이유는 그것이 작은 분자이고, 더 큰 상호작용 도메인이 하는 것보다 폴리펩타이드를 덜 방해할 것이기 때문이다. 류신 지퍼의 예는 폴리펩타이드, 예컨대, GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc 및 c-Max로부터의 류신 지퍼 도메인을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
이량체화 도메인의 추가적인 예는 헬릭스-루프-헬릭스 도메인을 포함한다(Murre et al. (1989), Cell 58:537-544). 레티노산 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 다른 핵 호르몬 수용체(Kurokawa et al. (1993), Genes Dev. 7:1423-1435) 및 효모 전사 인자 GAL4 및 HAP1(Marmonstein et al. (1992), Nature 356:408-414; Zhang et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2851-2855; 미국 특허 제5,624,818) 모두는 이러한 모티프를 갖는 이량체화 도메인을 갖는다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 상호작용 도메인은 사량체화 도메인인데, 이것은 3개의 다른 사량체화 도메인에 결합하여 사량체 복합체를 형성할 수 있다. 단백질 함유 사량체화 도메인의 예는 이. 콜라이 락토스 리프레서(repressor)(아미노산 46 내지 360; Chakerian et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:1371; Alberti et al. (1993), EMBO J. 12:3227; 및 Lewis et al. (1996), Nature 271:1247), 및 잔기 322 내지 355에서 p53 사량체화 도메인(Clore et al. (1994), Science 265:386; Harbury et al. (1993), Science 262:1401; 미국 특허 제5,573,925호)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명은 각각 상호작용 도메인에 대한 융합 단백질로서 발현됨으로써, 회합을 향상시켜 선택 가능한 활성도를 제공하는 선택 가능한 마커의 3개의 소단위의 사용을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 헤테로머 복합체의 3종의 구성성분이 존재한다. 발현된 벡터(들)에서 각각에 대한 암호 서열은 선택 가능한 마커, 예를 들어, 단일 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 발현하는 이중특이적 항체(여기서 2개의 경쇄 둘 모두는 중쇄와 회합할 수 있음)의 각각의 소단위 각각에 대한 암호 서열에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명은 또한 4개 또는 심지어는 그 초과의 소단위를 갖는 공지되어 있거나 또는 아직 개시되지 않은 선택 가능한 마커의 사용을 포함한다.
본 발명은 또한 3개 이상의 소단위를 포함하는 이종다량체(또는 이종-올리고머) 단백질, 예컨대 본 명세서에 이미 기술된 것을 제조하는 데 유용할 것이다. 이것은 관련 기술 분야에 공지된 이중특이적 항체, 및 다른 이종다량체 단백질을 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 유전자내 상보성이어서 제1 항체로부터 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 있는 제1 선택 가능한 마커(예를 들어, GS), 및 상이한 선택 가능한 마커, 예컨대, 분할된 대사 효소 또는 내성 마커, 또는 제1 선택 가능한 마커와 상이하고, 유전자내 상보성이어서 제1 항체와 회합하여 이중특이적 항체를 형성할 수 있는 제2 항체의 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 있는 제2 선택 가능한 마커를 사용함으로써 발현될 수 있다.
대안적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같이 유전자내 상보성일 수 있는 제1 선택 가능한 마커(예를 들어, GS)를 사용하여 이중특이적 항체의 2개의 상이한 중쇄를 발현시킬 수 있고, 여기서 중쇄는 서로와 회합할 수 있다. 이어서, 경쇄를 상이한 선택 가능한 마커를 사용하여 발현시킬 수 있다. 일부 경우에, 경쇄는 이중특이적 항체의 두 아암 모두에 대해서 동일할 수 있는데, 이는 단일 선택 가능한 마커(대사 효소 또는 내성 마커, 또는 선택 가능한 마커의 다른 형태)가 경쇄의 발현을 위해서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 상이한 경쇄는 이중특이적 항체의 각각의 상이한 중쇄와 회합할 수 있는데, 이 경우, 제1 선택 가능한 마커와 상이하고, 유전자내 상보성일 수 있는 상이한 선택 가능한 마커, 예컨대, 분할된 대사 효소 또는 내성 마커, 또는 제2 선택 가능한 마커를 사용하여 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 발현시킨다.
실시예에서 하기에 나타낼 바와 같이, 본 발명의 방법 및 조성물은 높은 수준의 이종다량체 단백질을 발현하는 목적하는 세포를 선택하는 데 필요한 시간의 양을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 높은 수준의 재조합 폴리펩타이드, 특히 이종다량체 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 추가로, 본 발명은 세포 배양 공정을 통해서 헤테로머 복합체의 생산을 개선시키는 데 있어서 특별하게 유용하다.
일부 실시형태에서, 돌연변이체 마커 소단위를 암호화하는 핵산은 링커를 암호화하는 핵산에 인 프레임(in frame)으로 융합되고, 이것은 이어서 상호작용 도메인을 암호화하는 핵산에 인 프레임으로 융합된다. 링커는 상호작용 도메인이 상호작용하고, 소단위가 기능하여 선택 가능한 활성도를 제공하도록 하는 임의의 상대적으로 짧고 가요성인 서열을 포함할 수 있다. 링커의 예는 관련 기술 분야에서 풍부하고, GGPGG, GPGGG를 포함할 수 있고, 여기서 단문자 아미노산 코드에서, G는 글리신이고, P는 프롤린이다. 일 실시형태에서, 링커는 예를 들어, 문헌[Curtis et al. (1991; Proc Natl Acad Sci 88(13):5809-5813)]에 기술된 일련의 글리신 및 세린 잔기이다.
일 실시형태에서, 2종의 상보성 돌연변이체 소단위는 2종의 벡터로부터 발현되고, 여기서 제1 벡터는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하고, 여기서 제1 핵산은 선택 가능한 마커의 돌연변이체 소단위를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 제2 벡터는 제1 핵산에 의해서 암호화된 제1 폴리펩타이드와 회합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산을 포함하고, 여기서 제3 핵산은 선택 가능한 마커의 상보성 돌연변이체 소단위를 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다. 따라서, 두 벡터 모두는 세포 집단에 동시에 도입되고, 유전자내 상보성을 위한 선택이 적용된다.
또 다른 실시형태에서, 2종의 상보성 단편은 2종의 벡터로부터 발현되고, 여기서 제1 벡터는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하고, 여기서 제1 핵산은 선택 가능한 마커의 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 제2 벡터는 제1 핵산에 의해서 암호화된 제1 폴리펩타이드와 회합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산을 포함하고, 여기서 제3 핵산은 선택 가능한 마커의 상보성 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다. 따라서, 두 벡터 모두는 세포 집단에 동시에 도입되고, 유전자내 상보성을 위한 선택이 적용된다.
예를 들어, 항체를 발현하기 위한 2-벡터 시스템은 항체의 하나의 쇄를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터를 제조함으로써 작제되고, 여기서 제1 핵산은 mutGS-NT를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다. 제2 벡터는 항체의 다른 쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하고, 여기서 제3 핵산은 mutGS-CT를 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화한다. 대안적으로, 제1 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화한다.
또 다른 실시형태에서, 2종의 상보성 단편은 2종의 벡터로부터 발현되고, 여기서 제1 벡터는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하고, 여기서 제1 핵산은 선택 가능한 마커의 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 제2 벡터는 제1 핵산에 의해서 암호화된 제1 폴리펩타이드와 회합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산을 포함하고, 여기서 제3 핵산은 선택 가능한 마커의 상보성 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다. 따라서, 두 벡터 모두는 세포 집단에 동시에 도입되고, 유전자내 상보성을 위한 선택이 적용된다.
이러한 예에서, 항체를 발현하기 위한 2-벡터 시스템은 항체의 하나의 쇄를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터를 제조함으로써 작제되고, 여기서 제1 핵산은 N-말단 글루타민 합성효소 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다. 제2 벡터는 항체의 다른 쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하고, 여기서 제3 핵산은 C-말단 글루타민 합성효소 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화한다. 대안적으로, 제1 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하고, 제3 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화한다.
추가적인 실시형태는 mutGS 소단위 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 허용하는 하나 이상의 IRES의 사용을 포함한다. "IRES"는 본 발명의 문맥에서 내부 부위(즉, mRNA의 5' 단부가 아닌 부위)로부터 mRNA의 번역의 개시를 용이하게 하는 내부 리보솜 유입 부위를 의미한다.
적합한 IRES의 일례는 문헌[Jang and Wimmer Genes &Development 4 1560 (1990) 및 Jang, Davies, Kaufman and Wimmer J. Vir. 63 1651 (1989)]에 기술된 바와 같은, 뇌심근염 바이러스(ECMV)의 IRES이다. EMCV의 잔기 335-848은 적합한 IRES를 형성하고; ECMV IRES의 다른 변이체 또는 부분은 공지되어 있고, 본 발명에서 사용하기에 적합할 것이다. IRES의 적합한 부분 또는 변이체는 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)의 충분한 번역을 부여할 것이다.
추가로, IRES의 3' 단부를 번역의 효율성을 감소시키도록 변경(또는 돌연변이)시킴으로써, 선택 및/또는 증폭 방법을 향상시키기 위한 수단을 제공할 수 있다. 예를 들어, IRES의 효율성은 효율적인 선택 및 증폭을 가능하게 하는 것으로서 이미 밝혀진 서열을 사용함으로써 감소될 수 있다(Aldrich et al., Biotechnol Prog 19, 1433; 2003). 대안적인 서열은 공지되어 있거나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 결정될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 선택 가능한 마커 및 헤테로머 복합체의 폴리펩타이드에 더하여, 상이한 기능적인 선택 가능한 마커를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서, "상이한 기능적인 선택 가능한 마커"는 유전자내 상보성일 수 있는 선택 가능한 마커의 돌연변이체 소단위가 아니라, 상이한 선택 가능한 활성도를 갖는 단백질이다. 널리 공지된 마커, 예컨대, 제오마이신, 네오마이신, 퓨로마이신, 블라스티시딘 S, 또는 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 GPT 등이 상이한 기능적인 선택 가능한 마커로서 사용될 수 있다. 추가로, 유전자내 상보성일 수 있는 상이한 선택 가능한 마커의 상보성 돌연변이체가 또한 사용될 수 있다.
이러한 실시형태에서, 본 발명은 2종의 벡터를 포함하는데, 여기서 벡터 각각은 선택 가능한 마커의 적어도 1종의 돌연변이체 소단위를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 헤테로머 복합체를 형성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산, 뿐만 아니라 또한 상이한 기능적인 선택 가능한 마커를 암호화하는 핵산을 포함한다. 추가로, 각각의 벡터의 제1 핵산에 암호화된 각각의 폴리펩타이드는 회합하여 복합체를 형성할 수 있고, 각각의 벡터의 제2 핵산에 의해서 암호화된 소단위 또는 소단위들은 회합하여 선택 가능한 활성도를 제공할 수 있고, 제3 핵산에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 제2 핵산에 의해서 암호화된 소단위의 선택 가능한 활성도와 상이한 선택 가능한 활성도를 제공한다.
예를 들어, 제1 벡터는 네오마이신에 대한 내성을 암호화할 수 있고, 제2 벡터는 제오마이신에 대한 내성을 암호화할 수 있거나 또는 단지 하나의 벡터가 추가적인 상이한 기능적인 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 따라서, 하나의 벡터가 세포주 내에 형질주입되고, 선택이 적용된다(즉, 약물 G418이 네오마이신 내성 세포에 첨가된다). 선택 후, 종래의 방법을 사용하여 예를 들어, PCR, 써던 블롯(Southern blot), ELISA, 웨스턴 블롯(western blot) 등에 의해서 벡터의 존재 및 벡터에 대해서 핵산에 의해서 암호화된 폴리펩타이드의 발현 수준을 결정할 수 있다. 높은 수준 발현이 수득된 후, 제2 벡터를 세포주 내에 형질주입한다. 제1 벡터에 대한 선택을 유지시키면서, 선택을 제2 선택 가능한 마커(즉, 제오마이신 내성)에 대해서 적용하고, 제2 벡터 및 각각의 벡터 암호화된 단백질의 발현을 평가한다. 이러한 실시형태에서, 두 벡터 모두가 존재하는 것으로 결정된 후, 선택이 세포에서 회합된 소단위의 발현에 대해서 적용되어 본 명세서에 기술된 바와 같은 선택 가능한 활성도를 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 독립적인 선택 가능한 활성도를 암호화하는 본 발명의 핵산 둘 모두를 동시에 형질도입하고, 선택을 동시에 적용한다. 두 벡터 모두가 존재하는 것으로 결정된 후, 선택이 세포에서 회합된 소단위의 발현에 대해서 적용되어 상기에 기술된 바와 같은 선택 가능한 활성도를 제공한다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 독립적인 선택 가능한 활성도를 암호화하는 본 발명의 벡터를 각각 별개의 세포주에 형질주입한다. 선택을 적용하고, 각각의 목적하는 벡터에 의해서 암호화된 단백질의 높은 수준을 발현하는 클론을 식별한 후, 세포를 호리(Hori) 등의 문헌(미국 특허 제5,916,771호)에 기술된 바와 같이 융합시킨다. 융합이 완결된 후, 소단위에 의해서 제공된 선택 가능한 활성도에 대해서 선택을 적용한다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 독립적인 선택 가능한 활성도를 임의로 함유하지 않는 본 발명의 핵산을 제3 벡터와 동시에 형질주입한다. 제3 벡터는 별개의 선택 가능한 활성도, 예컨대, 예를 들어, 성공적으로 형질주입된 세포의 예비 선택을 가능하게 할 수 있는 네오마이신 내성 또는 베타 갈락토시다제를 암호화한다. 이러한 예비 선택을 수행한 후, 선택을 돌연변이체 소단위의 선택 가능한 활성도에 대해서 적용할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 동일한 양의 2종의 발현 벡터를 형질주입시킨 반면, 제3 벡터를 제1의 2종의 벡터의 농도의 1/3로 형질주입시킨다(예를 들어, 3:3:1 또는 6:6:1 등). 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이러한 비의 변동이 본 발명의 범주 내인 것을 인식할 것이다.
목적하는 헤테로머 복합체의 구성성분을 암호화하는 핵산은 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해서 cDNA 또는 게놈 DNA로서 수득될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 구성성분을 암호화하는 메신저 RNA는 RNA 단리의 표준 기술을 사용하여 그리고 폴리-A mRNA를 격리하기 위한 올리고-dT 셀룰로스 크로마토그래피를 사용하여 적합한 기원으로부터 단리될 수 있다. 발현될 헤테로머 복합체가 항체인 경우, 목적하는 핵산의 적합한 기원은 성숙 B 세포 또는 하이브리도마 배양물로부터 단리될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하기 위한 핵산은 화학적 합성에 의해서 수득될 수 있다.
헤테로머 복합체의 목적하는 구성성분을 암호화하는 핵산에 더하여, 벡터 작제물은 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에서의 복제, 작제물의 진핵세포 염색체 내로의 통합을 용이하기 하기 위한 추가적인 구성성분 및 작제물을 함유하는 세포에 대한 선택 및/또는 스크리닝을 보조하기 위한 마커를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드, 파지, 파스미드, 코스미드, 바이러스, 레트로바이러스 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 재조합 DNA 벡터이며, 이것은 목적하는 핵산을 세포 내에 삽입한다.
핵산이 다른 핵산과 기능적 관계에 위치할 때 그것은 "작동 가능하게 연결"된다. 보다 구체적으로, 작동 가능하게 연결된은, 상이한 폴리펩타이드를 암호화하는 2종의 상이한 핵산이 동시에 유도된 전사를 갖는 것을 의미한다. 작동 가능하게 연결된은 또한 연결된 핵산이 단일 전사 단위 내에서 인접할 수 있지만, 번역은 하나 이상의 리보솜 개시 부위(예를 들어, 내부 리보솜 유입 부위)로부터 안내되는 것을 의미한다. 2종의 상이한 폴리펩타이드를 암호화하는 작동 가능하게 연결된 전사 단위는 "바이시스트로닉 전사물"이라 지칭된다.
본 발명의 방법은 또한 재조합 단백질의 생산을 유도하는 공지된 방법 또는 아직 발견되지 않은 방법과 조합하여 사용될 수 있다. "유도 조건"이라는 것은 목적하는 재조합 단백질의 세포당 상대적인 생산을 증가시키는 기술을 의미한다. 이러한 기술은 예를 들면 저온 이동, 및 화학물질의 첨가 및 임의의 공지된 기술 또는 아직 발견되지 않은 기술의 조합, 뿐만 아니라 아직 기술되지 않은 유도 기술 및/또는 아직 발견되지 않은 임의의 것을 포함한다. 전형적으로, 고밀도의 세포의 회분식 또는 관류 배양을 유도하여 재조합 단백질을 생산한다. 종종, 세포의 에너지의 대부분이 재조합 단백질 생산을 지시하도록 다른 세포 공정(예컨대, 성장 및 분열)이 저해된다.
소단위를 갖는 임의의 선택 가능한 마커가 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 선택 가능한 마커를 지칭하는 경우 용어 "소단위"는 선택 가능한 마커의 일부를 지칭한다. 추가로, 선택 가능한 마커의 제1 돌연변이체 소단위(본 명세서에서 "초기 돌연변이체 소단위"라 지칭됨)는 동일한 선택 가능한 마커의 제2 상보성 돌연변이체 소단위(본 명세서에서 "상보성 돌연변이체 소단위"라 지칭됨)와 함께 발현되어 돌연변이체 소단위 단독 중 어느 것에도 존재하지 않는 선택 가능한 활성도의 수준을 제공할 수 있다. 또한, 소단위는 또한 선택 가능한 마커의 상이한 소단위인 또 다른 돌연변이된 폴리펩타이드에 의해서 상보적인 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다.
동물 세포에 보통 독성인 특정 약물에 대한 내성을 부여하는 선택 가능한 마커가 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기는 내성 선택 가능한 마커의 비제한적인 예이다: 제오마이신(zeo); 퓨로마이신(PAC); 블라스티시딘 S(BlaS), 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 GPT(Mulligan & Berg (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 내성 유전자(Colberre-Garapin et al. (1981), J. Mol. Biol. 150:1); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로(hygro)(Santerre et al. (1984), Gene 30:147).
규정된 조건 하에서 세포 생존을 부여하거나 또는 세포사를 유도하는 대사 효소가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 예는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않으며: 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR); 단순 포진 바이러스 티미딘 카이나제(TK)(Wigler et al. (1977), Cell 11:223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT)(Szybalska & Szybalski (1962), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT)(Lowy et al. (1980), Cell 22:817), 이것은 각각 TK, HGPRT 또는 APRT가 결핍된 세포에서 사용될 수 있는 유전자이다.
일 실시형태에서, 글루타민 합성효소(GS)는 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용되는 선택 가능한 마커이다. GS는 하나의 소단위로부터의 N-말단 잔기 및 인접한 소단위로부터의 C-말단 잔기에 의해서 형성된 10개의 활성 부위를 갖는 동일한 소단위의 2개의 적층된 오량체 고리를 포함한다. N-말단(mutGS-NT) 및 C-말단(mutGS-CT) 돌연변이체 작제물을 제조하고, 상보성에 대해서 평가한다. mutGS-NT 및 mutGS-CT 중 어느 것도 글루타민 결핍 배지 중에서 세포 성장을 허용하지 않을 것이지만, GS 돌연변이체 세포가 두 작제물 모두로 형질주입된 경우, 유사한 수준으로 두 작제물 모두로 형질주입된 이들 세포는 글루타민 결핍 배지 중에서 생존한다. 2종의 이러한 돌연변이체로의 공동 형질주입이 일어난 경우, 돌연변이체는 "상보성"이라 지칭된다. 대안적으로, 내인성 GS를 발현하는 세포가 사용될 수 있고, 형질주입체는 메티오닌 설폭시민(MSX)의 독성 수준에 대해서 증가된 내성을 부여함으로써 선택될 수 있다.
색상 선택을 기반으로 하는 선택 가능한 마커가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 특정 예에서, 베타-갈락토시다제가 사용될 수 있다(Blau et al., WO 98/44350). 형광 마커가 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있고, 예를 들어, GFP가 단백질-단편 상보성 검정으로 단백질 상호작용을 측정하기 위해서 선택의 클론성 선택을 위해서 사용되어 왔다(Remy and Michnick (1999), Proc. Natl. Acad. Sci., 96:5394-5399). 유사하게 플루오레세인-접합된 메토트렉세이트를 사용하여 상보성 DHFR 단편을 발현하는 세포를 검출할 수 있다(Remy and Michnick (2001), Proc. Natl. Acad. Sci., 98:7678-83). 형광성 마커에 대한 이점은 이러한 선택이 임의의 동물 세포 유형에서 행해질 수 있고, 대사 경로에서 결핍을 갖는 것에 제한되지 않거나 예를 들어, 네오마이신에 대한 약물 민감성을 요구하지 않는다는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 번역 가공 전 및 후를 비롯한 자연 발생 또는 재조합 방식으로 발현된 단백질, 또는 이의 단편을 포함하는데, 이것은 전형적으로 2차 구조를 보유한다. 단백질은 큰 분자량(작은 것[50 내지 100개 아미노산을 갖는 것]의 경우 약 10,000 내지 특정 형태의 경우 1,000,000 초과)을 갖는 큰 분자이고; 이것은 다양한 양의 동일한 20종의 아미노산으로 구성되고, 이것은 무손상 단백질에서 펩타이드 결합이라고 불리는 공유 화학 링키지를 통해서 통합된다. 함께 연결된 아미노산은 폴리펩타이드 쇄라 불리는 선형의 비분지형 중합체 구조를 형성하고; 이러한 쇄는 수 백개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있고; 이것은 단백질의 주어진 종에 대해서 특이적인 순서로 배열된다. 용어 "펩타이드"는 전형적으로 20개 미만의 아미노산 길이의 폴리펩타이드 또는 단백질의 짧은 단편을 포함한다.
용어 "세포 배양"은 다세포 유기체 또는 조직 밖의 세포 성장 및 증식을 포함하는 것을 의미한다. 전형적으로, 세포 배양은 멸균의 제어된 온도 및 대기 조건 하에서 조직 배양 플레이트(예를 들어, 10-㎝ 플레이트, 96웰 플레이트 등), 또는 다른 접착성 배양물(예를 들어, 마이크로담체 비드 상에서) 또는 현탁 배양물, 예컨대, 롤러 병에서 수행된다. 배양물을 진탕 플라스크, 소규모 생물반응기, 및/또는 대규모 생물반응기에서 성장시킬 수 있다. 생물반응기는 환경 조건, 예컨대, 온도, 분위기, 교반 및/또는 pH가 모니터링되고, 조정될 수 있는 세포를 배양하는 데 사용되는 장치이다. 다수의 회사(예를 들어, ABS 인크.(ABS Inc.), 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재); 셀 트렌즈, 인크.(Cell Trends, Inc.), 미국 매릴랜드주 미들타운 소재)뿐만 아니라 대학교 및/또는 정부-지원 기관(예를 들어, 더 셀 컬쳐 센터(The Cell Culture Center), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)이 계약 기반으로 세포 배양 서비스를 제공한다.
배양물이 선택 가능한 활성도를 선택하는 작용제와 접촉되는 최적의 기간은 1회의 정상 성장 사이클(예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 여기서 1회 성장 사이클은 대략 20 내지 22시간인 것으로 보고되어 있음(Rasmussen et al. (1998), Cytotechnology, 28:31-42))에 대한 전형적인 기간보다 더 길다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 배양물은 바람직하게는 적어도 약 1일, 보다 바람직하게는 적어도 약 3일, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 약 7일 동안 선택 가능한 조건, 예를 들어, 약물, 대사산물, 또는 색상 물질을 포함한다.
배양물에서 성장에 적합한 매우 다양한 동물 세포주는 예를 들어, 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC, 미국 버지니아주 매너서스 소재) 및 NRRL(미국 일리노이주 피오리아 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 산업 또는 대학교 실험실에서 전형적으로 사용되는 보다 확립된 세포주 중 일부는 예를 들어, CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, CV1, MDCK, 293, 3T3, PC12, 골수종(예를 들어, NSO), 및 WI38 세포주를 포함한다. 다른 실시형태에서, 비-동물 세포주, 예를 들어, 식물 세포주, 곤충 세포주(예를 들어, sf9), 효모 세포 또는 박테리아 세포, 예컨대, 이. 콜라이가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, GS-결핍 CHO 세포, 예컨대, CHOZN(등록상표) GS-/- ZFN-변형 CHO 세포(시그마 알드리치 파인 케미컬즈(Sigma Aldrich Fine Chemicals), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)가 사용된다. GS-결핍 CHO 세포(또는 다른 포유동물 세포)는 또한 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가로, CHO 세포는 접착 또는 현탁 배양물로서 다루기에 용이하고, 비교적 양호한 유전 안정성을 나타낸다. 또한, 새로운 동물 세포주가 (예를 들어, 형질전환, 바이러스 감염 및/또는 선택에 의해서) 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 널리 공지된 방법을 사용하여 확립될 수 있다.
상기에 주목된 바와 같이, 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 헤테로머 복합체를 발현할 수 있다. 헤테로머 복합체가 가용성인 경우, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 배양물로부터, 즉 헤테로머 복합체가 분비되지 않은 경우에는 숙주 세포로부터, 그리고 헤테로머 복합체가 세포에 의해서 분비된 경우에는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 그러나, 발현 시스템은 또한 세포막에 고정된 헤테로머 복합체를 발현하는 조작된 숙주 세포를 포함한다.
이러한 발현 시스템으로부터의 헤테로머 복합체의 정제 또는 농축은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 적절한 세정제 및 지질 마이셀 및 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 그러나, 헤테로머 복합체의 구조적 특징 및 기능적 특징을 보유할 뿐만 아니라 예를 들어, 약물 스크리닝 검정에서 생물학적 활성도를 평가하는 것이 중요한 경우에는 이러한 조작된 숙주 세포 자체가 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 발현된 단백질을 수집할 수 있다. 또한, 단백질을 공지된 공정을 사용하여 이러한 배양물 또는 구성성분으로부터(예를 들어, 배양 배지 또는 세포 추출물 또는 체액으로부터) 정제 또는 부분적으로 정제할 수 있다. 구 "부분적으로 정제된"은 일부 분별 절차 또는 절차들이 수행되었지만, 목적하는 단백질보다 더 많은 폴리펩타이드 종(적어도 10%)이 존재함을 의미한다. "정제된"은 단백질이 본질적으로 균질한, 즉 1% 미만의 오염 단백질이 존재함을 의미한다. 분별 절차는 여과, 원심분리, 침전, 상 분리, 친화도 정제, 젤 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC; 수지, 예컨대, 페닐 에터, 부틸 에터 또는 프로필 에터 사용), HPLC, 상기의 일부 조합 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 단백질을 추가로 제형화하는 단계를 임의로 포함한다. 용어 "제형화"는 단백질이 최종 사용자를 위해서 완충제 교환, 멸균, 벌크 패키징 및/또는 패키징될 수 있음을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "멸균 벌크 형태"는 미생물 오염물이 (식품 및/또는 약물 목적을 위해서 허용 가능한 바와 같은 그러한 정도까지) 존재하지 않거나 본질적으로 존재하지 않고, 정의된 조성 및 농도를 갖는 것을 의미한다.
용어 "멸균 단위 투여 형태"는 소비자 및/또는 환자 투여 또는 소모에 적절한 형태를 의미한다. 이러한 조성물은 다른 구성성분, 예컨대, 생리학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 조합하여, 유효량의 단백질을 포함할 수 있다. 용어 "생리학적으로 허용 가능한"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성도의 효과를 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다.
본 발명의 경우, 포유동물 GS 단백질의 N-말단 내에서의 변화를 암호화하는 불활성화 돌연변이(mutGS-NT)의 세트뿐만 아니라 단백질의 C-말단에서의 변화를 암호화하는 불활성화 돌연변이(mutGS-CT)의 세트를 개발하였다. GS 촉매작용 부위를, 돌연변이가 개별적으로 그리고 조합하여, 글루타메이트, ATP, 및/또는 암모니아의 결합에 관여된 진화론적으로-보존된 알라닌 잔기 모두에 대해서 만들어진, 알라닌 스캔에 적용하였다. 잔기 대부분은 GS 효소의 공개된 X-선 결정학 및 생화학적 연구로부터의 증거를 기반으로 선택되었지만, 활성 부위 내의 기질/리간드/금속의 4.5Å 이내의 잔기는 잠재적인 후보물질로서 평가되었다. N-말단 및 C-말단의 촉매작용적으로-손상되지만, 구조적으로-무손상인 GS 돌연변이체의 조합물을 식별하였고, 공동 발현되는 경우 일부 GS 활성도를 회복시키는 서로 상보적인 능력에 대해서 평가하였다.
항체의 하나의 쇄의 발현을 mutGS-NT 또는 N-말단 GS 단편과 연결하고, 또 다른 것을 mutGS-CT 또는 C-말단 GS 단편과 연결함으로써 2-벡터 시스템을 작제하였다. mutGS-NT 또는 N-말단 GS 단편의 발현을 가능하게 하는 IRES를 갖는 단일 mRNA 상에서 항체 중쇄(HC)의 발현을 유도하는 프로모터/인핸서를 갖는 하나의 발현 박터를 작제하였다. 별개로, LC의 발현을 유도하는 프로모터/인핸서 및 mutGS-CT 또는 C-말단 GS 단편의 발현을 가능하게 하는 IRES를 사용하여 벡터를 작제함으로써 항체의 경쇄(LC)의 발현을 mutGS-CT 또는 C-말단 GS 단편에 연결하였다. mutGS-NT 및 mutGS-CT, N-말단 또는 C-말단 GS 단편 그 자체 모두는 글루타민 결핍 배지 중에서의 세포 성장을 허용하지 않았다. 그러나, GS 돌연변이체 세포가 두 작제물 모두로 형질주입된 경우, 유사한 수준으로 두 작제물 모두로 형질주입된 이들 세포는 글루타민 결핍 배지 중에서 생존이 허용되었다. 이들 세포는 또한 관심 항체에 대해서 유사한 양의 LC 및 HC를 생산하였다. 선택의 엄격성은 IRES의 효율을 감소시켜, mutGS 선택 가능한 마커의 감소된 번역을 생성시킴으로써, 또는 잠재적으로 GS 저해제, L-메티오닌 설폭스이민(MSX)을 첨가함으로써 추가로 증가될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 개개 양상의 단일 예시로서 의도되는 본 명세서에 기재된 특정 실시형태, 및 본 발명의 범주 내의 기능적으로 동등한 방법 및 성분에 의해 범주가 제한되지 않는다. 사실, 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명 및 수반하는 도면으로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 유전자내 상보성에서 유용할 가능성이 있다고 식별된 뮤린 글루타민 합성효소(GS) 돌연변이체의 선택 및 제조를 기술한다. 뮤린 GS의 4개의 N-말단 잔기(W60, N61, D63 및 S66) 및 11개의 C-말단 잔기(E134, E136, E196, E203, N248, H253, N255, R319, R324, E338 및 R340)를 알라닌 돌연변이 스캔에서의 평가를 위해서 선택하였다. 개별 및 조합 돌연변이체 작제물을 pcDNA3.3 벡터(네오마이신 내성, 인비트로젠 그랜드 아일랜드(Invitrogen Grand Island), 미국 뉴욕주 소재)에서 생성시켜, 총 9종의 N-말단 돌연변이체 작제물 및 16종의 C-말단 돌연변이체 작제물을 생성하였다.
돌연변이체 작제물을 CHO-K1 세포주에서 무손상 GS 단백질의 발현에 대해서 평가하였다. 세포를 36℃, 5% CO2, 70% 상대 습도에서 배기되는 진탕 플라스크 내에서 글루타민을 함유한는 비선택성의 화학적으로 정의된 성장 배지 중에서 배양하고, 가습 인큐베이터에서 150 내지 160rpm으로 진탕하였다. 생존 세포 밀도(VCD) 및 생존도를 비셀(ViCell) 자동 세포 계수기(베크만-쿨터, 인크.(Beckman-Coulter, Inc.), 미국 캘리포니아주 브레아 소재)를 사용하여 측정하였다. 3 내지 4일마다 희석에 의해서 배양물을 계대시켰다.
조건당 1백만개의 세포를 전기천공법에 의해서 10마이크로그램의 선형 DNA로 형질주입시켰다(생물학적 삼중물). DNA를 제조사의 권고에 따라서 PvuI-HF 제한 효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)로 밤새 37℃에서 선형화시켰다. 아가로스 젤 전기영동법을 사용하여 각각의 플라스미드의 완전한 선형화를 확인하였다. 제한 소화 후, 10% 반응 부피의 3M 아세트산나트륨 및 200% 반응 부피의 100% 에탄올을 각각의 소화물에 첨가함으로써 DNA를 밤새 -70℃에서 침전시켰다. 에탄올 침전 후, DNA를 펠릿화시키고, 펠릿을 70% 에탄올로 1회 세척하고, 공기 건조시키고, HEPES-완충 염수 중에 재현탁시켰다. DNA 농도를 나노드롭(NanoDrop) 2000(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 델라웨어주 윌밍톤 소재) 상에서 측정하고, HEPES-완충 염수를 사용하여 1마이크로그램/마이크로리터로 조정하였다.
유전자내 상보성 시험을 위해서, 10마이크로그램의 순수한 연어 정자 DNA(인비트로젠)와 함께 2종의 플라스미드 각각 5마이크로그램을 사용하였다. 3일 성장 배양물로부터 조건당 1백만개의 세포를 스피닝시키고, 세포를 150마이크로리터 HEPES-완충 염수 중에 재현탁시키고, 총 10마이크로그램의 플라스미드 DNA(플라스미드 각각 5마이크로그램 및 10마이크로그램)를 첨가하고, 혼합물을 96-웰 전기천공법 플레이트(바이오-라드 래보러토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)로 옮김으로써 형질주입을 설정하였다.
전기천공법을 젠 펄서(Gene Pulser) Mxcell(상표명)(바이오-라드 래보러토리즈, 인크., 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)를 사용하여 하기 설정으로 96-웰 플레이트에서 수행하였다: 지수 파장, 전압 = 290V, 커패시턴스= 950microF, 저항 = 950옴. 전기천공법 이후에, 세포를 배기되는 24 딥-웰 플레이트(24DWP) 내의 2㎖/웰의 미리 가온된 비선택성 성장 배지로 옮기고, 가습 퀴너(Kuehner) 인큐베이터(퀴너 아게(Kuehner AG), 스위스 바젤 소재) 내에서 220rpm에서 진탕하였다.
형질주입 3일 후, 세포를 계수하고, 1 x 106개의 생존 세포/㎖로 선택성 배지(글루타민이 결여된 화학적으로-정의된 성장 배지) 중으로 옮겼다. 90% 초과의 배양물 생존도가 회복될 때까지 3 내지 4일마다 선택성 배지 중에서의 세포의 연속 계대에 의해서 안정적인 풀을 생성시켰다. 시약(작업 농도(PBS 중의 1:50 희석물)에서 비아카운트(ViaCount) FLEX 시약(EMD 밀리포어(EMD Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재) 중의 배양물의 1:10 희석물) 중에서 세포를 15분 인큐베이션시킨 후, 비아카운트 검정 모듈을 사용하여 세포 계수를 구아바 이지사이트(Guava EasyCyte)(상표명) HT 유세포 분석기(EMD 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재) 상에서 수행하였다.
모든 풀은 기능 검정에서 시험하기 전에 적어도 90% 생존도로 회수되는 것이 가능하였다. 풀 생성 이후에, 삼중 풀의 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 각각의 작제물에 대한 GS 단백질 과발현의 수준을 설정하고, 임의의 돌연변이가 무손상 GS 단백질의 생산을 방해하였는지를 결정하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해서, 3 x 106개 세포를 EDTA-무함유 홀트 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(EDTA-free Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail)(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 일리노이주 락포드 소재)이 보충된 RIPA 완충제(써모 사이언티픽 피어스(Thermo Scientific Pierce), 미국 일리노이주 락포드 소재) 100마이크로리터 중에 30분 동안 얼음 상에서 용해시켰다. 용해물을 13,000rpm에서의 원심분리에 의해서 투명하게 하고, 4x 로딩 완충제(인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)를 첨가하고, 샘플을 95℃에서 5분 동안 비등시켰다. 각각의 샘플 15㎕를 E-페이지(Page) 48 젤(인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 상에서 유동시키고, iBlot(인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)를 사용하여 PVDF 막으로 옮겼다. 각각의 막을 1:500 마우스 항-글루타민 합성효소 항체(Cat # 610518, 비디 바이오사시언시스(BD biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)로 밤새 4℃에서 프로빙시키고, 그 다음 1:2,000 항-마우스 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 680 2차 항체(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)와 함께 인큐베이션시켰다. 블롯을 오디세이 인프라레드 이미징 시스템(Odyssey Infrared Imaging System)(LI-COR, 미국 네브라스카주 링컨 소재) 상에서 스캔하고, 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.
Figure 112021126232542-pat00001
초기 분석은 돌연변이에 대한 후보 잔기로서 아미노산 잔기 E388 및 R340을 나타내었지만, E388A 및 R340A GS 돌연변이체(단일 돌연변이로서 또는 다른 돌연변이와의 조합물로)의 과발현은 무손상 GS 단백질을 생성시키지 않았다. 따라서, 이러한 돌연변이를 함유하는 작제물을 추가로 고려하지 않았다.
안정적인 돌연변이체 GS 풀을 야생형 CHO-K1 모체 세포주 중에서 생성시켰는데, 이것은 기능적 GS 효소를 갖기 때문에, 글루타민이 결여되고, 25microM의 GS 저해제, L-메티오닌 설폭시민(MSX)이 보충된 선택성 배지 중에서 성장/생존 스크린을 사용하여 돌연변이체 활성도 평가를 수행하였다. 야생형 CHO-K1 세포는 선택성 배지 중에서 4계대 이후에 사멸하였다. 특정 N-말단 돌연변이 및 C-말단 돌연변이가 선택성 배지 중에서 배양물 성장을 예방하였지만, 심지어는 성장-손상된 풀이 상대적으로 높은 생존도를 보유하였다.
개별 GS N-말단 돌연변이체로 형질주입된 세포는 야생형 작제물과 유사하게 성장하였고, 따라서 이러한 작제물을 추가로 시험하지 않았다. 그러나, 2종의 N-말단 다중 돌연변이체 작제물, W60A N61A D63A(mutGS-NT1; 서열번호 6) 및 W60A N61A D63A S66A(mutGS-NT2; 서열번호 10)은 높은 수준의 과발현된 GS 단백질을 생성시켰고, 기능성 검정에서 빈 벡터 음성 대조군과 가장 유사하게 기능하였고, 이를 추가 분석을 위해서 선택하였다. 또한, 상보성 효과의 엄격성을 증가시키기 위한 노력으로 2종의 다른 N-말단 돌연변이체 작제물, W60A N61A D63A S66A D76A(mutGS-NT3; 서열번호 25), 및 W60A N61A D63R S66A(mutGS-NT4; 서열번호 19)를 제조하였고, 이를 평가하였다. 후자 작제물에서, 아스파테이트-63을 알라닌 대신에 아르기닌으로 돌연변이시켰는데, 그 이유는 아나베나 아졸라에(Anabena azollae)에서의 유사한 돌연변이체가 생합성 활성도를 완전히 제거하고, 야생형과 동일하게 발현된 반면, 알라닌에 대한 돌연변이는 6.5%의 생합성 활성도를 보유하였기 때문이었다(Eur. J. Biochem. 266, 1202 (1999) Crespo et al.).
몇몇 단일 C-말단 돌연변이체 작제물이 기능성 평가를 통과하였지만, 다중 돌연변이, E134A E136A E196A E203A(mutGS-CT1; 서열번호 21) 및 N248A H253A N255A(mutGS-CT2; 서열번호 22)를 함유하는 2종의 작제물을 추가 분석을 위해서 선택하였다.
실시예 2
본 실시예는 재조합 이종이량체 단백질, 즉, 단클론성 항체(mAb)의 발현에 대한 GS에서의 돌연변이의 효과를 기술한다. 실시예 1에 기술된 선택된 N-말단 돌연변이체 및 C-말단 돌연변이체를 mAb 발현 벡터 내로 클로닝하여 2-벡터 시스템의 다중 조합물을 작제하였는데, 여기서 경쇄(LC)의 발현은 IRES를 통해서 mutGS-CT에 연결되고, 중쇄(HC)는 mutGS-NT에 연결된다. CHO-K1 GS 넉 아웃 세포주를 제조사(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 지시에 따라서 CompoZr(등록상표) 넉아웃 ZFN 키트-CHO GS를 사용하여 작제하였다. CHO-K1 글루타민 합성효소 넉 아웃(CHO-K1 GS-KO) 세포주를 이미 기술된 바와 같이 배양하였다.
야생형 GS(양성 대조군) 또는 선택된 N-말단 돌연변이체 및 C-말단 돌연변이체 중 어느 하나에 연결된 mAb LC 또는 HC를 함유하는 벡터를 사용하여 삼중 CHO-K1 GS 넉아웃 형질주입을 수행하고, 글루타민 결핍 배지 중에서 배양하였다. 야생형 GS를 함유하는 초기 pcDNA3.3 벡터를 추가적인 양성 대조군으로 사용하였다. pcDNA3.3 야생형 GS 풀 및 mAb-연결된 야생형 GS 풀 둘 모두는 글루타민-무함유 배지 중에서 계대 20일까지 90% 초과의 생존도로 회수되었다. 이에 반해서, 모의물-형질주입된 풀 및 mAb-연결된 돌연변이체 GS 풀 모두는 글루타민-무함유 배지 중에서 17일 후에 사멸하였는데, 이는 선택된 돌연변이체가 기능적으로 손상된 GS 단백질 생성물을 생성한다는 것을 확인해 준다.
마지막으로, 선택된 N-말단 돌연변이체 및 C-말단 돌연변이체를 CHO-K1 GS 넉아웃 세포주에서 mAb-생산 풀의 생성을 위한 2-벡터 발현 시스템 내에서 GS 유전자내 상보성에 대해서 평가하였다. 이들 세포를 GS 서열 내의 제시된 돌연변이를 갖는 유전자내 상보성 벡터 A(LC:mutGS-CT) 및 B(HC:mutGS-NT)로 형질주입시켰다(하기 표 2에 나타냄). 모든 평가된 mutGS-CT/mutGS-NT 조합물은 글루타민-무함유 배지 중에서의 25일의 계대에 걸쳐서 대략 90% 생존도로 회수될 수 있었다. 2-벡터 LC:mutGS-CT/HC:mutGS-NT 풀은 야생형 GS를 함유하는 단일-벡터 양성 대조군보다 선택성 배지 중에서 회수되는 데 더 오랜 시간이 걸렸고, 더 큰 생존도 하락을 가졌다.
생성된 삼중의 안정적인 풀을 10-일 유가식 생산 검정을 사용하여 mAb 발현에 대해서 추가로 평가하였다. 24DWP(약 0.5 x 106개 생존 세포/㎖)로 화학적으로-정의된 생산 배지 중에 희석함으로써 1:5 분할로 4일 성장 배지로부터 생산 검정을 설정하였다. 배양물 성장 및 생존도를 구아바 비아카운트(Guava ViaCount) 검정(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 사용하여 3, 6, 8 및 10일에 모니터링하였다. 화학적으로-정의된 공급 배지를 사용하여 3, 6 및 8일에 볼러스(bolus) 공급을 수행하였다. 표색 폴리켐(PolyChem)(폴리메드코(Polymedco), 미국 뉴욕주 코틀랜드 매노 소재) 시약을 사용하여 공급일에 배지 글루코스 농도를 측정하고, 50% 글루코스 스톡 용액을 사용하여 12g/L로 조정하였다. POROS A/20 단백질 A 칼럼을 사용하는 친화도 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 10일 배양 상청액 상에서 생산 역가의 마지막을 결정하였다. IRES를 통해서 개별 GS 돌연변이체에 연결된 개별 mAb 쇄를 함유하는 GS 유전자내 상보성 2-벡터 시스템을 사용하여 생성된 모든 풀은 검출 가능한 수준의 항체를 생성하였고; 값을 하기 표 2(실시예 3)에 나타낸다.
실시예 3
본 실시예는 IRES GS 정션의 효율성을 감소시킴으로써 선택의 엄격성을 증가시킴으로써 형질주입된 풀에서 항체 역가를 증가시키는 방법을 기술한다. 초기 작제물에서의 서열은 GS의 개시 코돈에 융합된 ATG-12까지 야생형 EMCV 서열이다(Davies and Kaufman, J Virol 66, 1924; 1992). IRES의 효율성은 효율적인 선택 및 증폭을 가능하게 하는 것으로서 이미 밝혀진 서열을 사용함으로써 감소될 수 있다(Aldrich et al., Biotechnol Prog 19, 1433; 2003). 보다 효율적인 (ED3) 정션에서 정션의 DNA 서열을 하기 덜 효율적인 정션(317)의 DNA 서열과 비교한다. ED3 서열은 WT EMCV에서 발견된 ATG를 나타낸다. 마지막 ATG는 GS의 개시 코돈을 나타낸다.
Figure 112021126232542-pat00002
발현 벡터는 IRES 및 GS의 정션에서의 서열이 아닌 도 1에 나타낸 것과 동일하였다. 덜 효율적인 IRES-GS 정션을 갖는 두 플라스미드 모두로의 세포의 형질주입은 형질주입 이후에 더 낮은 생존도 및 더 긴 회수 시간을 초래하였다. 3개의 CT1-NT4 형질주입 중 2개 만이 회수되었고, 나머지 mutIRES 조합물 중 어느 것도 회수되지 않았다. 그러나, 회수된 이러한 mutIRES 조합물의 경우, 10-일 유가식 배양물은 하나의 풀의 경우 0.55그램/L를 생성하였고, 나머지 것의 경우 0.17g/L를 생성하였다. 이러한 풀의 구체적인 생산성은 각각 16p/c/d 및 6.9p/c/d였다. 0.55g/L 역가는 이전에 보고된 것을 초과하며, 이를 달성하기 위해서 FACS 분류가 필요하지 않다(Ye, J. et al. Biotechnol Prog 26, 1431; 2010).
Figure 112021126232542-pat00003
CT1-NT1-4 및 CT2-NT1-4 표지된 샘플 모두는 pED3 정션을 사용하였다(서열번호 24). mutIRES 표지된 샘플은 서열번호 23에 제시된 덜 효율적인 IRES를 갖는다.
실시예 4
본 실시예는 이들 배양물의 선택성을 증가시키기 위한 또 다른 전략을 기술한다. 형질주입을 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였지만, 더 높은 수준의 GS 발현을 선택하기 위해서 선택 동안 GS의 저해제, MSX를 배양물에 첨가하였다. 보다 효율적인(즉, 비-돌연변이체) IRES를 갖는 3개의 CT2-NT4 배양물 중 하나가 회수되었지만, CT1-NT4 중 어느 것도 회수되지 않았거나 또는 돌연변이체 IRES를 갖는 형질주입체 중 어느 하나가 회수되었다. 회수된 단일 배양물의 경우, 10-일 유가식 배양물은 9.18p/c/d의 특정 생산성으로, 0.29그램/L를 생성하였다(하기 표 2 참고).
실시예 5
본 실시예는 다수의 mut IRES CT1-NT4 형질주입으로부터의 결과를 기술한다. 이들 작제물은 서열번호 23에 제시된 덜 효율적인 IRES를 갖는다. mut IRES CT1-NT4를 함유하는 벡터를 사용하여 총 88종의 CHO-K1 GS 넉아웃 형질주입을 수행하였다. 88종의 형질주입 중 총 10종이 대략 25일 배양 후에 선택에 대해서 살아 남았고, 활발하게 성장하는 형질주입 풀을 생성하였고, 실시예 2에서 소수의 형질주입과 유사하게 거동하였다. 모의물-형질주입된 풀 GS 풀은 글루타민-무함유 배지 중에서 17일 후에 사멸하였다.
이중의 안정적인 풀을 10-일 유가식 생산 검정을 사용하여 mAb 발현에 대해서 추가로 평가하였다. 약 0.6 x 106개 생존 세포/㎖에서 24DWP로 화학적으로-정의된 생산 배지 중에 4일 성장 배양물 시드로부터 생산 검정을 설정하였다. 배양물 성장 및 생존도를 구아바 비아카운트 검정(밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 사용하여 3, 6, 8 및 10일에 모니터링하였다. 화학적으로-정의된 공급 배지를 사용하여 3, 6 및 8일에 볼러스 공급을 수행하였다. 표색 폴리켐(폴리메드코, 미국 뉴욕주 코틀랜드 매노 소재) 시약을 사용하여 공급일에 배지 글루코스 농도를 측정하고, 50% 글루코스 스톡 용액을 사용하여 12g/L로 조정하였다. POROS A/20 단백질 A 칼럼을 사용하는 친화도 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 10일 배양 상청액 상에서 생산 역가의 마지막을 결정하였다. IRES를 통해서 개별 GS 돌연변이체에 연결된 개별 mAb 쇄를 함유하는 GS 유전자내 상보성 2-벡터 시스템을 사용하여 생성된 모든 풀은 상대적으로 높은 수준의 항체를 생성하였고, 2개의 풀은 평균 1g/L를 초과하였고; 값을 하기 표 3에 나타낸다.
Figure 112021126232542-pat00004
실시예 6
본 실시예는 효소 글루타민 합성효소에 대한 분자 상보성 접근법을 기술한다. 글루타민 합성효소 효소를 2개의 독립적인 단편으로서 발현시켰고, 2개의 단편의 유전자 상보성에 의해서 효소 활성도를 완전히 재구성하였다. 다양한 잔기에서 글루타민 합성효소 효소를 분할시킨 일련의 작제물을 생성하였다. 이들 지점은 효수의 분자 구조로부터의 정보를 기반으로 하였다. 이들 작제물을 글루타민 합성효소 활성도가 결핍된 세포주를 구출하는 이들의 능력에 대해서 세포 기반 검정으로 시험하였다. 이러한 시험으로부터, 글루타민 합성효소 결핍 세포를 완전히 구출할 수 있는 몇몇 단편이 식별되었고, 따라서 이들 단편은 회합하여 완전 기능성 글루타민 합성효소 효소를 생성할 수 있음을 보여준다.
단백질 단편 상보성에 대한 이전 연구 중 다수는 기능성 단량체로서 존재하고, 이의 재조립이 설계된 단편을 단지 필요로 하는 단백질을 사용하여 왔다. 본 연구는, GS 단량체의 활성도 및 십량체의 기능성 효소 복합체의 후속 형성 둘 모두를 설명하기 위해서 분자 상보성을 사용하는 능력을 예증하였다. 단백질이 분할되게 할 수 있는 GS 단량체 내의 영역을 찾기 위해서 분자 모델링 접근법을 사용함으로써 상보성 단백질 단편을 식별하였다. GCN4 류신 지퍼(LZ) 및 가요성 링커를 또한 개별 단편에 첨가하여 재조립을 도왔다. 시험된 단편을 표 4에 나타내고, 이들 연구에서 사용된 뮤린 GS 단백질의 서열을 표 5에 나타낸다. GS 단편을 포유동물 발현 벡터 내에 클로닝하였고, GS 활성도가 결핍된 CHO 세포 내에 형질주입시켰다. 이들 세포는 글루타민이 보충된 세포 배양 배지에서 단지 정상적으로 생존할 수 있다. 배지로부터 글루타민을 제거함으로써 이들 세포를 구출하는 이들 작제물의 능력을 시험하였다.
Figure 112021126232542-pat00005
Figure 112021126232542-pat00006
Figure 112021126232542-pat00007
Y 104 E 110 S 125 N 126 E 264
도 2에 나타낸 바와 같이, 작제물 1, 2, 3 및 5는 글루타민 합성효소 결핍 세포를 성공적으로 구출할 수 있었다. 이는, 이들 단편이 생체내에서 완전히 기능성인 글루타민 합성효소 효소를 형성할 수 있음을 예증한다. 구출 결과의 요약을 표 6에 나타낸다. 대조군으로서, A 또는 B 단편 단독 중 임의의 것이 글루타민 합성효소 결핍 세포주를 구출할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, A 또는 B 단편 단독 중 어느 것도 글루타민 합성효소 결핍 세포주를 구출할 수 없었는데, 이는, 글루타민 합성효소 효소 활성도를 회복시키기 위해서 두 단편 모두가 필요함을 확인해 준다.
Figure 112021126232542-pat00008
이들 분자 상보성 작제물을 항체 경쇄 및 중쇄 유전자를 함유하는 발현 벡터와 관련하여 다음에 시험하여 세포주 발달 선택 시스템에서의 이의 활용을 평가하였다. 2종의 발현 벡터를 표 4에 나타낸 바와 같이 상보성 글루타민 합성효소 단편을 함유하도록 개작하였는데, 하나는 항체 경쇄 유전자를 함유하고, 두 번째 것은 항체 중쇄 유전자를 함유한다(도 4). IRES 서열을 또한 인 프레임 ATG의 돌연변이를 통해서 약화된 버전으로 대체하였다(BioTechniques 20:102-110 January 1996). 이것은 항체 유전자와 비교하여 발현될 글루타민 합성효소 단편의 수준을 추가로 감소시키고, 상당히 전사적으로 활성인 부위에서 게놈 통합에 대해서 편향될 선택성 압력의 수준을 달성하기 위해서 시스템의 선택 엄격성을 증가시키기 위함이었다. 본 연구로부터의 결과를 도 6에 나타낸다. 작제물 1, 2, 3 및 5를 이러한 검정으로 시험하였고, 또한 글루타민 합성효소 A 및 B 단편 각각에 두 배향 모두로 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자를 연결하였다. 작제물 2로부터의 글루타민 합성효소 단편을 함유하는 벡터는 글루타민 무함유 배지 중에서 선택에 살아남을 수 있었다.
작제물 2 선택된 풀로부터의 세포의 생산성을 10D 유가식 생산성 검정으로 평가하고, 전장 GS 효소를 발현하는 벡터를 사용하여 선택된 대조군 풀과 비교하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 작제물 2로부터의 세포는 높은 생산성을 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> 암젠 인크 <120> DIRECT SELECTION OF CELLS EXPRESSING HIGH LEVELS OF HETEROMERIC PROTEINS USING GLUTAMINE SYNTHETASE INTRAGENIC COMPLEMENTATION VECTORS <130> IPA181428-US-D1 <140> PCT/US2017/032139 <141> 2017-05-11 <150> US 62/334,966 <151> 2016-05-11 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 373 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ala Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Met 1 5 10 15 Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 Val Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 Cys Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu His 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Ile Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu 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Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Ile Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Lys Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Thr Gly 180 185 190 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 Cys Glu Gly Ile Arg Met Gly Asp His Leu Trp Ile Ala Arg Phe Ile 210 215 220 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr Ala Phe 245 250 255 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Cys Ile Glu Glu 260 265 270 Ala Ile Asp Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Gly 305 310 315 320 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Tyr Ala Val Thr 340 345 350 Glu Ala Ile Val Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 23 <211> 33 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 23 Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Ala Thr Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr 20 25 30 Gly <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Encephalomyocarditis virus <400> 24 Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys Ala 1 5 10 15 Cys Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly 20 <210> 25 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 25 Met Ala Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Met 1 5 10 15 Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 Val Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 Cys Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Ala Ala Phe Ala Gly 50 55 60 Ser Ala Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Ala Met Tyr Leu His 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Ile Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Lys Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Thr Gly 180 185 190 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 Cys Glu Gly Ile Arg Met Gly Asp His Leu Trp Ile Ala Arg Phe Ile 210 215 220 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Cys Ile Glu Glu 260 265 270 Ala Ile Asp Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Gly 305 310 315 320 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Tyr Ala Val Thr 340 345 350 Glu Ala Ile Val Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 26 <211> 47 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 26 Met Ser Asp Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Lys Val Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu 20 25 30 Val Gly Glu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 27 <211> 46 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Arg Met Lys 1 5 10 15 Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Val Tyr His Leu 20 25 30 Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 35 40 45 <210> 28 <211> 373 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Ala Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Met 1 5 10 15 Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 Val Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 Cys Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu His 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Ile Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Lys Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Thr Gly 180 185 190 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 Cys Glu Gly Ile Arg Met Gly Asp His Leu Trp Ile Ala Arg Phe Ile 210 215 220 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Cys Ile Glu Glu 260 265 270 Ala Ile Asp Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Gly 305 310 315 320 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Tyr Ala Val Thr 340 345 350 Glu Ala Ile Val Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 Phe Gln Tyr Lys Asn 370

Claims (23)

  1. 벡터로서,
    a) 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산, 및
    b) 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산으로서, 상기 제2 폴리펩타이드는 글루타민 합성효소의 N-말단 단편인, 제2 핵산을 포함하되,
    상기 제1 핵산의 전사는 상기 제2 핵산의 전사에 작동 가능하게 연결되고,
    추가로
    c) 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산으로서, 상기 제3 폴리펩타이드는 상기 제1 폴리펩타이드와 회합하여 헤테로머 복합체를 형성할 수 있는, 제3 핵산, 및
    d) 제4 폴리펩타이드를 암호화하는 제4 핵산으로서, 상기 제4 폴리펩타이드는 글루타민 합성효소의 C-말단 단편인, 제4 핵산을 포함하고,
    상기 제3 핵산의 전사는 상기 제4 핵산의 전사에 작동 가능하게 연결되고,
    상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 글루타민 합성효소의 C-말단 단편은 상호작용하여 선택 가능한 활성을 제공하고, 상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 C-말단 단편은 M1-E110 및 T111-N373; M1-Y104 및 N105-N373; M1-S125 및 N126-N373; 및 M1-E264 및 N265-N373으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    추가로 상기 벡터는 포유동물 세포에 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있는, 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헤테로머 복합체는 면역글로불린이고, 선택적으로 상기 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화하고, 그리고 상기 제3 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하는, 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)가,
    a) 상기 제1 핵산과 상기 제2 핵산 사이의 부위;
    b) 상기 제3 핵산과 상기 제4 핵산 사이의 부위, 및
    c) 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 부위, 및 제3 핵산과 제4 핵산 사이의 부위 둘 모두
    로 이루어진 군으로부터 선택된 부위에 존재하고;
    선택적으로 상기 내부 리보솜 유입 부위는 서열번호 23을 포함하는, 벡터.
  4. 제3항에 있어서, N-말단 류신 지퍼 또는 C-말단 류신 지퍼를 추가로 포함하는, 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 벡터로 형질주입(transfection), 형질전환 또는 형질도입된, 단리된 숙주 세포로서, 선택적으로 상기 세포가 골수종 세포주, CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 및 WI38 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  6. 헤테로머 복합체의 생산 방법으로서, 제5항의 숙주 세포를, 상기 헤테로머 복합체가 상기 숙주 세포에 의해서 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하며, 선택적으로 상기 헤테로머 복합체는 항체인, 헤테로머 복합체의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 헤테로머 복합체를 단리하는 단계를 더 포함하는, 헤테로머 복합체의 생산 방법.
  8. 발현 시스템으로서,
    a) 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물(bicistronic transcript)을 암호화하는 제1 벡터로서, 상기 제2 폴리펩타이드는 글루타민 합성효소의 N-말단 단편인, 제1 벡터, 및
    b) 제4 폴리펩타이드를 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제2 벡터로서, 상기 제4 폴리펩타이드는 상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 회합하여 선택 가능한 활성을 제공할 수 있는 글루타민 합성효소의 C-말단 단편인, 제2 벡터를 포함하고;
    상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 C-말단 단편은 M1-E110 및 T111-N373; M1-Y104 및 N105-N373; M1-S125 및 N126-N373; 및 M1-E264 및 N265-N373으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    추가로 상기 제3 폴리펩타이드는 상기 제1 폴리펩타이드와 회합하여 헤테로머 복합체를 형성할 수 있고,
    추가로 상기 발현 시스템은 포유동물 세포에 형질주입되어 상기 세포의 선택을 개선시킬 수 있는, 발현 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 상기 헤테로머 복합체는 면역글로불린이고, 선택적으로 상기 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 암호화하고, 그리고 상기 제3 핵산은 면역글로불린 경쇄를 암호화하는, 발현 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 내부 리보솜 유입 부위(IRES)가
    a) 상기 제1 핵산과 상기 제2 핵산 사이의 부위;
    b) 상기 제3 핵산과 상기 제4 핵산 사이의 부위, 및
    c) 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 부위, 및 제3 핵산과 제4 핵산 사이의 부위 둘 모두
    로 이루어진 군으로부터 선택된 부위에 존재하고;
    선택적으로 상기 내부 리보솜 유입 부위는 서열번호 23을 포함하는, 발현 시스템.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 발현 시스템으로 형질주입, 형질전환 또는 형질도입된, 단리된 숙주 세포로서, 선택적으로 상기 세포는 골수종 세포주, CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 및 WI38 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  12. 헤테로머 복합체의 생산 방법으로서, 제11항의 숙주 세포를, 상기 헤테로머 복합체가 상기 숙주 세포에 의해서 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 헤테로머 복합체의 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 헤테로머 복합체를 단리하는 단계를 더 포함하는, 헤테로머 복합체의 생산 방법.
  14. 발현 시스템으로서, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 글루타민 합성효소의 C-말단 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된 항체의 경쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하되, 글루타민 합성효소의 각각의 단편은 단독으로 발현되는 경우 선택 가능한 활성을 갖지 않고, 상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 C-말단 단편의 공동 발현이 글루타민 합성효소 활성을 제공하고, 상기 발현 시스템은 포유동물 세포 내로 형질주입되어 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있으며,
    상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편 및 C-말단 단편은 M1-E110 및 T111-N373; M1-Y104 및 N105-N373; M1-S125 및 N126-N373; 및 M1-E264 및 N265-N373으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발현 시스템.
  15. 제14항의 발현 시스템으로 형질주입, 형질전환 또는 형질도입된, 단리된 숙주 세포.
  16. 발현 시스템으로서, 글루타민 합성효소의 N-말단 단편을 암호화하는 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제1 벡터, 및 글루타민 합성효소의 C-말단 단편을 암호화하는 제4 핵산에 작동 가능하게 연결된, 제3 핵산을 포함하는 바이시스트로닉 전사물을 암호화하는 제2 벡터를 포함하되, 상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편과 C-말단 단편은 회합하여 선택 가능한 활성을 제공하고, 그리고 상기 발현 시스템은 포유동물 세포에 형질주입되어 상기 형질주입된 세포의 선택을 개선시킬 수 있고, 추가로 상기 제1 핵산은 항체 중쇄를 암호화하고, 상기 제3 핵산은 항체 경쇄를 암호화하며,
    상기 글루타민 합성효소의 N-말단 단편 및 C-말단 단편은 M1-E110 및 T111-N373; M1-Y104 및 N105-N373; M1-S125 및 N126-N373; 및 M1-E264 및 N265-N373으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발현 시스템.
  17. 제16항의 발현 시스템으로 형질주입, 형질전환 또는 형질도입된, 단리된 숙주.
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