ES2914118T3 - Selección directa de células que expresan niveles altos de proteínas heterodiméricas usando vectores de complementación intragénica de glutamina sintetasa - Google Patents

Abstract

Un vector que comprende: a) un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, y b) un segundo ácido nucleico que codifica un mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) que tiene dos o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A, donde la trascripción del primer ácido nucleico está unida de forma operativa a la transcripción del segundo ácido nucleico, que comprende además: c) un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido donde el tercer polipéptido es capaz de asociarse con el primer polipéptido para formar una complejo heteromérico, y d) un cuarto ácido nucleico que codifica un mutante de extremo C de glutamina sintetasa (mutGS-CT) que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A, donde la transcripción del tercer ácido nucleico está unida de forma operativa a la transcripción del cuarto ácido nucleico, donde el mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) y el mutante de extremo C de glutamina sintetasa (mutGS-CT) interactúan para proporcionar actividad glutamina sintetasa y además, donde el vector es capaz de transfectarse en las células de mamífero y mejorar la selección de las células transfectadas.

Description

DESCRIPCIÓN

Selección directa de células que expresan niveles altos de proteínas heterodiméricas usando vectores de complementación intragénica de glutamina sintetasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al campo general de la expresión recombinante de polipéptidos en cultivos celulares de mamíferos. Más particularmente, la invención es sobre la selección mejorada en las células de vectores modificadas genéticamente de manera recombinante diseñados para expresar polipéptidos heteroméricos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La expresión de proteínas recombinantes heteroméricas usualmente requiere una expresión similar de cadenas de componentes para evitar la síntesis innecesaria de cadenas que no se pueden incorporar a proteínas maduras. Además, la mayoría de los métodos para producir proteínas recombinantes heteroméricas requieren la selección de muchos clones para identificar clones poco frecuentes con expresión alta que expresan niveles altos de cada cadena de la proteína heteromérica madura. Se puede usar un sistema de marcador seleccionable de separación (en el cual un marcador seleccionable se divide en dos piezas y cada fragmento se vincula a la expresión de una cadena de la proteína heteromérica) para identificar aquellas células que expresan ambos fragmentos de marcadores seleccionables y por lo tanto, ambas cadenas de las proteínas heteroméricas. El documento US2007/254338 A1 y el documento US2003/082735 A1 muestran el uso de un sistema de selección de divisiones DHFR.

La glutamina sintetasa (GS) cataliza la biosíntesis de glutamina mediante la condensación de amoníaco con glutamato. La enzima GS de mamífero es un decámero compuesto de dos anillos pentaméricos apilados, con diez sitios activos ubicados en la unión de subunidades. Cada sitio activo está formado por residuos del dominio del extremo N (el dominio de p-grasp, compuesto de residuos 25-112) de una subunidad y por residuos del dominio del extremo C (el dominio catalítico, compuesto de residuos 113-373) de una subunidad adyacente. Los estudios genéticos en S. cerevisiae y E. coli mostraron que determinadas mutaciones de GS mostraron complementación intragénica, donde algunas mutaciones que se mapean al extremo 5’ del gen de la GS podrían complementar las del extremo 3’ (Mitchell, A. P. Genetics 111,243-258 (1985); MacNeil, T., et ál. Journal of Bacteriology 150, 1302-1313 (1982)). Por consiguiente, identificar un sistema de selección basado en una enzima metabólica, tal como una que utiliza complementación intragénica de glutamina sintetasa, podría ser útil para expresar moléculas con más de dos cadenas de polipéptidos únicas (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y otras proteínas recombinantes).

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Una modalidad de la presente divulgación proporciona un vector que comprende:

a. un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, y

b. un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido es una subunidad mutante inicial de un marcador seleccionable, donde la transcripción del primer ácido nucleico está unida de forma operativa a una transcripción del segundo ácido nucleico, que comprende además:

c. un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido donde el tercer polipéptido es capaz de asociarse con el primer polipéptido para formar una complejo heteromérico, y

d. un cuarto ácido nucleico que codifica un cuarto polipéptido, donde el cuarto polipéptido es una subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable, donde la transcripción del tercer ácido nucleico está unida de forma operativa a la transcripción del cuarto ácido nucleico,

donde la subunidad mutante inicial y la subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable interactúa para proporcionar una actividad seleccionable, y además, donde el vector es capaz de transfectarse en las células de mamífero y mejorar la selección de las células transfectadas.

Otra modalidad de la presente divulgación proporciona un vector que comprende:

e. un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, y

f. un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido es un fragmento inicial de un marcador seleccionable, donde la transcripción del primer ácido nucleico está unida de forma operativa a una transcripción del segundo ácido nucleico, que comprende además:

g. un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido donde el tercer polipéptido es capaz de asociarse con el primer polipéptido para formar una complejo heteromérico, y

h. un cuarto ácido nucleico que codifica un cuarto polipéptido, donde el cuarto polipéptido es un fragmento complementario del marcador seleccionable, donde la transcripción del tercer ácido nucleico está unida de forma operativa a la transcripción del cuarto ácido nucleico,

donde la subunidad mutante inicial y la subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable interactúa para proporcionar una actividad seleccionable, y además, donde el vector es capaz de transfectarse en las células de mamífero y mejorar la selección de las células transfectadas.

En una modalidad adicional, el complejo heteromérico es una inmunoglobulina. En una modalidad, el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, en una modalidad alternativa, el primer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y el tercer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina. En las modalidades antes mencionadas, el marcador seleccionable es una enzima metabólica que se seleccionan del grupo que consiste en glutamina sintetasa, treonina deshidratasa, adenilosuccinato sintetasa y glutamato deshidrogenasa.

La invención puede incluir un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES); en una modalidad, un IRES ocurre en un sitio que se selecciona del grupo que consiste en: un sitio entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico; un sitio entre el tercer ácido nucleico y el cuarto ácido nucleico y en los sitios entre tanto el primero como el segundo y el tercero y el cuarto ácido nucleico. En una modalidad adicional, el sitio interno de entrada al ribosoma comprende la SEQ ID NO:23.

Cuando la subunidad mutante inicial del marcador seleccionable es un mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT), la subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable es un mutante de extremo C de la glutamina sintetasa (mutGS-CT). La mutGS-NT comprende dos o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A y la mutGS-CT comprende una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A. En una modalidad, mutGS-NT se selecciona del grupo que consiste en W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6), W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19); y la mutGS-CT se selecciona del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22).

En otras modalidades, los fragmentos de extremo N y extremo C de la glutamina sintetasa se crean dividiendo la proteína en uno o más aminoácidos de la proteína de la glutamina sintetasa. En tal aspecto de la divulgación, el fragmento del extremo N y/o los fragmentos del extremo C de la glutamina sintetasa se dividen en un aminoácido de la glutamina sintetasa que se selecciona del grupo que consiste en: E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127, y N265.

La invención también proporciona una célula hospedadora aislad que se ha transfectado, transformado o transducido con el vector como se describe anteriormente. La célula hospedadora se puede seleccionar del grupo que consiste en CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, una línea celular de mieloma y células WI38. Un aspecto de la invención proporciona un método para producir un complejo heteromérico que comprende el paso de cultivar dicha célula hospedadora en condiciones donde el complejo heteromérico es expresado por la célula hospedadora. En una modalidad, el complejo heteromérico es un anticuerpo. Los métodos de la invención de las reivindicaciones también pueden comprender aislar el complejo heteromérico.

Una modalidad de la divulgación proporciona un sistema de expresión que comprende:

a) un primer vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido es una subunidad mutante inicial de un marcador seleccionable, y

b) un segundo vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido que está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un cuarto polipéptido, donde el cuarto polipéptido es una subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable que es capaz de asociarse con la subunidad mutante inicial del marcador seleccionable para proporcionar una actividad seleccionable, donde además el tercer polipéptido es capaz de asociarse con el primer polipéptido para formar un complejo heteromérico; y además donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y mejorar la selección de dichas células.

Otra modalidad de la divulgación proporciona un sistema de expresión que comprende:

c) un primer vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido es un fragmento inicial de un marcador seleccionable, y

d) un segundo vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido que está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un cuarto polipéptido, donde el cuarto polipéptido es un fragmento complementario del marcador seleccionable que es capaz de asociarse con el fragmento inicial del marcador seleccionable para proporcionar una actividad seleccionable, donde además el tercer polipéptido es capaz de asociarse con el primer polipéptido para formar un complejo heteromérico;

y además donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y mejorar la selección de dichas células.

En una modalidad adicional, el complejo heteromérico es una inmunoglobulina. En una modalidad, el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, en una modalidad alternativa, el primer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y el tercer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina. En las modalidades antes mencionadas, el marcador seleccionable es una enzima metabólica que se seleccionan del grupo que consiste en glutamina sintetasa, treonina deshidratasa, adenilosuccinato sintetasa y glutamato deshidrogenasa.

El sistema de expresión de la invención descrito anteriormente puede incluir un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES); en una modalidad, un IRES ocurre en un sitio que se selecciona del grupo que consiste en: un sitio entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico; un sitio entre el tercer ácido nucleico y el cuarto ácido nucleico y en los sitios entre tanto el primero como el segundo y el tercero y el cuarto ácido nucleico. En una modalidad adicional, el sitio interno de entrada al ribosoma comprende la SEQ ID NO:23.

Cuando la subunidad mutante inicial del marcador seleccionable es un mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT), la subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable es un mutante de extremo C de la glutamina sintetasa (mutGS-CT). La mutGS-NT comprende dos o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A y la mutGS-CT comprende una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A. En una modalidad, mutGS-NT se selecciona del grupo que consiste en W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6), W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19); y la mutGS-CT se selecciona del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22).

En otras modalidades, los fragmentos de extremo N y extremo C de la glutamina sintetasa se crean dividiendo la proteína en uno o más aminoácidos de la proteína de la glutamina sintetasa. En tal aspecto de la divulgación, el fragmento del extremo N y/o los fragmentos del extremo C de la glutamina sintetasa se dividen en un aminoácido de la glutamina sintetasa que se selecciona del grupo que consiste en: E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127, y N265.

La invención también proporciona una célula hospedadora aislad que se ha transfectado, transformado o transducido con el vector como se describe anteriormente. La célula hospedadora se puede seleccionar del grupo que consiste en CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, una línea celular de mieloma y células WI38. Un aspecto de la invención proporciona un método para producir un complejo heteromérico que comprende el paso de cultivar dicha célula hospedadora en condiciones donde el complejo heteromérico es expresado por la célula hospedadora. En una modalidad, el complejo heteromérico es un anticuerpo. Los métodos de la invención de las reivindicaciones también pueden comprender aislar el complejo heteromérico.

En una modalidad, la divulgación proporciona un sistema de expresión que comprende un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa mutante en el extremo N (mutGS-NT), y un segundo vector que comprende un tercer ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa mutante de extremo C (mutGS-CT), donde cada subunidad mutante de glutamina sintetasa no tiene una actividad seleccionable cuando se expresa sola y la coexpresión de mutGS-NT con el mutGS-CT proporciona actividad de glutamina sintetasa, donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y de mejorar la selección de las célula transfectadas.

En una modalidad, la divulgación proporciona un sistema de expresión que comprende un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un fragmento de extremo N de una glutamina sintetasa, y un segundo vector que comprende un tercer ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un fragmento de extremo C de glutamina sintetasa, donde cada subunidad mutante de glutamina sintetasa no tiene una actividad seleccionable cuando se expresa sola y la coexpresión de los fragmentos de extremo N y extremo C de glutamina sintetasa proporciona actividad de glutamina sintetasa, donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y de mejorar la selección de las célula transfectadas.

En otra modalidad, la divulgación proporciona un sistema de expresión que comprende un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa mutante en el extremo N (mutGS-NT), y un segundo vector que comprende un tercer ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa mutante de extremo C (mutGS-CT), donde cada subunidad mutante de glutamina sintetasa no tiene una actividad seleccionable cuando se expresa sola y la coexpresión de mutGS-NT con el mutGS-CT proporciona actividad de glutamina sintetasa, donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y de mejorar la selección de las célula transfectadas.

En otra modalidad, la divulgación proporciona un sistema de expresión que comprende un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un fragmento de extremo N de una glutamina sintetasa, y un segundo vector que comprende un tercer ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un fragmento de extremo C de glutamina sintetasa, donde cada fragmento de glutamina sintetasa no tiene una actividad seleccionable cuando se expresa sola y la coexpresión de los fragmentos de extremo N y extremo C de glutamina sintetasa proporciona actividad de glutamina sintetasa, donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y de mejorar la selección de las célula transfectadas.

La mutGS-NT comprende dos o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A y la mutGS-CT comprende una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A. En una modalidad, mutGS-NT se selecciona del grupo que consiste en W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6), W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19); y la mutGS-CT se selecciona del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22).

En otras modalidades, los fragmentos de extremo N y extremo C de la glutamina sintetasa se crean dividiendo la proteína en uno o más aminoácidos de la proteína de la glutamina sintetasa. En tal aspecto de la divulgación, el fragmento del extremo N y/o los fragmentos del extremo C de la glutamina sintetasa se dividen en un aminoácido de la glutamina sintetasa que se selecciona del grupo que consiste en: E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127, y N265.

De manera similar, la invención también proporciona una célula hospedadora aislad que se ha transfectado, transformado o transducido con el vector como se describe anteriormente. La célula hospedadora se puede seleccionar del grupo que consiste en CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, una línea celular de mieloma y células WI38. Un aspecto de la invención proporciona un método para producir un complejo heteromérico que comprende el paso de cultivar dicha célula hospedadora en condiciones donde el complejo heteromérico es expresado por la célula hospedadora. En una modalidad, el complejo heteromérico es un anticuerpo. Los métodos de la invención de las reivindicaciones también pueden comprender aislar el complejo heteromérico.

Otros aspectos de la divulgación incluyen un sistema de expresión que comprende un primer vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un primer ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado, unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica una subunidad mutante inicial de un marcador seleccionable, y un segundo vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un tercer ácido nucleico, unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica una subunidad mutante complementaria de un marcador seleccionable, donde la primera subunidad y la subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable asociado para proporcionar una actividad seleccionable y donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y mejorar la selección de las células transfectadas, y donde el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de anticuerpos y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de anticuerpo. En una modalidad, el marcador seleccionable es glutamina sintetasa.

Aun otros aspectos de la divulgación incluyen un sistema de expresión que comprende un primer vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un primer ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado, unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un fragmento inicial de un marcador seleccionable, y un segundo vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un tercer ácido nucleico, unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un fragmento complementario de un marcador seleccionable, donde la primera subunidad y los fragmentos complementarios del marcador seleccionable asociado para proporcionar una actividad seleccionable y donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y mejorar la selección de las células transfectadas, y donde el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de anticuerpos y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de anticuerpo. En una modalidad, el marcador seleccionable es glutamina sintetasa.

La glutamina sintetasa comprende dos mutaciones complementarias; por lo tanto, la mutGS-NT comprende dos o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A y la mutGS-CT comprende una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A. En una modalidad, mutGS-NT se selecciona del grupo que consiste en W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6), W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19); y la mutGS-CT se selecciona del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22).

En tales otras modalidades, los fragmentos de extremo N y extremo C de la glutamina sintetasa se crean dividiendo la proteína en uno o más aminoácidos de la proteína de la glutamina sintetasa. En tal aspecto de la divulgación, el fragmento del extremo N y/o los fragmentos del extremo C de la glutamina sintetasa se dividen en un aminoácido de la glutamina sintetasa que se selecciona del grupo que consiste en: E110, Y104, S125, N126, E264, T111, N105, N126, Q127, y N265.

La invención también proporciona una célula hospedadora aislad que se ha transfectado, transformado o transducido con el vector como se describe anteriormente. La célula hospedadora se puede seleccionar del grupo que consiste en CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, una línea celular de mieloma y células WI38. Un aspecto de la invención proporciona un método para producir un complejo heteromérico que comprende el paso de cultivar dicha célula hospedadora en condiciones donde el complejo heteromérico es expresado por la célula hospedadora. En una modalidad, el complejo heteromérico es un anticuerpo. Los métodos de la invención de las reivindicaciones también pueden comprender aislar el complejo heteromérico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es una representación esquemática de las construcciones de ácido nucleico utilizadas en los Ejemplos 1-5, donde cada uno comprende una subunidad de un marcador seleccionable y que expresa diferentes polipéptidos, que pueden asociarse para formar un complejo heteromérico en una célula. Las abreviaturas son de la siguiente manera: muGS, glutamina sintetasa mutante; Ampr, resistencia a la ampicilina. La Figura 1 (A) ilustra el vector A (LC:mutGS-CT) y la Figura 1 (B) ilustra el vector B (HC:mutGS-NT).

La Figura 2 es una gráfica que muestra los resultados del experimento de rescate 1. Las construcciones A y B para cada versión (1 -5) se transfectaron en células inactivadas CHO-K1 GS y se analizaron para determinar su capacidad de rescatar las células en un medio libre de glutamina. Se usó una enzima GS de longitud completa que expresa plásmido como el control.

La Figura 3 es una gráfica que muestra que ninguno de los fragmentos A o B solos son capaces de rescatar la línea celular KO, lo que confirma que ambos fragmentos son requeridos para que se restaure la actividad de la enzima GS.

La Figura 4 es una representación esquemática de los vectores de expresión usados en el Ejemplo 6, donde cada uno contiene una cadena ligera de anticuerpo o cadena pesada, IRES y fragmento de glutamina sintetasa.

La Figura 5 es una gráfica que muestra el uso de vectores de fragmento de GS corriente abajo de los genes de LC y HC de anticuerpo. Las combinaciones de vectores 2A-LC y 2B-HC pudieron rescatar las células inactivadas de GS.

La Figura 6 es una gráfica que muestra la productividad de las células de los grupos seleccionados de la construcción 2 en un ensayo de productividad alimentado por lotes 10D y esto se comparó con un grupo de control que se seleccionó usando un vector que expresa una enzima de glutamina sintetasa de longitud completa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La producción eficiente de complejos heteroméricos recombinantes en células se mejora si cada componente del complejo se expresa en cantidades proporcionales y altas. La presente invención mejora la selección de las células transfectadas proporcionando métodos y composiciones para seleccionar las células modificadas genéticamente de manera recombinante que expresan más de un polipéptido heterólogo en cantidades proporcionales, de manera que los polipéptidos puedan asociarse de manera eficaz para formar un complejo heteromérico a niveles de expresión más altos que los complejos heteroméricos preparados tradicionalmente. La presente invención también es beneficiosa porque reduce el tiempo requerido para seleccionar células que expresan niveles altos de un complejo de polipéptido heteromérico recombinante, otro aspecto para mejorar la selección de células transfectadas proporcionado por la presente invención.

Mientras que la terminología utilizada en la presente solicitud es estándar dentro de la técnica, las definiciones de determinados términos se proporcionan en la presente para asegurar la claridad y precisión del significado de las reivindicaciones. Las unidades, los prefijos y los símbolos se pueden observar en su forma aceptada por SI (Sistema de unidades internacional). Los intervalos numéricos descritos en la presente incluyen los números que definen el intervalo e incluyen y sustentan cada número entero dentro del intervalo definido. Los métodos y técnicas descritos en la presente en general se llevan a cabo de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y tratan a través de la presente memoria descriptiva salvo que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook et ál. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y Ausubel et ál., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).

Los métodos descritos son aplicables a cultivos adherentes o cultivos de suspensiones cultivados en reactores de tanques agitados (inclusive cultivos de lotes tradicionales o cultivos celulares alimentados por lote, que pueden tener pero no es necesario que tengan un filtro giratorio), sistemas de perfusión (inclusive flujo tangencial alternante (“ATF”), sistemas de perfusión acústica, sistemas de perfusión de filtro de profundidad, y otros sistemas), biorreactores de fibra hueva (HFB, que en algunos casos se pueden usar en procesos de perfusión) y otros variados métodos de cultivo celular (ver, por ejemplo, Tao et ál., (2003) Biotechnol. Bioeng. 82:751-65; Kuystermans & Al-Rubeai, (2011) “Bioreactor Systems for Producing Antibody from Mammalian Cells” en Antibody Expression and Production, Cell Engineering 7:25-52, Al-Rubeai (ed) Springer; Catapano et ál., (2009) “Bioreactor Design and Scale-Up” en Cell and Tissue Reaction Engineering: Principles and Practice, Eibl et ál. (eds) Springer-Verlag.

Tal como se usa en la presente, los términos “uno” y “una” significan uno o más, salvo que se especifique lo contrario. Además, a menos que el contexto lo requiera, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán el singular. En general, las técnicas de cultivo tisular y celular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteína y ácido nucleico e hibridación, y las nomenclaturas utilizadas con relación a estas, que se describen en la presente son muy conocidas y se utilizan comúnmente en la técnica.

La presente descripción proporciona métodos para modular las propiedades de los cultivos celulares que expresan una “proteína de interés”; “proteína de interés” incluye proteínas de origen natural, proteínas recombinantes y proteínas modificadas genéticamente (por ejemplo, proteínas que no son naturales y que han sido diseñadas y/o creadas por humano). Una proteína de interés puede ser, pero no es necesario que sea, una proteína que se conoce o se sospecha que sea terapéuticamente importante. Los ejemplos particulares de una proteína de interés incluyen proteína de unión al antígeno (como se describe en la presente), pepticuerpos (es decir, una molécula que comprende péptidos fusionados directa o indirectamente a otras moléculas, tal como un dominio Fc de un anticuerpo, donde el resto péptido se une específicamente a un objetivo deseado; los péptidos se pueden fusionar a una región Fc o se pueden introducir a un Bucle Fc o una molécula Fc modificada, por ejemplo como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US2006/0140934), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión Fc, donde un fragmento Fc se fusiona a una proteína o péptido, inclusive un pepticuerpo), citocinas, factores de crecimiento, hormonas y otras proteínas secretadas naturales, y también formas mutantes de proteínas de origen natural.

El término “complejo heteromérico” pretende incluir un complejo molecular formado por la asociación de al menos dos moléculas diferentes. La asociación puede ser una interacción no covalente o unión covalente, por ejemplo, enlaces covalentes. Las dos moléculas diferentes son típicamente dos polipéptidos diferentes, sin embargo, la divulgación contempla complejos heteroméricos entre polipéptidos y ácidos nucleicos y entre ácidos nucleicos diferentes. En una modalidad, el complejo heteromérico proporciona una actividad funcional, tal como, la capacidad de unirse a un sustrato (por ejemplo, una inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno correspondiente), actividad enzimática o similar. En una modalidad, el complejo heteromérico de la divulgación se secreta en el medio de cultivo de la célula hospedadora en la cual se produce.

Tal como se usa en la presente, los términos “se asocian” o “interactúan” pretenden describir una relación entre al menos dos moléculas donde una molécula se une a las otras y/o afecta la actividad de las otras. La interacción puede incluir la unión directa o indirecta de dos polipéptidos (o polipéptido y ácido nucleico) o la activación funcional o inhibición de la actividad de una molécula por otra molécula.

En una modalidad particular, el complejo heteromérico es una molécula de inmunoglobulina. La inmunoglobulina en sistemas vertebrados es un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Las cuatro cadenas se unen por enlaces disulfuro, de manera que cada cadena ligera se une con una cadena pesada, y las cadenas pesadas están conectadas a lo largo de sus colas formando un complejo heteromérico con forma de Y. Se conocen varias técnicas mediante las cuales se pueden manipular las moléculas de inmunoglobulina que codifican ADN para proporcionar ADN capaz de codificar proteínas recombinantes tales como anticuerpos con afinidad mejorada u otros polipéptidos a base de anticuerpos (ver, por ejemplo, Larrick, et ál. (1989), Biotechnology 7:934-938; Reichmann et ál. (1988), Nature 332:323-327; Roberts et ál. (1987), Nature 328:731-734; Verhoeyen et ál. (1988), Science 239:1534-1536; Chaudhary et ál. (1989), Nature 339:394-397).

También se pueden usar células recombinantes que producen anticuerpos humanos (tales como se preparan usando bibliotecas de anticuerpos, y/o animales transgénicos, y se modifican opcionalmente de manera adicional in vitro), y anticuerpos humanizados. Ver, por ejemplo, Cabilly et ál., patente estadounidense n.° 4.816.567; Cabilly et ál., patente europea n.° 0.125.023 B1; Boss et ál., patente estadounidense n.° 4.816.397; Boss et ál., patente europea n.° 0.120.694 B1; Neuberger et ál., WO 86/01533; Neuberger et ál., patente europea n.° 0.194.276 B1; Winter, patente estadounidense n.° 5.225.539; Winter, patente europea n.° 0.239.400 B¹ ; Queen et ál., patente europea n.° 0.451.216 B1; y Padlan et ál., patente europea n.°. 0.519.596 A1. Por ejemplo, la invención se puede usar para inducir la expresión de anticuerpos humanos y/o humanizados que reconocen de manera inmunoespecífica objetivos celulares específicos, por ejemplo, el receptor EGF humano, el antígeno her-2/neu, el antígeno CEA, Antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), CD5, CD11a, CD18, NGF, CD20, CD45, Ep-cam, otras moléculas de superficie de células cancerosas, TNF-alfa, TGF-b 1, VEGF, otras citocinas, alfa 4 beta 7 integrina, IgEs, proteínas virales (por ejemplo, citomegalovirus), etc., entre otros.

Los ejemplos de complejos heteroméricos, además de las inmunoglobulinas, incluyen, de modo no taxativo, cualquier proteína heteromérica o heterooligomérica, por ejemplo, BMP2/BMP7,proteína osteogénica, enzima convertidora de leucina 1 (ICE), varios receptores de interleucina (por ejemplo, el receptor IL-18, el receptor IL-13, el receptor IL-4 y el receptor IL-7), los receptores del núcleo tales como receptores retinoides, receptores de linfocitos T, integrinas tales como moléculas de adhesión celular, integrinas, receptor del factor de necrosis tumoral y formas de unión solubles y de membrana de proteínas de complejo de histocompatibilidad principal de clase I y clase II (MHC). Para los complejos heteroméricos que son receptores, la invención comprende tanto formas de unión solubles como de membrana de los polipéptidos. Las descripciones de proteínas heteroméricas adicionales que se pueden producir de acuerdo con la invención se pueden encontrar por ejemplo en Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Vol. II (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge Mass., 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, Eds. Oxford University Press Inc., New York, 1993) y The Cytokine Handbook (A W Thompson, ed.; Academic Press, San Diego Calif.; 1991).

Tal como se usa en la presente, el término “proteína de fusión” se refiere a una proteína o dominio de una proteína (por ejemplo, un dominio extracelular soluble) fusionado a una proteína heteróloga o péptido. Los ejemplos de tales proteínas de fusión incluyen proteínas expresadas como una fusión con una parte de una molécula de inmunoglobulina, proteínas expresadas como proteínas de fusión con un resto cremallera y proteínas polifuncionales novedosas tales como proteínas de fusión de citocinas y factores de crecimiento (es decir, GM-CSF yIL-3, MGF y IL-3). WO 93/08207 y WO 96/40918 describen la preparación de varias formas oligoméricas solubles de una molécula referida como CD40L, inclusive una proteína de fusión de inmunoglobulina y una proteína de fusión de cremallera, respectivamente; las técnicas discutidas allí son aplicables a otras proteínas. Cualquiera de las moléculas descritas en la presente se pueden expresar como una proteína de fusión, inclusive, de modo no taxativo al dominio extracelular de una molécula receptora de células, una enzima, una hormona, una citocina, una parte de una molécula de inmunoglobulina, un dominio de cremallera y un epítopo.

El término "proteína de unión al antígeno” se usa en su sentido más amplio y significa una proteína que comprende una porción que se une a un antígeno u objetivo y, opcionalmente, un armazón o marco que permita que la parte de unión al antígeno adopte una conformación que fomente la unión de la proteína de unión al antígeno con el antígeno. Los ejemplos de las proteínas de unión al antígeno incluyen un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo recombinante; un anticuerpo de cadena simple; un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un fragmento de Fab; un fragmento F(ab’)2; un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo IgM; un anticuerpo IgG1; un anticuerpo IgG2; un anticuerpo IgG3 o un anticuerpo IgG4 y fragmentos de estos. La proteína de unión al antígeno puede comprender, por ejemplo, una armazón proteica alternativa o armazón artificial con derivados de CDR o CDR injertados. Tales andamiajes incluyen, de modo no taxativo, andamiajes derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión al antígeno, así como también andamiajes totalmente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Ver, por ejemplo, Korndorfer et ál., 2003, Proteins: Structure, Function, andBioinformatics, 53(1):121-129 (2003); Roque et ál., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004). Adicionalmente, se pueden utilizar miméticos de anticuerpos peptídicos (“PAM”, por sus siglas en inglés), así como andamiajes basados en miméticos de anticuerpos que utilizan componentes de fibronectina como andamiaje.

Una proteína de unión al antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina de origen natural. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. Es una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena "ligera" (alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (alrededor de 50-70 kDa). La porción del extremo amínico de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígenos. La parte carboxiterminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable por la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente.

Las cadenas de inmunoglobulina de origen natural exhiben la misma estructura general de regiones de marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Del extremo N al extremo C, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La designación de los aminoácidos de cada dominio se puede hacer de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación NIH no. 91-3242, 1991. Si se desea, las CDR se pueden redefinir de acuerdo con un esquema de nomenclatura alternativo, tal como el de Chothia (ver Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et ál., (1989) Nature 342:878-883 o Honegger & Pluckthun, (2001) J . Mol. Biol. 309:657-670).

En el contexto de la presente descripción una proteína de unión al antígeno se “une específicamente” o “une selectivamente” a su antígeno objetivo cuando la constante de disociación (Kd) es S10-8 M. El anticuerpo se une específicamente con “alta afinidad” cuando el Kd es S5x 10-9 M, y con “afinidad muy alta” cuando la Kd es S5x 10-10 M.

El término "anticuerpo" incluye la referencia tanto a inmunoglobulinas glicosiladas y no glicosiladas de cualquier isotipo o subclase o a una región de unión al antígeno de estas que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica, salvo que se especifique lo contrario. Además, el término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una parte de unión al antígeno de esta que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique de otra manera. Las partes de unión al antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos y pueden formar un elemento de una proteína de interés. Las partes de unión al antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAb) y fragmentos que incluyen de regiones determinantes de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena simple (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuertos y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferirle al polipéptido una unión específica al antígeno.

El término “anticuerpo” se refiere a una molécula en la cual la estructura y/o la función se basa en la estructura y/o la función de un anticuerpo, p. ej., de una molécula de inmunoglobulina completa o de longitud completa y/o se extrae de los dominios de cadena pesada variable (VH) y/o cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo o un fragmento de este. Por lo tanto, una construcción de anticuerpos es capaz de unirse a su objetivo o antígeno específico. Además, el dominio de unión de una construcción de anticuerpos de acuerdo con la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión del objetivo. Estos requisitos mínimos, p. ej., se pueden definir por la presencia de al menos las tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o las tres c Dr de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH), preferentemente de las seis CDR. Un enfoque alternativo para definir los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo es la definición del epítopo del anticuerpo dentro de la estructura del objetivo específico, respectivamente, el dominio proteico de la proteína objetivo que compone la región del epítopo (conglomerado de epítopo) o mediante referencia a un anticuerpo específico que compite con el epítopo del anticuerpo definido. Los anticuerpos en los cuales se basan las construcciones de acuerdo con la invención incluyen por ejemplo anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab ligados mediante un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb tiene un dominio Vh, un dominio Vl o un fragmento de unión a antígeno de un dominio Vh o Vl ; una región determinante de complementariedad aislada (CDR); y una única cadena Fv (scFv) (Patentes estadounidenses 6.846.634, 6.696.245, Pub. de Sol. de patente estadounidense n.° 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et ál., (1989) Nature 341:544-546).

Un anticuerpo de cadena simple (scFv) es un anticuerpo en el que una región Vl y Vh están unidas mediante un enlazador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena de proteínas continua en la que el enlazador es lo suficientemente largo como para permitir que la cadena de proteínas se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión al antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et ál., 1988, Science 242:423-26 y Huston et ál., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas de polipéptidos, donde cada cadena de polipéptidos comprende dominios Vh and Vl unidos por un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre dos dominios de la misma cadena, por lo tanto, permite que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena de polipéptidos (véase, por ejemplo, Holliger et ál., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48; y Poljak et ál., (1994) Structure 2:1121-23). Si las dos cadenas de polipéptidos de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo que resulte de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión al antígeno idénticos. Puede utilizarse cadenas de polipéptidos que tienen diferentes secuencias para hacer un diacuerpo con dos diferentes sitios de unión al antígeno. De manera similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres o cuatro cadenas de polipéptidos, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión al antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o distintos.

Además, el término “anticuerpo” incluye construcciones monovalentes, bivalentes y polivalentes/multivalentes y, por lo tanto, las construcciones biespecíficas, que se unen específicamente a solo dos estructuras antigénicas, así como construcciones poliespecíficas/multiespecíficas, que se unen específicamente a más de dos estructuras antigénicas, p. ej., tres, cuatro o más, a través de dominios de unión diferentes. Además, el término “anticuerpo” incluye moléculas que consisten en solo una cadena polipeptídica, así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, estas cadenas pueden ser idénticas (homodímeros, homotrímeros u homo oligómeros) o diferentes (heterodímeros, heterotrímeros o heterooligómeros). Algunos ejemplos de los anticuerpos identificados arriba y las variantes o derivados de estos se describen, entre otros, en Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) y Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2° ed. 2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

El término “biespecífico”, según se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que es “al menos biespecífica”, es decir, que comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en donde el primer dominio de unión se une a un antígeno u objetivo (en la presente: el antígeno de superficie celular objetivo) y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno u objetivo. En consecuencia, las construcciones de anticuerpo biespecíficas comprenden especificidades para al menos dos antígenos u objetivos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos también pueden comprender construcciones de anticuerpos multiespecíficas tales como construcciones de anticuerpos triespecíficas, en donde las últimas incluyen tres dominios de unión, o construcciones que tienen más de tres (p. ej., cuatro, cinco...) especificidades.

Se puede incorporar una o más CDR en una molécula de manera covalente o no covalente para hacer una proteína de unión al antígeno. Una proteína de unión al antígeno puede incorporar las CDR como parte de una cadena de polipéptidos más grande, puede unir de forma covalente las CDR a otra cadena de polipéptidos o puede incorporar las c Dr de forma no covalente. Las CDR permiten que la proteína de unión al antígeno se una de manera específica a un antígeno en particular de interés.

Una proteína de unión al antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos o distintos. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana de origen natural tiene típicamente dos sitios de unión idénticos, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.

A los efectos de claridad, y como se describe en la presente, cabe destacar que una proteína de unión al antígeno puede, pero no es necesario que sea de origen humano (por ejemplo, un anticuerpo humano) y en algunos casos comprenderá una proteína no humana, por ejemplo, una proteína de rata o murino y en otros casos una proteína de unión al antígeno puede comprender un híbrido de humano y proteínas no humanas (por ejemplo, un anticuerpo humanizado).

Una proteína de interés puede comprender un anticuerpo humano. El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una modalidad, todos los dominios variables y constantes derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Dichos anticuerpos pueden prepararse en una cantidad de formas, inclusive mediante la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que se modifica genéticamente para que exprese los anticuerpos derivados de genes humanos que codifican la cadena pesada y/o ligera, tales como ratones derivados de un sistema Xenomouse®, UltiMab™, o Velocimmune®. También se pueden usar enfoques basados en fagos.

De manera alternativa, una proteína de interés puede comprender un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana en una o más sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos, a fin de que el anticuerpo humanizado tenga menos probabilidad de inducir una respuesta inmunitaria, y/o induzca una respuesta inmunitaria menos grave, en comparación con el anticuerpo de una especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una modalidad, determinados aminoácidos en los dominios de marco y constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos de especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra modalidad, el o los dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan al dominio o los dominios variables de una especie no humana. En las patentes estadounidenses n.° 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293 pueden encontrarse ejemplo de cómo elaborar anticuerpos humanizados.

Una región “Fc”, como se usa el término en la presente, contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios Ch2 y Ch3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos a través de dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrofóbicas de los dominios Ch3. Las proteínas de interés que comprenden una región Fc, inclusive proteínas de unión al antígeno y proteínas de fusión Fc, forman otro aspecto de la presente descripción.

Un “hemicuerpo” es una construcción de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que comprende una cadena pesada completa, una cadena ligera completa y una segunda región Fc de cadena pesada emparejada con la región Fc de la cadena pesada completa. Un enlazador puede, pero no necesita, utilizarse para unir la región Fc de cadena pesada y la segunda región Fc de cadena pesada. En modalidades particulares, un hemicuerpo es una forma monovalente de una proteína de unión al antígeno descrita en la presente. En otras modalidades, los pares de residuos cargados se pueden usar para asociar una región Fc con la segunda región Fc. Un hemicuerpo puede ser una proteína de interés en el contexto de la presente descripción.

El término “célula hospedadora” significa una célula que se ha modificado genéticamente para expresar un polipéptido de interés comercial o científico. La línea celular genéticamente modificada implica la transfección, transformación o transducción de las células con un ácido nucleico que codifica una molécula de polinucleótido recombinante (un “gen de interés”), y/o que de otro modo altere (por ejemplo, mediante la recombinación homóloga y la activación de genes o la fusión de una célula recombinante con una célula no recombinante) a modo de provocar que la célula hospedadora exprese un polipéptido recombinante deseado. Los métodos y los vectores para células y/o líneas celulares genéticamente modificadas para que expresen un polipéptido de interés son conocidos por los expertos en la técnica; por ejemplo, varias técnicas se ilustran en Current Protocols in Molecular Biologv. Ausubel et ál., eds. (Wiley & Sons, Nueva York, 1988, y actualizaciones trimestrales); Sambrook et ál., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. La expresión incluye la progenie de la célula madre, ya sea que la progenie sea idéntica en morfología o en estructura genética a la célula madre original o no, siempre y cuando el gen de interés se encuentre presente. Un cultivo celular puede comprender una o más células hospedadoras.

El término “hibridoma” significa una célula o progenie de una célula que resulta de la fusión de una célula inmortalizada y una célula productora de anticuerpos. El hibridoma resultante es una célula inmortalizada que produce anticuerpos. Las células individuales usadas para crear el hibridoma pueden ser de fuente de mamífero, inclusive, de modo no taxativo, hámster, rata, cerdo, conejo, oveja, cabra y humano. El término también comprende líneas celulares de trioma, que resultan cuando la progenie de las fusiones de mieloma de heterohíbrido, que son el producto de una fusión entre células humanas y una línea celular de mieloma murino, se fusionan posteriormente con una célula plasmática. Se pretende que el término incluya cualquier línea celular inmortalizada híbrida que produzca anticuerpos, tal como, por ejemplo, cuadromas (ver, por ejemplo, Milstein et ál., (1983) Nature, 537:3053)

Los términos “cultivo” y “cultivo celular” se usan de manera intercambiable y se refieren a una población celular que se mantiene en un medio en condiciones adecuadas para la supervivencia y/o crecimiento de la población celular. Como será evidente para los expertos en la técnica, estos términos también se refieren a la combinación que comprende la población celular y el medio donde se suspende la población.

Los términos “polipéptido” y “proteína” (por ejemplo, como se usan en el contexto de una proteína de interés o un polipéptido de interés) se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos es un análogo o mimético de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos también comprenden polímeros de aminoácidos que han sido modificados, p. ej., mediante la adición de residuos de carbohidratos para formar glicoproteínas, o fosforilados. Los polipéptidos y las proteínas se pueden producir mediante una célula de origen natural y no recombinante, o los polipéptidos y proteínas se pueden producir por una célula modificada genéticamente o recombinante. Los polipéptidos y las proteínas pueden comprender moléculas con la secuencia de aminoácidos de una proteína natural o moléculas con eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia natural.

Los términos “polipéptido” y “proteína” comprenden moléculas que comprenden únicamente aminoácidos naturales, y también moléculas que comprenden aminoácidos de origen natural. Los ejemplos de aminoácidos de origen no natural (que se pueden sustituir cualquier aminoácido de origen natural encontrado en cualquier secuencia descrita en la presente, según se desee) incluyen (de modo no taxativo:) 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetillisina, £-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos utilizada en la presente, la dirección izquierda es la dirección del extremo amino y la dirección derecha es la dirección del extremo carboxilo, de acuerdo con el uso y costumbre normal.

Con "cultivo celular" o "cultivo" se quiere decir el crecimiento y propagación de células fuera de un tejido u organismo multicelular. En la técnica se conocen las condiciones de cultivo adecuadas para células de mamífero. Véase, por ejemplo, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, Nueva York (1992). Las células de mamífero se pueden cultivar en suspensión o mientras están unidas a un sustrato sólido. Se puede utilizar biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, botellas de cultivo rotatorias, matraces de agitación o biorreactores de tanque agitado, con o sin microportadores. En una modalidad, se usan biorreactores de 500 L a 2000 L. En una modalidad, se usan biorreactores de 1000 L a 2000 L.

El término “medio de cultivo celular” (también llamado “medio de cultivo”, “medio de cultivo celular”, “medio de cultivo del tejido”) se refiere a cualquiera solución de nutriente utilizado para cultivar células, por ejemplo, células animales o de mamífero, y que generalmente proporciona al menos uno o más componentes de los siguientes: una fuente de energía (usualmente en la forma de un carbohidrato como glucosa); uno o más de todos los aminoácidos esenciales, y generalmente los veinte aminoácidos básicos, más cisteína; vitaminas y/u otros compuestos orgánicos típicamente requeridos a concentraciones bajas; lípidos o ácidos grasos libres; y oligoelementos, por ejemplo, compuestos inorgánicos o de origen natural que son típicamente requeridos en concentraciones muy bajas, usualmente en el rango micromolar.

La solución de nutrientes se puede complementar opcionalmente con componentes opcionales adicionales para optimizar el crecimiento de células, tales como hormonas y otros factores de crecimiento, por ejemplo, insulina, transferrina, factor del crecimiento epidérmico, suero y similares; sales, por ejemplo, calcio, magnesio y fosfato, y amortiguadores, por ejemplo, HEPES; nucleósidos y bases, por ejemplo, adenosina, timidina, hipoxantina; e hidrolisatos de proteína y tejidos, por ejemplo, proteína vegetal o animal hidrolizada (peptona o mezclas de peptona, que se pueden obtener de subproductos animales, gelatina purificada o material vegetal); antibióticos, por ejemplo, gentamicina; protectores celulares o tensioactivos tales como Pluronic®F68 (también referidos como Lutrol® F68 y Kolliphor® P188; copolímeros tribloqueno iónicos compuestos por una cadena hidrofóbica central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueado por doscadenas hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)); poliaminas, por ejemplo, putrescina, espermidina y espermina (ver por ejemplo, Pulicación de la OMPI n.° WO 2008/154014) y piruvato (ver por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8053238) dependiendo de los requisitos de las células a cultivar y/o los parámetros de cultivo celular deseados.

El medio de cultivo celular incluye los que se usan típicamente y/o se conoce que se usan con cualquier proceso de cultivo celular, tal como, de modo no taxativo, lote, lote extendido, lote de alimentación y/o perfusión o cultivo continuo de células.

Un medio de cultivo celular “base” (o lote) se refiere a un medio de cultivo celular que se usa típicamente para iniciar un cultivo celular y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular.

Un medio de cultivo celular “de crecimiento” se refiere a un medio de cultivo celular que se usa típicamente en cultivos celulares durante un período de crecimiento exponencial, una “fase de crecimiento” y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular durante esta fase. Un medio de cultivo celular de crecimiento también puede contener agentes de selección que confieren resistencia o supervivencia a marcadores seleccionables incorporados en la línea celular hospedadora. Dichos agentes de selección incluyen, de modo no taxativo, geneticina (G4118), neomicina, higromicina B, puromicina, zeocina, sulfoximina de metionina, metotrexato, medio de cultivo celular sin glutamina, glicina sin medio de cultivo celular, hipoxantina y timidina, o solo timidina.

Un medio de cultivo celular de “producción” se refiere a un medio de cultivo celular que se usa típicamente en cultivos celulares durante la transición cuando el crecimiento exponencial está terminando y la producción de la proteína empieza, las fases de “transición” y/o “producto” y es suficientemente completo para mantener una densidad celular deseada, viabilidad y/o titulación del producto durante esta fase.

Un medio de cultivo celular de “perfusión” se refiere a un medio de cultivo celular que se usa típicamente en cultivos celulares que se mantienen por la perfusión o métodos de cultivo continuo y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular durante este proceso. Las formulaciones de medios de cultivo celular de perfusión pueden ser más ricos o más concentrados que las formulaciones de medios de cultivo celular base para alojar el método usado para eliminar el medio gastado. El medio de cultivo celular de perfusión se puede usar durante las fases de crecimiento y producción.

El medio de cultivo celular concentrado puede contener algunos o todos los nutrientes necesarios para mantener el cultivo celular; en particular, el medio concentrado puede contener nutrientes identificados o que se sabe que se consumen durante el transcurso de la fase de producción del cultivo celular. Los medios concentrados se pueden basar en más o menos toda formulación de medio de cultivo celular. Dicho medio de alimentación concentrado puede contener algunos o todos los componentes del cultivo celular en, por ejemplo, alrededor de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 12 veces, 14 veces, 16 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 400 veces, 600 veces, 800 veces, o incluso alrededor de 1000 veces su cantidad normal.

Los componentes usados para preparar el medio de cultivo celular se pueden moler completamente a una formulación de medio en polvo; moler parcialmente con suplementos líquidos agregados al medio de cultivo celular según sea necesario; o agregar en forma completamente líquida al cultivo celular.

Los cultivos celulares también se pueden complementar con suministros concentrados independientemente de nutrientes particulares que pueden ser difíciles de formular o que se puedan eliminar rápidamente de los cultivos celulares. Tales nutrientes pueden ser aminoácidos tales como tirosina, cisteína y/o cistina (ver por ejemplo, la publicación de la OMPI n.° 2012/145682). En una modalidad, una solución concentrada de tirosina se suministra independientemente a un cultivo celular cultivado en un medio de cultivo celular que contiene tirosina, de manera que la concentración de tirosina en el cultivo celular no exceda los 8 mM. En otra modalidad, una solución concentrada de tirosia y cistina se suministra independientemente al cultivo celular que se cultiva en un medio de cultivo celular sin tirosina, cistina o cisteína. Los suministros independientes pueden empezar antes o en el inicio de la fase de producción. Los suministros independientes se pueden lograr con lote de suministro al medio de cultivo celular en el mismo o diferente día que el medio de suministro concentrado. Los suministros independientes también se pueden someter a perfusión en el mismo o diferente día que el medio de perfusión.

"Sin suero" se aplica a medios de cultivo celular que no contienen suero animal, tal como suero fetal bovino. Varios medios de cultivo de tejido, incluso medios de cultivo definidos, están comercialmente disponibles, por ejemplo, se puede usar cualquiera o una combinación de los siguientes medios de cultivo celular: Medio RPMI-1640, Medio RPMI-1641, Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Medio esencial mínimo de Eagle, Medio F-12K, Medio F12 de Ham, Medio de Dulbecco modificado por Iscove, Medio 5A de McCoy, Medio L-15 de Leibovitz, y medio sin suero tal como la serie 300 EX-CELL™ (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), entre otros. También están disponibles las versiones sin suero de dichos medios de cultivo. Los medios de cultivo celular pueden complementarse con concentraciones adicionales o aumentadas de componentes tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, amortiguadores, antibióticos, lípidos, oligoelementos y similares, dependiendo de los requisitos de las células que serán cultivadas y/o los parámetros deseados del cultivo celular.

El término “biorreactor” significa cualquier recipiente útil para el crecimiento de un cultivo celular. Los cultivos celulares de la presente descripción se pueden cultivar en un biorreactor, que se puede seleccionar basándose en la aplicación de una proteína de interés que se produce con las células que crecen en el biorreactor. Un biorreactor puede ser de cualquier tamaño siempre que sea útil para cultivar las células; típicamente, un biorreactor se ajusta en el tamaño adecuado al volumen de cultivo celular que crece dentro de él. Típicamente, un biorreactor tendrá al menos 1 litro y puede tener 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1,000, 1500, 2000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000 litros o más o cualquier volumen en el medio. Las condiciones internas del biorreactor, inclusive, entre otras, el pH y la temperatura, se pueden controlar durante el período de cultivo. Los expertos en la técnica conocerán y podrán elegir biorreactores adecuados para usar en la práctica de la presente invención basándose en las consideraciones particulares.

“Densidad de células" refiere al número de células en un volumen dado de medio de cultivo. "Densidad de células viables" refiere al número de células vivas en un volumen dado de medio de cultivo, tal como se determina por los ensayos de viabilidad estándar (tal como el método de exclusión de tinte de azul tripán).

El término “viabilidad celular” significa la capacidad de las células en el cultivo de sobrevivir en un conjunto determinado de condiciones o variaciones experimentales. El término también se refiere a la parte de las células que están vivas en un momento particular en relación con la cantidad total de células, vivas y muertas en el cultivo en ese momento.

"Hematocrito" (PCV), también referido como "porcentaje de hematocrito" (%PCV), es la relación del volumen ocupado por las células, al volumen total del cultivo celular, expresado como un porcentaje (ver Stettler, et ál., (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6):1228-33). El volumen de célula empacada es una función de densidad de célula y diámetro de célula; pueden surgir aumentos en el hematocrito de aumentos en la densidad de la célula o en el diámetro de la célula o en ambos. El hematocrito es una medida del contenido sólido en el cultivo celular. Los sólidos se eliminan durante la cosecha y purificación corriente abajo. Más sólidos significan más esfuerzo para separar el material sólido de un producto deseado durante las etapas de cosecha y de purificación corriente abajo. También, el producto deseado puede quedar atrapado en los sólidos y se puede perder durante el proceso de cosecha, resultando en un rendimiento de producto disminuido. Dado que las células hospedadoras varían en tamaño y los cultivos celulares también contienen células muertas y moribundas y otros desechos celulares, el hematocrito es una manera más exacta para describir el contenido sólido dentro de un cultivo celular que densidad celular o densidad de célula viable. Por ejemplo, un cultivo de 2000 L que tiene una densidad celular de 50 x 106 células/ml tendría volúmenes de células empacadas muy diferentes dependiendo del tamaño de las células. Además, algunas células, cuando están en un estado de crecimiento detenido, aumentarán de tamaño, por lo que el hematocrito antes de la detención de crecimiento y luego de esta probablemente serán diferentes, debido al aumento de la biomasa como resultado de un aumento del tamaño de las células.

"Detención de crecimiento", que también puede ser referido como "detención de crecimiento celular", es el punto donde las células dejan de aumentar en cantidad o cuando el ciclo celular ya no progresa. La detención de crecimiento se puede monitorear determinando la densidad de células viables de un cultivo celular. Algunas células en un estado de detención de crecimiento pueden aumentar de tamaño pero no de cantidad, de manera que el hematocrito de un cultivo con crecimiento detenido puede aumentar. La detención de crecimiento se puede revertir en cierta medida, si las células no se están deteriorando en salud, revirtiendo las condiciones que llevan a la detención del crecimiento.

El término “titulación” significa la cantidad total de un polipéptido o proteína de interés (que puede ser de origen natural o proteína recombinante de interés) producida por un cultivo celular en una cantidad determinada de volumen del medio. La titulación se puede expresar en unidades de miligramos o microgramos de polipéptido o proteína por mililitro (u otra medida de volumen) de medio. “Titulación acumulada” es la titulación producida por las células durante el transcurso del cultivo y se puede determinar, por ejemplo, midiendo las titulaciones a diario y usando los valores para calcular la titulación acumulada.

El término "cultivo de lote alimentado” se refiere a una forma de cultivo de suspensión y significa un método para cultivar células donde se proporcionan componentes adicionales al cultivo en un momento o momentos posteriores al comienzo del proceso de cultivo. Los componentes proporcionados típicamente comprenden suplementos nutricionales para las células que se agotaron durante el proceso de cultivo. Adicional o alternativamente, los componentes adicionales pueden incluir componentes complementarios (por ejemplo, un compuesto inhibidor del ciclo celular). Un cultivo de lote alimentado se detiene típicamente en algún punto y las células y/o componentes en el medio se cultivan y purifican opcionalmente.

Los términos "densidad celular viable integrada” o “IVCD” se usan de manera intercambiable y significan la densidad promedio de células viables durante el transcurso del cultivo multiplicado por la cantidad de tiempo del cultivo.

La “Densidad celular viable acumulada” (CVCD) se calcula multiplicando una densidad celular viable (VCD) promedio entre dos momentos con la duración de tiempo entre dos momentos. La CVCD es el área bajo la curva formada con la gráfica de VCD en función del tiempo.

La divulgación utiliza marcadores seleccionables que pueden estar sometidos a la complementación intragénica para seleccionar directamente las construcciones de expresión que codifican las proteínas heteroméricas, tales como anticuerpos, usando un sistema de dos vectores. “Complementación intragénica” se refiere a la complementación entre piezas de material genético (es decir, ácidos nucleicos), cada uno de los cuales tiene un defecto diferente dentro del mismo locus. Una proteína individual codificada por el material genético es defectuosa y no funcional, pero dos proteínas defectuosas individuales pueden asociarse para formar una proteína activa. Si las proteínas defectuosas individuales son capaces de asociarse y exhibir actividad, se dice que las proteínas defectuosas individuales son “complementarias”. Para las proteínas de marcadores seleccionables que están hechas de múltiples subunidades idénticas (tales como GS), la complementación intragénica puede ocurrir cuando las subunidades mutantes son complementarias.

La “complementación intragénica” también puede ocurrir entre fragmentos de una proteína individual codificada por el material genético que se asocia para formar una proteína activa. Como se describe en la presente, la enzima de GS madura en eucariotas existe como un complejo decamérico que consiste en dos anillos pentaméricos. Esta invención demuestra que la complementación intragénica de GS se puede usar de manera exitosa como parte de un sistema de selección para la generación de líneas celulares que expresan proteínas recombinantes. La utilidad del sistema para la expresión de alto nivel de un anticuerpo recombinante en el cual las células CHO se modifican genéticamente para volverse deficientes en glutamina sintetasa.

Una proteína individual codificada por el material genético se vuelve defectuosa y no funcional por la introducción de una o más mutaciones en el ácido nucleico codificante, cuyas mutaciones modifican la estructura de la proteína de manera suficiente para volverse no funcional. La mutación o mutaciones se pueden introducir mediante cualquier método conocido en la técnica de la biología molecular. De manera alternativa, se puede usar un fragmento de proteína que se vuelve defectuoso y no funcional. En tal caso, se pueden asociar dos fragmentos de proteínas para formar una proteína activa mediante complementación intragénica.

Las moléculas de ácido nucleico se construyen de manera que codifican un polipéptido y una subunidad mutante del marcador seleccionable, dispuesto de manera que la expresión de la subunidad mutante se correlaciona con la expresión del polipéptido. Por lo tanto, cuando las moléculas de ácido nucleico que codifican subunidades mutantes complementarias se introducen en células y se aplican condiciones selectivas, aproximadamente los mismos niveles o niveles superiores de expresión de cada subunidad mutante complementaria proporcionarán la actividad más seleccionable. Además, los polipéptidos unidos de forma operativa se expresarán en casi las mismas cantidades o cantidades superiores, optimizando de esa manera la selección de células que expresan niveles iguales o superiores de los polipéptidos deseados.

En una modalidad de la divulgación, el marcador seleccionable es glutamina sintetasa, (GS), cuyo sitio activo está ubicado en la unión de dos subunidades de GS, por eso la coexpresión de subunidades mutantes complementarias funcionalmente afectadas debería resultar en sitios activos funcionales intactos. Las subunidades mutantes individuales no tienen solo actividad significativamente seleccionable, sino que también proporcionan actividad seleccionable cuando están coexpresadas con su subunidad mutante complementaria. La actividad óptima de las subunidades puede depender de su interacción, y de tal manera pueden estar facilitadas por dominios de interacción. Tales dominios de interacción pueden ser endógenos a la subunidad o pueden ser heterólogos a la subunidad. Los marcadores seleccionables adicionales que son útiles en la presente invención incluyen arginosuccinato liasa, adenilsuccinato sintetasa y glutamato deshidrogenasa para los que se pueden identificar mutantes complementarios. Por ejemplo, la complementación intragénica con mutantes de argininosuccinato liasa se puede confirmar con el crecimiento en la ausencia de arginina, mientras que la complementación intragénica con mutantes de adenilosuccinato sintetasa se puede confirmar mediante el crecimiento en la ausencia de adenosina.

En una modalidad no taxativa, la divulgación conlleva el uso de dos fragmentos de un marcador seleccionable, cada uno de los cuales se puede expresar como una proteína de fusión a un dominio de interacción. Cuando se expresa, el dominio de interacción promueve la asociación o dimerización de dos fragmentos permitiendo de esa manera que las subunidades funcionen y proporcionando una actividad seleccionable (por ejemplo, entre otras, las descritas por Pelletier et ál. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., 95:12141-12146). Los marcadores seleccionables adecuados incluyen GS y los otros marcadores seleccionables descritos anteriormente, y los marcadores seleccionables tales como los que confieren resistencia a fármacos particulares que son comúnmente tóxicos y las enzimas metabólicas que confieren supervivencia celular o inducen la muerte celular en condiciones indicadas, como se describe en la presente.

Un “dominio de interacción” es un dominio, que incluye, de modo no taxativo, polipéptidos capaces de facilitar la interacción o asociación de dos o más polipéptidos homólogos o heterólogos. En una modalidad, el dominio de interacción es un dominio de dimerización. Un dominio de dimerización puede ser un polipéptido capaz de inducir la interacción o la asociación de dos polipéptidos. Hay dos tipos de dímeros, los capaces de formar homodímeros (con la misma secuencia) o los heterodímeros (con otra secuencia).

En una modalidad ilustrativa pero no taxativa, el dominio de interacción es un polipéptido de bobina en espiral de cremallera de leucina. Una cremallera de leucina comprende típicamente alrededor de 35 aminoácidos que contienen una repetición del residuo siete características con residuos hidrofóbicos en el primer y cuarto residuo de repetición (Harbury et ál. (1993), Science 262:1401). Por lo tanto, una cremallera de leucina está dispuesta a fusionarse a un polipéptido con el fin de oligomerizar el polipéptido ya que es una molécula pequeña y tiene menos probabilidades de interrumpir con la función normal de los polipéptidos que un dominio de interacción más grande. Los ejemplos de cremalleras de leucina incluyen de modo no taxativo dominios de cremallera de leucina de polipéptidos tales como GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc y c-Max.

Los ejemplos adicionales de dominios de dimerización incluyen dominios hélice-bucle-hélice (Murre et ál. (1989), Cell 58:537-544). El receptor de ácido retinoico, el receptor de hormona tiroidea, otros receptores de hormonas nucleares (Kurokawa et ál. (1993), Genes Dev. 7:1423-1435) y factores de transcripción de levadura GAL4 y HAP1 (Marmonstein et ál. (1992), Nature 356:408-414; Zhang et ál. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2851-2855; patente estadounidense n.° 5.624.818) todos tienen dominios de dimerización con este motivo.

En aun otra modalidad, el dominio de interacción es un dominio de tetramerización, que es un polipéptido capaz de unirse con otros tres dominios de tetramerización para formar un complejo tetramérico. Los ejemplos de dominios de tetramerización que contienen proteínas incluyen, de modo no taxativo, represor de lactosa E. coli (aminoácidos 46-360; Chakerian et ál. (1991), J. Biol. Chem. 266:1371; Alberti et ál. (1993), EMBO J. 12:3227; y Lewis et ál. (1996), Nature 271:1247), y el dominio de tetramerización p53 en los residuos 322-355 (Clore et ál. (1994), Science 265:386; Harbury et ál. (1993), Science 262:1401; patente estadounidense n.° 5,573,925).

En una modalidad alternativa, la divulgación conlleva el uso de tres subunidades de un marcador seleccionable, cada uno expresado como una proteína de fusión a un dominio de interacción, mejorando de esa manera la asociación para proporcionar una actividad seleccionable. En esta modalidad, hay tres componentes del complejo heteromérico. En los vectores expresados, las secuencias de codificación para cada uno están unidas de forma operativa a secuencias de codificación para cada una de las subunidades respectivas del marcador seleccionable, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que expresa una única cadena pesada y dos cadenas ligeras diferentes, donde las dos cadenas ligeras son capaces de asociarse con la cadena pesada. La divulgación también comprende el uso de marcadores seleccionables conocidos o aun no divulgados que tienen cuatro o incluso más subunidades.

La presente divulgación también será útil para preparar proteínas heterodiméricas (o hetero-oligoméricas) que comprenden tres o más subunidades tales como las descritas anteriormente en la presente. Esto incluye anticuerpos biespecíficos y otras proteínas heteromultiméricas que se conocen en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico se puede expresar usando un primer marcador seleccionable que es capaz de complementación intragénica como se describe en la presente (por ejemplo, GS) para expresar la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo, y un marcador seleccionable diferente tal como una enzima metabólica dividida o un marcador de resistencia, o un segundo marcador seleccionable que es diferente al primer marcador seleccionable y es capaz de complementación intragénica, para expresar la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo que es capaz de asociarse con el primer anticuerpos para formar un anticuerpo biespecífico.

De manera alternativa, el primer marcador seleccionable que es capaz de complementación intragénica como se describe en la presente (por ejemplo, GS) se puede usar para expresar dos cadenas pesadas diferentes de un anticuerpo biespecífico, donde las cadenas pesadas son capaces de asociarse entre sí. Las cadenas ligeras se pueden expresar usando un marcador seleccionable diferente. En algunos casos, la cadena ligera puede ser idéntica par ambos brazos del anticuerpo biespecífico, lo que indica que se puede usar un único marcador seleccionable (una enzima metabólica o marcador de resistencia, u otra forma de marcador seleccionable) para expresar las cadenas ligeras. De manera alternativa, una cadena ligera diferente se puede asociar con cada cadena pesada diferente del anticuerpo biespecífico, en cuyo caso un marcador seleccionable diferente tal como una enzima metabólica dividida o un marcador de resistencia, o un segundo marcador seleccionable y es capaz de complementación intragénica, se usa para expresar la primera y la segunda cadena ligera.

Como se mostrará con los ejemplos, se ha descubierto que los métodos y composiciones de la divulgación reducen la cantidad de tiempo necesario para seleccionar las células deseadas que expresan niveles altos de proteína heteromultimérica. Por lo tanto, en aun otra modalidad, la divulgación comprende seleccionar células que expresan niveles altos de un polipéptido recombinante, particularmente polipéptidos heteromultiméricos. Además, la invención encuentra una particular utilidad en mejorar la producción de complejos heteroméricos a través de procesos de cultivos celulares.

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos que codifican las subunidades del marcador mutante se fusionan en un marco a un ácido nucleico que codifica un enlazador, que luego se fusiona en un marco a un ácido nucleico que codifica un dominio de interacción. Los enlazadores pueden incluir cualquier secuencia relativamente corta y flexible que permita que el dominio de interacción interactúe y que las subunidades funcionen para proporcionar una actividad seleccionable. Los ejemplos de enlazadores son abundantes en la técnica relevante y pueden comprender GGPGG, GPGGG, donde en códigos de aminoácidos de una sola letra G es glicina y P es prolina. En una modalidad, el enlazador es una serie de residuos de glicina y serina, por ejemplo, descritos por Curtis et ál. (1991; Proc Natl Acad Sci 88(13):5809-5813).

En una modalidad, las dos subunidades mutantes complementarias se expresan a partir de dos vectores, donde el primer vector comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, y donde el primer ácido nucleico está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica una subunidad mutante de un marcador seleccionable. El segundo vector comprende un tercer ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de asociarse con el primer polipéptido codificado con el primer ácido nucleico, donde el tercer ácido nucleico está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica una subunidad mutante complementaria del marcador seleccionable. Por lo tanto, ambos vectores se introducen simultáneamente en una población celular y se aplica la selección de complementación intragénica.

En otra modalidad, los dos fragmentos complementarios se expresan a partir de dos vectores, donde el primer vector comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, y donde el primer ácido nucleico está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un fragmento de un marcador seleccionable. El segundo vector comprende un tercer ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de asociarse con el primer polipéptido codificado con el primer ácido nucleico, donde el tercer ácido nucleico está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un fragmento complementario del marcador seleccionable. Por lo tanto, ambos vectores se introducen simultáneamente en una población celular y se aplica la selección de complementación intragénica.

Por ejemplo, se construye un sistema de dos vectores para expresar un anticuerpo preparando un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una cadena del anticuerpo, donde el primer ácido nucleico está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica una mutGS-NT. El segundo vector comprende un tercer ácido nucleico que codifica la otra cadena del anticuerpo, donde el tercer ácido nucleico está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica una mutGS-CT. Por lo tanto, en una modalidad, el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina. De manera alternativa, el primer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y el tercer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina.

En otra modalidad, los dos fragmentos complementarios se expresan a partir de dos vectores, donde el primer vector comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, y donde el primer ácido nucleico está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un fragmento de un marcador seleccionable. El segundo vector comprende un tercer ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de asociarse con el primer polipéptido codificado con el primer ácido nucleico, donde el tercer ácido nucleico está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un fragmento complementario del marcador seleccionable. Por lo tanto, ambos vectores se introducen simultáneamente en una población celular y se aplica la selección de complementación intragénica.

En tal caso, se construye un sistema de dos vectores para expresar un anticuerpo preparando un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una cadena del anticuerpo, donde el primer ácido nucleico está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un fragmento de glutamina sintetasa de extremo N. El segundo vector comprende un tercer ácido nucleico que codifica la otra cadena del anticuerpo, donde el tercer ácido nucleico está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un fragmento de glutamina sintetasa de extremo C. Por lo tanto, en una modalidad, el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina. De manera alternativa, el primer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y el tercer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina.

Una modalidad adicional incluye el uso de uno o más IRES que permiten la expresión de una o más subunidades de mutGS. “IRES” significa, en el contexto de esta invención, un sitio interno de entrada al ribosoma que facilita el inicio de la traducción de un ARNm de un sitio interno (es decir, un sitio que no es el extremo 5’ del ARNm).

Un ejemplo de un IRES adecuado es el IRES del virus de encefalomiocarditis (ECMV), como lo describe Jang y Wimmer Genes & Development 41560 (1990) y Jang, Davies, Kaufman y Wimmer J. Vir. 631651 (1989). Los residuos 335-848 de EMCV forman un IRES adecuado; otras variantes o partes del IRES de ECMV son conocidas y serán adecuadas para la presente invención. Una parte o variante adecuada de un IRES es una que confiere suficiente traducción del segundo marco de lectura abierto (ORF).

Además, el extremo 3’ de un IRES se puede modificar (o mutar) para reducir la eficiencia de traducción, proporcionando de esa manera un medio para mejorar la selección y/o los métodos de amplificación. Por ejemplo, la eficiencia del IRES puede reducirse usando una secuencia que antes demostró una selección y una amplificación eficaz (Aldrich et ál., Biotechnol Prog 19, 1433; 2003). Las secuencias alternativas son conocidas o se pueden determinar fácilmente con un experto en la técnica.

En otra modalidad, la divulgación comprende además un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable funcional diferente, además de una subunidad de un marcador seleccionable y un polipéptido de un complejo heteromérico. A los efectos de la presente, un “marcador seleccionable funcional diferente” no es una subunidad mutante del marcador seleccionable que es capaz de complementación intragénica, sino una proteína con actividad seleccionable diferente. Los marcadores bien conocidos tales como zeomicina, neomicina, puromicina, Blasticidina S o GPT que confieren resistencia al ácido micofenólico, etc., se pueden usar como marcadores seleccionables funcionales diferentes. Además, los mutantes complementarios de un marcador seleccionable diferente que son capaces de complementación intragénica también se pueden usar.

En esta modalidad, la divulgación comprende dos vectores, donde cada vector comprende un primer ácido nucleico que codifica un polipéptido que puede formar un complejo heteromérico unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica al menos una subunidad mutante de un marcador seleccionable, y también un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable funcional diferente. Además, los polipéptidos respectivos codificados por el primer ácido nucleico de cada vector se pueden asociar para formar un complejo y la subunidad o las subunidades codificadas por los segundos ácidos nucleicos y los polipéptidos codificados por los terceros ácidos nucleicos proporcionan actividades seleccionables diferentes a la actividad seleccionable de las subunidades codificadas por los segundos ácidos nucleicos.

Por ejemplo, el primer vector puede codificar resistencia a neomicina y el segundo vector puede codificar resistencia a zeomicina o un solo vector puede contener el marcador seleccionable funcional diferente adicional. Por lo tanto, un vector se transfecta en una línea celular y se aplica la selección (es decir, el fármaco G418 se agrega a las células resistentes a neomicina). Después de la selección, se pueden usar métodos convencionales para determinar la presencia del vector y el nivel de expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos en el vector, por ejemplo, mediante PCR, transferencia Southern, ELISA, transferencia Western y similares. Una vez que se haya obtenido un nivel alto de expresión, el segundo vector se transfecta en la línea celular. A la vez que se mantiene la selección para el primer vector, la selección se aplica para el segundo marcador seleccionable (es decir, resistencia a la zeomicina) y se evalúa la presencia del segundo vector y la expresión de la proteína codificada del vector respectivo. En esta modalidad, cuando se haya determinado que ambos vectores están presentes, se aplica la selección para la expresión de las subunidades que se han asociado en la célula para proporcionar una actividad seleccionable como se describe en la presente.

En una modalidad alternativa, ambos ácidos nucleicos de la divulgación que codifican actividades seleccionables independientes se transfectan simultáneamente y la selección se aplica en el mismo momento. Cuando se haya determinado que ambos vectores están presentes, se aplica la selección para la expresión de las subunidades que se han asociado en la célula para proporcionar una actividad seleccionable como se describe anteriormente.

En aun otra modalidad, los vectores de la invención que codifican actividades seleccionables independientes se transfectan en líneas celulares separadas. Cuando se aplique la selección y se hayan identificado los clones que expresan niveles altos de las proteínas codificadas por cada vector deseado, las células se fusionan como se describe en Hori et ál. (Patente estadounidense n.° 5.916.771). Cuando la fusión esté completa, se aplica la selección para la actividad seleccionable proporcionada por las subunidades.

En aun otra modalidad, los ácidos nucleicos de la divulgación que no contienen opcionalmente una actividad seleccionable independiente se transfectan simultáneamente con un tercer vector. El tercer vector codifica una actividad seleccionable separada, tal como por ejemplo, resistencia a neomicina o betagalactosidasa que puede permitir una selección preliminar de células que se transfectaron con éxito. Cuando se haya realizado la selección preliminar, la selección se puede aplicar para la actividad seleccionable de las subunidades mutantes. En esta modalidad, se transfectan cantidades iguales de los dos vectores de expresión mientras que se transfecta un tercer vector con un tercio de la concentración de los dos primeros vectores (por ejemplo, una relación de 3:3:1 o 6:6:1 o similar).

Los ácidos nucleicos que codifican un componente del complejo heteromérico deseado se pueden obtener como un ADNc o como un ADN genómico a través de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ARN mensajero que codifica un componente deseado se puede aislar de una fuente adecuada que utilice técnicas estándares de aislamiento de ARN, y el uso de cromatografía de celulosa de oligo-dT para segregar el ARNm poli-A. Cuando el complejo heteromérico a expresar es un anticuerpo, las fuentes deseadas de ácidos nucleicos se pueden aislar de linfocitos B maduros o un cultivo de hibridoma. Además, los ácidos nucleicos para usar en la invención se pueden obtener mediante síntesis química.

Además del ácido nucleico que codifica el componente deseado del complejo heteromérico, las construcciones de vectores pueden incluir componentes adicionales para facilitar la replicación en células procariotas y/o eucariotas, integración de la construcción en un cromosoma eucariota y marcadores para ayudar a la selección y/o evaluación de células que contienen la construcción. Los vectores de la invención son vectores de ADN recombinantes que incluyen, de modo no taxativo, plásmidos, fagémidos, cósmidos, virus, retrovirus, y similares, que introducen un ácido nucleico deseado en una célula.

El ácido nucleico está "unido de forma operativa" cuando se encuentra en una relación funcional con otro ácido nucleico. Más específicamente, unido de forma operativa significa que dos ácidos nucleicos diferentes que codifican polipéptidos diferentes tienen una transcripción inducida simultáneamente. Unido de forma operativa también pretende significar que los ácidos nucleicos unidos pueden estar contiguos a una unidad de transcripción única, mientras que la traducción se dirige desde uno o más sitios de inicio ribosomal (por ejemplo, sitio interno de entrada al ribosoma). Las unidades de transcripción unidas de forma operativa que codifican dos polipéptidos diferentes se denominan “transcripciones bicistrónicas”.

Los métodos de la invención también se pueden usar en combinación con métodos conocidos o aún por conocer para inducir la producción de proteínas recombinantes. Por “inducir condiciones” significa una técnica para aumentar la producción relativa por célula de una proteína recombinante deseada. Tales técnicas incluyen cambio de temperatura fría, y adiciones de químicos, y combinaciones de cualquier técnica conocida o por conocer, para nombrar algunos ejemplos, y técnicas de inducción descubiertas y/o por descubrir. Típicamente, un lote o un cultivo de perfusión de células con alta densidad se induce para producir la proteína recombinante. Con frecuencia, otros procesos celulares (tales como crecimiento y división) se inhiben para dirigir la mayoría de la energía de las células en la producción de proteínas recombinantes.

Cualquier marcador seleccionable con subunidades se puede usar en los métodos y composiciones de la divulgación. Tal como se usa en la presente, el término “subunidad”, cuando se hace referencia a un marcador seleccionable se refiere a una parte de un marcador seleccionable. Además, una primera subunidad muíante (referida en la presente como una “subunidad muíante inicial”) de un marcador seleccionable se puede expresar con una segunda subunidad muíante complementaria (referida en la presente como una “subunidad mutante complementaria”) del mismo marcador seleccionable para proporcionar un nivel de actividad seleccionable no presente en ninguna subunidad mutante. Una subunidad también se puede referir a un polipéptido con mutaciones que se complementan por otro polipéptido mutado que también es una subunidad diferente del marcador seleccionable.

Los marcadores seleccionables que confieren resistencia a fármacos particulares que son comúnmente tóxicos para una célula animal se pueden usar en los métodos y composiciones de la divulgación. Por ejemplo, los siguientes son ejemplos no taxativos de marcadores seleccionables de resistencia: zeomicina (zeo); puromicina (PAC); Blasticidina S (BlaS), GPT, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); el gen de resistencia a la neomicina, que otorga resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin et ál. (1981), J. Mol. Biol.

150:1); e higro, que otorga resistencia a la higromicina (Santerre et ál. (1984), Gene 30:147).

Las enzimas metabólicas que confieren supervivencia celular o inducen muerte celular en condiciones indicadas también se pueden usar en los métodos y composiciones de las divulgaciones. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo: dihidrofolato reductasa (DHFR); virus del herpes timidina cinasa (TK) (Wigler et ál. (1977), Cell 11:223), hipoxantinaguanina fosforibosiltransferasa (HGPRT) (Szybalska & Szybalski (1962), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), y adenina fosforibosiltransferasa (APRT) (Lowy et ál. (1980), Cell 22:817), que son genes que se usan en células que carecen de TK, HGPRT o APRT, respectivamente.

En una modalidad, la glutamina sintetasa (GS) es el marcador seleccionable utilizado en los métodos y composiciones de la presente divulgación. La GS comprende dos anillos pentaméricos apilados de subunidades idénticas con diez sitios activos formados por residuos de extremo N a partir de una subunidad y residuos de extremo C de la subunidad adyacente. Las construcciones mutantes de extremo N (mutGS-NT) y de extremo C (mutGS-CT) se preparan y se evalúan para la complementación. Ni mutGS-NT ni mutGS-CT permitirán el crecimiento celular en el medio sin glutamina, sin embargo, cuando las células mutantes de GS se transfecten con ambas construcciones, las células transfectadas con ambas construcciones sobreviven en medios sin glutamina. Cuando ocurre la cotransfección con dos mutantes de tal tipo, los mutantes se denominan “complementarios”. De manera alternativa, las células que expresan GS endógena se pueden usar y los transfectantes se pueden seleccionar confiriendo mayor resistencia a los niveles tóxicos de metionina sulfoximina (MSX).

Los marcadores seleccionables que se basan en selección de color también se pueden usar en los métodos y composiciones de la divulgación. En un ejemplo particular, se puede usar beta-galactosidasa (Blau et ál., WO 98/44350). Los marcadores de fluorescencia también se pueden usar en los métodos de la presente divulgación, por ejemplo, GFP se ha usado para la selección clonal de las células para medir las interacciones de proteínas en ensayos de complementación de proteínas-fragmentos (Remy y Michnick (1999), Proc. Natl. Acad. Sci., 96:5394-5399). Se puede usar metotrexato conjugado con fluoresceína de manera similar para detectar fragmentos de DHFR complementarios que expresan células (Remy y Michnick (2001), Proc. Natl. Acad. Sci., 98:7678-83). Una ventaja para los marcadores fluorescentes es que esta selección se puede hacer en cualquier tipo de célula animal y no está limitado a los que tienen una deficiencia en la vía metabólica o no requiere sensibilidad al fármaco, por ejemplo, a neomicina.

Tal como se usa en la presente, el término “polipéptido” incluye proteínas de origen natural o expresadas de manera recombinante, inclusive procesamiento pre y postraduccional, o fragmentos de estas, que típicamente retienen una estructura secundaria. Las proteínas son moléculas grandes con pesos moleculares altos (de alrededor de 10.000 para pequeñas [de 50-100 aminoácidos] a más de 1.000.000 para determinadas formas); están compuestas por cantidades variables de los mismos 20 aminoácidos, que en la proteína intacta están unidas a través de enlaces químicos covalentes llamados enlaces peptídicos. Los aminoácidos, unidos, forman estructuras poliméricas no ramificadas llamadas cadenas de polipéptidos; tales cadenas pueden contener cientos de residuos de aminoácidos; estos están dispuestos en un orden específico para una especie determinada de proteína. El término “péptido” incluye fragmentos cortos de polipéptido o proteínas de típicamente menos de 20 aminoácidos de longitud.

El término "cultivo celular" pretende incluir el crecimiento y propagación de células fuera de un tejido u organismo multicelular. Típicamente, el cultivo celular se realiza en condiciones atmosféricas y de temperatura controlada y estériles en placas de cultivos de tejidos (por ejemplo, placas de 10 cm, placas de 96 pocillos, etc.) u otros cultivos adherentes (por ejemplo, en perlas de microportadores) o en cultivo de suspensiones tales como botellas de cultivo giratorias. Los cultivos se pueden cultivar en matraces de agitación, biorreactores a escala pequeña y/o biorreactores a gran escala. Un biorreactor es un dispositivo utilizado para cultivar células en las que las condiciones del ambiente tales como la temperatura, la atmósfera, la agitación y/o el pH se pueden controlar y ajustar. Varias compañías (por ejemplo, ABS Inc., Wilmington, Del.; Cell Trends, Inc., Middletown, Md.) y universidades y/o organizaciones patrocinadas por el gobierno (por ejemplo, The Cell Culture Center, Minneapolis, Minn.) ofrecen servicios de cultivo celular con un contrato.

Los períodos óptimos por los cuales los cultivos están en contacto con agentes que seleccionan la actividad seleccionable son más largos que el período típico para el ciclo de crecimiento normal (por ejemplo, para células de ovario de hámster chino (células c Ho )), donde el ciclo de crecimiento se ha informado que es de 20-22 horas (Rasmussen et ál. (1998), Cytotechnology, 28:31-42)). De tal manera, en una modalidad, los cultivos comprenden condiciones seleccionables, por ejemplo, drogas, metabolitos, o sustratos de color, preferentemente por al menos alrededor de un día, más preferentemente por al menos alrededor de 3 días e incluso más preferentemente por al menos alrededor de 7 días.

Hay disponible una amplia variedad de líneas celulares de animales adecuadas para el crecimiento en cultivos, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, Va.) y NRRL (Peoria, 111.). Algunas de las líneas celulares más establecidas típicamente usadas en los laboratorios industriales o académicos incluyen CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, CV1, MDCK, 293, 3T3, PC12, micloma (por ejemplo, NSO), y líneas celulares WI38, para nombrar algunos ejemplos. En otras modalidades, las líneas celulares no animales se pueden usar en los métodos de la divulgación, por ejemplo, líneas celulares vegetales, líneas celulares de insectos (por ejemplo, sf9), célula de levadura o célula de bacterias tales como E. coli.

En una modalidad, se usan las células CHO deficientes de GS tales como células CHO modificadas por GS-/- ZFN CHOZN® (Sigma Aldrich Fine Chemicals, St. Louis MO). Las células CHO deficientes de GS (u otras células de mamífero) también se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, las células CHO son fáciles de manipular como cultivos adherentes o de suspensión y exhiben una estabilidad génica relativamente buena. Además, se pueden establecer líneas celulares animales nuevas usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, mediante transformación, infección viral y/o selección).

Como se indicó anteriormente, se pueden utilizar una variedad de sistemas vectores de expresión de hospedador para expresar los complejos heteroméricos de la divulgación. Si el complejo heteromérico es soluble, el péptido o el polipéptido se pueden recuperar a partir del cultivo, es decir, a partir de la célula hospedadora en casos donde no se secretan los complejos heteroméricos, y a partir del medio de cultivo en casos donde los complejos heteroméricos se secretan por las células. Sin embargo, los sistemas de expresión también comprenden células hospedadoras modificadas genéticamente que expresan los complejos heteroméricos anclados en la membrana celular.

La purificación o enriquecimiento de los complejos heteroméricos de tales sistemas de expresión se pueden lograr usando detergentes adecuados y micelas de lípidos y métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. Sin embargo, tales células hospedadoras modificadas genéticamente se pueden usar en situaciones donde es importante no solo mantener las características estructurales y funcionales de los complejos heteroméricos, pero también para evaluar la actividad biológica, por ejemplo, en ensayos de evaluación de fármacos.

Se puede obtener la proteína expresada por los métodos de la invención. Además, la proteína se puede purificar, o purificar en parte, a partir de dicho cultivo o componente (por ejemplo, del medio de cultivo o extractos celulares o fluidos corporales) usando procesos conocidos. La frase “purificar en parte” significa que se ha llevado a cabo algún procedimiento o procedimientos de fraccionamiento, pero que hay más (al menos 10 %) de la especie de polipéptido que la proteína deseada. El término “purificar” significa que la proteína es esencialmente homogénea, es decir que hay menos del 1 % de las proteínas contaminantes. Los procedimientos de fraccionamiento pueden incluir, de modo no taxativo, uno o más pasos de filtración, centrifugación, precipitación, separación en fases, purificación por afinidad, filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC; usando tales resinas como feniléter, butiléter o propiléter), HPLC o alguna combinación anterior.

La divulgación también comprende opcionalmente formular las proteínas de manera adicional. Por el término “formular” se quiere decir que las proteínas pueden intercambiar con amortiguador, esterilizar, envasar a granel y/o envasar para un usuario final. A los efectos de la invención, el término “forma a granel estéril” significa que una formulación es libre o esencialmente libre de contaminación microbiana (en la medida que sea aceptable a los efectos de alimentos y/o fármacos) y tiene la composición y concentración definida.

El término “forma de dosis unitaria estéril” significa una forma que es adecuada para el cliente y/o la administración o consumo al paciente. Tales composiciones pueden comprender una cantidad eficaz de la proteína, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, portador o excipiente fisiológicamente aceptable. El término “fisiológicamente aceptable” significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos.

Para la presente invención, se desarrollaron conjuntos de mutaciones inactivadoras que codifican cambios en el extremo N (mutGS-NT) de la proteína GS de mamífero y también como conjuntos de mutaciones inactivadoras que codifican cambios en el extremo C (mutGS-CT) de la proteína. El sitio catalítico de GS se sometió a un escaneo de alanina en el cual se hizo la mutación, individualmente y en combinaciones, a todos los residuos de alanina conservados de manera evolutiva involucrados en la unión de glutamato, ATP y/o amoníaco. La mayoría de los residuos se seleccionaron basándose en la evidencia de los estudios bioquímicos y cristalográficos de rayos X publicados de enzimas de GS, pero todos los residuos dentro de los 4.5 Á de los sustratos/ligandos/metales en el sitio activo se evaluaron como candidatos potenciales. Las combinaciones de los mutantes de GS, estructuralmente intactos, catalíticamente deficientes de extremo N y de extremo C se identificaron y se evaluaron para determinar la capacidad de complementarse entre sí para restaurar algo de la actividad de la GS cuando se coexpresa.

Se construyó un sistema de dos vectores vinculando la expresión de una cadena de un anticuerpo con una mutGS-NT o fragmento de GS de extremo N y otro con una mutGS-CT o fragmento de GS de extremo C. Se construyó un vector de expresión con un promotor/mejorador que dirige la expresión de una cadena pesada (HC) de anticuerpo en un ARNm único con un IRES que permite la expresión de un mutGS-NT o fragmento de GS de extremo N. De manera separada, la expresión de la cadena ligera (LC) del anticuerpo se vinculó a mutGS-CT o fragmento de GS de extremo C construyendo un vector con un promotor/mejorador que dirige la expresión de la LC y un IRES que permite la expresión de mutGS-CT o fragmento de GS de extremo C. Ni mutGS-NT ni mutGS-CT, los fragmentos de GS de extremo n o extremo C, por sí mismos permitieron el crecimiento celular en el medio sin glutamina. Sin embargo, cuando las células mutantes de Gs se transfectaron con ambas construcciones, las células transfectadas con ambas construcciones en niveles similares permitieron la supervivencia en medios sin glutamina. Las células también produjeron cantidades similares de la LC y la HC para el anticuerpo de interés. La rigurosidad de la selección se puede aumentar más reduciendo la eficiencia del IRES, lo que resulta en la traducción reducida del marcador seleccionable de mutGS o potencialmente agregando el inhibidor de GS, sulfoximina de L-metionina (MSX).

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la selección y la preparación de mutantes de glutamina sintetasa (GS) murino identificados como probablemente útiles en la complementación intragénica. Cuatro residuos de extremo N de GS murino (W60, N61, D63, y S66) y 11 residuos de extremo C (E134, E136, E196, E203, N248, H253, N255, R319, R324, E338 y R340) se seleccionaron para su evaluación en un escaneo de mutación de alanina. Las construcciones mutantes de combinación e individuales se generaron en vectores pcDNA3.3 (resistencia a la neomicina, Invitrogen Grand Island, NY), lo que resulta en un total de 9 construcciones mutantes de extremo N y 16 construcciones mutantes de extremo C.

Las construcciones mutantes se evaluaron para determinar su expresión de proteína GS intacta en líneas celulares CHO-K1. Las células se cultivaron en medios de cultivo definidos químicamente no selectivos que contienen glutamina en matraces de agitación ventilados a 36 °C, 5% CO² , 70% humedad relativa y agitado a 150-160 rpm en incubadoras humedecidas. La densidad celular viable (VCD) y la viabilidad se midieron con un contador celular automatizado ViCell (Beckman-Coulter, Inc., Brea, CA). Los cultivos se pasaron por dilución cada 3-4 días.

Se transfectaron un millón de células por condición con ADN linealizado con 10 microgramos con electroporación (triplicados biológicos). El ADN se linealizó con enzimas de restricción de PvuI-HF (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante la noche a 37 °C de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La electroforesis en gel de agarosa se usó para confirmar la linealización completa de cada plásmido. Después de la digestión de restricción, el ADN se precipitó durante la noche a -70 °C agregando un volumen de reacción de 10 % de acetato de sodio 3M y un volumen de restricción de 200 % de etanol al 100 % a cada digerido. Después de la precipitación con etanol, se sedimentó el ADN, el precipitado se lavó una vez con etanol al 70 %, se secó al aire y se volvió a suspender en solución salina amortiguada con h EpES. Las concentraciones de ADN se midieron en NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) y se ajustaron a 1 microgramo/microlitro con solución salina amortiguada con HEPES.

Para las pruebas de complementación intragénica, se usaron 5 microgramos de cada uno de los dos plásmidos junto con 10 microgramos de ADN de esperma de salmón puro (Invitrogen). Las transfecciones se hicieron centrifugando 1 millón de células por condición de cultivos cultivados el día 3, resuspendiendo las células en 150 microlitros de solución salina amortiguada con HEPES, agregando un total de 10 microgramos de ADN de plásmido (5 microgramos de cada plásmido y 10 microgramos y transfiriendo la mezcla en pocillos de una placa de electroporación de 96 pocillos (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA).

La electroporación se realizó usando placas de 96 pocillos usando Gene Pulser MXcell™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) con las siguientes configuraciones: onda exponencial, voltaje = 290 V, capacitancia = 950 microF, resistencia = 950 ohms. Después de la electroporación, las células se transfectaron en un medio no selectivo precalentado de 2 ml/pocillo en placas ventiladas de 24 pocillos de profundidad (24DWP) y se agitó a 220 rpm en incubadoras Kühner (Kühner AG, Basel, Suiza).

Tres días después de la transfección, las células se contaron y se transfirieron en un medio selectivo (medio de crecimiento definido químicamente sin glutamina) a 1 x 106 células viables/mL. Se generaron grupos estables por serie pasando las células en el medio selectivo cada 3-4 días hasta que se recuperó la viabilidad del cultivo más del 90 %. Se realizó el conteo de células en un citómetro de flujo Guava EasyCyte™ HT (EMD Millipore, Billerica, MA) usando un módulo de ensayo ViaCount, después de una incubación de 15 minutos de células en reactivo (dilución de cultivo 1:10 en reactivo ViaCount FLEX (EMD Millipore, Billerica, MA) a una concentración de trabajo (dilución en PBS 1:50)).

Todos los grupos se dejaron recuperar hasta al menos 90 % de viabilidad antes de analizarse en ensayos funcionales. Después de la generación de grupos, se realizó un análisis de transferencia Western de grupos triplicados para establecer el nivel de la sobreexpresión de proteína de GS para cada construcción y para determinar si la mutación interfirió con la producción de la proteína de GS intacta.

Para el análisis de transferencia Western, se lisaron 3 x 106 células en 100 microlitros de amortiguador RIPA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) suplementado con cóctel inhibidor de fosfatasa y proteasa Halt sin EDTA (Thermo Scientific, Rockford, IL) por 30 minutos en hielo. Los lisados se enjuagaron a 13.000 rpm, se agregó amortiguador de carga 4x (Invitrogen, Grand Island, NY) y las muestras se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos. 15 pl de cada muestra se pasaron en gel E-Page 48 (Invitrogen, Grand Island, NY) y se transfierieron a membranas PVDF usando un iBlot (Invitrogen, Grand Island, NY). Cada membrana se sondeó con anticuerpo anti glutamina sintetasa de ratón 1:500 (Cat # 610518, BD Biosciences, San José, CA) durante la noche a 4 °C, seguido por incubación con 1:2000 anticuerpo secundario Alexa Fluor 680 antirratón (Life Technologies, Grand Island, NY). Las transferencias se escanearon en Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR, Lincoln, NE) y se cuantificaron usando software ImageJ.

Tabla 1: Mutantes de glutamina sintetasa de murino probados

Si bien en análisis inicial indicó que los residuos de aminoácidos E388 y R340 como residuos candidatos para la mutación, la sobreexpresión de los mutantes de GS de E388A y R340A (como mutaciones únicas o en combinación con otras mutaciones) no proporcionó una proteína de GS intacta. Por lo tanto, las construcciones que contenían estas mutaciones no se volvieron a considerar.

Como se generaron grupos de GS mutantes estables en la línea celular original CHO-K1 de tipo salvaje, que tiene la enzima de GS funcional, se realizó la evaluación de la actividad mutante con una pantalla de crecimiento/viabilidad en el medio selectivo sin glutamina y se complementó con 25 microM del inhibidor de Gs , sulfoximina de L-metionina (MSX). Las células CHO-K1 de tipo salvaje murieron después de 4 pasadas en medio selectivo. Determinadas mutaciones de extremo N y extremo C evitaron el crecimiento del cultivo en el medio selectivo, pero incluso los grupos sin crecimiento retuvieron una viabilidad relativamente alta.

Las células transfectadas con mutantes de extremo C de GS individuales crecieron similar a la construcción de tipo salvaje, por lo que estas construcciones no se volvieron a analizar. Sin embargo, dos construcciones mutantes múltiples de extremo N, W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6) y W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) proporcionaron niveles altos de proteína de GS sobreexpresada y tuvieron un rendimiento muy cercano al del control negativo del vector vacío en el ensayo funcional, y fueron seleccionadas para más análisis. Además, otras dos construcciones mutantes de extremo N, W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19) se prepararon en un esfuerzo de aumentar la rigurosidad del efecto de complementación y se evaluaron. En la construcción posterior, se mutó aspartato-63 a arginina en vez de alanina porque el mutante análogo en Anabena azollae eliminó completamente la actividad biosintética y se expresó igual que el tipo salvaje, mientras que la mutación a alanina retuvo 6,5 % de actividad biosintética (Eur. J. Biochem. 266, 1202 (1999) Crespo et ál.).

Si bien varias construcciones mutantes de extremo C únicas pasaron la evaluación funcional, dos construcciones contenían múltiples mutaciones E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22), se seleccionaron para más análisis.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe el efecto de las mutaciones en GS en la expresión de una proteína heterodimérica recombinante, es decir, un anticuerpo monoclonal (mAb). Los mutantes de extremo N y extremo C descritos en el Ejemplo 1 se clonaron en vectores de expresión mAb para construir múltiples combinaciones de sistemas de dos vectores donde la expresión de la cadena ligera (LC) está unida a través de un IREs a una mutGS-CT y la cadena pesada (HC) está unida a una mutGS-NT. Se construyó una línea celular inactivada de GS CHO-K1 usando CompoZr® Knockout ZFN Kit- CHO GS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). Se cultivaron líneas celulares inactivadas (CHO-K1 GS-KO) de glutamina sintetasa CHO-K1 como se describió anteriormente.

Se realizaron transfecciones inactivadas de GS de CHO-K1 triplicadas usando los vectores que contienen LC o HC de mAb unido a la GS de tipo salvaje (control positivo) o mutantes de extremo N y de extremo C y cultivadas en medio sin glutamina. El vector pcDNA3.3 inicial con la GS de tipo salvaje se usó como un control positivo adicional. Los grupos de GS de tipo salvaje pcDNA3.3 y los grupos de GS de tipo salvaje unidos a mAb recuperaron más de 90 % de viabilidad a los 20 días de pasar en el medio sin glutamina. Por el contrario, los grupos transfectados con simulación y todos los grupos de GS mutantes unidos a mAb murieron 17 días después en un medio sin glutamina, confirmando que los mutantes seleccionados proporcionan un producto de proteína de GS funcionalmente deficiente.

Finalmente, los mutantes de extremo N y extremo C seleccionados se evaluaron para determinar la complementación intragénica de GS dentro del sistema de expresión de dos vectores para la generación de grupos productores de mAb en la línea celular inactivada de GS CHO-K1. Estas células se transfectaron con vectores de complementación intragénica A (LC:mutGS-CT) y B (HC:mutGS-NT) con las mutaciones indicadas en la secuencia de GS (mostrada en la Tabla 2 a continuación). Todas las combinaciones de mutGS-CT/mutGS-NT evaluadas pudieron recuperar aproximadamente 90 % de la viabilidad después de 25 días de pasar en el medio sin glutamina. Los grupos LC:mutGS-CT/HC:mutGS-NT de dos vectores tuvieron una caída de viabilidad mayor y les tomó más en recuperarse en el medio selectivo que los controles positivos de vector únicos con la GS de tipo salvaje.

Los grupos estables triplicados generados se evaluaron adicionalmente para determinar la expresión de mAb con un ensayo de producción de lote de alimentación de 10 días. Los ensayos de producción se configuraron a partir de cultivos de crecimiento de día 4 en divisiones 1:5 mediante la dilución en un medio de producción definido químicamente en 24DWPs (~0.5 x 106 células viables/ml). El crecimiento y la viabilidad del cultivo se controlaron los días 3, 6, 8 y 10 usando el ensayo Guava ViaCount (Millipore, Billerica, MA). Se realizaron alimentaciones en bolo los días 3, 6 y 8 con un medio de alimentación definido químicamente. La concentración de glucosa media se midió los días de alimentación usando el reactivo colorimétrico PolyChem (Polymedco, Cortlandt Manor, NY) y se ajustó a 12 g/L con una solución madre de glucosa al 50 %. La titulación del fin de la producción se determinó en sobrenadante de cultivo de día 10 por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) usando una columna A de Proteína POROS A/20. Todos los grupos generados con el sistema de dos vectores de complementación intragénica de GS que contenían cadenas de mAb individuales unidos mediante IRES a mutantes de GS individuales produjeron niveles de detección de anticuerpos; los valores se mostraron en la Tabla 2 (Ejemplo 3), a continuación.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe un método para aumentar la titulación de anticuerpo en los grupos transfectados aumentando la rigurosidad de la selección reduciendo la eficiencia de la unión de GS de IRES. La secuencia en las construcciones iniciales es la secuencia de EMCV de tipo salvaje hasta el ATG-12 que se fusionó al codón de inicio de GS (Davies y Kaufman, J Virol 66, 1924; 1992). La eficiencia del IRES se redujo usando una secuencia que antes demostró una selección y una amplificación eficaz (Aldrich et ál., BiotechnolProg 19, 1433; 2003). La secuencia de ADN de las uniones en la unión más eficiente (ED3) se compara con la secuencia de ADN de la unión menos eficiente (317) a continuación. Los números debajo de la secuencia de ED3 indican los ATG encontrados en el EMCV de WT. El último ATG denota el codón de inicio de GS.

317 GATGATAATACCCTCGAGATCCGTGCCATCATG (SEQ ID NO:23)

ED3 GATGATAATATGGCCACAACCATG (SEQ ID NO:24)

10 11 12

Los vectores de expresión eran idénticos a los indicados en la Figura 1 en vez de a la secuencia en la unión del IRES y GS. La transfección de las células con ambos plásmidos con una unión de IRES-GS menos eficiente tuvo como resultado menor viabilidad después de la transfección y con mayores tiempos de recuperación. Solo dos de tres transfecciones CT1-NT4 se recuperaron y ninguna de las otras combinaciones de mutIRES se recuperaron. Sin embargo, para las combinaciones de mutIRES que sí se recuperaron, el cultivo de lote de alimentación de día 10 proporcionó 0,55 gramos/L para un grupo y 0,17 g/L para el otro. La productividad específica de estos grupos fue de 16 p/c/d y 6,9 p/c/d, respectivamente. La titulación de 0,55 g/L excedió las anteriormente informadas y no requirió la clasificación FACS para lograrlo (Ye, J. et ál. Biotechnol Prog 26, 1431; 2010).

Tabla 2: Expresión de transfectantes de GS intragénicos

con uniones de IRES-GS diferentes

Las muestras etiquetadas CT1-NT1-4 y CT2-NT1-4 usaron toda la unión pED3 (SEQ ID NO:24). Las muestras etiquetadas mutIRES tienen menos IRES eficientes mostrado en la SEQ ID NO:23.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe otra estrategia para aumentar la selectividad de estos cultivos. Las transfecciones se realizaron como se describió en el Ejemplo 2, pero durante la selección un inhibidor de GS, MSX, se agregó a los cultivos para seleccionar los niveles más altos de expresión de GS. Uno de los tres cultivos de CT2-NT4 con el IRES más eficiente (es decir, no mutante) se recuperó mientras que ninguno de los CT1-NT4 ni ninguno de los transfectantes con un IRES mutante se recuperó. Para el único cultivo que se recuperó, un cultivo de lote de alimentación de 10 días proporcionó 0,29 gramos/L con una productividad específica de 9,18 p/c/d (ver Tabla 2 a continuación).

Ejemplo 5

Este ejemplo describe los resultados de una gran cantidad de transfecciones de CT1-NT4 de IRES mut. Estas construcciones tienen menos IRES eficientes mostrado en la SEQ ID NO:23. Un total de 88 transfecciones inactivadas de GS CHO-K1 se realizaron usando los vectores que contienen CT1-NT4 de IRES mut. Un total de 10 de las 88 transfecciones sobrevivieron a la selección y proporcionaron grupos de transfección con crecimiento robusto después de aproximadamente 25 días de cultivo y se comportaron de manera similar a la cantidad más pequeña de transfecciones en el ejemplo 2. Los grupos de GS de los grupos transfectados con simulación murieron después de 17 días en el medio sin glutamina.

Los grupos estables duplicados se evaluaron adicionalmente para determinar la expresión de mAb con un ensayo de producción de lote de alimentación de 10 días. Los ensayos de producción se configuraron a partir de cultivos de crecimiento de día 4 cosechados en un medio de producción definido químicamente en 24DWPs a 0,6 x 106 células viables/ml. El crecimiento y la viabilidad del cultivo se controló los días 3, 6, 8 y 10 usando el ensayo Guava ViaCount (Millipore, Billerica, MA). Se realizaron alimentaciones en bolo los días 3, 6 y 8 con un medio de alimentación definido químicamente. La concentración de glucosa media se midió los días de alimentación usando el reactivo colorimétrico PolyChem (Polymedco, Cortlandt Manor, NY) y se ajustó a 12 g/L con una solución madre de glucosa al 50 %. La titulación del fin de la producción se determinó en sobrenadante de cultivo de día 10 por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) usando una columna A de Proteína POROS A/20. Todos los grupos generados con el sistema de dos vectores de complementación intragénica de GS que contenían cadenas de mAb individuales unidos mediante IRES a mutantes de GS individuales produjeron niveles relativamente más altos de anticuerpos con dos grupos con un promedio superior a 1 g/L; los valores se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3: Expresión de transfectantes de GS CT1-NT4 intragénicos

con uniones de IRES-GS mut

Ejemplo 6

Este ejemplo describe un enfoque de complementación molecular para la glutamina sintetasa de la enzima. La enzima de glutamina sintetasa se expresó como dos fragmentos independientes y la actividad de la enzima se reconstituyó completamente mediante complementación genética de los dos fragmentos. Se creó una serie de construcciones que dividen la enzima de glutamina sintetasa en varios residuos. Estos puntos se basaron en la información de la estructura molecular de la enzima. Estas construcciones se probaron en un ensayo a base de células para determinar su capacidad de rescatar una línea celular que es deficiente en actividad de glutamina sintetasa. A partir de esta evaluación, se identificaron varios fragmentos capaces de rescatar completamente las células deficientes de glutamina sintetasa y por lo tanto demuestran que estos fragmentos se pueden asociar para crear una enzima de glutamina sintetasa completamente funcional.

Mucho del trabajo anterior sobre complementación de fragmentos de proteínas ha usado proteínas que existen como monómeros funcionales y cuyo rearmado solo requiere los fragmentos diseñados. Este trabajo demostró la capacidad de usar la complementación molecular para recapitular la actividad de ambos monómeros de GS y la formación posterior del complejo de enzimas funcional decamérico. Los fragmentos de proteínas de complementación se identificaron usando un enfoque de modelado molecular para observar las regiones en el monómero de GS que permitiría que la proteína se divida. También se agregó una cremallera de leucina (LZ) GCN4 y el enlazador flexible a los fragmentos separados para ayudar al rearmado. Los fragmentos analizados se muestran en la Tabla 4 y la secuencia de la proteína de GS murino se usada en estos estudios se muestran en la Tabla 5. Los fragmentos de GS se clonaron en un vector de expresión de mamífero y se transfectaron en células CHO que son deficientes en actividad de GS. Estas células normalmente pueden sobrevivir solo en medios de cultivo celular complementados con glutamina. La capacidad de estas construcciones de rescatar estas células se analizó para eliminar la glutamina del medio.

Tabla 4: Diseño del fragmento de complementación molecular de GS:

1. Extremo N -- E110 -- LZ LZ -- T111 -- Extremo C

2. Extremo N -- Y104 -- LZ LZ -- N105 -- Extremo C

3. Extremo N -- S125 -- LZ LZ -- N126 -- Extremo C

4. Extremo N -- N126 -- LZ Q127 -- Extremo C - LZ

5. Extremo N -- E264 -- LZ LZ -- N265 -- Extremo C

Extremo N LZ = MSDRMKQLEDKVEELLSKVYHLENEVARLKKLVGERGGGGSGGGGGS

Extremo C LZ = GGGGSGGGGGSSDRMKQLEDKVEELLSKVYHLENEVARLKKLVGER-STOP

Tabla 5: Secuencia de la enzima de GS de ratón usada en estos estudios y puntos de división destacados

1 MATSASSHLNKGIKQMYMSLPQGEKVQAMYIWVDGTGEGLRCKTRTLDCE

51 PKCVEELPEWNFDGSSTFQSEGSNSDMYLHPVAMFRDPFRKDPNKLVLCE

101 VFKYNRKPAETNLRHICKRIMDMVSNQHPWFGMEQEYTLMGTDGHPFGWP

151 SNGFPGPQGPYYCGVGADKAYGRDIVEAHYRACLYAGVKITGTNAEVMPA

201 QWEFQIGPCEGIRMGDHLWIARFILHRVCEDFGVIATFDPKPIPGNWNGA

251 GCHTNFSTKAMREENGLKCIEEAIDKLSKRHQYHIRAYDPKGGLDNARRL

301 TGFHETSNINDFSAGVANRGASIRIPRTVGQEKKGYFEDRRPSANCDPYA

351 VTEAIVRTCLLNETGDEPFQYKN*

Y 104 E 110 S 125 N 126 E 264

Como se muestra en la Figura 2, las construcciones 1, 2, 3 y 5 pudieron rescatar con éxito las células deficientes en glutamina sintetasa. Esto demuestra que estos fragmentos fueron capaces de formar una enzima de glutamina sintetasa completamente funcional in vivo. Se muestra un resumen de los resultados de rescate en la Tabla 6. Como control, se evaluó si alguno de los fragmentos A o B solos fueron capaces de rescatar la línea celular deficiente de glutamina sintetasa. Como se muestra en la Figura 4, ninguno de los fragmentos A o B solos pudieron rescatar la línea celular deficiente en

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un vector que comprende:

a) un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, y

b) un segundo ácido nucleico que codifica un mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) que tiene dos o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A,

donde la trascripción del primer ácido nucleico está unida de forma operativa a la transcripción del segundo ácido nucleico, que comprende además:

c) un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido donde el tercer polipéptido es capaz de asociarse con el primer polipéptido para formar una complejo heteromérico, y

d) un cuarto ácido nucleico que codifica un mutante de extremo C de glutamina sintetasa (mutGS-CT) que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A,

donde la transcripción del tercer ácido nucleico está unida de forma operativa a la transcripción del cuarto ácido nucleico, donde el mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) y el mutante de extremo C de glutamina sintetasa (mutGS-CT) interactúan para proporcionar actividad glutamina sintetasa y además, donde el vector es capaz de transfectarse en las células de mamífero y mejorar la selección de las células transfectadas.

2. Un sistema de expresión que comprende:

a) un primer vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que está unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico un mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) que tiene dos o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A, y

b) un segundo vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido que está unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un mutante de extremo C de glutamina sintetasa (mutGS-CT) que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A, que es capaz de asociarse con el mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) para proporcionar actividad glutamina sintetasa,

donde además el tercer polipéptido es capaz de asociarse con el primer polipéptido para formar un complejo heteromérico; y además donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y mejorar la selección de dichas células.

3. El vector o sistema de expresión de cualquier reivindicación precedente, donde el complejo heteromérico es una inmunoglobulina, opcionalmente donde el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de inmunoglobulina y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de inmunoglobulina.

4. El vector o sistema de expresión de cualquier reivindicación precedente, donde un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) ocurre en un sitio que se selecciona del grupo que consiste en:

a) un sitio entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico;

b) un sitio entre el tercer ácido nucleico y el cuarto ácido nucleico, y

c) en los sitios entre tanto el primero como el segundo, y el tercero y el cuarto ácido nucleico opcionalmente, donde el sitio interno de entrada al ribosoma comprende la SEQ ID NO:23.

5. El vector o sistema de expresión de cualquier reivindicación precedente, donde la mutGS-NT se selecciona del grupo que consiste en W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6), W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19); y la mutGS-CT se selecciona del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22).

6. Una célula hospedadora aislada transfectada, transformada o transducida con el vector o sistema de expresión de cualquier reivindicación precedente, opcionalmente donde la célula se selecciona del grupo que consiste en c Ho , VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, una línea celular de mieloma y células WI38.

7. Un método para producir un complejo heteromérico que comprende el paso de cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 6 en condiciones donde el complejo heteromérico es expresado por la célula hospedadora, opcionalmente en el que cuando la célula se transforma o transduce con el vector de cualquier reivindicación precedente, el complejo heteromérico es un anticuerpo.

8. El método de la reivindicación 7, que comprende además aislar el complejo heteromérico.

9. Un sistema de expresión que comprende un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa mutante en el extremo N (mutGS-NT), y un segundo vector que comprende un tercer ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa mutante de extremo C (mutGS-CT), donde el mutGS-NT comprende dos o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en W60A N61A D63A D63R S66A y D76A y el mutGS-CT comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A y R324A en donde cada subunidad mutante de glutamina sintetasa no tiene una actividad glutamina sintetasa cuando se expresa sola y la coexpresión de mutGS-NT con el mutGS-CT proporciona actividad de glutamina sintetasa, donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y de mejorar la selección de las células transfectadas.

10. El sistema de expresión de la reivindicación 9 donde la mutGS-NT se selecciona del grupo que consiste en W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6), W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19); y la mutGS-CT se selecciona del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22).

11. Un sistema de expresión que comprende un primer vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un primer ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado, unido de forma operativa a un segundo ácido nucleico que codifica un mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) que tiene mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en W60A N61A D63R S66A y combinaciones de los mismos, y un segundo vector que codifica una transcripción bicistrónica que comprende un tercer ácido nucleico, unido de forma operativa a un cuarto ácido nucleico que codifica un mutante de extremo C de glutamina sintetasa (mutGS-CT) que tiene mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A N248A H253A N255A R319A R324A y combinaciones de los mismos, en donde el mutante de extremo N de glutamina sintetasa (mutGS-NT) y el mutante de extremo C de glutamina sintetasa (mutGS-CT) se asocian para proporcionar actividad glutamina sintetasa, y además donde el sistema de expresión es capaz de transfectarse en células de mamífero y mejorar la selección de las células transfectadas, y donde el primer ácido nucleico codifica una cadena pesada de anticuerpo y el tercer ácido nucleico codifica una cadena ligera de anticuerpo.

12. El sistema de expresión de la reivindicación 11 en donde el mutGS-NT se selecciona del grupo que consiste en W60A N61A D63A (mutGS-NT1; SEQ ID NO:6), W60A N61A D63A S66A (mutGS-NT2; SEQ ID NO:10) W60A N61A D63A S66A D76A (mutGS-NT3; SEQ ID NO:25), y W60A N61A D63R S66A (mutGS-NT4; SEQ ID NO:19); y la mutGS-CT se selecciona del grupo que consiste en E134A E136A E196A E203A (mutGS-CT1; SEQ ID NO:21) y N248A H253A N255A (mutGS-CT2; SEQ ID NO:22).

13. Una célula hospedadora aislada transfectada, transformada o transducida con el sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.