EA011879B1 - МОЛЕКУЛЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ Fc ФРАГМЕНТОМ - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к молекулам и способу, где один или более биологически активный пептид включен в Fc домен. В данном изобретении фармакологически активные соединения могут быть получены способом, включающим: а) выбор по меньшей мере одного пептида, который модулирует активность представляющего интерес белка, и б) получение фармакологического агента, содержащего аминокислотную последовательность выбранного пептида в области петли Fc домена. Указанный способ можно применять для модификации Fc домена, который уже связан через N- или С-конец или через боковую цепь с пептидом или полипептидом (например, этанерцепт). Этот способ можно также применять для модификации Fc домена, который является частью антитела (например, такого как адалимумаб, эпратузумаб, инфликсимаб, Герцептин® и т.п.). Таким образом, можно получать разные молекулы, имеющие дополнительные функциональные активности, такие как домен, связывающийся с различными эпитопами, или дополнительный домен, связывающийся с молекулой-предшественником существующего эпитопа. Пептид можно выбрать, например, с помощью фагового дисплея, дисплея Е. coli, рибосомного дисплея, скрининга РНК-пептидов, скрининга в дрожжах, химико-пептидного скрининга, рационального дизайна или структурного анализа белков.

Description

Заявка на данный патент испрашивает приоритет по заявке США № 60/612680, поданной 24 сентября 2004 г., включенной в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Успех препарата ЕиЬге1® (этанерцепт) ознаменовал собой появление терапевтических агентов, модифицированных присоединением константной области антитела. Антитело состоит из двух функционально независимых частей, вариабельной области, называемой «ЕаЬ», которая связывается с антигеном, и константной области, называемой «Ес», определяющей такие эффекторные функции, как активацию комплемента и взаимодействие с фагоцитами. У Ес большой период полужизни в сыворотке, а ЕаЬ является короткоживущим, см. Сароп е! а1. (1989), Ыа1иге 337:525-31. При объединении с терапевтическим белком домен Ес может увеличивать период полураспада или придавать такие функции, как связывание с рецептором Ес, связывание с белком А, фиксацию комплемента и, вероятно, даже проникновение через плаценту. И. В табл. 1 суммирована информация, касающаяся применения гибридных с Ес белков, известных в данной области.

Таблица 1. Слияние Ес с терапевтическими белками

Форма Ес	Партнер для слияния	Т ерапевтическое применение	Ссылки
|д61	Ν-конец СОЗО-б	болезнь Ходжкина, анапластическая лимфома; Т-кпеточная лейкемия	Патент США N 5,480,981
Гсу2а мыши	ИЛ-10	противовоспалительный агент; отторжение трансплантата	г(1епое1а1. (1995).3. ΙπηπΜΐηοΙ. 154: 5590-600
1дО1	рецептор ΤΝΡ	септический шок	Р)з6ег е( а!. (1996), Ν.

ЕпдЫ_МеЗ_ 334: 16971702; Уал гее, К. е(а!. (1996), 3,1ттипо1. 156:

_______________________________________________________________2221-30_________________ 1дС, 1дА, 1дМ или рецептор ΤΝΡ воспаление; аутоиммунные Патент США N 5,808,029, 1дЕ (исключая заболевания опубликован 15 сентября первый домен)_________________________________________________1998____________________

1д61 рецептор 0ϋ4 СПИД Сароп е! а1. (1989). МаШге ____________________________________________________________________337: 525-31_______________ 1дС1 Ν-конец ИЛ-2 противораковый, НагуИ! е( а1. (1995), !д(33_________________________________противовирусный агент______1ттипо1ес)1. 1: 95-105

1д(31 С-конец ОРС остеоартрит; нарушение УТО 97/23614, плотности костей опубликована 3 июля ________________________________________________________________1997____________________ 1дС1 Ν-конец лептина против ожирения 1Λ/Ο 98/28427, поданная ________________________________________________________________11 декабря 1997__________ 1дСу1 человека СТ1А-4 аутоиммунные заболевания 6ίη$Ιβν (1991). 3. Ехр. Мес).

____________________________________________________________________174:561-9_________________

Совершенно другой подход к разработке терапевтических агентов представляет собой скрининг библиотек пептидов. Взаимодействие белкового лиганда с рецептором зачастую происходит на относительно большом участке поверхности взаимодействия. Однако, как показано на примере гормона роста человека и его рецептора, лишь несколько ключевых участков на поверхности взаимодействия вносят вклад в энергию связывания. С1аск§оп е! а1. (1995), 8аепсе 267: 383-6. Основная часть белкового лиганда обеспечивает правильную топологию эпитопов или выполняет функции, не имеющие отношения к связыванию. Таким образом, лишь молекулы «пептидной» длины (от 2 до 40 аминокислот) могут связываться с рецептором данного большого белкового лиганда. Подобные пептиды могут имитировать биологическую активность большого белкового лиганда («пептидные агонисты») или путем конкурентного связывания ингибировать биологическую активность большого белкового лиганда («пептидные антагонисты»).

Эффективным способом идентификации подобных пептидных агонистов и антагонистов оказались библиотеки пептидов, созданные способом фагового дисплея. См., например, работы 8сой е! а1. (1990), 8аепсе 249: 386; Оеу1ш е! а1. (1990), 8аепсе 249: 404; патент США № 5223409, опубликованный 29 июня 1993; патент США № 5733731, опубликованный 31 марта 1998; патент США № 5498530, опубликованный 12 марта 1996; патент США № 5432018, опубликованный 11 июля 1995; патент США № 5338665, опубликованный 16 августа 1994; патент США № 5922545, опубликованный 13 июля 1999; \УО 96/40987, опубликованная 19 декабря 1996; и XVО 98/15833, опубликованная 16 апреля 1998 (все включены в настоящую заявку посредством ссылок). В подобных библиотеках случайные пептидные последовательности представлены через слияние пептида с белком оболочки нитевидного фага.

Обычно представленные пептиды являются аффинно очищенными при помощи иммобилизованного на антителе внеклеточного домена рецептора. Удерживаемые фаги можно обогатить путем последовательных циклов аффинной очистки и повторной репродукции. Пептиды, связывающиеся наилучшим образом, можно секвенировать для определения ключевых остатков в пределах одного или более структурно схожих семейств пептидов. См., например, работу С\\тг1а е! а1. (1997), 8с1епсе 276: 1696-9, в кото

- 1 011879 рой были идентифицированы два различных семейства. На основе первичных последовательностей пептидов можно также предположить, какие остатки можно безошибочно заменить посредством «сканирования аланином» или путем мутагенеза на уровне ДНК. Для дальнейшей оптимизации последовательности наилучшим образом связывающихся молекул могут быть созданы и проскринированы библиотеки мутантных форм. Ьо^тап (1997), Αηη. Κον. Вюрйуз. Вюто1. 81гис1. 26: 401-24.

Известны и другие методы исследования пептидов, конкурирующие с методом фагового дисплея. Библиотеку пептидов можно объединить с С-концом 1ас-репрессора и экспрессировать в Е. со11. С помощью другого метода с применением Е.сой возможно осуществить дисплей на наружной клеточной мембране путем слияния с липопротеином, ассоциированным с пептидогликаном (рерббод1усап-а88ос1а1еб 11рорто1ет, РАБ). В дальнейшем эти и схожие с ними способы в совокупности упоминаются как «Е. со11 дисплей». В другом биологическом подходе для скрининга композиций растворимых пептидов используются дрожжи для экспрессии и секреции. См. διηίΐΐι е1 а1. (1993), Мо1. Рйаттасо1. 43: 741-8. В дальнейшем способ Смита и соавторов (8тйй е1 а1.) и схожие способы упоминаются как «скрининг в дрожжах». В другом способе обрывают трансляцию произвольных молекул РНК до диссоциации рибосомы, в результате чего получают библиотеку полипептидов с еще присоединенными к ним молекулами ассоциированных РНК. В дальнейшем этот и схожие с ним способы в совокупности упоминаются как «рибосомный дисплей». В других способы применяют химическое связывание пептидов с РНК; см., например, Роберт РоЬейз & 8хоз1ак (1997), Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А. 94: 12297-303. В дальнейшем, этот и схожие способы в совокупности упоминаются как «РНК-пептидный скрининг». Были разработаны полученные химическими способами пептидные библиотеки, в которых пептиды иммобилизуют на стабильных небиологических материалах, таких как полиэтиленовые стержни или проницаемые для растворителей полимеры. В другой полученной химическими методами библиотеке пептидов используют фотолитографию для сканирования пептидов, иммобилизованных на предметных стеклах. В дальнейшем эти и схожие способы в совокупности упоминаются как «химико-пептидный скрининг». Преимущество химикопептидный скрининга может состоять в том, он позволяет применение Ό-аминокислот и других искусственных аналогов, а также непептидных элементов. Обзор как биологических, так и химических способов приведен в работе \Уе11з & Ьо^тап (1992), Сигг. Орт. Вю1ес1то1. 3: 355-62.

В случае известных биоактивных пептидов может быть выполнен рациональный дизайн пептидных лигандов с подходящими терапевтическими свойствами. В таком способе вносят пошаговые изменения в последовательности пептида и определяют влияние замены на биоактивность или прогнозируемую биофизическую характеристику пептида (например, структуру раствора). В дальнейшем эти способы в совокупности упоминаются как «рациональный дизайн». В одном из таких способов получают серию пептидов, в каждом из которых заменяют один из остатков на аланин. Эту технику обычно называют «аланиновая прогулка» (а1ашпе \уа1к) или «аланиновое сканирование» (а1ашпе зсап). Когда заменяют два остатка (последовательных или расположенных отдельно), это называется «двойной аланиновой прогулкой» (боиЬ1е а1ашпе \\'а1к). Образующиеся в результате аминокислотные замены могут быть использованы по отдельности или в комбинации с получением новой молекулы пептида с подходящими терапевтическими свойствами.

Структурный анализ белок-белкового взаимодействия также можно применять для определения предполагаемых пептидов, имитирующих активность связывания у больших белковых лигандов. В таком способе анализа кристаллическая структура может указывать на особенность и относительную ориентацию ключевых остатков большого белкового лиганда, на основе которых может быть сконструирован пептид. См., например, е1 а1. (1997), Ыа1иге Вю1ес11. 15: 1266-70. В дальнейшем эти и схожие способы упоминаются как «структурный анализ белка». Такие аналитические способы можно также применять для исследования взаимодействия между рецепторным белком и пептидами, выбранными при помощи фагового дисплея, на основе которых можно предложить дальнейшую модификацию пептидов для увеличения сродства связывания.

В принципе можно обнаружить пептидные миметики любого белка с применением способа фагового дисплея и других способов, упоминаемых выше. Эти способы были использованы для картирования эпитопов, для идентификации ключевых аминокислот в белок-белковом взаимодействии, и наконец, для открытия новых терапевтических агентов. Например, Сойезе е1 а1. (1996), Сигг. Орт. Вю1ес11. 7: 616-21. Библиотеки пептидов сейчас используют чаще всего для иммунологических исследований, например, для картирования эпитопов. Кгеедег (1996). Тйе 8с1епбз1 10(13): 19-20.

Особый интерес представляет применение библиотек пептидов и других технологий для обнаружения фармакологически активных пептидов. Ряд таких пептидов, идентифицированных в данной области техники, приведен в табл. 2. Пептиды описаны в перечисленных публикациях, каждая из которых включена здесь посредством ссылки. Описана фармакологическая активность пептидов, и во многих примерах за ней следует краткое пояснение в круглых скобках. Некоторые из этих пептидов модифицированы (например, с формированием сшитых с С-концов димеров). Обычно библиотеки пептидов скринируют на связывание с рецептором фармакологически активных белков (например, рецептор ЕРО (эритропоэтина)). По меньшей мере в одном из примеров (СТБА4), библиотека пептидов проскринирована на связывание с моноклональным антителом.

- 2 011879

Таблица 2. Фармакологически активные пептиды

Форма пептида	Партнер связывания/ Интересующий белок'	ДЛЯ
Фармакологическая активность	Ссылки
внутренний пептид, связанный дисульфидной связью	рецептор ЕРО	миметик ЕРО	ΜπαΟΙοη е( а!. (1996), Заепсе 273: 458-63; Патент СШ №. 5,773,569, опубликован 30 июня 1998 , Μπη6(οη е1 а!
Димер с поперечной	рецептор ЕРО	миметик ЕРО	Ыупаб е1 а1. (1996), ЗФепсе 273: 464-71;

'Белки, перечисленные в этой колонке, могут связываться с ассоциированными пептидами (например, рецептор ЕРО, рецептор ИЛ-1) или имитировать ассоциированные пептиды.

Ссылки, перечисленные в каждом случае, поясняют, связываются ли пептиды с молекулой или имитируют ее.

поперечной Заепсе 273: 464-71;

сшивкой по С- УУпдЫоп е1 а1. (1997).

концу Ыа1иге Вю(ес1чпо1оду

15:1261-5; Международная заявка на патент МО 96/40772, опубликована 19 декабря, 1996

линейный	рецептор ЕРО	миметик ЕРО	Ыагапда е1 а1. (1999), Ргос. ИаИ. Асай. За.
иЗА, 96: 7569-74; \Л/О 99/47151, опубликована 23 сентября, 1999
линейный; димер с поперечной сшивкой по Сконцу	с-Мр!	миметик ТРО	Смг1а е1 а!.! 199/1 Заелсе 276: 1696-9: Патент США № 5,869,451, опубликована 9 февраля, 1999;; МО 00/24770, опубликован Мау 4, 2000; Заявка на Патент США № 2003/0176352, опубликован 18 сентября, 2003; МО 03/031589, опубли кован 17 апреля, 2003
димер с дисульфидной связью		Стимулирование гематопоэза («миметик С-СЗР»)	РаикоуКз е1а1, (19841. НовоеЗеу1еге Ζ. ΡΙηνδίοΙ. Сбет. 365:303-11; !_аегит е(ак (1988), Ехр. Нета1. 16: 27480
алкиленсвязанный димер		миметик О-СЗР	ВбаТпадаг е1 а1. (19961. 1 Мед. Сбет. 39: 3814-9; СиЮбедвоп е1 а1. (19971, ΰ. Мед. Сбет. 40: 2876-82; Кпд е1 а1. (1991). Ехр. Нета1о1. 19:481: Κίηα е( а1. (19951. В1оод 86 (Зирр1. 11: 309а
линейный	рецептор ИЛ-1	воспалительные аутоиммунные заболевания («агонист ИЛ-1» или «миметик ИЛ-1 Ра»)	и Патент США № 5,608,035; Патент США № 5,786,331: Патент США № 5,880,096; УапоГзку е! а!. (19961, Ргос. ΝβΙΙ. Асад. Зек 93: 7381-6: Акезоп е! а!. (1996), ΰ ΒίοΙ. Сбет. 271: 30517-23;

- 3 011879 \Мекготек е!а1.

(1997), ΡοΙ. + РЬагтасо!. 49:10717; УалоГзку (1996), ΡΝΑ5, 93:7381-7386.

линейный	тимусный сывороточный фактор (1ас1еиг ΙΙψτηίηιιβ зеадие, РТЗ)	Стимулирование лимфоцитов («миметик РТЗ»)	1падак1-ОЬага е! а1. (1996). СеНи1ат 1ттипо1. 171: 30-40; УозЫба (1984), !гй. Ί. 1ттилорЬаттасо1. 6:141-6.
внутренний пептид, связанный дисульфидной связью	СПА4 МАЬ	миметик СТ1.А4	Рикито1о е1 а1. (1998). Ыа1иге Вю(есЬ. 16: 267-70
экзоциклический	рецептор ΤΝΡ-α	антагонист ΤΝΡ-α	Таказак! е( а!. (1997), ΝθίιΐΓβ Вго1есН. 15:1266-70; УУО 98/53842, опубликован 3 декабря, 1998
линейный	рецептор ΤΝΡ-α	антагонист ΤΝΡ-α	СЫппоз-^аз ( ), 1 1тт„ 5621-5626.
внутренний пептид, связанный дисульфидной связью	СЗЬ	ингибирование активации комплемента; аутоиммунные заболевания («антагонист СЗЬ»)	ЗаПи еТ а!. (1996), 1 1ттипо1.157: 884-91; Мопк1зе1а1. (1998), ΡΓΟίβίη Зет 7. 619-27
линейный	винкулин	процессы клеточной адгезии—клеточный рост, дифференцировка, заживление ран, опухолевые метастазы («винкулинсвязывающийся»)	Абеу е) а!. (1997), Вюсбет. ϋ. 324; 5238
линейный	С4-связывающийся белок (С4Ыпб1пд ρτοίείη, С4ВР)	противотромбозный	1_1пзе е! а!. (1997), 1 ΒίοΙ. СЬет. 272: 14658-65
линейный	Рецептор урокиназы	процессы, связанные с взаимодействием урокиназы с ее рецептором (например, ангиогенез, инвазия опухолевых клеток и метастазы); («антагонист икн»)	бообзоп е( а1. (1994), Ргос. Иа(1. Асаб. Зек 91: 7129-33; Международная заявка 1Λ/Ο 97/35969, опубликована 2 октября, 1997
линейный	Мбт2, Нбт2	Ингибирование инактивации р53, опосредованной Мбгп2 или Ьбт2; противоопухолевый («антагонист МбтМт»)	Р|скз1еу е1а1. (1994), Олсоаепе 9: 2523-9: Войдет е1а1. (1997)6. ΜοΙ. ΒϊοΙ. 269: 744-56; Войдет е1а1. (1996), Опсоаепе 13: 2141-7
линейный	ргт·*·1	противоопухолевый агент, имитирующий активность ρΖΙ^	ВаН е1а1. (1997), Сигг. ΒίοΙ. 7: 71-80
линейный	фарнезилтрансфераза	противоопухолевый агент, предотвращающий активацию онкогена гав	СйэЬз е( а1. (1994), СеИ 77:175-178
линейный	домен эффектора Ваз	противоопухолевый	Μοο6ίβ е1а1. (1994),

- 4 011879 агент, ингибирующий Тгепд® 6епе( 10:44биологическую функцию 48 онкогена га® Кодпдиеге1а1.

(1994), №(иге 370:527-532

линейный	8Н2/ЗНЗ домены	противоопухолевый агент, ингибирующий опухолевый рост с участием активированных тирозин киназ; лечение болезненных состояний, опосредованных ЗНЗ («антагонист ЗНЗ»)	Раиггоп е( а1 (1993), Сигг. ΒίοΙ. 3:434-432 Υιι е1 а1 (1994). Се11 76:933-945; Нюк1е« е1 а1. (1994). ЕМВО1 13: 5598-5604; Зрагк® е1а1. (1994), 3. ΒίοΙ. СМет 269: 23853-6; Зрагк® е1 а1. (1996), Ргос. Νθ(Ι, Асад. Зек
			93:1540-4; из Ра1. Νο. 5,886,150,1®®иед МагсН 23,1999; 63 Рак Νο. 5,888,763, |®®иед МагсН 30, 1999
линейный	р161Ж’	противоопухолевый агент, имитирующий активность р16;например, ингибирующий комплекс цикпина ϋ-Сдк («миметик р16»)	ЕйЬгаеи® е( а!. (1996), Сигг. ΒίοΙ. 6:84-91
линейный	Зге, Ьуп	ингибирование активации тучных клеток, патологические состояния, связанные с |дЕ, гиперчувствительность I типа («антагонист тучных клеток»)	31аиКегека1. (1997), ВюсНет. 36: 9388-94
линейный	протеаза тучных клеток	лечение воспалительных заболеваний, опосредованных высвобождением триптазы-6 («ингибиторы протеаз Маз(се11»;	Международная заявка ννο 98/33812, опубликована 6 августа, 1998
линейный	коровый антиген вируса гепатита В (НВУ) (НВсАд)	лечение инфекций вирусом гепатита В («против НВУ»)	Оузоп & Мигау (1995). Ргос. ΝβΙΙ. Асад. 8с1 92: 2194-8
линейный	селектины	адгезия нейтрофилов; воспалительные заболевания («антагонист селектина»)	Маг1еп® е( а1. (1995), 3. ΒίοΙ. СНет. 270: 21129-36; Заявка на Европейский патент ЕР 0 714 912, опубликована 5 июня, 1996
линейный, циклизированный	кальмодулин	антагонист кальмодулина	Р1егсе е( а(. (1995), Мо1ес. ΟίνεΓ$ί(ν 1: 259-65; Оедтап е* а1. (1993). 3. ΒίοΙ. СЬет. 268: 23025-30; Адеу & Кау (1996), беле 169: 133-4
линейный, циклизированный	интегрины	присутствующий в опухолях; лечение	Международные заявки: УУО 95/14714,

- 5 011879

состояний, связанных с	опубликована 1
опосредованных	июня, 1995; ννθ
интегриномклегочных	97/08203,
событий, включающих	опубликована 6
аггрегацию тромбоцитов,	марта, 1997; УУО
тромбоз, заживление ран,	98/10795,
остеопороз, заживление	опубликована 19
тканей, ангиогенез	марта, 1998; 1Λ/Ο
(например, для лечения	99/24462,
рака) и инвазия опухолей	опубликована 20
(«интегрин-	мая, 1999; Кгайе(а1.
связывающийся)	(1999), X ΒϊοΙ. СЬет. 274: 1979-1985

циклический, линейный линейный фибронектин компоненты внеклеточного матрикса Т-кпеток макрофагов соматостатин кортистатин и лечение воспалительных И/О 98/09985, и аутоиммунных опубликован 12 патологических состояний марта, 1998 и и лечение или предотвращение гормонпродуцирующих опухолей, акромегалия, гигантизм, деменция, язва желудка, рост, секреции модуляция сна или или опухолевый ингибирование гормонов,

Заявка на Европейский патент 0 911 393. опубликована 28 апреля, 1999 нейронной активности

линейный	бактериальный липополисахарид	антибиотик; септический шок; заболевания модулируемые САР37	Патент США № 5,877,151, опубликован 2 марта, 1999
линейный или циклический, содержащий Оаминокислоты	пардаксин, меллитин	антипатогенный	ννθ 97/31019, опубликован 28 августа, 1997
линейный, циклический	νιρ	импотенция, нейродегенеративные заболевания	ννθ 97/40070, опубликован 30 октября, 1997
линейный	СТЬз	рак	ЕР 0 770 624, опубликован 2 мая, 1997
линейный	ТНР-гамма2		Витз1е1П (1988), ВюсНет., 27:4066-71.
линейный	Амилин		Соорег (1987), Ргос. Ыа11. Асаб. 5οΐ.. 84:8628-32.
линейный	Адреномедуллин		Кйатига (1993), ВВКС, 192:553-60.
циклический, линейный	1/ЕСЕ	противоангиогенный; рак, ревматоидный артрит, диабетическая ретинопатия, псориаз («антагонист νΕ6Ε»)	Ра1гЬго111ег (1998), ВюсНет.. 37:1775417764.
циклический	ММР	воспалительные и аутоиммунные заболевания; опухолевый рост («ингибитор ММР»)	Κοίνιιηβη (1999), Шига Вю1есГ>.. 17:768-774.

- 6 011879

	фрагмент НСН	лечение ожирения	Патент США N8 5,869,452
	эхистатин	ингибирование агрегации тромбоцитов	бал (1988). 3. ΒίοΙ. СЬет., 263:19827-32.
линейный	СКВ аутоантитело	СКВ (системная красная волчанка)	ννθ 96/30057, опубликован 3 октября, 1996
	СО1 альфа	супрессия опухолевых метастаз	1з111качуа е(а1. (1998), РЕВЗ Бей. 441 (1): 20-4

антифосфолипидные антитела к бета-2гликопротеину-1 (02ΟΡΙ) клеток активация эндотелия, антифосфолипидный синдром (АФС), тромбоэмболический феномен, тромбоцитопения, и рецидивирующая потеря плода

В1апк е1а1. (1999), Ргос. ИаН. Асас1. За. ЦЗА96: 5164-8

линейный	бета цепь Т-клеточных диабет рецепторов	ννθ 96/11214, опубликован 18 апреля, 1996.
	антип ролиферативны й,	ννθ 00/01402,
	противовирусный	опубликован 13 января, 2000.
	противоишемический,	ννθ 99/62539,
	высвобождающий	опубликован 9
	гормоны роста	декабря, 1999.
	п ротивоангиоген ный	ννθ 99/61476, опубликован 2 декабря, 1999.

линейный агонист лечение связанных (например, заболеваний, инфекций, лейкемии, апоптоза; заболеваний, с Т-клетками аутоиммунных вирусных Т-клеточной Т-клеточной ννο 99/38526, опубликован 5 августа, 1999.

линейный	ГКГС II класса	лечение аутоиммунных заболеваний	Патент США № 5,880,103, опубликован 9 марта, 1999.
линейный	андроген К, р75, Μϋϋ, ОСС, хантингтин	проапоптотический, применим для лечения рака	ννθ 99/45944, опубликован 16 сентября, 1999.
линейный	фактор фон Виллебранда; Фактор VIII	Ингибирование взаимодействия Фактора VIII; антикоагулянты	ννθ 97/41220, опубликован 29 апреля, 1997.
линейный	ББР1 лентивируса	противомикробный	Патент США № 5,945,507, опубликован 31 августа, 1999.
линейный	Дельтасониндуцирующий пептид	нарушения сна	6га( (1986). РерНРев 7:1165.
линейный	С-реактивный белок (ЦРБ)	воспаление и рак	Вагпа (1994). Сапсег ΙτηπυηοΙ. 1гптипо№ег.
		38:38 (1994).
линейный	сперма-акгивирующий	бесплодие	Зигик! (1992), Сотр.

- 7 011879 пептид линейный ангиотензин гематопоэтические факторы для состояний, характеризующихся снижением

ВюсЬет. РМузю!.

102В:679.__________

Ёипс1егдап (1999), 1 Рег1О0ол1а1 вез. 34(4):223-228.

гематокритного числа при раке, СПИДе, и т. п.

линейный	Ηΐν-1 др41	против СПИДА	СЬап (1998), Се11 93:681-684.
линейный	РКС	ингибирование резорбции костей	Моопда (1998), Ехр. ΡΓιΥδίοΙ. 83:717-725.
линейный	Дефенсины (ΗΝΡ-1, -2, -3, -4)	противомикробный	Намд (1994), ΜβΙΚοόδ Εηζ. 236:160-172.
линейный	р185™дави, С-егЬВ-2	миметик ΑΗΝΡ: противоопухолевый	Рагк (2000), №. ΒϊΟίβοΠποΙ. 18:194198.
линейный	др130	анатгонист ИЛ-6	У7О 99/60013, опубликован 25 ноября, 1999.
линейный	коллаген, другие пептиды, связанные с суставами, хрящем, артритом	аутоиммунные заболевания	ννο 99/50282, опубликова 7 октября, 1999.
линейный	белок оболочки Н!У-1	лечение неврологических дегенеративных заболеваний	ννο 99/51254, опубликован 14 октября, 1999.

линейный

ИЛ-2 аутоиммунные заболевания (например, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит) линейный, циклический различные линейный, циклический

Апд-2

ΝΟΕ \Л/О 00/04048, опубликован 27 января, 2000; 1Λ/Ο 00/11028, опубликован 2 марта, 2000.________ воспалительные Патент США № состояния, аутоиммунные 6,660,843 заболевания, другие__________________________ ингибирование Заявка на Патент ангиогенеза (например, США № для лечения опухолей) 2003/0229023, опубликована 11 декабря, 2003; ννο 03/057134, опубликован 7/17/03; США 2003/0236193, опубликован 25 __________________________декабря, 2003______ ’ 1Λ/Ο 04/026329, опубликован 1 апреля, 2004 хроническая мигрень, гиперактивный пузырь, Другие состояния, Ν6Ε боль, астма, мочевой псориаз, рак, патологические связанные с миостатин

Патент США №

10/742,379, поданный 19 декабря, 2003;

РСТ/Ц503/40781, поданный 19 декабря, 2003

	ВАЕЕ/ТАЦ.-1	опосредованные в- клетками аутоиммунные заболевания и опухоли (например, волчанка, Вклеточная лимфома)	Патент США 2003/0195156, опубликован 16 октября, 2003; ννο 02/092620, опубликован 21 ноября, 2002
линейный	СЁР-1	Диабет, метаболический синдром

Пептиды, идентифицированные при скрининге библиотек пептидов, долгое время рассматривали просто как «ключ» к разработке терапевтических агентов, а не как сами терапевтические агенты. Как и другие белки и пептиды, они должны быстро удаляться ίη νίνο либо посредством почечной фильтрации, механизмами уничтожения клеток в ретикулоэндотелиальной системе или путем протеолитической деградации. Егапей (1992), Росик οη Сго\\!11 Рас1ог5 3: 4-11. В результате в данном способе применяют идентифицированные пептиды для подтверждения мишеней лекарства или в качестве основы для конструирования органических соединений, которые не могли быть так легко и так быстро идентифицированы при помощи скрининга химических библиотек. Ьо^тап (1997), Αηη. Βον. Вюрйук. Вюто1. 81гис1. 26:

- 8 011879

401-24; Кау е! а1. (1998), Эгид Όίδο. Тобау 3: 370-8.

Более поздней разработкой является слияние случайным образом созданных пептидов с Бе доменом. См. Патент США № 6660843, опубликованный 9 декабря 2003, Бе1де е! а1. (включенный ссылкой в полном объеме). Такие молекулы сейчас известны как «пептитела» (рербЬоб1е₈). Они включают один или несколько пептидов, соединенных по Ν-концу, С-концу, по боковой цепи аминокислоты или более чем по одному из этих сайтов. Технология пептител позволяет конструировать терапевтические агенты, которые содержат пептиды, которые имеют мишенью один или несколько лигандов или рецепторов, пептиды, характерные для опухолей, транспортируемые через мембрану пептиды, и т. п. Технология пептител оказалась полезной для конструирования ряда такого рода молекул, включая линейные и связанные дисульфидными мостиками полипептиды, «тандемные пептидные мультимеры» (т.е. более одного пептида на одной цепи домена Бс). См., например, патент США № 6660843; патент США № 2003/0195156, опубликованный 16 октября, 2003 (соответствует XVО 02/092620, опубликованной 21 ноября, 2002); заявку на патент США № 2003/0176352, опубликованной 18 сентября, 2003 (соответствует νθ 03/031589, опубликованной 17 апреля, 2003); патент США № 09/422838, поданный 22 октября, 1999 (соответствует νθ 00/24770, опубликованной 4 мая, 2000); заявку на патент США № 2003/0229023, опубликованную 11 сентября, 2003; νθ 03/057134, опубликованную 17 июля, 2003; заявку на патент США № 2003/0236193, опубликованную 25 декабря, 2003 (соответствует РСТ/И804/010989, поданного 8 апреля, 2004); патент США № 10/666480, поданный 18 сентября, 2003 (соответствует νθ 04/026329, опубликованной 1 апреля, 2004), включенные посредством ссылки в полном объеме. Дальнейшее развитие технологий, облегчающих такого рода рациональный дизайн лекарств, внесет полезный вклад в данную область техники.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу, в котором по меньшей мере один биологически активный пептид включен в качестве внутренней последовательности в домен Бс. Такая внутренняя последовательность может быть добавлена путем вставки (т.е. интеграции между соседними аминокислотами в существующий домен Бс) или путем замены аминокислот в существующем домене Бс (т. е. путем удаления аминокислот в существующей области Бс и добавления аминокислот пептида). В последнем случае не требуется, чтобы количество добавленных аминокислот пептида соответствовало количеству аминокислот, удаленных из прежде существующего домена Бс; например, настоящее изобретение относится к молекуле, в которой были удалены 10 аминокислот и были добавлены 15 аминокислот. В настоящем изобретении фармакологически активные соединения получают способом, включающим:

а) выбор по меньшей мере одного пептида, модулирующего активность представляющего интерес белка; и

б) получение фармакологического агента, который содержит аминокислотную последовательность выбранного пептида в качестве внутренней последовательности домена Бс.

Этот способ можно применять для модификации домена Бс, который уже связан через Ν- или Сконец или боковую цепь с полипептидом (например, этанерцепт) или с пептидом (например, как описано в заявках на патент США №№ 2003/0195156, 2003/0176352, 2003/0229023 и 2003/0236193; νθ 00/24770; νθ 04/026329). Описанный способ можно также применять для модификации домена Бс, который является частью антитела (например, адалимумаба, эпратузумаба, инфликсимаба, Герцептина® и т.п.). Таким образом, могут быть получены различные молекулы, имеющие дополнительные функции, такие как домен для связывания с эпитопом или дополнительные домены для связывания с эпитопом молекулыпредшественника. Пептид может быть выбран, например, при помощи способа фагового дисплея (который является предпочтительным), способа дисплея на Е. со11, рибосомным дисплеем, РНК-пептидного скрининга, скрининга в дрожжах, химико-пептидного скрининга, рационального дизайна или структурного анализа белков, или может представлять собой природный пептид (например, РТН, СЬР-1).

Изобретение также относится к молекулам, которые содержат домен Бс, модифицированный посредством включения пептида в качестве внутренней последовательности (предпочтительно в области петли) домена Бс. Молекулы, которые содержат последовательность пептида в своей внутренней области, названы здесь «Бс-внутренние пептитела» или «Бс-внутренние пептидные молекулы». Эти молекулы описаны в тексте ниже.

Бс-внутренние пептидные молекулы могут содержать более одной пептидной последовательности, расположенной тандемно, в конкретной внутренней области, и они могут также содержать пептиды в других внутренних областях. Хотя предполагаемые области петель являются предпочтительными, вставки в любые другие нетерминальные области Бс также считаются частью настоящего изобретения. Варианты и производные вышеуказанных соединений (описанные ниже) также охвачены настоящим изобретением.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены стандартными способами синтеза, способами рекомбинантной ДНК или любыми другими способами для получения пептидов и гибридных белков.

Основным способом применения, предусмотренным для Бс-внутренних пептидных молекул, является применение в качестве терапевтических или профилактических агентов. Выбранный пептид может

- 9 011879 иметь активность, сравнимую активностью (или даже выше ее) природного лиганда, которого имитирует пептид. Кроме того, определенные терапевтические агенты, основанные на природных лигандах, могут индуцировать образование антител к собственным эндогенным лигандам пациента. В противоположность этому уникальная последовательность связанного с разбавителем пептида позволяет избежать данной проблемы, поскольку имеет незначительное сходство (идентичность) или, как правило, не имеет сходства по последовательности с природным лигандом. Кроме того, Ре-внутренние пептитела могут иметь преимущества при ренатурации и очистке молекул, связанных по Ν- или С-концам с Рс домена. К тому же, Рс-внутренние пептитела могут быть более стабильными как термодинамически, благодаря стабилизации химерных доменов, так и химически, благодаря повышенной устойчивости к протеолитической деградации с участием амино- и карбоксипептидаз. Рс-внутренние пептитела могут также обладать улучшенными фармакокинетическими свойствами.

Хотя соединения согласно настоящему изобретению в основной части рассматривают в качестве терапевтических агентов, они могут также быть полезными при скрининге такого рода агентов. Например, можно применять Рс-внутреннее пептитело (например, пептид Рс-петля-8Н2 домен) в способах анализа с применением планшетов, покрытых антителами к Рс. Рс-внутренние пептитела могут сделать нерастворимые пептиды растворимыми и, таким образом, применимыми в ряде способов анализа.

Соединения согласно настоящему изобретению можно применять для терапевтических или профилактических целей, разрабатывая препараты на их основе с подходящими фармацевтическими носителями, и вводя эффективное количество пациенту, например, человеку (или другому млекопитающему), нуждающемуся в таком лечении. Другие смежные аспекты также включены в настоящее изобретение.

Многочисленные дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения ясны из описания фигур и подробного описания изобретения.

Описание фигур

На фиг. 1А, 1Б и 1В показаны области петли доменов Рс, которые могут быть модифицированы согласно настоящему изобретению. На данных структурных изображениях СН2 и СН3 доменов Рс в качестве области петли можно рассматривать любую часть модели, не обозначенную как β-слой (плоские стрелки) или α-спираль (цилиндр).

На фиг. 1А показан домен Рс мономерного 1дС2а мыши (Файл базы данных белков #111 С, Ы1р://^^те.гс8Ь.огд/рйЬ/). На данной фигуре показана трехмерная модель домена Рс мономера 1дС2а крысы на основе кристаллической структуры, полученной путем дифракции рентгеновских лучей (рйЬ #111 С). Потенциальные сайты вставок в Рс петле показаны как для СН2, так и для СН3 доменов, при этом особо отмечен предпочтительный сайт вставки в Рс петле СН3 домена.

На фиг. 1Б показан домен Рс мономерного 1дС1 мыши (Файл базы данных белков #1ЮУ). На этой фигуре показана трехмерная модель домена Рс мономера 1дС1 мыши на основе кристаллической структуры, полученной путем дифракции рентгеновских лучей (рйЬ #1ЮУ). Потенциальные сайты инсерций в Рс петле показаны как для СН2, так и для СН3 доменов, при этом особо отмечен предпочтительный сайт вставки в Рс петле СН3 домена.

На фиг. 1В показан домен Рс мономерного 1§С1 человека (Файл базы данных белков #1Н3Т). На этой фигуре показана трехмерная модель домена Рс мономера 1дС1 мыши на основе кристаллической структуры, полученной путем дифракции рентгеновских лучей (рйЬ #1Н3Т). Потенциальные сайты инсерций в Рс петле показаны как для СН2, так и для СН3 доменов, при этом особо отмечен предпочтительный сайт втсавки (инсерций) в Рс петле СН3 домена.

Данные структуры показывают высокую степень гомологии вторичной и третичной структур в пределах Рс доменов различных подтипов 1дС и между видами. Кристаллические структуры, полученные при помощи рентгеновского излучения, для данных структур можно найти в белковом банке данных К.С8В (1Шр://\\л\лу.гс5Ь.ощ/рйЬ/).

На фиг. 2А приведена последовательность Рс 1§С1 человека (8ЕО ΙΌ N0: 599), использованная для образования гибридных пептител, при этом предсказанные последовательности петли выделены жирным шрифтом. На фиг. 2 А в контексте последовательности 1дС1 человека, использованной в данном изобретении, показаны жирным шрифтом области Рс петли (8Е0 ΙΌ N0: 621, 622, 624, 625, 627, 628, 630, 632, 634 и 636), которые предложены согласно структурам, показанным на фиг. 1А, 1Б и 1В. Любой сайт или все сайты, показанные жирным шрифтом, могут быть пригодными для полного или частичного замещения или вставки пептидных последовательностей и считаются частью данного изобретения. Подчеркнуты особо предпочтительные внутренние сайты (8Е0 ΙΌ N0: 623, 626, 629, 631, 633, 635, и 637). Одним из предпочтительных сайтов является 8Е0 ΙΌ N0: 631 между ЬеИ1з₉ и ТйГ1₄₀ в петле ОЕЬТК (8Е0 ΙΌ N0: 630). Потенциальные петлевые сайты в других подтипах Ιβ предполагают на основании выравниваний, приведенных на фиг. 2Б и 2В.

На фиг. 2Б и 2В показано выравнивание последовательностей доменов Рс человека из подклассов ΙβΛ. ΙβΜ и ΙβΟ. На фиг. 2Б и 2В представлены примеры аминокислотных последовательностей (8Е0 ΙΌ N0: 600-607) доменов Рс человека из подтипов ΙβΑ, ΙβΜ и ΙβΟ, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Также на фиг. 2Б и 2В показана консенсусная последовательность (8Е0

- 10 011879

ΙΌ N0: 608).

На фиг. 2Б и 2В также показаны жирным шрифтом предпочтительные внутренние сайты для добавления пептида, которые соответствуют таковым в последовательности Бе, представленной на фиг. 2А (8ЕЦ ΙΌ N0: 599). В частности, на фиг. 2Б и 2В показаны следующие предпочтительные сайты:

ЗЕО ГО N0: 621 как показано жирным шрифтом в пределах ЗЕО Ю N08:

603 на 608;

ЗЕО Ю ΝΟ: 622 в пределах ЗЕО ГО N08: 603 на 606 и 608;

ЗЕО ГО N0: 638 в пределах ЗЕО ГО N0: 607;

ЗЕО ГО ΝΟ: 624 в пределах 8ЕО ГО ΝΟ: 603 - 608;

ЗЕО ГО N0: 625 в пределах ЗЕО ГО N08: 603 и 604;

ЗЕО ГО ΝΟ: 639 в пределах ЗЕО ГО N03: 605 - 608;

ЗЕО ГО N0: 627 в пределах ЗЕО ГО N08: 603 -605, 607, и 608;

ЗЕО Ю ΝΟ: 640 в пределах ЗЕО Ю N0: 606;

ЗЕО ГО N0: 628 в пределах ЗЕО ГО N08: 603, 604, и 608;

ЗЕО ГО N0: 641 в пределах ЗЕО ГО N0: 605;

8Е0 ГО N0: 642 в пределах ЗЕО ГО N0: 606;

ЗЕО ГО N0: 643 в пределах ЗЕО ГО N0: 607;

ЗЕО ГО ΝΟ: 630 в пределах ЗЕО ГО N0: 603;

ЗЕО ГО ΝΟ: 644 в пределах ЗЕО ГО N03: 604 - 608;

ЗЕО ГО ΝΟ. 632 в пределах ЗЕО ГО N03: 603, 604, 606, 607, и 608;

ЗЕО ГО N0: 645 в пределах ЗЕО ГО N0: 605;

ЗЕО ГО N0; 634 в пределах ЗЕО ГО N03: 603, 604, и 607;

ЗЕО ГО ΝΟ: 646 в пределах ЗЕО ГО N08: 605, 606 и 608;

ЗЕО ГО N0: 636 в пределах ЗЕО ГО N03: 603, 604, 606, и 608;

ЗЕО ГО ΝΟ: 614 в пределах ЗЕО ГО ΝΟ: 605; и

ЗЕО ГО N0: 620 в пределах ЗЕО ГО N0: 607.

Выравнивание последовательностей на фиг. 2Б и 2В позволяет выявить еще два потенциальных сайта вставки в Ц₁₆₇/Р₁₆₈ и/или 6₁₈₃/δ₁₈₄ (с использованием нумерации 8ЕЦ ΙΌ N0: 599 на фиг. 2А). Эти позиции соответствуют пробелам в последовательностях 1дС. где обнаруживают вставки 2 и 3 остатков в выравнивании последовательностей 1дА и 1дМ. Другие предпочтительные сайты инсерций соответствуют последовательности на фиг. 2А. Предпочтительные сайты инсерций подчеркнуты на фиг. 2Б и 2В и являются следующими:

Н₅₃/Е₅4 в ЗЕО ГО N08: 603 и 604;

Н100/Е101 в ЗЕО ГО N0: 605;

Н₄₇/Е₅₀ в ЗЕО ГО N0: 606;

О₅о/Е₅₁ в ЗЕО ГО ΝΟ: 607;

Н₆₅/Е₆₆ в ЗЕО ГО N0: 608;

Υ₈ι/Ν₈₂ в ЗЕО ГО N08: 603 и 604;

Ρ₁₂₈/Ν₁₂9 в ЗЕО ГО N0: 605;

Ρ₇₇/Ν₇₈ в ЗЕО ГО ΝΟ: 606;

Ρ₇₈/Ν₇₉ в ЗЕО ГО N0: 607;

Ρ₉₃/Ν₉₄ в ЗЕО ГО ΝΟ: 608;

Νι₁₀/Κιιι в ЗЕО ГО N08: 603 и 604;

Ν₁₅₇/Κ_1Μ в ЗЕО ГО N0: 605;

Ν₁₀₆/Κιο7 в ЗЕО ГО ΝΟ: 606;

Νιο7/Κι_Ο8 в ЗЕО ГО N0: 607;

Ν₁₂₂/Κ_ί23 в ЗЕО ГО ΝΟ: 608;

Ι-143/Τ144 в М143/Т144В ЗЕО ГО N08: 603 и 604;

- 11 011879

Μικ/Γ^ι в ЗЕО Ю ΝΟ: 605;

Μ139/Τ140 в ЗЕО Ю ΝΟ: 606;

Μΐ4ο/Τΐ4ΐ в ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 607;

Μ157/Τ158 в ЗЕО Ю ΝΟ: 608;

ОтΡΐ72 в ЗЕО Ю N03: 603 и 604;

О215/Р219 в ЗЕО Ю ΝΟ: 605;

Οιβ?/Ρΐ68 В ЗЕО ю ΝΟ: 606;

Οΐ6β/Ρΐ69 в ЗЕО Ю ΝΟ: 607;

ΟΐΒ₅/Ριββ в ЗЕО Ю ΝΟ: 608;

Ε173Ν174 в ЗЕО Ю N03: 603 и 604;

Ε220/Ν221 в ЗЕО Ю N0: 605;

Ε169/Ν170 в ЗЕО Ю N0: 606;

Ει7₀/Ν₁₇ι в ЗЕО Ю ΝΟ: 607;

Ει₈₉/Νι₉₁₎ в ЗЕО Ю ΝΟ: 608;

θιβδ/ϋιββ в ЗЕО Ю N03: 603 и 604;

Зззг/Огзз в ЗЕО Ю ΝΟ: 605;

δ<8ΐ/Οΐ82 в ЗЕО Ю N0:606;

6ΐ82/ϋΐ83 в ЗЕО Ю N0: 607;

8201/0202 в ЗЕО Ю ΝΟ: 608;

<3ΐ87/διβ8 в ЗЕО Ю N08: 603 и 604;

Огзд/Згзб в ЗЕО Ю ΝΟ: 605;

Οι_β3/δΐ84 в ЗЕО Ю ΝΟ: 606;

С184/З185 в ЗЕО Ю N0: 607;

Огоз/Зго? в ЗЕО Ю ΝΟ: 608;

Огоб/Игов в ЗЕО Ю N03: 603 и 604;

Ο252/Ν253 в ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 605;

<3₂οι/Ν₂ο2 в ЗЕО Ю ΝΟ: 606;

Сгог/Мгоз в ЗЕО Ю N0: 607; и θ₂24/Ν₂25 в ЗЕО Ю ΝΟ: 608.

На фиг. 2Г представлено выравнивание домена Ре 1дС1 человека (Атдеп Ре, 8ЕЦ ГО N0: 609), использованного в качестве основы для пептитела с крысиным ЦС2А на основании кристаллической структуры комплекса РсКп/Рс (Ш.рйЬ, 8ЕЦ ГО N0: 610). Также показана результирующая консенсусная последовательность (8ЕЦ ГО N0: 611).

На фиг. ЗА представлена аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0: 612) домена Ее 1дС1 человека с инсерцией миостатинсвязывающего белка (8ЕЦ ГО N0: 365). В дальнейшем эта молекула упоминается как «миостатин-петлевое пептитело» или «Ес-петлевой-туо7». Встроенный пептид показан жирным шрифтом, глициновые линкеры выделены курсивом.

На фиг. ЗБ показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0: 613) связанного по С-концу пептитела, обозначенного как Т№-19-07. Это пептитело содержит ту же пептидную последовательность, что и Рс-петлевой-туо7 (8ЕЦ ГО N0: 365). Пептид Т№-19-07 показан жирным шрифтом, глициновые и аланиновые линкеры выделены курсивом.

На фиг. ЗВ показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0: 615) Рс-внутреннего пептитела, упоминаемого далее как Рс-петлевой-ЕМР. Это пептитело содержит пептид-миметик ЕРО (8ЕЦ ГО N0: 2). Встроенный пептид показан жирным шрифтом, глициновые линкеры выделены курсивом. Цистеины, образующие дисульфидные связи, подчеркнуты.

На фиг. ЗГ показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0: 616) Рс-внутреннего пептитела, упоминаемого в дальнейшем как Рс-петлевой-АМР2. Биоактивный пептид (8ЕЦ ГО N0: 28), выделен жирным шрифтом, а глициновый линкер выделен курсивом. При встраивании пептида АМР-2 не образуется дисульфидных связей.

На фиг. ЗД показана аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0: 617) связанного по С-концу пептитела, в дальнейшем упоминаемого как Рс-петлевой-АМР2-димер. Последовательность терапевтического пептида (8ЕЦ ГО N0: 28) этого соединенного тандемно димера терапевтического пептида показана жирным шрифтом, последовательности линкеров выделены курсивом. Эта молекула содержит димер тандемных пептидов той же самой пептидной последовательности, что и в Рс-петлевом -АМР-2.

- 12 011879

На фиг. 4А и 4Б показана экспрессия в Е. со11 Ес-петлевого-туо7 и ΤΝ8-19-07 способом ДСНПААГ (4-20%). Пробы необработанного клеточного лизата (1ук), нерастворимой фракции (ίηκο1) и растворимой (ко1) фракции как для Ес-петлевого-Муо7 (#6951), так и для ΤΝ8-19-07 (#6826) показаны в восстановительных гелях. 8ееВ1ие и маркеры молекулярного веса (дорожка 1), лизаты целых клеток (дорожка 2), нерастворимая фракция (дорожка 3) и нерастворимая фракция (дорожка 4).

На фиг. 5 показано сравнение способом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) неочищенных реакций ренатурации Ес-петлевого-Муо7 (#6951) и ΤΝ8-19-07 (#6826). Приблизительно 10 мкг пептител наносили непосредственно из реакции ренатурации на колонку Уубак С4 (5 мкМ, 300 А, 4,6x250 мм) и элюировали линейным градиентом 40-50% АЦН при 0,5%/мин.

На фиг. 6 показано сравнение способом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) конечного очищенного пула Ес-петлевого ΤΝ8-19-07 (#6951) и Ескарбоксиконцевого ΤΝ8-19-07 (#6826). Наносили 10 мкг очищенных пептител на колонку Уубак С4 (5 мкМ, 300 А, 4,6x250мм) и элюировали линейными 40-50% градиентом АЦН при 0,5%/мин.

На фиг. 7 показан анализ конечного очищенного пула Ес-петлевого ΤΝ8-19-07 (#6951) и Ескарбоксиконцевого ΤΝ8-19-07 (#6826) способом ДСН-ПААГ (4-20% гель). Пять мкг каждой пробы наносили следующим образом: #6951 (дорожка 1), #6826 (дорожка 2), 8ееВ1ие + маркеры (дорожка М), восстановленный #6951 (дорожка 3), восстановленный #6826 (дорожка 4).

На фиг. 8 показан биоанализ ίη νίΐτο с использованием клеток для оценки миостатинингибирующих соединений. Ес-петлевой ΤΝ8-19-07 (#6951) сохраняет полную ингибирующую активность относительно карбоксиконцевого ΤΝ8-19-07 пептитела (#6826).

На фиг. 9 показан вестерн-блот анализ по изучению стабильности ίη νίνο Ес-петлевого ΤΝ8-19-07 (#6951) и карбоксиконцевого ΤΝ8-19-07 пептитела (#6826). Пул сывороток пяти мышей оценивали в каждой временной точке (0, 4, 24 и 48 ч). Дорожки 1-3 представляют собой стандарты Ес-петлевого ΤΝ819-07 в концентрации 2, 5 и 10 нг, соответственно. Дорожки 4 и 5 относятся к Ес-петлевым и карбоксиконцевым пептителам, соответственно, через 4 ч. Дорожки 6 и 7 представляют собой Ес-петлевые против карбоксиконцевых пептител, соответственно, при 24 ч. Дорожки 8 и 9 представляют собой Ес-петлевые против карбоксиконцевых пептител, соответственно, при 48 ч. Дорожки 10-12 представляют собой стандарт карбоксиконцевых пептител в концентрации 2, 5 и 10 нг, соответственно. Гель был получен при прогоне в 1 мм 4-12% ДСН-ПААГ геле в восстанавливающем буфере МЕ8, вестерн-блот проводили с применением конъюгатов козлиных антител к 1дС Ес человека с ПХ.

Нам фиг. 10А показана аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 618) домена Ес 1дС1 человека с инсерцией Апд2-связывающего пептида (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 147). В дальнейшем, эта молекула упоминается как «Апд2-петлевое пептитело» или «Ес-петлевой-Апд2». Биоактивный пептид выделен жирным шрифтом, а глициновый линкер обозначен курсивом.

На фиг. 10Б показана аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 619) связанного по С-концу пептитела, упоминаемого здесь как ΤΝ8-ί.'οη4. Эта молекула содержит ту же пептидную последовательность, что и Ес-петлевой-Апд 2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 147). Биоактивный пептид выделен жирным шрифтом, глициновые и аланиновые линкеры выделены курсивом.

На фиг. 11 показана экспрессия и распределение в Е. сой Ес-петелевого ΤΝ8-ί’οη4 (#6888) и карбоксиконцевого ΤΝ8-ί’οη4 (#5564) пептител способом ДСН-ПААГ. Пробы сырого клеточного лизата (1ук), нерастворимой фракции (ίηκο1) и растворимой (ко1) представлены в восстанавливающих гелях как для для Ес-петлевого-Τη8-Сοη4 (#6888) так и для ΤΝ8-ί’οη4 (#5564).

На фиг. 12 показано сравнение способом ОФ-ВЭЖХ Ес-петлевого Ап§2 (#6888) и карбоксиконцевого Ес ΤΝ8-19-07 (#5564) реакции ренатурации. Наносили 20 мкл смеси реакции ренатурации на колонку Уубак С4 (5 мкМ, 300 А, 4,6x250 мм) и элюировали линейными градиентом 40-50% АЦН при 0,5%/мин.

На фиг. 13 показано сравнение способом ОФ-ВЭЖХ конечных очищенных пулов Ес-петлевого Ап§2 (#6888) и карбоксиконцевого Ес ΤΝ8-ί’οη4 (#5564). Десять мкг очищенных пептител помещали на колонку Уубак С4 (5 мкМ, 300 А, 4,6x250 мм) и элюировали линейными градиентом 40-50% АЦН при 0,5%/мин.

На фиг. 14 показан очищенный Ес-петелевой-туо7 и ΤΝ8-19-7.

На фиг. 15 показан анализ связывания (В1асоге) Ес-петлевого-Аηд2 и Ес-Аηд2-тандема.

На фиг. 16 представлены результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) ίη νίίτο для Ес-петлевого-АидЗ. ΤΝ8-ί’οη4 и Ес-Аηд2-тандема.

На фиг. 17 представлены результаты υΤ7 анализа влияния эритропоэтина на пролиферацию для Еспетлевого-ЕМР. В анализе сравнивали активность двух различных молекул Ес-петлевого-ЕМР с активностью эритропоэтина альфа.

На фиг. 18 показана экспрессия и распределение в Е. сой Ес-петлевого ΤN8-АМΡ2 (#6875) пептитела способом ДСН-ПААГ. Пробы необработанных клеточных лизатов (1ук), нерастворимой фракции (ίηко1) и растворимой (ко1) для Ес-петлевого-АМР2 (#6888) показаны в восстанавливающих гелях.

На фиг. 19 показан анализ конечного очищенного пула Ес-петлевого-АМР2 (#6875) способом ДСН

- 13 011879

ПААГ (4-20% гель). На дорожку 2 наносили 5 мкг Бс-петлевого-АМР2 пептитела, на дорожку 4-5 мкг восстановленного Бс-петлевого-АМР2 пептитела; на дорожки 1 и 3 нанесены 8ееВ1ие и два маркера молекулярного веса.

На фиг. 20 представлены результаты анализа ОФ-ВЭЖХ конечного очищенного пула Бс-петлевогоАМР2 (#6875). Десять мкг очищенного пептитела наносили на колонку Уубак С4 (5 мкМ, 300 А, 4,6x250мм) и элюировали линейными градиентом 40-50% АЦН при 0,5%/мин.

На фиг. 21 показаны результаты биоанализа ίη νίνο на мышах Бс-петлевого-АМР2 и АМС531 антител. Мышам однократно вводили путем подкожной инъекции 50 мкг/кг пептитела или только носитель. Методику анализа см. в примере 9.

На фиг. 22 показано несколько подходов для включения 2 биоактивных пептидов в Бс-петлевое пептитело.

На фиг. 23 показаны гели ДСН-ПААГ очищенных Бс-петлевых кострукций. Пробы (2 мкг/дорожка) прогоняли +/- в восстанавливающем буфере в Трис-глициновом 4-20% ДСН-ПААГ геле.

На фиг. 24 показан ОФ-ВЭЖХ Бс-петлевых конструкций.

Подробное описание изобретения

Определение терминов

Термины, использованные в данном описании, определены, как следует ниже, если не ограничено в особых случаях.

При использовании в отношении аминокислотной последовательности термин «содержит» означает, что соединение может содержать дополнительные аминокислоты либо на Ν-, либо на С-конце, либо на обоих концах последовательности.

«Антитело» или «пептид(ы) антитела» относятся к целому антителу, или его связывающему фрагменту, который конкурирует с целым антителом за специфическое связывание и содержит химерные, гуманизированные, полностью человеческие и биспецифические антитела. В определенных способах реализации, связывающие фрагменты получают при помощи способов рекомбинантных ДНК. В других способах реализации связывающие фрагменты получают путем энзиматического химического расщепления целых антител. Связывающие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, БаЬ, БаЬ', Б(аЬ')2, Бν и одноцепочечные антитела.

Термин «нативный Бс» относится к молекуле или последовательности, включающей последовательность не являющегося антигенсвязывающим фрагмента, полученного при ферментативном гидролизе целого антитела либо в мономерной, либо мультимерной форме, в которую может быть добавлена пептидная путем вставки или замещением области петли. Первоначальный источник иммуноглобулина для нативного Бс имеет предпочтительно человеческое происхождение и может являться любым из иммуноглобулинов, однако 1дС1 и 1дС2 являются предпочтительными. Нативные Бс' образованы из мономерных полипептидов, которые могут соединяться с образованием димерных или мультимерных форм ковалентными (т.е. при помощи дисульфидных связей) или нековалентными связями. Число внутримолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Бс варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, 1дС, 1дА, 1дЕ) или подкласса (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дА1, 1дСА2). Одним из примеров нативного Бс является образованный при помощи дисульфидных связей димер, полученный при расщеплении 1дС папаином (см. ΕΙΙίδοη е! а1. (1982), ШсЫс Ас1б5 Ве5. 10: 4071-9). Термин «нативный Бс», как здесь используется, является общим для мономерных, димерных и мультимерных форм.

Термин «вариант Бс» относится к молекуле или последовательности, являющейся модификацией нативного Бс, но при этом включающей сайт связывания с «рецептором спасения» БсВп. В международных заявках νθ 97/34631 (опубликованной 25 сентября 1997) и νθ 96/32478 описаны примеры вариантов Бс, а также взаимодействие с «рецептором спасения» и они включены здесь посредством ссылки. Таким образом, термин «вариант Бс» включает молекулу или последовательность, которые являются гуманизированными формами нативного Бс отличного от человека животного. Кроме того, нативный Бс содержит сайты, которые могут быть удалены, поскольку они обеспечивают структурные особенности или биологическую активность, не являющиеся необходимыми для гибридных молекул настоящего изобретения. Таким образом, термин «вариант Бс» включает молекулу или последовательность с недостатком одного или более нативных сайтов или остатков аминокислот Бс, которые влияют на (1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранными клетками-хозяевами, (3) гетерогенность по Νконцу при экспрессии в выбранных клетках-хозяевах, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с рецептором Бс, за исключением «рецептора спасения» или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). Варианты Бс описаны более подробно ниже.

Термин «домен Бс» охватывает нативные Бс и молекулы вариантов Бс и последовательности, как определено выше. При использовании в отношении и вариантов Бс и нативных Бс термин «домен Бс» охватывает молекулы в мономерной или мультимерной форме, либо полученные в результате ферментативной обработки целого антитела или полученные другими способами.

Термин «мультимерный» в применении к домену Бс или молекулам, включающим домены Бс, относится к молекулам, имеющим две или более полипептидных цепи, связанные ковалентно, нековалент

- 14 011879 но или при помощи как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий. Молекулы 1дО обычно формируют димеры; 1дМ-пентамеры; 1дО-димеры; а 1дА-мономеры, димеры, триммеры или тетрамеры. Мультимеры могут быть сформированы при использовании последовательности и результирующей активности источника нативного 1д Ес или путем образования производных (как определено ниже) такого нативного Ес.

Термин «димер» в приложении к доменам Ес или молекулам, которые содержат Ес домены, относится к молекулам, имеющим две полипептидные цепи, связанные ковалентным или нековалентным способом. Примеры димеров в пределах области данного изобретения представлены в Патенте США № 6660843, фиг. 2, который включен здесь посредством ссылки.

Термин «образование производных» и «являющийся производным» включает способы и образующиеся соединения, соответственно в которых (1) соединение имеет циклическую часть; например, поперечную сшивку между остатками цистеинила в пределах соединения; (2) соединение является поперечно сшитым или имеет сайт образования поперечных сшивок; например, соединение имеет остаток цистеина и, таким образом, формирует поперечно сшитые димеры в культуре или ш νί\Ό; (3) одна или более пептидильных связей заменещена непептидильной связью; (4) Ν-конец замещен на -ΝΚΚ¹, ИКС(О)Я¹, -ЫВС(О)ОК?, -ΝΚ8(Ο)₂Κ¹, -ΝΗ^Ο)ΝΗΚ, сукцинимид, или замещенный или незамещенный бензилоксикарбонил -ΝΗ-, где заместители Κ и Κ¹ и кольцо являются такими, как определено далее; (5) С-конец 2 3 4 2 3 4 замещен на -С(О)К или -ΝΚ Κ , где Κ , Κ и Κ являются такими, как определено далее; и (6) соединения, в которых определенные аминокислоты модифицированы при помощи обработки реагентами, способными реагировать с некоторыми боковыми цепями или концевыми остатками. Производные подробнее описаны ниже.

Термин «полипептид» относится к молекулам, состоящим более чем из 40 аминокислот, либо природных, либо искусственно синтезированных, при условии, что такие молекулы не являются мембраносвязанными. Примеры полипептидов включают ИЛ-1ра, лептин, растворимые рецепторы ΤΝΕ 1 и 2 типа (δΤΝΕ-Κ1, 8ΤΝΕ-Κ2), КОЕ, ЕРО, ТРО, 6-С8Е, дарбепоэтин, ЕаЬ фрагменты и т.п.

Термин «пептид» относится к молекулам, состоящим от 2 до 40 аминокислот, при этом предпочтительно молекулам из 3-20 аминокислот, наиболее предпочтительно молекулам из 6-15 аминокислот. Примеры пептидов могут быть произвольно синтезированы любым из способов, приведенных выше, введены в библиотеку пептидов (например, библиотека на основе фагового дисплея) или получены при расщеплении белков.

Термин «рандомизированный», использованный в отношении пептидной последовательности, относится к полностью произвольным последовательностям (например, полученным при помощи техники фагового дисплея) и последовательностям, в которых один или более природных остатков замещены аминокислотным остатком, не встречающимся в данном положении у природной молекулы. Примеры способов для идентификации пептидных последовательностей включают фаговый дисплей, Е. со11 дисплей, рибосомный дисплей, скрининг в дрожжах, РНК-пептидный скрининг, химический скрининг, рациональный дизайн, структурный анализ белка, и т. п.

Термин «фармакологически активный» означает, что для описываемого вещества показано, что оно имеет активность, влияющую на медицинские параметры (например кровяное давление, показатели крови, уровень холестерина) или болезненное состояние (например рак, аутоиммунные заболевания). Таким образом, фармакологически активные пептиды включают агонистов или миметиков, как определено ниже.

Термины «пептид-миметик», «пептид-агонист» относятся к пептиду, имеющему биологическую активность, сравнимую с белком (например, ЕРО, ТРО, С-С8Е), который взаимодействует с представляющим интерес белком. Эти термины, кроме того, охватывают пептиды, которые косвенно имитируют активность интересующего белка, например, потенциируя действие природного лиганда, представляющего интерес белка; см., например, пептиды-миметики С-С8Е, указанные здесь в табл. 2 и 7 патента США № 6660843, включенного здесь посредством ссылки. Таким образом, термин «пептид-миметик ЕРО» охватывает любые пептиды, которые могут быть идентифицированы или произведены, как описано в работе \Упд11Юп е! а1. (1996), 8с1епсе 273: 458-63, Ыагапба е! а1. (1999), Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 96: 7569-74, или любом другом источнике, указанном в табл. 2, имеющем отношение к миметику ЕРО. Специалисты в данной области техники понимают, что каждый из данных источников позволит выбрать различные пептиды, которые там описаны, следуя описанным процедурам с различными пептидными библиотеками.

Термин «пептид-антагонист» или «пептид-ингибитор» относится к пептиду, который блокирует или каким-либо образом препятствует биологической активности связанного представляющего интерес белка, или обладает биологической активностью, сравнимой с известным антагонистом или ингибитором связанного интересующего белка. Таким образом, термин «пептид-антагонист ΤΝΡ» включает пептиды, которые могут быть идентифицированы или получены, как описано в работе е! а1. (1997), №11иге Вю1ес11. 15: 1266-70 или в любом из источников, указанном в табл. 2, имеющем отношение к антагонисту ΤΝΡ. Специалисты в данной области техники понимают, что каждый из данных источников позволит выбрать различные пептиды, которые там описаны, следуя описанным процедурам с различными пептидными библиотеками.

Термин «пептид-миметик ТРО» охватывает пептиды, которые могут быть идентифицированы или

- 15 011879 получены, как описано в работе С\\тг1а с1 а1. (1997), §аепсе 276: 1696-9 патентах США №№ 5869451 и 5932946; заявке на патент США 2003/0176352, опубликованной 18 сентября 2003; международной публикации XVО 03/031589, опубликованной 17 апреля 2003 и в любом другом источнике из Таблицы 2, имеющем отношение к миметику ТРО, а также νθ 00/24770, опубликованной 4 мая 2000, которые включены здесь посредством ссылок. Специалисты в данной области техники понимают, что каждый из данных источников позволит выбрать различные пептиды, которые там описаны, следуя описанным процедурам с различными пептидными библиотеками.

Термин «апд-2-связывающий пептид» охватывает пептиды, которые могут быть идентифицированы или получены, как описано в заявке на патент США № 2003/0229023, опубликованной 11 декабря 2003; νθ 03/057134, опубликованной 7/17/03; США 2003/0236193, опубликованной 25 декабря 2003; и любом другом источнике в табл. 2, имеющем отношение к апд-2. Специалисты в данной области техники понимают, что каждый из данных источников позволит выбрать различные пептиды, которые там описаны, следуя описанным процедурам с различными пептидными библиотеками.

Термин «ΝΟΡ-связывающий пептид» охватывает пептиды, которые могут быть идентифицированы или получены, как описано в νθ 04/026329, опубликованной 1 апреля 2004 и любом другом источнике в табл. 2, имеющем отношение к ΝΟΡ. Специалисты в данной области техники понимают, что каждый из данных источников позволит выбрать различные пептиды, которые там описаны, следуя описанным процедурам с различными пептидными библиотеками.

Термин «миостатинсвязывающий пептид» охватывает пептиды, которые могут быть идентифицированы или получены, как описано в патенте США № 10/742379, поданном 19 декабря 2003 и в любом другом источнике в табл. 2, имеющем отношение к миостатину. Специалисты в данной области техники понимают, что каждый из данных источников позволит выбрать различные пептиды, которые там описаны, следуя описанным процедурам с различными пептидными библиотеками.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает физиологически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению. Под «физиологически приемлемыми солями» понимают любые соли, для которых известно или позднее было показано, что они являются фармацевтически приемлемыми. Некоторыми отдельными примерами являются: ацетат; трифторацетат; гидрогалогениды, такие как гидрохлорид и гидробромид; сульфат; цитрат; тартрат; гликолат; и оксалат.

Структура соединений

Общая часть

В соединениях, полученных в соответствии с настоящим изобретением, пептид может быть присоединен к носителю через Ν-конец или С-конец пептида. Таким образом, молекулы-наполнителя согласно настоящему изобретению могут быть описаны следующей формулой I:

(Х¹)а-Е¹-(Х²)ь I где Р¹ представляет собой домен Рс модифицированный, таким образом, что он содержит по меньшей мере один X³ в области петли;

каждый X¹ и X² независимо выбран из -(Ь¹)с-Р¹, -(Ь¹)с-Р¹-(Ь²)а-Р², -(Е¹)с-Р¹-(Ь²)а-Р²-(Ь³)е-Р³ и -(Е')_сР¹-(Е²)а-Р²-(Ь³)е-Р³-(Е⁴)гР⁴;

X³ независимо выбран из-(Ь⁵)с-Р⁵, -(Е⁵)с-Р⁵-(Ь⁶)а-Р⁶, -(Р')с-Р'-(Р).--Р-(Р )е-Р , и -(Р')с-Р'-(Р).;-Р.(Е⁷)е-Р⁷-(Ь⁸)£-Р⁸;

каждый из Р¹, Р², Р³ и Р⁴ независимо представляет собой последовательность фармакологически активного полипептида или фармакологически активного пептида;

каждый из Р⁵, Р⁶, Р⁷ и Р⁸ независимо представляет собой последовательность фармакологически ак тивного пептида;

каждый из Ь¹, Ь², Ь³, Ь⁴, Ь⁵, Ь⁶, Ь⁷ и Ь⁸ независимо представляет собой линкер; и каждый а, Ь, с, б, е, и ί независимо равен 0 или 1.

В предпочтительных способах реализации а и Ь оба равны нулю, то есть X¹ и X² группы отсутствуют с Ν-конца или С-конца Рс домена.

Специалисты в данной области техники понимают, что в домене Рс может присутствовать более одного заместителя X³, и что множественные заместители X³ могут быть различными; например, содержать различные пептиды Р⁵, различные линкеры, присоединенные к одной и той же пептидной последовательности и т.д. Также X¹ и X² могут быть одинаковыми или различными и целые с-ί могут различаться для X¹, X² и X³. Таким образом, соединения I включают соединения формул

II

Х’-Е¹ и их мультимеры, где Р¹ присоединен к С-концу X¹;

III

Р¹-Х² и их мультимеры, где Р² присоединен к Ν-концу Х²

- 16 011879 и их мультимеры, где Е¹ присоединен к Ν-концу -(Ь¹)_с-Р¹; и

V

Г-^-рЧб²)^² и их мультимеры, где Е¹ присоединен к Ν-концу -Е¹-Р¹-Е²-Р².

Пептиды

Любое количество пептидов может быть использовано в отношении настоящего изобретения. Предпочтительные пептиды связываются с ангиопротеином-2 (апд-2), миостатином, фактором роста нервов (ФРН, иетуе дго\\111 ГасЮг, ΝΟΕ), фактором некроза опухолей (ФНО, (итог песто818 ГасЮг, ΤΝΕ), фактором, активирующим В-клетки (В се11 асНуаНпд Гас(ог. ВАЕЕ, также называемым ТАЕЬ-1) или имитируют активность ЕРО, ТРО или С-С8Е. Также представляют интерес целевые пептиды, включая пептиды, характерные для опухолей, транспортируемые через мембрану пептиды и т.п. Все эти классы пептидов могут быть обнаружены при помощи способов, описанных в источниках, цитируемых в данном описании или других источниках.

В частности, техника фагового дисплея применима для получения для применения согласно настоящему изобретению. Установлено, что основанную на аффинности селекцию библиотек произвольных пептидов можно применять для идентификации пептидных лигандов для любого сайта продукта любого гена. Эебтап е( а1. (1993), 1. Вю1. СЕет. 268: 23025-30. Фаговый дисплей особенно хорошо подходит для идентификации пептидов, которые связываются с такими представляющими интерес белками, как рецепторы клеточной поверхности или любыми белками, имеющими линейные эпитопы. ХУШоп е( а1. (1998), Сап. 1. М1стоЫо1. 44: 313-29; Кау е( а1. (1998), Цтид Шзс. Тобау 3: 370-8. Широкий обзор такого рода белков представлен в работе Нет/ е! а1. (1997), 1. РесерЮг & 8фпа1 Ттаиббисйоп Вее. 17(5): 671-776, включенной здесь посредством ссылки. Такие представляющие интерес белки являются предпочтительными для применения в данном изобретении.

Особенно предпочтительную группу пептидов представляют белки, которые связываются с рецепторами цитокинов. Цитокины недавно были классифицированы согласно их рецепторному коду. См. работу 1пд1о! (1997), АтсЫуит 1ттипо1од1ае е! Тйегар1ае ЕхрептепЫк 45: 353-7, включенную здесь посредством ссылки. Среди этих рецепторов, наиболее предпочтительными являются рецепторы цитокинов СКВ (семейство I в табл. 3). Классификация рецепторов представлена в табл. 3.

Таблица 3. Классификация рецепторов цитокинов согласно рецепторному коду

Цитокины (лиганды)	Тип рецепторов
семейство	подсемейство	семейство	подсемейство
1.	Гематопоэтин	1. ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-	I. Р цитокина	1. объединяет уСг, ИЛ-9Р,
	еские	7, ИЛ-9, ИЛ-13, ИЛ-	(Су1ок1пе К,	ИЛ-4Р
	цитокины	15 2. ИЛ-3, ИЛ-5, СМ-	СКК)	2. объединяет СР 140 βΚ
		С8Р		З.объединяет НР 130, ИЛ-
		3. ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-		6 Ρ, Р лептина
		12, ИР, ОЗМ, ΟΝΤΡ, лептин (ОВ)		4. «одноцепочечные» Р,
		4. С-СЗР, ЕРО,		ССЗР-Н, ТРО-Н. СН-К
		ТРО, РКЬ, СН		5. другие К2
		5. ИЛ-17, НУЗ-ИЛ- 17
II.	лиганды ИЛ-	ИЛ-10, ВСКР-1,	II. ИЛ-ЮК
	10	Н5У-ИЛ-10
III.	Интерфер	1.ИФН-а1, «2, а4,	III. Р	1. ΙΡΝΑΚ
	ОНИ	т, (, ИФН-β3 2. ИФН-γ	Интерферона	2. ΙΡΝΘΚ
IV.	ИЛ-1 и ИЛ-1	1. ИЛ-1а, ИЛ-1р,	IV. ИЛ-1Р	1. ИЛ-1 Р, ИЛ-1 КАсР
	подобные	ИЛ-1 Ра		2. ИЛ-18Р, ИЛ-18КАсР
	лиганды	2. ИЛ-18, ИЛ-
		18ВР
V.	семейство	ΤΝΡ-сс, ΤΝΡ-β	3. ΝΟΡΠΝΡ К'	ΤΝΡ-ΗΙ, ΑΘΡ-3Κ, ЦН4, ЦК5,
	ФНО (ΤΝΡ)	(ЦТ), РА8Ц		0X40, ОРС. ТАС1, С040,
		Οϋ4θ ь, Созой СЦ27 Б, 0X401., ΟΡΘί, ТКАН Л, АРКИЛ, ΑΘΡ-3, В1_у5, ТБ5, ΝΙη2, ΚΑΥ, Нейтрокин-α		РАЗ, ООН
	VI. Хемок	1. а хемокины: ИЛ-	4. Р хемокина	1. СХСК
	ины	8, СНО α, β, γ, !Р10, РЕ-4, ЗОЕ-1 1. рхемокины:		2. СОК
		ΜΙΡ1α, Μ1Ρ1β, МСР-1,2,3,4, ΚΑΝΤΕ3,
		эотаксин
		2. ухемокины:
		лимфотактин

²ИЛ-17Р - принадлежит к семейству СКВ, но не отнесен ни к одному из 4 указанных подсемейств. ²Другие подтипы ИФН I типа не установлены.

- 17 011879

Гематопоэтические цитокины, лиганды ИЛ-10 и интерфероны не имеют функциональных внутренних протеинкиназ. Сигнальными молекулами для цитокинов являются ΙΛΚ-киназы, 8ΤΆΤ и схожие нерецепторные молекулы. ИЛ-14, ИЛ-16 и ИЛ-18 были клонированы, но не классифицированы согласно рецепторному коду.

³ Рецепторы ΤΝΓ (ФНО) используют множество различных внутриклеточных молекул для передачи сигнала, включая «домен смерти» (йеа)11 йоташ) ЕА8 Р и 55 кДа ΊΝΓ-Ρ, которые вносят вклад в их цитотоксический эффект. ΝΟΓ/ΤΝΓ Р может связываться как с ΝΟΓ и схожими факторами, а также с лигандами а§ ΤΝΓ. Для рецепторов хемокинов характерен трансмембранный домен, семь раз пронизывающий мемьрану (7ТМ, змеевидный). Они сопряжены с С-белками.

	3. ОАКС5
VII. Рос 1.1 8СР, М-С8Р,	VIII. ККР 1. ΤΚ подсемейство
товые РООР-АА, АВ,	1.1 1дТК III К, УЕОР-К1,
фактор ВВ, ΚΟΚ, ПТ-1,	УБОРКИ
ы ΡίΤ-3ί, УЕСЕ,
88У-Р00Р,
НОЕ, 8Е	1.2 1дТК IV К
1.2 ΡΟΡα, ΡΟΡβ	1.3 Цистеин-богатаяТК-1
1.3 ЕСР, ТОР-а,
νν-Ρ19 (ЕОР-	1.4 Цистеин-богатая ΤΚ-ΙΙ,
подобный)	ΙΟΡ-ΚΙ
1.4ΙΟΕ-Ι, ЮГ-П,	1.5 Цистеин-богатая ΤΚ V
Инсулин	2. Подсемейство серин-
1.5 ΝΘΕ, ΒϋΝΡ, ΝΤ-	треониновая киназа
3, ΝΤ-46	(ПСТК, /
2. Τ6Ρ-Ρ1,β2φ3

Отдельные белки, представляющие интерес в качестве мишеней, для создания пептидов согласно настоящему изобретению включают следующие:

ανβ3 αΫβ1 Апд-2 ВАРЕ/ТАИ--1 В7

В7РР1 СКР1 Кальцитонин С 028 СЕТР сМе1 Фактор комплемента В С4Ь

СТ6А4 Глюкагон Рецептор глюкагона ЫР6 МРЬ миостатин сплайсированные варианты молекул, предпочтительно экспрессируемых на опухолевых клетках, например, С044, СОЗО негликозилированные варианты муцина и поверхностного гликопротеина Льюиса Υ С019, СР20, Οϋ33, С045 мембранный антиген и клеточный антиген, специфичныедля простаты металлопротеиназы матрикса (та(пх те1а11орго1е1пазез, ММР), как секретируемые, так и мембранно-связанные (например, ММР-9) катепсины ангиопоэтин-2 рецептор ΤΙΕ-2 гепариназа урокиназный активатор плазминогена (игоМпазе р1азгп1подеп асйуа(ог, иРА), рецептор иРА паратиреоидный гормон (ПТГ, РТН), паратиреоидный гормонподобный белок (РТНгР), ΡΤΗ-ΡΙ, ΡΤΗ-ΕΙΙ Нег2 НегЗ Инсулин

Примеры пептидов согласно настоящему изобретению представлены в табл. 4-20 патента США № 6660843, который представлен здесь посредством ссылки. Дополнительные предпочтительные пептиды представлены в заявк на патент США 2003/0229023, опубликованной 11 декабря 2003; νθ 03/057134, опубликованной 17 июля 2003; заявке на патент США 2003/0236193, опубликованной 25 декабря 2003; νθ 00/24770, опубликованной 4 мая 2000; заявке на патент США 2003/0176352, опубликованной 18 сентября 2003; νθ 03/031589, опубликованной 17 апреля, 2003; заявке на патент США 10/666480, поданной

- 18 011879 сентября 2003; \νϋ 04/026329, опубликованной 1 апреля 2004; заявке на патент США 10/742379, поданной 19 декабря 2003; заявке РСТ/И803/40781, поданной 19 декабря 2003, которые включены здесь посредством ссылок. Такие пептиды могут быть получены способами, раскрытыми в области техники.

Особенно предпочтительные пептиды представлены в таблицах ниже. Используются однобуквенные аминокислотные обозначения. Любой из этих пептидов может быть соединен тандемно (т.е. последовательно) с линкером или без него. Любой пептид, содержащий остаток цистеинила может быть поперечно сшит с другим Сук-содержащим пептидом или белком. Любой пептид, имеющий более одного остатка Сук, может также образовывать внутрипептидные дисульфидные связи. Для любого из этих пептидов могут быть получены производные, как описано выше. Все пептиды связаны пептидными связями, если не указано иначе.

Таблица 4. Последовательности пептидов-миметиков ЕРО

Поел едовател ьность	5ΕΟ Ю ΝΟ:
УХСХХбРХТУУХСХР	1
остузснЕСРГПлл/скробо	2
СбОУНСКМОРЬТУЛ/СКРЬОО	3
ΟΟνΥΑΟΕΜΟΡΙΤΙΛΛ/ΟδΡίΟΟ	4
ν0ΝΥΜ0ΗΕ6ΡΙΤ\ΛΛ/0ΚΡ600	5
αοίΥίερρορντννοοογκβο	6
6СТУ8СНЕ6РЬТ\ЛЛ/СКРО6638К	7
66ТУ8СН<ЗР1 Т\ЛЛ/СКРСКЗе	8
νΟΝΥΜΑΗΜΟΡΙΤνννΟΡΡΘΘ	9
СОРНЖ/УАСКМСР1-Т\МС	10
ССТУЗСНЕСРСПЛЛ/СКРО	11
60ЬУАСНМ6РМТ\ЛЛ/С0Р1К0	12
Т1АОУ1СУМСРЕТ\Л/ЕСРРЗРКА	13
УЗСНЕСРЬВЛЛ/СК	14
уснрсзрьтал/с	15
ΘΟίΥίΟΗΡΟΡντννΟΟΘΥΚΟΟ	16
ОбТУЗСНЕОРЬПЛЛ/СКРООС	17
ССОУНСВМСРЬТУ/УСКРЬбб	18
νΘΝΥΜΟΗΕΟΡΙΤνννΟΚΡΘΘΟ	19
ССУУАСКМ6Р1Т\ЛЛ/С8РЬС6	20
νΘΝΥΜΑΗΜΟΡΙΤνννΟΚΡΟΟ	21
ОСТУЗСНЕОРЬтаЛ/СКРО	22
ССЬУАСНМОРМРЛЛ/СОРкРО	23
Т1А0У1СУМ6РЕТ\Л/ЕСКР8РКА	24
У8СНЕОР1 Т\ЛЛ/СК	25
ΥΟΗΓΟΡίΤΙΛΛ/Ο	26
ЗСНГСРСПЛЛ/СК	27

Таблица 5. Последовательности пептидов-миметиков ТРО

Последовательность	3ΕΩ Ю ΝΟ:
ΙΕΘΡΤί-ΡΟννίΑΑΚΑ	28
ΙΕΟΡΤΙ-ΚΟννί-ΑΑΚΑ	29
ΙΕΟΡΤίΚΕννίΑΑΡΑ	30
ΤίΕΕννί	31
ορνΡϋονΑονν	32
ΘΡνΚϋΩΙΑΟί	33
ονκοονεννΑί	34
ΕβνΗΕΟνΜΚΥ	35
8νΚ3ΟΙ8Α3ί	36
ΟνΚΕΤΥΥΚΗΜ	37
ονκΕνινΜΗΜΐ	38
ΟΚνΚϋΟίννΑΑί	39
ΑΘνΚϋΟΙΙ-ίννΐ-	40

- 19 011879

ακνκϋΟίΜίδΐ	41
СТ1Р(Ж1СЮС	42
СТЮЕЕЬЕСС	43
СТРТЕ\Л/1 Н6С	44
СТЬРЕЖНССЕС	45
СТЬРЕУЛ/ЕАСЬС	46
СТЬЖЖЫЫ-СМС	47
СТЬАЕЕЬАЗСУЕОС	48
ΟδίΌΕΕΙ-δΗΟΟΥνΟ	49
СТЬКЕЕЬОРТТАУС	50
0Τί.ΚΕννΐ ν3ΗΕννν0	51
РЕСРТ1 РО\Л/М	52
ЕбРТЬКОУУЬА	53
ЕКСРПЛ/АКАС	54
РЕСРРСА/МММ	55
С6ТЕ(ЗРТ1-8Т\М-0С	56
СЕСЮСРТЫЕУАКС	57
СЕ1А/СРЗЬМЗЖТС	58
ΟίΤΟΡΕνΤΟννίΥΕΟ	59
СРАСРТЫЕЖТЬС	60
САО(ЗРТЬРЕ\Л/1бЕС	61
СССТЬРЕЖНСбЕССС	62
С6САОеРТЬКЕ\Л/13ЕССС	63
ΟΝΑϋΟΡΤίΚΟννίΕΘΡΡΡΚΝ	64
ΙΑΙΕΟΡΤίΚΩννίΗΟΝΘΚΟΤ	65
НбРУбРТЬРЕУЖТСА/АТКК	66
ΤΙΚΟΡΤίΡΟννίΚδΚΕΗΤδ	67
ΙδΟΘΡΤίΚΕννίδνΤΚΘΑδ	68
δίΕαρτίΡΕννίΤδΗΤΡΗδ	69
ΘΑΡΕΘΡΤίΡΟννίΕνννπνΟ	70
κϋΐ ο<3ρτι ροννι ρι ρδνα	71
ΑΙΡΟΟΡΤίΚΟννίΕΥΡΡΟΑ	72
АЕЮЕ<ЗРТ1 КЕ\Л/1 Е\ЛЛ/РМС	73
ЕАЫОРТЬКЕ\Л/1А\Л/ККАО	74
ΜΑΚΟΟΡΤίΚΕννίΡΤΥΡΜΜ	75
УУМРЕСРТЬКСМД-ЕНОРвС!	76
ΗΙΡΕΘΡΤίΡΟννίνΑΙΡΜν	77
01 6Η6ΡΤ1-Κ0ννΐ-δννΥΚ6Μ	78
ΕίΚΩΘΡΤΙ-ΗΕννί-ΟΗΙΑδΚ	79
νΟΙΕΟΡΤίΚΟννίΑαΡίΝΡ	80
ννδΡϋδΡΤΙ-ΡΕννίΑννΡΑνΟ	81
ΑνΡΩΟΡΤίΚΰννίίννΚΡΌΑ	82
ΡΙΡΕΟΡΤίΚΕννίΑΟΡΡΟΕ	83
ΡΕΑΕΟΡΤΙ-ΡΕννί-ΕΟΗΚΙ-ν	84
ΟΡΕΟΘΡΤΙ-ΚΕννίΑΑΙΚδν	85
ΑΘΚΕΟΡΤΙ.ΚΕ\Μ.ΝΜΚ\/ννα	86
АЬОЕСРТЬРСПЛ/1(3\ЛЮа\МЗ	87
ΥΟΟΕΟΡΤίΚαννίνΟίΟΙΟ	88
\МСКЕ6РТ1-КЕ\М.К\ЛгеЕ1-С	89
СЗЗССРТЬКЕ^ЮСРРМО	90
сзмссртькстасл/РАк	91
СО1ССРТЬРЕ\Л/1АСРЬОА	92
СМ/Е06РТ1.КЕ\Л/1-С1С1Л/ЕР	93
ΟΚΘΟΟΡΤΙΗΟννίδΟΕΡννΟ	94
СЕЮССРТЬКСМДАСЬСЮК	95
Е1 РЗСРТ1 КЕ\А1\/7УР1АС}	96
ΘΟΡδΟΡΤίΡΕννίΑΟΚΕνΟ	97
ТСЕОСРТЬРСМ/И-СРОСР	98
ООУСОЕбРТЬКаЖУСЬОЬОНб	99

- 20 011879

Таблица 6. Последовательности пептидов, связывающихся с Апд-2

Последовательность	5ΕΟ Ю ΝΟ.
ννορνντ	100
ννϋρνντο	101
ΟζΛ/νϋΡννΤ (ννΐΊβΓθίη ζ2 ίδ ап ас1(йс ог пеи(га1 ро1аг аггппо аай гезИие)	102
ΟζΛΛ/ϋΡννΤΟ (ννήβΓβίη ζ* ίβ ап аскЛс ог пеи1га1 ро1аг ат1по ас1<1 гезк!ие)	103
ΡΙ КО ΕΕΟΟννϋΡννΤΟΕΗΜννΕν	104
ТМЮЕЕСЕУУОРУУТСОНМРСК	105
ννΥΕΟϋΑΟΕννΟΡνντΟΕΗΜΑΕν	106
ΝΚίΘΕνΟΕννΟΡνντΟΕΗΜΕΝν	107
ААТОЕЕСЕ\Л/ОРУ\/ТСЕНМРКЗ	108
ίΚΗΟΕΟΟΕννΟΡννΤΟΕΗΜΡΟνν	109
νΡΚΟΚΟΟΕννϋΡννΤΟΕΗΜΥνβ	110
518НЕЕСЕ\Л/0Р\Л/ТСЕНМСМЭ	111
ννΑΑΟΕΕΟΕννϋΡνντΟΕΗΜΟΠΜ	112
•ПЛ/Р00КСЕУУ0РУ\/ТСЕНМ68Т	113
ΘΗδΩΕΕΘΘννΟΡννΤΟΕΗΜΘΤδ	114
ΟΗννΟΕΕΟΕννΟΡννΤΟΟΗΜΡδΚ	115
ΝνΚΟΕΚΟΕννΟΡννΤΟΕΗΜΡνΚ	116
Κ860νΕ0ΝννϋΡννΤ0ΕΗΜΡΚΝ	117
νκτοΕΗϋοννορνντοΕΗΜΠΕνν	118
ΑννΘΟΕΘΟϋννΟΡννΊΌΕΗΜΙ-ΡΜ	119
ΡνΝΟΕϋΟΕννΟΡννΤΌΕΗΜΡΡΜ	120
КАРОЕОСЕ\Л/ОР\ЛГГСАНМ01К	121
ΗΟΟΝΜΕΟΕννΟΡννΤΟΕΗΜΡΠΥ	122
ΡΚίΟΕΕΟνννΟΡννΤΟΕΗΜΡίΚ	123
ΚΤΤΟΕΚΟΕννΟΡννΤΟΕΗΜΕδΟ	124
0Т80Е0С\ЛЛ/0Р\Л/ТС0НМУ83	125
ΟνίΘΚΡΟΕννΟΡννΤΟΕΗΙ-ΕΘΙ	126
\Л/АСЮЕЕСА\Л/ОР\/УТСОНМ\Л31	127
1 РСОЕОСЕЖ)РУЯСЕНМУК8	128

- 21 011879

ΡΜΝΟνΕΟΟννϋΡννΤΟΕΗΜΡΚδ	129
ΡΘνν3Η60Ενν0ΡννΤ0ΕΗΜ68Τ	130
ΚδΤΟΟϋαοννΟΡννΤΌΕΗΜνΟΡ	131
ΟΡΚΙδΤΟΟννϋΡννΤΟΕΗΜΟαΐ	132
δΤΙΟΟΜΟΕννΟΡννΤΟΑΗΜΟνΟ	133
νίΘΟΩΟΟΕννΟΡννΤΟΚΙ-Ι-αΟνν	134
νίΟΟΟΘΟαννΟΡννΤΟδΗΙ-ΕΟΟ	135
ТТ1О8МСЕ\ЛЮР\Л/ТСАНМС)О(3	136
ΤΚΘΚ8ν00νν0ΡννΤ08ΗΜ086	137
ΤΤΙΟδΜΟΩννΟΡννΤΟΑΗΜΟΘΘ	138
νννΝΕννΟΕννϋΡννΤΟΝΗννΟΤΡ	139
ννον6ΜθοννορνντοκΗΜκι.α	140
ΑνΟδΟΤΟΕννΟΡννΤΟΑΗΐνΕν	141
ΩΟΜΚΜΕΟΕννΟΡννΤΟΆΗΐνΥΚ	142
ттю8мса\л/ор\л/тсЕнмскзе	143
ΤδΩΒνΘΟΕννΟΡννΤΟαΗίΤΥΤ	144
οννεννρροΕννορνντοοτνννρδ	145
6Τ8Ρ8Ε00νν0ΡννΤϋ8ΗΜν0Θ	146
ΟΕΕΟΕννΟΡννΤΟΕΗΜ	147
ΟΝΥΚΡΙ-ΟΕΙ-ΟΑΤΙ-ΥΕΗΕΙΕΗΥΤ	148
ίΝΕΤΡίΟΕίΕΩΤΙΥΕαννηΟΟδ	149
ΤΚΡΝΡΙΟΕΙΕΩΤΙΥΕΟννΤίαΗα	150
νΚΕΚΡίϋΑΙΕΟΤΙ-ΥΕΗννΜΕΟΟΑ	151
νΚΥΚΡίΟΕίΟΕΙΕΥΕΟαΤΡαΕΚ	152
ΤΝΕΜΡΜΟΟΕΕΟΚίΥΕΟ ΕΙ 1.006	153
ЗКРКРЬОЕЬЕОТЬУЕОУТТЮНА	154
океорюеьеотьуеоемюоа	155
ΟΝΕΚΡΙΥΙΟΕίΕΟΤΙΥΚΟΕΙ-ΕΟΗδ	156
ΥΚΕΤΡίΟΟίΕΟΤίΥΕΟΙΛ/ΠΟΗν	157
ΟΕΥΕΡίΟΕίΟΕΤίΥΝΟ\Λ/ΜΕΗΟΚ	158
8ΝΕΜΡ1.0ΕΙ-Ε0ΤΕΥΕ0ΡΜΙ-0Η0	159
οκυοριοειοκτιυοοεμιοοο	160
ΟΚΕΟΡίΟΕίΕΕΤίΥΚΟννΤΕΟΟΚ	161
νΚΥΚΡΙ ΟΕΙ ΟΕννΐ-ΥΗΟΕΤΙ.ΗΗΟ	162
ОКЕМРЮЕЮЕНУЕОЕМЕООЗ	163
ΟΤΕΟΡΙ ϋϋΙ-ΕΕΥΙ-ΥΕθννΐΡΚΥΗ	164
ΕϋΥΜΡΙ-ΟΑΙ-ΟΑΟΙ-ΥΕΟΕΙΙ-Ι-ΗΟ	165
ΗΤΕ0Ρί0ΕΙΕΕΤί.ΥΥ0ννΐ-Υ00Ι-	166
ΥΚΕΝΡΜϋΕίΕΟΤΙ-ΥΕΕΕΙ-ΕΟΗΑ	167
ΤΝΥΚΡίϋΕ Ι ΟΑΤ1 ΥΕ Η\Λ/11.(2 Η 8	168
окекреоееео^еоуттюор	169
τκΕθΡΐ θΕΐ οο·π.ΥΕον\/ΊΊ-θοκ	170
τΝΕΟΡίοΕίοοτίΥΕοννηοοκ	171
ΚΕΝΡΙ-ϋΕΙ-ΕΕΤΙ-ΥΕΟΕΤΕΟΟ	172
Α6ΘΜΡΡΥϋ<3ΜΙΑ3ννΡΝΥθνθΑ	173
αίγνοοροΜΗΐίΘΡνπ/νκκοι	174
ΑΡΘΟΚΡΥϋΘΜίΘννΡΤΥΟΚίν	175
δΘΟίΒΡΟΕΕΙΕΘΟΘΤΟΝίΑΙ.	176
РеоККРЬЕСМЕСОРЮЬСРЯ	177
6001 ΚΡ0Ε0ΜΡ606ΤΚ0ννΥΘ	178
ΚΚΡΟΕΕΙΕΟΘΟΤΥΟ	179
ΟΕΕΥΟϋΟΜΕΟΡΕΤΕΟΌΟΚΟΤ	180
ΚΙ ΕΥ006ΜΕ0ΡΕΤ060ϋΝ08	181
Ι,ΟΕννΟΕΘνΕΟΡΕΤΕΘΟΕΚΟΚ	182
ΑΟΟΥΟΕΟΜΕΟΡΕΤΕΟΟΕΜΟΚ	183
Ι Ι 0Υ0Εθν00ΡΕΤΕ<30ΕΝΙ 0	184
Η0ΕΥ0Ε6ΜΕ0ΡΕΤΕ60ΕΥ06	185
МШУСЕбМООРЕТЕбСОКОМ	186
ίΟΟΥΟΕΘνΕΟΡΕΤΕΘΟΕΝΟΡ	187
Ι ΟΟΥΟΕ6\/ΕΟΡΕΤΕ60ΕΚΟΚ	188
ΕΟΥΟΕΟνΕΟΡΕΤΡΘΟϋΝΗ	189

- 22 011879

Таблица 7. Последовательности НСБ-связывающих пептидов

Последо вател ьность	5ЕО ΙΡ ΝΟ.
Τ6ΥΤΕΥΤΕΕννΡΜ6ΕΘΥ0νν8Ε	190
ΤΡννίδΡΓΡΕΥΕΟΥΕΘΙΜΡΡΘ	191
ΕΜΚΕΡΝΡννΚΙΛ/ΕΡΡ<20ννΥΥΘ	192
\Л/КАРНЕЕЕЬАРРНЕНЕЕРЕ	193
Ε8ΥΐννΐΡΕΤΡ8ΝΙΡΚΥΜΙ ννΐ	194
УМЕРКУРЕРУЕРУУРУУЗЬКЬУ	195
ΤννΗΡΚΤΥΕΕΕΑΙ-ΡΕΕνΡΕΑΡ	196
ννΗΕΟΤΡΥΙΟΟΟΡΟνΥννίΟΑΡ	197
νννΝΥ<3ΡΕΕΜΝΕΡΡ8ΤΥΕΙ-ΗΕ	198
ννΚΙΗ8ΚΡ1 ΡΥ8Η\ΛΛ/ΕΕΡΑΡΡ	199
ΕννΡ6Ν0ΡΡΡ1Ι νΡννΡννΝΡΡν	200
ΡΥ8ίΕννΐΚΡΗ8ΕΕΕ0ΤνΤΕνν	201
ΟΕΜΕίί-ΚΕΕΝδΡΟΡδδΗΗΡΙ.	202
ΤΝνΡννΐ8ΝΝννΕΗΜΚ3ΕΕΤΕΡ	203
ΡΝΕΚΡΥΟΜΟδννΕΡΡΡννΡνΡΥ	204
ννδΗΤΕνννΡΩνννννΚΡΡΝΗΕΥν	205
ννθΕννΐΝΡΑθνΗΜΗΕΘΕΙ8Ε8	206
УРУУЕНРНР1У/Е1180Р№11А	207
νΐ ΗΙ.0ΡΡΚ0νν8ΝΕΡΡΘνΐΕΙ-	208
ΙΗΟϋννΕΤΕΕΟΟνννα	209
ΥΜΟΟΟΕΑΚΡΟΟΡανν	210
КЮСОУ8Е86СРТ1	211
ЕЮСЕ18ОСАСРАР	212
КЮСЕЕ8Т8ОСРРЬ	213
КЮСЕЕЗТОССРРЬ	214
К1 0СЕЕ8Т86СР\М.	215
ΙΟΟΟννΕΤΕΕΟΟΡννα	216
бЕРСРЫРУУСНУЮЗСЕСЕ	217

I ЗЕРСРМРУУбНКЬОЗСЕСЕ | 218

- 23 011879

Таблица 8. Последовательности пептидов, связывающихся с миостатином

Последо вательность	8ΕΟ Ю ΝΟ:
КОКСКМХ/УНМЛСКРР	647
КОЬСАММНММСКРР	219
ΚϋίΟΚΜννκννΜΟΚΡΡ	220
КОЬСКМУУНУУМСКРК	221
ννΥΡΟΥΕΡΗΕννΟΥΟί	222
ννΥΡΟΥΕΘΗΡννϋΥΟΙ.	223
ΙΡΘΟΚννννοναΟΥΟΡ	224
1РССЮЛМЮУОСУОР	225
ΑϋννονδΡΝννΡΟΜνΜ	226
НКЕСР\ЛЛЛ/А1.ЕС\Л/ОЕ	227
КОЬСКМУУНУУМСКРР	228
ЮКСАПЛЮУУМСРРЬ	229
ννΥΡΟΘΕΕΘΜννΟΙΝν	230
ννΕΤΟίννΝΟϋΝΕ	231
НТРСР\Л/ЕАР1-С\/Е\Л/	232
ΚΕννΟννΚννκννΜΟΚΡΕ	233
ΕΕΤΟΡδννΑΥΕΌίϋΙ	234
ΑΥΚΟΕΑΝϋνν(3Ο\ΜΛΛ	235
ΝδννΟΕΟΟννΗΚΟννννί.	236
ννδΑΟΥΑΟΗΕννΟΥΟΙ-	237
ΑΝννονδΡΝννΕΟΜνΜ	238
ννΤΕΟΥΟαΕΕννοννΝΙ.	239
ΕΝΤΟΕΡννκννΜΟΡΡΚ	240
ννί,ΡΟΗΟΕΟΕννΟΜΝΕ	241
5ΤΜ050ννΗννΜ0ΝΡΕ	242
ΙΕΘΟΗννννονΟΌΥΟΕ	243
ΙΥΟΟΚννννΟΙΟΟΥϋΙ	244
РОУ(/СЮРОУ\ЛЛ/СКНЛ/	245
ΩΘΗΟΤΡννΡ\Λ/ΜΟΡΡΥ	246
ννΟΕΟΥΚΕΟΕννΟίΟΤ	247
\Л/Е0СУ6РСЕКС\Л/8Р	248
СУКСРКСНЬ\Л/СЬУР	249
Η\Λ/Α0ΘΥννΡ\Λ/80Κννν	250
ΘΡΑΟΗδΡννννννονΕΘ	251
ττννοίδΡΜννροδοο	252
ΗΚΕΟΡΡννΑΙΡΟννϋΕ	253
ΡϋννονδΡΚννΥΟΝΜνν	254
\ЛЛ/КСН\УЕСМЭСЕРТ	255
ккнсомтл/мсАРк	256
ννΡΟΟΟδΤΙ-ΡννϋΥΝΙ	257

- 24 011879

ννδΡΟΥϋΗΥΡΥΟΥΤΙ	258
3\Л/МС<ЭРРКЕУСМ\М/	259
ΕΜΙ-ΟΜΙΗΡνΕΟΝΡΗ	260
ίΚΤΟΝί-ννΡννΜΟΡΡΙ-	261
ννΘΟΚννΥΕΑννΟΥΝΚ	262
ΡΙΗΟΤΟννΑννΜΟΡΡΤ	263
ϋ8Ν0ΡννΥΕ1-30νΐΕ	264
ΗίννΟΝίΑΜΜΚΟνΕΜ	265
ΝΙΟΟΙΥΡίΟΚΟΙΥΡ	266
ΑννΚΟΜννΡδϋνΟΤΡΟ	267
ννΡΚΟΡΕΟΑϋννΟΤδν	268
ΕΚΙΟΟΜννδννΜΟΑΡΡ	269
ννΡΥΟΗίΝΚδΕΟΤΕΡ	270
ρννκοΑίοΐϋκοκκν	271
ΝΙΘΟΚννΥΕνννΟΡΤΥ	272
ΙΟίΟΝΜννϋΟΜδΥΡΡ	273
ΕΜΡΟΝίννΟννΜΟΡΡν	274
ννΡΚΟνίΤΘίνοννδΕΟΡΘΕ	275
ΘΡδΟΤΡΟΙ-ΟΕΡΥνΟΟδΡΡ	276
ίΡννϋΗΟΟνΝΑΟννΟΡΟΜίνν	277
ΥΡΤ0δΕΚΡννΐΥ60Τ0νΐ νν	278
ίΘΡΟΡΙΗΗΘΡννΡΟΥΟνΥνν	279
РРРСЕТН013УУЬ6НСЬЗЕ	280
Н\Л/6СЕ0ЬМ\Л/61Л/НРЬСРКР	281
ίΡΙ-ΟΟΑΟΜΜΡΤΙΘΡΟνΑΥ	282
δΗννΟΕΤΤΕννΜΝΥΑΚΟνΗΑ	283
1 РКСТНУРР00(э6ЕС1.УУУ	284
ΡδδοννδΡνδκοϋΜΡονργ	285
δΗΚΟΕΥδΟννίΟΡίΟΥΕΡ	286
ΡννννΟΟΟΝΥνΟΗΜΙΗΟΟδΡ	287
ννΡΚΟΜΕΜΝδΡΟΑΡΟΟνδΥ	288
ΡϋΑΟΚΟΟΡννΥΜΡΜΘΟΜίΘ	289
Е1-АСРУЕЕЕЬСРОЗ	290
δΑΥΟΙΙΤΕδϋΡΥνί-ΟνΡΙ	291
ΡδΙΟΕδΥδΤΜννίΡΜΟΩΗΝ	292
ννίΟΟΗΟϋδννΑννΤΚΜΟΚδΗ	293
ΥΙΝϋνΜΜΝΤδΡΡνΕΟνΡΝ	294
ΥΡννΟΟΘΡΜΙΟΟΘΙΤΟΜΡΥ	295
ΡϋΥοτννίΝΟΡΚοννκεννδκ	296
ίΡίΟΝίΚΕΙδΗνΟΑδνίΡ	297
δΡΕΟΑΡΑΚννίΘΙΕαοαΚϋ	298
ΥΡ0ΘΡΝΙ-Η1-1-Ε\Λ/ΤΕ00ννΡ	299
ΕννΡΟΕΙΥΟδΕΡίΡΚΟννΡΡ	300
1-\/6СОМ\ЛЛ/НКСК1-Р	301
А6УУСН\М/6ЕМРСМ6С5А1-	302
ННЕСЕУУМАЕ!\Л/М51-0€Л/61	303
ΡΡΜΟΟΙΑΟΜΚϋΡΟΡΟνννΥ	304
ΚΟΟΟΤΡννΡΕννίννΚίδΕΚΡ	305

- 25 011879

ΥΝΡ08ΥΙ Ρβν8ΚΕΑ0αΐ.Ρ	306
ΑΗννΟΕΟΟΡννΗΥΘΝΙΟΜΑΥ	307
ΝίνΟΘΚΙδΑννΘΟΕΑΟΑΚΑ	308
ΗΝνΟΤΙΜΘΡδΜΚννΕΌννΝΟ	309
ΝΟίΟΑΜννοννΚΝΤίννΟΟΝδ	310
ΡΡΕΟΩΝΟΝΟΜΙΟδίΟΚίί	311
νι/ΥϋΟΝνΡΝ ЕЬЬЗСЬСРЬЕ	312
ΥΘΟΟϋΟΝΗννΜννΡΡΤΟΙδΙ	313
СММСНЕО1 НО\МЗАТСС!Р0	314
ΥΡΗΟΜΡΘΟΗΕΡΕνΗΟΕδΡ	315
ΑΥννοννΗοοονκρ	316
δΕΗννΤΡΤϋννΟΘΝΕνννννΚΡΡ	317
МЕМЬ03ЬРЕЬЬК0М\/Р13КА	318
ΘΡΡΕΕΑΙΜΕννίΟννΟΥΟΚΡΤ	319
δΡΕΝίίΝοίΥΐίΜΤκαεννΥθ	320
ΡΗννΕΕΟΙΡΡΗ\Λ/ΤΡΥ3ΥΟΚΜ	321
ΚΡίίΕΟΡΜΝΟίΑΕίνδΟΗδ	322
ΟΤΡΟΑίΡΟΕΕΥΕΡνΡ3Ρΐνΐ	323
ΡΜδΑΑΡΡΡίΤΥΡϋΙΜϋΩΥννΗ	324
ΝΟΚΑΗΡΡΕΜΡΜΡϋνΗΝΡνΕδ	325
ΟΤΟΛΟΚΙΟΘίννΕΙΙ-ΟδΙΡΝΟ	326
Μ!8ΕΡΕΕΡΙ ΘΝΙ\/ΗΡΟΕΑ	327
ΥΤΡΚΜΟ3ΕννΤ8ΕννΗΝΡΙΗΥΙ	328
Ι ΝΟΤΙ.Ι-ΡΕΙ-ΚΜνΐ-Ν8Ι.3ΟΜΚ	329
РОУЕЕЮЬМЕМЛ-ЕСРМОЗААТ	330
ΗΗΘννΝΥΙΡΚΘδΑΡΟννΡΕΑννν	331
УЕЗЬНОЮМ^ЕООКкАЗбРН	332
ΡΑΤίίΚΟΡννΟίνΕΟΥΘΟΝ	333
ЕЕШНЕРУРРУЗАРОУ	334
<ЗЫОЕРЗНР1АЕОРУОМР66	335
ΥΡΕΜ8ΜΙ Ε(31-1-0νΗΞΡΙ-0ΗΥ	336
ΗΝδδΩΜΙΙδΕίΙΜίνΟδΜΜΟ	337
ννΚΕΗΓΙ-Ν30ΥΙΡΟΚυΑΙΟΟ	338
ΟΕΡΡΥνΕΟΟίΡΑΟΙΕΥννίΑ	339
ΕΡΡΗννΐ-ΗΝΗΡ8ΕνΝΗννΐ-0ΜΝ	340
ΕΑΙ-Ρ0ΝΡΕΡ0νΐ ΤΙ-8ΕΡΕΥ	341
ΟΥννΕΟΟννΜΠι'ΡΡΕΝΘίΗνΩΥ	342
Ν0ΡΜΜίΕ0ί\Λ/ΡΙΜΤΡΜΡ6Ε3	343
ΡίΟΕΙΚΑΕίδΡΗΥΑίΟΟίΟΕ	344
ΘΚΙΙΕΘΙΙ-ΝΕΙ-Μαΐ-ΕΤΕΜΡΟ	345
1Ш.0ЕУКК0УУК5УУР	346
0ΘΗ0ΤΡννΡννΜ0ΡΡΥΘ3Θ8ΑΤ603(33Τ АЗЗСЗОЗАТСОСНСТРУУРтлСРРУ	347
ννΥΡ0ΥΕΘΗΡνν0Υϋ163(35ΤΑ83(38Θ8 ΑΤΘννΥΡΟΥΕΟΗΡννΟΥϋί	348
ΗΤΡ0ΡννΡΑΡί0νΕνν08Θ8ΑΤ663Θ3ΤΑ 38С8С8АТ6НТРСР\Л/РАР1-С\/Е\Л/	349
Ρϋνν0Ι0Ρ0\ΛΛΛ/0ΚΡννθ805ΑΤβΟ3(33Τ	350

- 26 011879

ΑδδΘδΘδΑΤΘΡΟννΟΙΟΡϋννννΟΚΕνν
ΑΝννθν5ΡΝννΡΟΜ\/ΜΘ5Θ8ΑΤΘΘ5Θ8Τ ΑδδΟδΘδΑΤΘΑΝννονδΡΝννΡΟΜνΜ	551
Р0УУСЮР0У\ЛЛ/СКЕ\ЛКЭ8<Э8АТе<Э868Т ΑδδΘδΘδΑΤΘΡϋννοιοροννννοκΕνν	552
ΗννΑΟΘΥννΡννδΟΚνννΘδΘδΑΤΘΘδΘδ ΤΑδδθδΘδΑΤΘΗννΑΟΘΥννΡννδΟΚννν	553
ΚΚΗΟΩίνντννΜϋΑΡΚΘδθδΑΤΘΘδΘδΤΑ δδΘβΘδΑΤΘΟΘΗΌΤΚννΡννΜΟΡΡΥ	554
0ΘΗ0ΤΚννΡννΜ0ΡΡΥ68Θ8ΑΤΘΘδΘδΤ ΑδδΘδΟδΑΤΘΚΚΗΟΟίννίννΜΟΑΡΚ	555
ΚΚΗ00ΐνντννΜ0ΑΡΚΘδΘ8ΑΤΘΘ86δΤΑ δδΟδΘδΑΤΘΟΟΗΟΤΚννΡννΜΟΡΡΥ	556
ΚΚΗΟΟίνντννΜΟΑΡΚΘΘΘΘΘΘΘΘΟΟΗ ΟΤΡ\Λ/ΡννΜΘΡΡΥ	557
ΟΘΗΟΤΚννΡννΜΟΡΡΥΘΟΟΟΟΟΚΚΗΟΟΙ \лгпл/мсарк	558
νΑίΗΘΟΌΤΡννΡννΜΟΡΡΟΡΕΘ	559
ΥΡΕΟΘίΟΤΡννΡννΜΌΡΡΟΤΙ-Α	560
61·Ν06Η0ΤΚννΡννΜ0ΡΡα08Ν	561
ΜΙΤΟΟΟΘΤΡννΡννΜΟΡΡαΡδΘ	562
ΑΘΑΟΕΗΟΤΡννΡννΜΟΑΡΝϋννΐ	563
ΘνΝΟΟΟΟΤΡννΡννΜΟΡΡΝβννΕ	564
ίΑΟΗΘΟΟΙΡννΡννΜΟΡΡΕΘννΕ	565
ΙίΕαΑΩΟΤΡννΡννΜΟΡΡαΡΘΟ	566
ΤΟΤΗΑΩΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟννΕΟ	567
\л/тоенстшруумсррор\л/р	568
ΙΥΡΗϋΟΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟΡΥΡ	569
δΥννΟΘΟΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟννΚΘ	570
М7УООеНСТР\Л/РОТМСРРСЮ\ЛГО	571
ЕЕЛЖНСТРУ/РММСРРОРбО	572
1-ООС1У7<ЗСТРУ\/Р\Л/МСРРООЕ8	573
ΥΟΤΟΟίΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟδΟΡ	574
ΕδΝΟΟΟΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟΟΟνν	575
ννΤϋΡΘΡΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟΑΝΘ	576
νΘΤΟΘΟΟΤΡννΡννΜΟΡΡΥΕΤΘ	577
ΡΥΕΟΘΚΟΤΡννΡννΜΟΡΡΥΕνΕ	578
5ЕУ06ЬСТР\Л/Р\Л/МСРР0еУУК	579
ΤΕδΟΘΗΟΤΒννΡννΜΟΡΡ(26νν<3	580
ΡΘΑΗΟΗΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟδΡΥ	581
νΑΕΕννΗΟΡΡννΡννΜΟΡΡΟΟννΡ	582
νθΤΟΘΗΟΤΡννΡννΜΟΡΡαΡΑΘ	583
ΕΕΟΟΑΗΟΡδννΡννΜΟΡΡΟβννν	584
ΑϋΤΩΟΗΟΤΡννΡννΜΟΡΡΟΗννΕ	185
δΘΡΟΟΗΟΤΡννΡννΜΟΑΡΟΘννΕ	186
ΤίνΟΘΗΟΤΡννΡννΜΟΡΡαΡννν	387
СМАНСКСТРУУАУУМСРРОЗУ/К	388
ΕΙΥΗΘΟΘΤΡννΡννΜΟΡΡαδννΑ	189

- 27 011879

УАОНОНСТЕбЛ/РХЛ/МСРРСКЖб	590
РЕ8<2(ЗНСТгаЛ/Р\Л/МСРРС1(3\Л/е	591
1 ΡΑΗΟΗΟΤΚννΡννΜΟΡΡακννΚ	592
ΡΤνΗΟΗΟΤΚννΡννΜΟΡΡΥΟννν	593
рорренстгал/кхл/мсррсюхл/Е	594
аьуусюрстсмруумсррквку	595
ΗΑΝϋΟΗΟΤΡνναννΜΟΡΡαννΘΘ	596
ЕТОНС1 СТКУУР\Л/МСРРУСАК	597
οτννοαιοτκννρννΜΟΡΡαΘννο	598
νΑΤΟΟΟΟΤΚννΡννΜϋΡΡΟΟννΘ	599
νΑΤΟΘΟΟΤΡννΡννΜΟΡΡαΒννΟ	100
ΟΒΕννΥΡΟΥΟΟΗίννΟΥΟΙΗΚΑ	101
Ι8ΑννΥ3ΟΥΑ(3ΗΡννθννθΙ-ΚαΚ	402
ννΤΘννΥΩΟΥΘΘΗίννΟΥΟίΡΒΚ	103
ΚΤΡννΥΡΟΥΟΟΗΕ\Λ/ΟΥΝΙ-Κ88	104
Ε3Κ\Λ/ΥΡ0ΥΕ6Ηίνν0Ρ0ίΤΕΤ	105
ΜΕΜίΟδίΡΕΙίΚΟΜνΡΙδΚΑ	106
ΚΜΕΜίΕ8ίίΕίίΚΕΐνΡΜ8ΚΑβ	107
ΡΜΕΜΙ-Ε81-1-ΕΙ-1-ΚΕΐνΡΜ8ΚΑΡ	408
ΚΜΕΜίΕ8ίίΕίίΚ0ΐνΡΜ3ΚΡ8	109
6МЕМЬЕ8ЬРЕЫ0Е1\/РМ8КАР	110
ΡΜΕΜΙΕ8Ι-ΙΕΙ±Κ0ΐνΡΙ3ΝΡΡ	111
К1ЕМиЕ8ЬЬЕИ0Е1\/Р18КАЕ	412
ΡΜΕΜΙΧ)31-1-ΕΙ-Ι-ΚΟΐνΡΜ8ΝΑί4	113
ΡΜΕΜΙ-Ε81-ΙΕ1 1-ΚΕΐνΡΤ3ΝΘΤ	114
ΡΜΕΜΙ-ΕβΙΡΕΙ-Ι-ΚΕίνΡΜδΚΑΟ	115
ΡΜΕΜΙΘ3ίίΕίίΚΕΐνΡΜ8ΚΑΚ	416
ΟΜΕΙίΟδίΡΕΙίΚΕίνΡΚδαΡΑ	117
ΚΜΕΜΙ 031.1-ΕΙ-Ι-ΚΕΐνΡΜ3ΝΑΡ	418
ΒΜΕΜίΕ3ίίΕίίΗΕίνΡΜ80Α0	419
ΟΜΕΜΙΕδΙίΟίΙΚΕίνΡΜδΚΑε	420
КМЕМЬОЗЬЬЕНКОМУРМТТбА	421
ΚΙΕΜΙ.Ε8ί-1-Εί-Ι-ΚΟΜνΡΜΑΝΑ3	422
ΚΜΕΜΙ Ε8Ι1-αΐ.Ι.ΝΕΐνΡΜ8ΡΑΡί	123
ΡΜΕΜίΕ31ΡϋίίΚΕίνΡΜ8Κ0ν	124
ΚΙΕΜΙΕ81ίΕίίΚ0ΐνΡΙ0ΚΑΡ	125
ΚΜΕίΙΕ8ίΡΕίΙΚ0ΜνΡΜ3038	126
ΡΜΕΜίΕ81ίΕνίΟΕΐνΡΚΑΚΟΑ	127
ΚΜΕΜί08ί10ίίΝΕΐνΡΜ3ΗΑΚ	128
ΚΜΕΜΙΕ5Ι ΙΕΙ 1-Κ0Ι\/ΡΜ8ΝΑ0	129
ΚΜΕΜΙ Ο3Ι ΡΕΙ Ι ΚΟΜνΡΙ8ΚΑΘ	430
ΗΜΕΜΙΕ8Ι ΙΕΙ Ι-ΚΕΐνΡΝ8ΤΑΑ	431
РМЕМ1 О31 ЬЕ1.1-КЕ1Х/Р18КА(3	432
Р1ЕМШ31 1 Е1,1МЕ1-УРМ8КАК	433
ΗΗΟννΝΥίΚΚΘδΑΡΟννΡΕΑννν	434
ονΕδίααΐ-ΐ-Μννι,οακίΑδΟΡαο	435
КМЕИЕЗЬРЕИКЕМУРРЗКАУ	436
ΟΑνβίΟΗΐίΜννίοακίΑδΘΡαΗ	437

- 28 011879

ОЕОЗЬООЫМ^ЬООКкАЗбРОЬ	438
ΡνΑδΕΟΟΙίίννίΟαΚΙ-ΑΟΟΡΗΑ	439
ΕνΟΕίΟΟΙ-Ι-Νννί-ΟΗΚΙ-ΆδΘΡΙ-α	ио
0νΕ3ίΕ0ίΕΜννΐ0ΗαΐΑ86ΡΗ6	441
ανο8ΐ αονΐ-ΐ.ννΐ-ΕΗκΐΑΐ-ΘΡαν	М2
ООЕ31 ОН1.Ш\М.ЕОКкА1.СРН(3	из
СНЕМ1 Е8И-01-1.П0М\/РМ8МАЕ	144
ΕνοείοοίίΜννιοακί-ΑδΘΡΟΑ	и5
Ε0Ε8Ι·00Ι-Ι-ΙΥΙ-0ΚΜΙ.386Ραν	Мб
АМ0С!1-НС|Ш\Л/1-0НК1-А8СРС!А	и7
К1ЕМ1 ЕЗи Е1-Ь0Е1А1.1РКА\Л/	ив
ЕУУЗЮНЬЬМ^ЬЕНКЬАЗОРОО	иэ
06Е81.аа11-МУУ1-0С1С11-А86Р0К	150
бУЕбьаашрюнмьУберно	451
ΝνΕ8Ι ΕΗΙ.ΜΜννΐ-ΕΒΙ ΙΑδ6ΡΥΑ	152
ονοδίαοίίίννίοΗΟίΑεορκρ	153
ЕУЕ8ЬОа1-1-М\М-ЕНК1-АСЮРа(3	154
ЕУО81 аС11.1МУ71-ОаК1-А8СРНА	155
ЕУ081-СЮ1-1-М\Л/1-0СЮЕА8еРаК	456
ЗУЕО1РО1 1-М\ЛЛ-ЕОК1-А8(ЗР0К	|457
еЕ08Ь0С(1-1-МУУ1-0СЮЕАА6РС1У	458
Αϋϋδ [ααι.ι.Μννΐ-οκκΐ-Α8Θ рн ν	459
РУ031-СЮШ\/УиЭ(Ж1А86РСЮ	460
ΚΑΤΙ.Ι.ΚΟΡνναΐ.νΕΘΥΟΟΝ	461
θνν^ΤΕΙΚΕΠ/νθ(-νΕΘΙ-ΘΟΝ[-ν	462
08КАТкЬКЕЕ\Л/0Ь\/ЕСЬ60К0А	463
0СРАТитЕЕ\л/а1УаеьбакЕА	464
ίΑΚΑΤΕίΚΕΡννΟίνΕΟΕΘΕΚνν	465
бзвотьькЕгмоЕУУбизомат	466
ϋΑΡίΑΤίΙΚΕΕνναΐνΟΑΥΘΟΡΜν	467
ΝΟΚΑΟίίΡΟΓννοίνοοί-ονκδνν	468
ЗУНЕТкЬУЕЬУУУНКбЬСАМОб	469
ΟΑΗΑΤίίΚΕΡϋΟίνΟΟΟΘΟΚίδ	470
аЕРАТЫКЕРУУаЬУАОкбОММВ	471
δΟΡΑΤίίΚΕΡννΟίνΟΟΕΟΕΥΚνν	472
ΤΜΚΑΤίίΚΕΕννίΕνΟΟαΒΕΜΟνν	473
ΘΕΡΑΤΙίΝΟΠΛ/ΟΕνοθΟΘΟΝΤΘ	474
ΟΕΚΕΤΕίΚΕΕννΟίνΗΘννΘΟΝνΑ	475
ΘΘΚΑΤίίΚΕΕννΟίΕΕΘΟΘΑΝΙ-ν	476
ΤΑΡίΑΤΕΙΝΕίνοίνΚΟΥΘΟΚίν	477
емкАтыаЕпл/оьуесоеомуум	478
ЗТКАТЫЫООЛ/аЬМКСУУАЕОРб	479
8ЕКАТЬЕКЕ1бЛ/С11-УеО\МЗОЫЕО	480
У6РАТЕ1КЕЕ\Л/аЬУЕСЬУС03Р	481
ΕΙΚΑΤΕίΚΕΡννΟίνΟΕννΚΕαΡΝ	482
ОЕНАТЫКЕЕЮЕУНбЕбЕТОЗ	483
ΤΟΡΑΤίίΚΕΕννΟΙΙΕΘΕΟαΚΗν	484
НУРАТЫКЕЕУУаЬУООЬРЕОСУ	485

- 29 011879

ΟδΗνΤΙΙΚΕΡΛ/ΟίνΕδΥΚΡίνΝ	486
ΙδΡΑΤίίΝΕΡννΟΕνϋΘΟΚΟΚΡΜ	487
ννϋΚΑΤίΤΝΟΕννΗΙΜΕΕΙδαΚΡΘ	488
ОЕКАТИКЕЕУУКМУЕСЬСКЫКС	489
ΝΕΡΑΤίίΚΕΕ\Λ/0ΐν0ΘΥ6νΝ0Κ	490
УКЕМЗМЬЕСЫОУЬЕЕШаНУ	491
ΗΟΡϋΜδΜ 1\Л/Е1 1.0У1.0С1.ВС}УЗ	492
таромзмюспЕУшоккаон	493
ТЗР0М5Ы\Л/ЕПЕЕШКЬ6НаН	494
Μ0Η0ΜδΜ1-Υ61.νΕ1-1-ΕδΙ-ΘΗ0Ι	495
ννΝΒ0ΜΚΜΙ Εδ1.ΕΕνΐ-0ΘΙΗ(20ν	496
бУномзинЕСЫ-АУшнизрси.	497
ТОРОМЗМЬЕСНЕУЮКкеООК	498
ткомзмьЕбььЕУЬокюоак	499
ΗΝδδ<2ΜΙ-Ι-8ΕΙ.ΙΜΐνΘ3ΜΜΟ	500
ΤΟΝδΡΟΜΙΣδΟΕΜΜίνΟδΜΙΟΘ	501
матзкн1ызЕЕммьуез1мне	502
номбномибоиньуетмюб	503
ΜΕΝδΚΟΝίίΚΕίΙΜίνΟΝΜδΗΟ	504
аОТЗВИМИКЕЕММкУСЕМЮС	505
ΟΟΝδΚΟΜΙ-ΙδΟΙ-ΜΙΙ-νΘδΜΙΟΘ	506
ΕΕΕΗννίΗΝΗΚδΕνΝΗννίΟΜΝ	507
ΝνΓΕΟνννΟΚΗΘΒννΥΟννίΟΙΝν	508
ΕϋΕίΟννίΟΝΗΚδΕνΕΗννίνΜΟν	509

Домены Ге

Данное изобретение требует присутствия по меньшей мере одного домена Ес, модифицированного посредством включения последовательности пептида.

Как упомянуто выше, и нативные Ес, и варианты Ес являются подходящими доменами Ес для применения в области данного изобретения. Нативный Ес может быть в значительной степени модифицирован с образованием варианта Ес согласно настоящему изобретению, при условии, что связывание с «рецептором спасения» сохранено; см., например, ΧΥΟ 97/34631 и \ΥΟ 96/32478. В таких вариантах Ес можно удалить один или более сайтов нативного Ес, которые обеспечивают структурные характеристики или функциональную активность, не являющиеся необходимыми для гибридных молекул согласно настоящему изобретению. Эти сайты могут быть удалены, например, замещением или удалением остатков, включением остатков в сайт, или усечением областей, содержащих сайт. Включенный или замещенный остаток может также являться измененными аминокислотами, например пептидометиками или Όаминокислотами. Варианты Ес могут потребоваться во многих случаях, некоторые из которых описаны ниже. Примеры вариантов Ес включают молекулы и последовательности, в которых:

1. Сайты, вовлеченные в формирование дисульфидных связей, удалены. Такое удаление может позволить избежать реакции с другим цистеинсодержащим белками, присутствующими в клетке-хозяине, применяемой для получения молекул по изобретению. Для этого можно отрезать цистеинсодержащий фрагмент на Ν-конце или можно удалить остатки цистеина или заменить их на другие аминокислоты (например, аланил, серил). В частности, можно удалить Ν-концевой фрагмент, состоящий из 20 аминокислот последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 599 или удалить или заменить остатки цистеина в положении 7 и 10 последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 599 Даже если удалены остатки цистеина, одноцепочечные домены Ес тем не менее могут формировать димеры доменов Ес, которые удерживаются вместе за счет нековалентных взаимодействий.

2. Нативный Ес модифицируют, чтобы сделать его более совместимым с выбранной клеткойхозяином. Например, можно удалить последовательность ПА около Ν-конца типичного нативного Ес, которая может узнаваться гидролитическим ферментом в Е. сой, таким как пролиниминопептидаза. Также можно добавить Ν-концевой остаток метионина, особенно если молекула экспрессируется в виде рекомбинантного белка в бактериальной клетке, такой как Е. сок. Одним из таких вариантов Ес представляет собой домен Ес последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 599 (фиг. 2А).

3. Часть Ν-конца нативного Ес удаляют для предотвращения гетерогенности по Ν-концам при экспрессии в выбранных клетках-хозяинах. Для этого можно удалить любой из первых 20 аминокислотных остатков с Ν-конца, особенно находящихся в положениях 1, 2, 3, 4 и 5.

4. Один или более сайтов гликозилирования удалены. Остатки, которые обычно гликозилируются (например, аспарагин), могут вызвать цитолитический ответ. Такие остатки могут быть удалены или заменены негликозилируемыми остатками (например, аланином).

5. Удаляют сайты, вовлеченные во взаимодействие с комплементом, такие как С1с|-связывающий сайт. Например, можно удалить или заменить последовательность ЕКК ΙβΟ1 человека. Рекрутирование комплемента может не быть полезным для молекул согласно настоящему изобретению, и его можно избежать при применении такого рода вариантов Ес.

6. Удаляют сайты, влияющие на связывание с рецептором Ес, но не с «рецептором спасения». На

- 30 011879 тивный Ес может иметь сайты для взаимодействия с определенными лейкоцитами, которые не являются необходимыми для гибридных молекул изобретения и также могут быть удалены.

7. Может быть удален сайт АЗКЦ. Сайты АЗКЦ известные в данной области техники; см., например, Мо1ес. 1ттипо1. 29 (5): 633-9 (1992) в отношении сайтов АЗКЦ Ι§61. Эти сайты также не являются необходимыми для гибридных молекул настоящего изобретения и могут быть удалены.

8. Когда нативный Ес получен на основе антитела, не являющегося человеческим, нативный Ес может быть гуманизирован. Обычно для того, чтобы гуманизировать нативный Ес, замещают выбранные остатки в не принадлежащем человеку нативном Ес на остатки, которые в норме характерны для нативного Ес человека. Способы гуманизации антител хорошо известны в данной области техники.

Предпочтительные варианты Ес включают следующее. В 8ЕО ΙΌ N0: 599 (фиг. 2А) лейцин в положении 15 может быть заменен на глутамат; глутамат в положении 99 на аланин; а лизины в положениях 101 и 103 на аланины. Кроме того, один или более остатков тирозина могут быть замещены на остатки фенилаланина.

Дополнительные носители

Изобретение, кроме того, охватывает молекулы, ковалентно модифицированные посредством включения одного или нескольких водорастворимых присоединенных полимеров, таких как полиэтилгликоль, полиоксиэтиленгликоль, или пропиленгликоль, как описано в патентах США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 и 4179337. Другие применимые полимеры, известные в данной области техники, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие основанные на углеводах, поли-(№винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, олиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси этих полимеров. Особенно предпочтительными являются пептитела, ковалентно модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть связаны с определенными положениями, например по Ν-концам пептител, или могут произвольно присоединяться к одной или более боковым цепям полипептида. Применение ПЭГ для улучшения терапевтической способности агентов со специфическим связыванием, например, пептител, и, в частности, для гуманизированных антител, описано в патенте США №6133426 Гонзалес и соавторов (Сопха1е5 е! а1.). опубликованном 17 октября 2000 г.

На настоящий момент доступны различные средства для присоединения химических агентов, применимых в качестве носителей, см., например, международную публикацию по системе Договора о патентной кооперации (РСТ) № νθ 96/11953 под названием «Композиции химически модифицированных по Ν-концу белков и способы», включенную здесь ссылкой в полном объеме. Эта публикация РСТ описывает, среди прочего, селективное присоединение водораствормых полимеров к Ν-концам белков.

Предпочтительным полимерным носителем является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Группа ПЭГ иметь любую подходящую молекулярную массу и может быть линейной или разветвленной. Средняя молекулярная масса ПЭГ предпочтительно колеблется от приблизительно 2 килодальтон («кДа») до приблизительно 100 кДа, более предпочтительно от приблизительно 5 кДа до приблизительно 50 кДа, наиболее предпочтительно от приблизительно 5 кДа, до приблизительно 20 кДа. Группы ПЭГ обычно присоединяют к соединением согласно настоящему изобретению путем ацилирования или восстановительное алкилирование через реакционную группу ПЭГ (например, альдегид, малеинимид, амино, тиол, или эфирную группу) в реактивную группу в изобретательном составе (например, альдегид, амино, тиол или эфирную группу).

Подходящий подход для присоединения ПЭГ к синтетическим пептидам заключается в объединении через формирование сопряженной связи в растворе пептида и ПЭГ, каждый из которых несет особые функциональные группы, реакционно-способные реактивные по отношению к друг другу. Пептиды могут быть легко получены стандартными способами твердофазного синтеза (см., например, фиг. 5 и 6 и сопроводительный текст). Пептиды «преактивируют» соответствующей функциональной группой в специфическом сайте. До реакции с ПЭГ пептиды-предшественники очищают и получают их полную характеристику. Сшивание пептида с ПЭГ обычно происходит в водной фазе и может легко контролироваться обращенно-фазной аналитической фазой аналитической ВЭЖХ. Соединенные с ПЭГ могут легко быть очищены при помощи препаративной ВЭЖХ и охарактеризованы при помощи аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс-спектрометрией с лазерной десорбцией.

Полимеры на основе полисахаридов представляют собой другой тип водорастворимых полимеров, которые можно применять для модификации белков. Декстраны представляют собой полимеры на основе полисахаридов, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, преимущественно соединенных α1-6 связями. Сам декстран доступен с различной молекулярной массой, и легко доступен с молекулярной массой от примерно 1 до 70 кДа. Декстран представляет собой пригодный водорастворимый полимер для применения согласно настоящему изобретению в качестве носителя или в комбинации с другим носителем (например, Ес). См., например, νθ 96/11953 и νθ 96/05309. Описано применение декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами; см., например, публикацию Европейского патента № 0315456, которая включена здесь посредством ссылки. При применении декстрана в качестве носителя в соответствии с настоящим изобретением предпочтителен декстран мо

- 31 011879 лекуярной массы от приблизительно 1 до приблизительно 20 кДа.

Дополнительными носителями могут являться белки, полипептиды, пептиды, антитела, фрагменты антител или низкомолекулярные соединения (например, соединения-пептидометики), способные связываться с «рецептором спасения». Например, можно применять в качестве носителя полипептид, как описано в патенте США № 5739277, опубликованном 14 апреля 1998 г. Преста и соавторами (Ргс$1а с1 а1). Пептиды также можно выбрать при помощи фагового дисплея при селекции на связывание с «рецептором спасения» БсЯи. Такие соединения, связывающиеся с «рецептором спасения», также входят в понятие «носитель» согласно настоящему изобретению. Следует выбирать такого рода носители с увеличенным периодом полураспада (например, избегая последовательностей, узнаваемых протеазами) и уменьшенной иммуногенностью (например, отдавая предпочтение неиммуногенным последовательностям, как описано для гуманизации антител).

Линкеры

Любая «линкерная» группа является необязательной. Если она присутствует, ее химическая структура не имеет большого значения, поскольку она играет, главным образом, разграничительную роль. Линкер предпочтительно образован аминокислотами, соединенными друг с другом пептидными связями. Таким образом, в предпочтительных способах реализации линкер состоит из 1-20 аминокислот, связанных пептидными связями, где аминокислоты выбраны из 20 природных аминокислот. Некоторые из этих аминокислот могут быть гликозилированы, как известно в данной области техники. В более предпочтительном способе реализации 1-20 аминокислот выбирают из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Еще более предпочтительно линкер образован по большей части из аминокислот, которые не создают стерических препятствий, таких как глицин и аланин. Таким образом, предпочтительными линкерами являются полиглицины (в особенности (С1у)₄, (С1у)₅), поли(С1у-А1а) и полиаланины. Другими специфическими примерами линкеров являются:

(01у)_э1_у8(01у)₄ (ЗЕО Ю N0: 595);

(О1у)зА5пО1уЗег(С1у)₂ (ЗЕО Ю N0: 596);

(С1у)₃Суб(61у)₄ (ЗЕО Ю N0: 597);и 61уРгоАзп61у61у (ЗЕО Ю N0: 598).

Для разъяснения вышеуказанных обозначений, например, (С1у)₃Ьу5(С1у)₄ означает С1у-С1у-С1у-Ьу5С1у-С1у-С1у-С1у. Также предпочтительны комбинации С1у и А1а. Указанные линкеры представлены в качестве примеров; линкеры, входящие в область данного изобретения, могут быть значительно длиннее и могут содержать другие остатки.

Также возможно применение линкеров не пептидной природы. Например, можно применять алкильные линкеры, такие как -(СН₂)₅-С(0)-, где 5 = 2-20. Такие алкильные линкеры могут также иметь в качестве заместителей не создающих стерических препятствий групп, таких как низшие алкилы (например, С₁-С₆)низшие ацилы, галогены (например, С1, Вг), СИ, ΝΗ₂, фенил, и т.п. Примером линкера непептидной природы является ПЭГ линкер

VI

О

где η является таковым, что молекулярная масса линкера составляет от 100 до 5000 кДа, предпочтительно от 100 до 500 кДа. Пептидные линкеры могут быть изменены с формированием производных, как описано выше.

Производные

Изобретение также предусматривает «производные», которые включают молекулы, несущие модификации, кроме или в дополнение к инсерциям, делециям или заменам аминокислотных остатков. Предпочтительно, модификации имеют ковалентную природу и включают, например, химическое связывание с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими веществами. Производные согласно настоящему изобретению могут быть получены с целью увеличения периода полужизни молекулы в кровеносной системе; улучшения способности действовать на молекулы-мишени в интересующие клетки, ткани или органы; или улучшения растворимости или поглощения молекулы; или с целью устранения или снижения любого нежелательного побочного эффекта молекулы. Примеры производных включают соединения, в которых:

1. Соединение или его некоторые части являются циклическими. Например, часть пептида может быть модифицирована таким образом, что она содержит два или более остатка Су5 (например, в линкере), которые могут циклизоваться с образованием дисульфидных связей. Ссылки на источники с описанием получения циклизированных производных, см. табл. 2.

2. Соединении поперечно сшито или обладает способностью к формированию поперечных сшивок. Например, часть пептида может быть модифицирована таким образом, что она содержит один остаток

- 32 011879

Сук и таким образом способна формировать межмолекулярные дисульфидные связи со схожей молекулой. Соединение может также быть поперечно сшито со своим С-концом, как в молекуле, представленной ниже.

VII

Ε¹-(Χ¹ν0Ο-Ν^^-γ^

Е¹-(X¹ )_ь-СО-Й-^--у ΝΗ

3. Одну или более пептидильных связей [-С(О)ХК-] замещают на не являющиеся пептидильными связи. Примерами связей, не являющимися пептидильными связями, являются -СН2-карбамат[-СН2Οί.’(Ο)ΝΚ-|. фосфонат, -СН2-сульфонамид [-ΟΗ2-δ(Ο)2ΝΚ-], мочевина [-ΝΗ^Ο)ΝΗ-], -СН2-вторичный амин и алкилированный пептид [-С(О)ХК.⁶, где К⁶ является низшим алкилом].

4. Получены производные по Ν-концу. Обычно, Ν-конец может быть ацилирован или модифицирован с образованием замещенного амина. Примеры групп, на основе которых получены производные по Ν-концу, включают -ΝΚΚ¹ (кроме -ΝΗ2), -\КС(О)К , -\КС(О)ОК , -ΝΚ8(Ο)2Κ¹, -ΝΗ^Ο)ΝΗΚ\ сукцинимид, или бензилоксикарбонил-ΝΗ- (ΟΒΖ-ΝΗ-), где каждый из К и К¹ независимо представляет собой водород или низший алкил, и где фенильное кольцо может быть замещено 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из С1-С₄алкила, С₁-С₄алкокси, хлора и брома.

5. Получены производные по свободному С-концу. Обычно С-конец эстерифицирован или амидирован. Например, можно применять способы, описанные в данной области техники для присоединения (ΝΗ-ΟΗ₂-ΟΗ₂-ΝΗ₂)₂ к соединениям согласно настоящему изобретению. Также можно применять описанные в данной области техники способы для присоединения -ΝΗ2 к соединениям согласно настоящему изобретению. Примеры групп, на основе которых получают производные по С-концу, включают, напри-

2 3 4 3 4 мер, -С(О)К , где К является низшим алкокси, или -ΝΚ К , где К и К независимо представляют собой водород или С₁-С₈ алкил (предпочтительно С₁-С₄алкил).

6. Дисульфидная связь заменена другой, предпочтительно более стабильной группой с поперечной связью, (например, алкилен). См., например, работы Вйа!падаг е! а1. (1996), 1. Меб. СИет. 39: 3814-9; А1Ьейк е! а1. (1993) Т1нг(ееп(11 Ат. Рер. 8утр., 357-9.

7. Модифицирован один или более отдельных аминокислотных остатков. Известно, что агенты, при помощи которых получают производные, специфично реагируют с определенными остатками боковых цепей или терминальными остатками, как описано подробно ниже.

Остатки лизина и аминоконцевые остатки могут вступать в реакцию с янтарным ангидридом или другими ангидридами карбоновых кислот, которые изменяют заряд остатков лизина на противоположный. Другие пригодные реагенты для получения производных по альфа-аминосодержащим остаткам включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборгидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; О-метилизомочевина; 2,4 пентандион; и реакции с глиоксилатом, катализируемые трансаминазой.

Остатки аргинила могут быть модифицированы при реакции с любым из или с комбинацией нескольких стандартных реагентов, включающих фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для получения производных по остаткам аргинила необходимо, чтобы реакцию проводили в щелочных условиях из-за высокого значения рКа гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, эти реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина.

Специфическая модификация остатков тирозина широко изучена, при этом особый интерес представляет введение спектральных меток в остатки тирозила путем реакции с ароматическими диазосоединениями или тетранитрометаном. Наиболее часто для получения О-ацетильных и 3-нитропроизводных тирозила применяют Ν-ацетилимидизол и тетранитрометан, соответственно.

Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) можно избирательно модифицировать при реакции с карбодиимидами (К'-Х=С=Х-К'), такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глутамила могут быть преобразованы в остатки аспарагинила и глутаминила при реакции с ионами аммония.

Остатки глутаминила и аспарагинила могут быть дезамидированы в соответствующие остатки глутамила и аспартила. Кроме того, эти остатки дезамидируются при умеренно кислых условиях. Каждая из форм этих остатков входит в область данного изобретения.

Остатки цистеинила могут быть замещены аминокислотными остатками или другими группами либо для устранения дисульфидных связей, либо, наоборот, для стабилизации поперечных связей. См., например, работу Вйа!падаг е! а1. (1996), 1. Меб. СИет. 39: 3814-9.

Получение производных при помощи бифункциональных агентов применимо для образования поперечных сшивок между пептидами или их функциональными производными с водонерастворимым опорным матриксом или с другими макромолекулярными носителями. Обычно применимые сшивающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, Ν

- 33 011879 гидроксисукцинимидные эфиры, например, эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, в том числе дисукцинимидные эфиры, такие как 3,3'дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-Ы-малеимидо-1,8октан. Агенты, при помощи которых получают производные, такие как метил-3-[(разидофенил)дитио]пропиоимидат, образуют фотоактивируемые промежуточные продукты, которые способны образовывать поперечные связи в присутствии света. Кроме того, химически активные водонерастворимые матриксы, такие как циан бромид-активируемые углеводы и химически активные субстраты, описанные в патентах США №№ 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, применимы для иммобилизации белков.

Углеводные (олигосахаридные) группы можно легко присоединить к сайтам, для которые известно, что они являются сайтами гликозилирования в белках. Обычно, О-связанные олигосахариды присоединяют к остаткам серина (8ет) или треонина (Тйт), тогда как Ν-связанные олигосахариды присоединяют к остаткам аспарагина (Акп), когда они входят в состав последовательности Акп-Х-8ет/Тйт, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина. X представляет собой предпочтительно одну из 19 природных аминокислот, кроме пролина. Структуры Ν-связанных и О-связанных олигосахаридов и остатков сахара, обнаруживаемые в каждом из типов, различны. Одним из типов сахара, который обычно встречается в обоих типах, является Ν-ацетилнейраминовая кислота (известная как сиаловая кислота). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком как Ν-связанных, так и О-связанными олигосахаридов и благодаря своему отрицательному заряду может сообщать кислые свойства гликозилированному соединению. Такой сайт (сайты) могут быть включены в линкер соединений согласно настоящему изобретению и предпочтительно гликозилируются в клетке при продукции рекомбинантных пептидных соединений (например, в клетках млекопитающего, таких как СНО, ВНК, СО8). Однако такие сайты могут также гликозилироваться при помощи синтетических и полусинтетических способов, известных в данной области техники.

Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила и треонила, окисление атомов серы в Сук, метилирование альфа-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина. СгещЫоп. Рго!е1пк: 81гнс1иге апб Мо1еси1е Ргорегйек (V. Н. Ргеешап & Со., 8ап Ртапаксо), рр. 79-86 (1983).

Такие группы производных предпочтительно улучшают одну или несколько характеристик, включающих противоангиогенную активность, растворимость, абсорбцию, биологический период полураспада, и т. п. соединений. Альтернативно, группы производных могут в результате давать соединения, имеющие такие же, или по существу такие же, характеристики и/или свойства, как и у соединений, не являющихся производными. Кроме того, группы могут устранять или снижать любой нежелательный побочный эффект соединения и т. п.

Соединения настоящего изобретения также могут быть изменены на уровне ДНК. Кодоны последовательности ДНК любой части соединения могут быть изменены на кодоны, более совместимые с выбранной клеткой-хозяином. Оптимальные кодоны для Е. Со11, представляющей собой предпочтительную клетку-хозяин, известны в данной области техники. Кодоны могут быть заменены для устранения сайтов рестрикции или включения молчащих сайтов рестрикции, которые могут помочь при процессинге ДНК в клетке-хозяине. Последовательности ДНК для носителя, линкера и пептида могут быть модифицированы с включением любых из вышеупомянутых изменений последовательности.

Изотоп- и токсин-конъюгированные производные

Другой ряд применимых производных представляют собой конъюгаты вышеописанных молекул с токсинами, метками или радиоизотопами. Формирование таких конъюгатов особенно применимо для молекул, включающих последовательности пептида, которые связываются с опухолевыми клетками или патогенами. Такие молекулы могут применяться как терапевтические агенты или как вспомогательные средства при хирургии (например, радиоиммуноуправляемая хирургия) или как диагностические агенты (например, в радиоиммунодиагностике или РИД).

Как терапевтические агенты, эти конъюгированные производные обладают рядом преимуществ. Они облегчают применение токсинов и радиоизотопов, которые могли бы быть токсичными при введении без специфического связывания, обеспечиваемого пептидной последовательностью. Они также могут снижать побочные эффекты, которые сопутствуют применению облучения и химиотерапии, обеспечивая более низкие эффективные дозы конъюгированного партнера.

Применимые партнеры для конъюгирования включают: радиоизотопы, такие как °Иттрий, Иод, Актиний и Висмут;

рициновый токсин, микробные токсины, такие как эндотоксин Ркеиботопак (например, РЕ38, РЕ40) и т. п.;

молекулы-партнеры в системах захвата (см. ниже);

биотин, стрептавидин (применимые либо в качестве молекул-партнеров в системах захвата, либо в качестве меток, особенно для диагностического применения) и цитотоксические агенты (например, доксорубицин).

Одним из полезных применений данных конъюгированных производных является их применение в

- 34 011879 системе захвата. В такой системе молекула согласно настоящему изобретению должна представлять благоприятную молекулу захвата. Эта молекула захвата должна быть способной специфически связываться с эффекторной молекулой, например, токсином или радиоизотопом. И молекулу, конъюгированную с носителем, и эффекторную молекулу вводят пациенту. В такой системе, эффекторная молекула имеет короткий период полураспада, когда не связана с конъюгированной с носителем молекулой захвата, что сводит к минимуму любые токсичные побочные эффекты. Молекула, конъюгированная с носителем, имеет сравнительно длинный период полураспада, является благоприятной и нетоксичной. Специфически связывающиеся части обеих молекул могут представлять собой часть пары с известным специфическим связыванием (например, биотин, стрептавидин) или может осуществляться на основе способов получения пептида, например, таких, как здесь описано.

Такие конъюгированные производные могут быть получены способами, известными в данной области техники. В случае белковых эффекторных молекул (например, эндотоксина Ркеиботоиак), такие молекулы могут экспрессироваться в виде гибридных белков с соответствующих ДНК-конструкций. Производные, конъюгированные с радиоизотопом, могут быть получены, например, как описано для антитела ВЕХА (Сои1!ег). Производные, включающие цитотоксические агенты или микробные токсины, могут быть получены, например, как описано для антитела ВВ96 (Вгк!о1-Муег8 8с.|шЬЬ). Молекулы, применяемые в системах захвата, могут быть получены, например, как описано в патентах, заявках на патент и публикациях №оВх. Молекулы, применяемые для радиоиммуноуправляемой хирургии и РИД, могут быть получены, например, согласно патентам, заявкам на патент и публикациям №оРгоЬе.

Также рассматривается способ получения конъюгированных соединений. Опухолевые клетки, например, демонстрируют эпитопы, не обнаруживаемые в клетках этого же типа в норме. Такие эпитопы связаны, например, с дугого рода посттрансляционными модификациями, происходящими из-за их быстрой пролиферации. Таким образом, одним из аспектов данного изобретения является способ, включающий:

а) осуществление выбора по меньшей мере одного рандомизированного пептида, который специфически связывается целевым эпитопом; и

б) получение фармакологического агента, который содержит (ί) по меньшей мере один носитель (предпочтительно, Ес домен), (ίί) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность выбранного пептида или пептидов и (ίίί) эффекторную молекулу.

Целевой эпитоп является предпочтительно специфичным для опухоли эпитопом или эпитопом, специфичным для патогенного организма.

Эффекторная молекула может быть любым из указанных выше партнеров для конъюгирования и предпочтительно представляет собой радиоизотоп.

Варианты

Варианты также входят в область настоящего изобретения. Среди вариантов представлены варианты с вставками, делециями и заменами. Очевидно, что конкретная молекула согласно настоящему изобретению может содержать один, два или все три типа вариантов. Варианты с делециями и заменами могут содержать природные аминокислоты, нестандартные аминокислоты (как представлено ниже) или оба типа.

В одном из примеров представлены варианты с вставками, в которых один или несколько аминокислотных остатков, либо природных, либо нестандартных, добавляют в аминокислотную последовательность пептида или пептитела. Вставки могут быть расположены по одному или по обоим концам белка, или могут находиться во внутренних областях аминокислотной последовательности пептитела. Варианты с вставками дополнительных остатков по одному или обоим концам могут включать, например, гибридные белки и белки с дополнительными вспомогательными последовательностями или метками. Варианты с вставками включают пептиды и пептитела с добавлением одного или более аминокислотных остатков к аминокислотной последовательности пептида или пептитела либо их фрагментов.

Варианты соглсно настоящему изобретению также включают зрелые пептиды и пептитела, у которых удалены лидерные или сигнальные последовательности, и образующиеся белки имеют дополнительные аминоконцевые остатки, аминокислоты которых могут быть природными и нестандартными. В данном изобретении рассмотрены молекулы (такие как пептитела) с дополнительным остатком метионина в положении -1 (Ме!^-1-рер!1Ьобу), а также и специфически связывающие агенты с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и -1 (МеГ²-Ьу§^-1-). Варианты с дополнительными остатками Ме!, Ме!-Ьу§, Ьу§ (или одним или более основными остатками, в целом), особенно полезны для усиленного производства рекомбинантных белков в бактериальных клетках-хозяинах.

Изобретение также охватывает варианты с дополнительными аминокислотными остатками, которые образуются в результате применения специфических систем для экспрессии. Например, при применении коммерчески доступных векторов, которые экспрессируют желаемый полипептид в виде части продукта, слитого с глутатион-8-трансфреразой (д1и!а!Ыοие-8-!^аη8Ге^а8е, С8Т), желаемый полипептид имеет дополнительный остаток глицина в аминокислотном положении -1 после отщепления С8Т от желаемого пептида. Также рассматриваются варианты, которые образуются при экспрессии в других векторных системах, в том числе таких, где происходит включение в аминокислотную последовательность

- 35 011879 полигистидиновых последовательностей, обычно с карбокси и/или аминоконца последовательности.

Варианты с вставками также включают гибридные белки, в которых амино- и/или карбоксиконцевые участки пептида или пептитела объединены с другим полипептидом, его фрагментом или аминокислотами, не являющимися частью какой-то определенной специфической белковой последовательности. Примерами таких гибридных белков являются иммуногенные полипептиды, белки с длительным периодом полужизни в кровотоке, такие как константные области иммуноглобулинов, маркерные белки, белки или полипептиды, облегчающие очистку желаемого пептида или пептитела, и полипептидные последовательности, которые способствуют образованию мультимерных белков (такие как, мотивы «лейцинова молния», которые способствуют образованию/стабильности димеров).

У такого типа варианта с вставкой обычно имеется вся или существенная часть нативной молекулы, связанной по N или С-концам с целой последовательностью или частью второго полипептида. Например, для гибридных белков обычно применяют лидерную последовательность других видов для возможности экспрессии рекомбинантного белка в гетерологичных клетках-хозяина. Другой пригодный гибридный белок содержит дополнительный иммунологически активный домен, такой как эпитоп антитела, для облегчения очистки гибридного белка. Включение сайта расщепления в или около места соединения гибридных белков облегчает удаление ненужного полипептида после очистки. Другие пригодные гибридные белки характеризуются присоединением функциональных доменов, таких как активные сайты для ферментов, домены гликозилирования, сигналы локализации в клетке или трансмембранные домены.

Существуют различные коммерчески доступные системы для экспрессии гибридных белков, которые можно применять в настоящем изобретении. Наиболее пригодные системы включают, но не ограничиваются, систему на основе глутатион-8-трансферазы (С8Т) (Рйагтааа), систему на основе белка, связывающего мальтозу (МВ, Веуег1еу, МА), систему РБА6 (ΙΒΙ, №\ν Науеп, СТ), и систему 6хН18 (Р1адеп, СЬа1аетог1й, СА). Эти системы способны экспрессировать рекомбинантные пептиды и/или пептитела, несущие лишь незначительное количество дополнительных аминокислот, которые едва ли оказывают значительный эффект на активность пептида или пептитела. Например, и система РБАС, и система 6хН18 добавляют лишь короткие последовательности, обе из которых, как было показано, являются слабо антигенными и не оказывают отрицательного влияния на укладку полипептида в его нативную конформацию. Другое присоединение по №концу, которое также рассматривается как применимое, является присоединением дипептида Ме1-Бу§ к ^концевой области белка или пептидов. Такое присоединение может быть полезным для увеличения экспрессии или активности белка.

При помощи других систем получают гибридные полипептиды, где желательно вырезание последовательности гибридного партнера из желаемого пептида или пептитела. В одном из способов реализации гибридный партнер соединен с рекомбинантным пептителом при помощи пептидной последовательности, содержащей специфическую последовательность, узнаваемую протеазами. Примерами соответствующих последовательностей являются последовательности, узнаваемые протеазой вируса гравировки табака (ЫГе Тесйио1од1е8, СайЬегкЬигд, ΜΌ) или фактором Ха (№\ν Епд1апй Вю1аЬ§, Веуейеу, МА).

Изобретение также предусматривает гибридные полипептиды, которые содержат всю последовательность все или часть пептитела или пептида согласно настоящему изобретению, в комбинации с укороченным тканевым фактором (уТФ). уТФ представляет собой фактор, действующий на сосуды, состоящий из укороченной формы индуцирующего коагуляцию белка человека, который действует как фактор свертывания в кровеносных сосудах опухоли, как описано в патентах США №№ 5877289; 6004555; 6132729; 6132730; 6156321; и Европейском патенте № ЕР 0988056. Слияние 1ТБ с пептителом к Апд-2 или пептидом, или его фрагментом, облегчает доставку антитела к Апд-2 к клеткам-мишеням.

В другом аспекте изобретение предусматривает варианты с делециями, в которых удалены один или более аминокислотных остатков в пептиде или пептителе. Делеции могут затрагивать один или оба конца пептитела или могут затрагивать один или более аминокислотных остатков в пределах аминокислотной последовательности пептитела. Варианты с делециями в обязательном порядке включают все фрагменты пептида или пептитела.

В еще одном аспекте изобретение предусматривает варианты пептидов и пептител изобретения с заменами. Варианты с заменами включают такие пептиды и пептитела, в которых удален один или более аминокислотных остатков и замещены одной или более альтернативными аминокислотами, которые могут представлять собой природные аминокислоты или не встречающиеся в природе. Варианты с заменами дают пептиды или пептитела, которые «схожи» с первоначальным пептидом или пептителом, поскольку эти две молекулы имеют определенный процент идентичных аминокислот. Варианты с заменами включают замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, аминокислот в пределах пептида или пептитела, при этом число замен может доходить до десяти процентов или более аминокислот пептида или пептитела. В одном аспекте замены являются консервативными по природе, однако изобретение также охватывает замены, которые не являются консервативными и также включают нестандартные аминокислоты.

Идентичность (1ЙепШу) и сходство (Лтйагйу) схожих пептидов и пептител можно легко определить известными способами. Такие способы включают, но не ограничиваются, способы, описанные в Сотри1а1юпа1 Мо1еси1аг Вю1оду. Бекк, А.М., ей., 0хГогй Ишуегкйу Ргекк, №\ν Уогк (1988); Вюсотрийпд: БчГог

- 36 011879 тайс8 апй Сепоте Рго)ес18. 8тйй, Ό.ν., ей., Асайетк Рге88, №\ν Уогк (1993); Сотри!ег Апа1у818 оП 8есщепсе Оа!а, Рай 1. Сгййп, А.М., апй СиПт, Н.С., ей8., Нитапа Рге88, №\ν кгаеу (1994); 8ес.|иепсе Апа1у818 т Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Неш_)е, С., Асайетк Рге88 (1987); 8ес.|иепсе Апа1у818 Рптег, СпЬзкоу, М. апй Оеуегеих, I., ей8., М. 8!оск!оп Рге88, №\ν Уогк (1991) и СагШо е! а1., 81АМ I. Аррйей Ма!й. 48:1073 (1988).

Предпочтительные способы для определения родства или процента идентичности двух пептидов или полипептидов, или полипептида и пептида, разработаны таким образом, что дают наибольшее число совпадений между анализируемыми последовательностями. Способы для определения идентичности представлены в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные способы для определения степени идентичности двух последовательностей включают, но не ограничиваются, пакет программ ССС, включающий САР (Эеуегеих е! а1., №с1. Ас1й. Ке8., 12:387 (1984); Сепе!к8 Сотри!ег Сгоир, Ишуегайу оП V^8сои8^и. Май18оп, νΐ, ВЬА8ТР, Β6.Λ8ΤΝ и ЕА8ТА (А1!8сйи1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215:403-410 (1990)). Программа В^Λ8ΤX общедоступна из Национального центра биотехнологической информации (№11юпа1 Сеп!ег Пог Вю!есйпо1о§у 1пПогта!юп, NСВI) и из других источников (В^А8Τ Мапиа1. А1!8сйи1 е! а1. NСВ/N^М/NIН Ве!йе8йа, МО 20894; А1!8сйи1 е! а1., см. выше (1990)). Также для определения идентичности можно применять известный алгоритм Смита-Уотермана (8тйй Vа!е^таи).

Применение определенных схем выравнивания для выравнивания двух аминокислотных последовательностей может привести к выявлению совпадений только короткого участка двух последовательностей, и этот небольшой участок выравнивания может иметь очень высокий процент идентичности последовательностей, даже при отсутствии значительного сходства между двумя полными последовательностями. Соответственно, в определенных способах реализации выбранный способ выравнивания (программа САР) дает выравнивание, которое охватывает по меньшей мере десять процентов анализируемого полноразмерного целевого полипептида, то есть по меньшей мере 40 последовательных аминокислот при сравнении, последовательностей из по меньшей мере 400 аминокислот, 30 последовательных аминокислот при сравнении последовательностей, включающих от по меньшей мере 300 до приблизительно 400 аминокислот, по меньшей мере 20 последовательных аминокислот при сравнении последовательностей, включающих от 200 до приблизительно 300 аминокислот, и по меньшей мере 10 последовательных аминокислот при сравнении последовательностей, включающих от приблизительно 100 до 200 аминокислот.

Например, при применении компьютерного алгоритма САР (Сепе!к8 Сотрикг Сгоир, Итуегайу оП ν 18^118111, Май18оп, νΐ) выравнивают два полипептида, для которых требуется определить процент идентичности последовательностей, для оптимального совпадения их соответствующих аминокислот («диапазон совпадений», как определяется алгоритмом). В определенных способах реализации в связи с определенным алгоритмом используют штраф за открытие пробела (дар орешпд репайу) (который обычно вычисляют как 3Хсреднее диагонали; «среднее диагонали» - среднее число применяемой диагональной матрицы сравнения; «диагональ» - счет или число, присуждаемое за каждое точное совпадение аминокислот при использовании конкретной матрицы сравнения) и штраф за продление пробела (дар ех!еп8юп репайу) (который обычно составляет 1/10 раз от штрафа за открытие пробела), а также матрицу сравнения, такую как РАМ 250 или ВЬО8ИМ 62. В определенных способах реализации алгоритм использует стандартную матрицу сравнения (о матрице сравнения РАМ 250 см. ЭауНоГГ е! а1., А!1а8 оП Рго!еш 8ес.|иепсе апй 8!гис!иге. 5(3)(1978); о матрице сравнения ВЬО8ИМ 62 см. НешкоП' е! а1., Ргос. №111. Асай. 8с1 И8А, 89:10915-10919 (1992)), также использованы алгоритмом.

В определенных способах реализации параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают следующие:

Алгоритм: Нидлмана и соавторов, №ей1етап е! а1., I. Мо1. Вю1., 48:443-453(1970)

Матрица сравнения: ВЬО8ИМ 62 из НещкоПП е! а1., см. выше (1992)

Штраф за пробел (дар репа1!у): 12

Штраф за длину пробела (дар 1епд!й репайу): 4

Порога сходства: 0

Программу САР можно применять с вышеуказанными параметрами. В определенных способах реализации вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения полипептидов (при отсутствие штрафа за концевые пробелы) при использовании алгоритма САР.

В определенных способах реализации параметры для сравнения полинуклеотидных молекул (в противоположность аминокислотной последовательности) включают следующие:

Алгоритм: Нидлмана и соавторов №ей1етап е! а1., см. выше (1970)

Матрица сравнения: совпадение = +10, несовпадение = 0

Штраф за пробел: 50

Штраф за длину пробела: 3

Программу САР можно также применять с вышеуказанными параметрами. Вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнений молекул полинуклеотидов.

Можно применять другие примеры алгоритмов, штрафы за открытие пробела, штрафы за продление пробела, матрицы сравнения, пороги сходства и т.п., в том числе изложенные в руководстве Ргодгат Мапиа1, V^8соп8^п Раскаде, Уегаюп 9, 8ер!етЬег, 1997. Конкретный выбор, который следует сделать, оче

- 37 011879 виден для специалистов в данной области техники, и он зависит от конкретного типа сравнения, которое необходимо провести, например ДНК-ДНК, белок-белок, белок-ДНК; и, кроме того, он зависит от того, проводят ли сравнение между данными парами последовательностей (в этом случае обычно предпочтительны САР или Вс5(Б1() или между одной последовательностью и большим числом последовательностей из базы данных (в этом случае предпочтительны БА8ТА или ВЬАЗТА).

Как здесь используется, двадцать стандартных аминокислот и их сокращенные названия употребляются стандартным образом. См. 1ттипо1оду-А 8νη11ιο$ί$ (2пб Εάίΐίοη, Е. δ. Со1иЬ апб Ό. Я. Сгеп, Ебк., 8шаиег Аккос1а1ек, 8ипбег1апб, Макк. (1991)), включенной здесь посредством ссылки.

Аминокислоты могут иметь или Ь или Ό стереохимическую структуру (за исключением С1у, который не является ни Ь, ни Ό) и полипептиды и композиции согласно настоящему изобретению могут включать комбинацию стереохимических структур. Тем не менее, Ь-стереохимия является предпочтительной. Изобретение также обеспечивает обращенные молекулы, в которых последовательность аминокислот от амино-конца к карбокси-концу перевернута. Например, обращенная последовательность молекулы, имеющей в норме последовательность Х1-Х2-Х3, будет Х3-Х2-Х1. Изобретение также обеспечивает ретро-обращенные молекулы, в которых, как выше, последовательность от амино-конца к карбоксиконцу перевернута и остатки, которые в норме являются «Ь» энантиомерами изменены в стереоизомерную «Ό» форму.

Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α-, α-двузамещенные аминокислоты, Ν,-алкиламинокислоты, молочная кислота, и другие нестандартные аминокислоты можно также применять в качестве компонентов для полипептидов согласно настоящему изобретению. Примеры нестандартных аминокислот включают, без ограничений: аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бета-аминопропионовую кислоту, аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокаприоновую кислоту, аминогептановую кислоту, аминоизомасляную кислоту, аминопимелиновую кислоту, диаминомасляную кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, диаминопропионовую кислоту, Ν-этилглицин, Ν-этиласпарагин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, гидроксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, Ν-метилглицин, саркозин, Νметилизолейцин, Ν-метилвалин, новалин, нолейцин, орнитин, 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, εΝ,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты (например, 4гидроксипролин).

Аналогично, если иначе не определено, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5' конец; направление в левую сторону двуцепочечных нуклеотидных последовательностей является 5' направлением. Направление 5'- 3' образующихся РНК траскриптов называется направлением транскрипции; области последовательностей на цепи ДНК, имеющих такую же последовательность, как и РНК и которые расположены к 5' по отношению к 5' концу РНК транскриптов называются «расположенные выше последовательности» (ирк1геат кециепсек); области последовательности на цепи ДНК, имеющих такую же последовательность, как и РНК и которые расположены к 3' по отношению 3' конец РНК транскриптов называются «расположенные выше последовательности» (бо\гпк1геат кесщепсек).

Следует принять во внимание, что аминокислотные остатки могут быть подразделены на классы на основании их общих свойств боковых цепей:

1. Нейтральные гидрофобные: аланин (А1а; А), валин (Уа1; V), лейцин (Ьеи; Ь), изолейцин (11е; I), пролин (Рго; Р), триптофан (Тгр; ^), фенилаланин (Рйе; Б) и метионин (Ме1, М).

2. Нейтральные полярные: глицин (С1у; С); серин (8ег; δ), треонин (Тйг; Т), тирозин (Туг; Υ), Сук1еюе (Сук; С), глутамин (С1и; Ц), аспарагин (Акп; Ν) и норлейцин.

3. Кислые: аспарагиновая кислота (Акр; Ό), глутаминовая кислота (С1и; Е);

4. Основные: лизин (Ьук; К), аргинин (Агд.; Я), гистидин (Н1к; Н).

См. Ье^т, Ье^т, В., Сепек V, 0х£огб Ишуегкйу Ргекк (1994), р.11.

Консервативные аминокислотные замены могут охватывать нестандартные аминокислотные остатки, которые обычно включают путем химического синтеза, а не синтеза в биологических системах. Они включают, без ограничения, пептидометики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислот. Неконсервативная замена может включать замену представителя одного из этих классов на пред ставителя другого класса.

В получении таких замен, согласно определенным воплощениям может учитываться гидропатический индекс аминокислот. Каждой аминокислоте присужден гидропатический индекс на основе ее характеристик гидрофобности и заряда. Они представляют собой: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).

Значение гидропатического индекса аминокислот в определении биологической функции при взаимодействии белка установлено в данной области техники. Ку1е е1 а1., Σ. Мо1. Вю1., 157:105-131 (1982).

- 38 011879

Известно, что определенные аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими схожий гидропатический индекс или счет и, тем не менее, сохраняют аналогичную биологическую активность. При получении замен, основанных на гидропатическом индексе, в определенных способах реализации включают замены аминокислот, чьи гидропатические индексы находятся в пределах ±2. В определенных способах реализации включают замены тех аминокислот, чьи гидропатические индексы находятся в пределах ±1, и в определенных способах реализации - те, чьи индексы находятся в пределах ±0,5.

В данной области техники также установлено, что замену на сходные аминокислоты можно эффективно осуществлять на основе гидрофильности, особенно если биологически функциональное пептитело или пептид, полученный таким образом, предназначен для применения в иммунологических способах реализации, как в настоящем случае. В определенных способах реализации наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, определенная на основе гидрофильности смежных аминокислот, соотносится с его иммуногенностью и антигенностью, т. е. с биологическими свойствами белка.

Следующие значения гидрофильности определены для аминокислотных остатков: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 1); глутамат (+3,0 1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5 1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин(-1,3); валин (1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При получении замен на основании аналогичных значениях гидрофильности, в определенных способах реализации включены замены аминокислот, чьи значения гидрофильности находятся в пределах ±2, в определенных способах реализации тех аминокислот, значения для которых находятся в пределах ±1, в определенных способах реализации - в пределах 0,5. Можно также идентифицировать эпитопы в первичных аминокислотных последовательностях на основании гидрофильности. Эти области также называют «коровые области эпитопа».

Типичные аминокислотные замены представлены в табл. 10 ниже.

Таблица 10. Аминокислотные замены

Исходные остатки	Примеры замен	Предпочтительные замены
А1а	\/а1, Ьеи, Не	Уа1
Агд	Ьуз, С1п, Азп	Ьуз
Азп	(31п, С1и, Азр	61п
Азр	(31и, С1п, Азр	С1и
Суз	Зег, А1а	Зег
О1п	Азп, С1и, Азр	Азп
С1и	Азр, 61п, Азп	Азр
С1у	Рго, А1а	А1а
ΗΪ3	Азп, С!п, Ьуз, Агд	Агд
Не	Ьеи, Уа1, Ме!, А1а, РНе, норлейцин	Ьеи
Ьеи	норлейцин, Не, Уа1, Ме!, А1а, РНе	Не
Ьуз	Агд, 1,4- диаминомасляная кислота, ΟΙη, Азп	Агд
Ме!	Ьеи, РЬе, Не	Ьеи
РЬе	Ьеи, Уа1, Не, А1а, Туг	Ьеи
Рго	А(а	С1у
8ег	Тпг, А1а, Суз	ТЬг
ТЫ	Зег	Зег
Тгр	Туг, РНе	Туг
Туг	Тгр, РЬе, ТЬг, Зег	РЬе
Уа1	Не, Ме!, Ьеи, РЬе, А1а, норлейцин	Ьеи

Квалифицированный специалист будет способен определить подходящие варианты полипептидов, как изложено выше, с применением известных способов. В определенных способах реализации специалист в данной области техники может идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут

- 39 011879 быть изменены без нарушения активности, путем изменения областей, которые, как считается, не важны для деятельности. В определенных способах реализации можно идентифицировать остатки и части молекул, которые консервативны среди схожих пептидов или полипептидов. В определенных способах реализации даже в областях, которые могут быть важными для биологической активности или для структуры, можно осуществлять консервативные аминокислотные замены без нарушения биологической активности или без негативного влияния на структуру полипептида.

Кроме того, специалист в данной области техники может проанализировать структурнофункциональные исследования, идентифицирующие остатки в схожих полипептидах, которое важны для активности или структуры. Принимая во внимание такого рода сравнения, можно предсказать значение аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, которые важны для активности или структуры в схожих белках. Специалист в данной области техники может выбрать замены на химически схожие аминокислоты для таких предсказанных важных аминокислотных остатков.

Специалист в данной области техники также может проанализировать трехмерную структурную и аминокислотную последовательность по сравнению с такой структурой в схожих полипептидах. С учетом такой информации специалист в данной области техники может предсказать выравнивание аминокислотных остатков антитела в отношении трехмерных структур. В определенных способах реализации специалист в данной области техники может решить не вносить радикальных изменений в аминокислотные остатки, которые, как предсказано, располагаются на поверхности белка, поскольку такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Кроме того, специалист в данной области техники может создать пробные варианты, содержащие единственную аминокислотную замену по каждому необходимому аминокислотному остатку. Варианты можно затем проскринировать с применением анализов активности, известных специалистам в данной области техники. Такие варианты можно применять для получения данных о подходящих вариантах. Например, при обнаружении того, что изменение определенного аминокислотного остатка приводит к нарушению, нежелательному уменьшению или неподходящему изменению активности, варианты с такой заменой могут быть отклонены. Другими словами, на основе информации, полученной из таких стандартных экспериментов, специалист в данной области техники может легко определить аминокислоты, дальнейших замен которых необходимо избежать либо в отдельности, либо в сочетании с другими мутациями.

Ряд научных публикаций посвящен предсказанию вторичной структуры. См. Мои1! ί.. Сигг. Ор. ίη В1о!есй. 7(4):422-427 (1996), Сйои е! а1. Вюсйет15!гу, 13(2):222-245 (1974); Сйои е! а1., В1осйет15!гу. 113(2):211-222 (1974); Сйои е! а1., Абν. Епгушо1. Ке1а!. Агеак Мо1. Вю1., 47:45-148 (1978); Сйои е! а1., Апп. Иеу. Вюсйет., 47:251-276 и Сйои е! а1., Вюрйу₈. 1., 26:367-384 (1979). Кроме того, на настоящий момент доступны компьютерные программы, помогающие предсказывать вторичную структуру. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на моделировании по гомологии. Например, два полипептида или белки, имеющие идентичность по последовательности более чем 30%, или сходство более чем 40%, часто имеют схожую структурную топологию. Развитие базы данных структуры белков (РОВ) за последнее время способствовало увеличению возможностей прогнозирования вторичной структуры, включая потенциальное число укладок в пределах полипептидной или белковой структуры. См. Но1т е! а1., №с1. Ас1б. Ке₈., 27(1):244-247 (1999). Было высказано предположение (Вгеппег е! а1., Сигг. Ор. 8!гис!. В1о1., 7(3):369-376 (1997)), что существует ограниченное число укладок данного полипептида или белка и, что как только критическое число структур будет определено, предсказание структуры станет значительно более точным.

Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают «прядение нитей» (1йгеабтд) (1опе₈, Ό., Сигг. Орш. 8!гис!. Вю1., 7(3):377-87 (1997); 81рр1 е! а1., 8!гис!иге. 4(1):15-19 (1996)), «анализ профиля» (ргой1е апа1у₈15) (Во\\зе е! а1., 8аепсе. 253:164-170 (1991); &&5^ν е! а1., Ме1й. Епэтт., 183:146-159 (1990); &ώδ^ν е! а1., Ргос. Ν!. Асаб. 8сй, 84(13):4355-4358 (1987)) и «эволюционную связь» (еуойЮопагу йпкаде) (см. Но1т, выше (1999), апб Вгеппег, выше (1997)).

В определенных способах реализации варианты пептител включают гликозилированные варианты, в которых к пептителу добавлены один или более сайтов гликозилирования, такие как Ν-связанный сайт гликозилирования. Для Ν-связанного сайта гликозилирования характерна последовательность: А₈п-Х-8ег или А₈п-Х-Тйг, в которой аминокислотный остаток, обозначенный как X, может быть любым аминокислотным остатком, кроме пролина. Замена или добавление аминокислотных остатков для получения данной последовательности создает потенциальный новый сайт для добавления Ν-связанной углеводной цепи. Альтернативно, замены, которые устраняют эту последовательность, удаляют существующую Νсвязанную углеводную цепь. Также предусмотрена перегруппировка Ν-связанных углеводных цепей, при которой устраняют один или более Ν-связанных сайтов гликозилирования (обычно природный) и создают один или более новых Ν-связанных сайтов.

Соединения согласно настоящему изобретению могут также быть изменены на уровне ДНК. Последовательность ДНК любой части соединения могут быть изменены на кодоны, более совместимые с выбранной клеткой-хозяином. Оптимальные кодоны для Е. сой, которая является предпочтительной клеткой-хозяином, известны в области техники. Кодоны могут быть заменены для удаления сайтов рестрик

- 40 011879 ции или для включения молчащих сайтов рестрикции, которые могут облегчать процессинг ДНК в выбранной клетке-хозяине. Последовательности ДНК носителя, линкера и пептида могут быть модифицированы с включением любого из упомянутого выше изменения последовательности. Таким образом, все модификации, замены, способы образования производных, и т. п., описанные здесь, применимы одинаково ко всем аспектам настоящего изобретения, включая, но не ограничиваясь, пептиды, димеры и мультимеры пептидов, линкеры и носители.

Созревание аффинности

Один из способов реализации настоящего изобретения включает «созревание аффинности» пептидов и пептител. Этот способ предполагает увеличение аффинности или биоактивности пептидов и пептител согласно настоящему изобретению, с применением техники фагового дисплея или других технологий селекции. На основании консенсусной последовательности (которую определяют для коллекции схожих пептидов) могут быть созданы библиотеки вторичного фагового дисплея, в которых «коровые» амино кислоты (определенные на основе консенсусной последовательности) остаются константными или изменяются с определенной частотой. Кроме того, отдельная пептидная последовательность может быть использована для создания измененной библиотеки направленного фагового дисплея. Анализ (пэннинг) таких библиотек может выявить пептиды (которые могут быть преобразованы в пептитела) с повышенной способностью связываться с мишенью или с увеличенной биоактивностью.

Непептидные аналоги/миметики белков

Кроме того, также предусмотрены непептидные аналоги пептидов, которые обеспечивают стабильную структуру или снижение биодеградации. Миметики аналоги пептидов могут быть получены на основании выбранного пептида-ингибитора путем замены одного или более остатков непептидными составляющими. Предпочтительно, непептидные составляющие позволяют пептиду сохранить свою природную конформацию или предпочтительно ее стабилизировать, например, биоактивую конформацию, сохраняющую способность узнавать и связывать Апд-2. В одном из аспектов, образующиеся аналоги/миметики демонстрируют повышенное сродство к связыванию Апд-2. Один из примеров способа получения непептидных миметиков - аналогов описан в работе Нэчмена и соавторов, №с1ипап е! а1., Кеди1. Рер!. 57:359-370 (1995). Если необходимо, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы, например, путем гликозилирования, амидированием, карбоксилированием или фосфорилированием, или путем образования кислотно-аддитивных солей, амидов, эфиров, в частности, Сконцевых эфиров и Ν-ацил производных пептидов согласно настоящему изобретению. Пептитела также могут быть модифицированы для создания пептидных производных, путем формирования ковалентных или нековалентных комплексов с другими молекулами. Ковалентно связанные комплексы могут быть получены путем связывания химических агентов с функциональными группами боковых цепей аминокислот, составляющих пептитела или с Ν- или С-концами.

В частности, как предполагается, пептиды могут быть конъюгированы с репортерной группой, включающей, но не ограничивающейся, радиоактивную метку, флуоресцентную метку, фермент (например, катализирующий колориметрическую или флуоресцентную реакцию), субстрат, твердый матрикс или носитель (например, биотин или авидин). Изобретение, соответственно, предусматривает молекулу, включающую молекулу пептитела, где молекула предпочтительно содержит репортерную группу, выбранную из группы, состоящей из радиоактивной метки, флуоресцентной метки, фермента, субстрата, твердого матрикса или носителя. Такие метки хорошо известны специалистам в данной области техники, например, в особенности рассматриваются биотиновые метки. Применение таких меток хорошо известно специалистам в данной области техники и описано, например, в патентах США №№ 3817837; 3850752; 3996345 и 4277437. Другие метки, которые также можно применять, включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные метки, флуоресцентные метки и хемилюминесцентные метки. Патенты США, касающиеся применения таких меток, включают, например, патенты США №№ 3817837; 3850752; 3939350 и 3996345. Любое из пептител согласно настоящему изобретению может включать одну, две или более любую из таких меток.

Способы получения

Соединения согласно настоящему изобретению можно получить в трансформированных клеткаххозяевах при помощи технологий с использованием рекомбинантных ДНК. Для этого получают рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую пептид. Способы получения таких молекул ДНК хорошо известны специалистам в данной области. Например, последовательности, кодирующие пептиды, можно выделить из молекулы ДНК при помощи соответствующих рестрикционных ферментов. Альтернативно, молекулу ДНК можно синтезировать химическими способами, например, при помощи фосфорамидатов. Кроме того, возможно применение комбинированных способов.

Изобретение также охватывает вектор, способный экспрессировать пептиды в соответствующих клетках-хозяевах. Вектор содержит молекулу ДНК, кодирующую пептиды, связанную с сохранением функции с соответствующей последовательностью, кодирующей экспрессию. Способы осуществления связывания с сохранением функции либо до встраивания молекулы ДНК, либо после встраивания молекулы ДНК в вектор хорошо известны специалистам в данной области. Последовательности, контролирующие экспрессию, включают промоторы, активаторы, энхансеры, операторы, сайты связывания с ри

- 41 011879 босомами, сигналы инициации, сигналы терминации, сигналы кэппирования, полиаденилирования и другие сигнальные последовательности, участвующие в контроле транскрипции и трансляции.

Образующийся в результате вектор, включающий молекулу ДНК, применяют для трансформации соответствующей клетки-хозяина. Указанную трансформацию проводят способами, известными специалистам в данной области.

При реализации настоящего изобретения можно использовать любые из множества доступных и известных клеток-хозяев. Выбор конкретного хозяина зависит от нескольких факторов, известных специалистам в данной области. Они включают, например, совместимость с выбранным вектором для экспрессии, токсичность пептидов, кодируемых молекулой ДНК, эффективность трансформации, легкость ренатурации пептидов, характеристики экспрессии, биобезопасность и затраты. При приведении в равновесие данных факторов следует учесть, что не все хозяева одинаково эффективны для экспрессии конкретной последовательности ДНК. В соответствии с этими общими принципами применимые хозяевамикроорганизмы бактерии (например, Е. сой), дрожжи (например, а5 8ассйаготусе5 5р.), а также клетки грибов, насекомых, растений, клеточные культуры млекопитающих (в том числе человека), а также другие клетки-хозяева, известные специалистам в данной области.

Затем трансформированную клетку-хозяина культивируют и очищают. Клетки-хозяева можно культивировать при стандартных условиях ферментации, таким образом происходит экспрессия желательных соединений. Подобные условия ферментации хорошо известны специалистам в данной области. Наконец, пептиды очищают от культуры способами, известными специалистам в данной области.

Кроме того, соединения можно получить синтетическими способами. Например, можно применять способы твердофазного синтеза. Соответствующие методики хорошо известны специалистам в данной области, среди них методики, описанные в работах МегпПе1б (1973), СИет. Ро1урерббе5, рр. 335-61 (Ка15оуаиш5 аиб РаиауоЙ5 еб5.); МегпПе1б (1963), 1. Ат. СИет. 8ос. 85: 2149; Эау15 е! а1. (1985), Вюсйет. 1и!1. 10: 394-414; 81е\\'аг1 апб Уоиид (1969), 8ойб РИа5е Рерббе 8уп!йе515: И.8. Ра!. № 3,941,763; Ρίηη е! а1. (1976), ТИе Рго!еш5 (3гб еб.) 2: 105-253; и Епскзоп е! а1. (1976), ТИе Рго!еш5 (3гб еб.) 2: 257-527. Предпочтительным способом синтеза отдельных пептидов является способ твердофазного синтеза, поскольку он является наименее затратным способом получения малых пептидов.

Соединения, содержащие производные пептидов или не-пептидные группы можно синтезировать способами, хорошо известными специалистам в области органической химии.

Применение соединений

Общая часть. Соединения согласно настоящему изобретению обладают фармакологической активностью благодаря способности связываться с представляющим интерес белками как в качестве агонисты, миметики или антагонисты нативных лигандов данных белков. Применение конкретных соединений представлено в табл. 2. Активность данных соединений измеряют способами, известными специалистам в данной области. Для соединений, представляющих собой миметики ТРО и миметики ЕРО, далее, в разделе Примеры, описаны анализы ίη νί\Ό.

Кроме терапевтического применения, соединения согласно настоящему изобретению применяют для диагностики заболеваний, которые характеризуются дисфункцией ассоциированного интересующего белка. В одном из способов реализации способ детекции в биологическом образце интересующего белка (например, рецептора), который можно активировать, включает следующие этапы: (а) приведение в контакт образца с соединением согласно настоящему изобретению; (б) детектирование активации исследуемого белка соединением. Биологические образцы включают препараты ткани, интактные клетки или их экстракты. Соединения согласно настоящему изобретению можно включать в диагностические наборы для детекции ассоциированных с ними исследуемых белков в биологическом образце. Соединения в подобных наборах имеют присоединенные метки для возможности детекции. Соединения применимы для идентификации нормальных и аномальных интересующих белков. Для соединений-миметиков ЕРО, например, присутствие аномального интересующего белка в биологическом образце может указывать на такие нарушения, как анемия Блэкфана-Даймонда, при которой, как полагают, нарушается функционирование рецептора ЕРО.

Терапевтическое применение молекул-миметиков ЕРО

Соединения-миметики ЕРО согласно настоящему изобретению применимы для лечения нарушений, характеризующихся низким уровнем эритроцитов. В изобретение включены способы регуляции эндогенной активности рецепторов ЕРО у млекопитающих, предпочтительными являются способы повышения активности рецепторов ЕРО. В общем, любое патологическое состояние, при котором показано лечение эритропоэтином, такое как анемия, можно лечить соединениями миметиками ЕРО согласно изобретению. Данные соединения вводят в таком количестве и таким способом доставки, которые соответствуют природе и степени тяжести состояния, подлежащего лечению, и которые могут быть уточнены специалистом в данной области. Предпочтительно введение осуществляют путем инъекции - подкожной, внутримышечной или внутривенной.

- 42 011879

Терапевтическое применение соединений миметиков ТРО

Для соединений-миметиков ТРО, можно применять стандартные анализы, подобные описанным в XVО 95/26746, озаглавленным «Составы и способы стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов». Анализ ш у1уо описан в представленных ниже примерах.

Состояния, при которых показано подобное лечение, характеризуются существующим недостатком мегакариоцитов/тромбоцитов, или предполагаемым недостатком мегакариоцитов/тромбоцитов (например, при планируемом хирургическом вмешательстве или у донора тромбоцитов). Подобные состояния возникают, как правило, вследствие дефицита (временного или постоянного) активного лиганда Мр1 ш У1уо. Недостаток тромбоцитов описывается общим термином тромбоцитопения; следовательно, способы и составы согласно настоящему изобретению, в общем, применимы для лечения тромбоцитопении у пациентов, нуждающихся в подобном лечении.

Тромбоцитопения (дефицит тромбоцитов) возникает по ряду причин, включая химиотерапию и другие способы терапии с применением различных препаратов, радиационную терапию, хирургические операции, случайную кровопотерю и другие конкретные болезненные состояния. Примеры конкретных болезненных состояний, характеризующихся тромбоцитопенией, при которых показано лечение в соответствии с настоящим изобретением включают апластическую анемию, идиопатическую анемию, метастатические опухоли, результатом которых является тромбоцитопения, системную красную волчанку, спленомегалию, синдром Фанкони, дефицит витамина В12, дефицит фолиевой кислоты, аномалия МейХегглина, синдром Вискотта-Олдрича и ночную пароксизмальную гемоглобинурию. Кроме того, некоторые способы лечения СПИДа приводят к тромбоцитопении (напр., А2Т). При некоторых состояниях, сопровождающих заживление ран, также возможно улучшение, связанное с повышением количества тромбоцитов.

При ожидаемом дефиците тромбоцитов, например при планируемом хирургическом вмешательстве, соединение согласно настоящему изобретению вводят пациенту за нескольких дней до нескольких часов перед тем, как возникает потребность в тромбоцитах. При острых ситуациях, например при внезапной и сильной кровопотере, соединения согласно настоящему изобретению можно вводить вместе с кровью и очищенными тромбоцитами.

Соединения-миметики ТРО по настоящему изобретению применимы для стимулирования некоторых типов клеток, отличных от мегакариоцитов, если обнаруживается, что подобные клетки экспрессируют рецептор Мр1. В область настоящего изобретения входят также состояния, ассоциированные с такого рода клетками, экспрессирующими рецептор Мр1, чувствительные к стимуляции лигандом Мр1.

Соединения-миметики ТРО согласно настоящему изобретению применимы во всех ситуациях, где желательна продукция тромбоцитов или клеток-предшественников тромбоцитов, или же в ситуациях, где желательна стимуляция рецептора с-Мр1. Таким образом, например, соединения согласно настоящему изобретению применимы для лечения любого состояния у млекопитающих, которое характеризуется дефицитом тромбоцитов, мегакариоцитов и т. п. Подобные состояния подробно описывают следующие источники: νθ 95/26746; νθ 95/21919; νθ 95/18858; νθ 95/21920, включенные в данное описание.

Соединения-миметики ТРО согласно настоящему изобретению применимы также для поддержания жизнеспособности или времени хранения тромбоцитов и/или мегакариоцитов и схожих клеток. Соответственно, эффективное количество одного или нескольких соединений согласно настоящему изобретению полезно вводить в составы, содержащие подобные клетки.

Терапевтическое применение Апд-2 связывающих молекул

Агенты, регулирующие активность связывания с Апд-2 или другую клеточную активность, можно применять в комбинации с другими терапевтическими агентами для усиления терапевтического эффекта или для уменьшения потенциальных побочных эффектов.

Согласно одному из аспектов, настоящее изобретение предлагает реагенты и способы, применимые для лечения заболеваний и состояний, характеризующихся нежелательным или аберрантным уровнем активности Апд-2 в клетке. Такие заболевания включают рак и другие гиперпролиферативные состояния, такие как гиперплазия, псориаз, контактный дерматит, иммунологические нарушения и бесплодие.

Настоящее изобретение также предлагает способы лечения рака у животных, в том числе человека, включающие введение в организм животного или человека эффективного количества конкретного связывающего агента, например, пептитела, которое ингибирует или снижает активность Апд-2. Кроме того, изобретение относится к способам ингибирования роста раковых клеток, в том числе процессов клеточной пролиферации, инвазивности и метастаза в биологических системах. Способы включают применение соединения согласно настоящему изобретению в качестве ингибитора роста раковых клеток. Предпочтительно, данные способы применяют для ингибирования и уменьшения роста раковых клеток, инвазивности, метастаза или частоты возникновения опухолей у животных, например, млекопитающих. Кроме того, способы согласно настоящему изобретению легко адаптировать для применения в аналитических системах, например, при анализе роста раковых клеток и их свойств, а также для идентификации соединений, воздействующих на рост раковых клеток.

Раковые заболевания, для лечения которых применимы соединения согласно настоящему изобретению, предпочтительно возникают у млекопитающих. Млекопитающие включают, например, человека и

- 43 011879 других приматов, а также домашних животных или животных-компаньонов, например, собак и кошек; лабораторных животных, например, крыс, мышей и кроликов; а также сельскохозяйственных животных, например, лошадей, свиней, овец и крупный рогатый скот.

Опухоли и неоплазмы включают новообразования тканевых клеток, в которых клетки размножаются бесконтрольно и прогрессирующе. Некоторые новообразования являются доброкачественными, а другие признаны злокачественными и могут привести к гибели организма. Злокачественные новообразования или рак отличаются от доброкачественных новообразований тем, что кроме агрессивной клеточной пролиферации, они могут прорастать в окружающие ткани, образуя метастазы. Кроме того, характерным свойством злокачественных новообразований является более выраженная потеря дифференцировки (большая дедифференцировка) и организации относительно друг друга и относительно окружающих тканей. Это свойство называется также анаплазией.

Новообразования, при которых показано лечение согласно настоящему изобретению, включают также солидные опухоли, то есть саркомы и карциномы. Карциномы включают злокачественные образования из эпителиальных клеток, которые инфильтрируют (прорастают) в окружающие ткани и образуют метастазы. Аденокарциномы представляют собой карциномы из ткани, или же образующие узнаваемые гландулярные структуры. Другая обширная категория раковых заболеваний включает саркомы, представляющие собой опухоли, клетки которых внедряются в фибриллярную или гомогенную субстанцию, например, эмбриональную соединительную ткань. Лечение рака согласно изобретению показано также при раковых заболеваниях миелоидной или лимфоидной системы, в том числе лейкемиях, лимфомах и других видах рака, при которых, как правило, не образуется опухолевой массы, однако раковые клетки распределены по всей сосудистой или лимфоретикулярной системе.

Таким образом, Апд-2-связывающие молекулы согласно изобретению применимы для лечения многих видов рака, в том числе солидных опухолей и лейкемии. Опухолевые клетки или раковые заболевания, при обнаружении которых показано лечение согласно настоящему изобретению включают, например, адренокортикотропный гормон-продуцирующую опухоль; острую лимфоцитарную лейкемию; острую нелимфоцитарную лейкемию; аденому; рак коры надпочечника; аденокарцинома молочной железы, предстательной железы и толстого кишечника; амелобластому; апудому; рак мочевого пузыря; рак мозга; бранхиому; рак молочной железы; все виды бронхогенной карциномы легких; карциноидное заболевание сердца; карциному (например, карциному Уокера, базально-клеточную карциному, базосквамозную карциному, карциному Брауна-Пирса, карциному из эпителия протоков, опухоль Эрлиха, Кребс 2, клетки Меркеля, мукоидную, немелкоклеточную легочную, овсяно-клеточную, папиллярную, фиброзную, бронхиолярную, бронхогенную, чешуйчато-клеточную и переходно-клеточную карциному); злокачественный карциноидный синдром; иммунопролиферативную мелкоклеточную легочную карциному; цементому; рак шейки матки; хондробластому; хондрому; хондросаркому; хористому; хроническую лимфоцитную лейкемию; хроническую миелоцитную лейкемию; рак прямой кишки; хордому; краниофарингиому; кожную Т-клеточную лимфому; дисгерминому; эндометриальный рак; рак пищевода; саркому Эвинга; фиброма; фибросаркома; рак желчного пузыря; гигантоклеточную опухоль; глиому; лейкоз ворсистых клеток; гамартому; опухоли головы или шеи; гепатому; нарушение гистиоцитоза; лимфому Ходжкина; саркому Капоши; рак почки; липому; липосаркому; рак печени; рак легких (мелкоклеточный и немелкоклеточный); злокачественную внутрибрюшинную эффузию; злокачественную плевральную эффузию; меланому; мезенхимому; мезонефрому; мезотелиому; множественную миелому; миосаркому; миксому; миксосаркому; нейробластому; лимфому, не являющуюся лимфомой Ходжкина; одонтому; остеому; остеосаркому; рак яичников; рак яичников (зародышевых клеток); рак поджелудочной железы; папилломы; рак полового члена; плазмоцитому; рак предстательной железы; ретикулоэндотелиоз; ретинобластому; рак кожи; саркому мягких тканей; чешуйчато-клеточную карциному; рак желудка; тератому; рак яичка; тимому; рак щитовидной железы; трофобластические новообразования; рак тела матки; рак влагалища; рак вульвы; опухоль ^11ш'а.

Кроме того, показано лечение таких видов рака, как: холангиома; холестеатома; циклиндрома; цистаденокарцинома; цистаденома; гранулезноклеточная опухоль; гинандробластома; гидраденома; опухоль островков поджелудочной железы; опухоль из лейдиговских клеток; папиллома; опухоль из клеток Сертоли; текаклеточная опухоль; лейомиома; лейомиосаркома; миобластома; миома; миосаркома; рабдомиома; рабдомиосаркома; эпендимиома; ганглионеврома; глиома; медуллобластома; менингиома; неврилеммома; нейробластома; нейроэпителиома; нейрофиброма; нейрома; параганглиома; нехромаффинная параганглиома; ангиокератома; ангиолимфоидная гиперплазия с эозинофилией; склерозирующая ангиома; ангиоматоз; гломангиома; гемангиоэндотелиома; гемангиома; гемангиоперицитома; гемангиосаркома; лимфангиома; лимфангиомиома; лимфангиосаркома; пинеалома; карциносаркома; хондросаркома; филоидная цистосаркома; фибросаркома; гемангиосаркома; лейомиосаркома; лейкосаркома; липосаркома; лимфангиосаркома; миосаркома; миксосаркома; рак яичников; рабдомиосаркома; саркома; новообразования; нерофиброматоз; и цервикальная дисплазия.

- 44 011879

Терапевтическое применение ХСТ-связывающих молекул

ΝΟΡ-связывающие молекулы можно применять для предотвращения и лечения заболеваний и нарушений, опосредованных ΝΟΡ. Показания включают без ограничения боль (включая без ограничения боль, вызванную воспалением, и ассоциированную гипералгезию и аллодинию; невропатическую боль и ассоциированную гипералгезию и аллодинию; невропатическую боль при диабете; каузалгию; симпатически поддерживаемую боль; синдром деафферентации; острую боль; тензионную головную боль; мигрень; зубную боль; травматическую боль; боль, связанную с хирургическим вмешательством; боль, вызванную ампутацией или абсцессом; каузалгию; заболевания, связанные с демиелинизацией и невралгию тройничного нерва). Пептиды и модифицированные пептиды согласно настоящему изобретению обладают терапевтической ценностью при предотвращении и лечении других заболеваний, в которых ΝΟΡ представляет собой причинный фактор, включая без ограничения астму, недержание мочи (т. е. гиперактивный мочевой пузырь), псориаз, рак (особенно рак поджелудочной железы и меланому), хронический алкоголизм, инсульт, синдром таламической боли, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), интоксикацию или химиотерапию, общую головную боль, мигрень, приступообразную сильную головную боль (кластерная головная боль), смешанные васкулярные и аваскулярные синдромы, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, воспалительные заболевания кишечника, воспалительные заболевания глаз, воспалительные заболевания мочевого пузыря или его нестабильное состояние, псориаз, кожные заболевания с воспалительным компонентом, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, коллагеновые и васкулярные заболевания, хронические воспалительные состояния, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальных тканей, простой герпес, нарушение моторики респираторной, урогенитальной, желудочно-кишечной или сосудистой системы, раны, ожоги, кожные аллергические реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язвенную болезнь желудка, язвенную болезнь двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные нарушения.

Терапевтическое применение молекул, связывающих миостатин

Агенты, связывающие миостатин, согласно настоящему изобретению, присоединяются к миостатину и блокируют или ингибируют сигнал миостатина в клетках-мишенях. Настоящее изобретение предлагает реагенты и способы уменьшения количества или снижения активности миостатина в организме животного путем введения эффективной дозы одного или нескольких агентов, связывающих миостатин, в организм животного. Согласно одному аспекту, настоящее изобретение предлагает реагенты и способы лечения связанных с миостатином расстройств в организме животного, включающий этап введения эффективной дозы одного или нескольких связывающих агентов в организм животного. Нарушения, связанные с миостатином, включают без ограничения различные виды потери мышечной массы, а также метаболические расстройства, такие как диабет и связанные с ним нарушения, а также дегенеративные костные заболевания, такие как остеопороз.

Как показано в примере 8 (патент США № 10/742379) пептитела согласно настоящему изобретению значительно увеличивают мышечную массу (без жира) на модели мышей СЭ1 пи/пи. Эта активность ίη νίνο коррелирует с активностью связывания и ингибирования ίη νίίτο, описанной далее на примере тех же пептител.

Нарушения, связанные с потрей мышечной масс, включают дистрофии, такие как мышечная дистрофия Дюшенна, прогрессирующая мышечная дистрофия, мышечная дистрофия Беккера, мышечная дистрофия Ландузи-Дижерина, мышечная дистрофия Эрба и нейроаксональная мышечная дистрофия новорожденных. Например, блокирование миостатина при помощи антител ίη νίνο способствовало улучшению дистрофического фенотипа на модели мышей тбх мышечной дистрофии Дюшенна (Βο§ά;·ιηονΚΙι с1 а1. (2002), №1игс 420: 28). Применение пептител способствует увеличению мышечной массы (без жира) и увеличивает соотношение мышечной массы (без жира) к массе жира в тбх мышиных моделях, как описано в нижеследующем примере 9.

Дополнительные нарушения, характеризующиеся потерей мышечной массы, возникают вследствие хронических заболеваний, таких как амиотрофный латеральный склероз, конгестивная обструктивная болезнь легких, рак, СПИД, почечная недостаточность или ревматоидный артрит. Например, кахексию или потерю мышечной массы с потерей массы тела индуцировали у безтимусных (нюде) мышей путем систематического введения миостатина (ΖίιηιηοΐΈ с1 а1., см. выше). Согласно другому примеру, обнаружено, что сывороточные и интрамускулярные концентрации миостатин-иммунореактивного белка повышены у мужчин, теряющих мышечную массу в связи с заболеванием СПИД, причем повышение обратно пропорционально мышечной массе (без жира) (Οοηζ;·ι1οζ-ί.’;·ιά;·ινίά с1 а1. (1998), ΡΝΑ8 И8А 95: 14938-14943). Дополнительные факторы, способствующие потере мышечной массы, возникают вследствие отсутствия двигательной активности, связанной с инвалидностью: пребыванием в инвалидном кресле, длительным постельным режимом, вызванным инсультом, хроническим заболеванием, переломом костей или травмой, а также мышечной атрофией в условиях микрогравитации (космического полета). Например, обнаружено повышение миостатин-иммунореактивного белка в плазме после продолжительного постельного режима (Ζ;κ1ι\νίοί;·ι с1 а1. ί ΟηνίΙ РРу8ю1. 6(2):11 (1999)). Также было обнаружено, что в мышцах крыс, под воздействием условий микрогравитации в течение полета на космическом корабле

- 45 011879 экспрессировалось повышенное количество миостатина по сравнению с мышцами крыс, которых не подвергали такому воздействию (Ьа1аш е! а1. (2000), ЕЕпйосип. 167 (З):417-28).

Кроме того, связанное с возрастом увеличение отношения жира к мышцам и связанная с возрастом атрофия мышц, как оказалось, связана с миостатином. Например, среднее количество миостатиниммунореактивного белка в плазме увеличивается с возрастом в группах молодых (19-З5 лет), среднего возраста (З6-75 лет) и пожилых (76-92 лет) мужчин и женщин, тогда как средняя мышечная масса и свободная от жира масса с возрастом снижались в этих группах (Уагакйекк! е1 а1. ί №.11г Адтд 6(5):З4З-8 (2002)). Также показано, что нокаут по гену миостатина у мышей увеличивал миогенез и снижал адипогенез (Ьт е1 а1. (2002), ВюсНет ВюрШз Кек Соттип 291(З):701-6), в результате чего у взрослых особей была повышена мышечная масса и уменьшено накопление жира и секреция лептина. Типичные молекулы улучшают соотношение мышечной массы без жира и жира у пожилых особей мышей тйх, как показано ниже.

Кроме того, миостатин, как оказалось, экспрессируется на низком уровне в сердечной мышце и его экспрессия усиливается в кардиомиоцитах после инфаркта (8Нагта е1 а1. (1999), ί Се11 РНузю1. 180 (1):19). Следовательно, уменьшение уровня миостатина в сердечной мышце может улучшить восстановление сердечной мышцы после инфаркта.

Миостатин также оказывает влияние на метаболические нарушения, включающие диабет 2 типа, инсулиннезависимый сахарный диабет, гипергликемию и ожирение. Например, было показано, что недостаток миостатина улучшает фенотипы при ожирении и диабете в двух моделей у мышей (Уеп е1 а1. см. выше). Кроме того, увеличение мышечной массы за счет уменьшения уровня миостатина может увеличить прочность костей и ослабить остеопороз и дегенеративные заболевания костей и другие дегенеративные заболевания костей. Обнаружено, например, что у мышей с недостатком миостатина наблюдается увеличение минерального содержимого и плотности плечевой кости мыши, а также повышение минерального содержимого как трабекулярной, так и кортикальной кости в областях присоединения мышц, а также увеличение мышечной массы (Натиск е1 а1. (2002), Са1с1£ Т188ие 1п1 71(1): 6З-8). В настоящем изобретении примеры пептител способствуют увеличению содержания мышечной массы без жира по отношению к содержанию жира на модели мышей тйх, как показано ниже.

Настоящее изобретение также предусматривает способы и реагенты для увеличения мышечной массы мясомолочного скота путем введения эффективной дозы миостатинсвязывающего агента животному. Поскольку зрелый С-концевой полипептид миостатина идентичен у всех проанализированных видов, миостатинсвязывающие агенты, как ожидается, должны быть эффективны для увеличения мышечной массы и уменьшения содержания жира у любых видов животных, имеющих сельскохозяйственное значение, включая крупный рогатый скот, цыплят, индеек и свиней.

Миостатинсвязывающие молекулы по настоящему изобретению можно применять в отдельности или в комбинации с другими терапевтическими агентами для увеличения их терапевтических эффектов или уменьшения потенциальных побочных эффектов. Молекулы согласно настоящему изобретению обладают одной или более желательными, но непредвиденными комбинациями свойств для улучшения терапевтической ценности агентов. Эти свойства включают повышение активности, увеличение растворимости, снижение деградации, повышение периода полураспада, уменьшение токсичности и уменьшение иммуногенности. Таким образом, молекулы согласно настоящему изобретению применимы для широкого круга режимов лечения. Кроме того, гидрофильные и гидрофобные свойства соединений согласно настоящему изобретению сбалансированы, что повышает их полезность для применения ш νίίτο и в особенности ш νίνο. В особенности, соединения согласно настоящему изобретению обладают подходящей степенью растворимости в водных средах, что обеспечивает их поглощение и биодоступность в организме, при этом они также имеют определенную степень растворимости в липидах, что позволяет соединениям проходить через клеточную мембрану в предполагаемое место действия, как, например, определенная мышца.

Миостатинсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению применимы для лечения «объекта» или любого животного, включая людей, при введении в эффективных дозах в соответствующей композиции.

Кроме того, миостатинсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению применимы для обнаружения и количественной оценки миостатина в ряде исследований. Такие исследования описаны подробно в патентах США № 10/742З79.

В общем, миостатинсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению применимы в качестве агентов захвата, для связывания и иммобилизации миостатина в ряде исследований, подобных тем, которые описаны, например, в Аза1, ей., Ме11юЙ8 ш Се11 Вю1оду, З7, АпйЬоФез ш Се11 Вю1оду. Асайетю Ргезз, 1пс., №\ν Уотк (199З). Миостатинсвязывающую молекулу может быть помечена некоторым способом или она может вступать в реакцию с третьей молекулой, такой как антитело к связывающей молекуле, помеченное для возможности детекции и количественной оценки миостатина.

Например, миостатинсвязывающая молекула или третья молекула могут быть модифицированы с добавлением детектируемой молекулы, такой как биотин, которая может затем связываться четвертой молекулой, такой как ферментативно меченный стептавидин или другими белками. (Акегзйот (1985), ί

- 46 011879

1ттипо1 135:2589; СкаиЬей (1997), Моб РаШо1 10:585).

В любом конкретном анализе могут потребоваться стадии инкубации и/или промывки после каждой комбинации реагентов. Стадии инкубации могут варьировать от приблизительно 5 с до нескольких часов, предпочтительно от приблизительно 5 мин до приблизительно 24 ч. Однако время инкубации зависит от формата исследования, объема раствора, концентрации и т.п. Обычно, анализы проводят при температуре окружающей среды, хотя их можно проводить при различных температурах.

Терапевтическое применение ВАЕЕ-связывающих молекул

ВАТР(фактор, активирующий В-клетки)-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут быть особенно полезными при лечении аутоиммунных заболеваний, связанных с В-клетками. В частности, они могут быть полезными для лечения, предотвращения, улучшения, диагностики или прогнозировании волчанки, в том числе системной красной волчанки (СКВ) и ассоциированных с волчанкой заболеваниях и состояниях. Другие предпочтительные показания включают опухоли, ассоциированные с В-клетками, включая В-клеточную лимфому.

Соединения согласно настоящему изобретению можно также применять для лечения воспалительных состояний суставов. Воспалительные состояния суставов являются хроническими заболеваниями суставов, поражающими и калечащими в различной степени миллионы людей во всем мире. Ревматоидный артрит является заболеванием суставов, при котором хрящ и кость медленно разрушаются за счет пролиферирующей, инвазивной соединительной ткани, называемой паннусом, которая образуется из синовиальной мембраны. Болезнь может затрагивать околосуставные структуры, такие как синовиальные сумки, оболочки сухожилия и сами сухожилия, а также внесуставные ткани, такие как подхожный слой, сердечно-сосудистая система, легкие, селезенка, лимфатические узлы, скелетные мышцы, нервная система (центральная и периферическая) и глаза (811ЬегЬегд (1985), Апбегкоп'к Ра!йо1оду, Кккапе (еб.), 11:1828). Остеоартрит представляет собой общее заболевание суставов, характеризующееся дегенеративными изменениями суставного хряща и реактивной пролиферацией кости и хряща вокруг сустава. Остеоартрит представляет собой клеточно-опосредуемый активный процесс, который может явиться результатом неправильного ответа хондроцитов на катаболические и анаболические стимулы. Изменения некоторых молекул матрикса суставного хряща, как сообщают, происходят на ранних стадиях остеоартрита (Тйопаг е! а1. (1993). Кйеитабс бкеаке скшск о£ №г111 Атепса, Мо8ко\\з1х (еб.), 19:635-657 и 8Ыпте1 е! а1. (1992), Аг111п1к Ккеит., 35:1304-1308). ТАЬЬ-1, ТАЬЬ-1К и их модуляторы, как полагают, полезны при лечении данных и связанных патологических состояний.

ВАРР-связывающие молекулы могут также быть полезными при лечении ряда дополнительных заболеваний и нарушений, включающих острый панкреатит; боковой амиотрофический склероз (БАС); болезнь Альцгеймера; астму; атеросклероз; аутоиммунную гемолитическую анемию; рак, в особенности типы рака, ассоциированные с В-клетками; кахексию/анорексию; синдром хронической усталости; цирроз (например, первичный желчный цирроз); диабет (например, инсулиновый диабет); лихорадку; гломерулонефрит, включая 1дА гломерулонефрит и первичный гломерулонефрит; синдром Гудпасчера; синдром Гийена-Барре; реакцию «трансплантант против хозяина»; тиреоидит Хашимото; геморрагический шок; гиперальгезию; воспалительную болезнь кишки; воспалительные состояния суставов, включая остеоартрит, псориатический артрит и ревматоидный артрит; воспалительные состояния, происходящие из-за напряжения, растяжения, повреждения хряща, травмы, ортопедических операций, инфекции или других болезненных процессов; инсулинзависимый сахарный диабет; ишемическое повреждение, включая ишемию головного мозга (например, повреждение мозга в результате травмы, эпилепсии, кровоизлияния или удара, каждые из которых могут привести к нейродегенерации); ухудшение обучаемости; болезни легкого (например, острый респираторный дистресс синдром); волчанку, в частности системную красную волчанку (СКВ), множественную миелому, множественный склероз; миастению дгагк; миеломную (например, АМЬ и СМЬ) и другие типы лейкемии; миопатии (например, метаболизм белков мышц, особенно при сепсисе); нейротоксичность (например, индуцированную ВИЧ); остеопороз; боль; болезнь Паркинсона; пемфигус; полимиозит/дерматомиозит; воспаление легких, включая аутоиммунное воспаление легких; преждевременные роды; псориаз; болезнь Рейтера; реперфузионное повреждение; септический шок; побочные эффекты рентгенотерапии; синдром Шегрена; нарушения сна; временную болезнь нижнечелюстного сустава; тромбоцитопению, включая идиопатическую тромбоцитопению и аутоиммунную неонатальную тромбоцитопению; опухолевые метастазы; увеит и васкулит.

Комбинационная терапия

Терапевтические способы, композиции и соединения согласно настоящему изобретению могут также применяться по отдельности или в комбинации с другими цитокинами, растворимым рецептором Мр1, гематопоэтическими факторами, интерлейкинами, факторами роста или антителами при лечении болезненных состояний, характеризующихся различными симптомами, а также недостатком тромбоцитов. Предполагают, что соединение согласно настоящему изобретению является полезным при лечении некоторых форм тромбоцитопении в комбинации с общими стимуляторами гематопоэза, такими как ИЛ3 или СМ-С8Р. Другие мегакариоцитические стимулирующие факторы, т.е. тед-С8Р, фактор стволовых клеток Шет се11 £ас!ог, 8СР), фактор, ингибирующий лейкемию, онкостатин М (опсок1абп М, О8М), или другие молекулы с мегариоцит-стимулирующей активностью, можно также применять с лигандом Мр1.

- 47 011879

Дополнительные примеры цитокинов или гематопоэтических факторов для такого совместного введения включают ИЛ-1 альфа, ИЛ-1 бета, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-11, колониестимулирующий фактор-1 (С8Е-1), 8СЕ, 6М-С8Е, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (д^аηи1οсу(е со1опу к(1ти1а(тд Гас(ог, 6-С8Е), ΕΡΟ, интерферон-альфа (ИФН-альфа), консенсусный интерферон, бета ИФН-бета, или ИФН-гамма. Кроме того, полезно введение, одновременно или последовательно, эффективного количества растворимого рецептора Мр1 млекопитающего, который влияет на процесс фрагментирования мегакариоцитов в тромбоциты, как только мегакариоциты достигают зрелой формы. Таким образом, введение соединения согласно настоящему изобретению (для увеличения числа зрелых мегакариоцитов) с последующим введением растворимого рецептора Мр1 (для инактивации лиганда и для предоставления возможности образования тромбоцитов из зрелых мегакариоцитов), как ожидается, является особенно эффективными средствами для стимулирования образования тромбоцитов. Доза, упоминаемая выше, должна быть скорректирована для компенсации таких дополнительных компонентов в терапевтической композиции. За изменением состояния подвергаемого лечению пациента можно наблюдать стандартными способами.

В случаях, если соединения согласно настоящему изобретению добавлены в композиции тромбоцитов и/или мегакариоцитов и схожих клеток, добавляемое количество обычно устанавливают экспериментально при помощи способов и анализов, известных в данной области. Как правило, диапазон добавляемого количества составляет 0,1 мкг-1 мг соединения согласно настоящему изобретению на 10⁶ клеток.

Фармацевтические композиции

Общая часть

Настоящее изобретение также обеспечивает способы применения фармацевтических композиций соединений согласно настоящему изобретению. Такие фармацевтические композиции могут предназначаться для введения путем инъекции или для перорального, пульмонального, назального, трансдермального или других способов введения. В общем, изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые содержат эффективные количества соединения согласно настоящему изобретению совместно с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции содержат разбавители различного буферного состава (например, Τηκ-Η61, ацетатный, фосфатный), рН и ионной силы; добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, ^геем 80, Ро1укогЬа(е 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, ΤΙιιιικιέοΣ бензиловый спирт) и наполнители (например, лактоза, маннитол); включение вещества в порошковые препараты полимерных соединений, таких как полилактат, полигликолевая кислота, и т.п. или в липосомы. Также можно применять гиалуроновую кислоту, что может способствовать продолжительному существованию в кровотоке. Такие композиции оказывать влияние на физическое состояние, стабильность, степень высвобождения ίη νίνο, степень очищения ίη νίνο настоящих белков и производных. См., например, Веттд(ог1'8 Ркагтасеибса1 8с1егоек, 18(11 Еб. (1990, Маск РиЬНкЬшд Со., ΕηκΙοη, РА 18042), с. 1435-1712, которые включены здесь ссылкой. Композиции могут быть подготовлены в жидкой форме, или могут быть в виде сухого порошка, например, в лиофилизированной форме. Также рассматриваются имплантируемые препараты с замедленным высвобождением, являющиеся трансдермальными препаратами.

Препараты для перорального введения

Для применения согласно настоящему изобретению предназначены препараты в твердой форме для перорального введения, общая характеристика которых дана в главе 89 сборника Рсттд^'к РйагтасеиЦса1 8с1ег1сек (1990), 18(1 Еб., Маск ΡиЬ1^κЫηд Со. Еак(ог1 РА 18042, включенном здесь ссылкой. Препараты в твердой форме включают таблетки, капсулы, пилюли, пастилки или лепешки, крахмальные капсулы или драже. Также для приготовления фармацевтических композиций можно применять липосомальные или белковые капсулы (как, например, белковые микросферы, о которых сообщается в патенте США № 4925673). Можно применять инкапсуляцию в липосомы, и липосомы могут образовывать производные с различными полимерами (например, патент США № 5013556). Описание возможных твердых форм препаратов для терапевтического применения дано в главе 10 «Современной фармацевтики» Маршалла (Маг8Йа11, К., Мобет Рйагтасеибск (1979)), под редакцией Банкера и Родеса (6. 8. Ваг1кег аг1б С. Т. В1юбек), включенной здесь ссылкой. В общем, препарат содержит соединение согласно настоящему изобретению и инертные компоненты, которые обеспечивают защиту от среды желудка и высвобождение биологически активного вещества в кишечнике.

Препараты соединений согласно настоящему изобретению для перорального введения также рассматриваются особо. При необходимости, соединения могут быть химически модифицированы для более эффектиной пероральной доставки. Обычно, химическая модификация заключается в присоединении по меньшей мере одного агента к молекуле самого соединения, где вышеуказанный агент обеспечивает (а) ингибирование протеолиза; и (б) попадание в кровяной поток из желудка или кишечника. Увеличение общей стабильности соединения и увеличение времени циркуляции в организме также является желательным. Применимыми для этой цели агентами в данном изобретении могут являться ковалентно присоединенные носители. Примеры таких агентов включают: ПЭГ, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и поли

- 48 011879 пролин. См., например, АЬис1ю\\'кк| апб Пау1к, 8о1иЫе Ро1утег-Епхуте Аббис!к, Епхутек ак Эгидк (1981), НосепЬегд апб КоЬейк, ебк., ’№11еу-1п!егкс1епсе, №\ν Уогк, ΝΥ, рр. 367-83; Не^тагк, е! а1. (1982), ί. Арр1. Вюсйет. 4:185-9. Другими полимерами, которые можно применять, являются поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан. Предпочтительным для фармацевтического применения, как указано выше, является ПЭГ.

Для препаратов с пероральной доставкой, также можно применять соли модифицированных алифатических аминокислот, таких как №(8-[2-гидроксибензоил]амино)каприлат натрия (ак кобшт Ν-(8-[211убгохуЬепхоу1| атто) саргу1а!е, 8NАС), в качестве носителей для повышения поглощения терапевтических соединений согласно настоящему изобретению. Клиническая эффективность препарата гепарина с применением 8NАС продемонстрирована в исследования Фазы II, проведенных Епнкркеге ТесЬпо1од1ек. См. патент США 5792451, «Композиции препаратов с пероральной доставкой и способы».

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть включены в препараты в виде мелких частиц в форме гранул или драже из частиц размером около 1 мм. Препарат вещества для введения при помощи капсул также быть в виде порошка, слегка спрессованной массы или даже в виде таблеток. Терапевтический агент может быть подготовлен путем компрессии.

Также могут быть включены красители и ароматизирующие вещества. Например, можно получить препараты белка (или производной) (например, путем инкапсуляции в липосомы или микросферы), а затем включить их в состав пищевого продукта, например, охлажденного напитка, содержащего красители и ароматизирующие вещества.

Можно разбавить или увеличить объем соединения согласно настоящему изобретению при помощи инертных веществ. Такого рода разбавители могут включать углеводы, особенно маннитол, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Определенные неорганические соли могут также применяться в качестве наполнителей, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия.

Одними из коммерчески доступных растворителей являются - Рак!-Р1о, Етбех, 8ТА-Кх 1500, Етсотргекк и Ау1се11.

Дезинтегрирующие агенты также можно включать в состав препарата терапевтического агента в твердой форме. Вещества, применяемые в качестве дезинтегрирующих агентов, включают, но не ограничиваются, крахмал, в том числе коммерческий дезинтегрирующий агент на основе крахмала Ехр1о!аЬ. Также можно применять натрия крахмал гликолат, АтЬегШе, карбоксиметилцеллюлозу натрия, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновую цедру, кислую карбоксиметилцеллюлозу, натуральные тампоны и бентонит. Другой формой дезинтегрирующих агентов являются нерастворимые катионообменные смолы. Порошковые камеди также можно применять в качестве дезинтегрирующих агентов и в качестве связывающих веществ, и могут включать такие порошковые камеди, как агар, Кагауа или трагакант. Альгиновая кислота и ее натриевая соль также применимы в качестве дезинтегрантов.

Связывающие вещества можно применять для удержания терапевтического агента для формирования твердых таблеток, и они включают вещества из природных материалов, таких как гуммиарабик, трагакант, крахмал и желатин. Другие связывающие вещества включают метилцеллюлозу (МЦ), этилцеллюлозу (ЭЦ) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Поливинилпирролидон (ПВП) и гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ) можно применять в спиртовых растворах для гранулирования терапевтического агента.

В состав препарата можно включать антифрикционные агенты для предотвращения слипания в процессе приготовления препарата. Смазывающие вещества можно применять в качестве прослойки между терапевтическим агентом и стенкой матрицы, и они могут включать, но не ограничиваются, стеариновую кислоту, в том числе ее магниевые и кальциевые соли, политетрафторэтилен (ПТФЭ), жидкий парафин, растительные масла и воска. Также можно применять растворимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, СагЬо^ах 4000 и 6000.

В препарат можно добавлять вещества, способствующие скольжению, которые улучшают свойства пластичности в лекарства в ходе приготовления и способствуют изменению структуры при компрессии. Вещества, способствующие скольжению, могут включать крахмал, тальк, пирогенную силику и гидратированный силикоалюминат.

Для облегчения растворения соединения согласно настоящему изобретению в водную среду можно добавить сурфактант в качестве увлажняющего агента. Сурфактанты могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, диоктил натрия сульфокцинат и диоктил натрия сульфонат. Можно применять катионные детергенты, и они могут включать бензалконий хлорид или бензетониум хлорид. В список потенциальных неионных детергентов, которые можно включать в состав препарата в качестве сурфактантов, входят лауромакроголь 400, полиоксил 40 стереат, полиоксиэтилен гидрогенизированное касторовое масло 10, 50 и 60, глицерол моностереат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, эфиры жирных кислот и сахарозы, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Такие сурфактанты могут присутствовать в препарате белка или производного либо в отдельности, или в виде смеси в различных пропорциях.

- 49 011879

В препараты также могут входить добавки для повышения усвоения соединения. Добавками, потенциально обладающими таким свойством, являются, например, жирные кислоты: олеиновая кислота, и линолевая кислота, и линоленовая кислота.

В некоторых случаях может быть желательным контролируемое высвобождение препарата. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть включены в инертный матрикс, который делает возможным высвобождение либо путем диффузии, либо выщелачиванием, например, камеди. Матриксы с медленным разложением также можно включать в композиции, например, альгинаты, полисахариды. Другую форму соединений согласно настоящему изобретению с контролируемым высвобождением получают способом, основанным на терапевтической системе 0рос (0гок) (А1ха Согр.), т.е. лекарство заключают в полупроницаемую мембрану, которая позволяет входить воде и вытеснять лекарство через единственное небольшое отверстие благодаря осмотическим эффектам. Некоторые энтеросолюбильные оболочки также обуславливают эффект замедленного высвобождения.

Для препаратов можно применять различные оболочки. Они включают различные сахара, которые можно применять для глазирования.

Терапевтический агент можно также производить в виде покрытых пленкой таблеток, и вещества, применимые в таких случаях, подразделяют на 2 группы. В первую входят неэнтеросолюбильные вещества и включают метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, провидон и полиэтиленгликоли. Вторая группа состоит из энтеросолюбильных веществ, которые обычно представляют собой эфиры фталевой кислоты.

Для обеспечения оптимального пленочного покрытия можно применять смеси веществ. Пленочное покрытие может быть выполнено в виде смазывающего покрытия, или псевдоожиженного слоя, или путем компрессии оболочки.

Формы пульмонального введения

Также предусмотрено пульмональное введение настоящих белков (или их производных). Белок (или производное) вводят в легкие млекопитающих при ингаляции и прохождении через эпителиальную выстилку легкого в кровоток, (другие сообщения об этом включают работы Ай_)е1 е1 а1., РЬагта. Кек. (1990) 7: 565-9; Ай)е1 е1 а1. (1990), ИНетаЙ. 1. РЬагтасеийск 63: 135-44 (лейпролид ацетат; Вгацие! е1 а1. (1989), 1. Сагйюуакс. РЬагтасо1. 13 (кирр1.5): к. 143-146 (епйо1Ье11п-1); НиЬЬагй е1 а1. (1989), Аппа1к Ιπΐ. Мей. 3: 206-12 (а1-антитрипсин); 8тйЬ е1 а1. (1989), 1. С1ш. Шуей. 84: 1145-6 (а1-протеиназа); 0к\\'ею е1 а1. (МагсЬ 1990), АегокоШайоп оГ Рго1ешк, Ргос. 8утр. Кекр. Эгид ЭеШ'егу ΙΙ. Кеуйопе, Со1огайо (рекомбинантный гормон роста человека); ЭеЬк е1 а1. (1988), 1. Тттипо1. 140: 3482-8 (интерферон-γ фактор некроза опухоли α) апй Р1а1х е1 а1., патент США № 5284656 (колониестимулирующий фактор гранулоцитов).

Для применения на практике данного изобретения предусмотрен широкий спектр механических устройств, разработанных для доставки в легкие терапевтических продуктов, включающих, но не ограничиваяющихся, распылители, ингаляторы с измеряемой дозой и порошковые ингаляторы, каждый из которых известен специалистам в данной области. Некоторыми специфическими примерами коммерчески доступных устройств, полезных для практического применения этого изобретения, являются распылитель ийгауеШ, производства Ма11Шскгой1, Шс., 8ΐ. Ьошк, М1ккоип; распылитель Асот ΙΙ производства Магсщек! Мейюа1 Ргойисй, Епд1е^оой, Со1огайо; 1йе УепШ1Ш, ингалятор с измеряемой дозой производства 61ахо Шс., КекеагсЬ Тпапд1е Рагк, №г111 Саго1ша; и порошковый ингалятор 8р1пЬа1ег производства Р1копк Согр., ВейГогй, МаккасЬикейк.

Все устройства такого рода требуют применения препаратов, подходящих для распределения соединения согласно настоящему изобретению. Обычно, каждому препарату соответствует особый тип устройства для применения, и может включать применение подходящего распыляющего вещества в дополнение к разбавителям, адьювантам и/или носителям, применимым в терапии.

Соединения согласно настоящему изобретению преимущественно производят в виде частиц со средним размером частицы менее 10 мкм (или микрон), наиболее предпочтительно 0,5 на 0,5 мкм для наиболее эффективной поставки в периферические области легкого.

Фармацевтически приемлемые носители включают углеводы, такие как трегалоза, маннитол, ксилитол, сахароза, лактоза и сорбитол. Другие компоненты для применения в препаратах могут включать ЭРРС, О0РЕ, Э8РС и Э0РС. Можно применять природные или синтетические сурфактанты. Также можно применять ПЭГ (даже отдельно от его применения для получения производного белка или аналога). Можно применять декстраны, например, циклодекстран. Также могут применяться соли желчных кислот и другие схожие усилители. Можно применять целлюлозу и производные целлюлозы. Можно применять аминокислоты, например, в составе буферов.

Также изобретение предусматривает применение липосом, микрокапсул или микросфер, соединение включения или другие типы носителей.

Препараты, пригодные для применения с распылителем либо струйным, либо ультразвуковым, обычно включают соединения согласно настоящему изобретению, растворенные в воде в концентрации

- 50 011879 от приблизительно 0,1 до 25 мг биологически активного белка на 1 мл раствора. Препарат может также включать буфер и моносахарид (например, для стабилизации белков и регуляции осмотического давления). Препараты для применения с распылителем могут также содержать сурфактант для уменьшения или предотвращения агрегации белка у поверхности, вызванной измельчением раствора при формировании аэрозоля.

Препараты для применения с ингаляторами с измеряемыми дозами обычно включают тонко диспергированный порошок, содержащий соединение согласно настоящему изобретению, удерживаемое на распыляющем веществе при помощи сурфактанта. Распыляющее вещество может быть любым стандартным веществом, применяемым для этой цели, например, хлорфторкарбоном, гидрохлорфторкарбоном, гидрофторкарбоном или углеводородом, в том числе трихлорфторметаном, дихлордифторметаном, дихлортетрафторэнтанолом и 1,1,1,2-тетрафторэтаном или их комбинацией. Применимые сурфактанты включают сорбиттриолеат и соевый лецитин. Олеиновая кислота также может применяться в качестве сурфактанта.

Препараты для распыления из порошкового ингалятора включают тонко диспергированный сухой порошок, содержащий соединение согласно настоящему изобретению, и могут также включать наполнители, такие как лактоза, сорбитол, сахароза, маннитол, трегалоза или ксилитол в количестве, облегчающем рассеивание порошка из устройства, например, от 50 до 90 вес.% препарата.

Другие формы доставки

Также предусмотрено назальное введение соединения согласно настоящему изобретению. Назальное доставка позволяет белку пройти в кровоток непосредственно после введения терапевтического продукта в нос, без необходимости поступления продукта в легкое. Препараты для назальной доставки включают препараты с декстраном или циклодекстраном. Также предусмотрена доставка посредством транспорта через другие слизистые оболочки.

Также предусмотрено буккальное введение соединения согласно настоящему изобретению. Буккальное введение препаратов известно в данной области техники для применения с пептидами.

Дозировки

Режим дозирования, связанный со способом лечения описанных патологических состояний, определяет лечащий врач, учитывающий различные факторы, которые модифицируют действие лекарств, например, возраст, состояние, массу тела, пол, режим питания пациента, степень тяжести любого рода инфекции, времени введения и других клинических показателей. Обычно ежедневный режим составляет от 0,1-1000 мкг соединения согласно настоящему изобретению на килограмм массы тела, предпочтительно 0,1-150 мкг на килограмм.

Определенные предпочтительные способы реализации

Изобретатели определили предпочтительные пептидные последовательности для молекул, имеющих много различных типов активности. Изобретатели, кроме того, определили предпочтительные структуры данных предпочтительных пептидов в сочетании с предпочтительными линкерами и носителями. Предпочтительные структуры для таких предпочтительных пептидов указывались в табл. 11 ниже. Последовательности линкеров показаны жирным шрифтом. Последовательности активных пептидов показаны жирным шрифтом и подчеркнуты.

- 51 011879

Таблица 11. Предпочтительные воплощения

Последовательность/структура	5Εα ΙΟ ΝΟ:	Активность
1 МОКТНТСРРС РАРЕШЗСР5 νΡΙ_ΕΡΡΚΡΚϋ ΤίΜΙδΗΤΡΕν ΤΟνννϋνδΗΕ 51 ορΕνκΡΝννγν осуеунмакт κρβΕεογΝδτ γκννδνίτνί ΗΟΟννίΝβΚΕΥ 101 ΚΟΚνδΝΚΑίΡ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ ΚΟΟΡΚΕΡΟνΥ ΤίΡΡδΚϋΕίΟ ΟΙΕΟΡΤΕΚΟΥ/ 151 ΕΑΑΡΑΟ6ΤΚΝ ОУЗЬТСЕУКО ΡΥΡδΟΙΑνΕΤν Ε3ΝΟΟΡΕΝΝΥ КТТРРУЮЗО 201 ΘδΡΡίΥδΚίΤ νϋΚεΚννΟΟΟΝ УР8С8УМНЕА ΙΗΝΗΥΤϋΚδΙ. δίδΡΟΚ*	616	Еопетлееой Атр2
1 МОКТНТСРРС РАРЕШЭСР5 УРЬРРРКРКО ΤίΜΙδΚΤΡΕν τονννονδΗΕ 51 ϋΡΕνΚΡΝννΥν ΟΟΥΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΚΕΕ0ΥΝ3Τ ΥΚννδνίΤνί ΗΟΟννί-ΝβΚΕΥ 101 ΚΟΚΥδΝΚΑΕΡ ΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑ ΚΟΟΡΚΕΡΟνΥ ΤίΡΡδΚΟΕί οαατΥδΟΗΓΟΡί 151 ТУУУСКРСКЗСе ΤΚΝΟνδΙ-ΤΟΙ_ν ΚΕΕΥΡδϋΙΑν ΕννΕδΝΟΟΡΕΝ ΝΥΚΤΤΡΡνίΟ 201 δοοβρρίΥβκ ίτνοκδκνναο сиурзсзумн εαι ηνηυτοκ зьзьброк*	648	Рс-петлевой ЕМР1 (1 С1у линкер)
1 МОКТНТСРРС ΡΑΡΕΙ±06Ρδ νΡίΡΡΡΚΡΚΟΤΙ_ΜΙ3ΗΤΡΕνΤθνννθν3ΗΕ 51 ΟΡΕνΚΡΝννΥν ϋβνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΗΕΕΟΥΝ3Τ ΥΚννδνίΤνί ΗΟϋννίΝβΚΕΥ 101 ΚσκνδΝΚΑΙΡ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ ΚΟΟΡΚΕΡΟνΥ Т1.РРЗКОЕ1.С СТУЗСНРСРЬ 151 ТИУСКРСКЭСТ ΚΝΟνδΙΤΟίν ΚΟΡΥΡβϋΙΑν ΕΙΛ/ΕδΝΟΟΡΕΝ ΝΥΚΤΤΡΡνίΟ 201 5063ΡΡΙΥ3Κ ЦТУОКЗИЛ/СЮ ОМУРЗСЗУМН ΕΑΙΗΝΗΥΤΟΚ 8ί8Ι.δΡ6Κ*	649	Рс-петлевой- ЕМР1 (261у линкера)
1 МОКТНТСРРС РАРЕИС6Р8 УРЕРРРКРКО ΤΙ,ΜΙδΗΤΡΕν ТСУУУОУбНЕ	650	Рс-петлевойЕМР1

- 52 011879

51 ΟΡΕνΚΡΝΙΛ/Υν ΗοοννίΝΘκεγ	ΟβΥΕΥΗΝΑΚΤ ΚΡΕΕΕΟΥΝ3Τ	γκγνδνι_τνι_		(301у линкера)
101 ΚΟΚνΒΝΚΑίΡ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ Κ6ΟΡΚΕΡΟΥΥ ΤίΡΡ5Κ0Εί6 ССТУЗСНЕСР
151 ЕТУУУСКРООб ΕΝΝΥΚΤΤΡΡν	οτκΝονειτο ι,νκοργρεοι	ΑνΕννΕδΝΟΟΡ
201 ЮЗООЗНРЬУ ΟΚ3ί8ί8Ρ3Κ	εΚΕΤνϋΚδΚνν ΟΟΟΝΥΡδΟδΥ	ΜΗΕΑΙ-ΗΝΗΥΤ
1 МОКТНТСРРС РАРЕИССР8 νΠ-ΡΡΡΚΡΚϋ ΤΙ.ΜΙ3ΡΤΡΕν ТСУУУОУЗНЕ	651	Ес-петлевой-
				ΕΜΡ1
51 ΟΡΕνΚΡΝΙΛίΥν ΗΟΟΙΛίΙΝΟΚΕΥ	ΟΟΥΕΥΗΝΑΚΤ ΚΡΚΕΕΟΥΝ8Τ	ΥΡΥν5νΐ_Τνΐ-		(4<Э1у линкера)
101 КСКУЗИКАйР ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ ΚΟΟΡΚΕΡΟΥΥ ТЬРРЗКОЕйЭ 0(36ΤΥ5ΟΗΓΟ
151 Р1/ПЛЛ/СКРОС ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ	006ΤΚΝ0ν3Ι_ ΤΟίνΚΘΡΥΡδ	ΟΙΑνΕΙΛ/ΕδΝΟ
201 РУ1_03068ЕЕ γτοκδίδίδρ	ίΥδΚίΐνΟΚδ Κννθ06ΝνΕ30	δνΜΗΕΑίΗΝΗ
251 ΘΚ*
1 МЭКТНТСРРС РАРЕИССРЗ νΡίΡΡΡΚΡΚΟ ΤίΜΙδΚΤΡΕν ТС\ЛЛ/ОУ5НЕ	652	Ес-петлевой-
				ЕМР1
51 ηΡΕνΚΡΝ«Υν	ϋΟνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΡΕΕΟΥΝ8Τ	γργνενίτνι.		(Сув>А1а
ΗΟϋννίΝΟΚΕΥ				иалал! и/4б1у
101 ΚΟΚνδΝΚΑίΡ ΑΡ1ΕΚΤΙ3ΚΑ ΚΟΟΡΚΕΡΟΥΥ ΤίΡΡδΡϋΕίΟ 6ΟΟΤΥ5ΑΗΡΟ		линкера)
151 ΡΕΠΝνΑΚΡΟΟ ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ	βαοτκΝονδί. τοιλκοευρβ	ϋΙΑνΕνΥΕ3ΝΘ
201 ΡνίΟδΟΟδΡΕ ΥΤ0Κ3ί5ί5Ρ	ίΥδΚίτνϋκδ κννοοοΝνΡδο	5ΥΜΗΕΑΙ_ΜΝΗ
251 6Κ'
1 ΜϋΚΤΗΤΟΡΡΟ РАРЕИ.С6РЗ νΕίΡΡΡΚΡΚϋ Т1_М13КТРЕУ τονννονεΗΕ	653	Ес-петлевой-
				ТМР20
51 ΟΡΕνΚΡΝΙΛ/Υν ΗΟσννίΝΘΚΕΥ	ΟΟΥΕΥΗΝΑΚΤ ΚΡΡΕΕΟΥΝ3Τ	γρννδνίτνί		(231у линкера)
101 ΚΟΚν8ΝΚΑΙ_Ρ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ КСОРНЕРОУУ ΤίΡΡδΚΟΕίΟ СОСУСОЕСРТ
151 ίΚΟ«Ενθί6ί	ΟΗδθΟΤΚΝΟν ЗЬТСЬУКОРУ	ΡδσίΑνΕννΕδ
ΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤ
201 ТРРУШЗОСЗ ΝΗΥΤΟΚ8Ι.81	ΡΡίΥβΚίΤνΟ ΚδΗννΟΟΟΝνΡ	808νΜΗΕΑίΗ
251 3ΡΘΚ*
1 МОКТНТСРРС ΡΑΡΕΙΧΟΟΡβ νΕίΡΡΡΚΡΚΟ ТШ5КТРЕУ ΤΟνννϋνδΗΕ	654	Рс-петлевой-
				ТМР20
51 ϋΡΕνΚΕΝνΥΥν	ΟΟΥΕΥΗΝΑΚΤ ΚΡΒΕΕΟΥΝ3Τ	γκννβνΐ-τνι.		(Суз>А1а
ΚΟΟΥ/ίΝΟΚΕΥ				уагагН, ^/72<ЗГу
101 ΚΌΚνβΝΚΑίΡ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ ΚΘΟΡΡΕΡΟνΥ ТЬРРЗНОЕЬС ΟΟΟΥΑΟΕΟΡΤ		линкера)
151 ίΚΟΛίνΑίβΕ ΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤ	0Η860ΤΚΝ0ν ЗйТСЬУКСРУ	РЗШАУЕШЕЗ
201 трруюзосз ΝΗΥΤΟΚδίδί	ΡΡίΥ3ΚίΤνθ ΚδκννοΟΟΝνΡ	ЗСЗУМНЕАБК
251 8РСК*

- 53 011879

1 МОКТНТСРРС РАРЕИССР8 УРЬРРРКРКО ΤίΜΙδΚΤΡΕν τονννονδΗΕ	655	Рс-петлевойβΙΡΙ (2О1у линкера)
51 ϋΡΕνΚΕΝννΥν ΟβνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΡ.ΕΕΟΥΝ5Τ ΗΟϋννίΝΘΚΕΥ	ΥΚννδνΐ-Τνί.
101 ΚύΚν5ΝΚΑΙ_Ρ ΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑ ΚΟΟΡΡΕΡΟνΥ ΤΙ_ΡΡ5βΟΕΙ_<5 βΗΑΕΟΤΕΤδΟ
151 νδδΥίΕΟΟΑΑ ΚΕΕΙΑΙΝίνΚΟ κοοοτκΝονδ εσίΑνΕννΕδΝ	ίΤΟΙ-νΚΘΡΥΡ
201 ΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤ ΡΡνΐ030Θ8Ε ΡίΥδΚίΤνϋΚ ΟδνΜΗΕΑίΗΝ	ЗКЖК2О№/Е8
251 НУТОКЗЬЗЬЗ РОК*
1 моктнтсррс РАРЕИ.60РЗ уперркркр τίΜίδκτρεν τονννϋνδΗΕ	656	Ес-петлевой-
			О1Р1
51 ϋΡΕνΚΕΝννΥν ΟβνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΡΕΕ0ΥΝ5Τ ΗΟϋννίΝΟΚΕΥ	γρννδνιτνι.		(401у линкера)
101 ΚΟΚνΒΝΚΑίΡ ΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑ ΚΟΟΡΡΕΡΟΥΥ Т1_РРЗКОЕ1_С СССНАЕСТЕТ
151 δΟΥβδΥίΕΟΟ ΑΑΚΕΡΙΑννίν КСКСССОСТК βΡΥΡδΟΙΑΥΕ	ΝΟνδίΤΟίνΚ
201 ΥνΕ3ΝβΟΡΕΝΝ УКТТРРУШЗ 065ΡΡίΥ3Κί ЫХ/ЕЗСЗУМНЕ	τνοκ3Ρ\Λ/οαβ
251 ΑΕΗΝΗΥΤΟΚ8 Ι_3ί8Ρ6Κ*
1 МОКТНТСРРС РАРЕИССР5 УПЕРРКРКО ТЬМ13КТРЕ\/ ТС\ЛЛ/ОУЗНЕ	657	Ес-петлевой-
			ΑΝΒ2
51 ϋΡΕνΚΡΝνΥΥν ΟβνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΚΕΕΟΥΝ5Τ ΗΟϋννίΝΘΚΕΥ	γρννδνιτνι		(2О1у линхера)
101 ΚΟΚνδΝΚΑίΡ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ ΚβΟΡΡΕΡΟΥΥ бОЕЕСЕИОРУУ	Т1РР6Р0ЕЮ
151 ТСЕНМООТКН ОУ31.ТС1Л/К<3 ΡΥΡδΟΙΑνενν КТТРРУЮЗЭ	ΕδΝΒΟΡΕΝΝΥ
201 ΟδΡΕίΥδΚΙΤ νΟΚδΚννΟΟβΝ УРЗСЗУМНЕА ίΗΝΗΥΤΟΚδί 818Ρ6Κ’
1 МОКТНТСРРС РАРЕ1Д.ССР8 νΡΙ_ΡΡΡΚΡΚϋ Т1_М18КТРЕУ ТС\ЛЛ/ОУЗНЕ	612	Ес-петлевой-
			Муо7
51 ϋΡΕνΚΡΝνΥΥν ΟβνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΚΕΕΟΥΝ8Τ ΗΟσννίΝβΚΕΥ	γκνγενίτνΐ-		(2С1у линкера)
101 ΚΟΚνδΝΚΑίΡ ΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑ ΚΘΟΡΚΕΡΟνΥ ΤΙΡΡδΚϋΕίΟ βίΛΟΗβΟΟΙΡ
151 УУРУУМСРРЕСУУ ΕββΤΚΝΟνδΙ. Τ01_νΚ0ΡΥΡ8 ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ	ΟΙΑνΕ’ΛΕδΝβ
201 РУЮбООЗЕР ΙΥδΚίΤνΟΚδ РМ/СЮСНУЕЗС ντοκδίδίδΡ	8νΜΗΕΑίΗΝΗ
251 ек*
1 моктнтсррс рареиссрз урьррркрко τίΜίδΗΤΡΕν τονννϋνδΗΕ	658	Ес-петлевой-
			ΑΝ61
51 ΟΡΕνκΡΝνΥΥν ϋΟνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΚΕΕΟΥΝ5Τ ΗΟΟΙΛ/ΙΝΘΚΕΥ	γρννδνιτνι		(4С1у линкера)
101 ΚΟΚνδΝΚΑίΡ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑ ΚββΡΡΕΡΟνΥ еоееоитсом	Т1РРЗРОЕЮ
151 ΟνΚΕΟΑΜΜΡΟ РРКЕСССООТ ΚΝ0ν5Ι_Τ0Ι_ν ΕννΕδΝΟΟΡΕΝ	ΚβΡΥΡδϋΙΑν
201 ΝΥΚΤΤΡΡνΐ·ϋ 3003ΕΡΙΥ8Κ |_ТУ0КЗРЖЮ ΕΑίΗΝΗΥΤΟΚ	ΟΝνΕδΟδνΜΗ
251 31.31.8РСК
1 МОКТНТСРРС ΡΑΡΕΙΛΟΟΡ3 νΡίΡΡΡΚΡΚΟ ΤίΜΙδΡΤΡΕν ТСУУУОУЗНЕ	650	Ес-петлевой-
			ΑΝβ1
51 ΟΡΕνΚΡΝννΥν ΟβνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΚΕΕΟΥΝ5Τ	γρννδνιτνι		(2хпептад,
ΗΟΟννίΝΟΚΕΥ			да/4С1у линкера)
101 ΚΟΚνδΝΚΑίΡ ΑΡ1ΕΚΤΙ8ΚΑ ΚβΟΡΡΕΡβνΥ ΟβΟβΟΙΛΠΌΡΜ	Т1РР8РОЕЮ
151 ΟνΚΡΟΑΜΜΡΟ РВКЕОССРИТ βΡΜΟνΚΕΡΑΜ	МЕСРРКЕССО
βΟΐΚΝύνείτ
201 ΟίνΚΟΡΥΡδΟ ΙΑνΕνΥΕδΝΟΟ ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡ УЮбООЗРП Υ3ΚΙ.Τν0Κ3Κ
251 ννΟΟΟΝΥΡδΟδ νΜΗΕΑΙΗΝΗΥ ТОК31.515РС К

- 54 011879

Рабочие примеры

Соединения, описанные выше, можно получить, как описано ниже. Эти примеры включают предпочтенные воплощения изобретения и являются иллюстративными, а не ограничивающими.

Пример 1. Получение Рс-петлевого-Апд2

В этом примере изобретения, связанный дисульфидными мостиками пептид ТЫ8-Соп4 включали в домен Рс-петли человеческого фС 1, определенный как последовательность Ό137Ε138Ε139Τ140Κ141 (фиг. 2А). ТЫ8-Соп4 С)ЕЕСЕ\\'1)Р\\'ТСЕНМ ФЕЕ) ΙΌ N0: 147)

Вставка пептида происходит между аминокислотными остатками Рс Ьеи139 и ТЬг140 и содержит 2 остатка Гли как линкер, фланкирующий вставленный пептид (фиг. 10А). Конструкция ТШ-С'оп4 с Рспетлей маркирована как Атдеп клон #6888. С-конец слитого пептитела ТЖ-С’оп4 (фиг. 10Б) содержит линкер из 5-и С1у маркирован как Атдеп клон #5564.

Обоими клонами #6888 и #5564 трансформировали Е. со11 с помощью общепринятых способов, известных специалистам. Показано, что оба клона экспрессировались на высоком уровне и почти всегда находились во фракции нерастворимых включений (фиг. 11). Изолированную фракцию включений (1 г) растворяли в 6М гуанидине-НС1, 50 мМ Трис, 8 мМ ДТТ (дитиотреитол), рН 9 (10 мл) при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 ч.

Денатурированные и восстановленные пептитела ренатурировали из растворенных включений путем разбавления 1:25 (об./об.) в буфере для ренатурации, состоящем из 2 М мочевины, 50 мМ Трис, 4 мМ цистеина, 1 мМ цистамина, рН 8,5. Растворенные пептитела добавляли по каплям в буфер для ренатурации при 4°С при перемешивании. Реакции ренатурации осуществляли при перемешивании в течение 48 ч, а затем аликвоты анализировали ДСН-ПААГ и обратно-фазной ВЭЖХ. ТШ-С'оп4 с Рс-петлей (#6888) являлось более гомогенным в реакции ренатурации, чем пептитело ТШ-Соп4 с С-концевым Рс (#5564), как показано обратно-фазной ВЭЖХ (фиг. 12).

Очистку ренатурировавших ТШ-С'оп4 с Рс-петлей и ТЖ-С’оп4 с С-концевым Рс проводили, используя способ с 2-колонками. Сначала колонку для рекомбинантного белка-А калибровали смесью 2 М мочевины, 50 мМ Трис, рН 8,5 и загружали реакционной смесью ренатурирующего отфильтрованного пептитела. Колонку затем промывали двойным объемом калибровочного буфера, после чего двойным объемом ФСБ (фосфатно-солевого буфера). Фракцию пептител элюировали 50 мМ №0Ас. рН 3 и быстро нейтрализовывали разбавлением 1:4 в 10 мМ №0Ас, 50 мМ №С1, рН 5. Разбавленный элюат белка-А снова фильтровали и загружали в катионо-обменную колонку §Р ЗерРагозе НР (РРагташа), откалиброванную в 10 мМ №0Ас, 50 мМ №С1, рН 5. Фракции пептител затем элюировали с линейным градиентом 50-500 мМ №С1, собирали и концентрировали до примерно 2 мг/мл. Конечный пул ТЖ-С’оп4 с Рспетлей (#6888) и ТЖ-С’оп4 с С-концевым Рс (#5564) оценивали обратно-фазовой ВЭЖХ (фиг. 13) и ДСН-ПААГ (фиг. 14). Как обратно-фазовая ВЭЖХ, так и ДСН-ПААГ показывали, что улучшенная гомогенность продукта достигается для ТШ-Соп4 с Рс-петлей (#6888) по сравнению с С-концевым слитым пептителом (#5564).

Как ТШ-С'оп4 с Рс-петлей, так и С-концевое слитое ТШ-С'оп4 пептитела далее анализировали ίπ νί1го с помощью ИФА по конкурентному ингибированию рецептора ангипоэтина 2. В этом анализе пептитело конкурирует со слитым белком рецептора ангиопоэтина 2 и Рс за связывание с иммобилизованным ангиопоэтином 2. Связывание слитого белка рецептора ангиопоэтина 2 и Рс отслеживали с помощью флуоресценции, используя способ ферментативной иммунодетекции, и учитывали как константу ингибирования при 505-ом ингибировании (ИК₅₀). Этот эксперимент показал, что ТЖ-Соп4 с Рс-петлей полностью активен по сравнению с ТЖ-С’оп4 С-концевым Рс (фиг. 15).

Стабильность ш νί\Ό пептитела ТЖ-Соп4 с Рс-петлей сравнивали с С-концевым пептителом ΙΝ8Соп4 у мышей. При этом анализе 15 мышам вводили подкожно одно из пептител в концентрации 5 мг/кг. Через 4 ч после инъекции 5 мышей умерщвляли и брали сыворотку. Через 24 ч то же делали с другими 5 мышами, то же и через 48 ч. Каждый индивидуальный образец сыворотки анализировали Вестернблоттингом на детектируемое человеческое пептитело фС-Рс. Поскольку все сыворотки в пределах группы из 5-и мышей были очень похожи, группы были объединены, чтобы получить показательные образцы на одном геле/блоте. Результат этого анализа (фиг. 16) четко показывает, что как пептитело ТЖ-Соп4 с Рс-петлей, так и С-концевое пептитело ТЖ-Соп4 содержится в объединенных мышиных сыворотках в течение 48-часового интервала без явного исчезновения. Этот результат показывает, что сконструированные пептитела, содержащие Рс-петлю, не дестабилизированы 1п νί\Ό путем вставки пептида.

Пример 2. Получение Рс-петлевого-туо7

В другом способе реализации настоящего изобретения новый, полученный с помощью дисульфидных связей пептид ТЖ-19-7 (заявка на патент США 2004-0181033-А1, которая включена здесь как ссылка) последовательности:

ТЖ-19-07 ЬАПНСфС1К\Р\МСРРЕС\Е фЕф ΙΌ N0: 365) сконструировали как внутренний гибридный пептид между Ьеи139 и ТЬг140 в предполагаемой последовательности Рс-петли ОЕЬТК фС1 Рс последовательности (фиг. 2А). Дополнительные два остатка С1у также добавляли на каждый конец пептида ТЖ-19-07 как фланкирующие линкеры. Окончательная последовательность Рс-петли ТЖ-19-07

- 55 011879 приведена на фиг. 3А и маркирована как клон # 6951. Альтернативно, слияние по С-концам ΤΝ8-19-07 с последовательностью Ес 1дС1 получали для того, чтобы использовать в качестве контроля (фиг. 3Б) и маркировали как клон #6826. Гибридный белок по С-концам включал в качестве линкера пять остатков 61у между Ес и ΤΝ8-19-07.

Обоими клонами #6951 и #6826 трансформировали в Е. со11 с помощью общепризнанных способов, известных специалистам, и обнаружили, что они экспрессируются на высоком уровне и находятся практически полностью во фракции нерастворимых включений (фиг. 4 А и 4Б). Изолированную фракцию включений (1 г) растворяли в 6 М гуанидин-НС1, 50 мМ Трис, 8 мМ ДТТ, рН 9 (10 мл) при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 ч. Денатурированные и восстановленные пептитела сворачивали заново из фракции растворенных включений путем разведения 1:25 (об./об.) в смеси 2М мочевины, 50 мМ Трис, 4 мМ цистеина, 1 мМ цистамина, рН 8,5. Растворенные пептитела добавляли по каплям в буфер для ренатурации при 4°С при перемешивании. Реакции ренатурации проводили при перемешивании в течении 48 ч, а затем аликвоты анализировали с помощью ДСН-ПААГ и обратно-фазной ВЭЖХ. Обнаружили при обратно-фазной ВЭЖХ, что ΤΝ8-19-07 с Ес-петлей (#6951) является значительно более гомогенным (фиг. 5) в реакции ренатурации, чем С-концевое пептитело ΕΟ-ΤΝ8-19-07 (#6826).

Очистку проводили способом с 2-колонками. Сначала колонку с рекомбинантным белком А калибровали в 2М мочевине, 50 мМ Трис, рН 8,5 и в нее загружали реакцию ренатурации фильтрованного пептитела. Колонку затем промывали двойным объемом калибровочного буфера, а затем двойным объемом ФСБ. Фракцию пептитела элюировали 50 мМ №1ОАс. рН 3 и быстро нейтрализовали разведением 1:4 в 10 мМ №1ОАс, 50 мМ №С1, рН 5. Разбавленный элюат белка-А снова фильтровали и загружали в катионо-обменную колонку 8Р 8ерНаго$е НР (РЕагтас1а), откалиброванную в 10 мМ №1ОАс, 50 мМ №С1, рН 5. Фракции пептител затем элюировали с линейным градиентом 50-500 мМ №С1, собирали и концентрировали до примерно 2 мг/мл. Конечный пул ΤΝ8-19-07 с Ес-петлей (#6951) и ΤΝ8-19-07 с С-концевым Ес (#6826) оценивали обратно-фазовой ВЭЖХ (фиг. 6) и ДСН-ПААГ (фиг. 7). Как обратно-фазовая ВЭЖХ, так и ДСН-ПААГ показывали, что улучшенная гомогенность продукта достигается для ΤΝ8-19-07 с Еспетлей (#6951) по сравнению с С-концевым слитым пептителом (#6826).

Клеточный анализ ίη νίίΐΌ, в котором измеряют подавление сигнальной активности миостатина, применяли для определения биоактивности ΤΝ8-19-07 с Ес-петлей (#6951) по сравнению с С-концевым слитым пептителом (#6826). В этом анализе обе конструкции титровали к 4 нМ миостатину и оценивали их способность подавлять сигнальную активность миостатина с помощью системы с репортерным белком люциферазы. Относительные активности пептител фиксировали как эффективные концентрации для 50%-ного подавления (ЕС₅₀). Этот эксперимент показывает, что пептитело ΤΝ8-19-07 с Ес-петлей (#6951) сохраняет полную биоактивность ίη νίύΌ (фиг. 8).

Стабильность ίη νί\Ό пептитела ΤΝ8-19-07 с Ес-петлей сравнивали с С-концевым пептителом ΤΝ819-07 у мышей. При этом анализе группам из 15 мышей вводили подкожно одно из пептител в концентрации 5 мг/кг. Через 4 ч после инъекции 5 мышей умерщвляли и брали сыворотку. Через 24 ч то же делали с другими 5 мышами, то же и через 48 ч. Каждый индивидуальный образец сыворотки анализировали Вестерн-блоттингом на детектируемое человеческое пептитело 1дС-Ес. Поскольку все сыворотки в пределах группы из 5-и мышей были очень похожи, группы были объединены, чтобы получить показательные образцы на одном геле/блоте. Результат этого анализа (фиг. 9) четко показывает, что пептитело ΤΝ8-19-07 с Ес-петлей содержится в объединенных мышиных сыворотках в течение 48-часового интервала без явного исчезновения. В отличие от этого, концентрация С-концевого пептитела ΤΝ8-19-07 постоянно снижается в течение всего времени эксперимента и становится практически необнаруживаемой во временной отметке 48 ч. Этот результат показывает, что подход к дизайну Ес-петель может давать дополнительную стабильность ίη νί\Ό пептителу ΤΝ8-19-07.

Пример 3. Получение ΤΝ8-^η4

Эту молекулу получали в соответствии с описанным выше в примере 1 и в заявке на патент США № 2003/0236192 (также РСТ/и804/10989), которая включена здесь как ссылка.

Пример 4. Получение тандема Есщи^

Эту молекулу получали в соответствии с описанным в и.8. 2003/0236193, опубликованной 25 декабря, 2003 (также РСТ/и804/10989, поданной 8 апреля, 2004), которая включена здесь как ссылка.

Пример 5. Получение ΤΝ8-19-7

Эту молекулу получали в соответствии с описанным выше в примере 2 и в заявке на патент США № 10/742379, поданной 19 декабря, 2003 (также РСТ/и803/40781, поданной 19 декбря, 2003), которая включена здесь как ссылка.

Пример 6. Ртрата!^ о£ Ес-петлевого-ЕМР

Эту молекулу получали в соответствии с описанным в примере 1.

Пример 7. Получение Ес-петлевого-АМР2

В другом способе реализации настоящего изобретения линейный несвязный пептид АМР2 вставляли в домен Ес-петли человеческого 1§С1, определенного как последовательность Ό₁3₇Ε₁₃₈Ε₁39Τ₁₄₀Κ₁₄₁ (фиг. 2А). АМР-2: 1Е6РТЕЕОАЕААЕА (8ЕЕ) ГО ΝΟ: 28)

Вставка в Ес находилась между Ееи₁₃,₉· и Τ1ιγ₁₄₀ и включала 2 остатка 61у в качестве линкеров, флан

- 56 011879 кирующих каждый из концов вставленного пептида (фиг. 3Г). Конструкцию Бс-петля:АМР2 маркировали как Атдеп клон #6875.

Клоном Бс-петля:АМР2 (#6875) трансформировали Е.сой с помощью общепринятых способов, известных специалистам, и показано, что клон экспрессировался на высоком уровне и почти всегда находился во фракции нерастворимых включений (фиг. 17). Изолированную фракцию включений (1 г) растворяли в 6М гуанидине-НС1, 50 мМ Трис, 8 мМ ДТТ, рН 9 (10 мл) при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 ч. Денатурированные и восстановленные пептитела ренатурировали из растворенных включений путем разбавления 1:25 (об./об.) в смеси из 2М мочевины, 50 мМ Трис, 4 мМ цистеина, 1 мМ цистамина, рН 8,5. Растворенные пептитела добавляли по каплям в буфер для ренатурации при 4°С при перемешивании. Реакции ренатурации осуществляли при перемешивании в течение 48 ч, а затем аликвоты анализировали ДСН-ПААГ и обратно-фазной ВЭЖХ.

Очистку проводили, используя способ с 2-колонками. Сначала колонку для рекомбинантного белка-А калибровали смесью 2М мочевины, 50 мМ Трис, рН 8,5 и загружали реакционной смесью ренатурирующего отфильтрованного пептитела. Колонку затем промывали двойным объемом калибровочного буфера, после чего двойным объемом ФСБ. Фракцию пептител элюировали 50 мМ №0Ас, рН3 и быстро нейтрализовали разбавлением 1:4 в 10 мМ №0Ас, 50 мМ №С1, рН 5. Разбавленный элюат белка-А снова фильтровали и загружали в катионо-обменную колонку δР δерΗа^οке НР (Рйагтааа), откалиброванную в 10 мМ №0Ас, 50 мМ №С1, рН 5. Фракции пептител затем элюировали с линейным градиентом 50-500 мМ №С1, собирали и концентрировали до примерно 2 мг/мл. Конечный пул Бс-петля:АМР2 (#6875) оценивали с помощью ДСН-ПААГ (фиг. 19) и обратно-фазной ВЭЖХ (фиг. 20).

Конечный препарат Бс-петля: АМР2 тестировали в биоанализе ш у1уо на мышиной модели по сравнению с С-концевым слитым пептителом, состоящим из двух последовательностей АМР2 тандемно (Бстандем-АМР2). В этом сравнительном анализе Бс-тандем-АМР2 имел общую валентность четырех пептидов АМР2 по сравнению лишь с двумя пептидами Бс-петля: АМР2. Мышам однократно подкожно инъецировали 50 мкг/кг одного из пептител, а уровень тромбоцитов отслеживали в течение 15 дней (фиг. 21). В то время как Бс-тандем-АМР2 индуцировало значительное увеличение первоначального уровня тромбоцитов, общий ответ оканчивался к 9-му дню. В отличие от этого, Бс-петля: АМР2 вызывало меньший ответ, который выходил на пик на 8-й день и продолжался в течение 15 дней. Эти результаты позволяют предположить, что эффективное время полужизни пептитела Бс-петля: АМР2 может быть много больше, чем у С-концевого слитого пептитела. Различие в общей амплитуде ответа может быть следствием большей валентности Бс-тандем-АМР2.

Пример 8. Получение АМР2

Эту молекулу получали в соответствии с описанным выше в примере 7 и в патенте США № 6660843.

Пример 9. Клеточный анализ ш νίΙΐΌ и измерение сигнальной активности миостатина (фиг. 8)

Для того чтобы количественно оценить активность миостатина и ее блокирование, разработали систему с люциферазой в качестве репортерного белка, обозначенной как рМАЯЕ-Ьис, с помощью которой можно оценить эффективность сигналинга миостатина/активина. Вектор рМАЯЕ-1ис сконструировали субклонированием δтаб-чувствительного САСА тандемно повторяющейся последовательности в репортерную плазмиду рЬис-МСА содержащую минимальный промоторный элемент (ТАТА-бокс). Вектор рМАЯЕ-1ис стабильно трансфицировали в клеточную линию (мышиную) С2С12, являющейся производной скелетных мышц.

Характеристика миостатинового ответа стабильных клонов привела к идентификации репортерных клонов клеточной линии С2С12, которые можно использовать для высоко чувствительного и воспроизводимого обнаружения сигнальных активностей миостатина и активина в формате 96 лунок.

Пример 10. Анализ связывания Апд-2 ГФВР (гомогенная флуоресценция с временным разрешением) ш уйго (фиг. 15)

Начиная с концентрации 100 нМ, пептитело с Бс-петлей и соответствующие контроли последовательно разводили в 3-кратном буфере ГФВР 9 раз в 96-луночной плашке. Разведения затем смешивали со следующими реагентами в круглодонной непрозрачной 96-луночной плашке: стрептавидин-европий (1,6 нМ), биотинилированный человеческий ангиотензин-2 (8,0 нМ), человеческий Т1е2-Бс-АРС (10 нМ). Плашку для анализа затем инкубировали при комнатной температуре при перемешивании в течение 2 ч. После этого плашку анализировали на ридере для микроплашек ЯиЬук1аг (ВМС ЬаЫесйпо1од1ек 1пс.). Результаты переводили в % подавления и ИК50 затем высчитывали, анализируя значения % подавления в программе СЯАБ1Т 5.0 (ИК50, 0-100% параметр).

Пример 11. Анализ эффективности АМР-2 т у1уо (фиг. 21)

Самкам мышей ВЭБ1 инъецировали подкожно либо жидкость-носитель (1хФСБ с 0,1% БСА), 50 мкг/кг Бс-тандем-АМР2, либо 50 мкг/кг Бс-петля-АМР2. Объем инъекции составлял 0,2 мл. Кровь собирали из каждой мыши через пункцию ретроорбитального синуса в гепаринизированную капиллярную трубку, а затем переносили в микроконтейнеры с ЭДТА. Полный обсчет крови (ПОК), включая обсчет белых кровяных клеток, проводили с использованием анализера крови АП^А120, который калибровали по крови мыши (Вауег Согр., Таггуф^п, ΝΥ). Дни, когда брали образцы крови, - 0, 3, 5, 7 и 10.

- 57 011879

Обсчет тромбоцитов представляли в виде графика функции от времени после инъекции.

Пример 12. υΤ-7 Еро-анализ пролиферации для ЭМП активности (фиг. 18)

В анализе пролиферации иГО7Еро использовали линию человеческих лейкозных мегакариобластов, на которую воздействовали мышиным ЕРО (мЕРО) и человеческим ЕРО (чЕРО) или другим подобным ЕРО молекулам, необходимых для роста и выживания.

Факторы роста последовательно разводили, начиная с 1000 нг/мл до 0,488 нг/мл, в трех повторностях в 100 мкл 10% ЭБС модифицированной по Дульбекко среды Игла (МДСИ) в 96-луночной плашке. 15000 клеток на лунку добавляли в 96-луночную плашку в 100 мкл 10% ЭБС МДСИ. Общий объем в лунке составлял 200 мкл среды с 15000 клеток на лунку. Одни клетки и среда составляли нулевые контроли. Клетки инкубировали в комнате с высокой влажностью при 37°С.

После инкубации в течение 72 ч с тестируемым фактором роста жизнеспособные клетки определяли путем включения МЪ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксфенил)-2-(4-сульфофенил)2Н-тетразол, внутренняя соль) (5+/-1 ч при 37°С) и рост оценивали по ОГО. (поглощение при 490 нм), ограничения не > 4,0 О.Э. Источник: Уа8И8айа Мшга, Кейа Кш!о, и №по Кота!8и (1998), Кеди1а!юп оП Во!й Егу!йго1й и Медакагуосуйс ПШегепЕайоп оП а Нитап Ьеикет1а Се11 Ьше, υΤ-7, Ас!а Наета!о1одка, 99:180-184.

Пример 13. Другие сайты инсерций в Ес-петле

Доказав возможность получения пептител с Ес-петлей со вставкой в сайт Ε139/Τ140, используя несколько различных пептидов, исследовали дополнительные петли в кристаллической структуре Ес. Используя гомологичное моделирование Ес-домена, выбрали 12 разных потенциальных сайтов инсерций, основываясь на взаимодействии с доступной поверхностью растворителя, стерических ограничений в пределах петли, близости к возможности Ес-димеров и наложению на сайты известной эффекторной функции, такой как ЕсКп связывание. Сайты Ес-петли, которые были определены как потенциальные для инсерций, были проанализированы подробно и ранжированы. См. фиг. 2А и табл. 12 ниже.

Таблица 12. Специфичные сайты инсерций для последовательности Ес человеческого 1дС1

Домен	Петля	Инсерция	Комментарий
СН2	Р25-Р26	Не предпочтительна	Значительный поворот
СН2	1Э46-Е53	н49/еи-1” Ε50/ϋ51-28	Нет гомологии Η/Е сайту
СН2	Уба-Аса	Не предпочтительна	ЕсКп взаимодействие
СН2		у77/ы78-1ая Ν7β/5Τ9-2’	Низкий уровень гомологии Υ/Ν сайту
СН2	Уи-Еи	Не предпочтительна	РсКп взаимодействие
СН2-СНЗ линкер	Ν1Ο6Ρΐ27	К107/А108 — 1ая Νί06/Κίΰ7-2“	Открытый поворот
СНЗ	ϋΐ37-Κ14ι	6ΐ3θ/Τΐ40 ~ 1“ Е1зв/Шзэ-2ая	Успешно тестированный 6139/1)40
СНЗ	ΝΐΒ5Νΐ77	Ει69/Νΐ70- 1” Ν,το/Ν,τι -2”	Нет значительного поворота Νι65-Ρι63- Нет гомологии Е/Ν сайту
СНЗ	Τΐ75δΐ84	31β1/Οΐ&2 — 1ан УпвЛитэ-г3’’	Нет гомологии У/1 сайту. Сам 8/ϋ сайт
			лучше открыт
СНЗ	К^б-Угоз	Ο701/Ν702-Γ Νω2/ν203 - 2“	α/β состав. С/Ν сайт открыт. Низкий уровень гомологии Ν/У сайту
СНЗ	Η.Ο.	Οΐβτ/Ρΐ88	1дА, 1дМ сайт вставки
СНЗ	НО.	Οΐ83/$1β4	1дА, 1дМ сайт вставки

Из этих потенциальных сайтов вставки шесть экспрессировали с применением вставки пептида ΤΝ8-19-7 (пример 2) и оценивали на эффективность ренатурации и активность ш уйго. Присоединяли дополнительные конструкции, содержащие асимметричную линкерную систему С1у4/С1у6, встроенную в исходный петлевой сайт вставки (Ε139/Τ140), описанный ранее. Всего семь новых конструкций ЕсПетля- миостатин ренатурировали, очищали и тестировали на активность.

- 58 011879

Семь новых конструкций Бс-Петля ΤΝ8-19-7, которые были протестированы, содержали вставки как в СН2, так и в СН3 доменах 1дС1 Бс человека. А именно, инсерции были: С201/№02 (СН3), Ε169/Ν170 (СН3), 8181/0182 (СН3), Н49/Е50 (СН2), Ы39/Т140 (С4-6) (СН3), Υ77/Ν78 (СН2), и К107/А108 (линкерный домен СН2-СН3). Этими конструкциями трансформировали Е. сой стандартными способами, известными в данной области, и их экспрессию наблюдали почти исключительно в нерастворимой фракции телец включения. Интересно, что конструкции Н49/Е50, Й139/Т140 (С4-6) и Υ77/Ν78 экспрессировались на наиболее высоком уровне. Конструкции Ε169/Ν170, 8181/0182, К107/108 демонстрировали средний уровень экспрессии, а экспрессию конструкции С201/202 наблюдали, но на очень низком уровне.

Конструкции Бс-Петля ТК8-19-7, которые хорошо экспрессировались в Е. Сой, очищали сначала путем солюбилизации изолированных фракций телец включения изолированного в 6 М гуанидин-НС1, 50 мМ Тик, 8 мМ ДТТ рН 9,0 (10 мл на 1 г телец включения) при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 ч. Затем оценивали ряд условий для каждых денатурированных и восстановленных конструкций Бс-Петля ТИ8-19-7 для определения оптимальных условий ренатурации. Три из трех конструкций С201/Ы202, Ε169/Ν170 и 8181/0182 не наблюдали ренатурации ни при каких из проанализированных условий. Из оставшихся четырех конструкций Бс-Петля ТТС8-19-7 конструкция Ы39/Т140 (С4-6) ренатурировала наилучшим образом, тогда как остальные три Н49/Е50, Υ77/Ν78 и К107/А108 ренатурировали с достаточным для дальнейшей очистки выходом.

С применением оптимальных условий ренатурации, денатурированные и восстановленные конструкции Бс-Ьоор ТЫ8-19-7 ренатурировали из солюбилизированной фракцией телец включения, разбавленной 1:25 (об./об.) в 4М мочевине, 50 мМ ТгЬ-НСк 0,16 М Агд-НС1, 20% глицирине, 3М цистине, 5 мМ цистамине рН 8,5. Солюбилизированные пептитела добавляли по капле в ренатурирующий буфер при 4°С при помешивании. Смесь реакции ренатурации оставляли при перемешивании на 72 ч и затем очищали при помощи хроматографии. Конечную очистку проводили при помощи 2-колоночной хроматографии, как описано в примере 2.

Конечный пул Й139/Т140 (С4-6), Н49/Е50, Υ77/Ν78, и К107/108 анализировали ОФ-ВЭЖХ и ДСНПААГ, как проиллюстрировано на фиг. 23 и 24. Выход для этих четырех конструкций представлен в табл. 13.

Таблица 13. Экспрессия и выход при очистке ренатурируемых Бс-петлевых конструкций

Сайт вставки	Грамм ТВ на грамм материала	Мг продукта на грамм ТВ
Н49/Е50 (СН2 домен)	0.182	2,08
И39/Т140 (64-6) (СНЗ домен)	0,156	14,58
Υ77/Ν78 (СН2 домен)	0,162	10,26
К107/А108	0,140	0,22

Среди четырех очищенных вариантов вариант с инсерционным сайтом Ы39/Т140 (С4-6)был получен в наиболее чистом виде и с наибольшим выходом.

Очищенные варианты с Бс-петлевыми инсерциями затем анализировали на функциональную активность связывания с рецептором миостатина с применением клеточного ш ν 11го анализа ингибирования, как описано в примере 9. Результаты представлены в табл. 14.

Таблица 14. Результаты клеточного ш уйго анализа ингибирования миостатина

Варианты с инсерциями в Ес-петлю	ИК^нМ)
Н49/Е50	13,94
Ы39/Т140 (64-6)	0,8727
Υ77/Ν78	17,06
Ес-Ьоор #6951 (139/140)	0,8335

Очищенные варианты с Бс-петлевыми инсерциями затем анализировали на связывание с БсКп с применением системы для анализа В1асоге. Пробу К107/А108 не тестировали из-за недостаточного количества образца, оставшегося после анализа. Значения ИК50, определенные с помощью клеточного анализа ингибирования миостатина ш νί!ΐΌ, были аналогичными для вставки Ы39/Т140 (С4-6) и исходного БсПетля #6951, тогда как вставки в Бс-петлевю Н49/Е50 и Υ77/Ν78 демонстрировали снижение способности ингибировать миостатин (фиг. 30). Эксперименты по определению связывания с БсКп В1асоге показали, что Н49/Е50 и Υ77/Ν78 связывают рецептор Бс на уровне, сравнимом с контролем (Ес-Ьоор-1хТШ19-7, #6951) с ЭК₅₀ около 680 нМ, а Й139/Т140 (С4-6) имели более низкое и более подходящее значение ЭК₅₀ около 220 нМ.

В итоге из шести новых проанализированных инсерционных сайтов, три оказались неспособными к

- 59 011879 эффективной ренатурации. Среди трех ренатурированных вариантов инсерционных сайтов, К107/А108 демонстрировал низкую степень ренатурации, Н49/Е50 (область СН2) ренатурировал в малой степени эффективно, и две остальных вставки Υ77/Ν78 (область СН2) и исходный инсерционный сайт Ε139/Τ140 (область СН3) с расширенным несимметричным линкером ренатурировали с наибольшей эффективностью. Интересно, что все из данных вариантов новых инсерционных ренатурироали с значительно более низким выходом, по сравнению с исходной Ес-петлевой конструкцией (#6951) с ΤΝ8-19-7 в положении Ε139/Τ140 с применением симметричных линкеров О1у2.

При анализе сохранения способности связываться с ЕсКп, все Ес-петлевые молекулы проявили схожее сродство, за возможным исключением конструкции с расширенным несимметричным линкером, который связывался с немного большим сродством. Это соответствовало концепции конструирования минимизировать стерическое взаимодействие между включенным пептидом и ЕсКп-связывающей поверхности.

Несмотря на то, что все очищенные Ес-петлевые конструкции демонстрировали активность в функциональном клеточном анализе ш νίΙΐΌ (табл. 14) исходный сайт вставки (Ε139/Τ140) и инсерция с расширенным асимметричным линкером в этот же сайте показали наибольшую активность.

Эта работа демонстрирует эти множественные петлевые домены в пределах Ес 1дО1 человека, как идентифицировано на фиг. 23, допускают инсерцию биоактивных пептидов, при этом сохраняется активность как пептида так и эффекторные функции Ес, такие как связывание с ЕсКп. Варианты с инсерциями пептидов в данных Ес-петлевых доменах могут значительно различаться по эффективности ренатурации и активности пептида. Каждую комбинацию пептид/инсерция можно оптимизировать индивидуально для достижения макимальной эффектиности ренатурации и активности.

Более предпочтительным являются вставки пептидов, направленные в субдомены, подчеркнутые на фиг. 23. Наиболее предпочтительными являются инсерционный сайт (Ε139/Τ140) и две дополнительных петли в домене СН2 (Н49/Е50 и Υ77/Ν78).

Список сокращений

Сокращения, использованные в ходе настоящего описания, имеют значения, указанные ниже, если в особых случаях не определено иначе.

Ас ацетил (применяется в отношении ацетилированных оснований)

АсВра асе1у1а1ес1 р-Ьепгоу1-Ь-рИепу1а1ап1пе (ацетилированный рбензоил-Ь-фенилаланин)

АЦН ацетонитрил

АЗКЦ антителозависимая клеточная цитотоксичность (АОСС, ап(|Ьобу-с1ереп<1еп1 се!1и1аг су1о1охю!1у)

- 60 011879

ΑίΡ ат1П0180Ьи1упс асй (аминоизомасляная кислота)

ЬА Ье1а-а1ап1пе (бета-аланин)

Вра р-Ьеп2оу1-1_-рпепу1а1ап1пе (р-бензоил-Ь-фенилаланин)

ВгАс Ьготоасе1у1 (ВгСН₂С(О) (бромацетил)

ЕСА Бычий сывороточный альбумин (В8А, Βονίηβ зегит а1Ьит1П)

ΒζΙ Вепгу! (бензил)

Сар Саргою асй (капроновая кислота)

СТ1. Су1о1охю Т 1утрИосу1ез (цитотоксические Т-лимфоциты)

СТЁА4 Су(о1ох1с Т 1утрЬосу(е апйдеп 4 (антиген цитотоксического Тлимфоцита 4)

ОАРС ОиНу Ыоос1 дгоир апбдеп гесер1ог (Рецептор антигена группы крови Даффи)

ОСС О1су1сопеху1сагЬоФ|т1с1е (дициклогексилкарбодиимид)

Обе 1-(4,4-ФтеШу1-2,6-с1юхо-сус1оЬехуНбепе)е111у1 (1-(4,41диметил-2,6-диоксо -циклогексилиден)этил)

ΕϋΤΑ е(Ьу1епе Фатте 1е(гаасейс асИ (этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТА)

ЕМР Егу1Игоро1еЁп-т1те11с рерйбе (эритропоэтин-мимикрирующий пептид, пептид-миметик эритропоэтина)

Ε3Ι-Μ8 Е1ес(гоп эргау ютгабоп таза 8рес1готе1гу (массспекгрометрия с ионизацией электрораспылением)

ЕРО Егу1Ьгоро1е(т, эритропоэтин

Етос Т1иогепу1теШохусагЬопу1 флуоренилметоксикарбонил ФМОК

С-С8Е Сгапи1осу1е со1опу збтФабпд (ас(ог (колониестимулирующий фактор гранулоцитов)

СН СгоуИР Рогтопе (гормон роста, ГР)

НСТ Рета1осгй (гематокрит)

НСВ Ьетод1оЫл (гемоглобин)

ЬСН Нитап дгомЛР Рогтопе (гормон ромта человека, чГР)

НОВ! 1-НубгохуРепго(паго1е (1-гидроксибензотриазол)

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хромотография (р|др регГогтапсе Нций сЬгота(одгарпу, НРЬС)

ИЛ интерлейкин (И, ίηίβΓίβυΗη)

- 61 011879

ИЛ-Р	рецептор интерлейкина (Ιί-Κ, ю1ег1еик1п гесер(ог)
ИЛ-1Р	рецептор интерлейкина 1 (И-1К, 1п(ег1еик1п-1 гесерйг)
ИЛ-1ра	антагонист рецептора интерлейкина 1 (11_-1га , 1П1ег1еик1П-1

гесерки ап1адоп!з()

Ьа и	1_аипс асй
ЬР5	Нроро1узассЬагйе (липополисахарид, ЛПС)
ίΥΜΡΗ	1утрИосу(ез (лимфоциты)
МАЮ1-М8	Ма(пх-азз1з1ес1 1азег безогрбол ίοπίζθΐίοπ тазз зрес!готе1гу, масс-спектрометрия с лазерной десорбцией-ионизацией в присутствии матрицы
Ме	те!Ку| (метил)
МеО	теФоху (метокси)
МЕ8	(2-[Ν-ΜθΓρήοΙίηο]βίΙΐ3ηβ3ΐιΙΐοηίο асй) (2-[Ы-морфолино]этан

сульфоновая кислота)

ГКГС	главный комплекс гистосовместимости (МНС, тарг

Ыв(осотра(|Ь|1Йу сотр!ех)

ММР	та!пх те(а(1орго1е1пазе (матриксные металлопротеиназы)
ΜΜΡΙ	та(пх те(а!1орго1е1пазе ίηϊιίβίΙοΓ (ингибиторы матриксных

металлопротеиназ)

ИаОАс	зосИит асе(а!е (ацетат натрия)
1-Иар ΝΕίΙΤ	1 -пар(Ку1а1ап1пе (1 -нафтилаланин) пеи1горЫ1з, нейтрофил
ΝΘΕ	пегуе дгоуйп 1ас(ог (ФРН фактор роста нервов)
Ме	поИеисте (норлейцин)
ΝΜΡ	М-теН1у1-2-руггоНФполе (Н1-метил-2-пирролидинон)
ПААГ	электрофорез в полиакриламидном геле (РАСЕ ро1уасгу1агп1Йе де1 е1ес1горНогез1з)
ФСБ	фосфатно-солевой буфер (РВ8, РИозрпа1е-ЬиЯегей заНпе)
РЫ	2,2,4,6,7-репс)ате111укйЬус1гоЬепго(игап-5-8и1(опу1 (2,2,4,6,7-

пендаметилдигидробензофуран-5-сульфонил)

ПЦР	полимеразная цепная реакция (РСК, ро1утегазе спаю
геайюп) Рес	ρίρβοοΙίε аск1, пипеколиновая кислота

- 62 011879

ПЭГ	полиэтиленгликоль (РЕС, Ро1у(еФу1епе д1усо1))
рС1и Рю	ругод1и(атю ааб (полиглутаминовая кислота) ρϊοοΙίπϊο асН (пиколиновая кислота)
РЕТ	р1а(е1е(5 (тромбоциты)
ΡΥ РТЕЕ	р(105р(ю(уг081Пе (фосфотирозин) ро1у(е(га(1иогоеФу1еле (политетрафторэтилен)
ВВС	геб ЫооО сеПз (эритроциты)
КВ8	пЬозоте Ь1псйпд зйе (сайт связывания рибосомы)
ОФ-ВЭЖХ	обращеннофазная ВЭЖХ (КР-НРЬС геуегзеб рИазе НРЬС)
КТ	гоот (етрега(иге (25 ’С), комнатная температура
8аг	загсозте, саркозин
ДСН ЗТК	додецилсульфат натрия (ЭО8, зоскит бобесу! зи1Та(е) зеппе-Фгеотпе ктазез (СТК, серин-треониновые киназы)
1-Вос	1еб-Ви(охусагЬопу1 (трет-бутоксикарбонил)
(Ви	1ег1-Ви(у1 (трет-бутил)
Т6Е	Оззие дгоиЛН Гас(ог (тканевой ростовой фатор)
ТНЕ	Футю пштюга! (ас(ог, гуморальный фактор тимуса
ТК	(угоз1пе к1паве (тирозинкиназа)
ТМР тромбопоэтина) ΤΝΕ	Т(1готЬоро1е(1п-т1те(ю рерйбе (пептид - миметик Титог лесго513 (ас(ог (ФНО, фактор некроза опухолей)
ТРО	ΤήΓοηΦοροίβίίη (тромбопоэтин)
ТКАН	ТМЕ-ге1а(еб арор(оз!з-1пбис1пд Идапб (ФНО-подобный

индуцируемый апоптозом лиганд)

Тб	(п(у1 (тритил)
ик	игок1пазе (урокиназа)
икк	игок'пазе гесерФг (рецептор урокиназы)
УЕСЕ сосудов, ФРЭС)	уазси1аг епбофейа! се11 дгои/Ф Гас(ог (фактор роста эндотелия

νΐΡ уазоасИуе )п(ез(1па1 рерйбе (вазоактивный пептид кишечника)

УЛЗС «Ийе Ыооб сеНз, лейкоциты

Claims (62)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы и его мультимеры, где

   Р¹ представляет собой домен Рс, модифицированный таким образом, что содержит по меньшей мере один X³ в участке петли, причем указанный участок петли находится в неконцевой области Рс-домена;

   каждый из X¹ и X² независимо выбран из -(Ь¹)с-Р¹, -(Е¹)с-Р¹-(Ь²)б-Р², -(Е¹)с-Р¹-(Е²)б-Р²-(Е³)е-Р³ и -(Е¹)с-Р¹-(Е²)б-Р²-(Е³)е-Р³-(Ь⁴)_£-Р⁴;

   X³ независимо выбран из -(Ь⁵)с-Р⁵, -(Ь⁵)с-Р⁵-(Е⁶)б-Р⁶, -(Е⁵)с-Р⁵-(Е⁶)б-Р⁶-(Ь⁷)е-Р⁷ и -(Ь⁵)с-Р⁵-(Ь⁶)б-Р⁶(Е⁷)е-Р⁷-(Ь⁸)_£-Р⁸;

   каждый из Р¹, Р², Р³ и Р⁴ независимо представляет собой последовательность фармакологически активного полипептида или фармакологически активного пептида;

   каждый из Р⁵, Р⁶, Р⁷ и Р⁸ независимо представляет собой последовательность фармакологически ак тивного пептида;

   каждый из Ь¹, Ь², Ь³, Ь⁴, Ь⁵, Ь⁶, Ь⁷ и Ь⁸ независимо представляет собой линкер и каждый из а, Ь, с, б, е и £ независимо равен 0 или 1.
2. 2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что а и Ь равны 0.
3. 3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Рс домен содержит Рс домен 1дС.
4. 4. Соединение по п.3, отличающееся тем, что Рс домен содержит последовательность, выбранную из 8ЕО ГО ΝΟ: 599 и 603-607.
5. 5. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Рс домен содержит Рс домен 1дС1.
6. 6. Соединение по п.5, отличающееся тем, что Рс домен 1дС1 содержит 8ЕО ГО ΝΟ: 599, а X³ встав

   - 63 011879 лен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 621, 622, 624, 625, 627, 628, 630, 632, 634 и 636, или заменяет всю или часть этой последовательности.
7. 7. Соединение по п.6, отличающееся тем, что X³ вставлен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 623, 626, 629, 631, 633, 635 и 637 или заменяет всю или часть этой последовательности.
8. 8. Соединение по п.7, отличающееся тем, что X³ вставлен между парой остатков Ьеивд/ТЬг^.
9. 9. Соединение по п.5, отличающееся тем, что Ес домен 1дС1 содержит 8ЕЦ ГО ΝΟ: 603, а X³ вставлен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 621, 622, 624, 625, 627, 628, 630, 632, 634 и 636, или заменяет всю или часть этой последовательности.
10. 10. Соединение по п.9, отличающееся тем, что X³ вставлен между парой остатков Н₅з/Е₅₄, Υ₈ι/Ν₈₂, Ν1Λ11, ^{^}143^/Т144^, ^171^/Р172^{, Е}173^/N174^, 8185^186, θ187^/8188 ^или θ205^/Ν206.
11. 11. Соединение по п.5, отличающееся тем, что Ес домен 1дС1 содержит последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 604, а X³ вставлен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 621, 622, 624, 625, 627, 628, 632, 634, 636 и 644, или заменяет всю или часть этой последовательности.
12. 12. Соединение по п.11, отличающееся тем, что X³ вставлен между парой остатков Н₅₃/Е₅₄, Υ₈ι/Ν₈₂, «11, ^М143^/Т144^, ^171^/Р172^{, Е}173^/N174^{, 8}185^/^186^, θ187^/8188 ^или θ205^/Ν206.
13. 13. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Ес домен содержит Ес домен 1дС3.
14. 14. Соединение по п.13, отличающееся тем, что Ес домен 1дС3 содержит 8ЕЦ ГО ΝΟ: 605, а X³ вставлен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 614, 621, 622, 624, 627, 639, 641, 644, 645 и 646, или заменяет всю или часть этой последовательности.
15. 15. Соединение по п.14, отличающееся тем, что X³ вставлен между парой остатков Н1₀₀/Ею1, +128^^129, ^N157^/К158^{, М}190^/Т19Ь ^218^/Р219^{, Е}220^/N221^{, 8}232^/^233^, θ234/⁸235 ^или θ252^/Ν253.
16. 16. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Ес домен содержит Ес домен 1дС2.
17. 17. Соединение по п.16, отличающееся тем, что Ес домен содержит 8ЕЦ ГО ΝΟ: 606 и X³ вставлен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 621, 622, 624, 632, 636, 639, 640, 642, 644 и 646, или заменяет всю или часть этой последовательности.
18. 18. Соединение по п.17, отличающееся тем, что X³ вставлен между парой остатков Н₄₉/Е₅₀, Ε--/Ν-₈, ^N106^/К107^{, М}139^/Т140^, ^167^/Р168^{, Е}169^/N170^{, 8}181^/^182^, θ183^/8184 ^или θ201^/Ν202.
19. 19. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Ес домен содержит Ес домен 1дС4.
20. 20. Соединение по п.19, отличающееся тем, что Ес домен содержит 8ЕЦ ГО ΝΟ: 607 и X³ вставлен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 620, 621, 624, 627, 632, 634, 638, 639, 643 и 644, или заменяет всю или часть этой последовательности.
21. 21. Соединение по п.20, отличающееся тем, что X³ вставлен между парой остатков р₅₀/Е₅1, Е₇₈/Ы₇9, ^N107^/К108^, ^40^+141 Р168^/Р169, ^Ε170^/Ν171, ^82^183, θ184/⁸185 ^или θ202^/Ν203.
22. 22. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Ес домен содержит 8ЕЦ ГО ΝΟ: 608 и X³ вставлен в последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 621, 622, 628, 624, 627, 632, 636, 639, 644 и 646, или заменяет всю или часть этой последовательности.
23. 23. Соединение по п.22, отличающееся тем, что X³ вставлен между парой остатков Н₆₅/Е₆₆, Ед₃/Мд₄, ^N122^/К123^{, М}157^/Т158^, ^185^/Р188^{, Е}189^/N190^, θ203^/8207 ^или θ22·Ι^/Ν225.
24. 24. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X³ содержит последовательность ангиотензин-2 (апд2)-связывающего пептида.
25. 25. Соединение по п.24, отличающееся тем, что последовательность апд-2-связывающего пептида выбрана из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 100-189.
26. 26. Соединение по п.25, отличающееся тем, что последовательность апд-2-связывающего пептида представляет собой 8ЕЦ ГО ΝΟ: 147.
27. 27. Соединение по п.26, отличающееся тем, что Е¹ содержит Ес домен 1дС1.
28. 28. Соединение по п.27, которое имеет последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 618.
29. 29. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X³ содержит последовательность миостатинсвязывающего пептида.
30. 30. Соединение по п.29, отличающееся тем, что последовательность миостатинсвязывающего пептида выбрана из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 218-509.
31. 31. Соединение по п.30, отличающееся тем, что последовательность миостатинсвязывающего пептида представляет собой 8ЕЦ ГО ΝΟ: 365.
32. 32. Соединение по п.31, отличающееся тем, что Е¹ содержит Ес домен 1дС1.
33. 33. Соединение по п.32, которое имеет последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 612.
34. 34. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X³ содержит последовательность пептида-миметика эритропоэтина (ЕРО-миметика).
35. 35. Соединение по п.34, отличающееся тем, что последовательность ЕРО-миметика выбрана из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-27.
36. 36. Соединение по п.35, отличающееся тем, что последовательность ЕРО-миметика представляет собой 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2.
37. 37. Соединение по п.36, отличающееся тем, что Е¹ содержит Ес домен 1дС1.
38. 38. Соединение по п.37, которое имеет последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 615.

    - 64 011879
39. 39. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X³ содержит последовательность пептида-миметика тромбопоэтина (ТРО-миметика).
40. 40. Соединение по п.39, отличающееся тем, что последовательность ТРО-миметика выбрана из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 28-99.
41. 41. Соединение по п.40, отличающееся тем, что последовательность ТРО-миметика представляет собой 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 28.
42. 42. Соединение по п.41, отличающееся тем, что Е¹ содержит Ес домен !дС1.
43. 43. Соединение по п.42, которое имеет последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 616.
44. 44. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X³ содержит последовательность пептида, связывающего фактор роста нейронов (ЫСЕ).
45. 45. Соединение вещества по п.44, отличающееся тем, что последовательность пептида, связывающего ЫСЕ, выбрана из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 190-218.
46. 46. Вещество по п.1, отличающееся тем, что X³ содержит последовательность пептида, связывающего фактор, активирующий В-клетки (ВАЕЕ).
47. 47. Соединение вещества по п.46, отличающееся тем, что последовательность пептида, связывающего ВАРЕ, выбрана из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 510-594.
48. 48. ДНК, кодирующая соединение по п.1.
49. 49. Вектор экспрессии, который содержит ДНК по п.48.
50. 50. Клетка-хозяин, которая содержит вектор экспрессии по п.49.
51. 51. Клетка по п.50, отличающаяся тем, что представляет собой клетку Е. сой.
52. 52. Способ получения фармакологически активного соединения, который включает:

    а) выбор по меньшей мере одного рандомизированного пептида, который модулирует активность представляющего интерес белка; и

    б) получение фармакологического агента, который содержит аминокислотную последовательность выбранного пептида в качестве внутренней неконцевой последовательности Ес домена.
53. 53. Способ по п.52, отличающийся тем, что внутренняя последовательность Ес домена представляет собой область петли.
54. 54. Способ по п.52, отличающийся тем, что пептид выбран способом, включающим одну или более методику, выбранную из скрининга в дрожжах, рационального дизайна, структурного анализа белков или скрининга библиотеки фагового дисплея, библиотеки Е. сой дисплея, библиотеки рибосомальных генов или химической пептидной библиотеки.
55. 55. Способ по п.52, отличающийся тем, что получение фармакологического агента осуществляют посредством:

    а) получения генетической конструкции, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую Ес домен, причем последовательность выбранного пептида вставлена между парой остатков или заменяет один или более аминокислотный остаток в пределах Ес домена; и

    б) осуществления экспрессии генетической конструкции.
56. 56. Способ по п.55, отличающийся тем, что указанную генетическую конструкцию экспрессируют в клетке Е. сой.
57. 57. Способ по п.52, отличающийся тем, что представляющий интерес белок представляет собой поверхностный клеточный рецептор.
58. 58. Способ по п.52, отличающийся тем, что представляющий интерес белок имеет линейный эпитоп.
59. 59. Способ по п.52, отличающийся тем, что представляющий интерес белок представляет собой рецептор цитокинов.
60. 60. Способ по п.52, отличающийся тем, что Ес домен представляет собой Ес домен [дС.
61. 61. Модифицированное антитело, содержащее Ес домен, модифицированный таким образом, что он содержит по меньшей мере один X³ в области петли, причем указанный участок петли находится в неконцевой области Ес домена, где

    X³ независимо выбран из -(Ь⁵)с-Р⁵, -(Ь⁵)с-Р⁵-(Ь⁶)б-Р⁶, -(Ь⁵)с-Р⁵-(Ь⁶)б-Р⁶-(Ь⁷)е-Р⁷ и -(Ь⁵)с-Р⁵-(Ь⁶)б-Р⁶(Ь⁷)е-Р⁷-(Ь⁸)г-Р⁸;

    каждый из Р⁵, Р⁶, Р⁷ и Р⁸ независимо представляет собой последовательность фармакологически активных пептидов;

    каждый из Ь⁵, Ь⁶, Ь⁷ и Ь⁸ независимо представляет собой линкер; и каждый из с, б, е и Г независимо равен 0 или 1.
62. 62. Способ получения модифицированного антитела, который включает:

    а) выбор по меньшей мере одного пептида, который модулирует активность представляющего интерес белка; и

    б) получение антитела, которое содержит аминокислотную последовательность выбранного пептида в участке петли Ес домена указанного антитела, причем указанный участок петли находится в неконцевой области Ес домена.