JPH09151200A - ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤 - Google Patents
ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト胃癌に対して有効CTLを引き起こすペプ
チドの提供である。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するペプチドが
胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘導する。従
って該ペプチドは胃癌に対する治療、予防剤として期待
される。
チドの提供である。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するペプチドが
胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘導する。従
って該ペプチドは胃癌に対する治療、予防剤として期待
される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト胃癌細胞に対
するCTL（Cytotoxic T Lymphocytes、医科免疫学（改訂
第３版）菊池浩吉編集、参照）をin vivo又はin vitro
において誘導可能なペプチド及び該ペプチドをコードす
るＤＮＡに関する。更に詳しくは、HLA-A31抗原（Human
Leucocyte Antigen、現代免疫学（第２版）、山村雄
一、多田富雄編集、参照）と結合することによりヒト胃
癌細胞に対するCTLを提示され得るペプチド及び該ペプ
チドをコードするDNAに関する。また、本発明はヒト胃
癌細胞に対するCTLをin vivo又は in vitroにおいて誘
導可能なペプチドを含有するヒト胃癌治療、予防剤、及
び該ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えウイルス
又は組換え細菌を含むヒト胃癌治療、予防用ワクチンに
関する。
するCTL（Cytotoxic T Lymphocytes、医科免疫学（改訂
第３版）菊池浩吉編集、参照）をin vivo又はin vitro
において誘導可能なペプチド及び該ペプチドをコードす
るＤＮＡに関する。更に詳しくは、HLA-A31抗原（Human
Leucocyte Antigen、現代免疫学（第２版）、山村雄
一、多田富雄編集、参照）と結合することによりヒト胃
癌細胞に対するCTLを提示され得るペプチド及び該ペプ
チドをコードするDNAに関する。また、本発明はヒト胃
癌細胞に対するCTLをin vivo又は in vitroにおいて誘
導可能なペプチドを含有するヒト胃癌治療、予防剤、及
び該ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えウイルス
又は組換え細菌を含むヒト胃癌治療、予防用ワクチンに
関する。
【０００２】
【従来の技術】悪性腫瘍に対する薬物療法としては、腫
瘍細胞に直接傷害性を示す化学療法剤や、宿主の免疫能
を非特異的に賦活化し、宿主の生体防御機能を増強する
ことにより治療を行おうとする免疫療法剤などが用いら
れている。しかし、現在までに悪性腫瘍、特に消化器腫
瘍に対し、完全に治癒を誘導することができる薬剤は存
在しないのが現状である。
瘍細胞に直接傷害性を示す化学療法剤や、宿主の免疫能
を非特異的に賦活化し、宿主の生体防御機能を増強する
ことにより治療を行おうとする免疫療法剤などが用いら
れている。しかし、現在までに悪性腫瘍、特に消化器腫
瘍に対し、完全に治癒を誘導することができる薬剤は存
在しないのが現状である。
【０００３】近年、マウスを中心とした動物腫瘍モデル
を用いた研究より、種々の腫瘍細胞上に存在する腫瘍関
連抗原、腫瘍特異抗原に対する抗原特異的な免疫応答を
増強する事により、腫瘍を完全に治癒することが可能で
あることが明らかになり、臨床においても、これら腫瘍
特異抗原に対する抗原特異的な免疫応答を増強すること
により治療を行おうとする試みが行われている。
を用いた研究より、種々の腫瘍細胞上に存在する腫瘍関
連抗原、腫瘍特異抗原に対する抗原特異的な免疫応答を
増強する事により、腫瘍を完全に治癒することが可能で
あることが明らかになり、臨床においても、これら腫瘍
特異抗原に対する抗原特異的な免疫応答を増強すること
により治療を行おうとする試みが行われている。
【０００４】これらの癌抗原特異的な免疫応答を増強す
ることにより癌治療を行おうとする薬剤及び試みとし
て、腫瘍細胞で発現し、主にＢ細胞により認識される抗
原に対するモノクーロナル抗体を用いたもの、放射線も
しくは薬剤により不活化した自己の腫瘍細胞もしくはそ
れらの可溶化画分をワクチンとして、患者自身に投与す
ることにより腫瘍に対する特異的免疫応答を誘導しよう
とするもの、更に腫瘍細胞の免疫原性を高めるために腫
瘍細胞にウイルスや種々のサイトカイン遺伝子を導入し
た後に患者自身に投与することにより腫瘍に対する特異
的免疫応答を誘導しようとするものなどが報告されてい
る。
ることにより癌治療を行おうとする薬剤及び試みとし
て、腫瘍細胞で発現し、主にＢ細胞により認識される抗
原に対するモノクーロナル抗体を用いたもの、放射線も
しくは薬剤により不活化した自己の腫瘍細胞もしくはそ
れらの可溶化画分をワクチンとして、患者自身に投与す
ることにより腫瘍に対する特異的免疫応答を誘導しよう
とするもの、更に腫瘍細胞の免疫原性を高めるために腫
瘍細胞にウイルスや種々のサイトカイン遺伝子を導入し
た後に患者自身に投与することにより腫瘍に対する特異
的免疫応答を誘導しようとするものなどが報告されてい
る。
【０００５】しかしながら、生体内で腫瘍拒絶に主に作
用するのがCTLを始めとするＴ細胞である事が明らかに
なりつつあり、現在ではＢ細胞認識抗原に対する抗体を
用いた治療法では限界があることが明らかにされた。ま
た、Ｔ細胞による免疫応答は、Ｔ細胞集団中に存在する
２つの機能的亜集団（Th1, Th2 サブセット）の活性化
状態で増強的にも、抑制的にも作用する事が明らかにさ
れ、複数の抗原を含む腫瘍細胞自体の免疫は腫瘍細胞に
対する免疫応答を逆に抑制する場合もあることが明らか
になってきた。さらに、不活化腫瘍細胞の接種は、生体
内での再活性化による腫瘍の再増殖の可能性も完全には
否定し得ず、安全性の問題が残る。
用するのがCTLを始めとするＴ細胞である事が明らかに
なりつつあり、現在ではＢ細胞認識抗原に対する抗体を
用いた治療法では限界があることが明らかにされた。ま
た、Ｔ細胞による免疫応答は、Ｔ細胞集団中に存在する
２つの機能的亜集団（Th1, Th2 サブセット）の活性化
状態で増強的にも、抑制的にも作用する事が明らかにさ
れ、複数の抗原を含む腫瘍細胞自体の免疫は腫瘍細胞に
対する免疫応答を逆に抑制する場合もあることが明らか
になってきた。さらに、不活化腫瘍細胞の接種は、生体
内での再活性化による腫瘍の再増殖の可能性も完全には
否定し得ず、安全性の問題が残る。
【０００６】以上のような問題点を回避する為には、腫
瘍拒絶に対し、中心的役割を果たすと考えられているCT
Lを活性化する抗原タンパク質を同定し、本抗原タンパ
ク質を用いてCTLを活性化する方法が考えらている。
瘍拒絶に対し、中心的役割を果たすと考えられているCT
Lを活性化する抗原タンパク質を同定し、本抗原タンパ
ク質を用いてCTLを活性化する方法が考えらている。
【０００７】近年の研究の進歩によりCTLの誘導は、細
胞内のタンパク質分解酵素により断片化された抗原タン
パク質由来の８ないし１２残基のアミノ酸より構成され
るペプチドがHLA抗原と結合することにより、CTLへの抗
原提示分子として作用することにより行われることが明
らかにされた。
胞内のタンパク質分解酵素により断片化された抗原タン
パク質由来の８ないし１２残基のアミノ酸より構成され
るペプチドがHLA抗原と結合することにより、CTLへの抗
原提示分子として作用することにより行われることが明
らかにされた。
【０００８】従って、癌抗原ペプチドに於いても、HLA
分子と結合し、腫瘍細胞に対するCTLを誘導可能なペプ
チドを発見できれば、これを癌に対する治療、予防剤と
して使用することが可能になると考えられる。
分子と結合し、腫瘍細胞に対するCTLを誘導可能なペプ
チドを発見できれば、これを癌に対する治療、予防剤と
して使用することが可能になると考えられる。
【０００９】このような考えのもと、CTLを誘導可能な
癌抗原ペプチドの検索が行われているが、現在までに明
らかになっているものは、いずれもメラノーマ腫瘍中に
存在する癌抗原であるMAGE family, Mart-1, Thyrosina
se, gp100タンパク質由来のペプチドのみであり、胃癌
を始めとする消化器癌に対しては、CTLを誘導可能な癌
抗原ペプチドが存在するか否か、ましてその癌抗原ペプ
チドの構造は全く明らかにされていない。
癌抗原ペプチドの検索が行われているが、現在までに明
らかになっているものは、いずれもメラノーマ腫瘍中に
存在する癌抗原であるMAGE family, Mart-1, Thyrosina
se, gp100タンパク質由来のペプチドのみであり、胃癌
を始めとする消化器癌に対しては、CTLを誘導可能な癌
抗原ペプチドが存在するか否か、ましてその癌抗原ペプ
チドの構造は全く明らかにされていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、１）
ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチドの提
供、２）上記ペプチドをコードするDNAの提供、３）上
記ペプチドを含有するヒト胃癌治療、予防剤の提供、及
び４）上記ペプチドをコードするＤＮＡを有する組換え
ウイルス又は組換え細菌を含むヒト胃癌治療、予防用ワ
クチンの提供である。
ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチドの提
供、２）上記ペプチドをコードするDNAの提供、３）上
記ペプチドを含有するヒト胃癌治療、予防剤の提供、及
び４）上記ペプチドをコードするＤＮＡを有する組換え
ウイルス又は組換え細菌を含むヒト胃癌治療、予防用ワ
クチンの提供である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者等は腫瘍細胞に
対する生体防御機構として、腫瘍抗原を認識するCTLが
大きな役割を果たしていることに着目した。即ち、ワク
チンの一部として使用可能なペプチド又はそれをコード
するDNAを含む形質転換体によりこのCTLを効率的に誘導
することが癌の治療、予防に有効であることに着目し、
研究を進めた。
対する生体防御機構として、腫瘍抗原を認識するCTLが
大きな役割を果たしていることに着目した。即ち、ワク
チンの一部として使用可能なペプチド又はそれをコード
するDNAを含む形質転換体によりこのCTLを効率的に誘導
することが癌の治療、予防に有効であることに着目し、
研究を進めた。
【００１２】このCTLの誘導は、HLA抗原が癌抗原ペプチ
ドと結合し、CTLへの抗原提示分子として機能すること
により行われることが知られている。従って、HLA抗原
と結合し、胃癌細胞と反応するCTLを活性化することが
可能なペプチドを発見できれば、これを胃癌の治療、予
防剤として使用することが可能になると考えられる。
ドと結合し、CTLへの抗原提示分子として機能すること
により行われることが知られている。従って、HLA抗原
と結合し、胃癌細胞と反応するCTLを活性化することが
可能なペプチドを発見できれば、これを胃癌の治療、予
防剤として使用することが可能になると考えられる。
【００１３】本発明者らは、胃癌細胞に対し、HLA-A31
拘束性に特異的に反応する胃癌患者由来のCTL細胞株（T
c-HST-2）及び、本CTLが作用する同一患者由来の胃癌細
胞株（HST-2）の樹立に成功している（J.I.Meth. 154;
235-243, 1992, Cancer 75;1484-1489, 1995）。
拘束性に特異的に反応する胃癌患者由来のCTL細胞株（T
c-HST-2）及び、本CTLが作用する同一患者由来の胃癌細
胞株（HST-2）の樹立に成功している（J.I.Meth. 154;
235-243, 1992, Cancer 75;1484-1489, 1995）。
【００１４】しかしながら、このCTLが腫瘍抗原を認識
しているか、更にはいかなる抗原を認識しているかは明
らかにされていなかった。また、胃癌を始めとする消化
器癌に特異的に存在し、CTLを誘導可能な癌抗原ペプチ
ドの存在そのもの、まして物質的本体も全く明らかにさ
れていなかった。
しているか、更にはいかなる抗原を認識しているかは明
らかにされていなかった。また、胃癌を始めとする消化
器癌に特異的に存在し、CTLを誘導可能な癌抗原ペプチ
ドの存在そのもの、まして物質的本体も全く明らかにさ
れていなかった。
【００１５】そこで、本発明者らは、胃癌細胞HST-2細
胞表面上に存在するHLA結合ペプチドを精製し、CTL細胞
株Tc-HST-2を活性化するペプチドを同定した。更に、同
定した本ペプチドを常法に従い、化学的に合成した。係
るペプチドは、CTL細胞株Tc-HST-2を実際に活性化する
ことを初めて解明した。また、本ペプチドがHST-2以外
の胃癌細胞にも発現していることも発見した。以上の結
果より本ペプチドが、胃癌の治療、予防剤としての利用
可能が極めて高いことを明らかにした。本発明は、かか
る発見に基づき完成するに至ったものである。
胞表面上に存在するHLA結合ペプチドを精製し、CTL細胞
株Tc-HST-2を活性化するペプチドを同定した。更に、同
定した本ペプチドを常法に従い、化学的に合成した。係
るペプチドは、CTL細胞株Tc-HST-2を実際に活性化する
ことを初めて解明した。また、本ペプチドがHST-2以外
の胃癌細胞にも発現していることも発見した。以上の結
果より本ペプチドが、胃癌の治療、予防剤としての利用
可能が極めて高いことを明らかにした。本発明は、かか
る発見に基づき完成するに至ったものである。
【００１６】即ち、本発明は、１）ヒト胃癌細胞中に存
在する胃癌抗原蛋白質の断片であり、該断片がＨＬＡ分
子に結合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細
胞を誘導しうるペプチド、２）該ペプチドを含有するヒ
ト胃癌治療、予防剤、３）該ペプチドをコードするＤＮ
Ａ、及び４）該ＤＮＡを有する組換えウイルス又は組換
え細菌を含むヒト胃癌治療、予防用ワクチンである。
在する胃癌抗原蛋白質の断片であり、該断片がＨＬＡ分
子に結合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細
胞を誘導しうるペプチド、２）該ペプチドを含有するヒ
ト胃癌治療、予防剤、３）該ペプチドをコードするＤＮ
Ａ、及び４）該ＤＮＡを有する組換えウイルス又は組換
え細菌を含むヒト胃癌治療、予防用ワクチンである。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。
する。
【００１８】本発明に於いて用いられるヒト胃癌細胞中
に存在する胃癌抗原タンパク質の断片であり、該断片が
HLA分子に結合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞傷害
性T細胞を誘導し得るペプチド を同定するためには、
（１）in vitroで大量増殖可能なHLA型の判明したヒト
胃癌細胞株と、（２）該細胞株に対しHLA分子及びT細胞
受容体拘束性に反応し、細胞障害活性を示すin vitroで
大量増殖可能なCTL細胞株の樹立が必須である。
に存在する胃癌抗原タンパク質の断片であり、該断片が
HLA分子に結合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞傷害
性T細胞を誘導し得るペプチド を同定するためには、
（１）in vitroで大量増殖可能なHLA型の判明したヒト
胃癌細胞株と、（２）該細胞株に対しHLA分子及びT細胞
受容体拘束性に反応し、細胞障害活性を示すin vitroで
大量増殖可能なCTL細胞株の樹立が必須である。
【００１９】in vitroで大量増殖可能なHLA型の判明し
たヒト胃癌細胞株としては、例えば本発明者らにより樹
立されたHST-2細胞（J. Immunol. Meth. vol. 154, p 2
35-243 (1992) 、Jpn. J. Cancer Res. vol. 84, p 906
-913 (1993) ）を用いることができる。本細胞は胃癌患
者の癌性腹水より樹立された胃印環細胞癌株である。
たヒト胃癌細胞株としては、例えば本発明者らにより樹
立されたHST-2細胞（J. Immunol. Meth. vol. 154, p 2
35-243 (1992) 、Jpn. J. Cancer Res. vol. 84, p 906
-913 (1993) ）を用いることができる。本細胞は胃癌患
者の癌性腹水より樹立された胃印環細胞癌株である。
【００２０】また、該細胞株に対しHLA分子及びT細胞受
容体拘束性に反応し、細胞障害活性を示すin vitro で
大量増殖可能なCTL細胞株としては、同様に本発明者ら
により樹立されたTc-HST-2細胞（J. Immunol. Meth. vo
l. 154, p 235-243 (1992)、 Jpn. J. Cancer Res. vo
l. 84, p 906-913 (1993) ）を用いることができる。本
CTL細胞株がHST-2細胞と特異的に反応すること及び、本
CTL細胞株がHST-2抗原とHLA-A31抗原を同時に認識する
ことは、Cancer vol. 75, p1484-1489 (1995)に記載さ
れている。
容体拘束性に反応し、細胞障害活性を示すin vitro で
大量増殖可能なCTL細胞株としては、同様に本発明者ら
により樹立されたTc-HST-2細胞（J. Immunol. Meth. vo
l. 154, p 235-243 (1992)、 Jpn. J. Cancer Res. vo
l. 84, p 906-913 (1993) ）を用いることができる。本
CTL細胞株がHST-2細胞と特異的に反応すること及び、本
CTL細胞株がHST-2抗原とHLA-A31抗原を同時に認識する
ことは、Cancer vol. 75, p1484-1489 (1995)に記載さ
れている。
【００２１】Tc-HST-2細胞のCTL活性を誘導可能な胃癌
抗原ペプチドを含むHLA結合ペプチドを得るためにはHST
-2細胞を用いることができる。即ち、HST-2細胞を一般
的に用いられる培養条件、たとえばウシ胎仔血清を含む
RPMI1640培地にて培養した後、PBS（Phosphate-Buffer
Saline ）で洗浄後、0.1%のトリフルオロ酢酸 (TFA)溶
液で、細胞表面上に存在するHLA分子に結合しているペ
プチドを効率的に抽出する。TFAを用いたHLA結合ペプチ
ドの抽出法はScience vol.249, p 283-287 (1990)に記
載されている。
抗原ペプチドを含むHLA結合ペプチドを得るためにはHST
-2細胞を用いることができる。即ち、HST-2細胞を一般
的に用いられる培養条件、たとえばウシ胎仔血清を含む
RPMI1640培地にて培養した後、PBS（Phosphate-Buffer
Saline ）で洗浄後、0.1%のトリフルオロ酢酸 (TFA)溶
液で、細胞表面上に存在するHLA分子に結合しているペ
プチドを効率的に抽出する。TFAを用いたHLA結合ペプチ
ドの抽出法はScience vol.249, p 283-287 (1990)に記
載されている。
【００２２】Tc-HST-2細胞のCTL活性を誘導可能な胃癌
抗原ペプチドの精製は逆相クロマトグラフィーを用い、
上述のHLA結合ペプチドより精製できる。本胃癌抗原ペ
プチドの精製法に関しては後述の実施例で詳しく述べ
る。
抗原ペプチドの精製は逆相クロマトグラフィーを用い、
上述のHLA結合ペプチドより精製できる。本胃癌抗原ペ
プチドの精製法に関しては後述の実施例で詳しく述べ
る。
【００２３】逆相クロマトグラフィーにより分離したHL
A結合ペプチド画分中のTc-HST-2反応性胃癌抗原ペプチ
ドの同定法としては、Science vol.249, p 283-287 (19
90)に記載された方法と同様の方法を用い各画分中のCTL
誘導活性を測定することにより同定することができる。
即ち、HLA-A31陽性のHST-2もしくはKG-1細胞を51Crを含
むクロム酸ナトリウムで放射線標識した後、逆相クロマ
トグラフィーで分離したHLA結合ペプチドと混合し、３
時間３７度で培養した後、Tc-HST-2を加え、更に１２時
間培養し、上清中に放出される51Crの放射活性を測定す
ることによりCTL誘導活性を検出することができる。
A結合ペプチド画分中のTc-HST-2反応性胃癌抗原ペプチ
ドの同定法としては、Science vol.249, p 283-287 (19
90)に記載された方法と同様の方法を用い各画分中のCTL
誘導活性を測定することにより同定することができる。
即ち、HLA-A31陽性のHST-2もしくはKG-1細胞を51Crを含
むクロム酸ナトリウムで放射線標識した後、逆相クロマ
トグラフィーで分離したHLA結合ペプチドと混合し、３
時間３７度で培養した後、Tc-HST-2を加え、更に１２時
間培養し、上清中に放出される51Crの放射活性を測定す
ることによりCTL誘導活性を検出することができる。
【００２４】逆相クロマトグラフィーにより分離された
Tc-HST-2細胞のCTL活性を誘導可能な胃癌抗原ペプチド
は、常法に従い、固相法プロテインシークエンサーを用
いそのアミノ酸配列を決定することができる。CTL誘導
活性を示すペプチドとして同定 されたペプチドとして
は、例えば配列表の配列番号１記載のペプチドを例示す
ることができる。
Tc-HST-2細胞のCTL活性を誘導可能な胃癌抗原ペプチド
は、常法に従い、固相法プロテインシークエンサーを用
いそのアミノ酸配列を決定することができる。CTL誘導
活性を示すペプチドとして同定 されたペプチドとして
は、例えば配列表の配列番号１記載のペプチドを例示す
ることができる。
【００２５】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を
有するペプチドを本発明に於いて用いることができるの
は言うまでもない。また、ヒト胃癌細胞中に存在する胃
癌抗原タンパク質の断片であり、該断片がHLA分子に結
合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘
導可能なペプチドであれば、配列表の配列番号１記載の
アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有するペ
プチドも用いることができる。
有するペプチドを本発明に於いて用いることができるの
は言うまでもない。また、ヒト胃癌細胞中に存在する胃
癌抗原タンパク質の断片であり、該断片がHLA分子に結
合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘
導可能なペプチドであれば、配列表の配列番号１記載の
アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有するペ
プチドも用いることができる。
【００２６】さて、本発明に於ける配列表の配列番号１
記載のアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有
するペプチドとは、具体的には、（１）配列表の配列番
号１に示されるアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸を
他のアミノ酸に置換したもの、（２）配列表の配列番号
１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドのＮ又はＣ
末端から１個以上のアミノ酸を削除したもの、（３）更
には、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を全
配列中の一部に有するペプチド等である。尚、本発明に
於いて、ペプチドとはアミノ酸が数個結合したものから
タンパク質のようにアミノ酸が多数結合したものまで含
む事にする。念の為に申し述べるが、配列表の配列番号
１記載のアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を
有するペプチドでも、胃癌細胞を標的とする細胞障害性
Ｔ細胞を誘導可能なペプチドで無ければ本発明に於いて
用いることが出来ない。例えば、配列表の配列番号２記
載のアミノ配列を有するペプチドは本発明に於いて用い
ることが出来るが、配列表の配列番号３又は４記載のア
ミノ配列を有するペプチドは、CTL誘導活性が無いので
用いることが出来ない（後述の実施例参照）。
記載のアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有
するペプチドとは、具体的には、（１）配列表の配列番
号１に示されるアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸を
他のアミノ酸に置換したもの、（２）配列表の配列番号
１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドのＮ又はＣ
末端から１個以上のアミノ酸を削除したもの、（３）更
には、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を全
配列中の一部に有するペプチド等である。尚、本発明に
於いて、ペプチドとはアミノ酸が数個結合したものから
タンパク質のようにアミノ酸が多数結合したものまで含
む事にする。念の為に申し述べるが、配列表の配列番号
１記載のアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を
有するペプチドでも、胃癌細胞を標的とする細胞障害性
Ｔ細胞を誘導可能なペプチドで無ければ本発明に於いて
用いることが出来ない。例えば、配列表の配列番号２記
載のアミノ配列を有するペプチドは本発明に於いて用い
ることが出来るが、配列表の配列番号３又は４記載のア
ミノ配列を有するペプチドは、CTL誘導活性が無いので
用いることが出来ない（後述の実施例参照）。
【００２７】当該ペプチドの製造法は特に限定されるも
のではない。例えば、固相法ペプチド合成技術を用いて
合成してもよく、又組換えＤＮＡ技術を用いて製造して
も構わない。具体的には、配列表の配列番号１、２等に
示される胃癌細胞を標的とするCＴLを誘導可能なペプチ
ドを通常の固相法ペプチド合成技術を用いて合成しても
よく、又当該ペプチドを構成するアミノ酸をコードする
DNAを適当な発現ベクターに接続し、これによって形質
転換されたＢＣＧ菌やエシェリヒア属細菌等の細胞を培
養することによっても製造できる。
のではない。例えば、固相法ペプチド合成技術を用いて
合成してもよく、又組換えＤＮＡ技術を用いて製造して
も構わない。具体的には、配列表の配列番号１、２等に
示される胃癌細胞を標的とするCＴLを誘導可能なペプチ
ドを通常の固相法ペプチド合成技術を用いて合成しても
よく、又当該ペプチドを構成するアミノ酸をコードする
DNAを適当な発現ベクターに接続し、これによって形質
転換されたＢＣＧ菌やエシェリヒア属細菌等の細胞を培
養することによっても製造できる。
【００２８】尚、配列表の配列番号１又は２記載のアミ
ノ酸配列を有するペプチドをコードするDNAは、当該ア
ミノ酸配列より演繹できる。各アミノ酸配列に対応する
コドンは当業者において周知であることは言うまでもな
い。
ノ酸配列を有するペプチドをコードするDNAは、当該ア
ミノ酸配列より演繹できる。各アミノ酸配列に対応する
コドンは当業者において周知であることは言うまでもな
い。
【００２９】尚、本発明のペプチドはすべて、逆相HPLC
で精製し、逆相HPLCで単一成分であることを確認したの
ち、質量分析により確認した上でCTLアッセイに用い
た。
で精製し、逆相HPLCで単一成分であることを確認したの
ち、質量分析により確認した上でCTLアッセイに用い
た。
【００３０】本発明のペプチドは、胃癌細胞特異的CTL
株Tc-HST-2に対し、CTL活性を誘導することが出来る。C
TL誘導活性の測定法としては、前述のクロム遊離法を用
いることもできるが、Immunogenetics vol.35, p145(19
92) に記載されているTNF遊離法を用いて検定すること
もできる。即ち、TNF遊離法とはHLA-A31陽性のHST-2も
しくはKG-1細胞と、本発明のペプチドとを混合し、３７
度で３時間培養した後、Tc-HST-2を加え、更に１２時間
培養し、上清中に放出されるTNF活性を測定することに
よりCTL誘導活性を検出する方法である。
株Tc-HST-2に対し、CTL活性を誘導することが出来る。C
TL誘導活性の測定法としては、前述のクロム遊離法を用
いることもできるが、Immunogenetics vol.35, p145(19
92) に記載されているTNF遊離法を用いて検定すること
もできる。即ち、TNF遊離法とはHLA-A31陽性のHST-2も
しくはKG-1細胞と、本発明のペプチドとを混合し、３７
度で３時間培養した後、Tc-HST-2を加え、更に１２時間
培養し、上清中に放出されるTNF活性を測定することに
よりCTL誘導活性を検出する方法である。
【００３１】尚、TNF活性の測定はImmunogenetics vol.
35, p145(1992) に記載される方法で測定することがで
きる。即ち、TNF感受性のWehi164細胞と検定サンプルを
混合し、２４時間培養した後、MTT (3-(4,5-dimethylth
iazol-z-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液を
加え、更に３時間培養しミトコンドリア内で変換された
ホルマザンをacid propanolで溶解したのち、その生成
量を吸光度（OD570）で測定することによりTNF活性を検
定することができる。
35, p145(1992) に記載される方法で測定することがで
きる。即ち、TNF感受性のWehi164細胞と検定サンプルを
混合し、２４時間培養した後、MTT (3-(4,5-dimethylth
iazol-z-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液を
加え、更に３時間培養しミトコンドリア内で変換された
ホルマザンをacid propanolで溶解したのち、その生成
量を吸光度（OD570）で測定することによりTNF活性を検
定することができる。
【００３２】本願発明に係るペプチド、例えば配列表の
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｔ
細胞エピトープとして胃癌細胞特異的CTLを誘導するこ
とができるので、ヒト胃癌の治療、予防剤として非常に
期待できる。実際の使用法としては、１）本発明のペプ
チドをそのまま、又は２）医薬的に許容される担体及び
/又は希釈剤ととともに、３）更に必要ならば、下記の
ような補助剤も加えて、注射器で投与することもできる
し、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与し
てもよい。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清ア
ルブミンであり、又、希釈剤とは例えばＰＢＳ、蒸留水
等である。
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｔ
細胞エピトープとして胃癌細胞特異的CTLを誘導するこ
とができるので、ヒト胃癌の治療、予防剤として非常に
期待できる。実際の使用法としては、１）本発明のペプ
チドをそのまま、又は２）医薬的に許容される担体及び
/又は希釈剤ととともに、３）更に必要ならば、下記の
ような補助剤も加えて、注射器で投与することもできる
し、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与し
てもよい。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清ア
ルブミンであり、又、希釈剤とは例えばＰＢＳ、蒸留水
等である。
【００３３】本発明のヒト胃癌治療、予防剤中には、ヒ
ト胃癌細胞中に存在する胃癌抗原蛋白質の断片であり、
該断片がＨＬＡ分子、具体的にはＨＬＡ−Ａ３１分子に
結合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を
誘導しうるペプチドを０.０１ー１００重量％、好まし
くは０．１ー９５％含有させる。
ト胃癌細胞中に存在する胃癌抗原蛋白質の断片であり、
該断片がＨＬＡ分子、具体的にはＨＬＡ−Ａ３１分子に
結合し、かつ胃癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を
誘導しうるペプチドを０.０１ー１００重量％、好まし
くは０．１ー９５％含有させる。
【００３４】また、投与量は成人１人当たり、本発明に
係るペプチドを１回0.01mg〜100mgの範囲になるように
投与する。もちろん、上記範囲はあくまでも目安であ
り、これに限定されるものではない。製剤の形態も特に
限定されない。従って、凍結乾燥したものや、糖などの
賦形剤を加えて顆粒にしたものなどでよい。また、本製
剤は上記投与方法で問題となる重篤な急性毒性はない。
係るペプチドを１回0.01mg〜100mgの範囲になるように
投与する。もちろん、上記範囲はあくまでも目安であ
り、これに限定されるものではない。製剤の形態も特に
限定されない。従って、凍結乾燥したものや、糖などの
賦形剤を加えて顆粒にしたものなどでよい。また、本製
剤は上記投与方法で問題となる重篤な急性毒性はない。
【００３５】さて、本剤に添加してCTL誘導活性を高め
る補助剤としては、BCG菌などの菌体成分、Nature, vo
l. 344, p873 (1990)に記載されるISCOM、J.Immunol. v
ol. 148, p1438(1992)に記載されるサポニン系のQS-2
1、リポソーム、水酸化アルミニウムなどが利用でき
る。
る補助剤としては、BCG菌などの菌体成分、Nature, vo
l. 344, p873 (1990)に記載されるISCOM、J.Immunol. v
ol. 148, p1438(1992)に記載されるサポニン系のQS-2
1、リポソーム、水酸化アルミニウムなどが利用でき
る。
【００３６】また、レンチナン、シゾフィラン、ピシバ
ーニールなどの免疫賦活剤も補助剤として用いることも
できる。また、IL-2, IL-4, IL-12,IL-1, IL-6, TNFな
どのＴ細胞の増殖、分化を増強するサイトカイン等も補
助剤として用いることができる。
ーニールなどの免疫賦活剤も補助剤として用いることも
できる。また、IL-2, IL-4, IL-12,IL-1, IL-6, TNFな
どのＴ細胞の増殖、分化を増強するサイトカイン等も補
助剤として用いることができる。
【００３７】このような方法で生体内にCTLなどの免疫
応答を誘導できることは上記記載のそれぞれの文献やSc
ience, vol, 255, p333 (1992) などに記載されている
ことも付記しておく。
応答を誘導できることは上記記載のそれぞれの文献やSc
ience, vol, 255, p333 (1992) などに記載されている
ことも付記しておく。
【００３８】患者から採取した細胞または、同一のHLA
パプロタイプを持つ細胞に試験管内で当該抗原ペプチド
を加え、抗原提示させた後、患者血管内に投与し、患者
体内で効果的にCTLを誘導することもできる。また、患
者末梢血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培
養することにより試験管内でCTLを誘導した後に患者血
管内に戻すこともできる。このような細胞移入による治
療は既に癌治療法として実施されており、当業者間では
よく知られた方法である。
パプロタイプを持つ細胞に試験管内で当該抗原ペプチド
を加え、抗原提示させた後、患者血管内に投与し、患者
体内で効果的にCTLを誘導することもできる。また、患
者末梢血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培
養することにより試験管内でCTLを誘導した後に患者血
管内に戻すこともできる。このような細胞移入による治
療は既に癌治療法として実施されており、当業者間では
よく知られた方法である。
【００３９】また、本発明で明らかにされた胃癌抗原ペ
プチドをコードするDNAを適当なベクターに組み込み、
この組換えＤＮＡを有するワクシニアウイルス等のウイ
ルス又はBCG菌等の細菌はヒト胃癌治療、予防用生ワク
チンとして有効に利用できる。すなわち、これらの組換
えウイルス又は組換え細菌において発現させる抗原タン
パク遺伝子中に（１）配列表の配列番号１記載のアミノ
酸配列を有するペプチドをコードするDNA又は（２）配
列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の一部を改変した
アミノ酸配列を有するペプチド（例えば、配列表の配列
番号２記載のアミノ酸配列を有するペプチド）をコード
するDNAを組み込んでおけば、該ペプチド配列が抗原タ
ンパク質の一部として発現された後、細胞内でプロセス
されてHLA抗原に提示され、これを認識するCTLを誘導す
ることができる。尚、投与量、投与法は通常の種痘やBC
Gワクチンと変るところはない。
プチドをコードするDNAを適当なベクターに組み込み、
この組換えＤＮＡを有するワクシニアウイルス等のウイ
ルス又はBCG菌等の細菌はヒト胃癌治療、予防用生ワク
チンとして有効に利用できる。すなわち、これらの組換
えウイルス又は組換え細菌において発現させる抗原タン
パク遺伝子中に（１）配列表の配列番号１記載のアミノ
酸配列を有するペプチドをコードするDNA又は（２）配
列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の一部を改変した
アミノ酸配列を有するペプチド（例えば、配列表の配列
番号２記載のアミノ酸配列を有するペプチド）をコード
するDNAを組み込んでおけば、該ペプチド配列が抗原タ
ンパク質の一部として発現された後、細胞内でプロセス
されてHLA抗原に提示され、これを認識するCTLを誘導す
ることができる。尚、投与量、投与法は通常の種痘やBC
Gワクチンと変るところはない。
【００４０】
【実施例】実施例により本発明を更に詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるもの
でない。
が、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるもの
でない。
【００４１】実施例１ HST-2からのTc-HST-2応答ペプ
チドの精製及び同定 175cm2プラスチック培養器（Falcon社cat.No.3028）中
の50mlの10％FCS含有RPMI1640培地（2mMグルタミン、5X
10-5M 2ME、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプ
トマイシン、16mMNaHCO3含有）に2X105/ml細胞数にHST-
2を接種し、5%CO2ガス下、37℃で4日間培養した。培養
後、培養上清を除き、PBS(-)で洗浄後、２０ml の0.1%T
FA 溶液を加え、４℃で３０分間インキュベーション
し、HLA結合ペプチドをHLA分子より遊離させた。 この
遊離させたHLA結合ペプチドは、10,000gで１５分遠心分
離し、細胞残さと分離した。
チドの精製及び同定 175cm2プラスチック培養器（Falcon社cat.No.3028）中
の50mlの10％FCS含有RPMI1640培地（2mMグルタミン、5X
10-5M 2ME、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプ
トマイシン、16mMNaHCO3含有）に2X105/ml細胞数にHST-
2を接種し、5%CO2ガス下、37℃で4日間培養した。培養
後、培養上清を除き、PBS(-)で洗浄後、２０ml の0.1%T
FA 溶液を加え、４℃で３０分間インキュベーション
し、HLA結合ペプチドをHLA分子より遊離させた。 この
遊離させたHLA結合ペプチドは、10,000gで１５分遠心分
離し、細胞残さと分離した。
【００４２】上述のごとくHST-2を培養して得たHLA結合
ペプチド溶液２０mlを、凍結乾燥し、５mlの0.1%TFA溶
液で溶解した。このHLA結合ペプチド溶液１mlを逆相HPL
Cカラム（μ BONDSHERE, 5μ C18-300A, 19X150mm）で
処理した。なお、逆相HPLCカラムはあらかじめ、0.1%TF
Aを含む蒸留水で平衡化し、溶出液である0.1%TFA中のア
セトニトリル濃度を0から80%までに直線的に増加させる
ことにより溶出した。尚、流速は毎分１mlで行った。ま
た、溶出液を1mlずつ分取した。上記の操作を１０回繰
返し、同一の保持時間を示す画分を集め、凍結乾燥し
た。なお、各回のHPLCの溶出パターンには有意な差異は
認められなかった。HPLCの溶出パターンを図１に示す。
ペプチド溶液２０mlを、凍結乾燥し、５mlの0.1%TFA溶
液で溶解した。このHLA結合ペプチド溶液１mlを逆相HPL
Cカラム（μ BONDSHERE, 5μ C18-300A, 19X150mm）で
処理した。なお、逆相HPLCカラムはあらかじめ、0.1%TF
Aを含む蒸留水で平衡化し、溶出液である0.1%TFA中のア
セトニトリル濃度を0から80%までに直線的に増加させる
ことにより溶出した。尚、流速は毎分１mlで行った。ま
た、溶出液を1mlずつ分取した。上記の操作を１０回繰
返し、同一の保持時間を示す画分を集め、凍結乾燥し
た。なお、各回のHPLCの溶出パターンには有意な差異は
認められなかった。HPLCの溶出パターンを図１に示す。
【００４３】HPLC溶出画分中のTc-HST-2細胞に対するCT
L誘導活性は以下のごとく測定した。即ち、標的細胞と
して、HLA-A31抗原を発現するHST-2もしくはKG-1細胞1X
106個 を10%FCSを含むRPIM培地に細胞数1X107個/mlとな
るように懸濁し、そこに100μlの51Cr-クロム酸ナトリ
ウム／PBSを加え、5%CO2存在下、37℃で３時間培養する
ことにより51Crを標識した。51Crで標識された細胞1X10
4個を100μlに懸濁し、これにHPLC で分離したHLA結合
ペプチドを含む溶液３μlを加え、更に３時間同様の条
件で培養した。これにより、HLA結合ペプチドをHLA分子
に結合させた。その後、2.5X105個/mlのTc-HST-2を100
μl加え、更に12時間同様の条件で培養した。12時間培
養の後、100μlの培養上清を採取しこの上清中に放出さ
れた51Crの放射活性をγカウンターで測定することによ
り、CTL活性を測定した。特異的細胞障害活性は以下の
数式１に基づき計算した。
L誘導活性は以下のごとく測定した。即ち、標的細胞と
して、HLA-A31抗原を発現するHST-2もしくはKG-1細胞1X
106個 を10%FCSを含むRPIM培地に細胞数1X107個/mlとな
るように懸濁し、そこに100μlの51Cr-クロム酸ナトリ
ウム／PBSを加え、5%CO2存在下、37℃で３時間培養する
ことにより51Crを標識した。51Crで標識された細胞1X10
4個を100μlに懸濁し、これにHPLC で分離したHLA結合
ペプチドを含む溶液３μlを加え、更に３時間同様の条
件で培養した。これにより、HLA結合ペプチドをHLA分子
に結合させた。その後、2.5X105個/mlのTc-HST-2を100
μl加え、更に12時間同様の条件で培養した。12時間培
養の後、100μlの培養上清を採取しこの上清中に放出さ
れた51Crの放射活性をγカウンターで測定することによ
り、CTL活性を測定した。特異的細胞障害活性は以下の
数式１に基づき計算した。
【００４４】
【数１】特異的細胞障害活性＝（各穴の測定値−最小放
出値）/（最大放出値−最小放出値）×100
出値）/（最大放出値−最小放出値）×100
【００４５】ただし、最小放出値は標的細胞のみのはい
っている穴の測定値で、標的細胞からの51Crの自然遊離
値を、そして最大放出値は標的細胞に界面活性剤トリト
ン×−１００を加えて細胞を破壊した際の遊離値を示し
ている。結果を図２に示す。この図から分かるようにHP
LCでの溶出分画の第１２画分にCTL誘導活性が確認され
た。
っている穴の測定値で、標的細胞からの51Crの自然遊離
値を、そして最大放出値は標的細胞に界面活性剤トリト
ン×−１００を加えて細胞を破壊した際の遊離値を示し
ている。結果を図２に示す。この図から分かるようにHP
LCでの溶出分画の第１２画分にCTL誘導活性が確認され
た。
【００４６】Tc-HST-2に対するCTL誘導活性の確認され
た、第１２画分を更に逆相HPLCカラム （μBONDSHERE,
5μ C18-300A, 19X150mm）で処理した。なお、逆相HPL
Cカラムはあらかじめ、0.1%TFAを含む蒸留水で平衡化
し、溶出液である0.1%TFA中のアセトニトリル濃度を０
から４０％までに直線的に増加させて溶出させた。尚、
流速は毎分１mlで行った。また、溶出液を1mlずつ分取
した。上記の操作を10回繰返し、同一の保持時間を示す
画分を集め、凍結乾燥した。尚、各回のHPLCの溶出パタ
ーンには有意な差異は認められなかった。HPLCの溶出パ
ターンを図３に示す。
た、第１２画分を更に逆相HPLCカラム （μBONDSHERE,
5μ C18-300A, 19X150mm）で処理した。なお、逆相HPL
Cカラムはあらかじめ、0.1%TFAを含む蒸留水で平衡化
し、溶出液である0.1%TFA中のアセトニトリル濃度を０
から４０％までに直線的に増加させて溶出させた。尚、
流速は毎分１mlで行った。また、溶出液を1mlずつ分取
した。上記の操作を10回繰返し、同一の保持時間を示す
画分を集め、凍結乾燥した。尚、各回のHPLCの溶出パタ
ーンには有意な差異は認められなかった。HPLCの溶出パ
ターンを図３に示す。
【００４７】HPLC溶出画分中のTc-HST-2細胞に対するCT
L誘導活性は前述と同様の方法を用い測定した。結果を
図４に示す。この図から分かるように、HPLCでの溶出分
画の第１７画分にCTL誘導活性が確認された。
L誘導活性は前述と同様の方法を用い測定した。結果を
図４に示す。この図から分かるように、HPLCでの溶出分
画の第１７画分にCTL誘導活性が確認された。
【００４８】CTL誘導活性が確認された第１７画分を分
析用の逆相HPLCカラムで分離した（ZORBAX, ODS colum,
4 mm x 250 mm）。尚、逆相HPLCカラムはあらかじめ、
0.1%TFAを含む蒸留水で平衡化し、溶出液である0.1%TFA
中のアセトニトリル濃度を0から60%までに直線的に増加
させて溶出させた。尚、流速は毎分１mlで行い、主要な
ピークを得た。このピークを分取し、プロテインシーク
エンサー（ABI社製477A）に導入した。アミノ酸配列の
決定方法はエドマン分解法に基づき行った。N末からの
アミノ酸配列は配列表の配列番号１記載の通りであっ
た。
析用の逆相HPLCカラムで分離した（ZORBAX, ODS colum,
4 mm x 250 mm）。尚、逆相HPLCカラムはあらかじめ、
0.1%TFAを含む蒸留水で平衡化し、溶出液である0.1%TFA
中のアセトニトリル濃度を0から60%までに直線的に増加
させて溶出させた。尚、流速は毎分１mlで行い、主要な
ピークを得た。このピークを分取し、プロテインシーク
エンサー（ABI社製477A）に導入した。アミノ酸配列の
決定方法はエドマン分解法に基づき行った。N末からの
アミノ酸配列は配列表の配列番号１記載の通りであっ
た。
【００４９】実施例２ 胃癌抗原ペプチドの合成及びCT
L誘導活性の測定 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と同一のアミノ
酸配列を有する合成ペプチド１及び本ペプチドのＮ末端
より９乃至７番目までのアミノ酸を含む３種のペプチ
ド、即ちペプチド１ー９（配列表の配列番号２記載のア
ミノ酸配列を有するペプチド）、ペプチド１ー８（配列
表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するペプチド）
及びペプチド１ー７（配列表の配列番号４記載のアミノ
酸配列を有するペプチド）をペプチド自動合成機（ABI
社製477A）を用いて合成した。尚、合成は同機の取扱説
明書のプロトコールに従った。本合成ペプチドは、レジ
ンから切断した後に、TFA/ドライエーテルによって再沈
澱させ、逆相HPLCで単一成分であることを確認すると共
に質量分析計で確認した。その後、TNF放出法によるCTL
アッセイに供した。即ち、標的細胞として、HLA-A31抗
原を発現するHST-2細胞1X104個を100μl中に懸濁し、次
に終濃度が10μM、1μ又は0.1μMとなるように上記４種
類の合成ペプチドを5μl加えた。更に３時間同様の条件
で培養することにより、HLA結合ペプチドをHLA分子に結
合させた。その後、1X106個/mlのTc-HST-2を100μl加
え、更に12時間同様の条件で培養した。12時間培養後、
30μlの培養上清を採取し、この上清中に放出されたTNF
活性を測定することによりCTL誘導活性を求めた。尚、T
NF活性は以下の方法に基づき測定した。
L誘導活性の測定 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と同一のアミノ
酸配列を有する合成ペプチド１及び本ペプチドのＮ末端
より９乃至７番目までのアミノ酸を含む３種のペプチ
ド、即ちペプチド１ー９（配列表の配列番号２記載のア
ミノ酸配列を有するペプチド）、ペプチド１ー８（配列
表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するペプチド）
及びペプチド１ー７（配列表の配列番号４記載のアミノ
酸配列を有するペプチド）をペプチド自動合成機（ABI
社製477A）を用いて合成した。尚、合成は同機の取扱説
明書のプロトコールに従った。本合成ペプチドは、レジ
ンから切断した後に、TFA/ドライエーテルによって再沈
澱させ、逆相HPLCで単一成分であることを確認すると共
に質量分析計で確認した。その後、TNF放出法によるCTL
アッセイに供した。即ち、標的細胞として、HLA-A31抗
原を発現するHST-2細胞1X104個を100μl中に懸濁し、次
に終濃度が10μM、1μ又は0.1μMとなるように上記４種
類の合成ペプチドを5μl加えた。更に３時間同様の条件
で培養することにより、HLA結合ペプチドをHLA分子に結
合させた。その後、1X106個/mlのTc-HST-2を100μl加
え、更に12時間同様の条件で培養した。12時間培養後、
30μlの培養上清を採取し、この上清中に放出されたTNF
活性を測定することによりCTL誘導活性を求めた。尚、T
NF活性は以下の方法に基づき測定した。
【００５０】すなわち、TNF感受性細胞であるWehi164細
胞7X104個を120μlに懸濁し、そこに30μlの上記培養上
清を加え、24時間培養した。培養後、各穴に5mg/mlのMT
Tを10μl加え、更に３時間培養した。次に、150μlの0.
01%塩酸を含むプロパノールを加え、培養中に生成され
たホルマゾンを可溶化後、570nmの波長での吸光度を測
定することにより、TNF活性を測定した。結果を図５に
示す。図５から分かるように、合成ペプチド１及びペプ
チド１ー９にTC-HSTー2に対するCTL誘導活性が確認され
た（図５）。
胞7X104個を120μlに懸濁し、そこに30μlの上記培養上
清を加え、24時間培養した。培養後、各穴に5mg/mlのMT
Tを10μl加え、更に３時間培養した。次に、150μlの0.
01%塩酸を含むプロパノールを加え、培養中に生成され
たホルマゾンを可溶化後、570nmの波長での吸光度を測
定することにより、TNF活性を測定した。結果を図５に
示す。図５から分かるように、合成ペプチド１及びペプ
チド１ー９にTC-HSTー2に対するCTL誘導活性が確認され
た（図５）。
【００５１】実施例３ ヒトMKN28胃癌細胞株における
該胃癌抗原ペプチドの発現 HST-2以外の胃癌細胞株にもTC-HST-2の認識する胃癌抗
原ペプチドが発現しているか否か確認するため、HLAーA3
1陰性のヒト胃癌細胞株であるMKN28に対するTC-HSTー2に
よる細胞障害活性を51Cr放出法で検定した。51Cr放出法
によるCTL活性の検定は実施例１と同様の方法を用い
た。結果を図６に示す。HLA-A31を発現していないMKN28
細胞に対しTC-HST-2は細胞障害活性を示さなかった。一
方、MKN28にHLA-A31遺伝子を含むプラスミドpBJ-A31を
エレクトロポレーション法によりトランスフェクトし、
HLA-A31を発現するようになったMKN28のサブラインであ
るMKN28 A31(+)cl-2及びMKN28 A31(+)cl-5に対してはTC
-HST-2は有意な細胞障害活性を示した（図６）。以上の
結果よりTC-HST-2の認識する該胃癌抗原ペプチドがMKN2
8にも発現している事及び該ペプチドがHLA-A31分子に結
合しTC-HSTー2に認識されることが確認された。
該胃癌抗原ペプチドの発現 HST-2以外の胃癌細胞株にもTC-HST-2の認識する胃癌抗
原ペプチドが発現しているか否か確認するため、HLAーA3
1陰性のヒト胃癌細胞株であるMKN28に対するTC-HSTー2に
よる細胞障害活性を51Cr放出法で検定した。51Cr放出法
によるCTL活性の検定は実施例１と同様の方法を用い
た。結果を図６に示す。HLA-A31を発現していないMKN28
細胞に対しTC-HST-2は細胞障害活性を示さなかった。一
方、MKN28にHLA-A31遺伝子を含むプラスミドpBJ-A31を
エレクトロポレーション法によりトランスフェクトし、
HLA-A31を発現するようになったMKN28のサブラインであ
るMKN28 A31(+)cl-2及びMKN28 A31(+)cl-5に対してはTC
-HST-2は有意な細胞障害活性を示した（図６）。以上の
結果よりTC-HST-2の認識する該胃癌抗原ペプチドがMKN2
8にも発現している事及び該ペプチドがHLA-A31分子に結
合しTC-HSTー2に認識されることが確認された。
【００５２】
【発明の効果】本発明に係るペプチドは、ヒト胃癌細胞
に対するCTLをin vivo又はin vitroにおいて誘導可能で
あり、当該ペプチドをそのまま又は当該ペプチドを含有
する製剤はヒト胃癌の予防、治療剤として大いに期待で
きる。又、ヒト胃癌細胞に対するCTLをin vivo又はin v
itroにおいて誘導可能なペプチドをコードするＤＮＡを
組換えＤＮＡの形でウイルス又は細菌に含ませ得たもの
はヒト胃癌治療、予防用ワクチンとして充分薬効が期待
される。
に対するCTLをin vivo又はin vitroにおいて誘導可能で
あり、当該ペプチドをそのまま又は当該ペプチドを含有
する製剤はヒト胃癌の予防、治療剤として大いに期待で
きる。又、ヒト胃癌細胞に対するCTLをin vivo又はin v
itroにおいて誘導可能なペプチドをコードするＤＮＡを
組換えＤＮＡの形でウイルス又は細菌に含ませ得たもの
はヒト胃癌治療、予防用ワクチンとして充分薬効が期待
される。
【００５３】
配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト
【図１】 HST-2胃癌細胞からのHLA結合ペプチドの逆相
HPLCカラムでの溶出パターンを示す。図中、直線はアセ
トニトリル濃度を示し、曲線は各濃度でのOD210での吸
光度を示す。
HPLCカラムでの溶出パターンを示す。図中、直線はアセ
トニトリル濃度を示し、曲線は各濃度でのOD210での吸
光度を示す。
【図２】 HST-2由来HLA結合ペプチドを用いた時のTc-H
ST-2の特異的細胞障害活性を示す。○は標的細胞にHST-
2を用いた場合の特異的細胞障害活性を、そして◆は標
的細胞にHLA-A31陽性のKG-1細胞を用いた場合の細胞障
害活性を示す。全ての実験CTL対標的細胞の比を１００
対１で行った結果を示した。
ST-2の特異的細胞障害活性を示す。○は標的細胞にHST-
2を用いた場合の特異的細胞障害活性を、そして◆は標
的細胞にHLA-A31陽性のKG-1細胞を用いた場合の細胞障
害活性を示す。全ての実験CTL対標的細胞の比を１００
対１で行った結果を示した。
【図３】 図２でCTL誘導活性を示した第１２画分の逆
相HPLCカラムでの溶出パターンを示す。図中、直線はア
セトニトリル濃度を示し、曲線は各濃度でのOD210での
吸光度を示す。
相HPLCカラムでの溶出パターンを示す。図中、直線はア
セトニトリル濃度を示し、曲線は各濃度でのOD210での
吸光度を示す。
【図４】 HST-2由来HLA結合ペプチドを用いた時のTc-H
ST-2の特異的細胞障害活性を示す。□は標的細胞にHST-
2を用いた場合の特異的細胞障害活性を、そして ◆は標
的細胞にHLA-A31陽性のCCRF-CEM細胞を用いた場合の細
胞障害活性を示す。全ての実験CTL対標的細胞の比を１
００対１で行った結果を示した。
ST-2の特異的細胞障害活性を示す。□は標的細胞にHST-
2を用いた場合の特異的細胞障害活性を、そして ◆は標
的細胞にHLA-A31陽性のCCRF-CEM細胞を用いた場合の細
胞障害活性を示す。全ての実験CTL対標的細胞の比を１
００対１で行った結果を示した。
【図５】 ペプチド１（配列表の配列番号１記載のペプ
チド）、ペプチド１ー９（配列表の配列番号２記載のペ
プチド）、ペプチド１ー８（配列表の配列番号３記載の
ペプチド）、及びペプチド１ー７（配列表の配列番号４
記載のペプチド）を用いたときのTNF放出法によるTc-HS
T-2のCTL誘導活性を示す。TNFの放出によりTNF感受性の
Wehi細胞が障害され、残存生細胞によるMTTの取り込み
が低下する。ペプチド濃度は10mM、1mM、0.1mMである。
全ての実験は標的細胞としてHST-2を用い、CTL対標的細
胞の比を１００対１で行った結果を示した。■は、ペプ
チド１を添加した場合の活性を、□はペプチド１ー９添
加した場合の、そして△はペプチド１ー８を添加した場
合の、○はペプチド１ー７を添加した場合の、そして破
線はペプチドを添加しなかった場合の細胞障害活性を示
す。
チド）、ペプチド１ー９（配列表の配列番号２記載のペ
プチド）、ペプチド１ー８（配列表の配列番号３記載の
ペプチド）、及びペプチド１ー７（配列表の配列番号４
記載のペプチド）を用いたときのTNF放出法によるTc-HS
T-2のCTL誘導活性を示す。TNFの放出によりTNF感受性の
Wehi細胞が障害され、残存生細胞によるMTTの取り込み
が低下する。ペプチド濃度は10mM、1mM、0.1mMである。
全ての実験は標的細胞としてHST-2を用い、CTL対標的細
胞の比を１００対１で行った結果を示した。■は、ペプ
チド１を添加した場合の活性を、□はペプチド１ー９添
加した場合の、そして△はペプチド１ー８を添加した場
合の、○はペプチド１ー７を添加した場合の、そして破
線はペプチドを添加しなかった場合の細胞障害活性を示
す。
【図６】 胃癌細胞株MKN28及びHLA-A31を人工的に発現
させたサブラインであるMKN28 A31(+)cl-2、 MKN28 A31
(+)cl-5細胞を用いたときのTC-HST-2による細胞障害活
性を示す。全ての実験はCTL対標的細胞の比を１００対
１で行った結果を示す。
させたサブラインであるMKN28 A31(+)cl-2、 MKN28 A31
(+)cl-5細胞を用いたときのTC-HST-2による細胞障害活
性を示す。全ての実験はCTL対標的細胞の比を１００対
１で行った結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＤ Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ 39/00 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 1/21 48/00 7/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＣＪ 7/00 ＡＥＤ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 佐原 弘益 北海道利尻郡利尻富士町鴛泊字栄町156番 ３号 (72)発明者 八十島 孝博 北海道瀬棚郡今金町字今金45番４号 (72)発明者 和田 好正 北海道札幌市中央区南十二条西二十一丁目 １番５号505 (72)発明者 鈴木 学 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 羽室 淳爾 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内
Claims (11)
- 【請求項１】 ヒト胃癌細胞中に存在する胃癌抗原蛋白
質の断片であり、該断片がＨＬＡ分子に結合し、かつ胃
癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘導しうるペプ
チド。 - 【請求項２】 ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ３１である請求
項１記載のペプチド。 - 【請求項３】 該ペプチドが配列表の配列番号１記載の
アミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド。 - 【請求項４】 該ペプチドが胃癌細胞を標的とする細胞
障害性Ｔ細胞をより効率的に誘導可能にする為に、配列
表の配列番号１記載のアミノ酸配列の一部を改変したア
ミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド。 - 【請求項５】 該ペプチドが配列表の配列番号２記載の
アミノ酸配列を有する請求項４記載のペプチド。 - 【請求項６】 ヒト胃癌細胞中に存在する胃癌抗原蛋白
質の断片であり、該断片がＨＬＡ分子に結合し、かつ胃
癌細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘導しうるペプ
チドを含有するヒト胃癌治療、予防剤。 - 【請求項７】 ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ３１である請求
項６記載のヒト胃癌治療、予防剤。 - 【請求項８】 該ペプチドが配列表の配列番号１又は２
記載のアミノ酸配列を有する請求項６記載のヒト胃癌治
療、予防剤。 - 【請求項９】 請求項１又は４記載のペプチドをコード
するＤＮＡ。 - 【請求項１０】 請求項３又は５記載のペプチドをコー
ドするＤＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項９又は１０記載のＤＮＡを有す
る組換えウイルス又は組換え細菌を含むヒト胃癌治療、
予防用ワクチン。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8217140A JPH09151200A (ja) | 1995-09-29 | 1996-08-19 | ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤 |
| KR1019960042331A KR100378901B1 (ko) | 1995-09-29 | 1996-09-25 | 사람위암에대한면역반응을유도할수있는펩타이드및이러한펩타이드를함유하는사람위암의예방또는치료용제제 |
| CN96121195A CN1158856A (zh) | 1995-09-29 | 1996-09-27 | 能够针对人胃癌诱导免疫应答的肽和含该肽的预防或治疗人胃癌的药剂 |
| US08/723,116 US5837248A (en) | 1995-09-29 | 1996-09-30 | Peptide capable of inducing immune response to human gastric cancer and agent for preventing or treating human gastric cancer, containing the peptide |
| EP96307163A EP0770624B1 (en) | 1995-09-29 | 1996-09-30 | Peptide capable of inducing immune response to human gastric cancer and agent containing it for preventing or treating human gastric cancer |
| DE69627780T DE69627780T2 (de) | 1995-09-29 | 1996-09-30 | Peptid das eine Immunantwort gegen menschlichen Magenkrebs induziert und Arzneimittel die es enthält zur Vorbeugung oder Behandlung von Magenkrebs |
| US09/103,808 US6368852B1 (en) | 1995-09-29 | 1998-06-24 | Peptide capable of inducing immune response to human gastric cancer and agent for preventing or treating human gastric cancer, containing the peptide |
| US10/038,899 US20030186406A1 (en) | 1995-09-29 | 2002-01-08 | Peptide capable of inducing immune response to human gastric cancer and agent for preventing or treating human gastric cancer, containing the peptide |
| US11/050,679 US20050208064A1 (en) | 1995-09-29 | 2005-02-07 | Peptide capable of inducing immune response to human gastric cancer and agent for preventing or treating human gastric cancer, containing the peptide |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-253491 | 1995-09-29 | ||
| JP25349195 | 1995-09-29 | ||
| JP8217140A JPH09151200A (ja) | 1995-09-29 | 1996-08-19 | ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09151200A true JPH09151200A (ja) | 1997-06-10 |
Family
ID=26521838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8217140A Pending JPH09151200A (ja) | 1995-09-29 | 1996-08-19 | ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5837248A (ja) |
| EP (1) | EP0770624B1 (ja) |
| JP (1) | JPH09151200A (ja) |
| KR (1) | KR100378901B1 (ja) |
| CN (1) | CN1158856A (ja) |
| DE (1) | DE69627780T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999067288A1 (fr) * | 1998-06-25 | 1999-12-29 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Peptides d'antigenes tumoraux provenant de la cyclophiline b |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09151200A (ja) * | 1995-09-29 | 1997-06-10 | Ajinomoto Co Inc | ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤 |
| US6977074B2 (en) | 1997-07-10 | 2005-12-20 | Mannkind Corporation | Method of inducing a CTL response |
| JP2000023673A (ja) | 1998-07-13 | 2000-01-25 | Ajinomoto Co Inc | ヒト胃癌抗原遺伝子および胃癌抗原蛋白質 |
| ES2212638T3 (es) * | 1998-09-25 | 2004-07-16 | Lindhofer, Horst, Dr. | Utilizacion de celulas tumorales en tiempo escalonado en combinacion con anticuerpos intactos para la inmunizacion. |
| EP1124961B9 (en) | 1998-10-23 | 2010-07-21 | Kirin-Amgen Inc. | Thrombopoietic compounds |
| IL159853A0 (en) * | 2001-07-17 | 2004-06-20 | Teva Pharma | Dosage forms for immediate gastric release of a calcium transport stimulator coupled with delayed gastric release of a bis-phosphonate |
| US20030206916A1 (en) * | 2002-05-03 | 2003-11-06 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Immunogenic peptides |
| US20050026871A1 (en) * | 2002-07-17 | 2005-02-03 | Moshe Flashner-Barak | Method of increasing bioavailability of alendronate or other bis-phosphonate by predose administration of vitamin D derivative |
| CA2572765C (en) | 2004-07-08 | 2013-05-21 | Amgen Inc. | Compound having improved bioefficiency when administered in a multidose regimen |
| EA011879B1 (ru) | 2004-09-24 | 2009-06-30 | Эмджин Инк. | МОЛЕКУЛЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ Fc ФРАГМЕНТОМ |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| JO3324B1 (ar) | 2006-04-21 | 2019-03-13 | Amgen Inc | مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية |
| CN104914242B (zh) * | 2014-09-29 | 2017-08-11 | 深圳华大基因科技服务有限公司 | 用于癌症诊断和治疗的方法和组合物 |
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|---|---|---|---|---|
| DE2860875D1 (en) * | 1977-09-28 | 1981-10-15 | Nat Res Dev | Immunological preparations incorporating mhc antigens and their production |
| DE3377363D1 (en) * | 1982-03-31 | 1988-08-18 | Ajinomoto Kk | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| US5468481A (en) * | 1988-06-23 | 1995-11-21 | Amergen, Inc. | MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| JP3255699B2 (ja) * | 1992-04-23 | 2002-02-12 | 味の素株式会社 | ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子 |
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| JPH09151200A (ja) * | 1995-09-29 | 1997-06-10 | Ajinomoto Co Inc | ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤 |
| JP2000023673A (ja) * | 1998-07-13 | 2000-01-25 | Ajinomoto Co Inc | ヒト胃癌抗原遺伝子および胃癌抗原蛋白質 |
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- 2002-01-08 US US10/038,899 patent/US20030186406A1/en not_active Abandoned
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- 2005-02-07 US US11/050,679 patent/US20050208064A1/en not_active Abandoned
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