CN1318447C - 得自亲环蛋白b的肿瘤抗原肽 - Google Patents
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Abstract
得自亲环蛋白B的肿瘤抗原肽或其具有相同功能特性的衍生物；含有作为活性成分的这些肿瘤抗原肽、其衍生物、亲环蛋白或其肽片段、或编码所述亲环蛋白或其肽片段的基因的用于肿瘤的药物、预防剂或诊断剂；上述物质在体外治疗肿瘤中的应用；以及抗上述肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及得自亲环蛋白和相关物质的新的肿瘤抗原肽。更具体地说，本发明涉及得自亲环蛋白B及其具有相同功能性质的衍生物的肿瘤抗原肽，以及进一步涉及体内或体外利用这类肿瘤抗原肽、其衍生物、亲环蛋白B多肽、或它们的基因治疗、预防或诊断肿瘤。
技术背景
已知免疫系统尤其是T细胞在体内肿瘤排斥中起着重要作用。实际上在人肿瘤病灶中已经观察到对肿瘤细胞具有细胞毒性效应的淋巴细胞的浸润(Arch.Surg.，126：200，1990)，而且已经比较容易地从黑素瘤分离到识别自身肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(例如，Immunol.Today，8：385，1987；J.Immunol.，138：989，1987；和Int.J.Cancer，52：52，1992)。此外，通过引入识别自身肿瘤细胞的CTL对黑素瘤的临床治疗结果也表明T细胞在肿瘤排斥中的重要性(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。
虽然长期以来人们不了解攻击自身肿瘤细胞的CTL的靶分子，但是免疫学和分子生物学的最新进展已经逐渐揭示了这类靶分子。准确地说，已经发现CTL利用T细胞受体(TCR)识别称为肿瘤抗原肽的肽和主要组织相容性复合体I类抗原(MHC I类抗原，在人类称为HLA抗原)之间的复合物，由此攻击自身肿瘤细胞。
肿瘤抗原肽产生自肿瘤特异性蛋白即肿瘤抗原蛋白在具有蛋白酶体的细胞中的降解，该肿瘤抗原蛋白在细胞内合成。由此产生的肿瘤抗原肽结合至在内质网中的MHC I类抗原(HLA抗原)上，形成复合物，而且该复合物被转运到细胞表面作为抗原提呈。肿瘤特异性CTL识别作为抗原提呈的该复合物，并通过其细胞毒性作用或产生淋巴因子呈现其抗肿瘤效应。因为这一系列作用的阐明，通过使用肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽作为所谓的癌症疫苗增强肿瘤患者体内的肿瘤特异性CTL来治疗肿瘤已成为可能。
作为肿瘤抗原蛋白，T.Boon等于1991年首次由人黑素瘤细胞鉴定了命名为MAGE的蛋白(Science，254：1643，1991)。此后主要从黑素瘤细胞鉴定了数种其它肿瘤抗原蛋白。已鉴定的黑素瘤抗原的实例是黑色素体蛋白，例如黑素细胞组织特异性蛋白、gp 100(J.Exp.Med.，179：1005，1994)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：3515，1994)和酪氨酸酶(J.Exp.Med.，178：489，1993)、不仅在黑素瘤细胞而且在各种癌症细胞和正常睾丸细胞上表达的MEGE-相关蛋白(J. Exp.Med.，179：921，1994)、具有肿瘤特异性氨基酸突变的β-连环蛋白(J.Exp.Med.，183：1185，1996)和CDK4(Scence，269：1281，1995)。还鉴定了不是得自黑素瘤的肿瘤抗原蛋白，包括癌基因产物，例如HER2-neu(J. Exp.Med.，181：2109，1995)和p53(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：14704，1996)、肿瘤标记物例如CEA(J.Natl.Cancer Inst.，87：982，1995)和PSA(J.Natl.Cancer Inst.，89：293，1997)，以及病毒蛋白例如HPV(J.Immunol.，154：5934，1995)和EBV(Int.Immunol.，7：653，1995)。关于这些主题的详细描述可见公开出版的综述(例如Immunol.Today，18：267，1997；J.Exp.Med.，183：725，1996；和Curr.Opin.Immunol.，8：628，1996)。
应用肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽治疗或诊断肿瘤时，重要的是鉴定可广泛用于比黑素瘤发病率高得多的上皮肿瘤例如胃癌和肺癌的肿瘤抗原。与此相关的是，本发明人对编码得自食管癌鳞状癌细胞的新肿瘤抗原蛋白基因进行了克隆，以及首次从非黑素瘤肿瘤细胞鉴定了几种结合并提呈在HLA型为HLA-A24或HLA-A26的HLA抗原上的肿瘤抗原肽(J.Exp.Med.，187：277，1998；国际专利公开WO97/46676)。
当将这些肿瘤抗原肽在临床实际应用时，最好使用两种或多种不同肿瘤抗原肽而不是仅使用单一肽。也就是说，鉴于这样的事实：所有癌症细胞并不是表达共有的相同肿瘤抗原以及在单一癌症细胞上存在两种或多种不同肿瘤抗原肽，所以认为采用两种或多种不同肿瘤抗原肽治疗更有效。实际上，对于黑素瘤已经尝试研制包含两种或多种肽的混合制剂，因为衍生自肿瘤抗原的单一肽不能产生足够的作用(Int.J.Cancer，66：162，1996；和Int.J.Cancer，67：54，1996)。在这样的情况下，需要鉴定能够广泛用于发病率高的上皮肿瘤如胃癌和肺癌的新的肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽。
发明公开
本发明的目的是提供得自亲环蛋白和相关物质的新肿瘤抗原肽。更具体地说，其目的是提供得自亲环蛋白B的肿瘤抗原肽和其具有相同功能性质的衍生物以及在体内或体外利用所述肿瘤抗原肽、其衍生物、亲环蛋白B多肽、或它们的基因来治疗、预防和诊断肿瘤。
衍生自亲环蛋白B的本发明肿瘤抗原肽包括结合并提呈在日本人和白种人携带率高的HLA抗原HLA-A24和HLA-A2上的肿瘤抗原肽，而且它也是能够用于治疗或预防包括上皮肿瘤的多种肿瘤(例如肺癌、膀胱癌、骨肉瘤和白血病)的肿瘤抗原肽。因此，预测亲环蛋白B、本发明的肿瘤抗原蛋白和它们的基因、或衍生自亲环蛋白B的肿瘤抗原肽可用作新的抗肿瘤药物。
为了获得新肿瘤抗原肽和产生所述肽的肿瘤抗原蛋白，本发明人进行了以下努力。
本发明人首次从肺腺癌患者淋巴细胞建立了识别HLA-A24或HLA-A2阳性膀胱癌、肺癌、骨肉瘤或白血病细胞系的CTL细胞系并命名为KG-CTL(保藏号：FERM BP-6725)。
其次，从上述KG-CTL与其强烈反应的膀胱癌细胞系HT-1376制备cDNA文库，并用所述文库的重组质粒和含有HLA-A2402(HLA-A24中的一种)cDNA的重组质粒双重转染COS-7细胞。用上述KG-CTL处理所获得转染子，并检测产生的IFN-γ量以确定是否活化KG-CTL。重复进行所述筛选的结果，本发明人最终成功克隆编码肿瘤抗原蛋白的基因。对该基因的碱基测序表明，所述肿瘤抗原蛋白与已知蛋白亲环蛋白B具有相同的氨基酸序列。
已知亲环蛋白B是免疫抑制剂环胞菌素A的结合蛋白并参与活化免疫细胞。但是，在本发明以前并不知道它具有肿瘤抗原的作用。
再后，本发明人在亲环蛋白B的氨基酸序列中鉴定了结合并提呈在HLA-A24和HLA-A2上的肿瘤抗原肽部分，并证实在这样的肽及其衍生物中保有肿瘤抗原肽活性。
此外，本发明人证实亲环蛋白B的同系物、亲环蛋白A、C和D也具有与亲环蛋白B相似的肿瘤抗原肽活性。
根据上述发现完成了本发明。
因此，本发明涉及：
(1)产生自亲环蛋白的部分肽而且能够结合至HLA抗原并被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽，或其具有相同功能性质的衍生物；
(2)产生自亲环蛋白B的部分肽而且能够结合至HLA抗原并被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽，或其具有相同功能性质的衍生物；
(3)其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2的按照上述(1)或(2)的肿瘤抗原肽，或其具有相同功能性质的衍生物；
(4)按照上述(3)的肿瘤抗原肽，它选自包括SEQ ID NO：1-36或SEQ ID NO：41-43中任何一种所示的氨基酸序列的全部或部分的序列，或其具有相同功能性质的衍生物；
(5)按照上述(4)的肿瘤抗原肽，它选自包括SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的全部或部分的序列，或其具有相同功能性质的衍生物；
(6)按照上述(4)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包括在SEQ ID NO：1-36中的任何一种所示的氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分的序列；
(7)按照上述(6)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包括在SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分的序列；
(8)按照上述(6)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包括在SEQ ID NO：1-11中的任何一种所示的氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或在C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的序列；
(9)按照上述(6)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包括在SEQ ID NO：12-36中的任何一种所示的氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或在C末端的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的序列；
(10)按照上述(8)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包括SEQ ID NO：37或38所示的氨基酸序列的全部或部分的序列；
(11)按照上述(10)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包括SEQ ID NO：39或40所示的氨基酸序列的全部或部分的序列；
(12)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的至少一种选自按照上述(1)-(11)中的任一项的肿瘤抗原肽及其衍生物的物质；
(13)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它含有作为活性成分的亲环蛋白、包含能够结合至HLA抗原而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽部分的亲环蛋白的部分多肽、或编码所述亲环蛋白或其部分多肽的基因；
(14)治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的亲环蛋白B、含有能够结合至HLA抗原而且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽部分的亲环蛋白B的部分多肽、或编码所述亲环蛋白B或其部分多肽的基因；
(15)特异性结合按照上述(1)-(11)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体；
(16)其中HLA抗原和按照上述(1)-(11)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物提呈在从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞表面上的抗原提呈细胞；
(17)HLA抗原和产生自亲环蛋白的肿瘤抗原肽之间的复合物提呈于其上的抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞制备如下：使从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞与所述亲环蛋白、其包含能够结合至HLA抗原并被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽部分的部分多肽、或编码所述亲环蛋白或其部分多肽的基因结合；
(18)HLA抗原和产生自亲环蛋白B的肿瘤抗原肽之间的复合物提呈于其上的抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞制备如下：使从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞与亲环蛋白B、包含能够结合至HLA抗原并被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽部分的亲环蛋白B的部分多肽、或编码所述亲环蛋白B或其部分多肽的基因结合；
(19)用于治疗肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的按照上述(16)-(18)中任一项的抗原提呈细胞；
(20)特异性识别HLA抗原和按照上述(1)-(11)任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的细胞毒性T淋巴细胞；
(21)特异性识别提呈在按照上述(16)-(18)任一项的抗原提呈细胞上的HLA抗原和肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的细胞毒性T淋巴细胞；
(22)用于治疗肿瘤的药用组合物，它含有作为活性成分的按照上述(20)或(21)的细胞毒性T淋巴细胞；
(23)其保藏号为FERM BP-6725的细胞毒性T淋巴细胞；
(24)鉴定肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽的方法，它包括采用按照上述(23)的KG-CTL；和
(25)包含作为活性成分的按照上述(1)-(11)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的肿瘤诊断剂。
本发明基于我们首次证实称为亲环蛋白的物质具有肿瘤抗原蛋白活性。虽然本发明下文将参照作为本发明实施方案的亲环蛋白B进行详细描述，但是以下说明书并不限于亲环蛋白B，而且也涉及其它已知亲环蛋白，即亲环蛋白A、C和D(Biochemistry，3，8218，1994)。
在本发明中，术语“肿瘤抗原肽”是指包含亲环蛋白B的部分而且能够结合至HLA抗原并被CTL识别的部分肽。因此，任何肽均属于本发明的肿瘤抗原肽范围，无论其长度或其在亲环蛋白B的氨基酸序列中的位置，只要所述肽包含人亲环蛋白B的氨基酸序列的部分，而且所述肽和HLA抗原之间的复合物能够被CTL识别，其中所述氨基酸序列部分以GenBank登记号M60857注册于WWW Entrez数据库并描述于Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：1903-1907，1991。鉴定本发明的这种肿瘤抗原肽可通过合成包含亲环蛋白B的部分的候选肽，并进行分析，以确定所述候选肽和HLA抗原之间的复合物是否被CTL识别，换句话说，所述候选肽是否具有肿瘤抗原肽活性。
关于此，可按照在肽化学中通常使用的方法合成肽。这类已知方法的实例描述于文献中，包括“肽合成”，Interscience，纽约，1966；“蛋白质”，第二卷，Academic Press Inc.，纽约，1976；“Pepuchido-Gosei”，Maruzen Co.Ltd.，1985；和“Iyakuhin-no-Kaihatu，Zoku，第14卷，Peputido-Gosei”，Hirokawa Shoten，1991。
鉴定本发明肿瘤抗原肽的方法进一步在下文进行描述。
已知在结合至并提呈在以下HLA型上的抗原肽的相应的序列规律(基元)：HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602(参见例如，Immunogenetics，41：178，1995)。例如关于HLA-A24的基元，已知在8-11个氨基酸组成的肽的序列中，位置2的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，和C末端的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.，152：3913，1994；Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4307，1994)。同样，已知HLA-A2的下表1中所示的基元(Imunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4749，1995)。
表1
| HLA-A2类型 | N末端第二个位置的氨基酸 | C末端的氨基酸 |
| HLA-A0201 | L，M | V，L |
| HLA-A0204 | L | L |
| HLA-A0205 | V，L，I，M | L |
| HLA-A0206 | V，Q | V，L |
| HLA-A0207 | L | L |
(所述肽长度为8-11个氨基酸)
通过分析与各种HLA分子结合的抗原肽(Immunogenetics，41：178，1995)，已经证实所述肽长度通常为8-14个氨基酸长，尽管也在HLA-DR、-DP和-DQ观察到14个或更多氨基酸长度的抗原肽。
容易从亲环蛋白B的氨基酸序列选择包含在这类基元中的肽部分。即包含在上述基元结构中的所述肽部分可容易地通过检查亲环蛋白B的氨基酸序列来选择。然后，可通过按照上述方法合成如此选择的候选肽，并进行分析以确定所述候选肽和HLA抗原之间的复合物是否被CTL识别，换句话说，所述候选肽是否具有肿瘤抗原肽活性，从而鉴定本发明肿瘤抗原肽。
鉴定本发明肿瘤抗原肽方法的具体实例为描述于J.Immunol.，154：2257，1995中的方法。具体地说，从预期提呈所述候选肽的HLA抗原型阳性的人分离外周血淋巴细胞，并加入所述候选肽体外刺激所述淋巴细胞。如果所述候选肽诱导特异性识别用所述候选肽施以脉冲的HLA抗原提呈细胞的CTL，说明所述候选肽可以用作肿瘤抗原肽。关于此，可检测CTL诱导的存在与否，例如采用ELISA法检测CTL在应答抗原肽提呈细胞时产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。或者，也可以将检测CTL对51Cr标记的抗原肽提呈细胞的细胞毒性的方法(51Cr释放测定，Int.J.Cancer，58：317，1994)用于这种检测。
此外，也可以如下实现上述检测。通过将表达预期提呈所述候选肽的HLA抗原型cDNA的表达质粒引入例如COS-7细胞(ATCC第CRL 1651号)或VA-13细胞(RIKEN CELL BANK，The Institute ofPhysical and Chemical Research)中，用所述候选肽对所获得的细胞施以脉冲。然后用上述CTL处理所述细胞，并检测所述CTL产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量(J. Exp.Med.，187：277，1998)。
上述各种测定的范例在下文的实施例7和10和12中进行说明。
亲环蛋白B含有HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽部分。为了鉴定HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽，可以使用作为编码所述HLA抗原的cDNA的HLA-A24 cDNA(Cancer Res.，55：4248-4252，GenBank登记号M64740)和采用肽刺激的人外周血淋巴细胞或KG-CTL(FERM BP-6725)制备的这些CTL。同样对于HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽，以上述相似的方式可实现对这类肿瘤抗原肽的鉴定，其中不同的是使用HLA-A2 cDNA(GenBank登记号M84379)。
除了上述其中所述序列规律(基元)已阐明的情况外，在其中相关肽基元没有像HLA-A26阐明的情况下，可以例如按照WO 97/46676中所述方法鉴定本发明肿瘤抗原肽，前提是可利用识别HLA-A26和肿瘤抗原肽之间的复合物的CTL细胞系。
上述鉴定肿瘤抗原肽的方法在下文中统称为“肿瘤抗原肽分析方法”。
如上所述，已知结合并提呈在HLA-A24上的肿瘤抗原肽序列遵循一定规律(基元)，而且所述基元特别为在8-11个氨基酸组成的肽序列中，在位置2的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.，152：3913，1994；Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4307，1994)。同样，相似的规律(基元)可见于结合并提呈在HLA-A2上的肿瘤抗原肽序列中，特别是上述表1所示的基元是已知的(Immunogenetics，41，178，1995；J.Immunol.，155：4749，1995)。因此，在本发明肿瘤抗原肽中，HLA-A24-和HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽的典型实例为包含在亲环蛋白B氨基酸序列中的这类基元结构中的部分肽而且能够结合至相应的HLA抗原并被CTL识别的这类肿瘤抗原肽。
上述HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽的具体实例为包含SEQ IDNOs 1-11中的任一种所示的氨基酸序列的全部或部分而且能够结合至HLA-A24抗原并被CTL识别的这些肿瘤抗原肽。同样，HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽的具体实例为包含SEQ ID NO：12-36中任一种所示的氨基酸序列的全部或部分而且能够结合至HLA-A2抗原并被CTL识别的这些肿瘤抗原肽。
因此，本发明肿瘤抗原肽的实例包括：
1)SEQ ID NO：1-36中任一种所示氨基酸序列组成的肽，
2)包含SEQ ID NO：1-36中任一种所示全长氨基酸序列而且与所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延长的肽，或由SEQID NO：1-36中任一种所示氨基酸序列的连续部分组成的肽，所述肽能够结合至相应的HLA抗原并被CTL识别。在这种情况下，鉴于上述2)中的所述肽被相应的HLA抗原结合并提呈的事实，所述肽可为约8-11个氨基酸长度。
本发明HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽的合适实例包括包含SEQID NO：1或2所示氨基酸序列的全部或部分而且能够结合HLA-A24抗原并被CTL识别的这些肿瘤抗原肽。因此，这类实例有：
1)SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列组成的肽，
2)包含SEQ ID NO：1或2所示的全长氨基酸序列而且与所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延长的肽，或SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的连续部分组成的肽，所述肽能够结合至HLA-A24抗原并被CTL识别。在这种情况下，鉴于上述2)中的肽结合并提呈在HLA-A24抗原上的事实，所述肽可为约8-11个氨基酸长度。
在本发明中，术语“具有与肿瘤抗原肽相同功能性质的衍生物”(下文就可简称为肿瘤抗原肽衍生物)是指其氨基酸序列含有一个或多个、优选1个至数个本发明肿瘤抗原肽氨基酸序列的氨基酸残基改变而且具有肿瘤抗原肽性质、能够结合至HLA抗原并被CTL识别的改变的肽。因此，所有改变的肽均属于本发明肿瘤抗原肽范围，只要它们含有一个或多个本发明肿瘤抗原肽氨基酸序列的氨基酸残基的改变而且具有肿瘤抗原肽特性(即能够结合至HLA抗原并被CTL识别)。
在这种情况下，氨基酸残基的“改变”是指取代、缺失和/或添加(包括在所述肽的N末端和/或C末端添加氨基酸)氨基酸残基，优选取代氨基酸残基。对于包含氨基酸残基取代的改变，尽管只要保持肿瘤抗原肽活性可任意确定被取代的氨基酸残基的数目和位置，但是优选一个至数个残基被取代，因为如上所述肿瘤抗原肽通常为约8-14个氨基酸长度。
在上述肿瘤抗原肽的情况下，本发明肿瘤抗原肽衍生物的优选长度为约8-14个氨基酸，尽管HLA-DR、-DP和-DQ的衍生物具有14或更长氨基酸长度是可能的。
可根据上述肽制备方法合成含有本发明肿瘤抗原肽的改变部分的改变的肽，并对肿瘤抗原肽进行上述分析，从而鉴定本发明的这类肿瘤抗原肽衍生物。
如上所述，已经阐明结合至并提呈在HLA型例如HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602上的肽的序列规律(基元)。所以，在本发明肿瘤抗原肽中含有改变的一个或多个氨基酸的肿瘤抗原肽衍生物可以根据这类基元制备。
例如关于结合至并提呈在HLA-A24上的抗原肽基元，如上所述已知在8-11个氨基酸组成的肽的序列中，位置2的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.，152：3913，1994；Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4307，1994)。同样，已知HLA-A2的上表1所示的基元。此外，也可接受具有类似于符合所述基元的氨基酸的性质的氨基酸残基。所以，本发明肿瘤抗原肽衍生物的实例包括包含其中根据所述基元在允许取代的任何位置(对于HLA-24和HLA-A2分别为位置2和C末端)的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代的氨基酸序列的全部或部分的这些肽衍生物，而且这类肽衍生物具有结合至HLA抗原并被CTL识别的活性。优选实例为包含其中氨基酸残基取代选自按照上述基元的所述位置的氨基酸残基的氨基酸序列的全部或部分的这些肿瘤抗原肽衍生物，而且这类衍生物具有上述活性。氨基酸序列的“全部或部分”的优选长度为约8-14个氨基酸，尽管HLA-DR、-DP和-DQ可以为14或更多氨基酸长度。
HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽衍生物实例包括包含下述氨基酸序列的全部或部分的肽衍生物：在所述氨基酸序列中在根据衍生自具有HLA-A24或HLA-A2的结合基元的亲环蛋白B氨基酸序列的肽的上述基元允许取代的位置、尤其是位置2和/或C末端的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代，并且这类衍生物具有上述活性。优选实例为这些肿瘤抗原肽衍生物：它们包含其中在位置2和/或C末端的氨基酸残基被按照上述基元的氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分，而且这类衍生物具有上述活性。在这些HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽衍生物中，所述氨基酸序列的“全部或部分”的优选长度为约8-11个氨基酸。
特别的实例为这些肿瘤抗原肽衍生物：它们包含其中在SEQ IDNO：1-36中任一种所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分，而且这类衍生物具有上述活性。优选实例为这些肿瘤抗原肽衍生物：它们包含其中在SEQ ID NO：1-36中任一种所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被按照上述基元的氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分，而且这类衍生物具有上述活性。HLA-A24-限制性肿瘤抗原衍生物的特别实例为这些肿瘤抗原肽衍生物：它们包含其中在SEQ ID NO：1-11的任一种所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分，而且这类衍生物具有上述活性。同样，HLA-A2-限制性肿瘤抗原衍生物的实例为这些肿瘤抗原肽衍生物：它们包含其中在SEQ ID NO：12-36的任一种所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代和/或C末端的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分，而且这类衍生物具有上述活性。
本发明HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽衍生物的合适实例为这些肿瘤抗原肽衍生物：它们包含其中在SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分，而且这类衍生物具有上述活性。更优选的实例为这些肿瘤抗原肽衍生物：它们包含其中一个或多个氨基酸残基按照上述基元被取代的氨基酸序列的全部或部分，即SEQ ID NO：37或38所示氨基酸序列的全部或部分，而且这类衍生物具有上述活性。这类肿瘤抗原肽衍生物的合适实例示于SEQ ID NO：39和40中。
而且，如上所述，除了上述亲环蛋白B之外，亲环蛋白B的同系物、亲环蛋白A、C和D也是产生肿瘤抗原肽的肿瘤抗原蛋白。这类肿瘤抗原肽的具体实例包括HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽，例如SEQ ID NO：41(亲环蛋白A)、SEQ ID NO：42(亲环蛋白C)和SEQ IDNO：43(亲环蛋白D)。
本发明肿瘤抗原肽或其衍生物可用于如下治疗或预防肿瘤的药用组合物。
当目的是用于治疗或预防肿瘤时，将至少一种或联合两种或多种本发明肿瘤抗原肽或它们的衍生物给予患者，必要时，与其它药物如其它肿瘤抗原肽联合给予。当将用于治疗或预防肿瘤的包含作为活性成分的本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的组合物给予亲环蛋白B阳性患者时，所述肿瘤抗原肽或其衍生物与抗原提呈细胞的HLA抗原以高密度提呈，所以，提呈的HLA抗原复合物特异性的CTL增殖并破坏所述肿瘤细胞。因此，可以治疗所述患者的肿瘤，或者可以防止所述肿瘤的增殖或转移。而且，包含作为活性成分的本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的用于治疗或预防肿瘤的组合物可以通过其联合应用化疗或放疗从而增强治疗效果。
包含作为活性成分的本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的用于治疗或预防肿瘤的组合物可以和佐剂一起给予，以便有效建立所述细胞免疫，或者可以以颗粒剂型给予。为此，可应用描述于文献(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)中的佐剂。另外，也可以应用脂质体制剂、其中所述成分结合到直径数μm的微珠上的颗粒剂或其中所述成分结合到脂质的制剂。例如可以皮内、皮下或静脉内注射实现给药。虽然可以将需要给予的在所述制剂中的本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的量根据以下因素调节至适量：例如需要治疗的疾病、特定患者的年龄和体重，但是通常优选每数天或数月给予0.0001mg-1000mg，优选0.001mg-1000mg，而更优选0.1mg-10mg。
此外，产生本发明肿瘤抗原肽的亲环蛋白B蛋白或编码所述亲环蛋白B的基因也可以用于治疗或预防肿瘤的药用组合物。除了所述全长亲环蛋白B或其全长基因之外，其任何部分、连接在一起的这样的部分甚或其碱基或氨基酸序列改变的部分均可以实现所需要的治疗或预防肿瘤的目的，只要它们包含至少一个能够结合至HLA抗原并被CTL识别的肽部分。在这种情况下，“包含至少一个能够结合至HLA抗原并被CTL识别的肽部分”的这些物质在本发明中称为“部分多肽”。
当亲环蛋白B蛋白或其部分多肽用作治疗或预防肿瘤的组合物时，它可以以类似于上述肿瘤抗原肽或其衍生物的剂型、给药模式和剂量给药。当给予肿瘤患者时，亲环蛋白B蛋白或其部分多肽结合至抗原提呈细胞中，随后通过细胞内降解产生的肿瘤抗原肽结合至HLA抗原形成复合物。所述复合物以高密度提呈在抗原提呈细胞表面上，对所提呈复合物特异性的CTL有效地在体内增殖并破坏所述肿瘤细胞。以这种方式达到治疗或预防肿瘤。
为了将编码亲环蛋白B或其部分多肽的基因用于治疗或预防肿瘤的组合物，可以使用以下方法。
采用病毒载体或按照其它方法中的任何一种可以实现给予并将本发明所述基因导入细胞中(Nikkei-Science，1994年4月，第20-45页；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(5)，1994，和其中所引用的参考文献)。
采用病毒载体的方法的实例包括这样的方法：其中将本发明DNA导入DNA或RNA病毒如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或Sindbis病毒中，并引入细胞中。在这些方法中，特别优选采用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或痘苗病毒的方法。
其它方法可以包括其中表达质粒直接肌内注射(DNA疫苗接种)的方法、所述脂质体法、脂质转染法、微量注射法、磷酸钙方法和电穿孔，特别优选DNA疫苗接种和所述脂质体法。
为了使本发明的基因用作医疗实践中的药物，人们可以采用以下两种方法之一：其中DNA直接引入机体的体内法，或其中将某些细胞从人体取出，在体外将DNA导入所述细胞中后，再将所述细胞导入所述机体的体外法(Nikkei-Sciecnce，1994年4月，第20-45页；Gekkan-yakuji，36(1)，2348(1994)；Jikkenn-Igaku-Zokan，12(15)，1994；和其中引用的参考文献)。更优选体内法。
体内法时，根据需要治疗的疾病和症状以及其它因素可以采用任何合适的途径给予所述基因。例如可以通过静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内途径给予。体内法时，所述组合物可以以各种剂型如溶液剂给予，而且通常配制为例如含有作为活性成分的本发明DNA的注射剂形式，必要时也可加入常规载体。如果本发明基因包含于脂质体或膜融合的脂质体(例如仙台病毒(HVJ)脂质体)中，则所述组合物可以为脂质体制剂形式，例如悬浮剂、冷冻药物、离心浓缩的冷冻药物等。
虽然在这类制剂中的本发明基因的量可以根据需要治疗的疾病、患者的年龄和体重等而不同，但是通常优选每隔数天或数月给予本发明基因0.0001-100mg、优选为0.001-10mg。
通过这样给予本发明基因可在抗原提呈细胞中高度表达所述肿瘤抗原蛋白。随后通过细胞内降解产生的肿瘤抗原肽与HLA抗原结合形成复合物，而所述复合物致密地出现在所述细胞表面上。因此，对这些复合物特异性的CTL有效地在机体内增殖并破坏肿瘤细胞。这样达到治疗或预防肿瘤的增殖或转移。
可以如下制备能够用作上述药物的亲环蛋白B、其部分多肽和编码这类物质的基因。根据可通过WWW Entrez数据库检索获得、以收录号M60857注册于GenBank的人亲环蛋白B cDNA的碱基序列制备合适的PCR引物，并利用它们按照标准讲义(例如“Molecularcloning”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))的描述进行PCR，能够容易地克隆编码亲环蛋白B的基因。为此，人们也可以查阅Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：1903，1991，该文献为关于亲环蛋白B的克隆的报告。此外，也可以采用市售亲环蛋白B cDNA克隆(ATCC第107758号，名称：HTNAQ10)。如果需要，可以按照标准讲义如上述“Molecular Cloning”容易地进行改变。而且，按照许多公开出版物和参考文献如上述的“Molecular Cloning”可以采用如此克隆的编码人亲环蛋白B的基因表达亲环蛋白B蛋白。通过将需要表达的DNA导入合适的载体(例如pSV-SPORT1)中，在某些情况下需要在所述DNA的上游加入控制转录的调节序列如启动子序列(例如trp、lac、T7或SV40早期启动子)后进行上述操作，从而构建在宿主细胞复制并发挥作用的表达质粒。然后将所述表达质粒导入合适的宿主细胞中获得转化体。宿主细胞的实例包括例如原核生物细胞如大肠杆菌、单细胞真核生物如酵母和从多细胞真核生物如昆虫或动物获得的细胞。用所述磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电脉冲法等可以将基因转入宿主细胞中。在合适培养基中培养的转化体产生目的蛋白。按照标准生化方法分离和纯化如此获得的肿瘤抗原蛋白。
能够确定如上所述制备的亲环蛋白B蛋白、其部分多肽或编码这类物质的基因是否具有肿瘤抗原活性，即例如采用如下的表达基因的方法，通过细胞内降解所述蛋白确定是否产生能够与HLA抗原结合并被CTL识别的肿瘤抗原肽。
首先，将含有候选基因或基因片段的表达质粒和另一种含有编码HLA抗原的DNA的表达质粒双转染入不表达肿瘤抗原蛋白的细胞，例如得自非洲绿猴肾脏的COS-7(ATCC CRL 1651)或成纤维细胞VA-13(RIKEN CELL BANK，The Institute of Physical and ChemicalResearch)。例如通过利用脂质转染胺试剂(Gibco BRL)的脂质转染法可以实现所述转染。然后，加入限定于所用特定HLA抗原的肿瘤效应CTL，使其作用于所述转染子，然后例如采用ELISA检测所述CTL应答所述靶细胞而产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量，以确定所述候选基因是否为编码肿瘤抗原蛋白的DNA。因为亲环蛋白B含有HLA-A24-或HLA-A2-限制性肿瘤抗原肽部分，所以例如HLA-A24cDNA(Cancer Res.，55：4248-4252(1995)；GenBank收录号为M64740)或HLA-A2 cDNA(GenBank收录号为M84379)可以用作编码所述HLA抗原的上述DNA，而从人外周血淋巴细胞以及KG-CTL(FERMBP-6725)制得的CTL可以用作上述CTL。
具有这样的活性检测结果的具体实例在下文的实施例2中进行描述。
本发明还包括特异性结合至本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体。例如按照述于“Antibodies：A Laboratory Manual”，Lane，H.D.等编辑，Clod Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989中的方法容易制得这类抗体。具体来说，采用所述肿瘤抗原肽或其衍生物以所述常规方法适当免疫动物，容易制得识别本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体和进一步中和其活性的抗体。这类抗体可以用于亲和层析、免疫诊断等。
首先，根据需要标记上述抗体，然后用其检测在得自怀疑患有肿瘤的患者标本(例如血液、肿瘤组织)中存在的抗原，从而可以利用所述抗体进行是否存在肿瘤的免疫诊断。具体而言，可从免疫印迹、放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光分析等选择合适的这样的免疫诊断法。
本发明肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白(亲环蛋白B)或它们的基因也可以如下用于体外治疗肿瘤患者。
肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或它们的基因在治疗肿瘤中的应用，重要的是确立能够在患者体内有效诱导特异性CTL的给药方法。作为这样的方法之一，本发明提供含有HLA抗原和本发明肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的抗原提呈细胞，所述复合物提呈在从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞表面上，而且本发明还提供包含作为活性成分的所述抗原提呈细胞的治疗肿瘤的药用组合物。
在这方面，“具有抗原提呈能力的细胞”不特别受限制，只要它是在其细胞表面上表达能够提呈本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的HLA抗原的细胞即可，优选树突细胞，据报道其提呈抗原的能力特别高。需要加入以从上述具有抗原提呈能力的细胞中制备本发明的抗原提呈细胞的物质可以是本发明肿瘤抗原肽或其衍生物以及所述肿瘤抗原蛋白、亲环蛋白B和它们的基因。为了制备本发明抗原提呈细胞，不仅可以使用所述全长亲环蛋白B和其基因，也可以使用其部分多肽和其基因。当以蛋白或基因形式使用时，必需将其加入细胞中。关于此，参阅上述关于治疗或预防肿瘤的含有作为活性成分的所述基因或蛋白的组合物的描述。
为了制备本发明抗原提呈细胞，从肿瘤患者分离具有抗原提呈能力的细胞，并用本发明肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或其部分多肽体外进行脉冲处理，形成HLA抗原和所述肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物(Cancer Immunol.Immunother.，46：82，1998；J.Immunol.158：1796，1997；Cancer Res.，59：1184，1999)。当使用树突细胞时，例如可用以下步骤制备本发明抗原提呈细胞：通过采用Ficoll方法从肿瘤患者外周血分离淋巴细胞，去除非粘附细胞，在GM-CSF和IL-4存在下培养粘附细胞，以诱导树突细胞，并用本发明肿瘤抗原肽、肿瘤抗原蛋白等培养并脉冲处理所述树突细胞。详见实施例13。
当通过将编码本发明肿瘤抗原蛋白或其部分多肽的基因导入上述具有抗原提呈能力的细胞中制备本发明抗原提呈细胞时，所述基因可以是DNA或RNA形式。具体而言，可参阅例如Cancer Res.，56：5672，1996或J.Immunol.，161：5607，1998使用DNA，而可通过参阅例如J.Exp.Med.，184：465，1996使用RNA。
用于治疗肿瘤包含作为活性成分的上述抗原提呈细胞的药用组合物含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基等，以便稳定维持所述抗原提呈细胞。可以例如静脉内、皮下或皮内给予。通过将这样的包含作为活性成分的抗原提呈细胞的治疗肿瘤的组合物再导入所述患者体内，在所述亲环蛋白B阳性患者体内有效诱导特异性CTL，以实现肿瘤治疗。确定无疑的是，所述患者和所用的肽之间的HLA类型需要匹配。例如HLA-A24限制性肿瘤抗原肽或其衍生物必须用于HLA-A24阳性肿瘤患者。
此外，体外应用按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或它们的基因的另一实例是下文的过继免疫疗法。
在黑素瘤已经观测到过继免疫疗法获得的治疗效应，其中体外大量培养从所述患者取出的侵润肿瘤的T细胞，然后再回输给所述患者(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。同样，在小鼠黑素瘤通过用肿瘤抗原肽TRP-2体外刺激脾细胞，因此增殖所述肿瘤抗原肽特异性CTL，然后将所述CTL给予移植黑素瘤的小鼠，观测到对所述小鼠黑素瘤转移的抑制(J.Exp.Med.，185：453，1997)。该观测结果是因为特异性识别抗原提呈细胞的HLA抗原和所述肿瘤抗原肽之间的复合物的CTL体外增殖所致。所以，认为治疗肿瘤的方法是有效的，所述方法包括利用按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或它们的基因体外刺激患者的外周血淋巴细胞，以增殖肿瘤特异性CTL，然后将所述CTL送回所述患者体内。
因此，本发明提供特异性识别所述HLA抗原和所述肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的CTL，而且还提供包含作为活性成分的所述CTL的用于治疗肿瘤的药用组合物。这种组合物优选含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基等以稳定保持CTL。它可以例如静脉内、皮下或皮内给予。通过将包含作为活性成分的CTL的用于治疗肿瘤的组合物再导入所述患者体内，CTL针对所述肿瘤细胞的毒性作用相应在亲环蛋白B阳性患者中得到加强，而因此破坏所述肿瘤细胞，达到治疗所述肿瘤。
按照本发明的肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原肽及其衍生物也可以用作诊断肿瘤的诊断剂的活性成分。所以，通过将按照本发明的肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原肽或其衍生物本身用作检测得自怀疑患有肿瘤的患者的标本(例如血液或肿瘤组织)中的存在的抗体的诊断剂，可以早期检测到肿瘤并诊断肿瘤的复发和转移。相同的方法也可用于选择适用包含作为活性成分的例如本发明的肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽的药物的肿瘤患者。特别是可应用免疫印迹、RIA、ELISA或荧光或发光分析进行这样的诊断。
此外，近年来，已经建立了利用所述抗原肽和HLA抗原之间的复合物检测抗原特异性CTL的新型检测方法(Science，274：94，1996)。通过将按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物和HLA抗原之间的复合物进行上述检测法，并因此检测肿瘤抗原特异性CTL，可以早期检测肿瘤并诊断肿瘤的复发或转移。相同的方法也可用于选择适用包含作为活性成分的例如本发明的肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽的药物的肿瘤患者；或者用于确定所述药物的治疗作用。因此，本发明还提供包含作为活性成分的一部分的按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的用于肿瘤的诊断剂。
具体来说，可以如下进行这样的诊断：制备按照文献(Science，274：94，1996)所述方法荧光标记的HLA抗原和肿瘤抗原肽之间的复合物的四聚体，并用于利用流式细胞仪定量检测怀疑患有肿瘤的患者的外周血淋巴细胞中的所述抗原肽特异性CTL。
本发明还提供了从得自肺腺癌的侵润肿瘤的淋巴细胞建立的CTL的KG-CTL(保藏号FERM BP-6725)。已证实KG-CTL对HLA-A24-和HLA-A2-阳性癌细胞具有有效杀伤作用，而且本发明亲环蛋白B也是利用其与所述KG-CTL的反应性作为指标而发现的肿瘤抗原蛋白。所以，如同亲环蛋白B作为肿瘤抗原蛋白的发现一样，可以通过利用KG-CTL发现新的肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽。详见下文的实施例2。
附图简述
图l为检测结果图，其中在加入本发明肿瘤抗原肽“84-92(SEQID NO：1)”之后将用HLA-A2402 cDNA的重组质粒或HLA-A2601cDNA的重组质粒转染的COS-7细胞与KG-CTL共培养，并检测KG-CTL产生的IFN-γ量。横坐标轴表示加入的肽浓度，而纵坐标轴表示KG-CTL产生的IFN-γ量。
图2为检测结果图，其中在加入本发明肿瘤抗原肽“91-99(SEQID NO：2)”之后将用HLA-A2402 cDNA的重组质粒或HLA-A2601cDNA的重组质粒转染的COS-7细胞与KG-CTL共培养，并检测KG-CTL产生的IFN-γ量。横坐标轴表示加入的肽浓度，而纵坐标轴表示KG-CTL产生的IFN-γ量。
实施本发明的最佳方式
进一步用以下实施例说明本发明，但是这些实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1
从得自肺腺癌的肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)建立细胞毒性T淋巴细胞
(CTL)细胞系
将从肺腺癌患者外科手术取出的标本在培养基中切割成小碎块，然后将所述细胞悬浮在含有胶原酶和DNA酶的培养基中。采用Ficoll-Conray溶液经密度离心从所述细胞悬浮液分离淋巴细胞。在含有45％RPMI-1640、45％AIM-V(Gibco BRL)和10％FCS并加有100U/ml白介素-2和0.1mM NEAA(Gibco BRL)的培养基(下文称为淋巴细胞培养基)中培养所述淋巴细胞。在培养的最初2天期间，在所述培养基中加入1μg/ml抗CD3抗体NU-T3(Nichirei Corporation)。继续培养30天以上，由此建立对几种HLA-A24-或HLA-A2-阳性癌细胞系应答的CTL系。该CTL系命名为KG-CTL，并用于以下试验。如下测定KG-CTL对各种癌细胞系的反应性。将癌细胞系以1×104细胞/孔平板接种至96-孔板的各孔中。第二天，以1×105细胞/孔加入KG-CTL，再培养18小时，收获培养基测定KG-CTL产生的干扰素-γ(IFN-γ)量。采用酶联免疫分析(ELISA)定量测定IFN-γ。具体来说，将抗人IFN-γ的小鼠单克隆抗体吸附在96-孔微量滴定板的各孔中作为固相抗体，在用牛血清白蛋白封闭非特异性结合后，使所述标本中的IFN-γ与所述抗体结合。然后使作为检测抗体的抗人IFN-γ的兔多克隆抗体结合。在结合用碱性磷酸酶标记的抗兔免疫球蛋白的山羊抗体后，采用过氧化物酶显色试剂盒T(Sumitomo Bakelite Co.)使其显色，然后检测吸光度(405nm)。与用标准IFN-γ获得的值进行比较，以定量测定IFN-γ的量。KG-CTL对各种腺癌细胞系的反应性总结于表2。同样，KG-CTL对淋巴细胞系的反应性见表3。
表2
| 腺癌细胞系 | KG-CTL产生的IFN-γ量(pg/ml) | HLA-A型 |
| HT-1376(膀胱癌细胞系) | 4608 | 2402/2402 |
| 1-87(肺癌细胞系) | 194 | 0207/1101 |
| 11-18(肺癌细胞系) | 4632 | 0201/2402 |
| PC-9(肺癌细胞系) | 1102 | 0206/2402 |
| LC-1(肺癌细胞系) | 129 | 3101/3302 |
| YT-803(肺癌细胞系) | 285 | 3101/3302 |
| 143B(骨肉瘤细胞系) | 1547 | 0211/0211 |
| 无(只有KG-CTL) | 100 | - |
表3
| 细胞系 | KG-CTL产生的IFN-γ量(pg/ml) | HLA-A型 |
| SSB(B细胞系1)) | 5769 | 2402/2402 |
| Ban-B1(B细胞系1)) | 78 | 3101/3302 |
| HPB-MLT(白血病细胞系) | 189 | 0101/0201 |
| MOLT-16(白血病细胞系) | 13 | 2301/3002 |
| MT-2(白血病细胞系) | 3495 | 2402/2402 |
| 无(只有KG-CTL) | 0 | - |
1)用EB病毒转化健康供体B细胞获得的B细胞系。
表2的结果表明KG-CTL与表中的HLA-A2402-阳性癌细胞(HT-1376、11-18和PC-9)强烈反应并产生IFN-γ，而且KG-CTL也与HLA-A2-阳性细胞(143B)反应并产生IFN-γ。同样，表3的结果表明KG-CTL与HLA-A2402-阳性的EB-病毒转化的B细胞系以及白血病细胞系(SSB和MT-2)强烈反应，而且KG-CTL也与HLA-A2-阳性白血病细胞系(HBP-MLT)强烈反应。
所建立的KG-CTL保藏于工业科学技术局的国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)(微生物名称：KG-CTL；保藏日期：1998年6月19日；保藏号：FERMP-16854)(转为国际保藏的日期：1999年5月20日；保藏号：FERM BP-6725)。而且，Shionogi&Co.按照Nakao等所述方法(Cancer Res.，55：4248-4252(1995))对KG-CTL的HLA分子进行分型，证实A的基因座为A0206和A2402。
实施例2
鉴定肿瘤抗原蛋白
用以下方法从在实施例1中KG-CTL与其强烈反应的膀胱癌细胞系HT-1376(ATCC CRL 1472)制备cDNA文库。
首先通过分离总的RNA部分并采用mRNA纯化系统(PharmaciaBiotech)按照生产商的方案在寡聚脱氧胸苷酸(oligo(dT))柱上纯化，从HT-1376制备poly(A)+mRNA。采用SuperScriptTM质粒系统(GibcoBRL)按照生产商的方案从所述mRNA制备具有与每个末端连接的Not I连接物和Sca I连接物的cDNA，然后连接入用限制酶Not I和SalI消化的表达载体质粒pSV-SPORT1(Gibco BRL)的切割位点中，获得重组质粒。采用Gene Pulser(Bio-Rad)的电脉冲将所述重组质粒导入大肠杆菌ElectroMAX DH10BTM细胞(Gibco BRL)中，然后在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基(1％Bacto-trypton、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl，pH7.3)中选择所述重组质粒导入其中的转化体。
以以下方法从合并的约100个上述转化体中回收重组质粒DNA。在含有LB培养基加氨苄青霉素(50μg/ml)的96孔U形底微量培养板的每个孔中加入100个转化体并进行培养。然后将部分培养物转移到另一个每孔含有0.25ml TYGPN培养基的96孔U形底微量培养板中(F.M.Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley&Sons，Inc.)，并于37℃培养48小时。将其余的在所述微量培养板的LB培养基中的培养物冷冻保藏。用碱裂解法在所述微量培养板上从培养于TYGPN培养基中的转化体制备重组质粒DNA(F.M.Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley&Sons，Inc.)。将用异丙醇沉淀回收的重组质粒DNA悬浮于50μl含有20ng/ml RNA酶的10mM Tris、1mM EDTA，pH7.4中。
另一方面，采用保藏于工业科学技术局国立生命科学和人体技术研究所的食管癌细胞系KE-4(1-1-3 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)(保藏日期：1997年5月23日；保藏号：FERM BP-5955)为原材料，按照Naka等在Cancer Res.，55：4248-4252(1995)中的描述制备其中HLA-A2402(GenBank收录号M64740)和HLA-A2601的cDNA已导入表达载体pCR3(Invitrogen)的重组质粒。
然后，用HT-1376 cDNA的重组质粒和HLA-A2402 cDNA的重组质粒采用如下的脂质转染法双重转染得自非洲绿猴肾脏的细胞系COS-7(ATCC第CRL1651号)。将8000个COS-7细胞加入96-孔平底微量培养板的每一孔，在100μl含有10％FCS的RPMI 1640培养基中培养1天。利用脂质转染胺试剂(Gibco BRL)，从由25μl相当于约100个转化体的HT-1376 cDNA重组质粒、10μl(200 ng)HLA-A2402 cDNA重组质粒和35μl稀释约50倍的脂质转染试剂组成的70μl混合物中取出30μl加入以双重转染所述COS-7细胞。复份制备转染子。5小时后，将200μl含有10％FCS的培养基加入所述转染子中，再于37℃培养48小时。去除培养基后，每孔加入KG-CTL 1.5×105细胞，在100μl含有10％FCS和25U/mlIL-2的培养基中于37℃培养24小时。回收培养基并用实施例1所述的ELISA法检测IFN-γ量。
对于IFN-γ产量高的各组，用HT-1376 cDNA重组质粒转染的约100个转染子的相应的冷冻保藏合并物在以下的进一步筛选中使用。将所述转染子合并物平板接种在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基中以获得集落。如上所述每组培养400个集落，以便在每孔中含有单一类型的转染子，制备HT-1376 cDNA的重组质粒DNA。此外，用类似于上述的方法，用HT-1376 cDNA的重组质粒和HLA-A2402 cDNA的重组质粒双重转染C0S-7细胞，然后与KG-CTL共培养，定量检测GK-CTL在对所述靶细胞的反应中产生的IFN-γ，以选择阳性质粒。用这些方法选择HT-1376 cDNA重组质粒克隆，所述克隆命名为4F2。而且，用4F2重复相似的步骤，以确定KG-CTL产生的IFN-γ量。结果见下表4。
表4
| 细胞 | KG-CTL产生的IFN-γ量(pg/ml) |
| COS-7+HLA-A2402 | 469 |
| COS-7+HLA-A2402+4F2 | 543 |
与只用HLA-A2402转染的COS-7细胞相比，KG-CTL与用HLA-A2402和4F2双重转染的COS-7细胞反应更强烈并产生更多的IFN-γ。该结果表明4F2编码的蛋白是肿瘤抗原蛋白。
实施例3
确定肿瘤抗原蛋白基因的碱基序列
采用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)测定实施例2获得的编码所述肿瘤抗原蛋白的质粒克隆4F2的碱基序列。利用WWW Entrez数据库将所确定的碱基序列和由该碱基序列编码的氨基酸序列与已知的序列进行比较，揭示所述质粒克隆4F2的碱基序列相当于以GenBank收录号N60857注册的人亲环蛋白B的氨基酸序列。所述亲环蛋白B的序列也描述于Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：1903，1991中。亲环蛋白B是免疫抑制剂环胞菌素A的结合蛋白，而且已知它参与体内的免疫细胞活化。上述实施例2首次发现已知其唯一功能是参与免疫细胞活化的亲环蛋白B具有肿瘤抗原蛋白的作用。
实施例4
选择候选肽
由HLA抗原结合并提呈的抗原肽序列中存在某些规律(基元)。关于HLA-A24的基元，已知在8-11个氨基酸组成的序列中，在位置2上的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸(Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，152：3913，1994；J.Immunol.，155：4307，1994)。同样，已知8-11个氨基酸组成的肽HLA-A2和HLA-A0201肽，其位置2上的氨基酸是亮氨酸或蛋氨酸，而C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸；H-LA-A0204的位置2上的氨基酸是亮氨酸，而C末端氨基酸是亮氨酸；HLA-A0205的位置2上的氨基酸是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸，而C末端氨基酸是亮氨酸；HLA-A0206的位置2上的氨基酸是缬氨酸或谷氨酰胺，而C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸；HLA-A0207的位置2上的氨基酸是亮氨酸，而C末端氨基酸是亮氨酸(Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4749，1995；另参见表1)。
根据这类基元，从本发明人发现其肿瘤抗原蛋白功能的亲环蛋白B的氨基酸序列(GenBank收录号M60857)中选择具有上述基元的8-11肽组成的肽部分。所选定的具有HLA-A24结合基元的肽示于SEQID NO：1-11，而具有HLA-A2结合基元的肽示于SEQ ID NO：12-36。这些肽用Fmoc方法在Biologica Co.合成。
然后按照文献(J.Exp.Med.，187：277，1998)，用表达HLA-A2402的HLA-A2402 cDNA的重组质粒通过脂质转染法转染104COS-7细胞。以10μM向这些细胞中分别加入先前合成的具有HLA-A24结合基元的各种肽，保持2小时以对所述细胞施以脉冲。然后将所述细胞与2×104KG-CTL共培养18小时，用ELISA法测定KG-CTL产生的培养物上清液中的IFN-γ量。然后用两种肽即包含亲环蛋白B氨基酸序列的位置84-位置92的序列(SEQ ID NO：1，下文有时简称为“84-92”)的肽和包含位置91-位置99的序列(SEQ ID NO：2，下文有时简称为“91-99”)的肽，进行以下实验。
实施例5
合成Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe(SEQ ID NO：1)
在该合成中采用Fmoc-Phe-Alko树脂(0.56mmol/g，100-200目)。用100mg该树脂，按照下述流程1开始合成，依次偶联以下残基：Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH。偶联后，将所述方案进行至下表5所示流程1的步骤3，以获得肽树脂。
在该树脂中加入2ml试剂K(5％苯酚，5％苯硫基甲烷，5％H2O和2.5％乙二硫醇的TFA)，使其在室温下反应2.5小时。用冰冷却的同时，向该反应物中加入10ml乙醚，搅拌该混合物10分钟，过滤，然后用10ml乙醚洗涤。向该滤饼中加入10ml10％醋酸水溶液(下文称为含水醋酸)，搅拌该混合物30分钟。然后过滤该树脂，用4mL含水醋酸洗涤。冻干滤液和洗涤液后，将获得粗品肽溶解于含水醋酸中，并上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料COSMOSIL5C18-AR柱(25φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在260分钟内将乙晴浓度升高至25％，以7ml/min的流速洗脱产物。以A 220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得11.7mg Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe。
所获得的肽Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe在用含0.1％TFA的0-60％乙晴线性浓度梯度洗脱的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6Φ×250mm)的分析中的保留时间为23.9分钟，所述产物的氨基酸分析的和质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx：1.01(1)
*Val：1.00(1)
Ile：0.85(1)
Phe：1.94(2)
Lys：1.74(2)
His：0.95(1)
Arg：0.86(1)
质谱(FAB)
[M+H]+：1190
表5
流程1
| 步骤 | 处理时间(分钟)×处理次数 |
| 1.(洗涤)DMF 1.2ml2.(去保护)50％哌定/DMF3.(洗涤)DMF 1.2ml4.(偶联)氨基保护的各氨基酸(5当量)/NMP溶液0.9ml，DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml5.(洗涤)DMF 1.2ml6.(偶联)氨基保护的各氨基酸(5当量)/NMP溶液0.9ml，DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml7.(洗涤)DMF 1.2ml | 1×212×11×730×11×230×11×4 |
实施例6
合成Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe(SEQ ID NO：2)
以与实施例5相同的方法，采用100mg Fmoc-Phe-Alko树脂，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH，然后将产物去保护。将生成的粗品肽溶解于含水醋酸中，并上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料COSMOSIL 5C18-AR柱(25Φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在260分钟内将乙腈浓度升高至31％，以7ml/min流速洗脱产物。以A 220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得3.6mg Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe。
所获得的肽Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe在用含有0.1％TFA的0-60％线性浓度梯度的乙腈洗脱的反相填料YMC-PACKODS-AM柱(4.6Φ×250mm)的分析中，其保留时间为25.8分钟，所述产物的氨基酸分析(未检测到Met)以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx：2.02(2)
Glx：1.04(1)
Gly：2.04(2)
*Ile：1.00(1)
Phe：1.97(2)
质谱(FAB)
[M+H]+：1029
实施例7
鉴定肿瘤抗原肽
采用上述实施例5和6中合成的两种肽以实施例4所述的相同方法进行试验，发现这些肽可用作肿瘤抗原肽。结果见图1和2。在这两个图中，水平轴表示肽浓度(pg/ml)，垂直轴表示KG-CTL产生的IFN-γ量。当用“84-92”和“91-99”对用HLA-A2402 cDNA的重组质粒转染的COS-7细胞施以脉冲时，KG-CTL的反应性以浓度依赖性方式递增。与用HLA-A2601 cDNA的重组质粒转染的COS-7细胞相比，用HLA-A2402 cDNA的重组质粒转染的COS-7细胞在施以脉冲时产生更高的KG-CTL反应性。上述结果证实所述两种肽“84-92”和“91-99”具有HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽的作用。
实施例8
合成Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe(SEQ ID NO：39)
因为实施例7表明“84-92”和“91-99”具有肿瘤抗原肽作用，所以制备两种衍生物“84-92·2F-Y”(SEQ ID NO：39)和“91-99·2F-Y”(SEQ ID NO：40)，其中在HLA-A24的结合基元范围中的位置2的苯丙氨酸被取代为酪氨酸。
以实施例5所述的相同方法合成肽Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe(SEQ ID NO：39)。具体来说，采用100mg Fmoc-Phe Alko树脂，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH，然后将产物去保护。将生成的粗品肽溶解于含水醋酸中，并上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料COSMOSIL 5C18-AR柱(25Φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，在200分钟内乙腈浓度升高至25％，以7ml/min流速洗脱产物。以A 220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得44.9mg Lys-Tys-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe。
所获得的肽Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe在用含有0.1％TFA的0-60％线性梯度浓度的乙腈洗脱的反相填料YMC-PACKODS-AM柱(4.6Φ×250mm)的分析中，其保留时间为17.7分钟，所述产物的氨基酸分析以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx：1.06(1)
*Val：1.00(1)
Ile：0.85(1)
Tyr：0.89(1)
Phe：0.95(1)
Lys：1.85(2)
His：0.98(1)
Arg：0.91(1)。
质谱(FAB)
[M+H]+：1206
实施例9
合成Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe(SEQ ID NO：40)
以实施例5所述的相同方法，采用100mg Fmoc-Phe-Alco树脂，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH，然后将产物去保护。将生成的粗品肽溶解于含水醋酸中，并上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料COSMOSIL 5C18-AP柱(25Φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，然后在200分钟内将乙腈浓度升高至27％，以7ml/min流速洗脱产物。以A 220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得12.8mg Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe。
所获得的肽Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe在用含有0.1％TFA的0-60％线性梯度浓度的乙腈洗脱的反相填料YMC-PACKODS-AM柱(4.6Φ×250mm)的分析中，其保留时间为24.7分钟，所述产物的氨基酸(Met未检测到)分析以及质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx：2.04(2)
Glx：1.02(1)
Gly：2.06(2)
*Ile：1.00(1)
Tyr：0.82(1)
Phe：0.98(1)。
质谱(FAB)
[M+H]+：1045
实施例10
用肿瘤抗原肽及其衍生物从外周血淋巴细胞诱导CTL
本发明人研究了用实施例5合成的肽“84-92”(SEQ ID NO：1)和实施例8合成的肽“84-92·2F-Y”(SEQ ID NO：39)是否能够从外周血淋巴细胞诱导抗原特异性CTL。
采用Ficoll法从HLA-A基因座的A24杂合子的白血病患者的外周血分离淋巴细胞。将淋巴细胞以2×106细胞/孔加入24孔培养板的各孔中，并在淋巴细胞培养基中培养。以10μM将上述肿瘤抗原肽加入所述培养基中，以刺激外周血淋巴细胞。1周后，加入上述肿瘤抗原肽达到10μM以进行第二次刺激，同时加入约2×105X-辐射(50 Gy)的外周血淋巴细胞。1周后，以相同的方法进行第三次刺激。第三次刺激后1周收获培养的淋巴细胞。用以下两种细胞作靶细胞(1×104细胞)：表达本发明肿瘤抗原蛋白(亲环蛋白B)的HLA-A2402-阳性的EB病毒转化的B细胞系BEC-2和表达本发明肿瘤抗原蛋白的HLA-A2402-阴性的EB病毒转化的B细胞系Ban-B1，用ELISA监测上述淋巴细胞(8×104细胞)应答所述靶细胞时在培养基中产生的IFN-γ量。结果见表6。
表6
| 上清液中的IFN-γ(pg/ml) | ||
| 抗原肽 | BEC-2 | Ban-B1 |
| “84-92” | 383 | 38 |
| “84-92·2F-Y” | 489 | 63 |
| 无 | 245 | 74 |
用实施例6合成的“91-99”(SEQ ID NO：2)和实施例9合成的“91-99·2F-Y”(SEQ ID NO：40)以及上述“84-92”(SEQ ID NO：1)和“84-92·2F-Y”(SEQ ID NO：39)进一步进行类似于上述试验的另一个试验。结果见表7。
表7
| 上清液中的IFN-γ(pg/ml) | ||
| 抗原肽 | BEC-2 | Ban-B1 |
| “84-92” | 1896 | 160 |
| “84-92·2F-Y” | 710 | 46 |
| “91-99” | ＞2000 | 40 |
| “91-99·2F-Y” | 650 | 100 |
用“84-92”、“84-92·2F-Y”、“91-99”和“91-99·2F-Y”肽刺激的外周血淋巴细胞与HLA-A24-阳性BEC-2反应，但是不与HLA-A24-阴性细胞Ban-B1反应，说明成功诱导HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽特异性CTL。此外，与用“84-92”和“91-99”肽刺激的外周血淋巴细胞一样，用“84-92·2F-Y”和“91-99·2F-Y”肽刺激的外周血淋巴细胞与BEC-2反应，说明通过取代从原肽获得的衍生物具有类似于原肽的CTL诱导能力。
同样，可进行相似的试验，但是用HLA-A2402 cDNA(GenBank收录号M64740)的表达质粒导入其中而且用上述肽脉冲处理的COS-7细胞(ATCC号CRL1651)或VA-13细胞(RIKEN CELL BANK，TheInstitute of Physical and Chemical Research)代替在上述试验中使用的BEC-2，以及用HLA-A2402 cDNA的表达质粒导入其中但是没有用所述肽脉冲处理的COS-7或VA-13细胞代替在上述试验中使用的Ban-B1(J.Exp.Med.，187：277，1998)。
实施例11
合成亲环蛋白衍生的肽
因为上述实施例1-10表明亲环蛋白B是肿瘤抗原蛋白，所以本发明人还研究了已知为亲环蛋白B同系物的亲环蛋白A、C和D是否也具有这样的活性。
亲环蛋白A、C和D的氨基酸序列也已经公开(Biochemistry，3：8218，1994)。根据所述文献，选择并用Fmoc法合成了具有HLA-A24结合基元的3种肽，即包含亲环蛋白A氨基酸序列的位置59至位置67的序列的肽(SEQ ID NO：41，下文有时称为Cyp-A”59-67”)、包含亲环蛋白C氨基酸序列的位置89至位置97的序列的肽(SEQ ID NO：42，下文有时称为Cyp-C”89-97”)和包含亲环蛋白D氨基酸序列位置94至位置102的序列的肽(SEQ ID NO：43，下文有时称为Cyp-D”94-102”)。作为实例，Cyp-A”59-67”(SEQ ID NO：41)的合成及其结果如下所述。
在该合成中采用Fmoc-Phe-Alko树脂(0.67mmol/g，100-200目)作树脂。采用50mg该树脂，按照下述流程1(表8)开始合成，依次偶联以下残基：Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Gly-OH。偶联后，所述方案进行至流程1(表8)的步骤3，以获得肽树脂。
在该肽树脂中加入1ml试剂K(5％苯酚，5％苯硫基甲烷，5％H2O和2.5％乙二硫醇的TFA)，使其在室温下反应2.5小时。用冰冷却的同时，向该反应物中加入10ml乙醚，搅拌该混合物10分钟，过滤，然后用10ml乙醚洗涤。向该滤饼中加入10ml含水醋酸，搅拌该混合物30分钟。然后过滤树脂，用4mL含水醋酸洗涤。冻干滤液和洗涤液后，将获得的粗品肽溶解于含水醋酸中，并上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A SH-363-5(30Φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤柱，然后在60分钟内将乙晴浓度从0升高至15％并在240分钟内从15％升高至30％，以7ml/min的流速洗脱产物。以A 220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起并冻干获得9.7mg Gly-Phe-Met-Cys-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe。
用反相填料YMC-PACK ODS-AM AM303(4.6Φ×250mm)分析所获得的肽Gly-Phe-Met-Cys-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe，并用含0.1％TFA的18-48％乙晴线性浓度梯度证实其保留时间为18.8分钟。所述产物的氨基酸分析(Cys不能检测到)和质谱结果与理论值一致。
氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，10小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值标示于括号内。
Asx：0.99(1)
Glx：1.06(1)
Gly：2.96(3)
Met：0.99(1)
*Phe：2.00(2)
质谱(FAB)
[M+H]+：961
表8
流程1
| 步骤 | 处理时间(分钟)×处理次数 |
| 1.(洗涤)DMF 1.2ml2.(去保护)50％哌啶/DMF3.(洗涤)DMF 1.2ml4.(偶联)氨基保护的各氨基酸(5当量)/NMP溶液0.9ml，DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml5.(洗涤)DMF 1.2ml6.(偶联)氨基保护的各氨基酸(5当量)/NMP溶液0.9ml，DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml7.(洗涤)DMF 1.2ml | 1×212×11×730×11×230×11×4 |
实施例12
用亲环蛋白衍生的肽从外周血淋巴细胞诱导CTL
本发明人研究了用实施例11合成的3种肽是否能够从外周血淋巴细胞诱导抗原特异性CTL。采用Ficoll法从HLA-A基因座的A24杂合子的健康供者的外周血分离淋巴细胞。用上述肽以与实施例10所述相同的方法刺激所述淋巴细胞3次。第三次刺激后1周收获淋巴细胞，并用以下两种细胞作靶细胞：51Cr标记的HLA-A24-阳性的源自T细胞淋巴瘤的细胞系KOPT-K1和51Cr标记的HLA-A24-阴性的源自T细胞白血病的细胞系RPMI8402，按照D.D.Kharkevitch等(Int.J.Cancer，58：317(1994))所述方法检测其细胞毒性活性。结果见表9。
表9
| 对靶细胞的细胞毒性活性(％) | ||
| 刺激肽 | KOPT-K1 | RPMI8402 |
| Cyp-A”59-67” | 27 | 0 |
| Cyp-C”89-97” | 20 | 0 |
| Cyp-D”94-102” | 22 | 0 |
用Cyp-A“59-67”、Cyp-C“89-97”和Cyp-D“94-102”肽刺激的淋巴细胞与HLA-A24-阳性的KOPT-K1反应，但是不与HLA-A24-阴性的RPMI8402反应，说明成功诱导HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽特异性CTL。上述结果证实非亲环蛋白B的亲环蛋白也具有肿瘤抗原作用。
同样，可进行相似的试验，但是其中用实施例10结尾部分描述的重组细胞代替在此试验中采用的KOPT-K1和RPMI8402。
实施例13
用亲环蛋白从外周血淋巴细胞诱导CTL
参考文献(例如J.Immunol.，158：1796，1997和Cancer Res.，59：1184，1999)所述方法，用本发明亲环蛋白、其部分多肽、本发明亲环蛋白衍生的肿瘤抗原肽等对合适的细胞施以脉冲，以制备HLA抗原和亲环蛋白衍生的肿瘤抗原肽之间的复合物提呈于其上的抗原提呈细胞。通过用抗原提呈细胞确定是否从外周血淋巴细胞诱导抗原特异性CTL，能够证实所需要的抗原提呈细胞的成功制备。尽管以下描述表明其中使用健康供者的外周血的实例，但是仍然没有说明抗原提呈细胞也能够用肿瘤患者外周血以相似方法制得。
首先采用Ficoll方法从HLA-A24-阳性健康供者的外周血分离淋巴细胞。将该淋巴细胞于37℃在培养瓶中静置3小时，以去除非粘附细胞。在GM-CSF(2000U/ml)和IL-4(2000U/ml)存在下将粘附细胞培养7天，以诱导树突细胞，已知树突细胞的抗原提呈能力强。用10μg/ml本发明肿瘤抗原肽、或100μg/ml本发明肿瘤抗原蛋白(亲环蛋白)或其部分多肽于37℃培养所收获的树突细胞以进行脉冲处理，然后用X射线(5000rad)进行辐照。在24孔培养板中，将用上述肽或蛋白脉冲处理的树突细胞与用生物磁性分离珠(Dynal)从上述健康供体的外周血淋巴细胞制备的CD8+T细胞共培养，以进行抗原刺激。刺激后第二天加入IL-2(100U/ml)。用所述肽或蛋白脉冲处理的上述树突细胞以相同方式每周刺激T细胞(2-4次)。在最后一次刺激后1周，收获所培养的T细胞。用以下两种细胞作靶细胞：表达本发明肿瘤抗原蛋白的HLA-A2402-阳性的EB病毒转化的B细胞系BEC-2和表达本发明肿瘤抗原蛋白的HLA-A2402-阴性的EB病毒转化的B细胞系Ban-B1，通过用如实施例10的ELISA检测所述培养上清液中的IFN-γ量或检测对51Cr标记的靶细胞的细胞毒性活性，从而确定上述T细胞的反应性。诱导了抗原特异性CTL时，仅观测到对BEC-2的反应。通过进行上述试验，人们能够确定用本发明肿瘤抗原肽、肿瘤抗原蛋白等脉冲处理的抗原提呈细胞(树突细胞)是否具有诱导抗原特异性CTLs的活性。
同样，可进行相似的试验，其中HLA-A2402 cDNA(GenBank收录号M64740)的表达质粒已导入其中而且用本发明肿瘤抗原肽或肿瘤抗原蛋白脉冲处理的COS-7细胞(ATCC号CRL1651)或VA-13细胞(RIKEN CELL BANK，The Institute of Physical and ChemicalResearch)代替在上述试验中使用的BEC-2，以及HLA-A2402 cDNA的表达质粒已导入其中但是没有用上述肽等脉冲处理的COS-7或VA-13细胞代替上述试验中使用的Ban-B1(J. Exp.Med.，187：277，1998)。
序列表独立文本
在SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九个氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列中，第二个氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九个氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
工业适用性
按照本发明能够提供源自亲环蛋白的肿瘤抗原肽及其具有相同功能性质的衍生物，以及将这类肿瘤抗原肽、其衍生物、亲环蛋白多肽或它们的基因用于体内或体外治疗、预防或诊断肿瘤。
序列表
<110>ITOH，Kyogo；Sumitomo Pharmaceuticals Company，Limited
<120>得自亲环蛋白B的肿瘤抗原肽
<130>661366
<140>
<141>
<150>日本：98-178449
<151>25.06.98
<160>43
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Lys Phe His Arg Val Ile Lys Asp Phe
1 5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe
1 5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Gly Phe Gly Tyr Lys Asn Ser Lys Phe
1 5
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Gly Tyr Lys Asn Ser Lys Phe His Arg Val Ile
1 5 10
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>5
Asn Phe Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp
1 5 10
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
Ile Tyr Gly Glu Arg Phe Pro Asp Glu Asn Phe
1 5 10
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
Arg Phe Pro Asp Glu Asn Phe Lys Leu
1 5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
His Tyr Gly Pro Gly Trp Val Ser Met
1 5
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
Phe Phe Ile Thr Thr Val Lys Thr Ala Trp
1 5 10
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Ala Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe
1 5 10
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>11
Val Phe Gly Lys Val Leu Glu Gly Met
1 5
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>12
Lys Val Leu Leu Ala Ala Ala Leu
1 5
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>13
Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val
1 5 10
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu
1 5 10
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>15
Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu
1 5 10
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>16
Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu
1 5
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>17
Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu
1 5 10
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu Leu
1 5 10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Lys Val Thr Val Lys Val Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210>20
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Thr Val Lys Val Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>21
Asp Leu Arg Ile Gly Asp Glu Asp Val
1 5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>22
Asp Val Gly Arg Val Ile Phe Gly Leu
1 5
<210>23
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>23
Arg Val Ile Phe Gly Leu Phe Gly Lys Thr Val
1 5 10
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
Gly Leu Phe Gly Lys Thr Val Pro Lys Thr Val
1 5 10
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>25
Thr Val Pro Lys Thr Val Asp Asn Phe Val
1 5 10
<210>26
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>26
Thr Val Asp Asn Phe Val Ala Leu
1 5
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>27
Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val
1 5 10
<210>28
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>28
Ser Gln Phe Phe Ile Thr Thr Val
1 5
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>29
Phe Ile Thr Thr Val Lys Thr Ala Trp Leu
1 5 10
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>30
Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val
1 5
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>31
His Val Val Phe Gly Lys Val Leu
1 5
<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>32
Lys Val Leu Glu Gly Met Glu Val
1 5
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>33
Lys Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val
1 5
<210>34
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>34
Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val
1 5
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>35
Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val Arg Lys Val
1 5 10
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>36
Gly Met Glu Val Val Arg Lys Val
1 5
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变异体
<222>2
<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp.
<220>
<221>变异体
<222>9
<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。
<400>37
Lys Xaa His Arg Val Ile Lys Asp Xaa
1 5
<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变异体
<222>2
<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。
<220>
<221>变异体
<222>9
<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met.
Asp Xaa Met Ile Gln Gly Gly Asp Xaa
1 5
<400>38
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变异体
<400>39
Lys Tyr His Arg Val Ile Lys Asp Phe
1 5
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变异体
<400>40
Asp Tyr Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe
1 5
<210>41
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>41
Gly Phe Met Cys Gln Gly Gly Asp Phe
1 5
<210>42
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>42
Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Ile
1 5
<210>43
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>43
Thr Phe His Arg Val Ile Pro Ser Phe
1 5
Claims (21)
1.衍生自亲环蛋白的肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽选自包含SEQID NO：1-36或SEQ ID NO：41-43中的任一种所示氨基酸序列的序列，而且能够结合至HLA抗原并可被细胞毒性T淋巴细胞识别。
2.权利要求1的肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽选自包含SEQ IDNO：1或2所示氨基酸序列的序列。
3.肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含其中SEQ ID NO：1-36中任一种所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的氨基酸序列的序列，且所述肿瘤抗原肽衍生物能够结合至HLA抗原并可被细胞毒性T淋巴细胞识别。
4.权利要求3的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含其中SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的氨基酸序列的序列。
5.权利要求3的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含一种氨基酸序列的序列，在所述氨基酸序列中SEQ ID NO：1-11中任一种所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或所述C末端氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代。
6.权利要求3的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含一种氨基酸序列的序列，在所述氨基酸序列中SEQ ID NO：12-36中任一种所示氨基酸序列的位置2的氨基酸残基被亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或所述C末端氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代。
7.权利要求5的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含SEQ ID NO：37或38所示氨基酸序列的序列。
8.权利要求7的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含SEQ ID NO：39或40所示氨基酸序列的序列。
9.用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的至少一种选自权利要求1-8中任一项的肿瘤抗原肽及其衍生物的物质。
10.用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的亲环蛋白、权利要求1或2的肿瘤抗原肽、或编码所述亲环蛋白或肿瘤抗原肽的基因。
11.用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的亲环蛋白B、选自包含SEQ ID NO：1-36所示的任一氨基酸序列的序列且能够与HLA抗原结合并被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽、编码所述亲环蛋白B或肿瘤抗原肽的基因。
12.特异性结合至权利要求1-8中任一项的所述肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体。
13.一种抗原提呈细胞，其中HLA抗原和权利要求1-8中任一项的所述肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物提呈在从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞表面上。
14.HLA抗原和衍生自亲环蛋白的肿瘤抗原肽之间的复合物提呈于其上的抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞是通过使从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞与所述亲环蛋白、权利要求1的的肿瘤抗原肽、或编码所述亲环蛋白或肿瘤抗原肽的基因结合而制得。
15.HLA抗原和衍生自亲环蛋白B的肿瘤抗原肽之间的复合物提呈于其上的抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞是通过使从肿瘤患者分离的具有抗原提呈能力的细胞与亲环蛋白B、选自包含SEQ IDNO：1-36中所示任一氨基酸序列的序列的肿瘤抗原肽、或编码所述亲环蛋白B或肿瘤抗原肽的基因结合而制得。
16.用于治疗肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求13-15中任一项的抗原提呈细胞。
17.特异性识别HLA抗原和权利要求1-8中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的细胞毒性T淋巴细胞。
18.特异性识别HLA抗原和权利要求1-8中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合物的细胞毒性T淋巴细胞，所述复合物提呈在权利要求13-15中任一项的抗原提呈细胞上。
19.用于治疗肿瘤的药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求17或18的细胞毒性T淋巴细胞。
20.权利要求17的细胞毒性T淋巴细胞，其保藏号为FERMBP-6725。
21.包含作为活性成分的权利要求1-8中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的肿瘤诊断试剂。
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