KR100653590B1 - 시클로필린 ｂ 유래의 종양 항원 펩티드 - Google Patents
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Abstract
시클로필린으로부터 유래된 종양 항원 펩티드 또는 기능적으로 동일한 성질을 갖는 그의 유도체; 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체, 시클로필린 또는 그의 부분적 폴리펩티드, 또는 상기 시클로필린 또는 그의 부분적 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 활성 성분으로 함유하는 종양을 위한 치료제, 예방법, 또는 진단법; 종양의 치료를 위한 상기 물질의 시험관 내 용도; 및 시클로필린 또는 그의 유도체로부터 유래된 상기 종양 항원 펩티드에 대한 항체가 제공된다.
Description
본 발명은 시클로필린 및 동종체 물질로부터 유래된 신규한 종양 항원 펩티드에 관한 것이다. 보다 특히, 시클로필린 B 및 기능적으로 동일한 성질을 갖는 그의 유도체로부터 유래된 종양 항원 펩티드에 관한 것이며, 나아가 상기 종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 시클로필린 B 폴리펩티드, 또는 이들의 유전자를 생체 내 또는 시험관 내에서 이용하는 종양의 치료제, 예방법, 또는 진단법에 관한 것이다.
면역 체계, 특히 T 세포가, 생체의 종양 제거에 중요한 역할을 한다는 것이 공지되어 있다. 실제로, 인간 종양 병소에서 종양 세포에 대해 세포 독성을 나타내는 임파구의 침윤이 관찰되고 있으며 (Arch. Surg., 126:200, 1990), 자가 종양 세포를 인식하는 세포독성 T 임파구 (CTLs) 를 커다란 어려움 없이 흑색종에서 분리하고 있다 (Immunol. Today, 8:385, 1987; J. Immunol., 138:989, 1987; 및 Int. J. Cancer, 52:52, 1992). 또한, 자가 종양 세포를 인식하는 CTLs 의 이식에 의한 흑색종 임상 치료의 결과도 역시 종양 제거에서 T 세포의 중요성을 시사한다 (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994).
비록, 오랜 기간 자가 종양 세포를 공격하는 CTLs 의 표적 분자를 알아내지 못해왔으나, 면역학 및 분자 생물학 분야에서의 최근 진전으로 상기 표적 분자가 점차 밝혀지기 시작하였다. 특히, CTL 은 T 세포 수용체 (TCRs) 를 이용하여, 종양 항원 펩티드로 불리는 펩티드, 및 주조직적합 복합체 클래스 I 항원 (MHC 클래스 I 항원, 및 인간의 경우는 HLA 항원으로 불림) 간의 복합체를 인식함으로써 자가 종양 세포를 공격하는 것이 밝혀졌다.
종양 항원 펩티드는 종양 특이적 단백질, 즉, 세포 내에서 합성되는 단백질인 종양 항원 단백질이 프로테오좀을 거쳐 분해됨으로써 생성된다. 상기와 같이 생성된 종양 항원 펩티드는 소포체 내에서 MHC 클래스 I 항원 (HLA 항원) 에 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 세포 표면으로 수송되어 항원으로 제시된다. 종양-특이적 CTL 은 항원으로 제시된 복합체를 인식하여, 세포독성 작용 또는 림포킨의 생산을 통해 항-종양 효과를 나타낸다. 상기와 같은 일련의 작용을 밝혀낸 결과, 종양 환자 체내의 종양-특이적 CTLs 을 강화시키기 위한 소위 암 백신인 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 이용하여 종양을 치료하는 것이 가능해지고 있다.
종양 항원 단백질로써는, T. Boon 등이 1991 년에 최초로 인간 흑색종 세포로부터 MAGE 라 명명된 단백질을 규명하였다 (Science, 254:1643, 1991). 이어서, 수개의 추가적인 종양 항원 단백질이 주로 흑색종 세포로부터 확인되고 있다. 현재까지 밝혀진 흑색종 항원의 예로는 멜라닌세포성 조직-특이적 단백질, gp-100 (J. Exp. Med., 179:1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994), 및 티로시나아제 (J. Exp. Med., 178:489, 1993) 과 같은 멜라닌소체성 단백질, 흑색종뿐만 아니라 다양한 암 세포 및 정상 정소 세포에서도 발현되는 MEGE-관련 단백질 (J. Exp. Med., 179:921, 1994), 종양-특이적인 아미노산 돌연변이를 갖는 β-카테닌 (J. Exp. Med., 183:1185, 1996), 및 CDK4 (Science, 269:1281, 1995) 가 있다. 흑색종 유래의 것 이외에 종양 항원 단백질도 발견되고 있으며, HER2-neu (J. Exp. Med., 181:2109, 1995) 및 p53 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14704, 1996) 과 같은 종양유전자 산물, CEA (J. Natl. Cancer Inst., 87:982, 1995) 및 PSA (J. Natl. Cancer Inst., 89:293, 1997) 과 같은 종양 표지 및 HPV (J. Immunol., 154:5934, 1995) 및 EBV (Int. Immunol., 7:653, 1995) 와 같은 바이러스성 단백질 등이 포함된다. 상기에 관한 자세한 기술은 출판된 평론 (예. Immunol. Today, 18:267, 1997; J. Exp. Med., 183:725, 1996; 및 Curr. Opin. Immunol., 8:628, 1996) 에서 찾아볼 수 있다.
종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 종양의 치료 또는 진단에 적용하기 위해서는, 흑색종보다 고빈도로 발생하는 위암 또는 폐암과 같은 상피성 종양에 널리 사용될 수 있는 종양 항원을 규명하는 것이 중요하다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 식도암에서 유래된 편평 종양세포로부터 신규한 종양 항원 단백질을 코드하는 유전자의 클로닝을 수행하였으며, 흑색종 이외의 종양세포로부터 최초로 HLA 타입이 HLA-A24 또는 HLA-A26 인 HLA 항원에 결합하고 제시되는 수개의 종양 항원 펩티드를 규명하였다 (J. Exp. Med., 187:277, 1998; 국제 특허 공개공보 WO 97/46676).
상기 종양 항원 펩티드가 실제 임상에 적용되는 경우에는, 단일 펩티드만 사용하는 것보다 두개 이상의 상이한 종양 항원 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 모든 종양 세포가 동일한 종양 항원을 공통적으로 발현하지 않으며 단일 종양 세포 상에 두개 이상의 상이한 종양 항원 펩티드가 제시된다는 것을 고려하면, 두개 이상의 상이한 종양 항원 펩티드를 이용한 치료가 더 효과적일 것으로 여겨진다. 실제로, 흑색종의 경우, 종양 항원에서 유래된 단일 펩티드가 적절한 효과를 나타내지 못하므로 (Int. J. Cancer, 66:162, 1996; 및 Int. J. Cancer, 67:54, 1996), 두개 이상의 펩티드를 함유하는 혼합 배합물의 개발이 시도되고 있다. 이러한 상황하에서, 위암이나 폐암과 같은 고빈도로 발생하는 상피성 종양에서 널리 사용될 수 있는 신규 종양 항원 단백질 및 종양 항원 펩티드의 발견이 요청되고 있다.
본 발명은 시클로필린, 및 동종체 물질로부터 유래된 신규한 종양 항원 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 특히, 시클로필린 B 및 기능적으로 동일한 성질을 갖는 그의 유도체로부터 유래된 종양 항원 펩티드뿐만 아니라 종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 시클로필린 B 폴리펩티드, 또 이들의 유전자를 생체 내 또는 시험관 내에서 이용하는 종양의 치료제, 예방법, 진단법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 시클로필린 B-유래 종양 항원 펩티드는 일본인 및 백인(Caucasian)에서 고확률로 나타나는 HLA 항원인 HLA-A24 및 HLA-A2에 결합하고 이에 제시되는 종양 항원 펩티드를 포함하고, 이는 또한 폐암이나 방광암, 및 골육종 같은 상피성 종양 및 백혈병을 포함하는 다양한 범위의 종양 치료 또는 예방에 적용될 수 있는 종양 항원 펩티드이다. 따라서, 본 발명의 종양 항원 단백질인, 시클로필린 B, 및 이들의 유전자, 또는 시클로필린 B 로부터 유래된 종양 항원 펩티드는 신규한 항암 치료제로 유용할 것으로 기대된다.
신규 종양 항원 펩티드 및 상기 펩티드가 유래되는 종양 항원 단백질을 수득하기 위하여, 본 발명자들은 하기의 시도를 하였다.
폐 선암종 환자의 임파구로부터, 본 발명자들은 첫 번째로 HLA-A24 또는 HLA-A2-양성인 방광암, 폐암, 골육종, 또는 백혈병 세포주를 인식하는 CTL 세포주를 구축하였으며, 상기 세포주를 KG-CTL (수탁 번호: FERM BP-6725) 이라고 명명하였다.
다음으로, 상기 KG-CTL 이 강하게 반응하는 HT-1376 방광암 세포주로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, 재조합 플라스미드의 라이브러리 및 HLA-A2402 (HLA-A24의 한 타입) cDNA 를 포함하는 재조합 플라스미드를 COS-7 세포에 이중 전달이입하였다. 생성된 전달이입체들을 상기 KG-CTL 로 처리하고, KG-CTL 이 활성화되었는지 아닌지를 측정하기 위해 IFN-γ의 생산량을 측정하였다. 상기와 같은 선별과정을 반복적으로 수행한 결과, 본 발명자들은 마침내 종양 항원 단백질을 코드하는 유전자의 클로닝에 성공하였다. 유전자의 염기 서열분석으로 상기 종양 항원 단백질이 공지된 단백질인 시클로필린 B 와 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 사실이 밝혀졌다.
시클로필린 B 는 시클로스포린 A 와 같은 면역 억제제의 결합 단백질이며, 면역 세포의 활성화에 관여하는 것이 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 이전에는 상기물이 종양 항원으로서 기능한다는 것이 알려진 바 없었다.
이어서, 본 발명자들은 HLA-A24 및 HLA-A2 에 결합하고 제시되는, 시클로필린 B 의 아미노산 서열 중 종양 항원 펩티드 부위를 규명하였으며, 종양 항원 펩티드로써의 활성이 상기 펩티드 및 이들의 유도체에 존재함을 밝혀내었다.
나아가, 본 발명자들은 시클로필린 B 의 동종체, 시클로필린 A, C, 및 D 가 또한 시클로필린 B 와 유사한 종양 항원 펩티드 활성을 보유하고 있음을 밝혀내었다.
본 발명은 상기에 기술한 발견들에 기초하여 완성되었다.
따라서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
(1) 시클로필린으로부터 유래된 부분 펩티드이며, HLA 항원에 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 인식되는 종양 항원 펩티드, 또는 기능적으로 동일한 성질을 갖는 그의 유도체;
(2) 시클로필린 B 부분 펩티드이며, HLA 항원에 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 인식되는 종양 항원 펩티드, 또는 기능적으로 동일한 성질을 갖는 그의 유도체;
(3) 상기 (1) 또는 (2) 항에 있어서, HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2 인 종양 항원 펩티드, 또는 기능적으로 동일한 성질의 유도체;
(4) 상기 (3) 항에 있어서, 서열 번호: 1 - 36 또는 서열 번호: 41 - 43 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드, 또는 기능적으로 동일한 성질을 갖는 그의 유도체;
(5) 상기 (4) 항에 있어서, 서열 번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드, 또는 기능적으로 동일한 성질을 갖는 그의 유도체;
(6) 상기 (4) 항에 있어서, 서열 번호: 1 - 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체;
(7) 상기 (6) 항에 있어서, 서열 번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체;
(8) 상기 (6) 항에 있어서, 서열 번호: 1 - 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체;
(9) 상기 (6) 항에 있어서, 서열 번호: 12 - 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 발린, 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체;
(10) 상기 (8) 항에 있어서, 서열 번호: 37 또는 38 에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체;
(11) 상기 (10) 항에 있어서, 서열 번호: 39 또는 40 에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체;
(12) 상기 (1) 내지 (11) 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 및 이들의 유도체들로부터 선택된 물질을 하나 이상 활성 성분으로써 함유하는, 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물;
(13) 시클로필린, HLA 항원과 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드 부위를 포함하는 시클로필린의 부분 폴리펩티드, 또는 시클로필린 또는 이들의 부분 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 활성 성분으로써 함유하는, 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물;
(14) 시클로필린 B, HLA 항원과 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드 부위를 포함하는 시클로필린 B 의 부분 폴리펩티드, 또는 시클로필린 B 또는 이들의 부분 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 활성 성분으로써 함유하는, 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물;
(15) 상기 (1) 내지 (11) 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체에 특이적으로 결합하는 항체;
(16) HLA 항원 및 상기 (1) 내지 (11) 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체간의 복합체가 종양 환자로부터 분리된 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된 항원-제시 세포;
(17) 시클로필린, HLA 항원과 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드 부위를 포함하는 시클로필린의 부분 폴리펩티드, 또는 시클로필린 또는 이들의 부분 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 이입시켜 제작되는, HLA 항원 및 시클로필린으로부터 유래된 종양 항원 펩티드간의 복합체가 종양 환자로부터 분리된 항원-제시능을 갖는 세포에 제시되는 항원-제시 세포;
(18) 종양 환자로부터 분리된 항원-제시능을 갖는 세포에 시클로필린 B, HLA 항원과 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드 부위를 포함하는 시클로필린 B 의 부분 폴리펩티드, 또는 시클로필린 B 또는 이들의 부분 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 이입시켜 제조되는, HLA 항원 및 시클로필린 B 로부터 유래된 종양 항원 펩티드간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포;
(19) 상기 (16) 내지 (18) 항 중 어느 한 항에 따른 항원-제시 세포를 활성 성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물;
(20) HLA 항원 및 상기 (1) 내지 (11) 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구;
(21) 상기 (16) 내지 (18) 항 중 어느 한 항에 따른 항원-제시 세포에 제시되는, HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구;
(22) 상기 (20) 또는 (21) 항에 따른 세포독성 T 임파구를 활성 성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물;
(23) 수탁 번호가 FERM BP-6725 인 세포독성 T 임파구;
(24) 상기 (23) 항에 따른 KG-CTL의 이용을 포함하는, 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드의 규명 방법; 및
(25) 상기 (1) 내지 (11) 항 중 어느 한 항에 따르는 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 활성 성분으로 함유하는 종양의 진단 시약.
본 발명은 시클로필린이라 불리는 물질이 종양 항원 단백질로써의 활성을 가지고 있다는 초기 증거에 근거한다. 본 발명의 구현예로서 시클로필린 B 에 관하여 본 발명을 하기에서 자세히 기술할 것이나, 하기의 기술은 시클로필린 B 에만 국한되지 않으며, 다른 공지된 시클로필린, 즉, 시클로필린 A, C, 및 D 와도 관련된다 (Biochemistry, 3, 8218, 1994).
본 발명에서, "종양 항원 펩티드" 라는 용어는 시클로필린 B 의 일부를 함유하며 HLA 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 부분적 펩티드를 언급한다. 따라서, WWW 엔트레쯔 데이타베이스 (WWW Entrez database) 에 유전자은행 기탁 번호 (GenBank Accession No.) M60857 로 등록되고 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:1903-1907, 1991] 에 기술된, 인간 시클로필린 B 의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 펩티드인 한, 시클로필린의 아미노산 서열에서의 길이나 위치와는 상관없이, 어떠한 펩티드라도 본 발명의 종양 항원 펩티드의 범주에 속하고, 상기 펩티드 및 HLA 항원간의 복합체는 CTL 에 의해 인식될 수 있다. 본 발명의 종양 항원 펩티드는 시클로필린 B 의 일부분을 함유하는 후보 펩티드를 합성하고 후보 펩티드 및 HLA 항원간의 복합체가 CTL 에 의해 인식되는지를, 다시 말하면, 후보 펩티드가 종양 항원 펩티드로써의 활성을 갖는지 여부를 확인하는 분석을 수행함으로써 규명될 수 있다.
이와 관련하여, 펩티드의 합성은 펩티드 화학에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행할 수 있다. 이러한 공지된 방법의 예로는 문헌 ["Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; 및 "Iyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, vol. 14, Peputido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991] 에서 기술된 것들이 있다.
본 발명의 종양 항원 펩티드를 규명하기 위한 방법은 하기에 자세히 기술되었다.
하기의 HLA 타입에 결합하고 제시되는 항원 펩티드 각각의 서열 규칙 (모티프) 이 공지되어 있다; HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, 및 -Cw0602 (참조, 예, Immunogenetics, 41:178, 1995). HLA-A24 에 대한 모티프에 관해서는, 예를 들면, 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열에서, 위치 2 의 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이고, 및 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이라는 것이 공지되어 있다 (J. Immunol., 152:3913, 1994; Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4307, 1994). 마찬가지로, 하기 표 1에서 보이는 모티프들은 HLA-A2 에 대해 공지된 것이다 (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4749, 1995).
| HLA-A2 타입 | N-말단에서 두번째 위치의 아미노산 | C-말단의 아미노산 |
| HLA-A0201 | L,M | V,L |
| HLA-A0204 | L | L |
| HLA-A0205 | V,L,I,M | L |
| HLA-A0206 | V,Q | V,L |
| HLA-A0207 | L | L |
(펩티드는 8 내지 11 아미노산 길이임)
다양한 HLA 분자에 결합한 항원 펩티드를 분석함으로써 (Immunogenetics, 41:178, 1995), 비록 HLA-DR, -DP, 및 -DQ 에서 14 개 이상의 아미노산 길이의 항원 펩티드가 관찰되기는 하지만 펩티드의 길이는 통상적으로 약 8 내지 14 개의 아미노산 길이라는 것이 밝혀졌다.
시클로필린 B 의 아미노산 서열로부터 상기와 같은 모티프에 관여하는 펩티드 부위를 선택하는 것은 용이하다. 즉, 상기 모티프 구조에 관여하는 펩티드 부위는 시클로필린 B 의 아미노산 서열을 조사함으로써 용이하게 선택할 수 있는 것이다. 본 발명의 종양 항원 펩티드는 상기에 기술된 방법에 따라 선택된 후보 펩티드를 합성하고, 후보 펩티드 및 HLA 항원간의 복합체가 CTL 에 의해 인식되는지 여부를, 다시 말하면, 후보 펩티드가 종양 항원 펩티드로써의 활성을 갖는지 여부를 확인하는 분석을 수행함으로써 규명될 수 있다.
본 발명의 종양 항원 펩티드를 규명하는 방법의 특정한 예로는 문헌 [J. Immunol., 154:2257, 1995] 에 기술된 방법이 있다. 구체적으로, 후보 펩티드를 제시할 것으로 추정되는 HLA 항원 타입에 양성인 인간으로부터 말초 혈액 임파구를 분리하고, 시험관 내에서 후보 펩티드를 첨가하여 자극하였다. 만약 후보물질이 후보 펩티드로 펄스된 HLA-항원-제시 세포를 특이적으로 인식하는 CTL 을 유도한다면, 후보 펩티드는 종양 항원 펩티드로 기능할 수 있을 것임을 나타낸다. 이와 관련하여, CTL 유도의 존재 또는 부재는, 예를 들어, 항원 펩티드-제시 세포에 반응하는 CTL 에 의해 생산된 다양한 사이토카인 (예, IFN-γ) 의 양을, 예를 들어, ELISA 방법을 사용하여 측정함으로써 검출될 수 있다. 이와는 달리, 51Cr 으로 표지된 항원 펩티드-제시 세포에 대한 CTL 의 세포독성을 측정하는 방법도 상기의 검출을 위해 이용할 수 있다 (51Cr 분비 분석법, Int. J. Cancer, 58:317, 1994).
나아가, 상기 검출은 또한 하기와 같이 달성될 수 있다. 후보 펩티드를 제시할 것으로 추정되는 타입의 HLA 항원 cDNA 를 발현하는 발현용 플라스미드를, 예를 들어, COS-7 세포 (ATCC 번호. CRL1651) 또는 VA-13 세포 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 에 이입하고, 생성된 세포는 후보 펩티드로 펄스를 준다. 세포를 이어서 상기에 기술한 바와 같이 CTL 로 처리하고, 이 CTL 에 의해 생산된 다양한 사이토카인 (예, IFN-γ) 의 양을 측정한다 (J. Exp. Med., 187:277, 1998).
상기에 기술된 다양한 분석법의 구체적인 예는 하기 실시예 7, 10, 및 12 에서 예시된다.
시클로필린 B 는 HLA-A24- 또는 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드 부위를 포함한다. HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드를 규명하기 위해서는, HLA 항원을 코드하는 cDNA 로서, HLA-A24 cDNA (Cancer Res., 55:4248-4252, 유전자은행 기탁 번호. M64740) 를, 인간 말초 혈액 임파구 또는 KG-CTL (FERM BP-6725) 의 펩티드-자극에 의해 제조된 CTL 과 함께 사용할 수 있다. 마찬가지로, HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드를 위해서는, HLA-A2 cDNA (유전자은행 기탁 번호. M84379) 를 사용하는 것을 제외하고는 상기에 기술된 것과 유사한 방식으로 종양 항원 펩티드의 발견을 달성할 수 있다.
서열 규칙 (모티프) 가 밝혀진 상기의 경우와는 별개로, HLA-A26 과 같이 적합한 펩티드 모티프가 밝혀지지 않은 경우, 본 발명의 종양 항원 펩티드는, 예를 들어, WO 97/46676 에 기술된 방법에 따라, HLA-A26 과 종양 항원 펩티드간의 복합체를 인식하는 CTL 세포주를 이용할 수 있다면, 규명할 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같은 종양 항원 펩티드의 규명 방법은 이후 총체적으로 "종양 항원 펩티드의 분석 방법" 으로 언급할 수 있다.
상기에 기술한 바와 같이, HLA-A24 에 결합하고 제시되는 종양 항원 펩티드의 서열은 특정 규칙 (모티프) 을 따르며, 특히, 상기 모티프는, 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열에서, 위치 2 의 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이며, C-말단의 아미노산 잔기는 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이라는 것이 공지되어 있다 (J. Immunol., 152:3913, 1994; Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4307, 1994). 마찬가지로, HLA-A2 에 결합하고 제시되는 종양 항원 펩티드의 서열에서도 비슷한 규칙 (모티프) 을 규명할 수 있으며, 특히, 상기 표 1 에서 보여진 모티프가 공지되어 있다 (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4749, 1995). 따라서, 본 발명의 종양 항원 펩티드 중에서, HLA-A24- 및 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드는 시클로필린 B 의 아미노산 서열에서 상기의 모티프 구조에 관여하는 부분 펩티드이며, 각각의 HLA 항원에 결합할 수 있고, CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드에 의해 예시되었다.
상기에서 기술한 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드의 특정한 예로는 서열 번호: 1 내지 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고 HLA-A24 항원에 결합할 수 있으며 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드가 있다. 마찬가지로, HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드의 특정한 예로는 서열 번호: 12 내지 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고 HLA-A2 항원에 결합할 수 있으며 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드가 있다.
따라서, 본 발명의 종양 항원 펩티드의 예로는 하기가 포함된다:
1) 서열 번호 1 내지 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 펩티드,
2) 서열 번호 1 내지 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전체 길이를 포함하고 상기 아미노산 서열과 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단 방향으로 연장된 펩티드, 또는 서열 번호 1 내지 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 연속된 부위로 구성되는 펩티드로, 상기 펩티드는 각각의 HLA 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식된다. 이와 관련해서, 상기 2) 의 펩티드는 상응하는 HLA 항원에 결합하고 제시된다는 점에서 약 8 내지 11 개의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명의 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드의 적합한 예로는 서열 번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산의 전부 또는 일부를 포함하며, HLA-A24 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드들이 포함된다. 따라서, 예는 하기와 같다:
1) 서열 번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 펩티드,
2) 서열 번호 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열의 전체 길이를 포함하고 상기 아미노산 서열과 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단 방향이 연장된 펩티드, 또는 서열 번호 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열의 연속된 부위로 구성되는 펩티드로, 상기 펩티드는 HLA-A24 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식된다. 이와 관련해서, 상기 2) 의 펩티드는 HLA-A24 항원에 결합하고 제시된다는 점에서 8 내지 11 개 가량의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명에서, "종양 항원 펩티드와 기능적으로 동일한 성질을 갖는 유도체" 라는 용어 (이하 종양 항원 펩티드 유도체로 약칭함) 는 본 발명의 종양 항원 펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상, 바람직하게는 하나 내지 수개의 아미노산 잔기가 변경되고, HLA 항원에 결합할 수 있으며 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드로서의 성질을 갖는, 변경된 펩티드를 언급한다. 따라서, 본 발명의 종양 항원 펩티드의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 변경을 포함하고, 종양 항원 펩티드의 성질을 갖는, 즉 HLA 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 한, 모든 변경된 펩티드는 본 발명의 종양 항원 펩티드의 범주에 속한다.
이와 관련해서, 아미노산 잔기의 "변경" 이라함은 아미노산 잔기의 치환, 삭제 및/또는 추가 (펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단으로의 아미노산 추가를 포함) 를 뜻하며, 아미노산 잔기의 치환이 바람직하다. 아미노산 잔기의 치환에 연관된 변경은, 종양 항원 펩티드로써의 활성이 유지되는 한, 치환할 아미노산 잔기의 수와 위치를 임의로 결정할 수 있으나, 상기에 기술한 바와 같이 종양 항원 펩티드가 통상적으로 약 8 내지 14 개의 아미노산 길이이므로 한개 내지 수개의 아미노산이 치환되는 것이 바람직하다.
본 발명의 종양 항원 펩티드 유도체의 바람직한 길이는 상기에 기술된 종양 항원 펩티드의 경우와 마찬가지로 약 8 내지 14 개의 아미노산이나, HLA-DR, -DP, 및 -DQ 를 위해서는 14 개 이상의 아미노산 길이인 유도체도 가능하다.
본 발명의 상기 종양 항원 펩티드 유도체는 펩티드의 상기 제조방법에 따라 본 발명의 종양 항원 펩티드의 일부 변경을 포함하는 변경된 펩티드를 합성하고, 종양 항원 펩티드를 위한 상기 분석법을 수행함으로써 규명될 수 있다.
상기에 기술한 바와 같이, HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, 및 -Cw0602 와 같은 HLA 타입에 결합하고 제시되는 펩티드의 서열 규칙 (모티프) 은 밝혀져 있다. 결과적으로, 본 발명의 종양 항원 펩티드에서 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체들은 상기 모티프에 근거하여 제조될 수 있다.
예를 들면, HLA-A24 에 결합하고 제시되는 항원 펩티드의 모티프에 관해서는, 상기에 기술한 바와 같이 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열에서, 위치 2 의 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이고, C-말단의 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이라는 것이 공지되어 있다 (J. Immunol., 152:3913, 1994; Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4307, 1994). 마찬가지로, 상기 표 1 에서 보이는 모티프들은 HLA-A2 에 대해 공지된 것이다. 또한, 모티프에 따르는 아미노산과 유사한 성질을 갖는 아미노산 잔기도 허용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 모티프에 따라 치환이 허용될 수 있는 어떠한 위치 (HLA-A24 및 HLA-A2 는 위치 2 및 C-말단) 에 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 구성된 펩티드 유도체가 포함되며, 상기 유도체는 HLA 항원에 결합하고 활성을 가지며 CTL 에 의해 인식된다. 이러한 종양 항원 펩티드 유도체의 바람직한 예로는 아미노산 잔기의 치환이 상기 모티프에 따른 위치에서의 아미노산 잔기의 치환으로부터 선택된 아미노산 서열의 전부 또는 부분을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 이 유도체는 상기 활성을 갖는다. 아미노산 서열의 "전부 또는 일부" 의 바람직한 길이는 HLA-DR, -DP, 및 -DQ 를 위해서는 14 개 이상의 아미노산 길이도 가능하다해도 약 8 내지 14 개의 아미노산이다.
HLA-A24- 또는 HLA-A2- 제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 HLA-A24- 또는 HLA-A2- 에 대한 결합 모티프를 갖는 시클로필린 B 의 아미노산 서열로부터 유래된 펩티드에서, 상기 모티프에 의거하여 치환이 허용되는 위치, 특히, 위치 2 및/또는 C-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 구성된 펩티드 유도체가 포함되며, 본 유도체는 상기 활성을 갖는다. 바람직한 예로는 위치 2 및/또는 C-말단의 아미노산이 상기 모티프에 따른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 본 유도체는 상기 활성을 갖는다. 이러한 HLA-A24- 또는 HLA-A2- 제한적인 종양 항원 펩티드 유도체에서, 아미노산 서열의 "전부 또는 일부" 의 바람직한 길이는 8 내지 11 가량의 아미노산이다.
특히, 예로는 서열 번호: 1 내지 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 위치 2 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 이 유도체는 상기 활성을 지닌다. 바람직한 예로는 서열 번호: 1 내지 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 위치 2 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 상기 모티프에 따른 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다. 구체적으로, HLA-A24- 제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 서열 번호: 1 내지 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 위치 2 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다. 마찬가지로, HLA-A2- 제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 서열 번호: 12 내지 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 위치 2 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다.
본 발명의 HLA-A24- 제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 적합한 예로는 서열 번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열의 위치 2 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다. 더욱 바람직한 예로는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 모티프에 따라 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부, 즉, 서열 번호: 37 또는 38 에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다. 이러한 종양 항원 펩티드 유도체의 적합한 예는 서열 번호: 39 및 40 에서 보여진다.
나아가, 상기에 기술한 바와 같이, 상기에 기재된 시클로필린 B 이외에도 시클로필린 B 의 동종체, 시클로필린 A, C, 및 D, 또한 종양 항원 펩티드를 생성하는 종양 항원 단백질이다. 이러한 종양 항원 펩티드의 구체적인 예로는 서열 번호: 41 (시클로필린 A), 서열 번호: 42 (시클로필린 C), 및 서열 번호: 43 (시클로필린 D) 와 같은 HLA-A24- 제한적인 종양 항원 펩티드가 포함된다.
본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체는 하기와 같이 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에 사용될 수 있다.
종양의 치료 또는 예방을 위한 목적으로 사용 시에는 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체의 최소한 하나 이상, 또는 두개 이상의 조합을, 필요하다면 다른 종양 항원 펩티드와 같은 다른 제제와 조합하여, 환자에게 투여한다. 종양의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 활성 성분으로 함유하는 조성물을 시클로필린 B-양성 환자에 투여시에는, 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체가 HLA 항원과 함께 항원-제시 세포에 고밀도로 제시되며, 따라서, 제시된 HLA 항원 복합체에 특이적인 CTL 이 증식하여 종양 세포를 사멸시킨다. 그 결과, 환자의 종양이 치료될 수 있거나, 또는 종양의 증식 또는 전이가 예방될 수 있다. 나아가, 종양의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 활성 성분으로 함유하는 조성물은 화학치료 또는 방사선치료와 복합적으로 사용하여 치료 효과의 상승을 달성할 수 있다.
종양의 치료 및 예방을 위해 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 활성 성분으로 함유하는 조성물은 세포성 면역을 효과적으로 확립하기 위해 보강제(adjuvant)와 함께 투여하거나, 또는 미립자 제형으로 투여될 수 있다. 상기의 목적을 위해, 문헌 (Clin. Microbio. Rev., 7:277-289, 1994) 에 기술된 보강제를 이용할 수 있다. 또한, 리포좀 제제, 지름이 수 ㎛ 인 비드에 성분을 결합시킨 미립자 제제, 또는 지질에 성분을 결합시킨 제제가 또한 가능하다. 투여는 예를 들어, 피부내, 피하, 또는 정맥 주사를 통해 수행할 수 있다. 투여될 제형물 내에서 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체의 양은, 예를 들어 치료할 질병, 특정 환자의 연령 및 체중 등에 따라 적절하게 조정할 수 있지만, 수일마다 내지 수개월마다 일반적으로 0.0001 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.001 mg 내지 1000 mg, 및 더 바람직하게는 0.1 mg 내지 10 mg 을 투여한다.
나아가, 본 발명의 종양 항원 펩티드가 유래된 시클로필린 B 단백질 또는 상기 시클로필린 B 를 코드하는 유전자도 또한 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에 사용할 수 있다. 전체 길이의 시클로필린 B 또는 전체 길이의 이들 유전자뿐만 아니라, 그의 어느 부분, 함께 연결된 상기 부분, 또는 염기나 아미노산 서열에 변경을 포함하는 것들도, HLA 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 펩티드 부위를 하나 이상 함유하는 한, 의도하는 종양의 치료 또는 예방을 달성할 수 있다. 이와 관련해서, "HLA 항원에 결합할 수 있고, CTL 에 의해 인식되는 펩티드 부위를 하나 이상 포함하는 물질들은 이후로 "부분적 폴리펩티드" 로 언급한다.
시클로필린 B 단백질 또는 이들의 부분적 폴리펩티드가 종양의 치료 또는 예방을 위한 조성물로 적용될 시에는, 상기 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체와 유사한 제형, 투여 방식, 및 투여량으로 적용될 수 있다. 종양 환자에게 투여되면, 시클로필린 B 단백질 또는 이들의 부분적 펩티드는 항원-제시 세포로 이입되며, 뒤이어 세포내 분해에 의해 생성되는 종양 항원 펩티드가 HLA 항원과 결합하여 복합체를 형성한다. 복합체는 항원-제시 세포의 표면에 고밀도로 제시되며, 제시된 복합체에 특이적인 CTL 들이 체내에서 효율적으로 증식하여 종양 세포를 사멸시킨다. 이러한 방식으로, 종양의 치료 및 예방이 달성된다.
종양의 치료 및 예방을 위한 조성물에 시클로필린 B 또는 이들의 부분적 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 적용하기 위해서는, 하기의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 유전자를 세포로 투여 및 이입시키는 것은 바이러스성 벡터 또는 다른 방식 (Nikkei-Science, 4 월, 1994, pp. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(5), 1994, 및 상기에서 인용된 문헌) 중 어느 하 나에 의해서도 달성될 수 있다.
바이러스성 벡터를 사용하는 방법의 예로는 본 발명의 DNA 를 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 또는 신드비스 바이러스와 같은 DNA 또는 RNA 바이러스에 삽입하여, 세포에 이입하는 방법이 포함된다. 상기 방법 중, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 백시니아 바이러스를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
다른 방법에는 발현용 플라스미드가 직접 근육 주사되는 방법 (DNA 예방접종), 리포좀 방법, 리포펙틴 방법, 미소주사법, 인산 칼슘 방법, 및 일렉트로포레이션이 포함되며, DNA 예방접종 및 리포좀 방법이 특히 바람직하다.
본 발명의 유전자가 실제 약물로 작용할 수 있게 하기 위해서는, 두 가지 방법중 하나를 사용할 수 있다: DNA 를 체내로 직접 이입하는 생체 내 방법, 또는 인간에서 특정 세포를 제거하고, 다음으로 상기 세포에 DNA 를 체외에서 주입하여, 세포를 체내에 재주입하는 생체 외(ex vivo) 방법 (Nikkei-Science, 4 월, 1994, pp. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(15), 1994; 및 상기에서 인용된 문헌). 생체 내 방법이 더 바람직하다.
생체 내 방법의 경우, 유전자는 치료할 질병 및 증상, 및 다른 요인들에 의거하여 어떠한 적절한 방식에 의해서 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥, 동맥, 피하, 피부내, 또는 근육내 경로로 투여할 수 있다. 생체 내 방법의 경우, 조성물은 용액과 같은 다양한 투여 형태로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 DNA 를 활성 성분으로 포함하고, 필요하다면 통상적인 담체를 첨가한, 주사 형태로 전형적으로 제조된다. 만약 본 발명의 유전자가 리포좀 또는 세포막-융합 리포좀 (예컨대, 센다이 바이러스 (HVJ)-리포좀) 에 함유된다면, 조성물은 현탁액, 동결 약물, 원심분리-농축된 동결 약물 등과 같은 리포좀 제제의 형태일 수 있다.
상기 제형물 내에서 본 발명의 유전자량은 치료할 질병, 환자의 연령과 체중 등에 따라 달라질 수 있지만, 본 발명의 유전자를 수일마다 내지 수개월마다 일반적으로 0.0001 - 100 mg, 바람직하게는 0.001 - 10 mg 으로 투여한다.
본 발명의 유전자를 상기와 같이 투여함으로써, 종양 항원 세포가 항원-제시 세포에서 고발현 된다. 이어서 세포내 분해과정에 의해 생성된 종양 항원 펩티드는 HLA 항원에 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 세포 표면에 밀도 높게 제시된다. 그 결과로, 상기 복합체에 특이적인 CTL 이 체내에서 효율적으로 증식하고, 종양 세포를 사멸시킨다. 이렇게 하여, 종양의 증식 또는 전이에 대한 치료 또는 예방이 달성된다.
상기에서 기술된 바와 같이 약물로써 사용 가능한 시클로필린 B, 이들의 부분적 폴리펩티드, 및 상기물을 코드하는 유전자는 하기와 같이 제조될 수 있다. 시클로필린 B 를 코드하는 유전자는, WWW 엔트레쯔 데이타베이스 검색에서 규명되는 유전자은행 기탁 번호 M60857 로 등록된 인간 시클로필린 cDNA 염기서열을 근거로 적절한 PCR 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머를 이용해 문헌 ["Molecular Cloning", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 와 같은 표준 참고서의 기술에 따라 PCR 을 수행함으로써 용이하게 클로닝될 수 있다. 상기 목적을 위해서, 시클로필린 B 의 클로닝에 관련된 문헌인 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:1903, 1991] 을 참고할 수도 있다. 나아가, 시판되는 시클로필린 B 의 cDNA 클론 (ATCC 번호. 107758, 명칭: HTNAQ10) 을 사용할 수도 있다. 원할경우, 앞서 언급한 ["Molecular Cloning"] 표준 참고서에 따라 용이하게 변경시킬 수도 있다. 나아가, 클로닝된 인간 시클로필린 B 를 코드하는 유전자를 이용하고 많은 문헌과 상기 ["Molecular Cloning"] 과 같은 참고서를 참조하여 시클로필린 B 단백질의 발현을 달성할 수 있다. 숙주 세포에서 복제하고 기능하는 발현용 벡터는 발현시킬 DNA 를 적절한 벡터 (예, pSV-SPORT1) 에 도입시키고, 몇몇 경우에는 DNA 의 상류에 전사를 조절하는 프로모터 서열 (예, trp, lac, T7, 또는 SV40 초기 프로모터) 과 같은 조절 서열을 첨가함으로써 구축될 수 있다. 발현용 플라스미드를 이어서 적절한 숙주세포로 주입하여 형질전환체를 수득한다. 숙주 세포의 예로는 예를 들어, 대장균과 같은 원핵생물, 효모와 같은 단세포성 진핵생물, 및 곤충이나 동물과 같은 다세포성 진핵생물로부터 유래된 세포가 포함된다. 숙주 세포로의 유전자 이입은 인산 칼슘 방법, DEAE-덱스트란 방법, 전기 펄스 방법 등을 통해 달성될 수 있다. 적절한 배지에서 배양된 형질전환체는 원하는 단백질을 생산한다. 이렇게 수득된 종양 항원 단백질은 표준 생화학적 방법에 따라 분리되고 정제될 수 있다.
상기와 같이 제조된 시클로필린 B 단백질, 이들의 부분적 폴리펩티드, 또는 상기물을 코드하는 유전자가 종양 항원으로써의 활성을 갖는지 여부, 즉 상기 단백질이 세포내 분해과정에 의해, HLA 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드를 생성하는지의 여부를, 예를 들어, 하기와 같은 유전자 발현을 이용한 방법으로 결정할 수 있다.
첫 번째로, 후보 유전자 또는 유전자 절편을 포함하는 발현용 플라스미드 및 HLA 항원을 코드하는 DNA 를 포함하는 발현용 플라스미드를 아프리카산 녹색 원숭이 신장으로부터 유래된 COS-7 (ATCC CRL 1651), 또는 섬유모세포 VA-13 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 와 같이 종양 항원 단백질을 발현하지 않는 세포에 이중 전달이입한다. 전달이입은 예를 들어, 리포펙타민 시약 (Gibco BRL) 을 사용하는 리포펙틴 방법에 의해 수행될 수 있다. 이어서, 사용한 특정 HLA 항원에 제한적인 종양-반응성 CTL 을 첨가하고, 전달이입체들에 작용하도록 하며, 이어서 표적 세포에 대한 반응으로 상기 CTL 이 생산한 다양한 사이토카인 (예, IFN-γ)의 양을, 예를 들어, ELISA 로 측정함으로써, 후보 유전자가 종양 항원 단백질을 코드하는지 여부를 결정한다. 시클로필린 B 는 HLA-A24- 또는 HLA-A2- 제한적인 종양 항원 펩티드 부위를 포함하므로, 예를 들어 HLA-A24 cDNA (Cancer Res., 55:4248-4252 (1995); 유전자은행 기탁 번호. M64740) 또는 HLA-A2 cDNA (유전자은행 기탁 번호. M84379) 를 상기 HLA 항원을 코드하는 DNA 로 사용할 수 있으며, 인간 말초 혈액 임파구에서 제조한 CTL 뿐만 아니라 KG-CTL (FERM BP-6725) 도 상기 CTL 로써 사용할 수 있다.
상기 활성 측정의 구체적인 예는 하기 실시예 2 에서 기술된다.
본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체에 특이적으로 결합하는 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 상기 항체들은 예를 들어, 문헌 ["Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H. D. 등. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989] 에서 기술된 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 자세하게는, 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 인식하는 항체 및 나아가 상기물의 활성을 중화시키는 항체는 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 통상적인 방법으로 동물에서 적절하게 면역화시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 상기 항체들은 친화도 크로마토그래피, 면역학적 진단법 등에 사용될 수 있다.
상기 항체를 이용한 종양 유무의 면역학적 진단법은 첫 번째로 상기 항체를 필요한 만큼 표지하고, 이를 종양의 보유가 의심되는 환자에게서 수득한 표본 (예를 들어 혈액, 종양 조직) 에서 항원의 존재를 검출하는데 사용함으로써 수행할 수 있다. 특히, 상기의 면역학적 진단법은 면역블롯팅, 방사면역측정법 (RIA), 효소 면역측정법(ELISA), 형광 또는 발광 분석법 등으로부터 유용하게 선택될 수 있다.
본 발명의 종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 종양 항원 단백질 (시클로필린 B), 또는 그들의 유전자는 종양 환자의 치료를 위해 시험관 내에서 하기와 같이 사용될 수 있다.
종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 종양 항원 단백질, 또는 그들의 유전자를 종양의 치료에 사용시, 환자의 체내에 특이적인 CTL 을 효율적으로 유도하는 투여 방법을 확립하는 것이 중요하다. 이를 위한 한가지 방법으로, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체간의 복합체가 종양 환자에서 분리된 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시되는, 항원-제시 세포를 제공하며, 또한 종양의 치료를 위해 상기 항원-제시 세포를 활성 성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
이와 관련해서, "항원-제시능을 갖는 세포" 는 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 제시할 수 있는 HLA 항원을 세포 표면에 발현하는 세포인 한 특별히 제한되지 않으며, 특별히 높은 항원-제시능을 갖는다고 보고된 가지세포(dendritic cell)가 바람직하다. 항원-제시능을 갖는 상기-언급된 세포로부터 본 발명의 항원-제시 세포를 제조하기 위해 첨가해야 할 물질로는 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체뿐만 아니라, 종양 항원 단백질, 시클로필린 B, 및 이들의 유전자도 될 수 있다. 본 발명의 항원-제시 세포를 제조하기 위해서는, 전체길이의 시클로필린 B 및 이들 유전자 뿐만 아니라 상기물의 부분적 폴리펩티드 및 이들의 유전자도 사용할 수 있다. 단백질 또는 유전자의 형태로 사용할 경우, 세포내로 이입되는 것이 필요하다. 이에 관해서는, 유전자 또는 단백질을 활성 성분으로 함유하는 종양의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 상기 기술을 참조한다.
본 발명의 항원-제시 세포를 제조하기 위해서는, 종양 환자로부터 항원-제시능을 갖는 세포를 분리하고, HLA 항원과 상기 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체간의 복합체를 형성하도록 생체 밖에서 본 발명의 종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 종양 항원 단백질, 또는 이들의 부분적 폴리펩티드로 펄스를 준다 (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998; J. Immunol. 158:1796, 1997; Cancer Res., 59:1184, 1999). 가지세포의 사용시, 본 발명의 항원-제시 세포는 예를 들어, Ficoll 방법을 이용하여 종양 환자의 말초 혈액에서 임파구를 분리하고, 비유착성 세포를 제거하고, 가지세포를 유도하기 위해 유착성 세포를 GM-CSF 및 IL-4 존재하에서 배양하고, 본 발명의 종양 항원 펩티드, 종양 항원 단백질 등으로 상기 가지세포를 배양, 펄스 자극함으로써 제조될 수 있다. 자세한 사항은, 실시예 13 을 참조한다.
본 발명의 항원-제시 세포를 본 발명의 종양 항원 단백질 또는 이들의 부분적 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 항원-제시능을 갖는 상기 언급된 세포에 이입함으로써 제조하는 경우에는, 상기 유전자는 DNA 또는 RNA 의 형태일 수 있다. 특히, DNA 는 예를 들어, 문헌 [Cancer Res., 56: 5672, 1996 또는 J. Immunol., 161:5607, 1998] 을 참고하여 사용할 수 있고, 및 RNA 는 예를 들어, 문헌 [J. Exp. Med., 184:465, 1996] 을 참고하여 사용할 수 있다.
상기 항원-제시 세포를 활성 성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물은 항원 제시 세포를 안정적으로 유지하기 위해 바람직하게는 생리적 식염수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 배지 등을 포함한다. 이는, 예를 들어, 정맥 내, 피하, 또는 피부내 투여될 수 있다. 종양의 치료를 위해 항원-제시 세포를 활성 성분으로 함유하는 상기와 같은 조성물을 환자의 체내로 재주입함으로써, 종양의 치료를 달성하기 위한 특이적인 CTL 이 시클로필린 B-양성 환자에서 효율적으로 유도된다. 환자 및 사용할 펩티드간의 HLA 타입이 적합성이 있어야 함은 당연하다. 예를 들어, HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유사체는 HLA-A24-양성 종양 환자에게 사용되어야 한다.
더불어, 본 발명의 종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 종양 항원 단백질, 또는 이들의 유전자의 시험관 내 용도의 다른 예로는 하기 입양 면역요법이 있다.
흑색종의 경우, 환자 자신에서 수득한 종양 침윤 T 세포를 생체 밖에서 대량 배양하고, 이어서 환자에게 반환시키는 입양 면역 요법이 치료 효과를 달성한다는 것이 관찰된다 (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994). 마찬가지로, 생쥐 흑색종에서, 종양 항원 펩티드 TRP-2 로 비장세포를 시험관 내에서 자극하여, 종양 항원 펩티드에 특이적인 CTL 을 증식시키고, 상기 CTL 을 흑색종이 이식된 생쥐에 투여함으로써 전이가 억제됨이 관찰된다 (J. Exp. Med., 185:453, 1997). 이는 항원-제시 세포의 HLA 항원과 종양 항원 펩티드간의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL 이 시험관 내에서 증식했기 때문이다. 따라서, 종양-특이적 CTL 을 증식시키기 위해 본 발명의 종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 종양 항원 단백질, 또는 이들의 유전자를 이용하여 환자의 말초 혈액 임파구를 시험관 내에서 자극하고, 이어서 CTL 을 환자에 반환시키는 것을 포함하는 종양 치료를 위한 방법은 유용할 것으로 추정된다.
따라서, 본 발명은 HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체간의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL 을 제공하며, 또한 상기 CTL 을 활성 성분으로 함유하는 종양의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 CTL 을 안정적으로 유지하기 위해, 바람직하게는 생리적 식염수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 배지 등을 포함한다. 이는 예를 들어, 정맥 내, 피하 또는 피부내로 투여될 수 있다. 종양의 치료를 위해 CTL 을 활성 성분으로 함유하는 상기 조성물을 환자의 체내로 재주입함으로써, 시클로필린 B-양성 환자에서 종양 세포에 대한 CTL 의 독성 효과가 향상되며, 따라서 종양 세포를 사멸시킴으로써 종양의 치료를 달성한다.
본 발명의 종양 항원 단백질, 종양 항원 펩티드, 및 그의 유도체는 또한 종양의 진단을 위한 진단 시약의 활성 성분으로 사용될 수 있다. 따라서, 종양의 보유가 의심되는 환자에게서 수득한 표본 (혈액 또는 종양 조직과 같은 것) 내 항체의 존재를 검출하기 위해 본 발명의 종양 항원 단백질, 종양 항원 펩티드, 또는 그의 유도체 자체를 진단법 시약으로 사용함으로써, 종양의 조기 검출 및 재발과 전이의 진단이 가능하다. 동일 절차를 예를 들어, 본 발명의 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 활성 성분으로 함유하는 약물이 적용 가능한 종양 환자의 선별을 위해 이용할 수 있다. 특히, 상기와 같은 진단은 면역블롯팅, 방사면역측정법 (RIA), 효소 면역측정법 (ELISA), 형광 또는 발광 분석법으로 수행할 수 있다.
나아가, 최근 몇 년간, 항원 펩티드 및 HLA 항원간의 복합체를 이용한 항원-특이적 CTL 검출을 위한 새로운 검출 방법들이 확립되고 있다 (Science, 274:94, 1996). 종양의 조기 검출 및 재발 또는 전이의 진단은 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유사체 및 HLA 항원간의 복합체를 상기 검출 방법에 적용시키고, 따라서 종양 항원-특이적 CTL 을 검출함으로써 가능하다. 동일 절차를 예를 들어, 본 발명의 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 활성 성분으로 함유하는 약물이 적용 가능한 종양 환자의 선택을 위해, 또는 상기 약물의 치료 효과를 측정하기 위해 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 활성 성분의 일부로 함유하는 종양 진단 시약을 제공한다.
특히, 상기와 같은 진단은 하기에서와 같이 수행될 수 있다: 문헌 (Science, 274:94, 1996) 에서 기술된 방법에 따라 형광 표지된 HLA 항원 및 종양 항원 펩티드간의 4중합체를 제조하고, 흐름 세포 측정기를 이용하여 종양의 보유가 의심되는 환자의 말초 혈액 임파구로부터 항원 펩티드-특이적 CTL 을 정량적으로 측정하는데 사용된다.
본 발명은 또한 폐 선암종으로부터 유래된 종양 침윤 임파구에서 확립된 CTL 인 KG-CTL (수탁 번호 FERM BP-6725) 를 제공한다. KG-CTL 은 HLA-A24- 및 HLA-A2-양성 종양 세포에 반응함이 증명되었고, 또한 본 발명의 시클로필린 B 는 상기 KG-CTL 에 대한 반응성을 지표로 사용하여 규명된 종양 항원 단백질이다. 따라서, KG-CTL 을 이용하여 시클로필린 B 로 새로운 종양 항원 단백질 및 종양 항원 펩티드를 규명할 수 있다. 자세한 사항은, 하기 실시예 2 를 참조한다.
도 1 은 HLA-A2404 cDNA 의 재조합 플라스미드 또는 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드가 전달이입된 COS-7 세포주를 본 발명의 종양 항원 펩티드 "84-92 (서열 번호: 1)" 를 첨가한 뒤 KG-CTL 과 공동 배양하고, KG-CTL 에 의해 생성된 IFN-γ의 양이 측정된, 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 첨가한 펩티드의 농도를 가리키며, 세로축은 KG-CTL 에 의해 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
도 2 는 HLA-A2404 cDNA 의 재조합 플라스미드 또는 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드가 전달이입된 COS-7 세포를 본 발명의 종양 항원 펩티드 "91-99 (서열 번호: 2)" 를 첨가한 뒤 KG-CTL 과 공동 배양하고, KG-CTL 에 의해 생성된 IFN-γ의 양이 측정된, 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 첨가한 펩티드의 농도를 가리키며, 세로축은 KG-CTL 에 의해 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 더욱 예시될 것이나, 어떠한 방식으로든 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1
폐 선암종으로부터 유래된 종양 침윤 임파구 (TILs) 로부터 세포독성 T 임파구 (CTLs) 세포주의 확립
폐 선암종 환자에서 얻은 외과적 시료를 배양 배지 내에서 작은 조각으로 나누고, 이어서 콜라게나제 및 DNAase 를 함유하는 배양 배지에 현탁시켰다. 세포 현탁액으로부터, Ficoll-Conray 용액을 이용한 밀도 원심분리에 의해 임파구를 분리하였다. 상기 임파구는 인터루킨-2 100 U/㎖ 및 NEAA (Gibco BRL) 0.1 mM 이 보강된 RPMI-1640 45%, AIM-V (Gibco BRL) 45%, 및 FCS 10% 로 구성된 배양 배지 (이하 임파구 배지라 칭함) 에서 배양되었다. 배양의 초기 이틀간, 항-CD3 항체 NU-T3 (Nichirei Corporation) 배양 배지에 1 ㎍/㎖ 로 첨가하였다. 배양은 30 일을 초과하여 계속되었으며, 여러 종류의 HLA-A24- 또는 HLA-A2-양성 종양 세포주에 반응하는 CTL 세포주를 확립하였다. 상기 CTL 세포주는 KG-CTL 로 명명되었으며, 하기의 실험에 사용되었다. 다양한 종양 세포주에 대한 KG-CTL 의 반응성은 하기와 같이 측정되었다. 암세포주는 1X104 세포/웰로 96-웰 플레이트에 심는다. 다음날, 1X105 세포/웰에서 KG-CTL 을 첨가하고, 18 시간 더 배양한 뒤, 배양 배지를 수확하여 KG-CTL 에 의해 생성된 인터페론-γ(IFN-γ) 의 양을 측정하였다. IFN-γ의 정량적 측정은 효소면역측정법 (ELISA) 에 의해 수행하였다. 자세하게는, 항-인간 IFN-γ생쥐 모노클로날 항체를 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 고체상 항체로써 부착시키고, 소 혈청 알부민으로 비특이적 결합을 차단한 뒤, 표본 내의 IFN-γ를 항체에 결합시켰다. 이어서 항-인간 IFN-γ토끼 폴리클로날 항체를 검출 항체로써 결합시켰다. 알칼린 포스파타아제로 표지된 항-토끼 면역글로불린 염소 항체를 결합시킨 뒤, 과산화효소 발색 키트 T (Sumitomo Bakelite Co.) 를 사용하여 발색을 일으키고, 흡광도 (405 ㎚) 를 측정하였다. 표준 IFN-γ로 얻어지는 수치와 비교하여 IFN-γ의 양을 정량적으로 결정한다. 다양한 유선종 세포주에 대한 KG-CTL 의 반응성이 표 2 에 요약되어 있다. 마찬가지로, 임파종 세포주에 대한 KG-CTL 의 반응성은 표 3 에 요약되어 있다.
| 유선종 세포주 | KG-CTL에 의해 생성된 IFN-γ의 양 (pg/㎖) | HLA-A 타입 |
| HT-1376 (방광암 세포주) | 4608 | 2402/2402 |
| 1-87 (폐암 세포주) | 194 | 0207/1101 |
| 11-18 (폐암 세포주) | 4632 | 0201/2402 |
| PC-9 (폐암 세포주) | 1102 | 0206/2402 |
| LC-1 (폐암 세포주) | 129 | 3101/3302 |
| YT-803 (폐암 세포주) | 285 | 3101/3302 |
| 143B (골육종 세포주) | 1547 | 0211/0211 |
| 없음 (KG-CTL만 사용) | 100 | - |
| 세포주 | KG-CTL에 의해 생성된 IFN-γ의 양 (pg/㎖) | HLA-A 타입 |
| SSB (B 세포주1)) | 5769 | 2402/2402 |
| Ban-B1 (B 세포주1)) | 78 | 3101/3302 |
| HPB-MLT (백혈병 세포주) | 189 | 0101/0201 |
| MOLT-16 (백혈병 세포주) | 13 | 2301/3002 |
| MT-2 (백혈병 세포주) | 3495 | 2402/2402 |
| 없음 (KG-CTL만 사용) | 0 | - |
1)B 세포주는 건강한 기증자의 B 세포를 EB 바이러스로 형질전환하여 수득함.
표 2 의 결과는 KG-CTL이 표에서 HLA-A2402-양성 암 세포주인 (HT-1376, 11-18, 및 PC-9) 와 강하게 반응하고 IFN-γ을 생성한다는 것을 보여주며, 또한 HLA-A2-양성 세포주인 (143B) 와 강하게 반응하고 IFN-γ을 생성한다는 것을 보여준다. 마찬가지로, 표 3 의 결과는 KG-CTL이 HLA-A2402-양성 EB-바이러스-형질전환된 B 세포주 및 백혈병 세포주 (SSB 및 MT-2) 와 강하게 반응한다는 것을 보여주며, 또한 HLA-A2-양성 백혈병 세포주 (HBP-MLT) 와 강하게 반응한다는 것을 보여준다.
확립된 KG-CTL 은 산업 과학기술처, 국립 생명과학 인간기술 연구소 (The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 에 수탁되었다 (미생물 명칭: KG-CTL; 수탁일: 1998, 6.19; 수탁번호: FERM P-16854)(국제 수탁 전환일: 1999, 5. 20; 수탁번호: FERM BP-6725). 나아가, KG-CTL 의 HLA 분자 형별 검사는 문헌 [Nakao 등, Cancer Res., 55:4248-4252 (1995)] 에 기술된 방법에 따라 시오노기 주식회사 (Shionogi & Co.) 에서 수행하였으며, A 유전자좌가 A0206 및 A2402 임을 확인하였다.
실시예 2
종양 항원 단백질의 규명
상기 실시예 1 에서 KG-CTL 이 강하게 반응한, 방광암 세포주 HT-1376 (ATCC CRL 1472) 로부터 cDNA 라이브러리를 하기의 방법에 따라 제조하였다.
HT-1376 으로부터, 제조자의 프로토콜에 따라 전체 RNA 분획을 분리하고 mRNA 정제 체계 (파마시아 바이오텍) 를 이용하여, 올리고 (dT) 칼럼으로 정제하여 폴리 (A)+ mRNA 를 첫 번째로 제조하였다. mRNA 로부터, 각 말단에 Not I 어댑터 및 Sca I 어댑터가 부착된 cDNA 를 제조자의 프로토콜에 따라 수퍼스크립트 플라스미드 시스템 (SuperScriptTM Plasmid system, Gibco BRL) 을 이용하여 제조하고, 이어서 제한 효소 Not I 및 Sca I 으로 잘린 발현용 벡터, 플라스미드 pSV-SPORT1 (Gibco BRL) 의 절단 위치에 결찰하여 재조합 플라스미드를 얻었다. 재조합 플라스미드는 유전자 펄스기 (Gene Pulser, BioRad) 내의 전기적 펄스를 이용하여 대장균 ElectroMAX DH10BTM 세포 (Gibco BRL) 에 이입되고, 재조합 플라스미드가 이입된 형질전환체를 암피실린 (50 ㎍/㎖) 을 포함하는 LB 배지 (박토-트립톤 1%, 효모 용출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%, pH 7.3) 에서 선별하였다.
상기의 약 100 개의 형질전환체 군으로부터 재조합 플라스미드 DNA 를 하기 방식에 따라 회수한다. 백여개의 형질전환체들을 암피실린 (50 ㎍/㎖) 이 첨가된 LB 배지가 들어있는, 96-웰 U형-바닥 마이크로플레이트의 각 웰에 넣고 배양하였다. 배양액의 일부는 이어서 TYGPN 배지 (F.M. Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons,Inc.) 가 0.25 ㎖ 씩 들어있는, 또 다른 96-웰 U형-바닥 마이크로플레이트로 옮기고 37℃ 에서 48 시간동안 배양하였다. 마이크로플레이트의 LB 배지 내에 남아있는 배양액을 냉동 보관하였다. TYGPN 배지에서 배양된 형질전환체의 재조합 플라스미드 DNA 의 제조는 알칼린 용해 방법 (F.M. Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc.) 에 의해 마이크로플레이트 상에서 수행되었다. 이소프로판올 침전법에 의해 회수한 재조합 플라스미드 DNA 는 RNase 20 ng/㎖ 을 포함하는 Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 7.4 용액 50 ㎕ 에 현탁시켰다.
또 한편으로, 산업 과학기술처, 국립 생명과학 인간기술 연구소 (The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 에 수탁된 식도암종 KE-4 세포주 (수탁일: 1997, 5. 23; 수탁번호: FERM BP-5955) 로 시작하여, 문헌 [Nakao 등, Cancer Res., 55:4248-4252, (1995)] 에 기술된 바에 따라 HLA-A2402 (유전자은행 기탁 번호. M64740) 및 HLA-A2601 의 cDNA 가 발현용 벡터 pCR3 (Invitrogen) 에 삽입된 재조합 플라스미드를 제조하였다.
이어서, 아프리카산 녹색 원숭이 신장으로부터 유래된 세포주 COS-7 (ATCC 번호. CRL1651) 를, 하기의 리포펙틴 방법을 이용하여 HT-1376 cDNA 의 재조합 플라스미드 및 HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드를 이중 전달이입하였다. 8 천개씩의 COS-7 세포를 96-웰 편평-바닥 마이크로플레이트의 각 웰에 넣어주고, FCS 10% 를 함유하는 RPMI1640 배지 100 ㎕ 에서 하루동안 배양하였다. 리포펙타민 시약 (Gibco BRL) 을 이용하여, 100 여개 형질전환체에 상응하는 HT-1376 cDNA 의 재조합 플라스미드 25 ㎕, HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드 10 ㎕ (200 ng), 및 50 배 가량 희석된 리포펙틴 시약 35 ㎕ 로 구성된 70-㎕ 혼합액 중 30 ㎕ 을 COS-7 세포의 이중 전달이입을 위해 첨가하였다. 상기 전달이입체는 두개씩 제작되었다. 5 시간 뒤, FCS 10% 를 함유하는 배양 배지 200 ㎕ 을 전달이입체에 첨가하고, 37℃ 에서 48 시간 더 배양하였다. 배양 배지를 제거한 뒤, KG-CTL를 1.5X105 세포/웰씩 첨가하고, FCS 10% 및 IL-2 25 U/㎖ 를 함유하는 배양 배지 100 ㎕ 로 37℃ 에서 24 시간 배양하였다. 배양 배지를 회수하여 상기 실시예 1 에서 기술된 ELISA 방법에 의해 IFN-γ의 양을 측정하였다.
IFN-γ고생산성을 나타낸 군에 대해서는, HT-1376 cDNA 의 재조합 플라스미드가 전달이입된 100 여개의 상응하는 형질전환체의 동결-보관된 군을 추가로 하기 선별에 사용하였다. 형질전환체 군을 암피실린 (50 ㎍/㎖) 을 포함하는 LB 한천 배지에 평판 배양하여 콜로니를 수득하였다. 각 군에서, 각각의 웰에 단일 종류의 형질전환체가 들어가도록 400 콜로니를 상기 기술한 바와 같이 배양하고, HT-1376 cDNA 의 재조합 플라스미드 DNA 를 제조하였다. 나아가, 상기에 기술한 것과 유사한 방식으로, HT-1376 cDNA 의 재조합 플라스미드 및 HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드로 COS-7 세포를 이중 전달이입시키고, KG-CTL 과 공동 배양한 뒤, 표적 세포에 대한 반응으로 KG-CTL 에 의해 생성되는 IFN-γ의 양을 정량적으로 측정하여 양성 플라스미드를 선별하였다. 이러한 절차에 따라, HT-1376 cDNA 재조합 플라스미드 클론이 선별되었으며, 상기 클론은 4F2 로 명명되었다. 나아가, KG-CTL 에 의해 생성되는 IFN-γ의 양을 측정하는 유사 과정을 4F2 로 반복하였다. 그 결과는 하기 표 4 에서 보여진다.
| 세포 | KG-CTL 에 의해 생성되는 IFN-γ의 양 (pg/㎖) |
| COS-7 + HLA-A2402 | 469 |
| COS-7 + HLA-A2402 + 4F2 | 543 |
HLA-A2402 만 전달이입된 COS-7 세포에 비해, KG-CTL 은 HLA-A2402 및 4F2 가 이중 전달이입된 COS-7 세포에 대해 더욱 강력히 반응했으며 더 많은 IFN-γ를 생성하였다. 본 결과는 4F2 에 의해 코드되는 단백질이 종양 항원 단백질임을 나타낸다.
실시예 3
종양 항원 단백질 유전자의 염기 서열 결정
실시예 2 에서 수득한, 종양 항원 단백질을 코드하는 플라스미드 클론 4F2 의 염기서열을 DyeDeoxy Terminator 염기서열분석 키트 (Perkin-Elmer) 를 이용하여 결정하였다. 결정된 염기 서열 및 염기 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열은 WWW 엔트레쯔 데이타베이스를 이용하여 공지된 서열과 비교하고, 플라스미드 클론 4F2 의 염기 서열이 유전자은행 기탁 번호. N60857로 등록된 인간 시클로필린 B 의 아미노산 서열에 상응한다는 것이 판명되었다. 상기 시클로필린 B 의 서열은 또한 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:1903, 1991] 에도 기술되어 있다. 시클로필린 B 는 시클로스포린 A 와 같은 면역억제제의 결합 단백질로, 생체 내 면역 세포의 활성화에 관여함이 공지되어 있다. 상기 실시예 2 에서 처음으로, 유일하게 공지된 기능이 면역세포 활성화의 관여였던 시클로필린 B 가 종양 항원 단백질로써의 기능을 보유하고 있음을 밝혀내었다.
실시예 4
후보 펩티드의 선택
HLA 항원에 결합하고 제시되는 항원 펩티드의 서열에는 특정한 규칙 (모티프) 이 있다. HLA-A24 의 모티프에 관해서는, 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열 중, 위치 2 의 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이고, C-말단의 아미노산이 페닐알라닌, 트립토판, 류신, 이소류신, 또는 메티오닌인 것이 공지되어 있다 (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 152:3913, 1994; J. Immunol., 155:4307, 1994). 마찬가지로, HLA-A2 에 관해서는 8 내지 11 개 아미노산으로 구성된 펩티드가, HLA-A0201 에 관해서는 위치 2 의 아미노산이 류신 또는 메티오닌이고 C-말단의 아미노산이 발린 또는 류신인 것이; HLA-A0204 에 관해서는 위치 2 의 아미노산이 류신이고 C-말단의 아미노산이 류신인 것이; HLA-A0205 에 관해서는 위치 2 의 아미노산이 발린, 류신, 이소류신, 또는 메티오닌이고 C-말단의 아미노산이 류신인 것이; HLA-A0206 에 관해서는 위치 2 의 아미노산이 발린 또는 글루타민이고 C-말단의 아미노산이 발린 또는 류신인 것이; HLA-A0207 에 관해서는 위치 2 의 아미노산이 류신이고 C-말단의 아미노산이 류신인 것이 공지되어 있다 (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4749, 1995; 또한 표 1 도 참조).
상기의 모티프에 근거하여, 본 발명가들에 의해 종양 항원 단백질로 기능함이 밝혀진, 시클로필린 B (유전자은행 기탁 번호. M60857) 의 아미노산 서열로부터 상기 모티프를 갖는 8 내지 11 개의 펩티드로 구성된 펩티드 부위를 선택하였다. HLA-A24 에 대한 결합 모티프를 갖는 선택된 펩티드는 서열 번호: 1-11 에서 보여지며, HLA-A2 에 대한 결합 모티프를 갖는 펩티드는 서열 번호: 12-36 에서 보여진다. 상기 펩티드들은 Fmoc 방법에 의해 Biologica Co. 에서 합성되었다.
이어서, 104 의 COS-7 세포에 HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드를 리포펙틴 방법으로 문헌 (J. Exp. Med., 187:277, 1998) 에 따라 전달이입하여 HLA-A2402 를 발현시켰다. 이들 세포에, HLA-A24 에 대한 결합 모티프를 갖는, 상기에서 합성한 다양한 펩티드를 10 μM 씩 2 시간동안 첨가하여 세포에 펄스를 주었다. 세포를 이어서 2x104 의 KG-CTL 세포와 18 시간동안 공동 배양하고, KG-CTL 에 의해 생산된 배양상층액 내 IFN-γ의 양을 ELISA 방법으로 측정한다. 이어서, 두개의 펩티드, 즉, 시클로필린 B 의 아미노산 서열 중 위치 84 내지 위치 92 의 서열을 포함하는 펩티드 (서열 번호: 1, 이하 때때로 "84-92" 로 약칭) 및 위치 91 내지 위치 99 의 서열을 포함하는 펩티드 (서열 번호: 2, 이하 때때로 "91-99" 로 약칭) 를 하기 실험에 사용한다.
실시예 5
Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (서열 번호: 1) 의 합성
본 합성을 위한 수지로 Fmoc-Phe-Alko 수지 (0.56 mmol/g, 100-200 메쉬) 를 사용하였다. 상기 수지의 100 mg 을 사용하여, 다음의 잔기를 순서대로 연결하기 위해 하기에 기술된 일정 1 에 따라 합성을 시작하였다: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH, 및 Fmoc-Lys(Boc)-OH. 연결을 마친 뒤, 하기 표 5 에서 보이는 일정 1 의 단계 3 까지의 절차를 수행하여 펩티드 수지를 얻었다.
상기 펩티드 수지에, 시약 K (페놀 5%, 티오아니졸 5%, 물 5%, 및 TFA 중의 에탄디티올 2.5%) 2 ㎖ 을 첨가하고 실온에서 2.5 시간 반응시킨다. 얼음에서 냉각시키면서, 디에틸 에테르 10 ㎖ 을 반응에 첨가하고, 혼합액을 10 분간 교반하고, 여과하여, 디에틸 에테르 10 ㎖ 로 세정한다. 여과 덩어리에 10% 아세트산 수용액 10 ㎖ (이하 수성 아세트산으로 칭함) 을 첨가하고, 혼합액을 30 분간 교반한다. 이어서 수지를 여과하고, 수성 아세트산 4 ㎖ 로 세정한다. 여과액과 세정액을 동결건조시킨 뒤, 수득한 미정제 펩티드는 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 COSMOSIL 5C18-AR 칼럼 (25φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세정하고, 이어서 260 분간 아세토니트릴의 농도를 25% 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물을 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe 11.7 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe 은 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 0 내지 60% 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 23.9 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 24 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 1.01 (1)
*Val: 1.00 (1)
Ile: 0.85 (1)
Phe: 1.94 (2)
Lys: 1.74(2)
His: 0.95 (1)
Arg: 0.86 (1)
분자량 분광법 (FAB)
[M+H]+: 1190
| 일정 1 | |
| 단계 | 시간(분) x 처리횟수 |
| 1. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 2 |
| 2. (탈보호) 50% 피페리딘/DMF | 12 x 1 |
| 3. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 7 |
| 4. (결합) 각 아미노-보호된 아미노산 (5 당량)/NMP 용액 0.9 ㎖, DIC (5 당량)/NMP 용액 0.3 ㎖ | 30 x 1 |
| 5. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 2 |
| 6. (결합) 각 아미노-보호된 아미노산 (5 당량)/NMP 용액 0.9 ㎖, DIC (5 당량)/NMP 용액 0.3 ㎖ | 30 x 1 |
| 7. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 4 |
실시예 6
Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe (서열 번호: 2) 의 합성
상기 실시예 5 와 동일한 방식으로, Fmoc-Phe-Alko 수지, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, 및 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 COSMOSIL 5C18-AR 칼럼 (25φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세정하고, 이어서 260 분간 아세토니트릴의 농도를 31% 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe 3.6 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 0 내지 60% 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 25.8 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 (Met은 검출되지 않음) 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 24 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 2.02 (2)
Glx: 1.04 (1)
Gly: 2.04 (2)
*Ile: 1.00 (1)
Phe: 1.97 (2)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1029
실시예 7
종양 항원 펩티드의 규명
상기 실시예 5 및 6 에서 합성된 두개의 펩티드로 상기 실시예 4 에서 기술한 것과 동일한 방식의 실험을 수행하였으며, 이들 펩티드가 종양 항원 펩티드로써 기능한다는 것을 알아내었다. 결과는 도 1 및 2 에서 보여진다. 상기 도에서, 가로축은 펩티드 농도 (pg/㎖) 를 나타내며, 세로축은 KG-CTL 에 의해 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다. HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드가 전달이입된 COS-7 세포를 "84-92" 및 "91-99" 로 펄스를 주면, KG-CTL 의 반응성은 농도-의존적으로 증가하였다. HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드가 이입된 COS-7 세포와 비교했을 때, HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드가 이입된 COS-7 세포가, 펄스를 준 경우에 KG-CTL 의 높은 반응성을 나타내었다. 상기 결과에 의해 두개의 펩티드 "84-92" 및 "91-99" 가 HLA-A24- 제한적인 종양 항원 펩티드로써 기능한다는 것을 증명하였다.
실시예 8
Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe 의 합성 (서열 번호: 39)
실시예 7 에서 "84-92" 및 "91-99" 이 종양 항원 펩티드로써 기능함을 밝혔으므로, HLA-A24 의 결합 모티프 범위 내에서 위치 2 의 페닐알라닌이 티로신으로 치환된 "84-92·2F-Y" (서열 번호: 39) 및 "91-99·2F-Y" (서열 번호: 40) 의 두 유도체가 제조되었다.
Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (서열 번호: 39) 은 상기 실시예 5 에서 기술된 것과 동일한 방식으로 합성되었다. 자세하게는, Fmoc-Phe-Alko 수지, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 및 Fmoc-Lys(Boc)-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 COSMOSIL 5C18-AR 칼럼 (25φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세정하고, 이어서 200 분간 아세토니트릴의 농도를 25% 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe 44.9 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe 은, 0.1% TFA를 함유 하는 아세토니트릴 농도 0 내지 60% 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 17.7 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 24 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 1.06 (1)
*Val: 1.00 (1)
Ile: 0.85 (1)
Tyr: 0.89 (1)
Phe: 0.95 (1)
Lys: 1.85 (2)
His: 0.98 (1)
Arg: 0.91 (1)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1206
실시예 9
Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe 의 합성 (서열 번호: 40)
상기 실시예 5 에서 기술된 것과 동일한 방식으로, Fmoc-Phe-Alko 수지, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 및 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 COSMOSIL 5C18-AR 칼럼 (25φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세정하고, 이어서 200 분간 아세토니트릴의 농도를 27% 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe 12.8 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 0 내지 60% 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 24.7 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 (Met은 검출되지 않음) 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 24 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 2.04 (2)
Glx: 1.02 (1)
Gly: 2.06 (2)
*Ile: 1.00 (1)
Tyr: 0.82 (1)
Phe: 0.98 (1)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1045
실시예 10
종양 항원 펩티드 및 이들의 유도체에 의한 말초 혈액 임파구로부터 CTL 의 유도
본 발명가들은 실시예 5 에서 합성된 "84-92" (서열 번호: 1) 펩티드 및 실시예 8 에서 합성된 "84-92·2F-Y" 펩티드 (서열 번호: 39) 를 이용하여 말초 혈액 임파구로부터 항원-특이적 CTL 이 유도될 수 있는지 여부를 조사하였다.
임파구는 Ficoll 방법을 이용하여 HLA-A 유전자좌의 A24 가 이종접합인 백혈병 환자의 말초 혈액으로부터 분리되었다. 임파구는 2x106 세포/웰씩 24 웰 플레이트에 놓여지고, 임파구 배지에서 배양되었다. 상기 종양 항원 펩티드를 10μM로 배양배지에 첨가하여 말초 혈액 임파구를 자극하였다. 일주일 후, 두 번째 자극을 위해 X-레이 (50 Gy) 조사된 말초 혈액 임파구 2x105 세포와 함께 상기 종양 항원 펩티드를 10μM로 첨가하였다. 다시 일주일 후, 세 번째 자극을 유사한 방식으로 수행하였다. 배양된 임파구를 세 번째 자극의 일주일 후, 수확하였다. 본 발명의 종양 항원 단백질 (시클로필린 B) 을 발현하는 HLA-A2402-양성 EB 바이러스-형질전환된 B 세포주인 BEC-2 및, 본 발명의 종양 항원 단백질을 발현하는 HLA-A2402-음성 EB 바이러스-형질전환된 B 세포주인 Ban-B1 을 표적 세포 (1x104 세포) 로 사용하여, 표적 세포에 대한 반응으로 상기 임파구 (8x104 세포) 가 생산하는 배양 배지 내 IFN-γ의 양을 ELISA 에 의해 측정한다. 결과는 표 6 에서 보여진다.
| 상층액 내의 IFN-γ(pg/㎖) | ||
| 항원 펩티드 | BEC-2 | Ban-B1 |
| "84-92" | 383 | 38 |
| "84-92·2F-Y" | 489 | 63 |
| 처리 안함 | 245 | 74 |
상기 "84-92" (서열 번호: 1) 및 "84-92·2F-Y" (서열 번호: 39) 뿐만 아니라, 실시예 6 에서 합성된 "91-99" (서열 번호: 2) 및 실시예 9 에서 합성된 "91-99·2F-Y" (서열 번호: 40) 을 이용하여 상기에 기술된 것과 유사한 또 다른 실험을 더 수행하였다. 결과는 표 7 에서 보여진다.
| 상층액 내의 IFN-γ(pg/㎖) | ||
| 항원 펩티드 | BEC-2 | Ban-B1 |
| "84-92" | 1896 | 160 |
| "84-92·2F-Y" | 710 | 46 |
| "91-99" | >2000 | 40 |
| "91-99·2F-Y" | 650 | 100 |
"84-92", "84-92·2F-Y", "91-99" 및 "91-99·2F-Y" 펩티드로 자극한 말초 혈액 임파구는 HLA-A24-음성 Ban-B1 이 아닌 HLA-A24-양성 BEC-2 에 반응하는데, 이는 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드-특이적 CTL 의 유도임을 시사한다. 나아가, "84-92" 및 "91-99" 펩티드로 자극한 말초 혈액 임파구와 마찬가지로, "84-92·2F-Y" 및 "91-99·2F-Y" 펩티드로 자극한 말초 혈액 임파구는 원래 펩티드의 치환에 의해 수득된 유도체가 원래 펩티드와 유사한 CTL-유도능을 가지고 있음을 시사하며, BEC-2 세포와 반응하였다.
마찬가지로, HLA-A2402 cDNA (유전자은행 기탁 번호. M64740) 발현용 플라스미드를 이입하고 상기 펩티드로 펄스를 준 COS-7 세포 (ATCC 번호. CRL1651) 또는 VA-13 세포 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 가 상기 실험에서의 BEC-2 대신 쓰이고, HLA-A2402 cDNA 발현용 플라스미드를 주입하고 상기 펩티드로 자극하지 않은 COS-7 또는 VA-13 세포가 상기 실험에서의 Ban-B1 대신 쓰이는 유사한 실험을 수행하였다 (J. Exp. Med., 187:277, 1998).
실시예 11
시클로필린-유래 펩티드의 합성
상기-기술한 실시예 1 내지 10 에서 시클로필린 B 가 종양 항원 단백질임이 밝혀졌으므로, 본 발명자들은 또한 시클로필린 B 의 공지된 동종체인 A, C, 및 D 가 그러한 활성을 갖고 있는지 여부를 조사하였다.
시클로필린 A, C, 및 D 의 아미노산 서열 또한 공표되어 있다 (Biochemistry, 3:8218, 1994). 문헌에 근거하여, HLA-A24 에 대한 결합 모티프를 갖는 세개의 펩티드, 즉, 시클로필린 A 의 아미노산 서열 위치 59 내지 위치 67 의 서열을 포함하는 펩티드 (서열 번호: 41, 이하 때때로 Cyp-A"59-67" 로 칭함), 시클로필린 C 의 아미노산 서열 위치 89 내지 위치 97 의 서열을 포함하는 펩티드 (서열 번호: 42, 이하 때때로 Cyp-C"89-97" 로 칭함), 및 시클로필린 D 의 아미노산 서열 위치 94 내지 위치 102 의 서열을 포함하는 펩티드 (서열 번호: 43, 이하 때때로 Cyp-D"94-102" 로 칭함) 를 선택하고 Fmoc 방법으로 합성하였다. 예로써, Cyp-A"59-67" (서열 번호: 41) 의 합성 및 그 결과는 하기에 기술된다. 합성을 위한 수지로 Fmoc-Phe-Alko 수지 (0.67 mmol/g, 100-200 메쉬) 를 사용하였다. 상기 수지의 50 mg 을 사용하여, 하기 (표 8) 에 기술된 일정 1 에 따라 합성을 시작하고 다음의 잔기를 순서대로 연결하였다: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, 및 Fmoc-Gly-OH. 연결을 마친 뒤, 하기 표 8 에서 보이는 일정 1 의 단계 3 까지의 절차를 수행하여 펩티드 수지를 얻었다.
상기 펩티드 수지에, 시약 K (페놀 5%, 티오아니졸 5%, 물 5%, 및 TFA 중의 에탄디티올 2.5%) 1 ㎖ 을 첨가하고 실온에서 2.5 시간 반응시킨다. 얼음에서 냉각시키면서, 디에틸 에테르 10 ㎖ 을 반응에 첨가하고, 혼합액을 10 분간 교반하고, 여과하여, 디에틸 에테르 10 ㎖ 로 세정한다. 여과 덩어리에 10% 수성 아세트산 10 ㎖ 을 첨가하고, 혼합액을 30 분간 교반한다. 이어서 수지를 여과하고, 수성 아세트산 4 ㎖ 로 세정한다. 여과액과 세정액을 동결건조시킨 뒤, 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A SH-363-5 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세정하고, 이어서 0 내지 15% 로 60 분간, 15 내지 30% 로 240 분간 아세토니트릴의 농도를 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Gly-Phe-Met-Cys-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe 9.7 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Gly-Phe-Met-Cys-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe 은 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 18% 내지 48% 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM AM303 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 18.8 분의 정체 시간을 가졌다. 생성물의 아미노산 분석 (Cys 는 검출되지 않음) 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 10 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 0.99 (1)
Glx: 1.06 (1)
Gly: 2.96 (3)
Met: 0.99 (1)
*Phe: 2.00 (2)
분자량 분광법 (FAB)
[M+H]+: 961
| 일정 1 | |
| 단계 | 시간(분) x 처리횟수 |
| 1. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 2 |
| 2. (탈보호) 50% 피페리딘/DMF | 12 x 1 |
| 3. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 7 |
| 4. (결합) 각 아미노-보호된 아미노산 (5 당량)/NMP 용액 0.9 ㎖ , DIC (5 당량)/NMP 용액 0.3 ㎖ | 30 x 1 |
| 5. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 2 |
| 6. (결합) 각 아미노-보호된 아미노산 (5 당량)/NMP 용액 0.9 ㎖, DIC (5 당량)/NMP 용액 0.3 ㎖ | 30 x 1 |
| 7. (세정) DMF 1.2 ㎖ | 1 x 4 |
실시예 12
시클로필린 유래 펩티드에 의한 말초 혈액 임파구로부터의 CTL 유도
발명가들은 실시예 11 에서 합성된 세개의 펩티드가 말초 혈액 임파구로부터 항원-특이적 CTL 을 유도할 수 있는지 여부를 검사하였다. Ficoll 방법을 이용하여 HLA-A 유전자좌의 A24 가 동종접합인 건강한 기증자의 말초 혈액에서 임파구를 분리하였다. 임파구는 실시예 10 에서 기술한 것과 동일한 방식으로 상기 펩티드로 세차례 자극하였다. 세번째 자극의 일주일 후 임파구를 수확하고, 그들의 세포독성을 51Cr-표지된 HLA-A24-양성 T 세포 임파종-유래 세포주 KOPT-K1 및 HLA-A24-음성 T 세포 백혈병-유래 세포주 RPMI8402 를 표적 세포로 이용하여, 문헌 [D.D. Kharkevitch 등, Int. J. Cancer, 58:317 (1994)] 에 기술된 방법에 따라 측정하였다. 결과는 표 9 에 보여진다.
| 표적 세포에 대한 세포독성 활성 (%) | ||
| 자극 펩티드 | KOPT-K1 | RPMI8402 |
| Cyp-A"59-67" | 27 | 0 |
| Cyp-C"89-97" | 20 | 0 |
| Cyp-D"94-102" | 22 | 0 |
Cyp-A"59-67", Cyp-C"89-97", 및 Cyp-D"94-102" 펩티드로 자극한 임파구는 HLA-A24-음성 RPMI8402 가 아닌 HLA-A24-양성 KOPT-K1과 반응하며, 이는 HLA-A24 제한적인, 종양 항원펩티드-특이적인 CTL 의 유도임을 시사한다. 상기 결과에 의해 시클로필린 B 이외의 시클로필린들도 또한 종양 항원으로 기능할 수 있음이 밝혀졌다.
마찬가지로, 실시예 10 의 말미에 기술된 재조합 세포로 본 실험에서 사용된 KOPT-K1 및 RPMI8402 를 치환한 유사한 실험을 수행할 수 있다.
실시예 13
시클로필린 단백질에 의한 말초 혈액 임파구로부터 CTL 유도
문헌 (예, J. Immunol., 158:1796, 1997 및 Cancer Res., 59:1184, 1999) 에서 기술된 방법을 참조하여, HLA 항원 및 시클로필린-유래 종양 항원 펩티드간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포를 제조하기 위해, 적절한 세포를 본 발명의 시클로필린, 이들의 부분적 폴리펩티드, 본 발명의 시클로필린-유래 종양 항원 펩티드 등으로 펄스를 줄 수 있다. 의도하는 항원-제시 세포의 성공적인 제조는 항원-제시 세포에 의해 말초 혈액 임파구로부터 항원-특이적 CTL 이 유도되는지 여부를 결정함으로써 확인할 수 있다. 비록 하기 설명은 건강한 기증자의 말초 혈액이 사용된 예를 나타내고 있으나, 항원-제시 세포는 종양 환자의 말초 혈액을 사용하여 유사한 방법으로 제조될 수 있음은 당연하다.
임파구가 먼저 Ficoll 방법에 의해 HLA-A24-양성인 건강한 기증자의 말초 혈액에서 분리된다. 임파구를 3 시간동안 37℃ 배양 플라스크에 놓아, 비유착성 세포를 제거한다. 유착성 세포는 GM-CSF (2000 U/㎖) 및 IL-4 (2000 U/㎖) 존재하에서 7 일간 배양하여, 높은 항원-제시능을 갖는다고 공지된 가지 세포로 유도한다. 수확한 가지세포는 본 발명의 종양 항원 펩티드 10 ㎍/㎖ 와 함께 배양하거나, 또는 본 발명의 종양 항원 단백질 (시클로필린) 또는 이들의 부분적 폴리펩티드 100 ㎍/㎖ 로 2 시간 동안 37℃ 에서 펄스를 주고, 이어서 X-레이 (5000 라드) 를 조사한다. 24-웰 플레이트에, 상기 펩티드 또는 단백질로 펄스를 준 가지세포를 항원성 자극을 위해, 상기 건강한 기증자의 말초 혈액 임파구로부터 생자기성 분리 비드 (Dynal) 을 이용해 제조한 CD8+ T 세포와 공동 배양한다. 자극을 준 다음 날, IL-2 (100 U/㎖) 를 첨가한다. T 세포는 동일한 방식으로 매주 (2 내지 4 번) 펩티드 또는 단백질로 펄스를 준 상기 가지세포를 이용하여 자극해준다. 최종 자극 일주일 후, 배양한 T 세포를 수확한다. 본 발명의 종양 항원 단백질을 발현하는 HLA-A2402-양성 EB 바이러스-형질전환된 B 세포주인 BEC-2 및, 본 발명의 종양 항원 단백질을 발현하는 HLA-A2402-음성 EB 바이러스-형질전환된 B 세포주인 Ban-B1 을 표적세포로 사용하여, 상기 T 세포의 반응성을 실시예 10 에서와 같이 ELISA 에 의해 배양 상층액 내 IFN-γ의 양을 측정하거나 또는 51Cr-표지된 표적 세포에 대한 세포독성 활성을 측정함으로써 결정한다. 항원-특이적 CTL 이 유도된 곳에서는, 오직 BEC-2 에 대한 반응이 관찰된다. 상기 실험을 수행함으로써, 본 발명의 종양 항원 펩티드, 종양 항원 단백질 등으로 펄스를 준 항원-제시 세포가 항원-특이적 CTL 유도 활성이 있는지 여부를 결정할 수 있다.
마찬가지로, HLA-A2402 cDNA (유전자은행 기탁 번호. M64740) 발현용 플라스미드를 이입하고 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 종양 항원 단백질로 펄스를 준 COS-7 세포 (ATCC 번호. CRL1651) 또는 VA-13 세포 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 가 상기 실험에서 사용된 BEC-2 대신 쓰이고, HLA-A2402 cDNA 발현용 플라스미드를 이입하지만 상기 펩티드 등으로 펄스를 주지 않은 COS-7 또는 VA-13 세포가 상기 실험에서 사용된 Ban-B1 대신 쓰이는 유사한 실험을 수행할 수 있다 (J. Exp. Med., 187:277, 1998).
서열 목록 프리 텍스트
서열 목록 번호: 37 에서 보이는 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 9 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열 목록 번호: 38 에서 보이는 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 9 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
본 발명에 따라, 시클리필린으로부터 유래된 종양 항원 펩티드 및 기능적으 로 동일한 성질을 갖는 이들의 유도체, 뿐만 아니라 상기 종양 항원 펩티드, 이들의 유도체, 시클로필린 폴리펩티드, 또는 이들의 유전자를 생체 내 또는 시험관 내에서 이용하는 치료제, 예방법 또는 진단법이 제공될 수 있다.
<110> Sumitomo Pharmaceutical Company, Limited
ITOH, Kyogo
<120> Tumor Antigen Peptides Originating In Cyclophilin B
<150> JP98-178449
<151> 1998-06-25
<160> 43
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Lys Phe His Arg Val Ile Lys Asp Phe
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gly Phe Gly Tyr Lys Asn Ser Lys Phe
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gly Tyr Lys Asn Ser Lys Phe His Arg Val Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asn Phe Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Ile Tyr Gly Glu Arg Phe Pro Asp Glu Asn Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Arg Phe Pro Asp Glu Asn Phe Lys Leu
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
His Tyr Gly Pro Gly Trp Val Ser Met
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Phe Phe Ile Thr Thr Val Lys Thr Ala Trp
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Val Phe Gly Lys Val Leu Glu Gly Met
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Lys Val Leu Leu Ala Ala Ala Leu
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Lys Val Thr Val Lys Val Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Thr Val Lys Val Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Asp Leu Arg Ile Gly Asp Glu Asp Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Asp Val Gly Arg Val Ile Phe Gly Leu
1 5
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Arg Val Ile Phe Gly Leu Phe Gly Lys Thr Val
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Gly Leu Phe Gly Lys Thr Val Pro Lys Thr Val
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Thr Val Pro Lys Thr Val Asp Asn Phe Val
1 5 10
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Thr Val Asp Asn Phe Val Ala Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val
1 5 10
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ser Gln Phe Phe Ile Thr Thr Val
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Phe Ile Thr Thr Val Lys Thr Ala Trp Leu
1 5 10
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
His Val Val Phe Gly Lys Val Leu
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Lys Val Leu Glu Gly Met Glu Val
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Lys Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val Arg Lys Val
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Gly Met Glu Val Val Arg Lys Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> Xaa is Phe,Tyr,Met or Trp.
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)
<223> Xaa is Phe,Leu,Ile,Trp or Met.
<400> 37
Lys Xaa His Arg Val Ile Lys Asp Xaa
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> Xaa is Phe,Tyr,Met or Trp.
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)
<223> Xaa is Phe,Leu,Ile,Trp or Met.
<400> 38
Asp Xaa Met Ile Gln Gly Gly Asp Xaa
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)
<223> Phe
<400> 39
Lys Tyr His Arg Val Ile Lys Asp Phe
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)
<223> Phe
<400> 40
Asp Tyr Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Gly Phe Met Cys Gln Gly Gly Asp Phe
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Ile
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Thr Phe His Arg Val Ile Pro Ser Phe
1 5
Claims (28)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열 번호: 1 - 36 또는 서열 번호: 41 - 43 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지고, HLA 항원에 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 의해 인식되는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드.
- 제 4 항에 있어서, 서열 번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드.
- 삭제
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- 하기의 아미노산 서열로 이루어지고, HLA 항원에 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 의해 인식되는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체:(ⅰ) 서열 번호: 1 - 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환된 아미노산 서열,(ⅱ) 서열 번호: 1 - 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열, 또는(ⅲ) 서열 번호: 1 - 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 서열 번호: 1 - 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열.
- 하기의 아미노산 서열로 이루어지고, HLA 항원에 결합할 수 있고 세포독성 T 임파구에 의해 인식되는 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체:(ⅰ) 서열 번호: 12 - 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민으로 치환된 아미노산 서열,(ⅱ) 서열 번호: 12 - 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 C-말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열, 또는(ⅲ) 서열 번호: 12 - 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 2 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민으로 치환되고, 서열 번호: 12 - 36 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 C-말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열.
- 제 8 항에 있어서, 서열 번호: 37 또는 38 에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체.
- 제 10 항에 있어서, 서열 번호: 39 또는 40 에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 서열에서 선택된 종양 항원 펩티드 유도체.
- 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 및 이들의 유도체들로부터 선택된 물질 하나 이상을 활성 성분으로써 함유하는, 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
- 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체, 또는 시클로필린, 상기 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 코드하는 유전자를 활성 성분으로써 함유하는, 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
- 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체, 또는 시클로필린 B, 상기 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 코드하는 유전자를 활성 성분으로써 함유하는, 종양의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
- 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체에 특이적으로 결합하는 항체.
- HLA 항원 및 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체 간의 복합체가 종양 환자로부터 분리된 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시된 항원-제시 세포.
- 종양 환자로부터 분리된 항원-제시능을 갖는 세포에 시클로필린, 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체, 또는 시클로필린을 코드하는 유전자를 이입하도록 하여 제조되는, HLA 항원 및 상기 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체 간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포.
- 종양 환자로부터 분리된 항원-제시능을 갖는 세포에 시클로필린 B, 제 4 항 또는 제 5 항의 종양 항원 펩티드, 또는 시클로필린 B 또는 상기 종양 항원 펩티드를 코드하는 유전자를 이입하도록 하여 제조되는, HLA 항원 및 상기 종양 항원 펩티드 간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포.
- 제 16 항에 따른 항원-제시 세포를 활성 성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물.
- HLA 항원 및 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구.
- 제 16 항에 따른 항원-제시 세포에 제시되는, HLA 항원 및 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구.
- 제 20 항에 따른 세포독성 T 임파구를 활성 성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물.
- 수탁 번호가 FERM BP-6725 인 세포독성 T 임파구.
- 제 23 항에 따른 KG-CTL의 이용을 포함하는, 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드의 규명 방법.
- 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체를 활성 성분으로 함유하는 종양의 진단 시약.
- 제 16 항에 따른 항원-제시 세포를 활성 성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물.
- 제 16 항에 따른 항원-제시 세포에 제시되는, HLA 항원 및 제 4 항, 제 5 항, 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 이들의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구.
- 제 20 항에 따른 세포독성 T 임파구를 활성 성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약학적 조성물.
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