ES2294844T3

ES2294844T3 - Peptidos antigenicos tumorales derivados de ciclofilina b.

Info

Publication number: ES2294844T3
Application number: ES99926783T
Authority: ES
Inventors: Kyogo Itoh; Shinya Gomi
Original assignee: Green Peptide Co Ltd
Current assignee: Green Peptide Co Ltd
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: AU749544B2; ATE375362T1; US7368107B2; DE69937294D1; KR100653590B1; NZ508996A; EP1090924A4; CN1525980A; EP1090924A1; KR20010053180A; AU4392699A; CA2331761A1; ID27788A; DE69937294T2; HK1067645A1; EP1090924B1; TWI228128B; EP1090924B8; WO1999067288A9; WO1999067288A1

Abstract

Un péptido antigénico tumoral que consta de 8 a 14 aminoácidos de longitud de la ciclofilina B que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID Nos: 1-36 y que se une a un antígeno HLA y es reconocido por linfocitos T citotóxicos.

Description

Péptidos antigénicos tumorales derivados de ciclofilina B.

La presente invención se refiere a nuevos péptidos antigénicos tumorales derivados de ciclofilina B y a derivados de los mismos que tienen propiedades funcionalmente equivalentes, y además a medicamentos, agentes profilácticos o de diagnóstico para tumores que utilizan in vivo o in vitro tales péptidos antigénicos tumorales, derivados de los mismos, polipéptidos de ciclofilina B o genes de los mismos.

Se sabe que el sistema inmune, particularmente las células T, desempeña una función importante en la eliminación de tumores por un organismo vivo. En efecto, se ha observado la infiltración de linfocitos que presentan efectos citotóxicos sobre las células tumorales en focos tumorales humanos (Arch. Surg., 126:200, 1990), y se han aislado de melanomas sin grandes dificultades linfocitos T citotóxicos (CTLs) que reconocen células tumorales autólogas (por ejemplo, Immunol. Today, 8:385, 1987; J. Immunol., 138:989, 1987; e Int. J. Cancer, 52:52, 1992). Además, los resultados del tratamiento clínico de melanomas mediante transferencia de los CTLs que reconocen células tumorales autólogas
sugieren también la importancia de las células T en la eliminación de tumores (J. Natl. Cancer Inst., 86:1159, 1994).

Aunque se desconocen desde hace mucho tiempo las moléculas diana para los CTLs que atacan las células tumorales autólogas, el reciente avance en inmunología y en biología molecular ha comenzado a elucidar gradualmente tales moléculas diana. Específicamente, se ha encontrado que el CTL, utilizando los receptores de células T (TCRs), reconoce un complejo entre un péptido, denominado péptido antigénico tumoral, y un antígeno del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (antígeno del MHC de clase I y, en el caso de humanos, referido como antígeno HLA), y ataca de este modo a las células tumorales autólogas.

Los péptidos antigénicos tumorales se generan por la degradación de proteínas específicas de los tumores, esto es, de proteínas antigénicas tumorales en las células con proteasomas, proteínas que son sintetizadas intracelularmente. Los péptidos antigénicos tumorales así generados se unen a los antígenos del MHC de clase I (antígenos HLA) en el retículo endoplásmico para formar complejos y los complejos son transportados a la superficie celular para ser presentados como un antígeno. Un CTL específico del tumor reconoce el complejo presentado como un antígeno y muestra efectos antitumorales a través de su acción citotóxica o de la producción de linfoquinas. Como consecuencia de la elucidación de una serie de acciones, ha sido posible tratar tumores mediante la utilización de proteínas antigénicas tumorales o de péptidos antigénicos tumorales como las denominadas vacunas contra el cáncer para incrementar los CTLs específicos del tumor en el organismo de un paciente tumoral.

Como proteína antigénica tumoral, T. Boon y col. identificaron por vez primera en 1991 una proteína denominada MAGE procedente de células de melanoma humano (Science, 254:1643, 1991). Posteriormente, se han identificado varias proteínas antigénicas tumorales adicionales procedentes principalmente de células de melanoma. Ejemplos de antígenos de melanoma que han sido identificados son proteínas melanosómicas tales como una proteína específica de tejido melanocítico, gp100 (J. Exp. Med., 179:1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994) y tirosinasa (J. Exp. Med., 178:489, 1993), proteínas relacionadas con MEGE que se expresan no sólo en melanomas sino también en varias células cancerosas y en células testiculares normales (J. Exp. Med., 179:921, 1994), \beta-catenina que tiene una mutación de aminoácidos específica del tumor (J. Exp. Med., 183:1185, 1996) y CDK4 (Science, 269:1281, 1995). Se han identificado también proteínas antigénicas tumorales distintas de las procedentes de melanomas, incluyendo productos de oncogenes tales como HER2-neu (J. Exp. Med., 181:2109, 1995) y p53 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14704, 1996), marcadores tumorales tales como CEA (J. Natl. Cancer Inst., 87:982, 1995) y PSA (J. Natl. Cancer Inst., 89:293, 1997), y proteínas víricas tales como HPV (J. Immunol., 154:5934, 1995) y EBV (Int. Immunol., 7:653, 1995). Descripciones detalladas de estos sujetos pueden encontrarse en revisiones publicadas (por ejemplo, Immunol. Today, 18:267, 1997; J. Exp. Med., 183:725, 1996; y Curr. Opin. Immunol., 8:628, 1996).

En las aplicaciones de una proteína antigénica tumoral o de un péptido antigénico tumoral para el tratamiento o diagnóstico de tumores, es importante identificar un antígeno tumoral que pueda ser ampliamente utilizado para tumores epiteliales tales como los cánceres gástricos y pulmonares que se presentan con una incidencia mucho más elevada en comparación con los melanomas. En relación con esto, los presentes inventores llevaron a cabo el clonaje de un gen que codificaba una nueva proteína antigénica tumoral procedente de células de carcinoma escamoso derivadas de cáncer de esófago e identificaron por vez primera a partir de células tumorales distintas de melanoma varios péptidos antigénicos tumorales que se unían a, y eran presentados sobre, antígenos HLA que eran HLA de los tipos HLA-A24 o HLA-A26 (J. Exp. Med., 187:277, 1998; Publicación de Patente Internacional WO 97/46676).

Cuando estos péptidos antigénicos tumorales son aplicados clínicamente en la práctica, es deseable utilizar dos o más péptidos antigénicos tumorales diferentes en lugar de utilizar solamente un único péptido. Es decir, considerando el hecho de que las células cancerosas no expresan todas en común un antígeno tumoral idéntico y que dos o más péptidos antigénicos tumorales diferentes son presentados en una sola célula cancerosa, se cree que un tratamiento utilizando dos o más péptidos antigénicos tumorales diferentes es más eficaz. En efecto, en el caso del melanoma, se ha intentado el desarrollo de formulaciones de cócteles que contienen dos o más péptidos, ya que un solo péptido derivado de un antígeno tumoral no mostró efectos adecuados (Int. J. Cancer, 66:162, 1996; e Int. J. Cancer, 67:54, 1996). Bajo tales circunstancias, se requiere la identificación de nuevas proteínas antigénicas tumorales y nuevos péptidos antigénicos tumorales que puedan ser utilizados ampliamente para tumores epiteliales tales como el cáncer gástrico y el cáncer de pulmón que se presentan con una elevada incidencia.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar nuevos péptidos antigénicos tumorales que constan de 8 a 14 aminoácidos de longitud de la ciclofilina B que contienen una secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36 y que se unen a un antígeno HLA y son reconocidos por linfocitos T citotóxicos, y derivados de los mismos que tienen propiedades funcionalmente equivalentes, así como medicamentos, agentes profilácticos y de diagnóstico para tumores que utilizan in vivo o in vitro los péptidos antigénicos tumorales, los derivados de los mismos, polipéptidos de ciclofilina B o genes de los mismos.

El péptido antigénico tumoral derivado de ciclofilina B de la presente invención comprende un péptido antigénico tumoral que se une a, y es presentado sobre, HLA-A24 y HLA-A2, que son antígenos HLA que llevan los japoneses y los caucásicos con una probabilidad elevada, y es también un péptido antigénico tumoral que puede ser aplicado para el tratamiento o la profilaxis de un amplio rango de tumores, incluyendo tumores epiteliales tales como cáncer de pulmón, cáncer de vejiga y osteosarcoma, y leucemias. Por consiguiente, se espera que la ciclofilina B, o los péptidos antigénicos tumorales derivados de ciclofilina B y un gen de los mismos, sean útiles como nuevos medicamentos antitumorales.

Con el fin de obtener nuevos péptidos antigénicos tumorales y una proteína antigénica tumoral de la que deriven dichos péptidos, los presentes inventores hicieron los intentos siguientes.

A partir de linfocitos de un paciente con adenocarcinoma de pulmón, los presentes inventores establecieron en primer lugar una línea celular de CTL que reconocía líneas celulares de cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, osteosarcoma o leucemia positivas para HLA-A24 o HLA-A2, y la denominaron KG-CTL (número de depósito: FERM BP-6725).

A continuación, se preparó una biblioteca de ADNc a partir de la línea celular de cáncer de vejiga HT-1376 con la cual la KG-CTL anterior reaccionaba potentemente, y células COS-7 fueron doblemente transfectadas con un plásmido recombinante de la biblioteca y con un plásmido recombinante que contenía ADNc de HLA-A2402 (un tipo de HLA-A24). Los transfectantes resultantes fueron tratados con la KG-CTL anterior y se midió la cantidad de IFN-\gamma producido con el fin de determinar si la KG-CTL estaba o no activada. Como resultado de tal ensayo de selección llevado a cabo repetidamente, los presentes inventores consiguieron finalmente clonar con éxito un gen que codificaba una proteína antigénica tumoral. La secuenciación de las bases del gen reveló que dicha proteína antigénica tumoral tenía la misma secuencia de aminoácidos que una proteína conocida, la ciclofilina B.

Se sabe que la ciclofilina B es una proteína de unión para un agente inmunosupresor, la ciclosporina A, y que participa en la activación de inmunocitos. Sin embargo, no se había sabido nunca antes de la presente invención que tenía una función como antígeno tumoral.

Posteriormente, los presentes inventores identificaron porciones peptídicas antigénicas tumorales en la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B que se unían a, y eran presentadas sobre, HLA-A24 y HLA-A2, y demostraron que la actividad como péptido antigénico tumoral residía en tales péptidos y en derivados de los mismos.

Además, los presentes inventores demostraron que homólogos de la ciclofilina B, las ciclofilinas A, C y D, tenían también actividades peptídicas antigénicas tumorales similares a las de la ciclofilina B.

La presente invención ha sido completada sobre la base de los hallazgos descritos anteriormente.

Por tanto, la presente invención se refiere a:

(1): un péptido antigénico tumoral que consta de 8 a 14 aminoácidos de longitud de la ciclofilina B, que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36 y que se une a un antígeno HLA y es reconocido por linfocitos T citotóxicos;

(2): el péptido antigénico tumoral de acuerdo con el punto (1) anterior, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2;

(3): un derivado del péptido antigénico tumoral de acuerdo con el punto (1) anterior, en el cual el residuo de aminoácido en posición 2 y/o el extremo C de la secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36 está sustituido por otro residuo de aminoácido y en el que el derivado se une a un antígeno HLA y es reconocido por linfocitos T citotóxicos;

(4): el derivado de acuerdo con el punto (3) anterior, en el cual el residuo de aminoácido en posición 2 y/o el extremo C de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2 está sustituido por otro residuo de aminoácido;

(5): el derivado de acuerdo con el punto (3) anterior, en el cual el residuo de aminoácido en posición 2 de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-11 está sustituido por tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y/o el residuo de aminoácido en el extremo C está sustituido por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina;

(6): el derivado de acuerdo con el punto (3) anterior, en el que el residuo de aminoácido en posición 2 de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 12-36 está sustituido por leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y/o el residuo de aminoácido en el extremo C está sustituido por valina o leucina;

(7): el derivado de acuerdo con el punto (5) anterior, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 37 ó 38;

(8): el derivado de acuerdo con el punto (7) anterior, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 39 ó 40;

(9): una composición farmacéutica que contiene al menos una de las sustancias seleccionadas de los péptidos antigénicos tumorales y derivados de los mismos de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (8) anteriores;

(10): una composición farmacéutica que contiene un polipéptido parcial de la ciclofilina B que comprende un péptido antigénico tumoral de acuerdo con los puntos (1) o (2) anteriores, o un gen que codifica el polipéptido parcial;

(11): un anticuerpo que se une específicamente al péptido antigénico tumoral o al derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (8) anteriores;

(12): una célula presentadora de antígeno en la que un complejo entre un antígeno HLA y el péptido antigénico tumoral o el derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (8) anteriores es presentado en la superficie de una célula con capacidad para presentar antígenos que ha sido aislada de un paciente tumoral;

(13): una célula presentadora de antígeno sobre la cual se presenta un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral derivado de ciclofilina B, siendo preparada dicha célula presentadora de antígeno permitiendo que una célula con capacidad para presentar antígenos aislada de un paciente tumoral sea incorporada con ciclofilina B, un polipéptido parcial de ciclofilina B que comprende el péptido antigénico tumoral de acuerdo con los puntos (1) o (2) anteriores, o un gen que codifique la ciclofilina B o el polipéptido parcial de la misma;

(14): una composición farmacéutica que contiene la célula presentadora de antígeno de acuerdo con los puntos (12) o (13) anteriores;

(15): un linfocito T citotóxico que reconoce específicamente un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (8) anteriores;

(16): un linfocito T citotóxico que reconoce específicamente un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo, que es presentado sobre una célula presentadora de antígeno de acuerdo con los puntos (12) o (13) anteriores;

(17): una composición farmacéutica que contiene el linfocito T citotóxico de acuerdo con los puntos (15) o (16) anteriores;

(18): un linfocito T citotóxico cuyo número de depósito es FERM BP-6725;

(19): un método para identificar proteínas antigénicas tumorales o péptidos antigénicos tumorales, que comprende la utilización de FERM BP-6725 de acuerdo con el punto (18) anterior;

(20): un agente para el diagnóstico de tumores que comprende un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (8) anteriores;

(21): utilización de al menos una de las sustancias seleccionadas de entre los péptidos antigénicos tumorales y los derivados de los mismos de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (8) anteriores, ciclofilina B, un polipéptido parcial de ciclofilina B que contiene un péptido antigénico tumoral de acuerdo con los puntos (1) o (2) anteriores, o un gen que codifica ciclofilina B o el polipéptido parcial de la misma, una célula presentadora de antígeno de acuerdo con los puntos (12) o (13) anteriores, o el linfocito T citotóxico de acuerdo con los puntos (15) o (16) anteriores, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores.

La presente invención está basada en nuestra primera demostración de que las sustancias denominadas ciclofilinas tienen actividad como proteínas antigénicas tumorales. Aunque la presente invención se describe con detalle a continuación con referencia a la ciclofilina B como material objeto de la presente invención, las descripciones siguientes no se limitan a ciclofilina B y se refieren también a las demás ciclofilinas conocidas, esto es a las ciclofilinas A, C y D (Biochemistry, 3:8218, 1994) las cuales, sin embargo, no están dentro del ámbito de la presente invención.

En la presente invención, el término "péptido antigénico tumoral" se refiere a un péptido parcial que comprende una parte de la ciclofilina B y que es capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por CTL. Por consiguiente, cualquier péptido entra dentro del ámbito del péptido antigénico tumoral de la presente invención, teniendo una longitud de 8 a 14 aminoácidos y comprendiendo una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID N^{os}: 1 a 36 que es parte de la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B humana, que está registrada en las bases de datos de WWW Entrez con el Nº de Acceso del GenBank M60857 y está descrita en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1903-1907, 1991, y un complejo entre dicho péptido y un antígeno HLA es capaz de ser reconocido por CTL. Tales péptidos antigénicos tumorales de la presente invención pueden ser identificados mediante la síntesis de un péptido candidato que contenga una parte de la ciclofilina B y la realización de un ensayo para determinar si un complejo entre el péptido candidato y un antígeno HLA es reconocido o no por CTL, en otras palabras, si el péptido candidato tiene o no actividad como péptido antigénico tumoral.

En conexión con esto, puede llevarse a cabo la síntesis de péptidos de acuerdo con un método utilizado normalmente en la química de péptidos. Ejemplos de tales métodos conocidos son los descritos en la literatura, incluyendo "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; e "Iyakuhin-no-Kaihatu", Zoku, vol. 14; "Peputido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991.

A continuación se describen adicionalmente métodos para identificar los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención.

Se conocen las reglas de secuencia respectivas (motivos) de los péptidos antigénicos que se unen a, y son presentados en, los siguientes tipos de HLA: HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401 y -Cw0602 (ver, por ejemplo, Immunogenetics, 41:178, 1995). Respecto al motivo para HLA-A24, por ejemplo, se sabe que en la secuencia de los péptidos que constan 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y el aminoácido en el extremo C es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina (J. Immunol., 152:3913, 1994; Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4307, 1994). De igual modo, para HLA-A2 se conocen los motivos mostrados en la Tabla 1 siguiente (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4749, 1995).

TABLA 1

1

Mediante el análisis de los péptidos antigénicos unidos a diferentes moléculas de HLA (Immunogenetics, 41:178, 1995), se ha demostrado que la longitud de los péptidos es normalmente de 8 a 14 aminoácidos aproximadamente, aunque se han observado también péptidos antigénicos de 14 o más aminoácidos de longitud para HLA-DR, -DP y -DQ.

Es fácil seleccionar las porciones peptídicas implicadas en tales motivos a partir de la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B. Esto es, tales porciones peptídicas implicadas en las estructuras de los motivos anteriores pueden ser fácilmente seleccionadas inspeccionando la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B. Los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención pueden ser posteriormente identificados mediante la síntesis de los péptidos candidatos así seleccionados, de acuerdo con el método anteriormente descrito, y la realización de un ensayo para determinar si un complejo entre el péptido candidato y un antígeno HLA es reconocido o no por CTL, en otras palabras, si el péptido candidato tiene o no actividad como péptido antigénico tumoral.

Un ejemplo específico del método para identificar los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención es un método descrito en J. Immunol., 154:2257, 1995. Específicamente, se aíslan linfocitos de sangre periférica de un humano que sea positivo para el tipo de antígeno HLA que se espera que presente al péptido candidato, y se estimulan in vitro por la adición del péptido candidato. Si el candidato induce CTL que reconozcan específicamente las células presentadoras de HLA-antígeno estimuladas con el péptido candidato, quiere decir que el péptido candidato puede funcionar como péptido antigénico tumoral. A este respecto, puede detectarse la presencia o ausencia de inducción de CTL midiendo, por ejemplo, la cantidad de varias citoquinas (por ejemplo, IFN-\gamma) producidas por los CTL en respuesta a las células presentadoras del péptido antigénico utilizando, por ejemplo, un método de ELISA. Alternativamente, puede utilizarse también para tal detección un método en el que se mida la citotoxicidad de los CTL contra las células presentadoras del péptido antigénico marcadas con ^{51}Cr (ensayo de liberación de ^{51}Cr, Int. J. Cancer, 58:317, 1994).

Además, la detección anterior puede ser también conseguida según sigue. Un plásmido de expresión que exprese un ADNc para el tipo de antígeno HLA que se espera que presente al péptido candidato es introducido en, por ejemplo, células COS-7 (Nº de ATCC CRL1651) o en células VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research), y las células resultantes son sometidas a un pulso con el péptido candidato. Las células son posteriormente tratadas con los CTLs según se describió anteriormente y se mide la cantidad de diferentes citoquinas (por ejemplo de IFN-\gamma) producidas por dichos CTLs (J. Exp. Med., 187:277, 1998).

Ejemplos específicos de diferentes ensayos como los descritos anteriormente se ilustran posteriormente en los Ejemplos 7, 10 y 12 de la presente más adelante.

La ciclofilina B contiene porciones de péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24 o HLA-A2. Con el fin de identificar los péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24, puede utilizarse ADNc de HLA-A24 (Cancer Res., 55:4248-4252, Nº de Acceso del GenBank M64740) como un ADNc que codifica el antígeno HLA, junto con los CTLs que son preparados mediante la estimulación con el péptido de linfocitos de sangre periférica humana o de KG-CTL (FERM BP-6725). De igual modo, para los péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A2, puede conseguirse la identificación de tales péptidos antigénicos tumorales de manera similar a la descrita anteriormente, excepto en que se utiliza ADNc de HLA-A2 (Nº de Acceso del GenBanK M84379).

Aparte de los casos anteriores en los cuales se han elucidado las reglas (motivos) de la secuencia, en los casos en los que no se haya elucidado el motivo peptídico relevante como HLA-A26, los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención pueden ser identificados, por ejemplo, según el método descrito en WO 97/46676, siempre que esté disponible una línea de CTL que reconozca un complejo entre HLA-A26 y un péptido antigénico tumoral.

Los métodos para identificar péptidos antigénicos tumorales según se describió anteriormente pueden ser denominados colectivamente de aquí en adelante como "métodos de ensayo para péptidos antigénicos tumorales".

Según se describió anteriormente, se sabe que las secuencias de los péptidos antigénicos tumorales que se unen a, y son presentados sobre, HLA-A24 obedecen cierta regla (motivo) y, en particular, el motivo es que en una secuencia de un péptido que conste de 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2, es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y el aminoácido en el extremo C es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina (J. Immunol., 152:3913, 1994; Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4307, 1994). De igual modo, puede encontrarse una regla (motivo) similar en las secuencias de los péptidos antigénicos tumorales que se unen a, y son presentados sobre, HLA-A2 y, en particular, se conocen los motivos mostrados en la Tabla 1 anterior (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4749, 1995). Por consiguiente, entre los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención, los péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24 y HLA-A2 están ejemplificados por aquellos péptidos antigénicos tumorales que son péptidos parciales implicados en tales estructuras de los motivos de la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B y que son capaces de unirse a los antígenos HLA respectivos y ser reconocidos por CTLs.

Ejemplos particulares de péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24 anteriormente descritos son aquellos péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-11 y que son capaces de unirse a un antígeno HLA-A24 y ser reconocidos por CTL. De igual modo, ejemplos particulares de péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A2 son aquellos péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 12-36 y que son capaces de unirse a un antígeno HLA-A2 y ser reconocidos por CTL.

Por tanto, ejemplos de péptidos antigénicos tumorales de la presente invención incluyen:

1): péptidos que constan de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36,

2): péptidos que comprenden la longitud completa de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36 y que están prolongados en dirección N-terminal y/o C-terminal en comparación con dicha secuencia de aminoácidos, o péptidos que constan de una porción consecutiva de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36, siendo capaces dichos péptidos de unirse a los antígenos HLA respectivos y ser reconocidos por CTLs. En este contexto, los péptidos del punto 2) anterior pueden tener 8-14 aminoácidos de longitud aproximadamente a la vista del hecho de que se unen a, y son presentados por, los antígenos HLA respectivos.

Ejemplos adecuados de péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24 de la presente invención incluyen aquellos péptidos antigénicos tumorales que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2 y que son capaces de unirse a un antígeno HLA-A24 y ser reconocidos por CTLs. Por tanto, son ejemplos:

1): péptidos que constan de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2,

2): péptidos que comprenden la longitud completa de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2 y que están prolongados en dirección N-terminal y/o C-terminal en comparación con dicha secuencia de aminoácidos, o péptidos que constan de una porción consecutiva de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2,

siendo capaces dichos péptidos de unirse a antígenos HLA-A24 y ser reconocidos por CTLs. En este contexto, los péptidos del punto 2) anterior pueden tener 8-14 aminoácido de longitud aproximadamente a la vista del hecho de que se unen a, y son presentados sobre, antígenos HLA-A24.

En la presente invención, el término "derivado con propiedades funcionalmente equivalentes a las de un péptido antigénico tumoral" (en la presente más adelante puede ser referido sencillamente como derivado de un péptido antigénico tumoral), se refiere a un péptido alterado cuya secuencia de aminoácidos contiene una sustitución de uno o dos residuos de aminoácidos específicos de una secuencia de aminoácidos de un péptido antigénico tumoral de la presente invención, y que tiene las mismas propiedades que el péptido antigénico tumoral, que es capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por CTL.

La longitud de los derivados del péptido antigénico tumoral de la presente invención es de 8 a 14 aminoácidos como en el caso del péptido antigénico tumoral anteriormente descrito.

Tales derivados de un péptido antigénico tumoral de la presente invención pueden ser identificados sintetizando péptidos alterados que contengan la alteración de una parte de un péptido antigénico tumoral de la presente invención de acuerdo con la preparación anterior del péptido, y llevando a cabo el ensayo anterior para péptidos antigénicos tumorales.

Según se describió anteriormente, las reglas (motivos) de la secuencia para péptidos que se unen a, y son presentados en, tipos de HLA tales como HLA-A0201, -A0204, -A0205, -A0206 y -A0207 han sido elucidadas. Por consiguiente, los derivados de péptidos antigénicos tumorales que contienen una sustitución de uno o dos aminoácidos específicos de un péptido antigénico tumoral de la presente invención pueden ser preparados sobre la base de tales motivos.

Por ejemplo, con relación al motivo de los péptidos antigénicos que se unen a, y son presentados en, HLA-A24, se sabe, según se describió anteriormente, que en la secuencia de un péptido que consta de 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y el aminoácido en el extremo C es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina (J. Immunol., 152:3913, 1994; Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4307, 1994). De igual modo, los motivos mostrados en la Tabla 1 anterior son conocidos para HLA-A2. Además, pueden aceptarse también residuos de aminoácidos que tengan propiedades similares a las de los aminoácidos de acuerdo con los motivos. Por tanto, ejemplos de derivados de péptidos antigénicos tumorales de la presente invención incluyen aquellos derivados peptídicos que comprenden el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que uno o dos residuos de aminoácidos en cualquiera de las posiciones en las que puede permitirse una sustitución de acuerdo con los motivos (para HLA-A24 y HLA-A2, la posición 2 y el extremo C) están sustituidos por otros aminoácidos, y derivados que tienen la actividad de unirse a antígenos HLA y ser reconocidos por CTLs. Ejemplos preferidos son aquellos derivados de los péptidos antigénicos tumorales que comprenden el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que la sustitución de los residuos de aminoácidos es seleccionada de la de los residuos de aminoácidos en dichas posiciones de acuerdo con los motivos anteriores, y derivados que tienen la actividad anterior. La longitud de la secuencia de aminoácidos es de 8 a 14 aminoácidos.

Ejemplos de derivados de péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24 o HLA-A2, incluyen aquellos derivados peptídicos que son el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que uno o dos residuos de aminoácidos en las posiciones en las que se permite la sustitución de acuerdo con los motivos anteriores, específicamente en la posición 2 y/o en el extremo C, de un péptido derivado de la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B que tiene un motivo de unión para HLA-A24 o HLA-A2, son sustituidos por otros residuos de aminoácidos, y derivados que tienen la actividad anterior. Ejemplos preferidos son aquellos derivados de péptidos antigénicos tumorales que son el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que los residuos de aminoácidos en posición 2 y/o en el extremo C están sustituidos por residuos de aminoácidos de acuerdo con los motivos anteriores, y derivados que tienen la actividad anterior. En tales derivados de péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24 o HLA-A2, una longitud preferida de la secuencia de aminoácidos es de 8 a 11 aminoácidos. Específicamente, ejemplos de derivados de antígenos tumorales restringidos por HLA-A24 son aquellos derivados de péptidos antigénicos tumorales que son el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que el residuo de aminoácido en posición 2 de una secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1 a 11 está sustituido por tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano y/o el residuo de aminoácido en el extremo C está sustituido por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina, y derivados que tienen la actividad anterior. De igual modo, ejemplos de derivados antigénicos tumorales restringidos por HLA-A2 son aquellos derivados de péptidos antigénicos tumorales que son el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que el residuo de aminoácido en posición 2 de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 12 a 36 está sustituido por leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y/o el residuo de aminoácido en el extremo C está sustituido por valina o leucina y derivados que tienen la actividad anterior.

Ejemplos adecuados de derivados de péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24 de la presente invención, son aquellos derivados de péptidos antigénicos tumorales que son el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que los residuos de aminoácidos en posición 2 y/o del extremo C de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2 están sustituidos por otros residuos de aminoácidos y derivados que tienen la actividad anterior. Ejemplos más preferidos son aquellos derivados de péptidos antigénicos tumorales que son el péptido antigénico tumoral de la presente invención en el que uno o más residuos de aminoácidos están sustituidos según los motivos anteriores, que es un derivado según se definió anteriormente que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 37 ó 38 y derivados que tienen la actividad anterior. Ejemplos adecuados de tales derivados de péptidos antigénicos tumorales están mostrados en las SEC ID N^{os}: 39 y 40.

Un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención, puede ser utilizado para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de tumores según sigue.

Cuando se utiliza con el objetivo de prevenir o tratar tumores, al menos uno de, o una combinación de dos o más de, los péptidos antigénicos tumorales o sus derivados de la presente invención, es administrado a un paciente, si es necesario, en combinación con otros agentes tales como otros péptidos antigénicos tumorales. Cuando la composición para tratar o prevenir tumores que contiene como ingrediente activo un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención es administrada a un paciente positivo para ciclofilina B, el péptido antigénico tumoral o el derivado del mismo es presentado a una densidad elevada con un antígeno HLA de las células presentadoras de antígeno y, por tanto, CTLs específicos para el complejo del antígeno HLA presentado proliferan y destruyen las células tumorales. Como resultado, el tumor del paciente puede ser tratado, o bien puede prevenirse la proliferación o la metástasis del tumor. Además, la composición para prevenir o tratar tumores que contiene como ingrediente activo un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención, puede conseguir un efecto terapéutico incrementado mediante su utilización combinada con quimioterapia o radioterapia.

La composición para el tratamiento o la prevención de tumores que contiene como ingrediente activo un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención, puede ser administrada junto con un adyuvante con el fin de establecer eficazmente la inmunidad celular, o puede ser administrada en una forma de dosificación particulada. Para tal fin, son aplicables los adyuvantes descritos en la literatura (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994). Además, son también posibles preparaciones de liposomas, preparaciones particuladas en las que el ingrediente está unido a esferas que tienen un diámetro de varios \mum, o preparaciones en las que el ingrediente está unido a lípidos. La administración puede ser llevada a cabo, por ejemplo, intradérmicamente, hipodérmicamente o mediante inyección intravenosa. Aunque la cantidad del péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención en la formulación que va a ser administrada puede ser ajustada según sea apropiado dependiendo de, por ejemplo, la enfermedad a tratar, la edad y el peso corporal del paciente particular, se prefiere normalmente administrar de 0,0001 mg a 1000 mg, preferiblemente de 0,001 mg a 1000 mg y, más preferiblemente, de 0,1 mg a 10 mg cada varios días a cada varios meses.

Además, la proteína ciclofilina B de la que derivan los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención o un gen que codifique dicha ciclofilina B, pueden ser utilizados también para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de tumores. Además de la ciclofilina B de longitud completa o del gen de la misma de longitud completa, cualquier parte de los mismos, tal como partes unidas entre sí, o incluso aquellas que contienen alteraciones en su secuencia de bases o en su secuencia de aminoácidos, puede conseguir el tratamiento o la prevención de tumores deseados siempre que contenga al menos una de las porciones del péptido que pueden unirse a un antígeno HLA y ser reconocidas por CTLs. En este contexto, aquellas sustancias que "contienen al menos una de las porciones del péptido que pueden unirse a un antígeno HLA y ser reconocidas por CTLs", son referidas en la presente como "polipéptidos parciales".

Cuando la proteína ciclofilina B o su polipéptido parcial son aplicados como composición para el tratamiento o prevención de tumores, pueden ser administrados en una forma de dosificación, con un modo de administración y una dosis similares a los del péptido antigénico tumoral o derivado del mismo anterior. Cuando se administra a un paciente tumoral, la proteína ciclofilina B o su polipéptido parcial es incorporada a las células presentadoras de antígeno y los péptidos antigénicos tumorales que se generan a continuación mediante degradación intracelular se unen a los antígenos HLA para formar complejos. Los complejos son presentados a una densidad elevada sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno y los CTLs específicos para el complejo presentado proliferan eficazmente en el organismo y destruyen las células tumorales. De esta manera, se consigue el tratamiento o la prevención de tumores.

Con el fin de aplicar un gen que codifique la ciclofilina B o su polipéptido parcial a una composición para el tratamiento o la prevención de tumores, pueden utilizarse los métodos siguientes.

La administración y la introducción del gen de la presente invención en las células puede conseguirse utilizando vectores víricos o de acuerdo con cualquiera de otros procedimientos (Nikkei-Science, Abril, 1994, pp. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(5), 1994, y las referencias citadas en los mismos).

Ejemplos de métodos que utilizan vectores víricos incluyen aquellos métodos en los que el ADN de la presente invención es incorporado a virus ADN o ARN tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus o virus Sindbis, e introducido en las células. Entre estos métodos, se prefieren particularmente los que utilizan retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados o virus vaccinia.

Otros métodos pueden incluir aquéllos en los que plásmidos de expresión son inyectados directamente por vía intramuscular (vacunación con ADN), el método de liposomas, el método de Lipofectina, microinyección, el método del fosfato de calcio y electroporación, siendo particularmente preferidos el método de vacunación con ADN y el método de liposomas.

Con el fin de permitir que un gen de la presente invención actúe como medicina en la práctica, puede utilizarse cualquiera de dos métodos: un método in vivo en el que el ADN es introducido directamente en el organismo, o un método ex vivo en el que ciertas células son extraídas de un humano y, después de introducir extracorpóreamente ADN en dichas células, las células son reintroducidas en el organismo (Nikkei-Science, Abril, 1994, pp. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(5), 1994; y las referencias citadas en los mismos). Es más preferido un método in vivo.

En el caso de los métodos in vivo, el gen puede ser administrado por cualquier vía apropiada dependiendo de la enfermedad y los síntomas a tratar y de otros factores. Por ejemplo, puede ser administrado por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intracutánea o intramuscular. En el caso de los métodos in vivo, las composiciones pueden ser administradas en varias formas de dosificación tales como una solución, y son formuladas típicamente, por ejemplo, en forma de inyección conteniendo el ADN de la presente invención como ingrediente activo, a la cual pueden añadirse también vehículos convencionales, si es necesario. Si un gen de la presente invención es incluido en liposomas o en liposomas fusionados a membranas (tales como virus Sendai (HVJ)-liposomas), las composiciones pueden estar en forma de formulaciones liposomales tales como suspensiones, fármaco congelado, fármaco congelado concentrado mediante centrifugación, o similares.

Aunque la cantidad del gen de la presente invención en tales formulaciones puede variar dependiendo de la enfermedad a tratar, de la edad y el peso del paciente, etcétera, se prefiere típicamente administrar 0,0001-100 mg, preferiblemente 0,001-10 mg, de un gen de la presente invención cada varios días a cada varios meses.

Mediante tal administración de un gen de la presente invención, la proteína antigénica tumoral es altamente expresada en las células presentadoras de antígeno. Los péptidos antigénicos tumorales que se generan posteriormente por degradación intracelular, se unen a los antígenos HLA para formar complejos y los complejos son presentados densamente sobre la superficie celular. Como resultado, CTLs específicos para estos complejos proliferan eficazmente en el organismo y destruyen las células tumorales. De esta forma, se consigue el tratamiento o la prevención de la proliferación o metástasis de los tumores.

La ciclofilina B, polipéptidos parciales de la misma y genes que codifican tales sustancias que pueden ser utilizadas como medicamentos según se describió anteriormente, pueden ser preparados según sigue. Un gen que codifique ciclofilina B puede ser fácilmente clonado mediante la preparación de cebadores de PCR apropiados sobre la base de la secuencia de bases del ADNc de la ciclofilina B humana registrado en el GenBank bajo el Nº de Acceso M60857 encontrada mediante la búsqueda en las bases de datos WWW Entrez, y la utilización de los mismos para llevar a cabo una PCR de acuerdo con la descripción de un texto estándar tal como "Molecular Cloning", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Para este fin, puede consultarse también Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1903, 1991, que es un informe que tiene que ver con el clonaje de la ciclofilina B. Además, puede utilizarse también un clon de ADNc de ciclofilina B disponible comercialmente (Nº de ATCC 107758, Denominaciones: HTNAQ10). Si se desea, puede realizarse fácilmente una alteración de acuerdo con un texto estándar tal como el anteriormente mencionado "Molecular Cloning". Además, puede conseguirla la expresión de la proteína ciclofilina B utilizando un gen que codifique la ciclofilina B humana así clonado de acuerdo con muchas publicaciones y referencias tales como "Molecular Cloning" anteriormente mencionada. Se construye un plásmido de expresión que se replique y funcione en células huésped mediante la incorporación del ADN que va a ser expresado a un vector apropiado (por ejemplo, pSV-SPORT1), en algunos casos después de añadir secuencia(s) reguladora(s) tal(es) como una secuencia promotora que controle la transcripción (por ejemplo, trp, lac, T7 o el promotor temprano de SV40), al ADN corriente arriba. El plásmido de expresión es introducido posteriormente en células huésped apropiadas para obtener transformantes. Ejemplos de células huésped incluyen, por ejemplo, procariotas tales como Escherichia coli, eucariotas unicelulares tales como levaduras y células derivadas de eucariotas multicelulares tales como insectos o animales. La transferencia de genes a las células huésped puede ser realizada mediante el método del fosfato de calcio, el método del DEAE-dextrano, el método del pulso eléctrico o similares. Los transformantes cultivados en un medio apropiado producen la proteína de interés. La proteína antigénica tumoral así obtenida puede ser aislada y purificada de acuerdo con procedimientos bioquímicos estándar.

Puede determinarse si la proteína ciclofilina B, un polipéptido parcial de la misma o un gen que codifique tal sustancia preparados según se describió anteriormente tienen o no actividad como antígeno tumoral, esto es, si se generan o no péptidos antigénicos tumorales capaces de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por CTL por la degradación intracelular de dicha proteína, mediante, por ejemplo, un método que utilice la expresión del gen según sigue.

En primer lugar, un plásmido de expresión conteniendo un gen o un fragmento génico candidato y otro plásmido de expresión conteniendo ADN que codifique un antígeno HLA son transfectados doblemente en células que no expresen proteínas antigénicas tumorales tales como COS-7 (ATCC CRL 1651) derivadas de riñón del mono verde africano, o fibroblastos VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research). La transfección puede ser llevada a cabo, por ejemplo, mediante el método de la Lipofectina utilizando el reactivo Lipofectamina (Gibco BRL). A continuación, se añade un CTL sensible al tumor que esté restringido por el antígeno HLA particular utilizado, se deja que actúe sobre los transfectantes y posteriormente puede medirse la cantidad de ciertas citoquinas (por ejemplo, IFN-\gamma) producidas por dicho CTL en respuesta a las células diana mediante, por ejemplo, un ELISA, para determinar si el gen candidato es un ADN que codifica una proteína antigénica tumoral. Como la ciclofilina B contiene porciones del péptido antigénico tumoral restringidas por HLA-A24 o HLA-A2, puede utilizarse, por ejemplo, ADNc de HLA-A24 (Cancer Res., 55:4248-4252 (1995); Nº de Acceso del GenBank M64740) o ADNc de HLA-A2 (Nº de Acceso del GenBank M84379) como el ADN anterior que codifica el antígeno HLA, y pueden utilizarse aquellos CTLs que son preparados a partir de linfocitos de sangre periférica humana, así como KG-CTL (FERM BP-6725), como el CTL anterior.

Un ejemplo específico de la medida de tal actividad se describe posteriormente en el Ejemplo 2.

Están también incluidos en la presente invención anticuerpos que se unan específicamente a un péptido antigénico tumoral de la presente invención o a un derivado del mismo. Tales anticuerpos son preparados fácilmente, por ejemplo, según un método descrito en "Antibodies: A Laboratory Manual", Lane, H.D. y col. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989. Específicamente, pueden prepararse fácilmente anticuerpos que reconozcan un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención y anticuerpos que neutralicen además su actividad, utilizando el péptido antigénico tumoral o el derivado del mismo para inmunizar apropiadamente un animal de la manera habitual. Tales anticuerpos pueden ser utilizados en cromatografía de afinidad, diagnóstico inmunológico, etcétera.

El diagnóstico inmunológico para detectar la presencia o ausencia de tumores utilizando dicho anticuerpo puede ser llevado a cabo marcando primeramente el anticuerpo anterior según sea necesario, y utilizando el mismo para detectar la presencia de antígenos en una muestra (tal como sangre, tejido tumoral) obtenida de un paciente sospechoso de tener un tumor. En particular, tal diagnóstico inmunológico puede ser seleccionado como apropiado de entre inmunotransferencia, radioinmunoensayo (RIA), ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), un ensayo fluorescente o luminiscente, etcétera.

Un péptido antigénico tumoral, un derivado del mismo, una proteína antigénica tumoral (ciclofilina B) o un gen de los mismos de la presente invención pueden ser utilizados también in vitro para el tratamiento de pacientes con tumores según sigue.

En la utilización de un péptido antigénico tumoral, de un derivado del mismo, de una proteína antigénica tumoral o de un gen de los mismos para el tratamiento de un tumor, es importante establecer un método de administración que pueda inducir eficazmente CTLs específicos en el organismo del paciente. Como uno de los medios para ello, la presente invención proporciona una célula presentadora de antígeno que contiene un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención, estando presentado el complejo en la superficie de la célula que tiene capacidad presentadora de antígenos aislada del paciente tumoral, y proporciona también una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores que contiene como ingrediente activo dicha célula presentadora de antígenos.

En este contexto, la "célula con capacidad presentadora de antígenos" no está específicamente restringida, siempre que sea una célula que exprese en su superficie celular un antígeno HLA capaz de presentar un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención, y se prefieren las células dendríticas, de las que se ha descrito que tienen especialmente una elevada capacidad presentadora de antígenos. La sustancia que ha de ser añadida para preparar una célula presentadora de antígenos de la presente invención a partir de la célula anteriormente mencionada con capacidad presentadora de antígenos, puede ser el péptido antigénico tumoral o sus derivados de la presente invención, así como la proteína antigénica tumoral, ciclofilina B, y un gen de los mismos. Para preparar una célula presentadora de antígeno de la presente invención, puede utilizarse no sólo la ciclofilina B de longitud completa y el gen de la misma, sino también su polipéptido parcial y un gen del mismo. Cuando se utiliza en forma de proteína o gen, es necesario que sea incorporada a las células. A este respecto, ver las descripciones anteriores sobre la composición para el tratamiento o prevención de tumores que contiene el gen o la proteína como ingrediente activo.

Para preparar las células presentadoras de antígeno de la presente invención, se aíslan del paciente tumoral células con capacidad presentadora de antígeno y se estimulan ex vivo con un péptido antigénico tumoral, un derivado del mismo, una proteína antigénica tumoral o su polipéptido parcial de la presente invención, con el fin de formar un complejo entre un antígeno HLA y dicho péptido antigénico tumoral o derivado del mismo (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998; J. Immunol. 158:1796, 1997; Cancer Res., 59:1184, 1999). Cuando se utilizan células dendríticas, las células presentadoras de antígeno de la presente invención pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante el aislamiento de linfocitos de sangre periférica de un paciente tumoral utilizando el método de Ficoll, la eliminación de las células no adherentes, la incubación de las células adherentes en presencia de GM-CSF e IL-4 para inducir células dendríticas y la incubación y estimulación de dichas células dendríticas con un péptido antigénico tumoral, una proteína antigénica tumoral de la presente invención, o similares. Para más detalles ver el Ejemplo 11.

Cuando las células presentadoras de antígeno de la presente invención son preparadas mediante la introducción de un gen que codifique una proteína antigénica tumoral o su polipéptido parcial de la presente invención en las células anteriormente mencionadas con capacidad presentadora de antígeno, dicho gen puede estar en forma de ADN o ARN. En particular, puede utilizarse ADN consultando, por ejemplo, Cancer res., 56:5672, 1996 o J. Immunol., 161:5607, 1998, y puede utilizarse ARN consultando, por ejemplo, J. Exp. Med., 184:465, 1996.

Una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores que contenga como ingrediente activo las células presentadoras de antígeno anteriores, contiene preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio o similares con el fin de mantener de manera estable las células presentadoras de antígeno. Puede ser administrada, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente o intradérmicamente. Mediante la reintroducción en el cuerpo del paciente de tal composición para el tratamiento de tumores que contiene como ingrediente activo las células presentadoras de antígeno, se inducen eficazmente CTLs específicos en el paciente positivo para ciclofilina B para conseguir el tratamiento del tumor. Es indiscutible el que los tipos de HLA entre el paciente y el péptido utilizado necesitan ser compatibles. Por ejemplo, un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo restringido por HLA-A24 debe ser utilizado con un paciente tumoral positivo para HLA-A24.

Además, otro ejemplo de utilización in vitro de un péptido antigénico tumoral, un derivado del mismo, una proteína antigénica tumoral o un gen de los mismos de acuerdo con la presente invención es en la inmunoterapia adoptiva siguiente.

Para melanomas, se ha observado que una inmunoterapia adoptiva en la cual células T que se infiltran en el tumor tomadas del(la) propio(a) paciente son cultivadas ex vivo en grandes cantidades y retornadas posteriormente al paciente, consigue un efecto terapéutico (J. Natl. Cancer Inst., 86:1159, 1994). De igual modo, en melanoma de ratón, se ha observado una supresión de las metástasis mediante la estimulación in vitro de esplenocitos con un péptido antigénico tumoral, TRP-2, proliferando de este modo CTLs específicos para el péptido antigénico tumoral, y la administración de dichos CTLs a un ratón con un melanoma injertado (J. Exp. Med., 185:453, 1997). Esto fue el resultado de la proliferación in vitro de CTLs que reconocían específicamente el complejo entre un antígeno HLA de las células presentadoras de antígeno y el péptido antigénico tumoral. Por consiguiente, se cree útil un método para el tratamiento de tumores que comprende la estimulación in vitro de linfocitos de sangre periférica de un paciente utilizando un péptido antigénico tumoral, un derivado del mismo, una proteína antigénica tumoral o un gen de los mismos de acuerdo con la presente invención para hacer proliferar CTLs específicos del tumor y el retorno posterior de los CTLs al paciente.

Por tanto, la presente invención proporciona CTLs que reconocen específicamente un complejo entre el antígeno HLA y el péptido antigénico tumoral o el derivado del mismo, y proporciona también una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores que contiene dichos CTLs como ingrediente activo. Tal composición contiene preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio o similares con el fin de mantener de manera estable los CTLs. Puede ser administrada, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente o intradérmicamente. Mediante la reintroducción de la composición para el tratamiento de tumores que contiene como ingrediente activo CTLs en el cuerpo del paciente, se incrementa el efecto tóxico de los CTLs contra las células tumorales en el paciente positivo para ciclofilina B y se destruyen de este modo las células tumorales para conseguir el tratamiento del tumor.

Las proteínas antigénicas tumorales, los péptidos antigénicos tumorales y los derivados de los mismos de acuerdo con la presente invención, pueden ser también utilizados como ingrediente activo de un agente de diagnóstico para diagnosticar tumores. Así, mediante la utilización de una proteína antigénica tumoral, de un péptido antigénico tumoral o de un derivado de los mismos de acuerdo con la presente invención por sí mismos como un agente de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos en una muestra (tal como sangre o un tejido tumoral) obtenida de un paciente sospechoso de tener un tumor, es posible la detección temprana de tumores y el diagnóstico de recurrencias y de metástasis. El mismo procedimiento puede ser también utilizado para la selección de pacientes tumorales a los que puedan aplicarse medicinas que contengan como ingrediente activo, por ejemplo, una proteína antigénica tumoral o un péptido antigénico tumoral de la presente invención. En particular, tal diagnóstico puede ser llevado a cabo utilizando inmunotransferencia, RIA, ELISA o un ensayo fluorescente o luminiscente.

Además, en los años recientes, se ha establecido un nuevo método de detección para detectar CTLs específicos de un antígeno utilizando un complejo entre el péptido antigénico y un antígeno HLA (Science, 274:94, 1996). Es posible la detección temprana de tumores y el diagnóstico de una recurrencia o de metástasis sometiendo a un complejo entre un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con la presente invención y un antígeno HLA al método de detección anterior y detectando mediante el mismo CTLs específicos para el antígeno tumoral. El mismo procedimiento puede ser también utilizado para la selección de pacientes tumorales a los que pueda aplicarse una medicina que contenga como ingrediente activo, por ejemplo, una proteína antigénica tumoral o un péptido antigénico tumoral de la presente invención, o para la determinación del efecto terapéutico de dicha medicina. Por tanto, la presente invención proporciona también un agente de diagnóstico para tumores que comprende como parte del ingrediente activo un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con la presente invención.

En particular, tal diagnóstico puede ser llevado a cabo según sigue: se prepara un tetrámero de un complejo entre un antígeno HLA marcado fluorescentemente de acuerdo con un método descrito en la literatura (Science, 274:94, 1996) y un péptido antigénico tumoral y se utiliza para determinar cuantitativamente los CTLs específicos para el péptido antigénico en linfocitos de sangre periférica de un paciente sospechoso de tener un tumor, utilizando un citómetro de flujo.

La presente invención proporciona también KG-CTL (número de depósito FERM BP-6725) que es un CTL establecido a partir de linfocitos infiltrantes de tumores derivados de adenocarcinoma de pulmón. Se ha demostrado que KG-CTL responde a las células cancerosas positivas para HLA-A24 y HLA-A2, y también la ciclofilina B de la presente invención es una proteína antigénica tumoral descubierta por la utilización como indicador de su reactividad con dicho KG-CTL. Por tanto, pueden encontrarse nuevas proteínas antigénicas tumorales y nuevos péptidos antigénicos tumorales, igual que ocurrió con la ciclofilina B, mediante la utilización de KG-CTL. Para más detalles, ver el Ejemplo 2 posterior.

La Figura 1 es una gráfica que indica los resultados de una medición en la que células COS-7 transfectadas con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 o con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2601 fueron cocultivadas con KG-CTLs después de la adición de un péptido antigénico tumoral de la presente invención, "84-92 (SEC ID Nº: 1)", y se midió la cantidad de IFN-\gamma producida por los KG-CTLs. El eje de abscisas indica la concentración añadida del péptido y el eje de ordenadas indica la cantidad de IFN-\gamma producida por los KG-CTLs.

La Figura 2 es una gráfica que indica los resultados de una medición en la que células COS-7 transfectadas con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2420 o con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2601 fueron cocultivadas con KG-CTLs después de la adición de un péptido antigénico tumoral de la presente invención, "91-99 (SEC ID Nº: 2)", y se midió la cantidad de IFN-\gamma producida por los KG-CTLs. El eje de abscisas indica la concentración añadida del péptido y el eje de ordenadas indica la cantidad de IFN-\gamma producida por los KG-CTLs.

La presente invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos siguientes, pero no está de ningún modo limitada por estos ejemplos.

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Ejemplo 1 Establecimiento de una Línea Celular de Linfocitos T Citotóxicos (CTLs) a Partir de Linfocitos Infiltrantes de Tumores (TILs) Derivados de Adenocarcinoma de Pulmón

Una muestra quirúrgica tomada de un paciente con adenocarcinoma de pulmón fue dividida en pequeños fragmentos en un medio de cultivo y las células fueron suspendidas posteriormente en un medio de cultivo que contenía colagenasa y ADNasa. De la suspensión celular, se separaron los linfocitos mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando una solución Ficoll-Conray. Los linfocitos fueron cultivados en un medio de cultivo (de aquí en adelante referido como medio de linfocitos) que constaba de un 45% de RPMI-1640, un 45% de AIM-V (Gibco BRL) y un 10% de FCS, suplementado con 100 U/ml de interleuquina-2 y NEAA 0,1 mM (Gibco BRL). Durante los dos primeros días del cultivo, se añadió al medio de cultivo un anticuerpo NU-T3 anti-CD3 (Nichirei Corporation) a 1 \mug/ml. El cultivo se continuó durante más de 30 días y de este modo se estableció una línea de CTL que respondía a varios tipos de líneas celulares cancerosas positivas para HLA-A24 o HLA-A2. La línea de CTL fue denominada KG-CTL y se utilizó en los experimentos siguientes. Las reactividades de KG-CTL frente a varias líneas de células cancerosas fueron determinadas según sigue. Las líneas de células cancerosas fueron sembradas en los pocillos de una placa de 96 pocillos a 1 x 10^{4} células/pocillo. Al día siguiente, se añadieron los KG-CTLs a 1 x 10^{5} células/pocillo, se cultivaron posteriormente durante 18 horas y se recogió luego el medio de cultivo para determinar la cantidad de interferón-\gamma (IFN-\gamma) producida por los KG-CTLs. La determinación cuantitativa de IFN-\gamma se llevó a cabo mediante un inmunoensayo enzimático (ELISA). Específicamente, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IFN-\gamma humano fue adsorbido sobre los pocillos de una microplaca de 96 pocillos como anticuerpo en fase sólida, y después de bloquear las uniones no específicas con seroalbúmina bovina, se dejó que el IFN-\gamma de la muestra se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se dejó que un anticuerpo policlonal de conejo anti-IFN-\gamma humano se uniera como anticuerpo de detección. Después de la unión de un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de conejo marcado con fosfatasa alcalina, se permitió la formación de color utilizando un kit T para la formación de color con peroxidasa (Sumitomo Bakelite Co.), y se midió posteriormente la absorbancia (405 nm). Se comparó con los valores obtenidos con IFN-\gamma estándar para determinar cuantitativamente la cantidad de IFN-\gamma. Las reactividades de KG-CTL sobre varias líneas celulares de adenocarcinoma están resumidas en la Tabla 2. De igual modo, las reactividades de KG-CTL sobre líneas de células linfoides están mostradas en la Tabla 3.

TABLA 2

2

TABLA 3

3

Los resultados de la Tabla 2 muestran que KG-CTL reacciona potentemente con las células cancerosas positivas para HLA-A2402 de la tabla (HT-1376, 11-18 y PC-9) y produce IFN-\gamma, y que reacciona también con las células positivas para HLA-A2 (143B) y produce IFN-\gamma. De igual modo, los resultados de la Tabla 3 muestran que KG-CTL reacciona potentemente con la línea de células B transformadas con el virus de EB positivas para HLA-A2402 y con una línea celular de leucemia (SSB y MT-2) y que también reacciona potentemente con la línea celular de leucemia positiva para HLA-A2 (HBP-MLT).

La línea establecida KG-CTL fue depositada en The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) (denominación del microorganismo: KG-CTL; fecha de depósito: 19 de Junio de 1998; número de depósito: FERM P-16854) (fecha de conversión en depósito internacional: 20 de mayo de 1999; número de depósito: FERM BP-6725). Además, la tipificación de las moléculas HLA de KG-CTL fue llevada a cabo por Shionogi & Co. de acuerdo con el método descrito en Nakao y col., Cancer Res., 55:4248-4252 (1995) y se confirmó que el locus A es A0206 y A2402.

Ejemplo 2 Identificación de la Proteína Antigénica Tumoral

Se preparó una biblioteca de ADNc a partir de la línea celular de cáncer de vejiga HT-1376 (ATCC CRL 1472), con la cual KG-CTL reaccionaba potentemente en el Ejemplo 1, mediante el método siguiente.

Se preparó en primer lugar ARNm Poli (A)^{+} a partir de HT-1376 mediante el aislamiento de la fracción de ARN total y la purificación en una columna de oligo(dT) utilizando un sistema de purificación de ARNm (Pharmacia Biotech) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A partir de los ARNms, se prepararon ADNcs que tenían un adaptador de NotI y un adaptador de ScaI unidos en cada extremo utilizando el Sistema Plasmídico SuperScript^{TM} (Gibco BRL) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se ligaron posteriormente en el sitio cortado de un vector de expresión, el plásmido pSV-SPORT1 (Gibco BRL), digerido con los enzimas de restricción NotI y SalI para producir plásmidos recombinantes. Los plásmidos recombinantes fueron introducidos en células de E. coli ElectroMAX DH10B^{TM} (Gibco BRL) utilizando pulsos eléctricos en el Gene Pulser (Bio-Rad), y los transformantes en los cuales se habían introducido los plásmidos recombinantes fueron seleccionados en medio LB (1% de Bacto-triptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,5% de NaCl, pH 7,3) conteniendo ampicilina (50 \mug/ml).

Los ADNs plasmídicos recombinantes fueron recuperados de grupos de unos 100 de los transformantes anteriormente descritos de la manera siguiente. Cien transformantes fueron introducidos y cultivados en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos de fondo en U que contenía medio LB más ampicilina (50 \mug/ml). Una parte del cultivo fue transferida posteriormente a otra microplaca de 96 pocillos de fondo en U que contenía 0,25 ml por pocillo de medio TYGPN (F.M. Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc.) y cultivada durante 48 horas a 37ºC. Los cultivos restantes en medio LB en la microplaca fueron almacenados en congelación. La preparación de los ADNs plasmídicos recombinantes de los transformantes cultivados en medio TYGPN fue llevada a cabo en la microplaca mediante el método de lisis alcalina (F.M. Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc.). Los ADNs plasmídicos recombinantes recuperados por precipitación con isopropanol fueron suspendidos en 50 \mul de Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, que contenía 20 ng/ml de ARNasa.

Por otra parte, partiendo de la línea celular de cáncer de esófago KE-4 depositada en The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) (fecha de depósito: 23 de Mayo de 1997; número de depósito: FERM BP-5955), se prepararon plásmidos recombinantes en los que ADNcs para HLA-A2402 (Nº de Acceso del GenBank M64740) y HLA-A2601 habían sido incorporados en un vector de expresión pCR3 (Invitrogen), según la descripción de Nakao y col., Cancer Res., 55:4248-4252 (1995).

Posteriormente, una línea celular derivada de riñón del mono verde africano, COS-7 (Nº de ATCC CRL 1651), fue transfectada doblemente con el plásmido recombinante de ADNc de HT-1376 y el plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 utilizando el método de Lipofectina según sigue. Ocho mil células COS-7 fueron dispuestas en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos de fondo plano e incubadas durante un día en 100 \mul de medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS. Utilizando el reactivo Lipofectamina (Gibco BRL), 30 \mul de una mezcla de 70 \mul que constaba de 25 \mul del plásmido recombinante de ADNc de HT-1376 correspondiente a 100 transformantes aproximadamente, 10 \mul (200 ng) del plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 y 35 \mul de reactivo Lipofectina diluido 50 veces aproximadamente, fueron añadidos en orden con el fin de transfectar doblemente las células COS-7. Los transfectantes fueron preparados por duplicado. Después de 5 horas, se añadieron a los transfectantes 200 \mul de un medio de cultivo que contenía un 10% de FCS, y se incubaron posteriormente durante 48 horas a 37ºC. Después de retirar el medio de cultivo, se añadieron 1,5 x 10^{5} células/pocillo de KG-CTL y se cultivaron durante 24 horas a 37ºC en 100 \mul de un medio de cultivo que contenía un 10% de FCS y 25 U/ml de IL-2. El medio de cultivo fue recuperado y medido para determinar la cantidad de IFN-\gamma mediante el método de ELISA descrito en el Ejemplo 1.

Para aquellos grupos que tuvieron como resultado una elevada producción de IFN-\gamma, se utilizaron los grupos correspondientes almacenados congelados de 100 transformantes aproximadamente transfectados con plásmidos recombinantes de ADNc de HT-1376 en el posterior ensayo de selección, según sigue. Los grupos de transformantes fueron sembrados en medio de agar LB que contenía ampicilina (50 \mug/ml) para obtener colonias. Para cada grupo, se cultivaron 400 colonias según se describió anteriormente de tal manera que un solo tipo de transformante estuviera incluido en cada pocillo, y se prepararon ADNs plasmídicos recombinantes para ADNc de HT-1376. Además, de manera similar a la descrita anteriormente, células COS-7 fueron transfectadas doblemente con el plásmido recombinante de ADNc de HT-1376 y con el plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 seguido por cocultivo con KG-CTL, y se determinó cuantitativamente el IFN-\gamma producido por KG-CTL en respuesta a las células diana con el fin de seleccionar los plásmidos positivos. Mediante estos procedimientos, se seleccionó un clon plasmídico recombinante de ADNc de HT-1376, y el clon fue denominado 4F2. Además, se repitieron procedimientos similares con 4F2 para determinar la cantidad de IFN-\gamma producida por KG-CTL. El resultado está mostrado en la Tabla 4 siguiente.

TABLA 4

4

Cuando se compararon con las células COS-7 transfectadas únicamente con HLA-A2402, las células KG-CTL reaccionaron más potentemente con las células COS-7 doblemente transfectadas con HLA-A2402 y 4F2 y produjeron más IFN-\gamma. Este resultado indicaba que la proteína codificada por 4F2 es una proteína antigénica tumoral.

Ejemplo 3 Determinación de la Secuencia de Bases del Gen de la Proteína Antigénica Tumoral

La secuencia de bases del clon plasmídico 4F2 que codificaba la proteína antigénica tumoral obtenida en el Ejemplo 2 fue determinada utilizando el kit de secuenciación "DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit" (Perkin-Elmer). La secuencia de bases determinada y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases fueron comparadas con secuencias conocidas utilizando las bases de datos WWW Entrez y se descubrió que la secuencia de bases del clon plasmídico 4F2 correspondía a la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B humana registrada con el Nº de Acceso del GenBank M60857. La secuencia de dicha ciclofilina B está también descrita en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1903, 1991. La ciclofilina B es una proteína de unión para un agente inmunosupresor, la ciclosporina A, y se sabe que participa in vivo en la activación de inmunocitos. Se encontró por vez primera, mediante el Ejemplo 2 anterior, que la ciclofilina B, de la cual la única función conocida había sido su participación en la activación de inmunocitos, tenía una función como proteína antigénica tumoral.

Ejemplo 4 Selección de Péptidos Candidatos

Hay ciertas reglas (motivos) en las secuencias de los péptidos antigénicos que se unen a, y son presentados por, los antígenos HLA. Respecto al motivo para HLA-A24, se sabe que en la secuencia de péptidos que constan de 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano y el aminoácido en el extremo C es fenilalanina, triptófano, leucina, isoleucina o metionina (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 152:3913, 1994; J. Immunol., 155:4307, 1994). De igual modo, se sabe para HLA-A2 que los péptidos constan de 8 a 11 aminoácidos y que para HLA-A0201, el aminoácido en posición 2 es leucina o metionina y el aminoácido en el extremo C es valina o leucina; para HLA-A0204, el aminoácido en posición 2 es leucina y el aminoácido en el extremo C es leucina; para HLA-A0205, el aminoácido en posición 2 es valina, leucina, isoleucina o metionina y el aminoácido en el extremo C es leucina; para HLA-A0206, el aminoácido en posición 2 es valina o glutamina y el aminoácido en el extremo C es valina o leucina; y para HLA-A0207, el aminoácido en posición 2 es leucina y el aminoácido en el extremo C es leucina (Immunogenetics, 41:178, 1995; J. Immunol., 155:4749, 1995; ver también la Tabla 1).

De acuerdo con tales motivos, porciones peptídicas que constaban de 8 a 11 péptidos con los motivos anteriores fueron seleccionadas de la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B (Nº de Acceso del GenBank M60857), cuya función como proteína antigénica tumoral fue encontrada por los presentes inventores. Los péptidos seleccionados que tienen un motivo de unión para HLA-A24 están mostrados en las SEC ID N^{os}: 1-11, y los péptidos que tienen un motivo de unión para HLA-A2 están mostrados en las SEC ID N^{os}: 12-36. Estos péptidos fueron sintetizados en Biologica Co. mediante el método de Fmoc.

Posteriormente, 10^{4} células COS-7 fueron transfectadas con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 mediante el método de la Lipofectina para expresar HLA-A2402, según la literatura (J. Exp. Med., 187:277, 1998). A estas células, se añadieron varios péptidos sintetizados previamente que tenían un motivo de unión para HLA-A24 a 10 \muM cada uno durante 2 horas con el fin de estimular las células. Las células fueron posteriormente cocultivadas con 2 x 10^{4} KG-CTLs durante 18 horas, y se determinó la cantidad de IFN-\gamma en el sobrenadante del cultivo producido por los KG-CTLs mediante el método de ELISA. Posteriormente, dos péptidos, esto es un péptido que contenía la secuencia desde la posición 84 hasta la posición 92 de la secuencia de aminoácidos de la ciclofilina B (SEC ID Nº: 1, referido algunas veces de aquí en adelante sencillamente como "84-92") y un péptido que contenía la secuencia desde la posición 91 hasta la posición 99 (SEC ID Nº: 2, referido algunas veces de aquí en adelante sencillamente como "91-99"), fueron sometidos a los experimentos siguientes.

Ejemplo 5 Síntesis de Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (SEC ID Nº: 1)

Se utilizó la resina Fmoc-Phe-Alko (0,56 mmoles/g, retícula 100-200) como resina en esta síntesis. Utilizando 100 mg de esta resina, la síntesis fue iniciada de acuerdo con el Plan 1 descrito posteriormente para acoplar los residuos siguientes en orden: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Lys(Boc)-OH. Después del acoplamiento, se llevaron a cabo los procedimientos hasta la Etapa 3 del Plan 1 mostrado posteriormente en la Tabla 5 para obtener una resina peptídica.

A esta resina peptídica, se añadieron 2 ml de Reactivo K (fenol 5%, tioanisol 5%, H_{2}O 5% y etanoditiol 2,5% en TFA) y se dejaron reaccionar durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Mientras se enfriaba con hielo, se añadieron a la reacción 10 ml de éter dietílico, la mezcla se agitó durante 10 minutos, se filtró y se lavó posteriormente con 10 ml de éter dietílico. A la masa del filtro se añadieron 10 ml de una solución acuosa de ácido acético al 10% (referida de aquí en adelante como ácido acético acuoso) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La resina fue posteriormente filtrada y lavada con 4 ml de ácido acético acuoso. Después de liofilizar el filtrado y el lavado, el péptido bruto obtenido fue disuelto en ácido acético acuoso e inyectado en una columna de fase reversa con el material de relleno COSMOSIL 5C 18-AR (25 \Phi x 250 mm) pre-equilibrada con TFA acuoso al 0,1%. La columna fue lavada con TFA acuoso al 0,1% y la concentración de acetonitrilo fue posteriormente incrementada hasta el 25% a lo largo de 260 minutos para eluir el producto a una velocidad de flujo de 7 ml/minuto. El eluato fue monitorizado por la A 220 nm. La fracciones que contenían el producto deseado fueron combinadas y liofilizadas para obtener 11,7 mg de Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe.

El péptido obtenido, Lys-Phe-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe, tenía un tiempo de retención de 23,9 minutos en un análisis utilizando una columna de fase reversa con el material de relleno YMC-PACK ODS-AM (4,6 \Phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de acetonitrilo a una concentración desde el 0% hasta el 60% que contenía un 0,1% de TFA, y los resultados del análisis de aminoácidos y de la espectrometría de masas del producto fueron consistentes con los valores teóricos.

Análisis de Aminoácidos

Hidrólisis: fenol 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 24 horas;

Método de análisis: método de la ninhidrina;

: ^{*}Aminoácido de referencia; los valores teóricos están indicados entre paréntesis:

: 400

: 5

TABLA 5 Plan 1

6

Ejemplo 6 Síntesis de Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe (SEC ID Nº: 2)

De la misma manera que la descrita en el Ejemplo 5, utilizando 100 mg de resina Fmoc-Phe-Alko, se acoplaron en orden Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH y el producto fue posteriormente desprotegido. El péptido bruto obtenido fue disuelto en ácido acético acuoso e inyectado en una columna de fase reversa con COSMOSIL 5C 18-AR como material de relleno (25 \Phi x 250 mm) preequilibrada con TFA acuoso al 0,1%. La columna fue lavada con TFA acuoso al 0,1% y la concentración de acetonitrilo fue posteriormente incrementada hasta el 31% a lo largo de 260 minutos para eluir el producto a una velocidad de flujo de 7 ml/minuto. El eluato fue monitorizado por la A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado fueron combinadas y liofilizadas para obtener 3,6 mg de Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe.

El péptido obtenido, Asp-Phe-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe, tenía un tiempo de reacción de 25,8 minutos en un análisis utilizando una columna de fase reversa con YMC-PACK ODS-AM como material de relleno (4,6 \Phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de acetonitrilo a una concentración desde el 0% hasta el 60% que contenía un 0,1% de TFA, y los resultados del análisis de aminoácidos (no se detectó Met) y de la espectrometría de masas del producto fueron consistentes con los valores teóricos.

Hidrólisis: fenol 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 24 horas;

Método de análisis: método de la ninhidrina;

: 7

Ejemplo 7 Identificación del Péptido Antigénico Tumoral

Se llevó a cabo un experimento con dos péptidos sintetizados en los Ejemplos 5 y 6 anteriores de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 4, y se encontró que estos péptidos funcionaban como un péptido antigénico tumoral. Los resultados están mostrados en las Figuras 1 y 2. En las figuras, el eje de abscisas indica la concentración del péptido (pg/ml) y el eje de ordenadas indica la cantidad de IFN-\gamma producida por KG-CTLs. Cuando células COS-7 transfectadas con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 fueron pulsadas con "84-92" y "91-99", la reactividad de KG-CTL fue incrementada de manera dependiente de la concentración. En comparación con las células COS-7 transfectadas con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2601, las células COS-7 transfectadas con el plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 tuvieron como resultado una mayor reactividad de KG-CTL cuando fueron sometidas al pulso. Los resultados anteriores demostraron que los dos péptidos, "84-92" y "91-99", funcionaban como un péptido antigénico tumoral restringido por HLA-A24.

Ejemplo 8 Síntesis de Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (SEC ID Nº: 39)

Como se reveló en el Ejemplo 7 que "84-92" y "91-99" funcionaban como un péptido antigénico tumoral, se prepararon dos derivados en los cuales la fenilalanina en posición 2 fue sustituida por tirosina dentro del ámbito del motivo de unión para HLA-A24, "84-92\cdot2F-Y" (SEC ID Nº: 39) y "91-99\cdot2F-Y" (SEC ID Nº: 40).

El péptido Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe (SEC ID Nº: 39) fue sintetizada de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 5. Específicamente, utilizando 100 mg de resina Fmoc-Phe-Alko, se acoplaron en orden Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Lys(Boc)-OH, y el producto fue posteriormente desprotegido. El péptido bruto obtenido fue disuelto en ácido acético acuoso e inyectado en una columna de fase reversa con COSMOSIL 5C 18-AR como material de relleno (25 \Phi x 250 mm) preequilibrada con TFA acuoso al 0,1%. La columna fue lavada con TFA acuoso al 0,1% y la concentración de acetonitrilo fue posteriormente incrementada hasta un 25% a lo largo de 200 minutos para eluir el producto a una velocidad de flujo de 7 ml/minuto. El eluato fue monitorizado por la A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado fueron combinadas y liofilizadas para obtener 44,9 mg de Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe.

El péptido obtenido Lys-Tyr-His-Arg-Val-Ile-Lys-Asp-Phe tenía un tiempo de retención de 17,7 minutos en un análisis utilizando una columna de fase reversa con YMC-PACK ODS-AM como material de relleno (4,6 \Phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de acetonitrilo a una concentración desde el 0% hasta el 60% que contenía un 0,1% de TFA, y los resultados del análisis de aminoácidos y de la espectrometría de masas del producto eran consistentes con los valores teóricos.

Análisis de Aminoácidos

Hidrólisis: fenol 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 24 horas;

Método de análisis: método de la ninhidrina;

: 8

Ejemplo 9 Síntesis de Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe (SEC ID Nº: 40)

De la misma manera que la descrita en el Ejemplo 5, utilizando 100 mg de resina Fmoc-Phe-Alko, se acoplaron en orden Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH, y el producto fue posteriormente desprotegido. El péptido bruto obtenido fue disuelto en ácido acético acuoso e inyectado en una columna de fase reversa con COSMOSIL 5C 18-AR como material de relleno (25 \Phi x 250 mm) preequilibrada con TFA acuoso al 0,1%. La columna fue lavada con TFA acuoso al 0,1% y la concentración de acetonitrilo fue posteriormente incrementada hasta el 27% a lo largo de 200 minutos para eluir el producto a una velocidad de flujo de 7 ml/minuto. El eluato fue monitorizado por la A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado fueron combinadas y liofilizadas para obtener 12,8 mg de Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe.

El péptido obtenido Asp-Tyr-Met-Ile-Gln-Gly-Gly-Asp-Phe tenía un tiempo de retención de 24,7 minutos en un análisis utilizando una columna de fase reversa con YMC-PACK ODS-AM como material de relleno (4,6 \Phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de acetonitrilo a una concentración desde el 0% hasta el 60% que contenía un 0,1% de TFA, y los resultados del análisis de aminoácidos (no se detectó Met) y de la espectrometría de masas del producto eran consistentes con los valores teóricos.

Análisis de Aminoácidos

Hidrólisis: fenol 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 24 horas;

Método de análisis: método de la ninhidrina;

: 9

: 10

Ejemplo 10 Inducción de CTL a Partir de Linfocitos de Sangre Periférica por los Péptidos Antigénicos Tumorales y Derivados de los Mismos

Los inventores investigaron si CTLs específicos de un antígeno podían ser inducidos a partir de linfocitos de sangre periférica utilizando el péptido "84-92" (SEC ID Nº: 1) sintetizado en el Ejemplo 5 y el péptido "84-92\cdot2F-Y" (SEC ID Nº: 39) sintetizado en el Ejemplo 8.

Se separaron linfocitos de sangre periférica de un paciente con leucemia que era heterozigoto para A24 en el locus HLA-A utilizando el método del Ficoll. Los linfocitos fueron colocados en los pocillos de una placa de 24 pocillos a 2 x 10^{6} células/pocillo y cultivados en el medio de linfocitos. Los péptidos antigénicos tumorales anteriores fueron añadidos al medio de cultivo a 10 \muM para estimular a los linfocitos de sangre periférica. Después de una semana, el péptido antigénico tumoral anterior fue añadido hasta alcanzar 10 \muM junto con 2 x 10^{5} células aproximadamente de linfocitos de sangre periférica irradiados con rayos X (50 Gy) para la segunda estimulación. Después de una semana adicional, se llevó a cabo la tercera estimulación de manera similar. Los linfocitos cultivados fueron recogidos una semana después de la tercera estimulación. Utilizando como células diana BEC-2 (1 x 10^{4} células), que es una línea de células B transformadas con el virus EB positivas para HLA-A2402 que expresan la proteína antigénica tumoral de la presente invención (ciclofilina B) y Ban-B1, que es una línea de células B transformadas con el virus EB negativas para HLA-A2402 que expresan la proteína antigénica tumoral de la presente invención, se midió mediante ELISA la cantidad de IFN-\gamma en el medio de cultivo producida por los linfocitos anteriores (8 x 10^{4} células) en respuesta a las células diana. Los resultados están mostrados en la Tabla 6.

TABLA 6

11

Se llevó a cabo además otro experimento similar al descrito anteriormente utilizando "91-99" (SEC ID Nº: 2) sintetizado en el Ejemplo 6 y "91-99\cdot2F-Y" (SEC ID Nº: 40) sintetizado en el Ejemplo 9, así como los péptidos "84-92" (SEC ID Nº: 1) y "84-92\cdot2F-Y" (SEC ID Nº: 39) anteriores. Los resultados están mostrados en la Tabla 7.

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TABLA 7

12

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Los linfocitos de sangre periférica estimulados con los péptidos "84-92", "84-92\cdot2F-Y", "91-99" y "91-99\cdot2F-Y" reaccionaron con las BEC-2 positivas para HLA-A24 pero no con las Ban-B1 negativas para HLA-A24, indicando la inducción de CTLs específicos para los péptidos antigénicos tumorales restringidos por HLA-A24. Además, los linfocitos de sangre periférica estimulados con los péptidos "84-92\cdot2F-Y" y "91-99\cdot2F-Y" reaccionaron con las BEC-2 como ocurrió con los linfocitos de sangre periférica estimulados con los péptidos "84-92" y "91-99", indicando que los derivados obtenidos de los péptidos originales por sustitución tenían una capacidad para inducir CTLs similar a la del péptido original.

De igual modo, puede llevarse a cabo un experimento similar en el que células COS-7 (Nº de ATCC CRL1651) o células VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) en las que se haya introducido un plásmido de expresión para el ADNc de HLA-A2402 (Nº de Acceso del GenBank M64740) y que hayan sido sometidas a un pulso con los péptidos anteriores sustituyan a las células BEC-2 utilizadas en el experimento anterior, y células COS-7 o VA-13 en las que se haya introducido el plásmido de expresión para el ADNc de HLA-A2402 pero que no hayan sido sometidas a un pulso con los péptidos, sustituyan a las células Ban-B1 utilizadas en el experimento anterior (J. Exp. Med., 187:277, 1998).

Ejemplo 11 Inducción de CTLs a Partir de Linfocitos de Sangre Periférica por la Proteína Ciclofilina

Mediante referencia a los métodos descritos en la literatura (por ejemplo, J. Immunol., 158:1796, 1997 y Cancer Res., 59:1184, 1999), células apropiadas pueden ser sometidas a un pulso con una ciclofilina de la presente invención, con un polipéptido parcial de la misma, con un péptido antigénico tumoral derivado de ciclofilina de la presente invención, o similares, con el fin de preparar células presentadoras de antígenos en las cuales se presente un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral derivado de ciclofilina. La preparación con éxito de las células presentadoras de antígeno deseadas puede ser confirmada determinando si se inducen CTLs específicos del antígeno a partir de linfocitos de sangre periférica por las células presentadores de antígeno. Aunque las siguientes descripciones indican un ejemplo en el que se utiliza sangre periférica de un donante sano, no hay que decir que las células presentadoras de antígeno pueden ser también preparadas de forma similar utilizando sangre periférica de un paciente tumoral.

Los linfocitos son separados primeramente mediante el método de Ficoll de la sangre periférica de un donante sano positivo para HLA-A24. Los linfocitos se dejan reposar durante 3 horas en un frasco de cultivo a 37ºC para eliminar las células no adherentes. Las células adherentes son cultivadas durante 7 días en presencia de GM-CSF (2000 U/ml) e IL-4 (2000 U/ml) para inducir células dendríticas, que se sabe que tienen una alta capacidad para presentar antígenos. Las células dendríticas recogidas son cultivadas con 10 \mug/ml del péptido antigénico tumoral de la presente invención, o con 100 \mug/ml de la proteína antigénica tumoral (ciclofilina) de la presente invención o de un polipéptido parcial de la misma a 37ºC durante 2 horas para ser estimuladas, y posteriormente irradiadas con rayos X (5000 rad). En una placa de 24 pocillos, las células dendríticas estimuladas con el péptido o la proteína anterior son cocultivadas con células T CD8^{+} preparadas utilizando esferas de separación biomagnéticas (Dynal) a partir de linfocitos de sangre periférica del donante sano anterior para la estimulación antigénica. Al día siguiente de la estimulación se añade IL-2 (100 U/ml). Las células T son estimuladas cada semana (de 2 a 4 veces) de la misma manera utilizando las células dendríticas anteriores estimuladas con el péptido o la proteína. Una semana después de la última estimulación, se recogen las células T cultivadas. Utilizando como diana células BEC-2, que son una línea de células B transformadas con el virus EB positivas para HLA-A2402 que expresan la proteína antigénica tumoral de la presente invención, y células Ban-B1, que son una línea de células B transformadas con el virus EB negativas para HLA-A2402 que expresan la proteína antigénica tumoral de la presente invención, se determina la reactividad de las células T anteriores midiendo la cantidad de IFN-\gamma mediante ELISA en el sobrenadante del cultivo igual que en el Ejemplo 10, o midiendo la actividad citotóxica sobre células diana marcadas con ^{51}Cr. Si se han inducido CTLs específicos para el antígeno, se observa reacción únicamente contra BEC-2. Mediante la realización del experimento anterior, puede determinarse si las células presentadoras de antígeno (células dendríticas) estimuladas con el péptido antigénico tumoral, con la proteína antigénica tumoral de la presente invención o similares, tienen actividad inductora de CTLs específicos del antígeno.

De igual modo, puede llevarse a cabo un experimento similar en el que células COS-7 (Nº de ATCC CRL1651) o células VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) en las que se haya introducido un plásmido de expresión para el ADNc de HLA-A2402 (Nº de Acceso del GenBank M64740) y que hayan sido sometidas a un pulso con un péptido antigénico tumoral o una proteína antigénica tumoral de la presente invención sustituyan a las células BEC-2 utilizadas en el experimento anterior, y células COS-7 o VA-13 en las que se haya introducido el plásmido de expresión para el ADNc de HLA-A2402 pero que no hayan sido sometidas a un pulso con los péptidos anteriores o similares, sustituyan a las células Ban-B1 utilizadas en el experimento anterior (J. Exp. Med., 187:277, 1998).

Texto libre del listado de secuencias

En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 37, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el noveno aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

En la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 38, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el noveno aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

De acuerdo con la presente invención, pueden proporcionarse péptidos antigénicos tumorales derivados de ciclofilina B y derivados de los mismos con propiedades funcionalmente equivalentes, así como medicamentos, agentes profilácticos o de diagnóstico para tumores utilizando tales péptidos antigénicos tumorales, derivados de los mismos, polipéptidos de ciclofilina B o genes de los mismos in vivo o in vitro.

<110> ITOH, Kyogo; Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited

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<120> Péptidos Antigénicos Tumorales Derivados de Ciclofilina B

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<130> E 3105 EP

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<140> EP 99 92 6783.4

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<141> 24-06-1999

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<150> 98-178449

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<151> 25-06-1998

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<160> 43

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\sa{Lys Phe His Arg Val Ile Lys Asp Phe}

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\sa{Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe}

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\sa{Gly Phe Gly Tyr Lys Asn Ser Lys Phe}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\sa{Gly Tyr Lys Asn Ser Lys Phe His Arg Val Ile}

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<210> 5

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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\sa{Asn Phe Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp}

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<210> 6

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Ile Tyr Gly Glu Arg Phe Pro Asp Glu Asn Phe}

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Arg Phe Pro Asp Glu Asn Phe Lys Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{His Tyr Gly Pro Gly Trp Val Ser Met}

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<210> 9

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<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Phe Ile Thr Thr Val Lys Thr Ala Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\sa{Val Phe Gly Lys Val Leu Glu Gly Met}

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<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Leu Leu Ala Ala Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu}

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<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Thr Val Lys Val Tyr Phe Asp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Lys Val Tyr Phe Asp Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Arg Ile Gly Asp Glu Asp Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Val Gly Arg Val Ile Phe Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Val Ile Phe Gly Leu Phe Gly Lys Thr Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Phe Gly Lys Thr Val Pro Lys Thr Val}

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<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Pro Lys Thr Val Asp Asn Phe Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Asp Asn Phe Val Ala Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Phe Phe Ile Thr Thr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ile Thr Thr Val Lys Thr Ala Trp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Val Val Phe Gly Lys Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Leu Glu Gly Met Glu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val Arg Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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\sa{Gly Met Glu Val Val Arg Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> 2

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<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> 9

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<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met

\newpage

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<400> 37

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\sa{Lys Xaa His Arg Val Ile Lys Asp Xaa}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

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<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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<222> 9

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<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

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\sa{Asp Xaa Met Ile Gln Gly Gly Asp Xaa}

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<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

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\sa{Lys Tyr His Arg Val Ile Lys Asp Phe}

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<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Phe Met Cys Gln Gly Gly Asp Phe}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 42

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\sa{Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Ile}

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<210> 43

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 43

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\sa{Thr Phe His Arg Val Ile Pro Ser Phe}

Claims

1. Un péptido antigénico tumoral que consta de 8 a 14 aminoácidos de longitud de la ciclofilina B que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36 y que se une a un antígeno HLA y es reconocido por linfocitos T citotóxicos.

2. El péptido antigénico tumoral de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2.

3. Un derivado del péptido antigénico tumoral de la reivindicación 1, en el cual el residuo de aminoácido en posición 2 y/o el extremo C de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-36 está sustituido por otro residuo de aminoácido y donde el derivado se une a un antígeno HLA y es reconocido por linfocitos T citotóxicos.

4. El derivado de la reivindicación 3, en el cual el residuo de aminoácido en posición 2 y/o el extremo C de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 2 está sustituido por otro residuo de aminoácido.

5. El derivado de la reivindicación 3, en el cual el residuo de aminoácido en posición 2 de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 1-11 está sustituido por tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y/o el residuo de aminoácido en el extremo C está sustituido por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

6. El derivado de la reivindicación 3, en el que el residuo de aminoácido en posición 2 de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N^{os}: 12-36 está sustituido por leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina, y/o el residuo de aminoácido en el extremo C está sustituido por valina o leucina.

7. El derivado de la reivindicación 5 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 37 ó 38.

8. El derivado de la reivindicación 7 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 39 ó 40.

9. Una composición farmacéutica que contiene al menos una de las sustancias seleccionadas de los péptidos antigénicos tumorales y derivados de los mismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una composición farmacéutica que contiene un polipéptido parcial de la ciclofilina B que comprende un péptido antigénico tumoral de la reivindicación 1 ó 2, o un gen que codifica el polipéptido parcial.

11. Una anticuerpo que se une específicamente al péptido antigénico tumoral o al derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. Una célula presentadora de antígeno, en la que un complejo entre un antígeno HLA y el péptido antigénico tumoral o el derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 es presentado en la superficie de una célula con capacidad presentadora de antígenos que es aislada de un paciente tumoral.

13. Una célula presentadora de antígeno, en la cual se presenta un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral derivado de ciclofilina B, siendo preparada dicha célula presentadora de antígeno dejando que una célula con capacidad presentadora de antígeno aislada de un paciente tumoral sea incorporada con ciclofilina B, un polipéptido parcial de ciclofilina B que comprende el péptido antigénico tumoral de la reivindicación 1 ó 2 o un gen que codifica la ciclofilina B o el polipéptido parcial de la misma.

14. Una composición farmacéutica que contiene la célula presentadora de antígeno de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13.

15. Un linfocito T citotóxico que reconoce específicamente un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

16. Un linfocito T citotóxico que reconoce específicamente un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo, que es presentado en una célula presentadora de antígeno de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13.

17. Una composición farmacéutica que contiene el linfocito T citotóxico de la reivindicación 15 ó 16.

18. Un linfocito T citotóxico cuyo número de depósito es FERM BP-6725.

19. Un método para identificar proteínas antigénicas tumorales o péptidos antigénicos tumorales, que comprende la utilización de FERM BP-6725 de acuerdo con la reivindicación 18.

20. Un agente de diagnóstico para tumores que comprende un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

21. Utilización de al menos una de las sustancias seleccionadas entre péptidos antigénicos tumorales y derivados de los mismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ciclofilina B, un polipéptido parcial de ciclofilina B que comprende un péptido antigénico tumoral de la reivindicación 1 ó 2, o un gen que codifica ciclofilina B o el polipéptido parcial de la misma, una célula presentadora de antígeno de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, o el linfocito T citotóxico de la reivindicación 15 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores.