KR20240099456A - 항종양제 및 그 평가방법 - Google Patents
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Abstract
현저하게 우수한 항종양 효과를 나타내고, 부작용이 적은 새로운 암 치료 방법을 제공.
에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 항종양제를 제공한다. 또한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드와 인간 HLA-A24를 공동 발현하는 세포를 제공함으로써 인간의 항종양 효과를 평가할 수 있다.
에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 항종양제를 제공한다. 또한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드와 인간 HLA-A24를 공동 발현하는 세포를 제공함으로써 인간의 항종양 효과를 평가할 수 있다.
Description
본 발명은 HLA-A 제한적인 CTL 유도능을 가지는 펩타이드를 4 개 연결하여 이루어진 CTL 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 이용한 암 화학 요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 암 화학 요법의 효과를 평가하기 위해 적합하게 이용할 수 있는 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드와 인간 HLA-A24를 공동 발현하는 세포에 관한 것이다.
암 펩타이드 백신 요법은 오랫동안 암의 새로운 치료법으로 기대되고 있는 치료법이다. 그러나 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드가 식별 가능하게 된 1990 년부터 암 펩타이드 백신 임상 연구가 전 세계적으로 실시되고 있지만, 치료 성적은 매우 제한적인 실정이다 (비특허 문헌 1).
암 펩타이드 백신 요법은 암 세포 표면에 항원 펩타이드를 제시하는 주 조직 적합성 복합체(MHC)를 에피토프 특이적인 세포 독성 T 림프구(CTL)의 세포 수용체(TCR)가 인식하여 CTL가 암 세포를 상해함으로써 효과를 발휘한다. 인간의 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)이라고 하며, HLA 유형은 상당한 다형성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 특정 HLA 형을 대상으로 한 암 펩타이드 백신의 개발이 실시되어 왔다. 그러나 암 백신의 대상이되는 HLA 형은 제한적이며 대상 외의 HLA 형을 가진 환자는 암 펩타이드 백신의 혜택을 누릴 수 없는 문제점이 있다. 또한 치료 시작 전에 HLA 형 검사를 요한다는 것이 치료의 시작시기를 지연시키고 환자 부담을 증가시키는 요인이 되고 있다. 이전보다 HLA 형 검사를 필요로 하지 않고, 모든 암 환자에 적응할 수 있는 암 펩타이드 백신의 개발·연구가 요구되고 있다.
이 과제를 해결하기 위한 HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 또는 HLA-A3 슈퍼 타입 중 하나 또는 복수의 HLA 형에 CTL 유도능을 나타내는 다양한 CTL 에피토프 펩타이드를 연결한 CTL 에피토프4 연결펩타이드가 보고 되어 있다(특허 문헌).
최근에 면역 세포의 억제·활성에 관한 분자 메커니즘이 밝혀졌다. T 세포의 면역 반응은 TCR에 의한 신호와 보조 신호에 의해 제어된다. 보조 신호에는 TCR을 통해 신호를 각각 양과 음으로 조절하는 공동 자극 신호(costimulation)와 공동 억제 신호(coinhibition)가 존재하며 T 세포의 면역 반응을 제어하고 있다. 암세포는 이 메커니즘을 이용하여 항원 특이적인 T 세포의 활성화를 억제함으로써 T 세포의 면역 피폐 상태를 유도한다. 최근 공동 자극 신호의 강화와 공동 억제 신호의 차단이 암 환자의 생체 내에서 항종양 면역 반응을 강화하고, 종양 면역 도피를 제어하는 것이 암 치료에 유효하다고 생각되어, 공동 자극 신호 분자 혹은 공동 억제 신호 분자를 표적으로 한 암 면역 요법이 여러 가지 제안되었다(비특허 문헌 2). 예를 들어, PD-1과 리간드 (PD-L1 및 PD-L2)의 결합을 저해하여 T 세포를 활성화하는 면역체크포인트분자 조절제인 니볼루맙(Nivolumab)이 악성 흑색종 등의 치료에 이용되고 있다(비특허 문헌 2, 비특허 문헌 3).
그러나 CTL 에피토프4 연결펩타이드와 이와 같은 면역체크포인트분자 조절제의 결합에 의한 항종양 효과에 대한 증강 효과는 제시되어 있지 않다.
Nature Med., 10(9):909-15(2004)
Nat. Rev. Cancer., 12(4):252-64(2012)
N. Engl. J. Med., 366(26):2443-54(2012)
본 발명은 CTL 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 병용 투여하여 현저하게 우수한 항종양 효과를 나타내고, 부작용이 적은 새로운 암 치료 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 인간의 항종양제의 효과를 평가하기 위해 적절하게 사용할 수 있는 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드와 인간 HLA-A24를 공동 발현하는 세포를 제공하는 것을 과제로 한다.
그러므로 본 발명자는 CTL 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제인 항 PD-1 항체 또는 항 PD-L1 항체를 병용 투여하여 항암 효과를 검토한 결과, 단독으로 약을 사용하는 것보다 심각한 부작용을 발생시키지 않으면서, 항종양 효과가 현저하게 증강하는 것으로 나타났다. 또한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드와 인간 HLA-A24를 공동 발현하는 세포를 수립하고, 해당 세포에 대한 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항종양 효과를 평가할 수 있는 방법을 확립하였다.
즉, 본 발명은 하기의 발명을 제공하는 것이다
[1]링커를 통해 연결된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함하는 에피토프4 연결펩타이드를 유효 성분으로 함유하고, 면역체크포인트분자 조절제와 병용하기 위한 것을 특징으로 하는 항종양제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[2][1]에 기재된 상기 에피토프4 연결펩타이드에 포함되는 에피토프 펩타이드가
PEP5,
PEP6,
PEP9 및
PEP2, PEP4 및 PEP10로 이루어진 군에서 선택되는 1 개의 에피토프 펩타이드로 구성되고, 상기 에피토프4 연결펩타이드의 C 말단이 PEP2, PEP4 또는 PEP10 인 것을 특징으로 하는 항종양제.
[3][1] 또는 [2]에 기재된, 상기 에피토프4 연결펩타이드가 다음에서 선택되는 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항종양제.
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP4;
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP2; 또는,
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP10;
상기 식에서 "(L)"는 링커를 나타낸다.
[4]링커가 아미노산 링커인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[5]아미노산 링커가 아르기닌을 2 개 연결한 아르기닌 다이머 또는 아르기닌을 3 개 연결한 아르기닌 트리머인 [4]에 기재된 항종양제.
[6]친수성 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 서열은 N 말단에 연결되고, 또한 아르기닌을 3개 연결한 아르기닌 트리머 또는 아르기닌를 4개 연결한 아르기닌 테트라머로 이루어진 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[7]에피토프4 연결펩타이드가 서열번호 24, 서열번호 25 또는 서열번호 26 인 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[8]면역체크포인트 분자 조절제는 PD-1 경로 길항제, ICOS 경로 작용제, CTLA-4 경로 길항제 및 CD28 경로 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[9]면역체크포인트분자 조절제는 PD-1 경로 길항제 및 CTLA-4 경로 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[10]면역체크포인트분자 조절제가 PD-1 경로 길항제인 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[11]PD-1 경로 길항제가 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 및 항 PD-L2 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[12]PD-1 경로 길항제가 항 PD-1 항체 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 항종양제.
[13]항 PD-1 항체가 니볼루맙(Nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)이며, 항 PD-L1 항체가 아테졸리주맙(Atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)인 [11] 또는 [12]에 기재된 항종양제.
[14]CTLA-4 경로 길항제가 항 CTLA-4 항체인 [8] 또는 [9]에 기재된 항종양제.
[15]항 CTLA-4 항체가 이필리무맙(Ipilimumab） 또는 트레멜리무맙(Tremelimumab)인 [14]에 기재된 항종양제.
[16]면역체크포인트분자 조절제가 투여된 암 환자를 치료하기 위한 에피토프4 연결펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항종양제이며, 상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[17]에피토프4 연결펩타이드가 투여된 암 환자를 치료하기 위한 면역체크포인트분자 조절제로 이루어진 항종양제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이며;
상기 면역체크포인트분자 조절제는 PD-1 경로 길항제, ICOS 경로 작용제, CTLA-4 경로 길항제 및 CD28 경로 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종이다.
[18]에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 결합되는 혼합 제제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 혼합제제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[19]에피토프4 연결펩타이드를 유효 성분으로하는 면역체크포인트분자 조절제의 항 종양 효과를 강화하는 항종양 효과 증강제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양 효과 증강제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[20]링커를 통해 연결된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함하는 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항종양제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[21]에피토프4 연결펩타이드와 사용 설명서를 포함한 키트 제제로서 당해 사용 설명서에는 암 환자에게 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 병용 투여하는 것이 기재되어 있는 것을 특징으로하는 키트 제제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 키트 제제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[22]SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포.
[23]다음 (a) ~ (e)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(a) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열번호 29로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(e) 서열번호 29로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
및 다음 (f) ~ (j)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(f) 서열번호 30로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(g) 서열번호 30로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(h) 서열번호 30로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(i) 서열번호 31로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(j) 서열번호 31로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
를 도입한 세포.
[24]다음 (k) ~ (o)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(k) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(l) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(m) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(n) 서열번호 33로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(o) 서열번호 33로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
및 다음 (p) ~ (t)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(p) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(q) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(r) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(s) 서열번호 35로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(t) 서열번호 35로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
를 도입한 세포.
[25][22] 내지 [24] 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항 종양 효과를 평가하기 위한 것을 특징으로 하는 세포.
[26][22] 내지 [24] 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항 종양 효과를 평가하기 위한 것을 특징을 하는 세포이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 세포:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[27][22] 내지 [24] 중 어느 한 항에 기재된 세포를 이용한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항 종양 효과를 평가하기 위한 방법이며,
다음의 (I) 및 (II)의 단계 :
(I) SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계, 및
(II) [22] ~ [24] 중 어느 한 항에 기재된 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[28][22] 내지 [24] 중 어느 한 항에 기재된 세포를 이용한 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항 종양 효과를 평가하기 위한 방법이며,
다음의 (I) 및 (II) 단계 :
(I) 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계 및
(II) 청구항 22 ~ 24 중 어느 한 항에 기재된 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식하는 단계;
를 포함하고, 상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 방법:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[29]링커를 통해 연결된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함 에피토프4 연결펩타이드 면역체크포인트분자 조절제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양의 예방 및 / 또는 치료용 약학 조성물이며
상기 에피토프4 연결펩타이드가
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와
서열 번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열 번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열 번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열 번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열 번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열 번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열 번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열 번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열 번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열 번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열 번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열 번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가
링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것을 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[30]링커를 통해 연결된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함 에피토프4 연결펩타이드를 예방 및 / 또는 치료에 유효한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함 면역 체크포인트분자 조절제와 함께 종양을 예방 및 / 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 에피토프4 연결 펩타이드가
서열 번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열 번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열 번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열 번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열 번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열 번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열 번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열 번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열 번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열 번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열 번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열 번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열 번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가
링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 서로 이웃이 순서로 포함하는 것을 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[31][30]에 기재된 상기 에피토프4 연결펩타이드를 상기 면역체크포인트분자 조절제의 투여 전이나 상기 면역체크포인트분자 조절제의 투여와 동시 또는 상기 면역체크포인트분자 조절제의 투여 후 환자에게 투여하는 방법.
[32][30]에 기재된 상기 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과의 증강 방법.
[33]면역체크포인트분자 조절제와 병용하여 종양의 예방 및 / 또는 치료에 사용하기 위해 링커를 통해 연결된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함 에피토프4 연결펩타이드로서, 상기 에피토프4 연결펩타이드가
서열 번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와
서열 번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열 번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열 번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열 번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열 번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열 번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열 번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열 번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열 번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP13), 서열 번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열 번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열 번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가
링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고 친수성 아미노산으로 이루어진 단백질 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가지며 면역체크포인트분자 조절제의 투여 전이나 면역체크포인트분자 조절제의 투여와 동시 또는 면역체크포인트분자 조절제의 투여 후 투여되는 상기 에피토프4 연결펩타이드:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 서로 이웃이 순서로 포함하는 것을 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
[34][33]에 기재된 서열 번호 24, 서열 번호 25 또는 서열 번호 26 인 에피토프4 연결펩타이드.
[35]면역체크포인트분자 조절제가 PD-1 경로 길항제인 [33] 또는 [34] 중 어느 한 항에 기재된 에피토프4 연결펩타이드.
[36]PD-1 경로 길항제가 항 PD-1 항체 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것을 특징으로 하는 [33] 내지 [35] 중 어느 하나에 기재된 에피토프4 연결펩타이드.
[37]항 PD-1 항체가 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이며, 항 PD-L1 항체가 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인 것을 특징으로 하는 [33] 내지 [36] 중 어느 하나에 기재된 에피토프4 연결펩타이드.
[38]상기 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과를 강화하기 위하여 사용되는 상기 에피토프4 연결펩타이드.
[39]환자의 종양을 예방 및 / 또는 치료하는 방법의 사용을 위해 동시에 또는 별도로 환자에게 투여되는 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제로서, 상기 에피토프4 연결펩타이드가 링커를 통해 연결된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함하고,
서열 번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP5)와,
서열 번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP1), 서열 번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP2), 서열 번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP4), 서열 번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP6), 서열 번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP7), 서열 번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP8), 서열 번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP9), 서열 번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP10), 서열 번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열 번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP15), 서열 번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP17) 및 서열 번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드(PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가
링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 상기 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 서로 이웃이 순서로 포함하는 것을 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
본 발명은 또한, 다음의 예에 관한 것이다.
·면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과를 강화하기 위해 상기에 기재된 에피토프4 연결펩타이드를 사용한다.
·면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과 증강제를 제조하기 위해 상기에 기재된 에피토프4 연결펩타이드를 사용한다.
·종양을 예방 및 / 또는 치료할 때 동시에, 순차적으로 또는 간격을 두고 사용하기 위한 조합제제로서 상기에 기재된 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트 분자 조절제를 포함하는 제품.
본 명세서는 본 원서의 우선권의 기초가 되는 일본 특허 출원 번호 2018-124894호에 공개된 내용을 포함하고 있다.
본 발명의 항종양제에 의하면, 부작용의 발생을 억제하면서 높은 항종양 효과 (특히 종양 축소 효과, 종양 증식 지연 효과 (연명 효과))를 발휘할 수 있는 암 치료가 가능하다. 나아가 암 환자의 장기 생존을 가져온다.
도 1은 CTL 에피토프4 연결펩타이드 TPV07의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 CTL 에피토프4 연결펩타이드 TPV08의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 CTL 에피토프4 연결펩타이드 TPV07의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 4은 CTL 에피토프4 연결펩타이드 TPV08의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 5의 a는 EL4. A24 / SART293-101 세포주를 마우스에 이식한 경우에 종양 체적 변화를 나타낸다. b는 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 마우스에 이식한 경우에 종양 체적 변화를 나타낸다.
도 6은 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV06 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
도 7은 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV06 + 항 마우스 PD-L1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
도 8은 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV07 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
도 9는 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV08 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
도 2는 CTL 에피토프4 연결펩타이드 TPV08의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 CTL 에피토프4 연결펩타이드 TPV07의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 4은 CTL 에피토프4 연결펩타이드 TPV08의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 5의 a는 EL4. A24 / SART293-101 세포주를 마우스에 이식한 경우에 종양 체적 변화를 나타낸다. b는 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 마우스에 이식한 경우에 종양 체적 변화를 나타낸다.
도 6은 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV06 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
도 7은 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV06 + 항 마우스 PD-L1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
도 8은 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV07 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
도 9는 B16F10. A24 / SART293-101 세포주를 이식한 마우스 모델에서 종양 증식에 대한 TPV08 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 효과를 나타낸다.
본 발명은 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제 (예를 들어, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체)를 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 항종양 제, 항종양 효과 증강제, 키트 제제 및 이 약을 사용하는 종양 치료 방법, 및 항종양 효과 증강 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 CTL 에피토프4 연결펩타이드 (본 명세서에서 에피토프4 연결펩타이드라고 기재한다)는 동일한 및 / 또는 다른 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩타이드에서 선정된 4 개의 펩타이드를 링커를 통해 직접 사슬 모양으로 연결한 1 분자의 펩타이드를 의미한다.
종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩타이드로는 다음과 같은 것이 알려져있다.
KLVERLGAA (서열 번호 1, 본 명세서에서 「PEP1」라고 기재, 국제 공개 제 200l / 0l1044호);
ASLDSDPWV (서열 번호 2, 본 명세서에서 「PEP2」라고 기재, 국제 공개 제 2002/010369호);
ALVEFEDVL (서열 번호 3, 본 명세서에서 「PEP3」라고 기재, 국제 공개 제 2002/010369호);
LLQAEAPRL (서열 번호 4, 본 명세서에서 「PEP4」라고 기재, 국제 공개 제 2000/12701호);
DYSARWNEI (서열 번호 5, 본 명세서에서 「PEP5」라고 기재, 일본 특허 공개 11-318455호);
VYDYNCHVDL (서열 번호 6, 본 명세서에서 「PEP6」라고 기재, 국제 공개 제 2000/12701호);
LYAWEPSFL (서열 번호 7, 본 명세서에서 「PEP7」라고 기재, 일본 특허 공개 2003-000270호);
DYLRSVLEDF (서열 번호 8, 본 명세서에서 「PEP8」라고 기재, 국제 공개 제 2001/011044호);
QIRPIFSNR (서열 번호 9, 본 명세서에서 「PEP9」라고 기재, 국제 공개 제 2008/007711호);
ILEQSGEWWK (서열 번호 10, 본 명세서에서 「PEP10」라고 기재, 국제 공개 제 2009/022652호);
VIQNLERGYR (서열 번호 11, 본 명세서에서 「PEP11」라고 기재, 국제 공개 제 2009/022652호);
KLKHYGPGWV (서열 번호 12, 본 명세서에서 「PEP12」라고 기재, 국제 공개 제 1999/067288호);
RLQEWCSVI (서열 번호 13, 본 명세서에서 「PEP13」라고 기재, 국제 공개 제 2002/010369호);
ILGELREKV (서열 번호 14, 본 명세서에서 「PEP14」라고 기재, 국제 공개 제 2002/010369호;
DYVREHKDNI (서열 번호 15, 본 명세서에서 「PEP15」라고 기재, 국제 공개 제 2005/071075호);
HYTNASDGL (서열 번호 16, 본 명세서에서 「PEP16」라고 기재, 국제 공개 제 2001/011044호);
NYSVRYRPGL (서열 번호 17, 본 명세서에서 「PEP17」라고 기재, 일본 특허 공개 2003-000270호);
RYLTQETNKV (서열 번호 18, 본 명세서에서 「PEP18」라고 기재, 국제 공개 제 2005/116056호)
아래의 표 1은 CTL 에피토프 펩타이드 PEP1 ~ PEP18의 유래가 되는 단백질의 정보를 기재한다. 이 단백질은 종양 조직에서 고 발현하는 것으로 보고되고 있다.
| 펩타이드 | 유래 | 아미노산서열 | 서열번호 |
| PEP1 | Lck-246 | KLVERLGAA | 서열번호1 |
| PEP2 | WHSC2-103 | ASLDSDPWV | 서열번호2 |
| PEP3 | HNRPL-140 | ALVEFEDVL | 서열번호3 |
| PEP4 | SART3-302 | LLQAEAPRL | 서열번호4 |
| PEP5 | SART2-93 | DYSARWNEI | 서열번호5 |
| PEP6 | SART3-109 | VYDYNCHVDL | 서열번호6 |
| PEP7 | MRP3-503 | LYAWEPSFL | 서열번호7 |
| PEP8 | Lck-488 | DYLRSVLEDF | 서열번호8 |
| PEP9 | SART3-734 | QIRPIFSNR | 서열번호9 |
| PEP10 | Lck-90 | ILEQSGEWWK | 서열번호10 |
| PEP11 | Lck-449 | VIQNLERGYR | 서열번호11 |
| PEP12 | CypB-129 | KLKHYGPGWV | 서열번호12 |
| PEP13 | UBE2V-43 | RLQEWCSVI | 서열번호13 |
| PEP14 | WHSC2-141 | ILGELREKV | 서열번호14 |
| PEP15 | EGFR-800 | DYVREHKDNI | 서열번호15 |
| PEP16 | Lck-208 | HYTNASDGL | 서열번호16 |
| PEP17 | MRP3-1293 | NYSVRYRPGL | 서열번호17 |
| PEP18 | PTHr-102 | RYLTQETNKV | 서열번호18 |
본 발명의 CTL 에피토프4 연결펩타이드는 상기 CTL 에피토프 펩타이드 중 특정 13 종류 (서열 번호 1로 표시되는 펩타이드「PEP1」, 서열 번호 2로 표시되는 펩타이드「PEP2」, 서열 번호 4로 표 되는 펩타이드「PEP4」, 서열 번호 5로 표시되는 펩타이드「PEP5」, 서열 번호 6으로 표시되는 펩타이드「PEP6」, 서열 번호 7로 표시되는 펩타이드「PEP7」, 서열 번호 8로 표시되는 펩타이드「PEP8」, 서열 번호 9로 표시되는 펩타이드「PEP9」, 서열 번호 10로 표시되는 펩타이드「PEP10」, 서열 번호 13로 표시되는 펩타이드「PEP13」, 서열 번호 15로 표시되는 펩타이드「PEP15」, 서열 번호 17로 표시되는 펩타이드「PEP17」및 서열 번호 18로 표시되는 펩타이드「PEP18」)에서 선택되는 4종류의 CTL 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 선형으로 연결된 펩타이드이며, 각 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL을 3개 이상 유도 및 / 또는 활성화 할 수 있다. 또한, CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 유도를 직접적으로 평가하지 않고, 면역 프로테아좀에 의한 절단 실험 (국제 공개 제 2015/060235호 등)에 의해 해당 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL 유도 여부를 판단 할 수 있다.본 발명에서 에피토프4 연결펩타이드는
서열 번호 5로 표시되는 펩타이드「PEP5」와,
서열 번호 1로 표시되는 펩타이드「PEP1」, 서열 번호 2로 표시되는 펩타이드「PEP2」, 서열 번호 4로 표시되는 펩타이드「PEP4」, 서열 번호 6으로 표시되는 펩타이드「PEP6」, 서열 번호 7로 표시되는 펩타이드「PEP7」, 서열 번호 8로 표시되는 펩타이드「PEP8」, 서열 번호 9로 표시되는 펩타이드「PEP9」, 서열 번호 10로 표시되는 펩타이드「PEP10」, 서열 번호 13로 표현 펩타이드「PEP13」, 서열 번호 15로 표시되는 펩타이드「PEP15」, 서열 번호 17로 표시되는 펩타이드「PEP17」및 서열 번호 18로 표시되는 펩타이드「PEP18」로 이루어진 군에서 선택되는 3가지 펩타이드가
링커를 통해 각각 연결되는
펩타이드이다.
본 발명에서 PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18의 각 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및 / 또는 부가된 아미노산 서열을 가지고, 원래의 펩타이드와 같거나 그 이상의 CTL 유도능 및 / 또는 면역 글로불린 생산 유도능을 가지는 펩타이드도 「CTL 에피토프 펩타이드」로 사용할 수 있다. 여기에서 「복수」는 2 ~ 3 개이며, 바람직한 것은 2 개이다. 이러한 펩타이드로는 원래의 아미노산과 유사한 특성을 갖는 아미노산으로 치환된 (즉, 보존적 아미노산 치환에 의해 얻어진) 펩타이드 등을 들 수 있다.
「원래 펩타이드와 같거나 그 이상의 CTL 유도능 및 / 또는 면역 글로불린 생산 유도능을 가지는 펩타이드」인지 여부는 국제 공개 제 2015/060235호 팜플렛에 기재된 방법에 준하여 평가할 수 있다. 상기 방법을 사용하여 평가하는 경우, CTL 유도능은 하나 이상의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및 / 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 시험 펩타이드를 미리 투여한 마우스 유래의 세포, 동계 마우스 유래의 항원 제시 세포 및 시험 펩타이드를 첨가한 웰의 IFN-γ 생산 세포의 수를 지표로 얻어진 Δ 값의 판정 결과 (양성 (10 ≤ Δ <100), 중간 양성 (100 ≤ Δ <200 ), 강 양성 (200 ≤ Δ))가 같거나 그 이상이면 원래의 펩타이드와 같거나 그 이상의 CTL 유도능을 가지는 펩타이드라고 판단할 수 있다. 이 경우 원래의 펩타이드가 「양성」이고, 하나 이상의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및 / 또는 부가 된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드도 「양성」이면 동등한 것으로 판단한다. 또한 면역 글로불린 생산 유도능 시험 펩타이드를 투여한 마우스 혈청 CTL 에피토프 특이 IgG 항체가를 지표로 얻은 IgG 항체가 증가(fold)의 측정 결과 (2 <fold <10, 10 ≤ fold <100, 100 ≤ fold)가 같거나 그 이상이면 같거나 그 이상의 면역 글로불린 생산 유도능을 가지는 펩타이드라고 판단할 수 있다. 이 경우 원래 펩타이드의 측정 결과가 「2 <fold <10」의 범위 내이고, 하나 이상의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및 / 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 측정 결과도 「2 <fold <10」의 범위 내이면 동등한 것으로 판단한다.
본 발명에서 링커는 CTL 에피토프4 연결펩타이드가 생체에 투여되었을 때 절단되어 연결된 CTL 에피토프 펩타이드가 개별적으로 분리되는 것이 좋으며, 그 예로는, 에스테르 결합, 에테르 결합, 아미드 결합, 당쇄 링커, 폴리에틸렌 글리콜 링커, 아미노산 링커 등을 들 수 있다. 아미노산 링커로 사용되는 아미노산 서열로는 아르기닌 다이머(RR), 아르기닌 트리머(RRR), 아르기닌 테트라머(RRRR), 리진 다이머(KK), 리진 트리머(KKK), 리진 테트라머(KKKK), 글리신 다이머(GG), 글리신 트리머(GGG), 글리신 테트라머(GGGG), 글리신 펜타머(GGGGG), 글리신 헥사머(GGGGGG), 알라닌 - 알라닌 - 티로신(AAY), 이소류신 - 루신 - 알라닌(ILA), 아르기닌 - 발린 - 리진 - 아르기닌(RVKR) 등이 예시되며, 아르기닌 다이머(RR) 또는 아르기닌 트리머(RRR)가 바람직하나, 가장 바람직한 것은 아르기닌 다이머(RR)이다. 에피토프 연결펩타이드에서 사용되는 링커는 해당 분야에 공지되어 있으며, 해당업자라면 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 에피토프4 연결펩타이드에서 선택되는 CTL 에피토프 펩타이드 및 그 연결 순서는 소정의 조합과 소정의 연결 순서로 합성한 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A 발현 유전자 변형 마우스에 투여하고, in vivo에서 각 CTL 에피토프 펩타이드 특이적인 CTL 유도의 유무를 평가하여 결정할 수 있다. in vivo에서 각 CTL 에피토프 펩타이드 특이적인 CTL 유도의 유무를 평가하는 방법은 국제 공개 제 2015/060235호 팜플렛에 기재된 방법에 준하여 평가할 수 있다. CTL 에피토프 펩타이드 및 그 연결 순서의 선택은 해당 방법을 이용하여 적어도 3 종 이상, 바람직하게는 4 종의 CTL 에피토프 펩타이드에 대해 각 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL의 유도를 보인 CTL 에피토프 펩타이드 및 그 연결 순서로 결정할 수 있다.
본 발명의 에피토프4 연결펩타이드는 바람직하게는 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징이 있다 :
(1) C 말단이 PEP2이고 (단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
따라서, 바람직한 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드는
서열 번호 5로 표시되는 펩타이드「PEP5」와,
서열 번호 1로 표시되는 펩타이드「PEP1」, 서열 번호 2로 표시되는 펩타이드「PEP2」, 서열 번호 4로 표시되는 펩타이드「PEP4」, 서열 번호 6으로 표시되는 펩타이드「PEP6」, 서열 번호 7로 표시되는 펩타이드「PEP7」, 서열 번호 8로 표시되는 펩타이드「PEP8」, 서열 번호 9로 표시되는 펩타이드「PEP9」, 서열 번호 10로 표시되는 펩타이드「PEP10」, 서열 번호 13로 표현 펩타이드「PEP13」, 서열 번호 15로 표시되는 펩타이드「PEP15」, 서열 번호 17로 표시되는 펩타이드「PEP17」및 서열 번호 18로 표시되는 펩타이드「PEP18」로 이루어진 군에서 선택되는 3 가지 펩타이드가
링커를 통해 각각 연결되고, 다음 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 펩타이드 :
(1) C 말단이 PEP2이고 (단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
보다 바람직한 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드는 서열 번호 5로 표시되는 펩타이드「PEP5」, 서열 번호 6으로 표시되는 펩타이드「PEP6」 및 서열 번호 9로 표시되는 펩타이드「PEP9」와
서열 번호 2로 표시되는 펩타이드「PEP2」, 서열 번호 4로 표시되는 펩타이드「PEP4」 및 서열 번호 10로 표시되는 펩타이드「PEP10」로 이루어진 군에서 선택되는 1 개의 펩타이드가
링커를 통해 각각 연결되고, C 말단이 PEP2, PEP4 또는 PEP10인 것이다.
보다 바람직한 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드는 다음에서 선택된 서열로 이루어진 펩타이드이다:
· PEP5- (L) -PEP6- (L) -PEP9- (L) -PEP4;
· PEP9- (L) -PEP5- (L) -PEP6- (L) -PEP4;
· PEP6- (L) -PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP4;
· PEP6- (L) -PEP9- (L) -PEP5- (L) -PEP4;
· PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP5- (L) -PEP4;
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP4;
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP2; 또는,
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP10.
상기 식에서 「(L)」는 링커를 나타낸다.
보다 바람직한 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드는 다음에서 선택되는 서열로 이루어진 펩타이드이다 :
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP4;
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP2; 또는,
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP10.
상기 식에서 「(L)」는 링커를 나타낸다.
보다 바람직한 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드는 링커가 아르기닌 다이머인 하기에서 선택된 서열로 표시되는 펩타이드 :
· PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 (서열 번호 24, 본 명세서에서 TPV06라고 기재한다);
· PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP2 (서열 번호 25, 본 명세서에서 TPV07라고 기재한다); 또는,
· PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP10 (서열 번호 26, 본 명세서에서 TPV08라고 기재한다)
*이며,
보다 바람직한 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드는 서열 번호 24로 표시되는 펩타이드 TPV06이다.
본 발명의 실시 예 중 하나에 있어서 바람직한 에피토프4 연결펩타이드는 다음 표 2에 나타낸 서열 번호 19 ~ 28에서 선택되는 서열로 표시되는 펩타이드이다.
| 펩타이드 | 아미노산서열 | 서열번호 |
| TPV01 | PEP5-RR-PEP6-RR-PEP9-RR-PEP4 | 서열번호19 |
| TPV02 | PEP9-RR-PEP5-RR-PEP6-RR-PEP4 | 서열번호20 |
| TPV03 | PEP6-RR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP4 | 서열번호21 |
| TPV04 | PEP6-RR-PEP9-RR-PEP5-RR-PEP4 | 서열번호22 |
| TPV05 | PEP9-RR-PEP6-RR-PEP5-RR-PEP4 | 서열번호23 |
| TPV06 | PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 | 서열번호24 |
| TPV07 | PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP2 | 서열번호25 |
| TPV08 | PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP10 | 서열번호26 |
| TPV09 | RRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 | 서열번호27 |
| TPV10 | RRRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 | 서열번호28 |
보다 바람직한 에피토프4 연결펩타이드는 상기 표 2에서 선택된 다음의 펩타이드 :· TPV01(서열 번호 19);
· TPV02(서열 번호 20);
· TPV03(서열 번호 21);
· TPV04(서열 번호 22);
· TPV05(서열 번호 23); 또는,
· TPV06(서열 번호 24);
이다.
또한, 본 발명에서는 에피토프4 연결펩타이드를 2종 이상 사용하거나, 예를 들면, 2종, 3종, 4종 이상의 에피토프4 연결펩타이드를 개별적으로 또는 혼합하여 사용하거나, 3종의 에피토프4 연결펩타이드를 혼합하여 사용하는 것도 바람직하다. 에피토프4 연결펩타이드를 2 종 이상 사용하는 경우, 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드가 적어도 1종 포함되어 있으면, 나머지 1종 이상은 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드를 사용하거나, 예를 들면 국제 공개 제 2015/060235호에 기재된 에피토프4 연결펩타이드를 사용하여도 된다. 서열 번호 24로 표시되는 펩타이드 및 국제 공개 제 2015/060235 호에 기재된 CTL 에피토프4 연결펩타이드를 1종 이상 사용하는 것이 바람직하고, 서열 번호 24로 표시되는 펩타이드 및 국제 공개 제 2015/060235 호에 기재된 에피토프4 연결펩타이드를 2종 사용하는 것이 보다 바람직하나, 서열 번호 24로 표시되는 펩타이드, 서열 번호 44로 표시되는 펩타이드(TPV011 : PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10) 및 서열 번호 45로 표시되는 펩타이드(TPV012 : RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2)의 3 종류를 혼합하여 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 CTL 에피토프4 연결펩타이드는 또한 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 가질 수 있다. 해당 펩타이드 서열은 CTL 에피토프4 연결펩타이드의 N 말단 및 / 또는 C 말단에 부가할 수 있으나, N 말단에 부가하는 것이 바람직하다. 해당 펩타이드 서열은 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 트레오닌, 티로신, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 ~ 15개, 바람직하게는 2 ~ 10개, 가장 바람직하게는 3 ~ 5개의 친수성 아미노산으로 이루어진 것을 선택할 수 있다. 예를 들어 해당 펩타이드 서열로, 아르기닌 트리머(RRR)와 아르기닌 테트라머(RRRR)를 이용할 수 있으며, 이러한 펩타이드 서열이 부가된 CTL 에피토프4 연결펩타이드로는 RRR-TPV06, RRRR-TPV06, TPV06 -RRR, TPV06-RRRR, RRR-TPV07, RRRR-TPV07, TPV07-RRR, TPV07-RRRR, RRR-TPV08, RRRR-TPV08, TPV08-RRR, TPV08-RRRR, KKK-TPV06, KKKK-TPV06, TPV06-KKK , TPV06-KKKK, KKK-TPV07, KKKK-TPV07, TPV07-KKK, TPV07-KKKK, KKK-TPV08, KKKK-TPV08, TPV08-KKK, TPV08-KKKK, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, TPV06-HHH, TPV06 -HHHH, HHH-TPV07, HHHH-TPV07, TPV07-HHH, TPV07-HHHH, HHH-TPV08, HHHH-TPV08, TPV08-HHH, TPV08-HHHH, RRKK-TPV06, RKRK-TPV06, RHRH-TPV06, RRHH-TPV06, KKHH-TPV06, KHKH-TPV06 등의 예가 있고, 바람직한 경우로는 RRR-TPV06, RRRR-TPV06, RRR-TPV07, RRRR-TPV07, RRR-TPV08, RRRR-TPV08, KKK-TPV06, KKKK-TPV06, KKK-TPV07, KKKK-TPV07, KKK-TPV08, KKKK-TPV08, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, HHH-TPV07, HHHH-TPV07, HHH-TPV08, HHHH-TPV08, RRKK-TPV06, RKRK-TPV06, RHRH-TPV06, RRHH -TPV06, KKHH-TPV06, KHKH-TPV06가 있고, 더욱 바람직한 것은 RRR-TPV06(TPV09), RRRR-TPV06(TPV10), RRR-TPV07, RRRR-TPV07, RRR-TPV08, RRRR-TPV08가 있으며, 가장 바람직한 것은 RRR-TPV06,(TPV09), RRRR-TPV06 (TPV10)이다.
친수성 아미노산으로 이루어진 해당 펩타이드 서열이 부가된 펩타이드는 수용성 용매에 대한 용해도가 향상하는 것으로 알려져 있다(Peptides : 38,302-311 (2012), 일본 특허 공개 2006-188507). 본 발명의 CTL 에피토프4 연결펩타이드에 해당 펩타이드 서열을 부가함으로써 수용성 용매에서 CTL 에피토프4 연결펩타이드의 용해도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 「친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 가지고 있어도 되는 에피토프4 연결펩타이드」는, 바람직하게는 N 말단에 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 갖고 있어도 되는 CTL 에피토프4 연결펩타이드이며, 보다 바람직하게는 N 말단에 아르기닌, 히스티딘과 리진으로 이루어진 군에서 선택되는 3 ~ 5 개의 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 갖고 있어도 되는 CTL 에피토프4 연결펩타이드이고, 더 바람직하게는 N 말단에 아르기닌 트리머(RRR) 또는 아르기닌 테트라머(RRRR)을 갖고 있어도 되는 CTL 에피토프4 연결펩타이드이며, 보다 바람직하게는 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 갖지 않는 CTL 에피토프4 연결펩타이드이다.
또한, 본 발명의 CTL 에피토프4 연결펩타이드는 예를 들면, 국제 공개 제 2015/060235호 팜플렛에 기재된 방법에 준하여 합성할 수 있다.
본 발명의 면역체크포인트분자 조절제는 면역체크포인트분자에 작용하여 암 환자의 생체 내에서 항종양 면역 반응을 유도하고, 종양 면역 도피를 제어하는 작용을 갖는다.
따라서 면역체크포인트분자 조절제로서 면역체크포인트분자를 표적으로 한 물질을 사용할 수 있다. 면역체크포인트분자로는 예를 들어, B7 family(B7-1, B7-2, PD-L1, PD-L2 등), CD28 family(CTLA-4, PD-1 등), TNF superfamily(4-1BBL, OX40L 등), TNF receptor superfamily(4-1BB, OX40 등) 분자들이 있으며, 이들은 자극성의 공동 자극 분자인 costimulatory 분자와 억제성의 공동 자극 분자인 coinhibitory 분자로 크게 분류된다.
본 발명에서 적합하게 사용할 수 있는 면역체크포인트분자 조절제로는 costimulatory 분자의 기능을 촉진하는 물질 혹은 coinhibitory 분자의 기능을 억제하는 물질을 들 수 있다. 보다 구체적인 면역체크포인트분자 조절제로는 예를 들어, PD-1 경로 길항제, ICOS 경로 작용제, CTLA-4 경로 길항제, CD28 경로 작용제, BTLA 경로 길항제, 4-1BB 경로 작용제 등을 들 수 있다 .
본 발명에서 면역체크포인트분자 조절제는 PD-1 경로 길항제, ICOS 경로 작용제, CTLA-4 경로 길항제 및 CD28 경로 작용제로 이루어진 군에서 1종 이상 선택하는 것이 좋으며, 보다 바람직한 것은 PD- 1 경로 길항제, CTLA-4 경로 길항제 및 CD28 경로 작용제로 이루어진 군에서 1종 이상을, 보다 바람직한 것은 PD-1 경로 길항제 및 CTLA-4 경로 길항제로 이루어진 군에서 적어도 1종 이상을 선택하는 것이며, 부작용 억제의 관점에서 더욱 바람직한 것은 PD-1 경로 길항제이다.
PD-1 경로 길항제는 T 세포에 발현되는 PD-1과 그 리간드인 PD-L1 또는 PD-L2에 의한 면역 억제 신호를 저해하는 것이며, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체, 항 PD-L2 항체, PD-1 세포 외 도메인, PD-L1 세포 외 도메인, PD-L2 세포 외 도메인, PD-1-Ig (PD-1 세포 외 도메인과 면역 글로불린(Ig)의 FC 영역과의 융합 단백질), PD-L1-Ig, PD-L2-Ig, PD-1 siRNA, PD-L1 siRNA, PD-L2 siRNA 등을 들 수 있다. PD-1 경로 길항제로서, 바람직한 것은 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 또는 항 PD-L2 항체이며, 보다 바람직한 것은 항 PD-1 항체 또는 항 PD-L1 항체이다. 그 중에서도 특히 바람직한 것은 항 PD-1 항체이다.
또한 CTLA-4 경로 길항제는 T 세포에 발현하는 CTLA-4와 그 리간드인 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)에 의한 면역 억제 신호를 저해하는 것으로, 항 CTLA -4 항체, CTLA-4 세포 외 도메인, CTLA-4-Ig, 항 B7-1(CD80) 항체 또는 항 B7-2(CD86) 항체, CTLA-4 siRNA 등을 들 수 있다. CTLA-4 경로 길항제로서, 바람직한 것은 항 CTLA-4 항체, CTLA-4 세포 외 도메인, CTLA-4-Ig, 항 B7-1(CD80) 항체 또는 항 B7-2(CD86) 항체이며, 더 바람직한 것은 항 CTLA-4 항체 또는 CTLA-4-Ig이다. 그 중에서도 특히 바람직한 것은 항 CTLA-4 항체이다.
이들의 항체로는 면역 글로불린(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY 등), Fab 단편, F(ab ') 2 조각, 단일 가닥 항체 단편(scFv), 단일 도메인 항체, Diabody 등 (Nat .Rev.Immunol. 6 : 343-357,2006)을 들 수 있고 이들은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 마우스 항체, 라마 항체, 닭 항체 등의 단클론 항체 또는 다클론 항체를 들 수 있다.
바람직하게는 인간화 IgG 단클론 항체 또는 인간 IgG 단클론 항체이다.
본 발명의 항 PD-1 항체로는 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 세미플리맙(Cemiplimab) 또는 스파르탈리주맙 (Spartalizumab) 등을 들 수 있고 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이 바람직하다.
본 발명의 항 PD-L1 항체로는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab) 또는 아벨루맙(Avelumab) 등을 들 수 있고 아테졸리주맙, 더발루맙 또는 아벨루맙이 바람직하다.
본 발명의 항 CTLA-4 항체로는 이필리무맙(Ipilimumab） 또는 트레멜리무맙(Tremelimumab) 등을 들 수 있고 이필리무맙이 바람직하다.본 발명에서 CTLA-4-Ig로는 아바타셉트(Abatacept) 등을 들 수 있고 아바타셉트가 바람직하다.
이러한 항체는 일반적으로 공지된 항체 제작 방법으로 제작할 수 있다.
또한, 항 PD-1 항체는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙으로, 항 PD-L1 항체는 아테졸리주맙, 더발루맙 또는 아벨루맙으로, 항 CTLA-4 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙으로 CTLA-4-Ig는 아바타셉트로, 이미 판매하거나 판매 예정으로 이를 사용할 수도 있다.
본 발명에서 2 종 이상의 면역체크포인트분자 조절제를 사용하는 경우, 예를 들어, 항 PD-1 항체 또는 항 CTLA-4 항체를 병용하여 사용할 수도 있고, PD-1과 CTLA-4의 모두 결합할 수 있는 이중 특이성 항체를 사용할 수도 있다. 이중 특이성 항체로는, XmAb20717 (PD-1 × CTLA-4)을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 에피토프4 연결펩타이드의 인간의 권장 복용량은 단독 투여의 경우, 에피토프4 연결펩타이드 1 종 당 3 ~ 9mg / body / day이다. 본 발명에서 에피토프4 연결펩타이드 투여일의 하루 투여량으로는 에피토프4 연결펩타이드에 의한 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과의 증강 효과의 관점에서 에피토프4 연결펩타이드를 혼자 투여하는 경우의 권장 용량의 50 ~ 200 %가 바람직하고, 80 ~ 120 %가 보다 바람직하며, 100 %가 특히 바람직하다.
따라서 인간의 권장 복용량이 3mg / body / day 인 경우, 투여량은 에피토프4 연결펩타이드 1 종 당 1.5 ~ 6mg / body / day가 바람직하고, 2.4 ~ 3.6mg / body / day가 보다 바람직하며, 3mg / body / day가 특히 바람직하다. 또한 인간의 권장 복용량이 9mg / body / day 인 경우, 투여량은 에피토프4 연결펩타이드 1 종 당 4.5 ~ 18mg / body / day가 바람직하고, 7.2 ~ 10.8mg / body / day가 보다 바람직하며, 9mg / body / day가 특히 바람직하다.
본 발명에서 면역체크포인트분자 조절제의 투여일의 하루 투여량으로는 에피토프4 연결펩타이드에 의한 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과의 증강 작용 측면에서 면역체크포인트분자 조절제를 단독으로 투여하는 경우의 권장 용량의 50 ~ 100 %가 바람직하며, 100 %가 더 바람직하다.
구체적으로 니볼루맙을 단독으로 투여하는 경우의 권장 복용량은 일본에서 승인을 받은 복용량인 1 회 2mg / kg (체중) 또는 1 회 3mg / kg(체중)이므로, 본 발명의 니볼루맙 투여일의 하루 투여량은 1 회 1 ~ 3mg / kg(체중)이 바람직하고, 보다 바람직한 것은 1 회 2mg / kg (체중) 또는 1 회 3mg / kg(체중)이다.
펨브롤리주맙을 단독으로 투여하는 경우의 권장 복용량은 일본에서 승인을 받은 복용량인 1 회 2mg / kg (체중) 또는 1 회 200mg이므로, 본 발명의 펨브롤리주맙 투여일의 하루 투여량은 1 회 1 ~ 2mg / kg(체중) 또는 1 회 100 ~ 200mg이 바람직하고, 보다 바람직한 것은 1 회 2mg / kg(체중) 또는 1 회 200mg이다.
아테졸리주맙을 단독으로 투여하는 경우의 권장 복용량은 일본에서 승인을 받은 복용량인 1 회 1200mg이므로, 본 발명의 아테졸리주맙 투여일의 하루 투여량은 1 회 600 ~ 1200mg이 바람직하고, 보다 바람직한 것은 1 회 1200mg이다.
아벨루맙 또는 더발루맙을 단독으로 투여하는 경우의 권장 복용량은 미국에서 승인을 받은 복용량인 1 회 10mg / kg(체중)이므로, 본 발명의 아벨루맙 또는 더발루맙 투여일의 하루 투여량은 1 회 5 ~ 10mg / kg(체중)이 바람직하고, 보다 바람직한 것은 1 회 10mg / kg(체중)이다.
이필리무맙을 단독으로 투여하는 경우의 권장 복용량은 일본에서 승인을 받은 복용량인 1 회 3mg / kg(체중)이므로, 본 발명의 이필리무맙 투여일의 하루 투여량은 1 회 1.5 ~ 3mg / kg(체중)이 바람직하고, 보다 바람직한 것은 1 회 3mg / kg (체중)이다.
또한, 본 발명에서 「권장 복용량」이라 함은 임상 시험 등에 의해 결정된 심각한 부작용이 발생하지 않고 안전하게 사용할 수 있는 범위에서 최대의 치료 효과를 가지는 복용량이다. 구체적으로는 일본 독립 행정법인 의약품 의료 기기 종합기구(PMDA; Pharmaceuticals and Medical Devices Agency), 미국 식품 의약품 국(FDA; Food and Drug Administration), 유럽 의약품 청(EMA; European Medicines Agency) 등의 공적 기관이나 단체가 승인·권장·권고하여 첨부 문서·인터뷰 폼·치료 지침 등에 기재된 복용량을 들 수 있으며, PMDA, FDA 또는 EMA 중 하나의 공적 기관이 승인한 복용량이 바람직하다.
본 발명의 항종양제 투여 일정은 암종과 병기 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
에피토프4 연결펩타이드의 경우는 1 주일에 1 회 투여하는 공정을 3 회(1 일차, 8 일차, 15 일차에 1 일 1 회) 반복하여 모두 21 일간을 1 주기로 하는 투여 일정이 바람직하다. 또한 3주기 이후는 1 일차에 투여하고 20 일간 휴약하는 총 21 일간을 1 주기로 하는 투여 스케줄(3 주에 1 회 투여하는 방법)이 바람직하다.
니볼루맙의 경우는 2 주 또는 3 주 간격으로 투여하는 투여 스케줄이 바람직하다.
펨브롤리주맙, 아테졸리주맙 또는 이필리무맙의 경우는 3 주 간격으로 투여하는 투여 스케줄이 바람직하다.
아벨루맙 또는 더발루맙의 경우는 2 주 간격으로 투여하는 투여 스케줄이 바람직하다.
본 발명의 항종양제의 1 일 투여 횟수는 암종과 병기 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
에피토프4 연결펩타이드, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 이필리무맙의 경우 1 일 1 회가 바람직하다.
본 발명의 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제의 투여 순서는 암종과 병기 등에 따라 적절하게 선택할 수 있지만 어느 쪽을 먼저 투여하거나 동시에 투여해도 상관 없다. 여기서 두 가지를 동시에 투여하지 않으면 투여 간격은 항종양 효과의 증강 효과를 발휘하는 범위 안에서 적절히 선택할 수 있지만, 1 ~ 21 일이 바람직하고, 이보다는 1 ~ 14 일이 바람직하며, 1 ~ 7 일이 특히 바람직하다. 본 발명의 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제의 투여 순서는 에피토프4 연결펩타이드를 먼저 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 대상이 되는 종양은 항종양 효과의 증강 효과를 나타내는 범위이면 특별히 제한되지 않지만, 에피토프4 연결펩타이드가 항종양 효과를 발휘하는 종양이 바람직하며, 보다 바람직한 것은 Lck, WHSC2, SART2, SART3, MRP3, UBE2V, EGFR 또는 PTHr 양성 종양이며, 가장 바람직한 것은 SART2 양성 종양이다.
본 발명의 대상이되는 암으로는, 구체적으로 뇌종양, 두경부암, 소화기암(식도암, 위암, 십이지장암, 간암, 담도암(담낭·담관암 등), 췌장암, 소장암, 대장암(대장암, 결장암, 직장암 등), 위장관 기저 종양 등), 폐암(비소 세포 폐암, 소세포 폐암), 유방암, 난소암, 자궁암(자궁 경부암, 자궁 몸암 등), 신장암, 요로상피암(방광암, 신우암, 요관암), 전립선암, 피부암, 원발불명암 등을 들 수 있다. 또한 여기서 암은 원발 뿐만 아니라 다른 장기(간)에 전이된 암을 포함한다. 이 중 항종양 효과의 관점에서 두경부암, 소화기암, 폐암, 신장암, 요로상피암, 피부암이 바람직하고, 소화기암, 폐암, 요로상피암, 피부암이 더욱 바람직하며, 폐암, 요로상피암이 특히 바람직하다. 또한, 본 발명의 항종양제는 종양을 외과적으로 적출한 후 재발 방지를 위해 행해지는 수술 후 보조 화학 요법에 이용하거나, 종양을 외과적으로 적출하기 위해 사전 열리는 수술 전 보조 화학 요법으로 이용할 수 있다.
본 발명에서 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제는 각 유효 성분의 투여 형태 및 투여 일정에 따라 각 유효 성분을 여러 제형으로 나누어 제제화 할 수 있으며, 하나의 제형으로 정리하여 제제화(즉, 복합제로서 제제화) 할 수 있다. 또한 각 제제를 병용에 적합한 1 개의 패키지로 제조 판매할 수 있으며, 또한 각 제제를 별도의 패키지로 나누어 제조 판매할 수 있다.
본 발명의 항종양제 투여 형태로서는 특별한 제한은 없고, 치료 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 구체적으로는 경구제(정제, 피복 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 액제 등), 주사제, 좌제, 첨부제, 연고제 등의 예시가 있다.
에피토프4 연결펩타이드, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 및 항 CTLA-4 항체의 투여 형태로 위의 투여 형태를 들 수 있으며, 바람직한 것은 주사제이다.
본 발명의 항종양제는 에피토프4 연결펩타이드에 대해서도 면역체크포인트분자 조절제에 대해서도 그 투여 형태에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 일반적인 공지 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 담체로는 일반 약에 범용되는 각종의 것, 예를 들면 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 희석제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 착색제, 맛을 내는 물질, 교취제 등의 예시가 있다.
본 발명은 또한 암 환자에 대한 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과를 강화하는 에피토프4 연결펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항종양 효과 증강제에 관한 것이다. 해당 항종양 효과 증강제는 상기 항종양제의 제제 형태를 가진다.
본 발명은 또한 면역체크포인트분자 조절제를 투여한 암 환자를 치료하기 위한 에피토프4 연결펩타이드를 포함하는 항종양제에 관한 것이다. 해당 항종양제는 상기의 제제 형태를 가진다.
본 발명은 또한 에피토프4 연결펩타이드를 투여한 암 환자를 치료하기 위한 면역 체크 포인트 분자 조절제를 포함하는 항종양제에 관한 것이다. 해당 항종양제는 상기의 제제 형태를 가진다.
「치료」는 종양을 외과적으로 적출한 후 재발 방지를 위해 행해지는 수술 후 보조 화학 요법과 종양을 외과적으로 적출하기 위해 사전에 행해지는 수술 전 보조 화학 요법이 포함된다.
본 발명은 또한 암 환자에 대한 면역체크포인트분자 조절제와 병용하는 것을 특징으로 하는 에피토프4 연결펩타이드를 포함하는 항종양제에 관한 것이다. 해당 항종양제는 상기의 제제 형태를 가진다.
본 발명은 또한 암 환자에 대한 에피토프4 연결펩타이드와 병용하는 것을 특징으로하는 면역체크포인트분자 조절제를 포함하는 항종양제에 관한 것이다. 해당 항종양제는 상기의 제제 형태를 가진다.
본 발명은 또한 에피토프4 연결펩타이드를 포함하는 항종양제와 암 환자에게 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 투여하는 것을 기재한 사용 설명서를 포함한 키트 제제에 관한 것이다.
여기서 「사용 설명서」는 법적 구속력의 유무를 불문하고, 투여될 제제의 양 및 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 권장 용량을 설명한다. 구체적으로는, 첨부 문서, 팜플렛 등의 예시가 있다. 또한 사용 설명서를 포함한 키트 제제는 키트 제제의 패키지에 사용 설명서가 인쇄·첨부되어 있는 것도, 키트 제제의 패키지에 항종양제와 함께 사용 설명서가 동봉되어 있는 것이어도 된다.
한편, 본 발명자 그룹은 비 인간 동물에서 인간 또는 비 인간 유래의 β2 마이크로 글로불린, HLA 클래스 I의 α1과 α2 영역 및 인간 또는 비 인간 유래의 MHC 클래스 I의 α3 영역이 연결된 인공 키메라 유전자를 발현시키는 기술을 확립하고 HLA 클래스 I을 발현하는 비 인간 동물의 제작에 성공하였다 (국제 공개 제 2015/056774호).
상기 비 인간 동물을 이용하여, 비 인간 동물에서 인간의 면역 반응을 재현하는 것이 가능하다. 즉, 상기 비 인간 동물의 항원 제시 세포는 HLA 클래스 I의 α1과 α2 영역을 발현하므로 이와 결합할 수 있는 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 제시할 수 있다.
본 발명자는 또한 인간 HLA-A24와 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 공동 발현시킴으로써, 에피토프4 연결펩타이드의 투여에 의한 CTL 유도의 효과를 평가할 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 마우스 종양 유래의 배양 세포에 인간 HLA-A24와 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 공동 발현하여, 상기 비 인간 동물에 이식시킴으로써 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 제시하는 종양을 증식시킬 수 있다.
즉, 본 발명은 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포를 제공하는 것이다. 여기서 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드는 PEP5를 포함하는 것이 바람직하며, 따라서 해당 세포에 PEP5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명자는 상기의 비 인간 동물에서 HLA-A24와 PEP5를 공동 발현하는 종양의 생착에 성공하고 이러한 시스템에 의해 본 발명의 항종양제 등의 평가가 가능하다는 것을 입증했다.
따라서, 본 발명은 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포(이하, 「본 발명의 세포」라고도 함)에 관한 것이다.
SART2는 앞에서 언급 한대로, 종양 조직에서 고 발현하는 것으로 보고된 단백질의 일종이다. 수지상 세포 등의 항원 제시 세포에서 HLA-A24 형의 HLA 분자와 결합하여 제시될 수 있다. SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드로는 상기의 PEP5들 수 있다. 펩타이드 PEP5의 아미노산 서열은 서열 번호 5에, 펩타이드 PEP5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29에 나타내었다.
본 명세서에서 「SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드」는 바람직하게는 (a) ~ (e)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(a) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열 번호 29로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(e) 서열 번호 29로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
이며, 보다 바람직하게는 다음의 (a) ~ (e)에서 선택되는 폴리 뉴클레오티드 :
(a) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
*(b) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (단, 아미노산의 부가는 N 말단 측면 부가에 한함);
(c) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열 번호 29로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드;
(e) 서열 번호 29로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
이며, 보다 바람직한 것은, 상기 (a) 또는 (d)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에서, 「서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드」는 부가된 신호 배열를 포함할 수 있다. 「서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드」는, 바람직한 것은 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단 측에 신호 배열인 10 ~ 30 개의 아미노산이 부가된 폴리펩타이드이며, 보다 바람직한 것은 신호 배열 15 ~ 25 개의 아미노산이 부가된 폴리펩타이드이고, 보다 바람직한 것은 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.
마찬가지로, 본 명세서에서, 「서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드」는 부가된 신호 배열를 포함할 수 있다. 바람직한 것은 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열의 N 말단 측에 신호 배열인 10 ~ 30 개의 아미노산이 부가된 폴리펩타이드이며, 보다 바람직한 것은 신호 배열인 15 ~ 25 개의 아미노산이 부가된 폴리펩타이드이고, 보다 바람직한 것은 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.
마찬가지로, 본 명세서에서, 「서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드」는 부가된 신호 배열를 포함할 수 있다. 바람직한 것은 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열의 N 말단 측에 신호 배열인 10 ~ 30 개의 아미노산이 부가된 폴리펩타이드이며, 보다 바람직한 것은 신호 배열인 15 ~ 25 개의 아미노산이 부가된 폴리펩타이드이며, 보다 바람직한 것은 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.
마찬가지로, 본 명세서에서, 「서열 번호 29로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드」는 신호 서열을 코딩하는 염기 서열이 부가된 것도 포함한다. 바람직한 것은 서열 번호 29로 표시되는 염기 서열의 5 '말단에 신호 배열을 코딩하는 30 ~ 90 염기가 부가된 폴리뉴클레오티드이며, 보다 바람직한 것은 신호 배열을 코딩하는 45 ~ 75 염기가 부가된 폴리뉴클레오티드이고, 보다 바람직한 것은 서열 번호 33로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다.
마찬가지로, 본 명세서에서, 「서열 번호 29로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드」는 부가된 신호 배열를 포함할 수 있다. 바람직한 것은 서열 번호 29로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열의 5 '말단에 신호 배열을 코딩하는 30 ~ 90 염기가 부가된 폴리뉴클레오티드이며, 보다 바람직한 것은 신호 배열 코딩하는 45 ~ 75 염기가 부가된 폴리뉴클레오티드이고, 보다 바람직한 것은 서열 번호 33로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 실시 예 중 하나에서 「SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드」는 바람직하게는 다음의 (k) ~ (o)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(k) 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(l) 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(m) 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(n) 서열 번호 33로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(o) 서열 번호 33로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
이며, 보다 바람직하게는 다음의 (k) ~ (o)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(k) 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(l) 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(단, 아미노산의 부가는 N 말단 측면에 부가 한한다);
(m) 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(n) 서열 번호 33로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(o) 서열 번호 33로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
이며, 보다 바람직한 것은, 상기 (k) 또는 (n)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드이다.
또한 「SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드」는 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열 특이적인 CTL이 인식할 수 있는 것이 바람직하다.
여기서 「서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에 특이적인 CTL가 인식 할 수 있다」는 예를 들어, 본 발명의 세포와 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에 특이적인 CTL을 이용한 51Cr 방출 검사법, ELISA법(예를 들어, IFN-γ의 측정)와 ELISPOT 분석 (예를 들어, IFN-γ의 측정)을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서, 「인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드」는 바람직하게는 다음의 (f) ~ (j)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(f) 서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(g) 서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(h) 서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(i) 서열 번호 31로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(j) 서열 번호 31로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
이며, 보다 바람직한 것은 상기 (f) 또는 (i)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에서, 「서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드」는 바람직하게는 서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단 측에 β2 마이크로 글로불린을 추가하고 C 말단에 MHC 클래스 I 의 α3 영역이 추가된 폴리펩타이드이며, 보다 바람직한 것은 서열 번호 34로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서, 「서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드」는 바람직하게는 서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열의 N 말단 측에 β2 마이크로 글로불린이 추가되고 C 말단에 MHC 클래스 I의 α3 영역이 추가된 폴리펩타이드이며, 보다 바람직한 것은 서열 번호 34로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서, 「서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드」는 바람직하게는 서열 번호 30로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열의 N 말단 측에 β2 마이크로 글로불린이 추가되고 C 말단에 MHC 클래스 I의 α3 영역이 추가된 폴리펩타이드이며, 보다 바람직한 것은 서열 번호 34로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서, 「서열 번호 31로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드」는 바람직하게는 서열 번호 31로 표시되는 염기 서열의 5 '말단에 β2 마이크로 글로불린을 코딩하는 염기 서열을 부가하여 3 '말단에 MHC 클래스 I의 α3 영역을 코딩하는 염기 서열이 추가된 폴리뉴클레오티드이며, 보다 바람직한 것은 서열 번호 35로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에서, 「서열 번호 31로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드」는 바람직하게는 서열 번호 31로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열의 5 '말단에 β2 마이크로 글로불린을 코딩하는 염기 서열이 부가되고 3'말단에 MHC 클래스 I의 α3 영역을 코딩하는 염기 서열이 부가된 폴리뉴클레오티드이며, 보다 바람직한 것은 서열 번호 35로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에서, 「β2 마이크로 글로불린」은 MHC 클래스 I 분자의 β 사슬을 구성하는 단백질을 말한다. 본 명세서에서, 「β2 마이크로 글로불린」은 인간 또는 비 인간(마우스, 랫드, 햄스터, 기니피그, 토끼, 돼지, 소, 양 등) 유래의 어느 것이라도 좋고, 바람직한 것은 인간 β2 마이크로 글로불린( 본 명세서에서는 「hβ2M」로 기재)이다.
본 명세서에서, 「인간 β2 마이크로 글로불린」은 다음 (i) ~ (iii)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(i) 서열 번호 36로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(ii) 서열 번호 36로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가되고, 또한 MHC 클래스 I의 α 사슬 복합체를 형성함으로써 해당 MHC 클래스 I 특이적인 항원 제시 능력을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(iii) 서열 번호 36로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 가지며 MHC 클래스 I의 α 사슬 복합체를 형성함으로써 해당 MHC 클래스 I 특이적인 항원 제시 능력을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
이며, 바람직하게는 (i)로 표시되는 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 「MHC 클래스 I의 α3 영역」은 CTL 표면에 발현하는 보조 수용체인 CD8 분자와의 결합에 관여하는 α3 영역과 C 말단에 존재하는 막 관통 영역 및 세포 내 영역을 말한다. 본 명세서에서 「MHC 클래스 I의 α3 영역」은 인간 또는 비 인간(마우스, 랫드, 햄스터, 기니피그, 토끼, 돼지, 소, 양 등) 유래의 어느 것이라도 좋고, 바람직한 것은 마우스 MHC 종류 I α3 영역(본 명세서에서 「mα3」로 기재)이다.
본 명세서에서 「마우스 MHC 클래스 I의 α3 영역」은 다음 (iv) ~ (vi)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(iv) 서열 번호 37로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(v) 서열 번호 37로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가되고, 또한 CD8 분자 결합 능력을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(vi) 서열 번호 37로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 가지며 CD8 분자 결합 능력을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
이며, 바람직한 것은 (iv)로 표시되는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 실시 예 중 하나에서, 본 명세서에서 「인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드」는 바람직하게는 다음 (p) ~ (t)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(p) 서열 번호 34로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(q) 서열 번호 34로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(r) 서열 번호 34로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(s) 서열 번호 35로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(t) 서열 번호 35로 표시되는 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
이며, 보다 바람직한 것은 상기 (p) 또는 (s)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드이다.
또한 「인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드」는 코딩된 α1과 α2 영역이 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 항원으로 제시할 수 있는 것이 바람직하고, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 항원으로 제시할 수 있고 CD8 분자 결합 능력을 갖는 것이 더욱 바람직하며, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 항원으로 제시할 수 있고 CD8 분자 결합능를 가지며 또한 β2 마이크로 글로불린이 MHC 클래스 I의 α 사슬 복합체를 형성함으로써 해당 MHC 클래스 I 특이적인 항원 제시 기능을 가지고 있는 것이 더욱 바람직하다.
이러한 기능을 가지고 있는지 아닌지는 예를 들어, 본 발명의 세포와 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에 특이적인 CTL을 이용한 51Cr 방출 검사법, ELISA법(예를 들어, IFN-γ의 측정)와 ELISPOT분석(예를 들어, IFN-γ의 측정)을 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 세포 수립에 사용되는 숙주 세포는 동물 유래의 세포주이며 동물에 이식한 경우에 종양을 형성할 수 있는 것이 바람직하다. 숙주 세포가 마우스 유래의 세포주이고, 마우스에 이식한 경우에 종양을 형성할 수 있는 것이 더욱 바람직하다. 숙주 세포에 의해 형성되는 종양이 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 흑색종과 림프종 등의 고형 종양은 종양의 성장과 퇴화 등의 평가가 용이하기 때문에 바람직하다. 숙주 세포로서 바람직한 것은 B16F10 세포이다.
본 발명의 세포 수립에 사용되는 숙주 세포에 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 벡터는 숙주 안에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 도입하는 숙주의 종류, 설치 방법 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA 벡터와 바이러스 벡터를 들 수 있다. 플라스미드 DNA 벡터로는, 예를 들어 pCMV6(Origene), piggyBac Transposon Vector(System Biosciences), pCAG(후지필름화광순약), pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific)을 들 수 있다. 또한 바이러스 벡터로는, 예를 들어 pMX(Cell Biolabs), pLVSIN(다카라바이오), pAAV(다카라바이오), pAdenoX(Clontech Laboratories)을 들 수 있다.
해당 벡터를 이용하여 숙주를 형질 전환하려면 리포펙션법, 일렉트로포레이션법 등을 이용하여 할 수 있다. 얻어진 형질 전환체는 동화할 수 있는 탄소원, 질소원, 금속염, 비타민 등을 포함하는 배지를 이용하여 적당한 조건 하에서 배양하면 된다.
세포가 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포인지 확인하기 위해서는, 예를 들어, 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드와 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 발현 검출 방법을 이용하여 그 발현을 지표로 확인할 수 있다.
SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 검출 방법은 예를 들어, PEP5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열 번호 29 또는 서열 번호 33로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 29 또는 서열 번호 33로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 하이브리다이즈하는 폴리펩타이드를 프라이머로 하여 노던 블랏법, 서던 블랏법, RT-PCR법, real-time PCR법, 디지털 PCR법 , DNA 마이크로 어레이법, in situ 하이브리다이제이션법, 시퀀스 분석 방법 등 일반 관용의 검출 방법을 사용할 수 있다.
인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 검출 방법은 예를 들어, HLA-A24의 α1과 α2 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열 번호 31 또는 서열 번호 35로 표시하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 31 또는 서열 번호 35로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 상기 일반 관용의 검출법을 사용할 수 있다.
해당 프라이머는 서열 번호 29 또는 서열 번호 33로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 29 또는 서열 번호 33로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로 일반적으로 공지된 방법에 의해 제작된다. 또한 서열 번호 31 또는 서열 번호 35로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 31 또는 서열 번호 35로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서 일반적으로 공지 방법에 의해 제작된다. 해당 프라이머의 염기 수는 10 ~ 50 염기이며, 10 ~ 40 염기 수가 바람직하고, 10 ~ 30 염기 수가 가장 바람직하다.
또한 해당 프라이머는 서열 번호 29 또는 서열 번호 33로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 29 또는 서열 번호 33로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 31 또는 서열 번호 35로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 31 또는 서열 번호 35로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 하이브리다이즈하는 것이라면 완전히 상보적일 필요는 없다. 소요 프라이머는 해당 염기 서열과 비교하여 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상, 보다 바람직하게는 98 % 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드이며, 완벽하게 상보적인 폴리뉴클레오티드가 가장 바람직하다.
SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 발현의 검출 방법에 사용하는 프라이머는 바람직하게는 서열 번호 42 및 서열 번호 43로 표시되는 프라이머 세트이다.
SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리펩타이드의 발현 검출 방법은 예를 들어, 서열 번호 5로 표시되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 ELISA 법, 웨스턴 블랏법, 유동 세포 계측법 또는 면역 조직 화학 염색법 등 일반 관용의 검출 방법을 사용할 수 있다. 바람직한 것은 유동 세포 계측법이다. 서열 번호 5로 표시되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 시판품을 사용하는 것과 일반적으로 공지된 방법으로 제작하는 것이 가능하다.
인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코드하는 폴리펩타이드의 발현 검출 방법은 예를 들어, HLA-A24의 α1과 α2 영역을 포함한 서열 번호 30 또는 서열 번호 34로 표시되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 ELISA 법, 웨스턴 블랏법, 유동 세포 계측법 또는 면역 조직 화학 염색법 등 일반 관용의 검출 방법을 사용할 수 있다. 바람직한 것은 유동 세포 계측법이다. 서열 번호 30 또는 서열 번호 34로 표시되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 시판품을 사용하는 것과 일반적으로 공지된 방법으로 제작하는 것이 가능하다. 시판품 항체로는 예를 들어, anti-human HLA-A, B, C Antibody(Clone : W6 / 32 Biolegend), Anti-HLA-A24(Human) mAb(Clone : 22E1, MBL), Anti-HLA A 항체(Clone : EP1395Y, Abcam)을 들 수 있으며, 바람직한 것은 anti-human HLA-A, B, C Antibody(Clone : W6 / 32 Biolegend)이다. 또한, 이러한 항체는 예를 들어 anti-human HLA-A, B, C Antibody(Clone : W6 / 32 Biolegend)이면, PE로 라벨된 PE anti-human HLA-A, B, C Antibody(Clone : W6 / 32 Biolegend)과 FITC로 라벨된 FITC anti-human HLA-A, B, C Antibody(Clone : W6 / 32 Biolegend) 등의 라벨된 항체도 anti-human HLA-A, B, C Antibody(Clone : W6 / 32 Biolegend)에 포함된다.
본 발명의 세포가 in vivo에서의 평가를 가능하게 하기 위해서는, 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식했을 때, 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에서 종양을 형성하며 자연퇴축하지 않는 것이 바람직하다. 해당 세포가 자연퇴축하지 않는다는 것을 확인하기 위한 방법으로는 예를 들어, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스 (국제 공개 제 2015/056774 호)의 피하에 본 발명의 세포를 이식 후 종양 직경을 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 세포는 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식했을 때 적어도 이식 후 20 일 이상 종양 직경이 퇴축하지 않는 것(종양 직경이 증가하고 있음)이 바람직하다. 또한 in vivo 시험 기간 중에 약을 투여하지 않은 군(대조군)에서 이식한 세포가 퇴축하지 않은 것(종양 직경이 증가하고 있음)이 확인되면 자연퇴축하지 않는 기간이 20 일 미만이라도 본 발명의 세포에 포함된다.
본 발명에 있어서, 비면역결핍의 인간을 제외한 동물의 「비면역결핍」은 동물 본래의 면역능 또는 변경된 면역 능력을 갖는 것을 말하며, 따라서 누드 마우스 등의 면역 결핍 동물은 포함하지 않는다. 또한 「인간을 제외한 동물」은 β2 마이크로 글로불린 유전자 자리가 있고 외래 유전자를 도입 할 수 있는 동물이라면 특별히 한정된 것은 아니지만, 바람직한 것은 설치류이며, 보다 바람직한 것은 마우스 또는 렛드이고, 사육 및 조작상 특히 바람직한 것은 마우스이다.
본 발명은 또한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항종양 효과를 평가하기 위한 본 발명의 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과를 평가하기 위한 본 발명의 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 세포를 이용한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항종양 효과를 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 해당 방법은 본 발명의 세포를 이식한 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물을 이용하는 것이 바람직하다. 여기에서 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물은 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 갖는 비면역결핍의 인간을 제외한 동물이면 좋고, 국제 공개 제 2015/056774 호에 개시된 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스(B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스)이 바람직하다.
해당 방법에 있어서, 이식하는 본 발명의 세포 수는 적절히 선택할 수 있지만, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스(B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스)를 사용하는 경우, 1 × 105 ~ 1 × 107 세포 / body가 바람직하고, 1 × 105 ~ 5 × 105 세포 / body가 보다 바람직하며, 5 × 105 세포 / body가 보다 바람직하다. 또한, 당해 방법의 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 1 회 투여량은 적절히 선택할 수 있지만, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스(B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스 )를 사용하는 경우, 10 ~ 1000μg / body가 바람직하고, 100 ~ 1000μg / body가 보다 바람직하며, 300μg / body가 보다 바람직하다.
본 발명의 세포를 이용한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항종양 효과의 평가는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
즉, 해당 방법은
(I) SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 실시 할 수 있다.
바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 2 회 이상 투여하는 단계 및
(II) 상기 단계 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 3 회 이상 투여하는 단계 및
(II) 상기 단계 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
본 발명은 또한, 본 발명의 세포를 이용한 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과를 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 그 방법은 본 발명의 세포를 이식한 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물을 이용하는 것이 바람직하다. 여기에서 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물은 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 갖는 비면역결핍의 인간을 제외한 동물이면 좋고, 국제 공개 제 2015/056774 호에 개시된 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스(B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스)가 바람직하다.
해당 방법에 있어서, 이식하는 본 발명의 세포 수는 적절히 선택할 수 있지만, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스(B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스)를 사용하는 경우, 1 × 105 ~ 1 × 107 세포 / body가 바람직하고, 1 × 105 ~ 5 × 105 세포 / body가 보다 바람직하며, 5 × 105 세포 / body가 보다 바람직하다. 또한, 해당 방법의 에피토프4 연결펩타이드 1 종당 1 회 투여량은 적절히 선택할 수 있지만, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스(B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스)를 사용하는 경우, 10 ~ 1000μg / body가 바람직하고, 100 ~ 1000μg / body가 보다 바람직하며, 300μg / body가 보다 바람직하다. 또한, 해당 방법의 면역체크포인트분자 조절제의 1 회 투여량은 적절히 선택할 수 있지만, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스(B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스)를 사용하는 경우, 10 ~ 1000μg / body가 바람직하고, 30 ~ 500μg / body가 보다 바람직하며, 50 ~ 200μg / body가 보다 바람직하다.
본 발명의 세포를 이용한 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과를 평가하기 위한 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
즉, 해당 방법은
(I) 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 2 회 이상 투여하는 단계 및
(II) 상기 단계 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) ~ (III)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 3 회 이상 투여하는 단계;
(II) 상기 단계 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계 및
(III) 상기 단계 (I) 후 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 에피토프4 연결펩타이드의 항종양 효과의 평가는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
즉, 해당 방법은
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 2 회 이상 투여하는 단계 및
(II) 상기 단계 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 3 회 이상 투여하는 단계 및
(II) 상기 공정 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
본 발명에서 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과의 평가는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
즉, 해당 방법은
(I) 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계 및
(II) 상기 공정 (I)와 같은 날에, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
또한, 본 발명에서 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과의 평가는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
즉, 해당 방법은
(I) 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드 및 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계 및
(II) 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) 및 (II)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 2 회 이상 투여하는 단계 및
(II) 상기 공정 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계.
보다 바람직한 해당 방법은 다음 (I) ~ (III)의 단계를 포함하는 방법이다.
(I) 에피토프4 연결펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 3 회 이상 투여하는 단계;
(II) 상기 공정 (I) 후, 본 발명의 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 이식하는 단계 및
(III) 상기 공정 (I) 후 면여체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스에 투여하는 단계.
상기 본 발명의 방법은 상기의 공정 후, 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 항종양 효과는 예를 들어 이식한 세포에 의해 동물에서 증식하여 종양의 증식 억제, 종양의 퇴축과 소실, 생존율의 증가 등의 지표로 평가할 수 있다.
「SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항종양 효과」및 「에피토프4 연결펩타이드의 항종양 효과」의 평가는 예를 들어, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스를 이용하여 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드 또는 에피토프4 연결펩타이드를 마우스 피하에 3 회 투여 후 본 발명의 세포를 마우스 피하에 이식한 후 종양 직경을 측정함으로써 항암 효과를 나타내는 지 확인할 수 있다.
「면역체크포인트분자 조절제의 항종양 효과」의 평가는 예를 들어, 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ? 마우스를 이용하여 본 발명의 세포 이식과 같은 날에 면역체크포인트분자 조절제를 마우스 정맥 또는 복강 내 투여하여 종양 직경을 측정함으로써 항암 효과를 나타내는 지 확인할 수 있다.
<실시예>
다음 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정된 것이 아니며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자에 의해 많은 변형이 가능하다.
또한, 본 발명의 이해를 쉽게하기 위해, 본 명세서에서 언급하는 서열 번호 29 ~ 43에 대한 설명을 아래 표 3에 나타낸다.
| SART2-93의 염기서열 | 서열번호29 |
| HLA-A24 α1 및 α2 영역의 아미노산서열 | 서열번호30 |
| HLA-A24 α1 및 α2 영역의 염기서열 | 서열번호31 |
| 신호서열 + SART2-93의 아미노산 서열 | 서열번호32 |
| 신호서열 + SART2-93의 염기서열 | 서열번호33 |
| hβ2M-HLA-A24 α1 및 α2영역-mα3의 아미노산 서열 | 서열번호34 |
| hβ2M-HLA-A24 α1 및 α2영역-mα3의 염기서열 | 서열번호35 |
| 인간 β2 마이크로 글로불린(신호서열은 제외)의 아미노산 서열 | 서열번호36 |
| 마우스 MHC 클래스 I의 α3 영역의 아미노산 서열 | 서열번호37 |
| hβ2M-HLA-A24 α1 + α2-mα3 증폭용 센스 프라이머 | 서열번호38 |
| hβ2M-HLA-A24 α1 + α2-mα3 증폭용 안티센스 프라이머 | 서열번호39 |
| 신호서열 + SART2-93 도입용 안티센스프라이머 | 서열번호40 |
| 신호서열 + SART2-93 도입용 센스프라이머 | 서열번호41 |
| 신호서열 + SART2-93 검출용 센스프라이머 | 서열번호42 |
| 신호서열 + SART2-93 검출용 안티센스프라이머 | 서열번호43 |
[실시예 1 펩타이드의 합성·정제]에피토프4 연결펩타이드 TPV07 및 TPV08을 자동 펩타이드 합성기 Prelude (Protein Technologies, Inc.)를 이용하여 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)법에 의한 고체상 펩타이드 합성법으로 합성하였다. 즉, Wang-ChemMatrix 수지에 α-아미노기가 Fmoc기로, 측쇄 관능기가 일반적인 보호기로 보호된 아미노산을 1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1, 2, 4-트리아졸 / N-메틸이미다졸 / 디클로로메탄 조건에 따라 축합되어 수지의 C 말단 아미노산의 담지를 완료했다. 이에 디블로킹액 (20 % 피페리딘 / N, N-디메틸포름아미드(DMF))을 주입하여 Fmoc기를 제거한 후, α-아미노기가 Fmoc기로, 측쇄 관능기가 일반적인 보호기로 보호된 아미노산을 1-[비스(디메틸아미노) 메틸렌]-5-클로로-1H-벤조-트리아졸륨 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HCTU) / N- 메틸모르포린(NMM) / DMF 조건에 따라 축합하고, 디펩타이드를 합성하였다. 디블로킹액에 의한 Fmoc기의 탈보호와 HCTU / NMM / DMF 조건에 의한 아미노산의 축합 작업을 반복함으로써 목적하는 서열을 갖는 펩타이드를 합성하였다. 보호 펩타이드 수지의 합성 완료 후 탈보호 용액(2.5 % 트리이소프로필실란, 2.5 % 물, 2.5 % 1,2-에탄디티올, 92.5 % 트리플루오로아세트산)을 보호 펩타이드 수지에 가하여, 4시간 반응함으로써 펩타이드 측쇄 보호기의 제거와 함께 수지로 부터 유리 펩타이드를 분리하였다. 수지를 여과하고, 얻은 여과액을 차가운 에테르에 첨가하여 침전한 펩타이드를 회수하였다. 회수한 각종 합성 펩타이드는 Proteonavi 컬럼(SHISEIDO)에서 용매계에 0.1 % TFA 수용액과 아세토니트릴을 사용하여 정제하였다. 최종 정제 펩타이드는 CAPCELL PAK UG120 컬럼(SHISEIDO) 및 HPLC 시스템(HITACHI)에 의해 순도를 확인하였다. 또한 ESI-MS 시스템(Synapt HDMS, WATERS)에 의해 분자량을 확인하고 동결 건조 후 냉온 암소에서 보관 이후에 나타내는 실시예에 제공하였다.
TPV07 및 TPV08의 질량 스펙트럼 (MS) 분석에 의해 측정한 분자량을 표 4에 나타내었다. 또한 TPV07 및 TPV08의 HPLC 크로마토그램 및 MS를 도 1 ~ 도 4에 나타내었다.
| 펩타이드 | 분자량 (Calculated) |
분자량 (Deconvoluted) |
| TPV07 | 5396.03 | 5395.20 |
| TPV08 | 5682.41 | 5682.00 |
TPV01 ~ TPV06, TPV09 및 TPV10는 예를 들어, 국제 공개 제 2015/060235호 팜플렛에 기재된 방법에 준하여 합성할 수 있으며, 위에 나열된 TPV07 및 TPV08과 같은 방법에 준하여 합성할 수도 있다. 어느 펩타이드라도, 순도 90%이상의 것을 얻을 수 있었다.[실시예 2 B16F10.A24 / SART293-101 세포주 및 EL4.A24 / SART293-101 세포주의 수립]
국제 공개 제 2015/056774호 실시예 8에 기재된 방법으로 B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스를 제작하였다. 이 마우스는 인간 β2 마이크로 글로불린, HLA-A24의 α1과 α2 영역 및 마우스 MHC 클래스 I의 α3 영역을 연결하고 있는 인공 키메라 단백질을 발현할 수 있다.
얻은 마우스로부터 비장을 적출하여 슬라이드 글라스에 비장을 으깬 뒤, BD Pharm Lyse (BD Bioscience)를 이용하여 용혈을 수행함으로써 단세포 현탁액을 조제하였다. 얻어진 단세포 현탁액에서 RNAeasy kit(Qiagen)을 이용하여 RNA를 추출 하였다. 즉, 1 × 106 개의 세포에 대해 Buffer RLT을 350μL 가한 후 QIAshredder 스핀 컬럼(Qiagen)에 추가하여 원심 분리를 하고(15000rpm 2 분), 여과액을 회수했다. 회수한 RNA 용액에 70 % 에탄올 수용액 350μL를 첨가한 후 RNeasy Mini 컬럼에 첨가하고 원심 분리 하였다(10000rpm 15 초). 또한 컬럼을 Buffer RW1 350μL로 세척 후 RNase-Free DNase set(Qiagen)에서 DNase 처리를 실시했다. 컬럼을 Buffer RW1 350μL로 세척 후 RNeasy Mini Kit의 프로토콜에 따라 RNA의 정제를 실시했다. 정제 후 RNase Free H2O 30μL를 첨가하여 Total RNA를 회수하였다.
얻은 Total RNA에서 Supererscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Thermo Ficher Scientific)을 이용해 cDNA를 합성하였다. 즉, Total RNA 2μg을 8μL의 정제수에 현탁하고 올리고(dT)20을 1μL, 10mM dNTP를 1μL 더한 후 65℃에서 5분간 인큐베이팅하였다. 얼음 위에서 2분간 냉각시킨 뒤 10X RT buffer를 2μL, 25m MgCl2를 1μL, 0.1 MDTT를 2μL, RNaseOUT(40U/μL)를 1μL, Super Script IIIRT를 1μL 첨가해 혼합하였다. 50℃에서 50분간 인큐베이팅한 후 85℃에서 5분간 처리하고 반응을 정지하였다.
합성한 cDNA를 템플릿으로하여, 센스 프라이머로 Primer 1 (TCAAGCTTAACTAGCATGGCCGTCATGGC : 서열 번호 38), 안티센스 프라이머로 Primer 2 (TTAAACCTCGAGTGCTCACGCTTTACAATCTCGGAGAGA : 서열 번호 39)를 이용하여 KOD-Plus-ver. 2 (동양방)에 의해 PCR (94 ℃에서 2 분 → 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 68 ℃에서 2 분을 30 사이클 → 68 ℃에서 2 분 → 4 ℃)하고, 서열 번호 35로 표시되는 서열을 가지는 상기의 인공 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻었다. 증폭된 폴리뉴클레오티드를 InFusion HD Cloning Kit(Clontech Laboratories)를 이용하여 PiggyBac Transposon Vector(System Biosciences)에 삽입하면 서열 번호 35을 갖는 플라스미드 벡터 A를 얻는다.
이어 PEP5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해, 위에서 얻은 서열 번호 35을 갖는 플라스미드 벡터 A를 템플릿으로, 안티센스 프라이머로 Primer 3 (CTCAAATTTCATTCCAGCGGGCACTGTAGTCTGCCCAGGTCTGGGT : 서열 번호 40), 센스 프라이머로 Primer 4 ( GCAGACTACAGTGCCCGCTGGAATGAAATTTGAGCACTCGAGGTTTAA : 서열 번호 41)를 이용하여 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라)에 의해 PCR(98 ℃에서 10 초, 55 ℃에서 15 초, 68 ℃에서 6 분을 25 사이클 → 68 ℃에서 3 분 → 4 ℃ )를 실시했다. 그 결과 PiggyBac Transposon Vector 내에 신호 서열 및 PEP5을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 서열 번호 33로 표시되는 염기 서열을 갖는 플라스미드 벡터 B를 얻는다.
상기에서 제작한 플라스미드 벡터 A와 B를 Lipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 Super PiggyBac Transposase Expression Vector(System Biosciences)와 함께 마우스 흑색종 세포주인 B16F10(American Type Culture Collection, ATCC)에 유전자를 도입하였다. 유전자 도입 후 한계 희석법을 이용하여 단일 클론 세포를 취득하였다.
또한 마우스 림프종 세포주인 EL4(ATCC)에 Cell line Nucleofector Kit L(Lonza) 및 Nucleofector Device(Lonza)를 이용하여 상기에서 제작한 플라스미드 벡터 A, B 및 Super PiggyBac Transposase Expression Vector (System Biosciences)의 유전자를 도입하였다. 유전자 도입 후 한계 희석법을 이용하여 단일 클론 세포를 취득하였다.
취득한 단일 클론 세포를 회수하고 RNAeasy kit(Qiagen)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 즉, 5 × 105 개의 세포에 Buffer RLT을 350μL 가한 후 QIAshredder 스핀 컬럼(Qiagen)에 추가한 후 원심 분리를 하고(15000rpm 2 분), 여과액을 회수하였다. 회수한 RNA 용액에 70 % 에탄올 수용액 350μL를 첨가 한 후 RNeasy Mini 컬럼에 첨가하고 원심 분리 하였다(10000rpm 15 초). 또한 컬럼을 Buffer RW1 350μL로 세척한 후, RNase-Free DNase set(Qiagen)에서 DNase 처리를 실시하였다. 컬럼을 Buffer RW1 350μL로 세척한 후 RNeasy Mini Kit의 프로토콜에 따라 RNA의 정제를 실시하였다. 정제 후 RNase Free H2O 30μL를 첨가하여 Total RNA를 회수하였다.
얻은 RNA에서 SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Thermo Ficher Scientific)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 즉, Total RNA 2μg을 14μL의 DPEC-treated water에 현탁하고 5X VILO Reaction Mix를 4μL, 10 × SuperScript Enzyme Mix를 2μL 섞었다. 25 ℃에서 10 분간, 42 ℃에서 60 분 동안 인큐베이팅하고, 85 ℃에서 5 분간 처리하여 반응을 정지하였다.
취득한 단일 클론 세포의 PEP5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 확인하기 위해 합성한 cDNA를 템플릿으로, 센스 프라이머로 Primer 5(ATGGCCGTCATGGC : 서열 번호 42), 안티센스 프라이머로 Primer 6(TCAAATTTCATTCCAGCG : 서열 번호 43)를 이용하여 KOD-Plus-ver. 2(동양방)에 의해 PCR(94 ℃에서 2 분 → 98 ℃에서 10 초, 55 ℃에서 30 초, 68 ℃에서 30 초를 30 사이클 → 68 ℃에서 1 분 → 4 ℃)하고, 서열 번호 33로 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭을 Agarose gel 전기 영동으로 확인하였다. 유전자를 도입하지 않은 B16F10 및 EL4 세포는 서열 번호 33로 나타내는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 증폭이 확인되지 못하나, 획득 한 단일 클론에서는 서열 번호 33로 나타내는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 확인할 수 있으며, 따라서 플라스미드 벡터 B의 도입에 의한 PEP5 발현 세포의 취득이 확인되었다.
또한 취득한 단일 클론 세포의 HLA 분자의 발현을 분석하기 위해 세포를 PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody(Clone : W6 / 32 Biolegend)으로 염색하였다. 염색 후, BD FACSVerse (BD Biosciences)로 해석하였다. 그 결과 유전자 도입하지 않은 B16F10 및 EL4 세포는 항체 염색법에 의한 형광 강도의 상승이 확인되지 않은 반면, 획득한 단일 클론에서는 항체 염색에 의한 형광 강도의 상승을 확인할 수 있으며, 따라서 플라스미드 벡터 A의 도입에 의한 HLA-A24 발현 세포의 취득이 확인되었다.
즉, 취득된 세포는 HLA-A24을 발현하는 동시에, PEP5도 발현하는 세포 (B16F10.A24 / SART293-101 세포 및 EL4.A24 / SART293-101 세포)인 것이 확인되었다.
[실시예 3 B16F10.A24 / SART293-101 세포주 및 EL4.A24 / SART293-101 세포주의 생착 확인]
실시예 2에서 얻어진 B16F10.A24 / SART293-101 세포주 및 EL4.A24 / SART293-101 세포주를 10 % FBS를 포함한 Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (Sigma-Aldrich) 배지를 이용하여 배양하였다. 계대시에는 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 중에서, 주 2 회, 1 : 25 ~ 1 : 40 비율로 계대하였다.
9 ~ 11 주령의 B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스 오른쪽 복부의 피하에 B16F10.A24 / SART293-101 세포주 및 EL4.A24 / SART293-101 세포주를 1 × 105 세포 / 0.1mL 씩 이식했다.
이식 후 7 일차부터 디지매틱캘리퍼를 이용하여 종양의 장경과 단경을 측정하여 다음 식으로 종양 체적 (TV)을 산출하였다.
TV (mm3) = 장경 (mm) × 단경 (mm) × 단경 (mm) / 2
결과를 도 5에 나타냈다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, EL4.A24 / SART293-101 세포주를 이식한 경우 일단 생착 (증식)이 확인된 마우스도 있었지만, 13 일차까지 모든 마우스 (5 마리)에서 자연 퇴축된 것으로 확인되었다. 한편, 도 5b에 나타낸 바와 같이, B16F10.A24 / SART293-101 세포주를 이식한 경우 이식한 모든 마우스 (10 마리)에서 이식 후 20 일이 경과하여도 자연 퇴축되지 않고 종양으로 생착된 것이 확인되었다. 즉 B16F10.A24 / SART293-101 세포주만 in vivo 시험에 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4 B16F10.A24 / SART293-101 세포주 피하 이식 모델에서 TPV06와 항 마우스 PD-1 항체와의 병용 효과]
8 주령의 B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스를 무작위로 각 군에 15 마리씩 배정하였다. 군 분류를 실시한 날을 Day0로 하였다.
에피토프4 연결펩타이드 TPV06을 증류수 (대총제약공장)에 용해하여 6mg / mL의 펩타이드 용액을 조제하고, B Braun Injekt 주사기 (비·브라운 에이 스크랩)에 충전하였다. 다른 주사기에 동량의 Montanide ISA 51 VG (SEPPIC)를 충진한 후, 두 주사기를 커넥터로 연결하여 펩타이드 용액과 Montanide ISA 51 VG를 잘 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 또한 매체 대조군으로 증류수와 동량의 Montanide ISA 51 VG를 혼합한 에멀젼을 제조하였다. 이것을 B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스의 능선부 주변의 피하에 100μL 씩 주 1 회, 총 3 회 투여하였다 (Day0,7,14).
항 마우스 PD-1 항체 (anti-mPD-1 Ab)는 GoInVivo Purified anti-mouse CD279 (PD-1) (Clone : RMP-1-14, Biolegend)를 투여 직전에 1mg / mL가 되도록 D- PBS (후지필름화광순약)을 이용하여 제조하였다. 에멀젼의 최종 투여로부터 1 주일 후 (Day21)에 항 마우스 PD-1 항체를 100μg / body에서 복강 내 투여하였다.
B16F10.A24 / SART293-101 세포주는 10 % FBS를 포함한 Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (Sigma-Aldrich) 배지를 이용하여 배양하였다. B16F10.A24 / SART293-101는 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 내에서, 주 2 회, 1 : 25 ~ 1 : 40 비율로 계대하였다.
항 마우스 PD-1 항체의 투여 후 같은 날에 (Day21) D-PBS (후지필름화광순약)을 사용하여 조제한 세포 현탁액을 마우스 오른쪽 복부의 피하에 5 × 105 세포 / 0. 1mL 씩 이식하였다.
B16F10.A24 / SART293-101 세포주 이식 후 7 일차부터 디지매틱캘리퍼를 이용하여 종양의 장경과 단경을 측정하여 다음 식으로 종양 체적 (TV)을 산출하였다.
TV (mm3) = 장경 (mm) × 단경 (mm) × 단경 (mm) / 2
세포 이식 후 종양 체적 변화를 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하면 TPV06 및 항 마우스 PD-1 항체는 모두 단독으로 종양 증식 억제 효과를 가지고 있지만, 이들을 병용하면 종양 증식이 더 현저하게 억제되었다.
세포 이식 후 18 일차의 결과를 하기 표 5에 나타낸다. 표 안의 TV의 값은 각 군의 평균치를 나타낸다. 또한, 상대 종양 체적 변화율 (T / C)은 TV에서 다음의 식에 의해 산출하였다.
T / C (%) = (각 약제 투여군의 평균 TV) / (대조군의 평균 TV) × 100
또한 동물용 전자 저울을 사용하여 무게를 측정하고, 군 분류를 실시한 Day0에 측정한 체중 (BW0)과 세포 이식 후 18 일차의 체중 (BW)에서 체중 변화율 (BWC)을 다음 식으로 계산하였다.
체중 변화율 BWC (%) = (BW-BW0) / BW0 × 100
또한 세포 이식 후 57 일차에 종양이 없는 (Tumor Free의) 마우스의 비율을 다음의 식에 의해 산출하였다.
Tumor Free (%) = (각 군의 Tumor Free 마우스의 수) / (각 군의 시험에 사용된 마우스의 수) × 100
| 이식후 18일차 | 이식후 57일차 | |||
| TV(mean±SE) | T/C | BWC(%) | Tumor Free(%) | |
| 대조군 | 1183.14±205.04 | - | 28.3 | 0.0 |
| TPV06 | 247.45±89.16 | 20.9 | 27.0 | 13.3 |
| 항 마우스 PD-1 항체 | 703.36±141.55 | 59.5 | 26.9 | 0.0 |
| TPV06 + 항 마우스PD-1 항체 | 71.45±46.72 | 6.0 | 23.8 | 53.3 |
세포 이식 후 18 일차에서 TPV06 군 또는 항 마우스 PD-1 항체 단독 투여군과 TPV06 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 투여군은 대조군에 비해 낮은 TV값을 가지며, 항종양 효과를 나타낸다. 또한 TPV06 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 투여군은 TPV06 군 또는 항 마우스 PD-1 항체 군의 단독 약제 군에 비해, 낮은 TV 값을 가지며, 더 강한 항종양 효과를 나타낸다. 또한 세포 이식 후 57 일차에서 TPV06 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 투여군은 53.3 %의 마우스가 Tumor Free였다. 또한 TPV06 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 투여군은 단독 약제 투여군에 비해 세포 이식 후 57 일차에서 생존율이 향상되고 있음을 확인할 수 있었다.또한 병용 투여군의 평균 체중 변화율은 TPV06 또는 항 마우스 PD-1 항체 단독 약제군과 비교하여 독성 증강을 수반하지 않는 것으로 나타난다.
[실시예 5 B16F10.A24 / SART293-101 세포주 피하 이식 모델에서 TPV06와 항 마우스 PD-L1 항체와의 병용 효과]
9 주령의 B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스를 무작위로 각 군에 15 마리씩 배정하였다. 군 분류를 실시한 날을 Day0로 하였다.
항 마우스 PD-1 항체 대신에 항 마우스 PD-L1 항체를 이용한 것 이외에는 실시예 4와 동일하게 실시하였다. 항 마우스 PD-L1 항체 (anti-mPD-L1 Ab)는 GoInVivo Purified anti-mouse CD274 (B7-H1, PD-L1) (Clone : 10F.9G2, Biolegend)를 투여 직전에 1mg / mL가 되도록 D-PBS (후지필름화광순약)을 이용하여 제조하였다. 에멀젼의 최종 투여로 부터 1 주일 후 (Day21)에 항 마우스 PD-L1 항체 200μg / body를 복강 내 투여하였다.
세포 이식 후 종양 체적 변화를 도 7에 나타낸 바와 같으며, 대조군과 비교하면 TPV06는 단독으로 종양 증식 억제 효과를 보였지만, 항 마우스 PD-L1 항체는 효과가 없었다. 그러나 TPV06와 항 마우스 PD-L1 항체를 병용하면 종양 증식이 보다 현저하게 억제되었다.
세포 이식 후 18 일차의 종양 체적, 상대 종양 부피 변화율 및 체중 변화율(BWC), 세포 이식 후 57 일차의 Tumor Free 마우스의 비율은 하기 표 6에 나타낸다.
| 이식후 18일차 | 이식후 57일차 | |||
| TV(mean±SE) | T/C | BWC(%) | Tumor Free(%) | |
| 대조군 | 627.2±82.7 | - | 19 | 0.0 |
| TPV06 | 205.8±73.9 | 32.8 | 21.9 | 0.0 |
| 항 마우스 PD-L1 항체 | 987.4±168.9 | 157.4 | 21.2 | 0.0 |
| TPV06 + 항 마우스 PD-L1 항체 | 17.7±14.9 | 2.8 | 20.4 | 66.7 |
세포 이식 후 18 일차에서 TPV06군의 단독 투여군과 TPV06 + 항 마우스 PD-L1 항체의 병용 투여군은 대조군에 비해 TV값이 낮으며, 항종양 효과를 나타냈다. 또한 TPV06 + 항 마우스 PD-L1 항체의 병용 투여군은 TPV06군 및 항 마우스 PD-L1 항체군의 단독 약제 투여군에 비해 TV 값이 낮으며, 더 강한 항종양 효과를 나타냈다. 또한 세포 이식 후 57일차에서 TPV06 + 항 마우스 PD-L1 항체의 병용 투여군은 66.7 %의 마우스가 Tumor Free였다. 또한 TPV06 + 항 마우스 PD-L1 항체의 병용 투여군은 단독 약제 투여군에 비해 세포 이식 후 57일차에서 생존율이 향상되고 있음을 확인할 수 있었다.또한 병용 투여군의 평균 체중 변화율은 TPV06 또는 항 마우스 PD-L1 항체 단독 약제군과 비교하여 독성 증강을 수반하지 않는 것으로 나타났다.
[실시예 6 B16F10.A24 / SART293-101 세포주 피하 이식 모델에서 TPV07 또는 TPV08와 항 마우스 PD-1 항체와의 병용 효과]
9 주령의 B2mtm2 (HLA-A24 / H-2Db / B2M) Tai 마우스를 무작위로 각 군에 15 마리씩 배정하였다. 군 분류를 실시한 날을 Day0로 하였다.
에피토프4 연결펩타이드로 TPV06 대신 TPV07 또는 TPV08을 이용한 것 이외에는 실시예 4와 동일하게 하였다. 또한 TPV07 및 TPV08는 TPV06와 마찬가지로 아니 증류수(대총제약공장)을 이용하여 6mg / mL로 조제 후 동량의 Montanide ISA 51 VG (SEPPIC)와 혼합하여 제조한 에멀젼을 투여하였으며, 본 실시예에서는 항 마우스 PD-1 항체 단독 투여군은 포함하지 않았다.
세포 이식 후 종양 부피 변화를 그림 8, 그림 9에, 세포 이식 후 18일차의 종양 체적, 상대 종양 체적 변화율 및 체중 변화율(BWC), 세포 이식 후 56일차의 Tumor Free 마우스 비율을 표 7에 나타내었다.
| 이식후 18일차 | 이식후 56일차 | |||
| TV(meam±SE) | T/C | BWC(%) | Tumor Free(%) | |
| 대조군 | 850.8±176.6 | - | 23.1 | 0.0 |
| TPV07 | 58.2±24.4 | 6.8 | 18.9 | 13.3 |
| TPV07 + 항 마우스 PD-1 항체 | 8.6±6.8 | 1.0 | 18.6 | 80.0 |
| TPV08 | 129.7±67.0 | 15.2 | 21.7 | 6.7 |
| TPV08 + 항 마우스 PD-1 항체 | 21.6±12.7 | 2.5 | 16.1 | 40.0 |
도 8 및 도 9와 같이, 대조군과 비교하면 TPV 07 및 TPV 08은 모두 단독으로 높은 종양 증식 억제 효과를 가졌으나 이들을 항마우스 PD-1 항체와 병용하자 종양 증식이 보다 현저하게 억제되었다.또한 표 7과 같이 세포이식 후 18일차에 TPV 07 투여군 또는 TPV 08 투여군의 단독 투여 및 TPV 07 + 항 마우스 PD-1 항체 또는 TPV 08 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용투여군은 대조군에 비해 TV값이 낮으며 항종양 효과를 나타냈다. 나아가 TPV07 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용투여군은 TPV07의 단독 약제 투여군에 비해 TV 값이 낮았으며 보다 강한 항종양 효과를 나타냈다. 마찬가지로 TPV08 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용투여군은 TPV08의 단독약제군에 비해 TV 값이 낮았으며 보다 강한 항종양 효과를 나타냈다.나아가 세포이식 후 56일차 TPV07 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용투여군은 80.0%의 마우스가 Tumor Free였고, TPV08 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용투여군은 40.0%의 마우스가 Tumor Free였다.나아가 TPV07 + 항 마우스 PD-1 항체 및 TPV08 + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 투여군은 단독 약제 투여군에 비해 세포 이식 후 56일차에서 생존율이 향상되었음을 확인할 수 있었다.
또 병용투여군의 평균 체중 변화율은 TPV07 및 TPV08의 단독 약제 투여군과 비교하여 독성의 증강이 수반되지 않음을 나타낸다.
[실시예 7 B16 F10.A24/SART293-101 세포주 피하 이식 모델에서의 3종 혼합 에피토프4 연결펩타이드(TPV06, TPV011 및 TPV012)와 항 마우스 PD-1 항체와의 병용효과]
9주령인 B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M) Tai 마우스를 랜덤하게 각 군에 15마리씩 할당했다. 군 분류를 실시한 날을 Day0로 하였다.
*TPV06 대신 TPV06과 다른 2종의 에피토프4 연결펩타이드(TPV011 및 TPV012) 등 총 3종을 혼합한 에피토프4 연결펩타이드만 사용한 것 외에는 실시예4와 동일한 시험을 실시하였다.
즉 대조군, 3종 혼합 에피토프4 연결펩타이드(TPV06, TPV011 및 TPV012) 군, 항 마우스 PD-1 항체군 및 3종 혼합 에피토프4 연결펩타이드(TPV06, TPV011 및 TPV012) + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 투여군을 시험하였다.
3종 혼합 에피토프4 연결펩타이드(TPV06, TPV011 및 TPV012)는 TPV06, TPV011 및 TPV012가 각각 6mg/mL(즉 펩타이드 총량으로서 18mg/mL)가 되도록 증류수(대총제약공장)를 이용하여 조제하고 동량의 Montanide ISA 51VG(SEPIC)와 혼합하여 조제한 에멀젼을 투여하였다.
그 결과, 3종 혼합 에피토프4 연결펩타이드(TPV06, TPV011 및 TPV012) + 항 마우스 PD-1 항체의 병용 투여군은 3종 혼합 에피토프4 연결펩타이드(TPV06, TPV011 및 TPV012)군 또는 항 마우스 PD-1 항체의 단독 투여군에 비해 세포 이식 후 56일차 생존율이 향상되었음을 확인할 수 있었다.
또 병용투여군의 평균 체중 변화율은 단독 약제 투약군과 비교하여 독성의 증강이 수반되지 않음을 나타내었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용을 통하여 본 명세서에 편입되었다.
Claims (28)
- 링커를 통해 연결된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함하는 에피토프4 연결펩타이드를 유효 성분으로 함유하고, 면역체크포인트분자 조절제와 병용하기 위한 것을 특징으로 하는 항종양제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
- 제1항에 있어서, 상기 에피토프4 연결펩타이드에 포함되는 에피토프 펩타이드가 PEP5, PEP6,
PEP9 및 PEP2, PEP4 및 PEP10로 이루어진 군에서 선택되는 1 개의 에피토프 펩타이드로 구성되고, 상기 에피토프4 연결펩타이드의 C 말단이 PEP2, PEP4 또는 PEP10인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 에피토프4 연결펩타이드가 다음에서 선택되는 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항종양제.
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP4;
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP2; 또는,
· PEP5- (L) -PEP9- (L) -PEP6- (L) -PEP10;
상기 식에서 "(L)"는 링커를 나타낸다.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 아미노산 링커인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제4항에 있어서,
아미노산 링커가 아르기닌을 2 개 연결한 아르기닌 다이머 또는 아르기닌을 3 개 연결한 아르기닌 트리머인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 서열은 N 말단에 연결되고, 또한 아르기닌을 3개 연결한 아르기닌 트리머 또는 아르기닌를 4개 연결한 아르기닌 테트라머로 된 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프4 연결펩타이드가 서열번호 24, 서열번호 25 또는 서열번호 26인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역체크포인트 분자 조절제는 PD-1 경로 길항제, ICOS 경로 작용제, CTLA-4 경로 길항제 및 CD28 경로 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역체크포인트분자 조절제는 PD-1 경로 길항제 및 CTLA-4 경로 길항제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역체크포인트분자 조절제가 PD-1 경로 길항제인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
PD-1 경로 길항제가 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 및 항 PD-L2 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 경로 길항제가 항 PD-1 항체 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 항 PD-1 항체가 니볼루맙(Nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)이며, 항 PD-L1 항체가 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, CTLA-4 경로 길항제가 항 CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 제14항에 있어서, 항 CTLA-4 항체가 이필리무맙（Ipilimumab） 또는 트레멜리무맙(Tremelimumab)인 것을 특징으로 하는 항종양제.
- 면역체크포인트분자 조절제가 투여된 암 환자를 치료하기 위한 에피토프4 연결펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항종양제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
- 에피토프4 연결펩타이드가 투여된 암 환자를 치료하기 위한 면역체크포인트분자 조절제로 이루어진 항종양제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이며;
상기 면역체크포인트분자 조절제는 PD-1 경로 길항제, ICOS 경로 작용제, CTLA-4 경로 길항제 및 CD28 경로 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종이다.
- 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 결합되는 혼합 제제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 혼합제제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
- 에피토프4 연결펩타이드를 유효 성분으로하는 면역체크포인트분자 조절제의 항 종양 효과를 강화하는 항종양 효과 증강제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양 효과 증강제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
- 링커를 통해 연결 된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드를 포함하는 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항종양제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 항종양제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
- 에피토프4 연결펩타이드와 사용 설명서를 포함한 키트 제제로서 당해 사용 설명서에는 암 환자에게 에피토프4 연결펩타이드와 면역체크포인트분자 조절제를 병용 투여하는 것이 기재되어 있는 것을 특징으로하는 키트 제제이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 키트 제제:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
- SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 HLA-A24의 α1과 α2 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포.
- 다음 (a) ~ (e)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(a) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열번호 29로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(e) 서열번호 29로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
및 다음 (f) ~ (j)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(f) 서열번호 30로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(g) 서열번호 30로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(h) 서열번호 30로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(i) 서열번호 31로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(j) 서열번호 31로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
를 도입한 세포.
- 다음 (k) ~ (o)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(k) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(l) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(m) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(n) 서열번호 33로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(o) 서열번호 33로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
및 다음 (p) ~ (t)에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
(p) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(q) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(r) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(s) 서열번호 35로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
(t) 서열번호 35로 표시되는 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
를 도입한 세포.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항 종양 효과를 평가하기 위한 것을 특징으로 하는 세포.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항 종양 효과를 평가하기 위한 것을 특징을 하는 세포이며,
상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 세포:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
- 청구항 22 내지 24 중 어느 한 항에 기재된 세포를 이용한 SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드의 항 종양 효과를 평가하기 위한 방법이며,
다음의 (I) 및 (II)의 단계 :
(I) SART2 유래의 인간 종양 항원 에피토프 펩타이드를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계, 및
(II) 청구항 22 ~ 24 중 어느 한 항에 기재된 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 24 중 어느 한 항에 기재된 세포를 이용한 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제의 항 종양 효과를 평가하기 위한 방법이며,
다음의 (I) 및 (II) 단계 :
(I) 에피토프4 연결펩타이드 및 / 또는 면역체크포인트분자 조절제를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계 및
(II) 청구항 22 ~ 24 중 어느 한 항에 기재된 세포를 인간 HLA-A24 유전자 ?ㅐ括? 비면역결핍의 인간을 제외한 동물에 이식하는 단계;
를 포함하고, 상기 에피토프4 연결펩타이드가,
서열번호 5로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP5)와, 서열번호 1로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP1), 서열번호 2로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP2), 서열번호 4로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP4), 서열번호 6으로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP6), 서열번호 7로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP7), 서열번호 8로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP8), 서열번호 9로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP9), 서열번호 10로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP10), 서열번호 13로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP13), 서열번호 15로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP15), 서열번호 17로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP17) 및 서열번호 18로 표시되는 에피토프 펩타이드 (PEP18)로 이루어진 군에서 선택되는 3 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지고, 친수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드 서열을 더 포함 할 수 있는 에피토프4 연결펩타이드이고, 다음의 (1) ~ (3)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 방법:
(1) C 말단이 PEP2이고(단, N 말단에 PEP7 및 PEP8을 N 말단에서 링커를 통해 인접한 순서로 포함되는 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이고;
(3) C 말단이 PEP10이다.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JPJP-P-2018-124894 | 2018-06-29 |
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| KR1020217002430A Division KR20210024601A (ko) | 2018-06-29 | 2019-06-28 | 항종양제 및 그 평가방법 |
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