CN115942954A - 抗-CD79b抗体和嵌合抗原受体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了CD79b抗体和CD79b‑特异性嵌合抗原受体(CAR)。本文中进一步提供了表达所述CD79b‑特异性CAR的免疫细胞和通过施用所述CD79b‑特异性CAR免疫细胞来治疗癌症的方法。

Description

抗-CD79b抗体和嵌合抗原受体及其使用方法
本申请要求2020年4月30日提交的美国临时申请号63/018,266(其整体通过提及而合并入本文)的权益。
发明背景
1.发明领域
总体而言，本公开内容涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。更特别地，它涉及CD79b抗体和相关的组合物(至少包括嵌合抗原受体)及其使用方法。
2.相关技术的描述
靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)T细胞在B细胞恶性肿瘤中是高度有效的。最近，两种抗-CD19 CAR T-细胞疗法产品被US FDA批准用于复发性或顽固性B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)和/或大B细胞淋巴瘤。在关键的试验中，在～40-50％的这些患者中已观察到持续超过1年的持久缓和。然而，在～50-60％中出现复发或进展，并且抵抗性的一个主要原因看起来是由于CD19抗原丢失。因此，急需开发针对新靶标的CAR T细胞疗法以进一步改善在这些患者中的结果。
发明概述
本公开内容涉及与特定的抗体相关的方法和组合物。所述抗体可以用在任何类型的免疫疗法中和用于其中CD79b的靶向是治疗性的任何医学应用。在一些实施方案中，本公开内容提供了分离的单克隆抗体，其中所述抗体与CD79b特异性地结合并且包含：
(I)：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR；
(II)：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR；或者
(III)：
(a)包含SEQ ID NO:21的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
在一些方面，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR。
在进一步的方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:7的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。在另一些方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:7的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域相同的VL结构域。
在一些方面，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR。
在进一步的方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:17的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:19的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。在另一些方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:17的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:19的VL结构域相同的VL结构域。
在一些方面，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:21的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
在进一步的方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:27的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:29的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。在另一些方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:27的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:29的VL结构域相同的VL结构域。
在一些方面，所述抗体是重组的。在一些方面，所述抗体为IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在一些方面，所述抗体为Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。在一些方面，所述抗体为人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体(de-immunizedantibody)。在一些方面，所述抗体与显像剂、化学治疗试剂、毒素或放射性核素相缀合。
在另一些实施方案中，本公开内容提供了组合物，其在药学上可接受的承载体中包含本公开内容的抗体。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码本公开内容的抗体的核酸序列。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含克隆T26的VH结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:1、2和3)；和克隆T26的VL结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:4、5和6)。
在另一些实施方案中，本公开内容提供了重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含克隆5B的VH结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:11、12和13)；和克隆5B的VL结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:14、15和16)。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含克隆28B的VH结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:21、22和23)；和克隆28B的VL结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:24、25和26)。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码本公开内容的多肽的核酸序列。
在另一些实施方案中，本公开内容提供了宿主细胞，其包含一种或多种编码本公开内容的抗体或本公开内容的重组多肽的多核苷酸分子。在一些方面，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗具有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本公开内容的抗体。在一些方面，所述癌症为B细胞恶性肿瘤。在一些方面，所述抗体处于在药学上可接受的组合物中。在一些方面，所述抗体全身地进行施用。在一些方面，所述抗体以静脉内方式、以真皮内方式、以肿瘤内方式、以肌内方式、以腹膜内方式、以皮下方式或局部地进行施用。在一些方面，所述方法进一步包括向所述受试者施用至少第二种抗癌疗法。在进一步的方面，所述第二种抗癌疗法为外科手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在一些方面，所述第二种抗癌疗法包括过继T-细胞疗法。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了经改造的CD79b CAR或TCR，其具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(I)：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR；
(II)：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR；或者
(III)：
(a)包含SEQ ID NO:21的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
在一些方面，所述抗原结合结构域包含：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR。
在进一步的方面，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:7的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。在一些方面，所述抗原结合结构域与SEQ ID NO:7的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域相同的VL结构域。
在一些方面，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR。
在进一步的方面，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:17的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:19的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。在一些方面，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:17的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ IDNO:19的VL结构域相同的VL结构域。
在一些方面，所述抗原结合结构域包含：
(a)包含SEQ ID NO:21的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
在进一步的方面，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:27的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:29的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。在一些方面，所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:27的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ IDNO:29的VL结构域相同的VL结构域。在一些方面，所述CAR包含一个或多个信号传导结构域CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137及其组合。在一些方面，所述CAR包含CD3ζ和CD28信号传导结构域。在一些方面，所述CAR包含CD3ζ和4-1BB信号传导结构域。在一些方面，所述CAR包含CD3ζ和OX-40信号传导结构域。在一些方面，所述CAR或TCR由病毒载体编码。在进一步的方面，所述病毒载体为慢病毒载体。
在一些方面，所述抗原结合结构域包含通过连接体与VL结构域相连接的VH结构域。在进一步的方面，所述连接体为连接体1(SEQ ID NO:44或45)、连接体2(SEQ ID NO:46或47)、连接体3(SEQ ID NO:48或49)或者连接体4(SEQ ID NO:50或51)。在一些方面，所述CAR包含VL-连接体1-VH、VL-连接体2-VH、VL-连接体3-VH、VL-连接体4-VH、VH-连接体1-VL、VH-连接体2-VL、VH-连接体3-VL或VH-连接体4-VL。在一些方面，所述CAR或TCR包含铰链。在进一步的方面，所述铰链为CD8铰链1(SEQ ID NO:52或53)、CD8铰链2(SEQ ID NO:54或55)、CD8铰链3(SEQ ID NO:56或57)、CD28铰链(SEQ ID NO:58或59)、IgG4铰链(SEQ ID NO:60或61)、IgG4CH2(SEQ ID NO:62或63)、IgG4 CH2CH3(SEQ ID NO:64或65)或者IgG4 CH1CH2CH3(SEQ IDNO:66或67)。在一些方面，所述CAR包含跨膜结构域。在进一步的方面，所述跨膜结构域为CD8 TM1(SEQ ID NO:68或69)、CD8 TM2(SEQ ID NO:70或71)或者CD28 TM(SEQ ID NO:72或73)。
在一些方面，所述方法进一步包括转导标记和/或安全开关。在进一步的方面，所述转导标记为增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。在更加进一步的方面，所述eGFP具有SEQ IDNO:83的氨基酸序列。在一些方面，所述转导标记和/或安全开关为截短的表皮生长因子(EGFR)。在进一步的方面，所述EGFR具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些方面，所述转导标记和/或安全开关通过切割肽与所述CAR相连接。在进一步的方面，所述切割肽为2A肽。在更加进一步的方面，所述2A肽为T2A肽。在更为进一步的方面，所述T2A肽具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一些方面，所述CAR进一步包含第二抗原结合结构域。在进一步的方面，所述第二抗原结合结构域为CD19、CD20或CD22抗原结合结构域。
在另一些实施方案中，本公开内容提供了表达载体，其编码本公开内容的CAR或TCR。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了经改造以表达CD79b CAR或CD79b TCR的宿主细胞。在一些方面，所述细胞经改造以表达本公开内容的CAR。在一些方面，所述宿主细胞为免疫细胞。在进一步的方面，所述免疫细胞为T细胞。在更加进一步的方面，所述T细胞为原代人T细胞或TIL。在另一些方面，所述T细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些方面，所述原代人T细胞是从健康供者获得的。在一些方面，所述T细胞是自体的。在一些方面，所述T细胞是同种异体的。在一些方面，所述细胞通过使用CRISPR或转座酶系统来进行改造。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了包含CD79b靶向型T细胞和药学承载体的药学组合物，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达本公开内容的CAR或TCR。
在另一些实施方案中，本公开内容提供了用于在受试者中治疗癌症的包含有效量的CD79b靶向型T细胞的组合物，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达本公开内容的CAR或TCR。
在另外一些实施方案中，本公开内容提供了包含有效量的CD79b靶向型T细胞的组合物用于在受试者中治疗癌症的用途，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达本公开内容的CAR或TCR。
在另一些实施方案中，本公开内容提供了用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的CD79b靶向型T细胞，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达本公开内容的CAR或TCR。在进一步的方面，所述癌症为B细胞恶性肿瘤。在更加进一步的方面，所述B细胞恶性肿瘤为B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。在一些方面，所述受试者事先已经被施用了CD19 CAR疗法。在一些方面，所述受试者是对CD19 CAR疗法有抵抗性的。在进一步的方面，所述受试者具有CD19抗原丢失。在更加进一步的方面，所述受试者复发有CD19-阴性肿瘤。在一些方面，所述CD79b靶向型T细胞以静脉内方式、以真皮内方式、以肿瘤内方式、以肌内方式、以腹膜内方式、以皮下方式或局部地进行施用。在一些方面，所述CD79b靶向型T细胞以静脉内方式进行施用。在一些方面，所述方法进一步包括向所述受试者施用至少第二种抗癌疗法。在进一步的方面，所述第二种抗癌疗法为外科手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在一些方面，所述癌症为表达CD79b的癌症。
在某些方面，所述CAR进一步包含第二抗原结合结构域。在一些方面，所述第二抗原结合结构域为CD19、CD20或CD22抗原结合结构域。
在另一个实施方案中，提供了表达载体，其编码本发明实施方案的CD79b CAR。
在本文中进一步提供了经改造以表达CD79b CAR(例如本发明实施方案的CD79b)的宿主细胞。在一些方面，所述宿主细胞为免疫细胞，例如T细胞。在一些方面，所述T细胞为原代人T细胞。在某些方面，所述T细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些方面，所述原代人T细胞是从健康供者获得的。所述T细胞可以是自体的或同种异体的。
在本文中还提供了包含CD79b CAR T细胞(例如本发明实施方案的CAR T细胞)和药学承载体的药学组合物。在本文中进一步提供了用于在受试者中治疗癌症的包含有效量的CD79b CAR T细胞(例如本发明实施方案的CAR T细胞)的组合物。在另一些实施方案中，提供了包含有效量的CD79b CAR T细胞(例如本发明实施方案的CAR T细胞)的组合物用于在受试者中治疗癌症的用途。
在一个进一步的实施方案中，提供了用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的CD79b CAR T细胞，例如本发明实施方案的CAR T细胞。在一些方面，所述癌症为B细胞恶性肿瘤，例如B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。在某些方面，所述癌症为表达CD79b的癌症。
在一些方面，所述受试者事先已经被施用了CD19 CAR疗法。在某些方面，所述受试者是对CD19 CAR疗法有抵抗性的，例如由于CD19抗原丢失。在某些方面，所述受试者复发有CD19-阴性肿瘤。
在某些方面，所述CD79b CAR T细胞以静脉内方式、以真皮内方式、以肿瘤内方式、以肌内方式、以腹膜内方式、以皮下方式或局部地进行施用。在另外的方面，所述方法进一步包括向所述受试者施用至少第二种抗癌疗法。在一些方面，所述第二种抗癌疗法为外科手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
本发明的其他目标、特征和优点将会从下面的详细描述中变得明显。然而，应当理解的是，虽然指明了本发明的优选实施方案，但是所述详细描述和特定实施例是仅通过举例说明而给出的，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改将会从该详细描述中对于本领域技术人员变得明显。
附图简述
下面的附图构成了本说明书的一部分并且被包括以进一步示范本发明的某些方面。通过与在本文中所呈现的特定实施方案的详细描述相组合地参考这些附图中的一幅或多幅，将会更好地理解本发明。
图1A-1D:(图1A)在细胞系中的CD79b表达。(图1B)在人组织中的CD79b表达。(图1C)在白血病中的CD79b表达。(图1D)在淋巴瘤中的CD79b表达。
图2A-2D:(图2A)用CD79b转导的细胞的流式细胞术分析。(图2B)CD79b单克隆抗体的结合亲和力。(图2C)CD79b单克隆抗体的表征。(图2D)淋巴瘤细胞系的克隆14染色。
图3A-3D:(图3A)关于CD79b CAR的示意性描绘的构建体。(图3B)CD79b CAR和CD19CAR的流式细胞术分析。(图3C)CD79b CAR和CD19 CAR的细胞毒性百分比，以未转导的T细胞作为对照。(图3D)CD79b CAR和CD19 CAR的流式细胞术，以未转导的T细胞作为对照。
图4A-4D:(图4A)与CD79b CAR和CD19外显子2Δ剪接变体一起共培养的T细胞。(图4B)以5:1的效应子:靶标比率温育4天的CAR的功效的流式细胞术分析。(图4C)用CD79b CAR的Daudi细胞的绝对细胞计数。(图4D)用CD79b CAR的CD19敲低细胞的绝对细胞计数。
图5A-5C:(图5A)临床前研究的示意图。(图5B)在研究期间小鼠的生物发光图像。(图5C)在研究期间小鼠的存活百分比。
图6A-6E:(图6A)某些实施方案的CD79b CAR构建体。(图6B-6C)线图和频率分布图显示，抗-CD79b CAR T细胞展现出针对Daudi淋巴瘤细胞的体外细胞毒性。(图6D-6E)线图和成像显示，抗-CD79b CAR T细胞展现出针对Daudi淋巴瘤异种移植物的体内功效。
图7：抗-CD79b抗体(克隆5B和28B)与人CD79b的结合。
图8A-8B:(图8A)在本文中的实施方案中所使用的抗-CD79b CAR的结构域图谱。(图8B)在包含EF1α启动子的慢病毒载体(pLVEG)中的CAR构建体的图谱。
图9A-9D:(图9A)CAR转导入NFAT受体细胞中。(图9B)在与抗体或Dadui伯基特细胞一起共培养的经转导的NFAT报道细胞中的萤光素酶活性。(图9C-9D)在与SUDHL6一起共培养的经转导的NFAT报道细胞中的萤光素酶活性。
图10A-10B:(图10A)在T细胞中CAR的代表性转导效率。(图10B)在表达或不表达CAR的T细胞中CD3ζ和ERK1/2的磷酸化。
图11A-11B:(图11A-11B)表达或不表达CAR的T细胞的增殖。
图12：表达或不表达CAR的T细胞的细胞因子表达。
图13A-13B:(图13A-13B)响应于淋巴瘤细胞，表达或不表达CAR的T细胞的脱粒。
图14A-14B:(图14A)表达或不表达CAR的T细胞对于淋巴瘤细胞的细胞毒性活性。(图14B)通过CAR T细胞的SUDHL6细胞的裂解。
图15A-15B:(图15A)在用表达或不表达CAR的T细胞进行治疗的小鼠中肿瘤负荷的生物发光成像。(图15B)在用表达或不表达CAR的细胞进行治疗的小鼠癌症模型中的存活概率。
举例说明性实施方案的描述
CD79b是一种泛B细胞谱系标志物和B细胞受体复合物的重要组分。CD79b在正常B细胞和B细胞恶性肿瘤中广泛表达，并且其表达在CD19-特异性CAR T细胞疗法后复发的CD19阴性肿瘤中通常得到保持。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了CD79b单克隆抗体和CD79b-特异性CAR，例如对于CD79b-CAR T细胞。
本研究在体外和体内模型中证明了本发明的CD79b-特异性CAR T细胞产品的功效。通过杂交瘤技术针对人CD79b开发出了三种鼠类单克隆抗体，并且证明它们与重组人CD79b特异性地结合，具有高的亲和力(1.44-17.8nM的Kd范围)，并且对多种淋巴瘤细胞系进行染色。接着，克隆了所述CD79b抗体的重链和轻链的可变区，并且对于具有CD3ζ和CD28/4-1BB共刺激结构域的抗-CD79b CAR开发了慢病毒构建体。证明可以通过使用慢病毒来将所述抗-CD79b CAR构建体转导入来自健康供者的原代CD4+和CD8+T细胞中，达到超过70％的转导效率。
观察到抗-CD79b CAR T细胞(而不是未转导的T细胞)显现出与对照抗-CD19 CART细胞相当的针对Daudi伯基特淋巴瘤和Mino套细胞淋巴瘤细胞系的显著的细胞毒性活性。更重要的是，抗-CD79b而不是抗-CD19 CAR T细胞裂解CD19-CD79b+淋巴瘤细胞。还在CD4+和CD8+抗-CD79b CAR T细胞中都观察到显著的脱粒，当将它们与淋巴瘤细胞一起共培养时。还在NSG小鼠中针对Mino淋巴瘤异种移植物模型在体内检查了抗-CD79b CAR T细胞的功效。将经萤光素酶标记的Mino套细胞淋巴瘤细胞以2×106个肿瘤细胞/小鼠IV注射到NSG小鼠中。在18天后，经由尾静脉以10×106个T细胞/小鼠用未转导的原代T细胞、抗-CD19CAR T细胞或抗-CD79b CAR T细胞对小鼠进行治疗。使用生物发光成像来评估肿瘤负荷。结果显示在用未转导的T细胞进行治疗的小鼠中的进行性的肿瘤生长。而在用抗-CD19-和抗-CD79b CAR T细胞进行治疗的小鼠中，肿瘤生长受到抑制并且存活得到改善。因此，这些结果显示了在具有B细胞恶性肿瘤的患者中该新型抗-CD79b CAR T细胞疗法的功效，其可以是一种用于克服由于在CD19-特异性CAR T-细胞疗法后CD19丢失而引起的抵抗性的新型策略。
在一些方面，本发明的抗-CD79b CAR构建体由慢病毒载体编码。可以将所述载体转导入免疫细胞(例如T细胞)中。所述构建体可以包含CD28、CD3ζ和/或4-1BB信号传导结构域。所述构建体可以包含转导标记，例如eGFP或截短的EGFR结构域。所述转导标记可以通过切割肽(例如2A肽)与所述CAR相连接。
在本文中进一步提供了通过施用在本文中所提供的CD79b-特异性CAR免疫细胞(例如T细胞)来治疗癌症的方法。所述癌症可以为表达CD79b的B细胞恶性肿瘤，例如B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。本发明的疗法可以用于治疗在抗-CD19-CAR T细胞疗法后复发有CD19阴性肿瘤的具有B细胞恶性肿瘤的受试者。
II.定义
如在本文中所使用的，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于意指，所述特定组分中的任一种没有被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由于组合物的任何非故意的污染而引起的特定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的为这样的组合物，其中用标准分析方法无法检测到所述特定组分的量。
如在本文中在说明书中所使用的，“a”或“an”可以意指一或多。如在本文中在权利要求书中所使用的，当与词语“包括(包含)”结合使用时，词语“a”或“an”可以意指一或多于一。
在权利要求书中术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是互斥的，尽管本公开内容支持指仅备选方案和“和/或”的定义。如在本文中所使用的，“另一”可以意指至少第二或更多。术语“大约”、“实质上”和“大致”通常意指所陈述的值±5％。
疾病或状况的“治疗”是指执行这样的计划方案，其可以包括向患者施用一种或多种药物，以努力减轻该疾病的征候或症状。可希望的治疗效果包括降低疾病进展的速率，改善或缓和疾病状态，和缓解或经改善的预后。减轻可以在该疾病或状况的征候或症状出现之前以及在其出现之后发生。因此，“治疗”可以包括“预防”疾病或不希望的状况。另外，“治疗”不要求征候或症状的完全减轻，不要求治愈，并且特别地包括对于患者仅具有边缘效应的计划方案。
如在整个本申请中所使用的，术语“治疗益处”或“在治疗上有效的”是指关于该状况的医学处理而言促进或增强受试者的康宁的任何事物。这包括但不限于疾病的征候或症状的频率或严重度的减小。例如，癌症的治疗可以涉及例如肿瘤大小的减小、肿瘤侵袭性的减小、癌症生长速率的减小或者移的防止。癌症的治疗也可以是指延长具有癌症的受试者的存活。
“受试者”和“患者”是指人或非人动物，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特别的实施方案中，所述受试者为人。
短语“药学的或在药理学上可接受的”是指这样的分子实体和组合物，其在当施用给动物例如人(适当时)时不产生不利的、变应性的或其他麻烦的反应。鉴于本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药学组合物的制备将会是本领域技术人员已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，将会理解的是，制备物应当符合由FDA生物标准局所要求的无菌度、致热性、一般安全和纯度标准。
如在本文中所使用的，“在药学上可接受的承载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水，醇性/水性溶液，盐水溶液，肠胃外载料，例如氯化钠、林格氏葡萄糖溶液等)、非水性溶剂(例如，丙二醇，聚乙二醇，植物油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌试剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗试剂、吸收延迟试剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解试剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、液体和营养物补充剂，此类相似材料及其组合，如本领域普通技术人员将会已知的。在药学组合物中各种组分的pH和精确浓度按照众所周知的参数来进行调整。
III.CD79b抗体
在某些实施方案中，考虑了与CD79b的至少一部分相结合并且抑制任何类型的CD79b活性(至少包括信号传导)的抗体或其片段。如在本文中所使用的，术语“抗体”旨在泛指任何免疫学结合试剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和经遗传修饰的IgG以及包含保留了抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。所述抗体可以选自由下列各项组成的组：嵌合抗体、经亲和力成熟的抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或抗原结合抗体片段或者天然或合成配体。在特别的情况下，所述抗-CD79b抗体为单克隆抗体或人源化抗体。
因此，通过已知方式和如在本文中所描述的，可以产生对于CD79b、其各自表位中的一个或多个来说特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段和结合结构域和CDR(包括上述中的任何一种的经改造的形式)，或者上述中的任何一种的缀合物，无论此类抗原或表位是从天然来源分离出的还是天然化合物的合成衍生物或变体。
适合于本发明实施方案的抗体片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，其由VL、VH、CL和CH1结构域组成；(ii)“Fd”片段，其由VH和CH1结构域组成；(iii)“Fv”片段，其由单个抗体的VL和VH结构域组成；(iv)“dAb”片段，其由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，其为包含两个相连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过允许这两个结构域相联合从而形成结合结构域的肽连接体相连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；和(ix)双链抗体(diabody)，其是通过基因融合构建的多价或多特异性片段(美国专利申请公开20050214860)。Fv、scFv或双链抗体分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来进行稳定化。也可以制备包含与CH3结构域相连接的scFv的微型抗体(minibody)。
在实施方案中还考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等人(2003)描述了“抗体样结合肽模拟物”(antibody-like binding peptidomimetics；ABiPs)，其是这样的肽，所述肽可以充当缩减的抗体，并且具有更长的血清半衰期以及更不麻烦的合成方法的某些优点。
可以给动物接种抗原，例如CD79b细胞外结构域(ECD)蛋白，以便产生特异于CD79b的抗体。经常地，将抗原结合或缀合至另一种分子以增强免疫应答。如在本文中所使用的，缀合物是与用于在动物中引发免疫应答的抗原相结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质。响应于抗原接种而在动物中产生的抗体包括各种各样的非相同的分子(多克隆抗体)，其由各种各样的产生独个抗体的B淋巴细胞制备。多克隆抗体是抗体类别的混合群体，每种抗体类别可以识别在同一抗原上的不同表位。如果给予关于在动物中产生多克隆抗体的正确条件，那么在动物血清中的抗体的大多数将会识别在该动物已就其进行了免疫接种的抗原化合物上的集体表位。这种特异性通过亲和纯化(以仅选择识别目的抗原或表位的那些抗体)而进一步得到增强。
单克隆抗体是单一类别的抗体，其中每个抗体分子识别相同的表位，因为所有产生抗体的细胞都源自单一的B-淋巴细胞细胞系。用于生成单克隆抗体(MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的那些方法相同的路线来开始。在一些实施方案中，啮齿动物例如小鼠和大鼠用于生成单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或青蛙细胞用于生成单克隆抗体。使用大鼠是众所周知的，并且可以提供某些优点。常规地使用小鼠(例如，BALB/c小鼠)，并且其通常给出高的稳定融合百分比。
杂交瘤技术牵涉来自事先用CD79b抗原进行免疫接种的小鼠的单个B淋巴细胞与无限增殖骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)的融合。该技术提供了一种将单个产抗体细胞繁殖无限世代数目的方法，从而可以产生无限量的具有相同的抗原或表位特异性的在结构上相同的抗体(单克隆抗体)。
血浆B细胞(CD45+CD5-CD19+)可以从经免疫接种的兔的新鲜制备的兔外周血单核细胞中分离出来，并且进一步地就CD79b结合细胞进行选择。在富集产生抗体的B细胞后，可以分离总RNA并且合成cDNA。来自重链和轻链两者的抗体可变区的DNA序列可以进行扩增，构建到噬菌体展示Fab表达载体中，并且转化到大肠杆菌(E.coli)中。CD79b特异性结合Fab可以通过多轮富集淘选来选择出来并且进行测序。选择出的CD79b结合命中可以在人胚胎肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中通过使用哺乳动物表达载体系统而表达为以兔和兔/人嵌合形式的全长IgG，并且用快速蛋白质液相色谱法(FPLC)分离单元通过使用G蛋白树脂来进行纯化。
在一个实施方案中，所述抗体为嵌合抗体，例如包含嫁接至异源的非人、人或人源化序列(例如，构架和/或恒定结构域序列)的来自非人供者的抗原结合序列的抗体。已经开发出了方法来用人来源的类似结构域替代单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，而使外源抗体的可变区保持完整。备选地，在关于人免疫球蛋白基因而言转基因的小鼠中产生“完全人的”单克隆抗体。还已经开发出了方法来通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)和人氨基酸序列两者的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更加人的形式。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR源自小鼠单克隆抗体，并且构架区和恒定区源自人氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。认为将抗体中的对于啮齿动物来说特征性的氨基酸序列替代为在人抗体的相应位置处发现的氨基酸序列将会降低在治疗使用期间的不利免疫反应的可能性。杂交瘤或其他产生抗体的细胞也可以经历基因突变或其他变化，其可能会或可能不会改变由该杂交瘤所产生的抗体的结合特异性。
用于在各种动物物种中产生多克隆抗体以及用于产生各种类型的单克隆抗体(包括人源化的、嵌合的和完全人的)的方法在本领域中是众所周知的并且是高度可预测的。例如，下列美国专利和专利申请提供了此类方法的使能性描述：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；和美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,196,265、4,275,149、4,277,437、4,366,241、4,469,797、4,472,509、4,606,855、4,703,003、4,742,159、4,767,720、4,816,567、4,867,973、4,938,948、4,946,778、5,021,236、5,164,296、5,196,066、5,223,409、5,403,484、5,420,253、5,565,332、5,571,698、5,627,052、5,656,434、5,770,376、5,789,208、5,821,337、5,844,091、5,858,657、5,861,155、5,871,907、5,969,108、6,054,297、6,165,464、6,365,157、6,406,867、6,709,659、6,709,873、6,753,407、6,814,965、6,849,259、6,861,572、6,875,434和6,891,024。在本文中和在那里所引用的所有专利、专利申请出版物和其他出版物均通过提及而合并入本申请中。
抗体可以从任何动物来源(包括鸟类和哺乳动物)产生。优选地，所述抗体是绵羊、鼠类(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的。另外，较新的技术允许从人组合抗体库中开发和筛选人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在动物免疫接种不存在下产生特异性抗体，如在美国专利号6,946,546(其通过提及而合并入本文)中所描述的。
完全预期到，对于CD79b的抗体将会具有中和或抵消CD79b的效应的能力，无论动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源为何。某些动物物种可能对于生成治疗性抗体来说较不优选，因为它们可能更可能由于通过抗体的“Fc”部分激活了补体系统而引起变态应答。但是，完整抗体可以被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。Fc部分的去除降低了抗原抗体片段引发不希望的免疫应答的可能性，并因此没有Fc的抗体可能优先用于预防性或治疗性治疗。如上面所描述的，抗体也可以被构建为嵌合的或者部分或完全人的，以便减少或消除由于向动物施用在其他物种中产生的或者具有来自其他物种的序列的抗体而引起的不利的免疫学后果。
置换变体典型地在蛋白质内的一个或多个位点处包含一个氨基酸向另一个氨基酸的调换，并且可以被设计成调节所述多肽的一种或多种特性，具有或没有其他功能或特性的损失。置换可以是保守的，即将一个氨基酸替代为一个具有相似形状和电荷的氨基酸。保守置换在本领域中是众所周知的，并且包括例如下列变化：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。备选地，置换可以是非保守的，从而影响所述多肽的功能或活性。非保守变化典型地牵涉用在化学上不同的残基置换残基，例如将极性或带电荷的氨基酸置换为非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
蛋白质可以是重组的或者体外合成的。备选地，可以从细菌中分离出非重组或重组的蛋白质。还考虑，可以在组合物和方法中实施包含此类变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。
考虑了，在组合物中每ml包含大约0.001mg至大约10mg的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，在组合物中的蛋白质浓度可以为大约、至少大约或至多大约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或者从其中可导出的任何范围)。在这之中，大约、至少大约或至多大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可以为结合CD79b的抗体。
抗体或优选地抗体的免疫学部分可以化学缀合至其他蛋白质或者表达为与其他蛋白质的融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求书的目的，所有此类融合的蛋白质都包括在抗体或抗体的免疫学部分的定义中。
实施方案提供了针对CD79b的抗体和抗体样分子、多肽和肽，其与至少一种试剂相连接以形成抗体缀合物或有效负荷。为了提高抗体分子作为诊断或治疗试剂的功效，常规的是连接或共价结合或复合至少一种所希望的分子或部分。这样的分子或部分可以为但不限于，至少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有所希望的活性(例如细胞毒性活性)的分子。已附接至抗体的效应分子的非限制性实例包括：毒素、治疗性酶、抗生素、经放射性标记的核苷酸等。相反地，报道分子被定义为可以通过使用测定法来检测的任何部分。已缀合至抗体的报道分子的非限制性实例包括：酶、放射性标记物、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体(例如生物素)。
本领域已知几种用于将抗体附接或缀合至其缀合物部分的方法。一些附接方法牵涉使用金属螯合物络合物，其采用例如，有机螯合试剂例如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3-6-二苯基甘脲-3，附接至抗体。单克隆抗体也可以在偶联试剂例如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶进行反应。在这些偶联试剂存在下或者通过与异硫氰酸酯进行反应来制备具有荧光素标记物的缀合物。
IV.细胞疗法
本公开内容的某些实施方案涉及获得细胞和向受试者施用细胞(作为免疫疗法)以靶向癌细胞。所述细胞可以递送在本文中所涵盖的抗体组合物，但是它们自身可以或可以不是免疫细胞。在特别的实施方案中，所述细胞为免疫细胞。细胞的例子包括T细胞(包括αβT细胞或γδT细胞)、天然杀伤(NK)细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、任何类型的干细胞(包括MSC或诱导型多能干细胞)或树突细胞。
在过去的二十年中已经描述了用于功能性抗肿瘤效应T细胞的衍生、激活和扩增的几种基本方法。这些包括：自体细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；离体激活的T细胞，通过使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或包被有T细胞配体和激活抗体的珠粒，或者依靠捕获靶细胞膜而分离出的细胞；天然地表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和经遗传重编程或“更改”以表达称为“T-抗体(T-body)”的展示出抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子的非肿瘤特异性自体或同种异体细胞。这些方法已引起了许多用于T细胞制备和免疫接种的计划方案，其可以用在本公开内容的方法之中。
A.T细胞制备
在一些实施方案中，所述T细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些方面，所述细胞为人细胞。所述细胞典型地为原代细胞，例如直接分离自受试者和/或分离自受试者并经冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括一个或多个T细胞亚类或者其他细胞类型，例如整个T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞和其亚群，例如通过下列方面所定义的那些：功能，激活状态，成熟度，对于分化的潜力，扩增，再循环，定位，和/或持久能力，抗原特异性，抗原受体的类型，在特定器官或区室中的存在，标志物或细胞因子分泌特性谱，和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，例如对于现成技术，所述细胞是多能的和/或专项多能的，例如干细胞，例如诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试者中分离细胞，制备、加工、培养和/或改造它们，如在本文中所描述的，并且在冷冻保存之前或之后将它们重新引入到相同的患者中。
在T细胞的亚型和亚群(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)中包括幼稚T(TN)细胞，效应T细胞(TEFF)，记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T细胞(TSCM)、中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)或终末分化效应记忆T细胞(TTEMRA)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，未成熟T细胞，成熟T细胞，辅助T细胞，细胞毒性T细胞，粘膜相关不变T(MAIT)细胞，天然出现的和适应性的调节T(Treg)细胞，辅助T细胞，例如TH1细胞，TH2细胞，TH3细胞，TH17细胞，TH9细胞，TH22细胞，滤泡辅助T细胞，α/βT细胞，和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，使所述T细胞群体中的一种或多种富集或耗竭对于特定标志物(例如表面标志物)来说阳性的或者对于特定标志物来说阴性的细胞。在一些情况下，此类标志物为在某些T细胞群体(例如，非记忆细胞)上不存在或以相对低的水平表达，但是在某些其他T细胞群体(例如，记忆细胞)上存在或以相对更高的水平表达的那些。在一个实施方案中，使所述细胞(例如，CD8+细胞或CD3+细胞)富集(即，正选择)对于CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L来说阳性的或者表达高表面水平的CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞，和/或耗竭(例如，负选择)对于CD45RA来说阳性的或者表达高表面水平的CD45RA的细胞。在一些实施方案中，使所述细胞富集或耗竭对于CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)来说阳性的或者表达高表面水平的CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)的细胞。在一些例子中，使CD8+T细胞富集对于CD45RO(或对于CD45RA来说阴性)和对于CD62L来说阳性的细胞。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(例如，B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物(例如，CD14)的负选择来将T细胞与PBMC样品分开。在一些方面，使用CD4+或CD8+选择步骤来分开CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。可以通过对于在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或相对较高程度表达的标志物的正或负选择来将此类CD4+和CD8+群体进一步分选成亚群。
在一些实施方案中，使CD8+细胞进一步富集或耗竭幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与各自亚群相关联的表面抗原的正或负选择。在一些实施方案中，进行关于中枢记忆T(TCM)细胞的富集以增加功效，例如以改善在施用后的长期存活、扩增和/或移入，这在一些方面在此类亚群中是特别稳固的。在一些实施方案中，将经TCM富集的CD8+T细胞和CD4+T细胞相组合进一步增强了功效。
在一些实施方案中，所述T细胞为自体T细胞。在该方法中，肿瘤样品获得自患者，并且获得了单细胞悬浮液。所述单细胞悬浮液可以以任何合适的方式来获得，例如以机械方式(使肿瘤解聚，例如使用gentleMACSTM Dissociator,Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.)或以酶促方式(例如，胶原酶或DNA酶)。将肿瘤酶促消化物的单细胞悬浮液在白介素-2(IL-2)中进行培养。培养所述细胞直至汇合(例如，大约2×106个淋巴细胞)，例如大约5天至大约21天，优选地大约10天至大约14天。例如，可以将所述细胞培养5天、5.5天或5.8天至21天、21.5天或21.8天，例如10天、10.5天或10.8天至14天、14.5或14.8天。
可以将经培养的T细胞汇集并且快速地扩增。快速扩增在大约10天至大约14天(优选地大约14天)的时间段内提供至少大约50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或者更大)的抗原特异性T-细胞数目的增加。更优选地，快速扩增在大约10天至大约14天(优选地大约14天)的时间段内提供至少大约200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更大)的增加。
扩增可以通过本领域中已知的许多方法中的任一种来完成。例如，可以在饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)(其中IL-2是优选的)存在下通过使用非特异性T-细胞受体刺激来快速地扩增T细胞。所述非特异性T-细胞受体刺激可以包括大约30ng/ml的OKT3，一种小鼠单克隆抗-CD3抗体(从Ortho-
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Raritan,N.J.可得)。备选地，可以通过下述方式来快速地扩增T细胞：用所述癌症的一种或多种抗原(包括其抗原性部分，例如表位，或细胞)(其可以任选地从载体表达)(例如，人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽)在T-细胞生长因子例如300IU/ml IL-2或IL-15(其中IL-2是优选的)存在下在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)。通过用在表达HLA-A2的抗原呈递细胞上脉冲的所述癌症的相同抗原进行再刺激来快速地扩增经体外诱导的T-细胞。备选地，可以例如用经辐射的自体淋巴细胞或者用经辐射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2来再刺激所述T-细胞。
所述自体T-细胞可以进行修饰以表达促进所述自体T-细胞的生长和激活的T-细胞生长因子。合适的T-细胞生长因子包括例如白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域中已知的，参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons,NY,1994。在特别的方面，经修饰的T-细胞以高水平表达T-细胞生长因子。T-细胞生长因子编码序列(例如，IL-12的编码序列)在本领域中是容易地可得的，正如启动子那样，其与T-细胞生长因子编码序列的可操作连接促进高水平表达。
B.经基因改造的抗原受体
所述细胞可以进行基因改造以表达经改造的抗原受体，例如经改造的TCR或嵌合抗原受体(CAR)。例如，修饰自体T-细胞以表达具有对于癌症抗原(例如CD79b)的抗原特异性的T细胞受体(TCR)。合适的TCR包括例如具有对于黑素瘤抗原(例如gp100或MART-1)的抗原特异性的那些。合适的修饰方法是本领域中已知的。参见例如Sambrook和Ausubel,见上。例如，可以通过使用Heemskerk等人,Hum Gene Ther.19:496-510(2008)和Johnson等人,Blood 114:535-46(2009)中所描述的转导技术来转导所述T细胞以表达具有对于癌症抗原的抗原特异性的TCR。
在一些实施方案中，所述T细胞包含一种或多种经由基因改造而引入的核酸，其编码一种或多种抗原受体，和此类核酸的经基因改造的产物。在一些实施方案中，所述核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从所述细胞获得的样品中，例如从另一生物或细胞获得的那种，其例如通常不被发现于正进行改造的细胞和/或此类细胞所源自的生物中。在一些实施方案中，所述核酸不是天然出现的，例如在自然界中未发现的核酸(例如，嵌合的)。
在一些实施方案中，所述CAR包含与CD79b特异性地结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述抗原为在细胞的表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述CAR为TCR-样CAR，并且所述抗原为经加工的肽抗原，例如细胞内蛋白质的肽抗原，其像TCR一样，在主要组织相容性复合物(MHC)分子的情景下在细胞表面上被识别。
示例性的抗原受体(包括CAR和重组TCR)以及用于改造所述受体和将所述受体引入到细胞中的方法，包括例如：在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所描述的那些；和/或由Sadelain等人,2013；Davila等人,2013；Turtle等人,2012；Wu等人,2012所描述的那些。在一些方面，所述经基因改造的抗原受体包括在美国专利号7,446,190中所描述的CAR，和在国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中所描述的那些。
1.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，所述CAR包含：a)细胞内信号传导结构域；b)跨膜结构域；和c)包含抗原结合区的细胞外结构域。
在一些实施方案中，所述经改造的抗原受体包含CAR，包括激活性或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,2013)。所述CAR通常包含与一个或多个细胞内信号传导组分相连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域，在一些方面所述连接经由连接体和/或跨膜结构域。此类分子典型地模拟或接近于通过天然抗原受体的信号，通过此类受体以及与之相组合的共刺激受体的信号，和/或通过单独的共刺激受体的信号。
本公开内容的某些实施方案涉及核酸的用途，所述核酸包括编码下述多肽的核酸：抗原特异性CAR多肽，包括已被人源化以减小免疫原性的CAR(hCAR)，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域(包含一个或多个信号传导基元)。在某些实施方案中，所述CAR可以识别包含在一种或多种抗原之间的共享空间的表位。在某些实施方案中，所述结合区可以包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，那种特异性源自与受体相结合的肽(例如，细胞因子)。
考虑了所述人CAR核酸可以是用于增强对于人患者的细胞免疫疗法的人基因。在一个特别的实施方案中，本公开内容包括全长CAR cDNA或编码区。所述抗原结合区或结构域可以包含源自特定的人单克隆抗体(例如，在美国专利7,109,304中所描述的那些，该文献通过提及而合并入本文)的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段。所述片段也可以是任何数目的人抗原特异性抗体的不同抗原结合结构域。在一个更特别的实施方案中，所述片段为抗原特异性scFv，其由为了在人细胞中表达而就人密码子使用进行了优化的序列编码。
所述布置可以是多聚体的，例如双链抗体或多聚体。所述多聚体最可能地通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双链抗体来形成。所述构建体的铰链部分可以具有多个备选物，从被完全删除到保持第一个半胱氨酸，到脯氨酸而不是丝氨酸置换，到被截短直至第一个半胱氨酸。所述Fc部分可以被删除。任何稳定的和/或二聚化的蛋白质可以用于该目的。人们可以使用仅一个所述Fc结构域，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。人们也可以使用已进行了修饰以改善二聚化的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区。人们也可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。人们也可以使用CD8α的部分。
在一些实施方案中，所述CAR核酸包含编码其他共刺激受体的序列，例如跨膜结构域和经修饰的CD28细胞内信号传导结构域。其他共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137)中的一种或多种。
在一些实施方案中，构建具有对于特定抗原(或标志物或配体)的特异性的CAR，所述特定抗原为例如在待被过继疗法所靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如癌症标志物，和/或意欲诱导减缓性应答的抗原，例如在正常或非患病细胞类型上表达的抗原。因此，所述CAR典型地在其细胞外部分中包含一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，所述CAR包含抗体分子的抗原结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
编码所述嵌合受体的开放阅读框的序列可以获得自基因组DNA来源、cDNA来源，或者可以是合成的(例如，经由PCR)，或者其组合。取决于基因组DNA的大小和内含子的数目，可能希望的是使用cDNA或其组合，因为发现内含子使mRNA稳定。此外，可能进一步有利的是使用内源或外源的非编码区来使mRNA稳定。
考虑了可以将所述嵌合构建体作为裸DNA或在合适的载体中引入到免疫细胞中。使用裸DNA通过电穿孔来稳定地转染细胞的方法是本领域中已知的。参见例如美国专利号6,410,319。裸DNA通常是指这样的DNA，其编码以适当的方向被包含在质粒表达载体中以用于表达的嵌合受体。
备选地，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或慢病毒载体)来将所述嵌合构建体引入到免疫细胞中。合适的用于根据本公开内容的方法进行使用的载体在所述免疫细胞中是非复制性的。已知大量的基于病毒的载体，其中在所述细胞中病毒的拷贝数维持足够低以保持所述细胞的生存力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
在一些方面，将所述抗原特异性结合或识别组分与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域相连接。在一些实施方案中，所述CAR包含与所述CAR的细胞外结构域相融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与在所述CAR中的结构域之一天然地相关联的跨膜结构域。在一些情况下，选择跨膜结构域或者通过氨基酸置换进行修饰以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域相结合，以便使与该受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域源自任何膜结合型或跨膜蛋白质。跨膜区包括源自下列分子的那些(即，至少包含下列分子的跨膜区)：T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，和CD3δ。备选地，在一些实施方案中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面，所述合成的跨膜结构域主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在特别的实施方案中，本发明CAR构建体包含轻链-连接体-重链-铰链-跨膜结构域-信号传导结构域。所述连接体可以包含下列各项、由下列各项组成或者基本上由下列各项组成：连接体1(SEQ ID NO:44或45)、连接体2(SEQ ID NO:46或47)、连接体3(SEQ ID NO:48或49)或者连接体4(SEQ ID NO:50或51)。所述铰链可以包含下列各项、由下列各项组成或者基本上由下列各项组成：CD8铰链1(SEQ ID NO:52或53)、CD8铰链2(SEQ ID NO:54或55)、CD8铰链3(SEQ ID NO:56或57)、CD28铰链(SEQ ID NO:58或59)、IgG4铰链(SEQ ID NO:60或61)、IgG4 CH2(SEQ ID NO:62或63)、IgG4 CH2CH3(SEQ ID NO:64或65)或者IgG4CH1CH2CH3(SEQ ID NO:66或67)。所述跨膜结构域可以包含下列各项、由下列各项组成或者基本上由下列各项组成：CD8 TM1(SEQ ID NO:68或69)、CD8 TM2(SEQ ID NO:70或71)、CD28TM(SEQ ID NO:72或73)或者CD8αTM(SEQ ID NO:87)。在特别的情况下，使用缺少LYC和/或NHRN的氨基酸序列(包括相继的)(例如在其C-末端处)的CD8αTM。所述信号传导结构域可以包含下列各项、由下列各项组成或者基本上由下列各项组成：CD28(SEQ ID NO:74或75)、4-1BB(SEQ ID NO:76或77)、OX-40(SEQ ID NO:78或79)和/或CD3细胞内(SEQ ID NO:80或81)。所述CAR构建体可以进一步包含下列各项、由下列各项组成或者基本上由下列各项组成：GFP(SEQ ID NO:82或83)、T2A(SEQ ID NO:84或85)和/或EGFR(SEQ ID NO:40或41)。示例性的重链(HC)、连接体和轻链(LC)组合可以包括但不限于：LC-连接体1-HC；LC-连接体2-HC；LC-连接体3-HC；LC-连接体4-HC；HC-连接体1-LC；HC-连接体2-LC；HC-连接体3-LC；或HC-连接体4-LC。
2.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，所述经基因改造的抗原受体包括重组TCR和/或从天然出现的T细胞中克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指这样的分子，其包含可变的α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变的γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)并且能够与结合至MHC受体的抗原特异性地结合。在一些实施方案中，所述TCR以αβ形式。
典型地，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上是相似的，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学定位或功能。TCR可以在细胞的表面上或者以可溶形式被发现。通常，TCR被发现于T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在那里它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。在一些实施方案中，TCR也可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短的胞质尾区(参见例如，Janeway等人,1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C-末端处的短的胞质尾区。在一些实施方案中，TCR与在介导信号转导中所牵涉的CD3复合物的不变蛋白质相关联。除非另有说明，术语“TCR”应当被理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语也涵盖完整的或全长的TCR，包括以αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，对于本文中的目的，提及TCR包括任何TCR或功能性片段，例如TCR的抗原结合部分，其与结合在MHC分子中的特异性抗原肽(即MHC-肽复合物)相结合。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(它们可以互换使用)是指这样的分子，其包含TCR的结构结构域的一部分，但是结合完全TCR所与之结合的抗原(例如，MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成用于结合至特异性MHC-肽复合物的结合位点，例如通常其中每条链包含三个互补性决定区。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域相缔合以形成与免疫球蛋白类似的环或互补性决定区(CDR)，其赋予抗原识别并且通过形成TCR分子的结合位点决定肽特异性。典型地，像免疫球蛋白一样，所述CDR通过构架区(FR)分隔开(参见例如，Jores等人,1990；Chothia等人,1988；Lefranc等人,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，虽然也已显示α链的CDR1与所述抗原肽的N-末端部分相互作用，而β链的CDR1与所述肽的C-末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可以包含进一步的高可变性(HV4)区。
在一些实施方案中，所述TCR链包含恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链(例如，α-链、β-链)的细胞外部分可以包含两个免疫球蛋白结构域，在N-末端处的可变结构域(例如，Va或Vp；典型地，基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)，和一个邻近细胞膜的恒定结构域(例如，α-链恒定结构域或Ca，典型地，基于Kabat的氨基酸117至259；β-链恒定结构域或Cp，典型地，基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，由所述两条链形成的TCR的细胞外部分包含两个膜近侧恒定结构域和两个包含CDR的膜远侧可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短的连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而构成所述两条链之间的连接。在一些实施方案中，TCR可以在α和β链中的每一个之中具有额外的半胱氨酸残基，从而所述TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，所述TCR链可以包含跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是带正电荷的。在一些情况下，所述TCR链包含胞质尾区。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子例如CD3相缔合。例如，包含具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以锚定在细胞膜中的蛋白质并且与CD3信号传导器或复合物的不变亚基相缔合。
通常，CD3为多蛋白质复合物，其可以具有三条不同的链(γ、δ和ε)(在哺乳动物中)和ζ-链。例如，在哺乳动物中，该复合物可以包含一条CD3γ链、一条CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。所述CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白质，其包含单个免疫球蛋白结构域。所述CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区是带负电荷的，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链相缔合的特征。所述CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾各自包含单个保守基元(称为基于免疫受体酪氨酸的激活基元或ITAM)，而每条CD3ζ链具有三个。通常，ITAM牵涉TCR复合物的信号传导能力。这些附属分子具有带负电荷的跨膜区并且在将信号从TCR传送入细胞中发挥作用。所述CD3-链和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在一些实施方案中，所述TCR可以为两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以为单链TCR构建体。在一些实施方案中，所述TCR为包含两条相连接的(例如通过二硫键)分开的链(α和β链或者γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴定了关于靶抗原(例如，癌症抗原)的TCR并且将其引入到细胞中。在一些实施方案中，编码所述TCR的核酸可以获得自各种各样的来源，例如通过公众可得的TCR DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，所述TCR获得自生物来源，例如细胞例如T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或者其他公众可得的来源。在一些实施方案中，所述T细胞可以获得自体内分离的细胞。在一些实施方案中，高亲和力T细胞克隆可以从患者中分离，并且分离TCR。在一些实施方案中，所述T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)进行改造的转基因小鼠中生成了关于靶抗原的TCR克隆。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR。在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分可以从所述TCR的序列的知识以合成方式生成。
C.递送方法
本领域技术人员将会有能力通过标准重组技术(参见例如，Sambrook等人,2001和Ausubel等人,1996，两者都通过提及而引入本文)来构建载体以用于本公开内容的任何抗原受体的表达。载体包括但不限于：质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)，例如逆转录病毒载体(例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如，源自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括其有复制能力的、复制缺陷的和无内容的形式)、腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、EB病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、Harvey鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体、细小病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、水泡性口膜炎病毒载体、maraba病毒载体和B组腺病毒enadenotucirev载体。
1.病毒载体
在本公开内容的某些方面可以提供编码抗原受体的病毒载体。在生成重组病毒载体中，非必需基因典型地被关于异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列替代。病毒载体是表达构建体的一个种类，其利用病毒序列来将核酸和可能地蛋白质引入到细胞中。某些病毒经由受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞并且整合到宿主细胞基因组中并且稳定地且有效地表达病毒基因的能力使得它们成为用于将外来核酸转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。可以用于递送本公开内容的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性例子在下面进行了描述。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调控或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域中众所周知的(参见例如，美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒能够感染非分裂细胞，并且可以用于核酸序列的体内和离体基因转移和表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒—其中用两种或更多种携带包装功能，即gag、pol和env，以及rev和tat的载体转染合适的宿主细胞—描述在美国专利5,994,136(其通过提及而合并入本文)中。
2.调控元件
在本公开内容中有用的载体之中所包含的表达盒特别地包含(以5'-至-3'方向)与蛋白质编码序列可操作地连接的真核转录启动子、剪接信号(包括间插序列)和转录终止/多腺苷酸化序列。在真核细胞中控制蛋白质编码基因的转录的启动子和增强子由多个遗传元件组成。细胞机器能够收集并且整合由每个元件所传达的调控信息，从而允许不同的基因发展出不同的、常常复杂的转录调控模式。在本公开内容的情景下使用的启动子包括组成性的、诱导型的和组织特异性的启动子。
a.启动子/增强子
在本文中所提供的表达构建体包含启动子以驱动抗原受体的表达。启动子通常包含这样的序列，其发挥功能以放置关于RNA合成的起始位点。对此的最有名的例子是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的启动子中，例如关于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和关于SV40晚期基因的启动子，叠置在起始位点本身上的离散的元件有助于固定起始位置。另外的启动子元件调控转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30110bp的区域中，虽然许多启动子已显示出也包含在起始位点下游的功能元件。为了使编码序列处于启动子的“控制之下”，人们将转录阅读框的转录起始位点的5′末端放置于所选择的启动子的“下游”(即3′)。“上游”启动子刺激所述DNA的转录并且促进所编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔经常是灵活的，从而当元件相对于另一个元件被倒置或移动时，保留了启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加至相距50bp，之后活性开始下降。取决于启动子，看起来独个元件既可以协作地也可以独立地发挥功能以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”相联合地进行使用，所述增强子是指在核酸序列的转录激活中所牵涉的顺式作用调控序列。
启动子可以是与核酸序列天然地相关联的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′-非编码序列来获得。这样的启动子可以称为是“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然地相关联的增强子，其位于那个序列的下游或上游。备选地，通过将编码核酸区段放置于重组或异源启动子(其是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的启动子)的控制之下将会获得某些优势。重组或异源增强子也是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，和从任何其他病毒或者原核或真核细胞中分离出的启动子或增强子，和不“天然地出现的”启动子或增强子，即其包含不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，在重组DNA构建中最经常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子系统。除了以合成方式产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以结合在本文中所公开的组合物通过使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)来产生序列。进一步地，考虑了也可以采用指导在非核细胞器(例如，线粒体、叶绿体等)之内的序列的转录和/或表达的控制序列。
自然，重要的将会是，采用这样的启动子和/或增强子，其有效地指导在被选择用于进行表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中DNA区段的表达。分子生物学领域的技术人员通常知晓用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用(参见例如，Sambrook等人,1989，其通过提及而合并入本文)。所采用的启动子可以是组成性的，组织特异性的，诱导型的，和/或在合适的条件下对于指导所引入的DNA区段的高水平表达来说有用，例如在重组蛋白质和/或肽的大规模产生中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。
另外，也可以使用任何启动子/增强子组合(按照例如真核启动子数据库EPDB，在epd.isb-sib.ch/处通过万维网)来驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。真核细胞可以支持从某些细菌启动子的细胞质转录，如果提供合适的细菌聚合酶，无论作为递送复合物的一部分还是作为另外的遗传表达构建体。
启动子的非限制性例子包括：早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；和连环应答元件启动子，例如环AMP应答元件启动子(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和在最小TATA盒附近的应答元件启动子(tre)。也可能的是使用人生长激素启动子序列(例如，在Genbank中所描述的人生长激素最小启动子，登录号X05244，核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(从ATCC可得，目录号ATCC 45007)。在某些实施方案中，所述启动子为CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、I类MHC或II类MHC启动子，但是对于驱动治疗性基因的表达来说有用的任何其他启动子也可适用于本公开内容的实践。
在某些方面，本公开内容的方法还涉及增强子序列，即增加启动子的活性并且具有顺式地并且无论其方向地，甚至在相对长的距离(直至远离靶启动子几千碱基)上起作用的潜力的核酸序列。但是，增强子功能不是必需限制于这样的长距离，因为它们也可以在与给定的启动子靠得很近处发挥功能。
b.起始信号和联动表达
在本公开内容中所提供的表达构建体之中也可以使用特定的起始信号以用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将会容易地能够决定这并且提供必需的信号。众所周知，起始密码子必须与所希望的编码序列的阅读框“符合读框”以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包括合适的转录增强子元件来增强表达的效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来创造多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕开5’甲基化的帽依赖性翻译的核糖体扫描模式并且在内部位点处开始翻译。已经描述了来自小RNA病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)的IRES元件，以及来自哺乳动物信息的IRES。可以将IRES元件与异源开放阅读框相连接。多个开放阅读框可以一起被转录，每个通过IRES分隔开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框对于核糖体来说是可接近的，以便于有效翻译。通过使用单个启动子/增强子来转录单个信息，可以有效地表达多个基因。
另外，某些2A序列元件可以用于产生在本公开内容中所提供的构建体之中的基因的联动表达或共表达。例如，切割序列可以用于通过连接开放阅读框以形成单个顺反子来共表达基因。一个示例性的切割序列为F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A-样”序列(例如，明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A；T2A)。
3.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以包含一个或多个复制起点位点(通常称为“ori”)，例如，相应于在上面所描述的EBV的oriP的核酸序列或者具有相似或提高的在编程中的功能的经基因改造的oriP，其是复制在其处起始的特定核酸序列。备选地，可以采用在上面所描述的其他染色体外复制型病毒的复制起点或者自主复制序列(ARS)。
4.选择和可筛选标记
在一些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标记来在体外或在体内鉴定包含本公开内容的构建体的细胞。此类标记将会赋予所述细胞以可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定包含所述表达载体的细胞。通常，选择标记为赋予允许进行选择的特性的标记。正选择标记为其中该标记的存在允许其选择的标记，而负选择标记为其中其存在阻止其选择的标记。正选择标记的一个例子为药物抗性标记。
通常，包括药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对于新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件的实施来区别转化体的表型的标记外，还考虑了其他类型的标记，包括可筛选标记例如GFP，其基础是色度分析。备选地，可以使用可筛选酶作为负选择标记，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将会知道如何采用免疫标记，可能地与FACS分析相联合地。不认为所使用的标记是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择和可筛选标记的进一步的例子是本领域技术人员熟知的。
5.核酸递送的其他方法
除了编码所述抗原受体的核酸的病毒递送外，下面的是另外的重组基因递送至给定宿主细胞的方法并且因此在本公开内容中加以考虑。
核酸例如DNA或RNA向本公开内容的免疫细胞中的引入可以使用任何合适的用于核酸递送以转化细胞的方法，其是在本文中所描述的或者将会是本领域普通技术人员已知的。此类方法包括但不限于：DNA的直接递送，例如通过离体转染、通过注射(包括微量注射)；通过电穿孔；通过磷酸钙沉淀；通过使用DEAE-葡聚糖以及随后的聚乙二醇；通过直接声波加载；通过脂质体介导的转染和受体介导的转染；通过微粒轰击；通过与碳化硅纤维一起进行摇动；通过土壤杆菌(Agrobacterium)-介导的转化；通过干燥/抑制介导的DNA摄取，和此类方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，可以稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物。
V.治疗方法
本发明实施方案的某些方面可以用于预防或治疗与CD79b信号传导相关联的疾病或病症，包括其中CD79b-阳性细胞的杀伤将会改善所述疾病或病症的至少一种症状的那种。CD79b的信号传导可以通过任何用于防止癌细胞增殖的合适的组合物来减小。在特别的情况下，此类物质将会是抗-CD79b抗体或表达抗-CD79b CAR的细胞。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于免疫疗法的方法，其包括施用有效量的包含本公开内容的抗体(至少包括CAR T细胞)的组合物。在一个实施方案中，通过施用引发免疫应答的表达CAR的细胞群体来治疗医学疾病或病症。在本公开内容的某些实施方案中，通过施用引发免疫应答的CAR免疫细胞群体来治疗癌症。在本文中提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括向所述个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。本方法可以应用于治疗例如免疫病症、实体癌和血液学癌症。特别地，所述癌症可以为B细胞恶性肿瘤，例如B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
本治疗方法对其来说有用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液学肿瘤中发现的那些。示例性的实体瘤可以包括但不限于从由下列各项组成的组中选择的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳腺。示例性的血液学肿瘤包括骨髓的肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用在本文中所提供的方法来进行治疗的癌症的进一步例子包括但不限于：肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、胃部或胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑素瘤。
所述癌症可以特别地是下列组织学类型的，虽然并不限于这些：赘生物，恶性的；癌；癌，未分化的；巨大和纺锤状细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；合并的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性的；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无被囊性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液囊腺癌；粘液囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺的；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性的；卵巢基质瘤，恶性的；泡膜细胞瘤，恶性的；粒层细胞瘤，恶性的；男性细胞瘤，恶性的；塞托利细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性的；脂质细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳房外副神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；恶性雀斑样痣黑素瘤；肢端雀斑样痣黑素瘤；结节性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性的；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合瘤，恶性的；米勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间充质瘤，恶性的；布伦纳瘤，恶性的；分叶状瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性的；卵巢甲状腺肿，恶性的；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性的；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性的；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性的；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性的；间质性软骨肉瘤；骨的巨大细胞瘤；尤因肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性的；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形胶质细胞瘤；原浆性星形胶质细胞瘤；纤维性星形胶质细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性的；粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞的；恶性淋巴瘤，大细胞的，弥漫性的；恶性淋巴瘤，滤泡性的；蕈样霉菌病；其他特化的非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度淋巴母细胞NHL；高度小无裂细胞NHL；巨块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS-相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞白血病；嗜酸细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；多毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；和慢性原始粒细胞白血病。
某些实施方案涉及治疗白血病的方法。白血病是一种血液或骨髓的癌症，并且以血液细胞(通常为白血球(白细胞))的异常增殖(通过倍增的产生)为特征。它是被称为血液学赘生物的一大组疾病的一部分。白血病是涵盖一系列疾病的广义术语。白血病在临床上和在病理学上被分为其急性和慢性形式。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，在个体中的激活的CD4和/或CD8 T细胞以产生γ-IFN的CD4和/或CD8 T细胞和/或相对于在施用所述组合之前而言增强的溶细胞活性为特征。γ-IFN可以通过本领域中已知的任何手段来测量，包括例如细胞内细胞因子染色(ICS)，其牵涉细胞固定、透化和用针对γ-IFN的抗体进行染色。溶细胞活性可以通过本领域中已知的任何手段来测量，例如使用用混合的效应细胞和靶细胞的细胞杀伤测定法。
在一些实施方案中，可以在T细胞疗法之前给所述受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭性化学疗法。所述非清髓性淋巴细胞耗竭性化学疗法可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径来进行施用。所述非清髓性淋巴细胞耗竭性化学疗法可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别地如果所述癌症是黑素瘤，其可以是转移性的。施用环磷酰胺和氟达拉滨的一个示例性途径为静脉内。同样地，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特别的方面，施用大约60mg/kg的环磷酰胺两天，之后施用大约25mg/m2氟达拉滨五天。
在某些实施方案中，与所述自体T细胞相伴地或在所述自体T细胞之后，向所述受试者施用促进所述自体T细胞的生长和激活的T细胞生长因子。所述T细胞生长因子可以为任何合适的促进所述自体T细胞的生长和激活的生长因子。合适的T-细胞生长因子的例子包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和/或IL-12、其可以单独地或以各种组合来进行使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或者IL-12和IL2。IL-12是特别的T-细胞生长因子。
治疗有效量的免疫细胞可以通过许多途径来进行施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内或关节内注射或输注。
对于分散的、实体的、可接近的肿瘤特别地考虑肿瘤内注射或者注射到肿瘤脉管系统中。局部、区域性或全身施用也可以是合适的。对于>4cm的肿瘤，待施用的体积将会为大约4-10ml(特别是10ml)，而对于<4cm的肿瘤，将会使用大约1-3ml的体积(特别是3ml)。以单一剂量递送的多次注射包含大约0.1至大约0.5ml体积。
所述T细胞群体可以以与所述疾病相一致的治疗制度方案来进行施用，例如在一至几天内单个或几个剂量以改善疾病状态，或者在延长的一段时间内定期剂量以抑制疾病进展和防止疾病复发。待在制剂中采用的精确剂量还将会取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应当根据开业医生的判断和每位患者的情况来决定。T细胞的治疗有效量将会取决于正在进行治疗的受试者、疾患的严重度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可以在人受试者的治疗中使用的剂量从至少3.8×104、至少3.8×105、至少3.8×106、至少3.8×107、至少3.8×108、至少3.8×109或至少3.8×1010个T细胞/m2进行变动。在某些实施方案中，在人受试者的治疗中使用的剂量从大约3.8×109至大约3.8×1010个T细胞/m2进行变动。在另外的实施方案中，T细胞的治疗有效量可以从大约5×106个细胞/kg体重至大约7.5×108个细胞/kg体重，例如大约2×107个细胞至大约5×108个细胞/kg体重，或大约5×107个细胞至大约2×108个细胞/kg体重进行变化。准确的T细胞的量由本领域技术人员基于所述受试者的年龄、体重、性别和生理学状况来容易地确定。有效量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线进行外推。
在本公开内容的某些实施方案中，将有效量的表达CD79b CAR的免疫细胞递送给有此需要的个体，例如具有癌症的个体。然后，所述细胞增强所述个体的免疫系统以攻击癌细胞。在一些情况下，给所述个体提供一个或多个剂量的所述免疫细胞。在给所述个体提供两个或更多个剂量的所述免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应当足以允许用于在所述个体中进行繁殖的时间，并且在特别的实施方案中，剂量之间的持续时间为l、2、3、4、5、6、7或更多天。
在特别的实施方案中，将已被改造以表达CD79b CAR的细胞提供给个体，以在所述个体中改善至少一种与癌细胞相关的症状的治疗有效量(在103至1010的范围内)。治疗有效量可以为103至1010、103至109、103至108、103至107、103至106、103至105、103至104、104至1010、104至109、104至108、104至107、104至106、104至105、105至1010、105至109、105至108、105至107、105至106、106至1010、106至109、106至108、106至107、107至1010、107至109、107至108、108至1010、108至109或109至1010个细胞。因此，在特别的实施方案中，给具有某种癌症的个体一次或多次地提供治疗有效量的表达CD79b CAR的细胞。
A.药学组合物
在本文中还提供了药学组合物和制剂，其包含表达CAR的细胞和在药学上可接受的承载体。
在本文中所描述的药学组合物和制剂可以通过混合具有所希望的纯度的活性成分(例如，抗体或多肽)与一种或多种任选的在药学上可接受的承载体(Remington'sPharmaceutical Sciences,第22版,2012)来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。在药学上可接受的承载体通常在所采用的剂量和浓度下对于受者来说是无毒性的，并且包括但不限于：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如，氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；雷琐酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。示例性的在本文中的在药学上可接受的承载体进一步包括间隙药物分散试剂，例如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0004019006860000451
Baxter International,Inc.)。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶相组合。
B.联合疗法
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法相组合的T细胞群体。所述另外的疗法可以是放射疗法、外科手术(例如，肿块切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法(nanotherapy)、单克隆抗体疗法或上述的组合。所述另外的疗法可以以辅助或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，所述另外的疗法为施用小分子酶抑制剂或抗转移试剂。在一些实施方案中，所述另外的疗法为施用副作用限制试剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重度的试剂，例如抗恶心试剂等)。在一些实施方案中，所述另外的疗法为放射疗法。在一些实施方案中，所述另外的疗法为外科手术。在一些实施方案中，所述另外的疗法为放射疗法和外科手术的组合。在一些实施方案中，所述另外的疗法为γ辐射。在一些实施方案中，所述另外的疗法为靶向PBK/AKT/mTOR途径的疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防试剂。所述另外的疗法可以为本领域中已知的化学治疗试剂中的一种或多种。
免疫细胞疗法可以相对于另外的癌症疗法(例如，免疫检查点疗法)而言之前、期间、之后或以各种组合进行施用。所述施用可以以从同时至数分钟至数天或数周变动的间隔。在其中与另外的治疗性试剂相分开地向患者提供免疫细胞疗法的实施方案中，人们通常将会确保在每次递送的时间之间没有显著的时间段到期，从而所述两种化合物将会仍然能够对于患者发挥有利地组合的效应。在这样的情况下，考虑了人们可以在相互的大约12至24或72小时内，和更特别地在相互的大约6-12小时内提供患者以抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可以希望的是显著地延长用于治疗的时间段，当各个施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以采用各种组合。对于下面的例子，免疫细胞疗法为“A”，而抗癌治疗为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。
向患者施用本发明实施方案的任何化合物或疗法将会遵循关于此类化合物的施用的一般计划方案，其中考虑了所述试剂的毒性，如果有。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本发明实施方案可以使用各种各样的化学治疗试剂。化学治疗试剂的例子包括：烷基化试剂，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；氮杂环丙烷类和甲基三聚氰胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；乙酰精宁类(acetogenins)(尤其是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑制素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；烯二炔蒽环类抗生素，包括烯二炔蒽环抗生素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；5-氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦生类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；利索新；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族化合物(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类，例如维甲酸；卡培他滨；卡铂；丙卡巴肼；普卡霉素；吉西他滨；诺维本；法呢基-蛋白质转移酶抑制剂；反铂；以及上述中任一个的在药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
引起DNA损伤并且已被广泛使用的其他因素包括通常所称的γ-射线、X-射线和/或放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐射和UV-辐射。最可能的是，所有这些因素都对DNA、对DNA的前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持造成宽范围的损伤。关于X-射线的剂量范围的变动为50至200伦琴的日剂量持续延长的时间段(3至4周)到2000至6000伦琴的单一剂量。关于放射性同位素的剂量范围广泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型以及赘生性细胞进行的摄取。
3.免疫疗法
技术人员将会理解，可以与所述实施方案的方法相组合地或相联合地使用免疫疗法。在癌症治疗的情景下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0004019006860000481
就是这样一个例子。免疫效应子可以例如为对于在肿瘤细胞表面上的一些标志物来说特异性的抗体。单独的所述抗体可以充当疗法的效应子，或者它可以募集其他细胞去实际地影响细胞杀伤。也可以将所述抗体缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且充当靶向试剂。备选地，所述效应子可以是携带与肿瘤细胞靶标直接地或间接地相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)，并且可以在联合疗法中进行使用。该方法组合了针对其抗原靶标的MAb的高特异性与高度强有力的细胞毒性药物，从而导致“经武装的”MAb，其将有效负荷(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞。药物的靶向递送也使得其在正常组织中的暴露最小化，从而导致降低的毒性和经改善的治疗指数。示例性的ADC药物包括
Figure BDA0004019006860000491
(brentuximabvedotin)和
Figure BDA0004019006860000492
(trastuzumab emtansine或T-DM1)。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向，即不存在于大多数其他细胞上的标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任一种可以适合于在本发明实施方案的情景下进行靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酰路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B、erb b2和p155。免疫疗法的一个备选的方面是组合抗癌效应与免疫刺激效应。也存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8；和生长因子，例如FLT3配体。
免疫疗法的例子包括：免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，IL-1，GM-CSF，和TNF；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53；和单克隆抗体，例如抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-p185。考虑了可以将一种或多种抗癌疗法与在本文中所描述的抗体疗法一起进行使用。
在一些实施方案中，所述免疫疗法可以为免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)要么调低信号。可以被免疫检查点阻断所靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制因子(VISTA)。特别地，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
所述免疫检查点抑制剂可以为药物例如小分子，重组形式的配体或受体，或者特别地为抗体，例如人抗体。可以使用免疫检查点蛋白质的已知的抑制剂或者其类似物，特别地可以使用抗体的嵌合、人源化或人形式。如技术人员将会知道的，对于在本公开内容中所提及的某些抗体可以使用备选和/或等价的名称。此类备选和/或等价的名称在本公开内容的情景下是可互换的。例如，已知兰洛利珠单抗(lambrolizumab)也以备选和等价的名称MK-3475和帕博利珠单抗(pembrolizumab)而为人所知。
在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与其配体结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，所述PD-1配体结合伙伴为PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂为抑制PDL1与其结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，PDL1结合伙伴为PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，所述PDL2结合拮抗剂为抑制PDL2与其结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，PDL2结合伙伴为PD-1。所述拮抗剂可以为抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抗-PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，所述抗-PD-1抗体选自由下列各项组成的组：纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗和CT-011。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)相融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0004019006860000501
)是一种可以使用的抗-PD-1抗体。帕博利珠单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、兰洛利珠单抗、
Figure BDA0004019006860000502
和SCH-900475)是一种示例性的抗-PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)也是一种抗-PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是一种PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文中所提供的方法之中靶向的另一个免疫检查点为细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4被发现于T细胞的表面上，并且当与在抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时作为“关”开关起作用。CTLA4是在辅助T细胞表面上表达的免疫球蛋白超家族的成员，并且向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T-细胞共刺激蛋白CD28相似，并且这两种分子都与在抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)相结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也被发现于调节T细胞中，并且可能对于其功能来说是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞激活导致增加的CTLA-4(关于B7分子的抑制性受体)的表达。
在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
适合于在本方法中进行使用的抗人CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)可以通过使用本领域中众所周知的方法来生成。备选地，可以使用本领域认可的抗-CTLA-4抗体。一种示例性的抗-CTLA-4抗体为伊匹木单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0004019006860000511
)或者其抗原结合片段和变体。在另一些实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹木单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体竞争与CTLA-4的结合和/或与上面提及的抗体结合相同的在CTLA-4上的表位。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体具有至少大约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗具有至少大约90％、95％或99％可变区同一性)。
4.外科手术
大约60％的具有癌症的人将会经历一些类型的外科手术，其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性外科手术。治愈性外科手术包括其中所有或部分癌性组织被物理移除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其他疗法(例如，本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或备选的疗法)相联合地进行使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的物理移除。除了肿瘤切除术外，通过外科手术进行的治疗包括激光外科手术、低温外科手术、电外科手术和显微控制的外科手术(莫斯外科手术)。
在切除部分或所有癌性细胞、组织或肿瘤后，在身体中可能形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或对该区域局部应用另外的抗癌疗法来完成。这样的治疗可以重复，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有变化的剂量。
5.其他试剂
考虑了可以与本发明实施方案的某些方面相组合地使用其他试剂以改善治疗的治疗功效。这些另外的试剂包括：影响细胞表面受体和GAP连接的上调的试剂，细胞抑制和分化试剂，细胞粘附的抑制剂，增加高增殖性细胞对于凋亡诱导剂的敏感性的试剂，或其他生物学试剂。通过提高GAP连接的数目而导致的细胞间信号传导的增加将会增加对于相邻的高增殖性细胞群体的抗高增殖效应。在另一些实施方案中，可以与本发明实施方案的某些方面相组合地使用细胞抑制或分化试剂以改善治疗的抗高增殖功效。细胞粘附的抑制剂被考虑用于改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的例子为局部粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。
VI.制造品或试剂盒
在本文中还提供了包含免疫细胞、抗体、试剂、缓冲液或其组合的制造品或试剂盒。所述制造品或试剂盒可以进一步包含包装插页，其包含关于使用所述免疫细胞来在个体中治疗癌症或延迟癌症进展或者增强具有癌症的个体的免疫功能的说明书。可以在所述制造品或试剂盒中包括任何在本文中所描述的抗原特异性免疫细胞。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。所述容器可以由各种各样的材料例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈斯特洛伊耐蚀镍基合金)形成。在一些实施方案中，所述容器容纳所述制剂和在该容器上或与该容器相连的标签(其可以指明使用说明)。所述制造品或试剂盒可以进一步包括从商业或用户立场所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，所述制造品进一步包括一种或多种另外的试剂(例如，化学治疗试剂和抗肿瘤试剂)。合适的用于所述一种或多种试剂的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
VII.在某些实施方案中使用的序列
克隆T26 VH区：
核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACCAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCAATTGATCCTTCAGATAGTTATACTGGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTACAAGAAGCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(357nt)(SEQ IDNO:8)
氨基酸序列
EVQLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGPGLEWIGAIDPSDSYTGYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCTRSYYGNSWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:7)(119aa)
T26 VH CDR1：GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)
T26 VH CDR2：IDPSDSYT(SEQ ID NO:2)
T26 VH CDR3：NSWFAYWGQGTLV(SEQ ID NO:3)
克隆T26 VL区：
核苷酸序列
ACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATAAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGAATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGTTGCAGCCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAGGTTGGAAATAAAAC(330nt)(SEQ ID NO:10)
氨基酸序列
IVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYINWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDVAAYYCQQSNEDPFTFGSGTRLEIK(110aa)(SEQ ID NO:9)
T26 VL CDR1：QSVDYDGDSY(SEQ ID NO:4)
T26 VL CDR2：AAS(SEQ ID NO:5)
T26 VL CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO:6)
克隆5B VH区：
核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCAATTGATCCTTCAGATAGTTATACTGGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTACAAGAAGCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGATTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(357nt)(SEQ IDNO:18)
氨基酸序列
EVQLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDPSDSYTGYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCTRSYYGNSWFDYWGQGTLVTVSA(119aa)(SEQ ID NO:17)
5B VH CDR1：GYTFTSYW(SEQ ID NO:11)
5B VH CDR2：IDPSDSYT(SEQ ID NO:12)
5B VH CDR3：NSWFDYWGQGTLV(SEQ ID NO:13)
克隆5B VL区：
核苷酸序列
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGAAGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGAATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTAATGAGGACCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATAAAA(333nt)(SEQ ID NO:20)
氨基酸序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYEGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYHCQQSNEDPFTFGGGTKLEIK(111aa)(SEQ ID NO:19)
5B VL CDR1：QSVDYEGDSY(SEQ ID NO:14)
5B VL CDR2：AAS(SEQ ID NO:15)
5B VL CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO:16)
克隆28B VH区：
核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCAATTGATCCTTCAGATAGTTATACTGGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTACAAGAAGCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(357nt)(SEQ IDNO:28)
氨基酸序列
EVQLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDPSDSYTGYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCTRSYYGNSWFAYWGQGTLVTVSA(119aa)(SEQ ID NO:27)
28B VH CDR1：GYTFTSYW(SEQ ID NO:21)
28B VH CDR2：DPSDSYT(SEQ ID NO:22)
28B VH CDR3：SWFAYWGQGTLV(SEQ ID NO:23)
克隆28B VL区：
核苷酸序列
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATTTATGTTGCATCCAATCTAGAATCTGGAATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAC(333nt)(SEQ ID NO:30)
氨基酸序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIN(111aa)(SEQ ID NO:29)
28B VL CDR1：QSVDYDGDSY(SEQ ID NO:24)
28B VL CDR2：VAS(SEQ ID NO:25)
28B VL CDR3：QQSNEDPFT(SEQ ID NO:26)
SEQ ID NO:40
截短的人EGFR
CGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTAGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGG
SEQ ID NO:41
EGFRIII-IV
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRR
SEQ ID NO:42
CD8前导
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
SEQ ID NO:43
CD8前导
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:44
连接体1
GGTGGCGGAGGTTCT
SEQ ID NO:45
连接体1
GGGGS
SEQ ID NO:46
连接体2
GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC
SEQ ID NO:47
连接体2
GGGGSGGGGS
SEQ ID NO:48
连接体3
GGAGGAGGTGGTAGTGGTGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGAAGT
SEQ ID NO:49
连接体3
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:50
连接体4
GGAGGAGGTGGTAGTGGTGGAGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC
SEQ ID NO:51
连接体4
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:52
CD8铰链1
ACAACTACTCCAGCACCACGACCACCAACACCTGCTCCAACTATCGCATCTCAACCACTTTCTCTACGTCCAGAAGCATGCCGACCAGCTGCAGGAGGTGCAGTTCATACGAGAGGTCTAGATTTCGCATGTGAT
SEQ ID NO:53
CD8铰链1
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:54
CD8铰链2
AAGCCCACAACTACTCCAGCACCACGACCACCAACACCTGCTCCAACTATCGCATCTCAACCACTTTCTCTACGTCCAGAAGCATGCCGACCAGCTGCAGGAGGTGCAGTTCATACGAGAGGTCTAGATTTCGCATGTGAT
SEQ ID NO:55
CD8铰链2
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:56
CD8铰链3
TTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACAACTACTCCAGCACCACGACCACCAACACCTGCTCCAACTATCGCATCTCAACCACTTTCTCTACGTCCAGAAGCATGCCGACCAGCTGCAGGAGGTGCAGTTCATACGAGAGGTCTAGATTTCGCATGTGAT
SEQ ID NO:57
CD8铰链3
FSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:58
CD28铰链
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGG
SEQ ID NO:59
CD28铰链
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKG
SEQ ID NO:60
IgG4铰链
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCA
SEQ ID NO:61
IgG4铰链
ESKYGPPCPSCP
SEQ ID NO:62
IgG4 CH2
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG
SEQ ID NO:63
IgG4 CH2
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
SEQ ID NO:64
IgG4 CH2CH3
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:65
IgG4 CH2CH3
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:66
IgG4 CH1CH2CH3
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:67
IgG4 CH1CH2CH3
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:68
CD8 TM 1
ATCTACATCTGGGCACCATTGGCTGGGACTTGTGGTGTCCTTCTCCTATCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
SEQ ID NO:69
CD8 TM 1
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:70
CD8 TM 2
ATCTACATCTGGGCACCATTGGCTGGGACTTGTGGTGTCCTTCTCCTATCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAAC
SEQ ID NO:71
CD8 TM 2
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
SEQ ID NO:72
CD28 TM
AAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTC
SEQ ID NO:73
CD28 TM
KHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF
SEQ ID NO:74
CD28
AGAAGTAAAAGAAGTAGGCTACTTCATAGTGATTACATGAATATGACTCCTCGACGACCTGGTCCCACCCGTAAGCATTATCAGCCCTATGCACCACCACGAGATTTCGCAGCCTATCGCTCC
SEQ ID NO:75
CD28
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO:76
4-1BB
AAACGAGGTAGAAAAAAACTTCTTTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGATGTAGTTGTCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
SEQ ID NO:77
4-1BB
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:78
OX-40
AGGCGCGACCAGCGGCTGCCACCTGATGCACACAAGCCACCAGGAGGAGGCTCTTTCCGGACCCCAATCCAGGAGGAGCAGGCAGACGCACACAGCACACTGGCCAAGATC
SEQ ID NO:79
OX-40
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:80
CD3ζ细胞内
AGAGTTAAATTTAGCAGAAGTGCAGATGCTCCTGCGTATAAACAGGGTCAAAACCAACTATATAATGAACTAAATCTAGGACGAAGAGAAGAATATGATGTTTTAGATAAAAGACGTGGTCGAGATCCTGAAATGGGAGGAAAACCTAGAAGAAAAAATCCTCAAGAAGGCCTATATAATGAACTACAAAAAGATAAGATGGCAGAAGCTTATAGTGAAATTGGAATGAAAGGAGAACGTCGTAGAGGTAAAGGTCATGATGGTCTTTATCAAGGTCTTAGTACAGCAACAAAAGATACATATGATGCACTTCATATGCAAGCACTTCCACCTCGT
SEQ ID NO:81
CD3ζ细胞内
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:82
增强型GFP
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
SEQ ID NO:83
增强型GFP
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
SEQ ID NO:84
T2A
GAGGGCAGAGGCAGTCTGCTGACATGCGGTGACGTGGAAGAGAATCCCGGCCCT
SEQ ID NO:85
T2A
EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:86
CD8αTM(核苷酸序列)
ATCTACATCTGGGCACCATTGGCTGGGACTTGTGGTGTCCTTCTCCTATCACTGGTTATCACC
SEQ ID NO:87
CD8αTM(氨基酸序列)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
VIII.实施例
包括了下面的实施例以示范本公开内容的特别的实施方案。本领域技术人员应当意识到，在下面的在实施例中所公开的技术代表了由发明人发现在本发明的实践中很好地发挥功能的技术，并且因此可以被认为构成了关于本发明的实践的优选方式。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应当意识到，在所公开的特别的实施方案中可以进行许多变化，并且其仍然获得同样或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1–CD79b抗体和CAR的开发
CD79b表达局限于B细胞谱系：使用实时PCR，发现CD79b在宽范围的B细胞淋巴瘤细胞系(包括Mino、Daudi、HBC-1、Jeko、SUDHL6、SUDHL4和U2932)中表达，但是在Jurkat和J76T-细胞淋巴瘤/白血病细胞系中没有表达(图1A)。为了确定CD79b是否在正常组织上表达，从Applied Biosystems获得了包含20种正常人组织总RNA的FirstChoice人总RNA调查小组(Human Total RNA Survey Panel)。从经纯化的来自人扁桃体样品的B和T细胞中提取总RNA，并且分别用作阳性和阴性对照。发现CD79b转录物仅存在与淋巴样组织例如脾脏和淋巴结中，但是在所有非淋巴样正常组织中不存在(图1B)。
使用公众可得的基因表达数据集(Oncomine)，发现CD79b在ALL和慢性淋巴细胞白血病(图1C)以及多种B细胞淋巴瘤亚型例如伯基特淋巴瘤、弥漫型大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤和套细胞淋巴瘤(图1D)中高表达。关于每种肿瘤类型的样品数目显示在括号中。
多种针对人CD79b的单克隆抗体的生成以及抗体的重链和轻链序列的鉴定：抗人CD79b单克隆抗体通过杂交瘤技术来生成，其中用表达人CD79b的小鼠成纤维细胞L细胞对小鼠进行免疫接种(图2A)。通过ELISA，鉴定出三个具有对于重组人CD79b蛋白的高结合能力的克隆(图2B)。这三种单克隆抗体的亲和力通过Octet测定法来进一步测定，并且选择分别具有在1.44、17.8和2.0nM处的Kd值的三个克隆，即14(IgG1)、16A(IgG2)和45(IgG2)，用于进一步开发(图2C)。将单克隆抗体克隆#14与荧光色素相缀合，并且显示出与来自BDBiosciences的商业抗-CD79b抗体相当的对于B细胞淋巴瘤细胞系的染色(图2D)。提取所述单克隆抗体的杂交瘤的总RNA，合成cDNA。使用5’-RACE PCR(cDNA末端的快速扩增)来克隆关于重链和轻链的V-基因。通过DNA序列来预测蛋白质序列。纯化杂交瘤培养物上清液，并且通过来自MD Anderson Proteomics Core Facility的质谱法来确证重链和轻链蛋白质序列。
抗-CD79b CAR T细胞的生成：使用可变区单链片段(scFv)的特定序列，生成了几个抗-CD79b CAR构建体。为了检测在经转导的T细胞中的CAR表达，使用CAR-增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合物构建体或截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)(图3A)。后者也可以充当安全开关以在严重毒性的情况下消除CAR T细胞。掺入CD3-ζ(CD3z)链以提供关于激活T细胞的信号1，并且掺入共刺激结构域CD28或4-1BB以提供信号2(图3A)。
将这些构建体克隆到慢病毒载体pHR_SFFV中，然后将其用于转导原代健康供者T细胞。在图3B中显示了使用克隆45-CD79b-CD28-CAR通过在CD4+和CD8+T细胞中的eGFP表达所测定的代表性转导效率(>70％)。使用抗-CD19-CAR T细胞作为对照。
CAR T细胞针对用CellTrace Far Red标记的Daudi细胞的细胞毒性活性通过以所示的效应子:靶标(E:T)比率在16-小时流式细胞术测定法中的Aqua染色来测定(图3C)。在图3D中显示了代表性点图，其具有在20:1的E:T比率下对于各种培养条件的死细胞百分比(右上象限)。数据显示，抗-CD19-CAR T细胞和抗-CD79b-CAR T细胞对于Daudi伯基特淋巴瘤细胞都是高度有细胞毒性的，相比于未转导的对照T细胞而言。
抗-CD79b CAR T细胞对于CD19+和CD19-淋巴瘤细胞都是有细胞毒性的：为了测定抗-CD79b CAR T针对CD19阴性(CD19-)淋巴瘤细胞的功效，用弥漫型大B细胞淋巴瘤细胞系，即SUDHL6(其缺乏CD19)，来进行脱粒和细胞毒性测定法。首先，通过CRISPR-Cas9来敲除CD19(CD19KOSUDHL6)，然后用缺乏外显子2的CD19剪接变体(CD19Dex2)转导这些淋巴瘤细胞，所述外显子2是关于在抗-CD19 CAR构建体中所使用的抗-CD19抗体克隆FMC63的结合位点。
将未转导的原代T细胞(Ctrl T)，克隆-14-CD79b-CD28 CAR、14-CD79b-4-1BB CAR和FMC63-CD19-CD28 CAR与Daudi或上述SUDHL6细胞(CD19KOSUDHL6-CD19Dex2)一起以5:1的E:T比率进行共培养。用CellTrace Far Red标记T细胞，和用CellTrace Violet标记靶细胞。在2小时后，向培养物添加高尔基体抑制剂和脱粒标志物(CD107a/b)以测定T细胞的脱粒。在4天的共培养后测定针对肿瘤细胞的细胞毒性活性。14-CD79b-CD28和14-CD79b-4-1BB CAR T细胞，而不是对照T细胞，显示出明显地增加的针对所述两个细胞系的脱粒和细胞毒性活性(图4A和B)。相反地，FMC63-CD19-CD28 CAR对于CD19+Daudi有细胞毒性，但是对于CD19KOSUDHL6-CD19Dex2肿瘤细胞没有细胞毒性。
使用用于流式细胞术的CountBright绝对计数珠粒，在4-天共培养后还测定了活肿瘤细胞的绝对数目(图4C)。结果与所观察到的活肿瘤细胞百分比相一致(图4B)。显示了靶细胞和效应T细胞的代表性点图(图4A和B)。实验重复了至少3次，具有相似的结果。
抗-CD79b CAR T细胞展示出针对淋巴瘤异种移植物的体内功效：为了测试抗-CD79b CAR T细胞的体内功效，将表达萤火虫萤光素酶基因的Mino套细胞淋巴瘤细胞系通过IV途径以2×106个肿瘤细胞/小鼠注射到NSG小鼠中。在18天后，经由尾静脉注射以10×106个CAR+T细胞或未转导的T细胞/小鼠用未转导的原代T细胞、抗-CD19-CD28 CAR T细胞或克隆45抗-CD79b-CD28 CAR T细胞对小鼠进行治疗。使用生物发光成像来评估肿瘤负荷(图5A)。结果显示在用未转导的T细胞进行治疗的小鼠中的进行性的肿瘤生长。相反地，在用抗-CD19-和抗-CD79b CAR T细胞进行治疗的小鼠中都观察到良好的肿瘤控制和明显地经改善的存活(p<0.05)(图5B和5C)。对于每个独个实验已至少三次验证了体外结果，和两次验证了体内结果。因此，抗-CD79b CAR疗法可以用于治疗具有或没有CD19表达的B细胞恶性肿瘤。
实施例2–另外的CD79b抗体和CAR的开发
使用新的抗-CD79b抗体克隆来生成抗-CD79b CAR T细胞：使用来自另外的抗体克隆(T26、5B和28B)的可变区单链片段(scFv)的特定序列，生成了几个抗-CD79b CAR构建体。为了检测在经转导的T细胞中的CAR表达，使用CAR-增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合物构建体或截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)(图6A)。后者也可以充当安全开关以在严重毒性的情况下消除CAR T细胞。掺入CD3-ζ(CD3z)链以提供关于激活T细胞的信号1，并且掺入共刺激结构域CD28或4-1BB或OX-40以提供信号2(图6A)。
抗-CD79b CAR T细胞展示出针对Daudi淋巴瘤细胞的体外细胞毒性。将上述CAR构建体(T26和28B)克隆到慢病毒载体pLVEG中，然后将其用于转导原代健康供者T细胞以生成抗-CD79b-CAR T细胞。使用抗-CD19-CAR T细胞作为对照。在共培养1天和4天后，以所示的效应子:靶标(E:T)比率通过流式细胞术测定法来测定CAR T细胞(用CellTrace Far Red标记的)针对Daudi细胞(用CellTrace Violet标记的)的细胞毒性活性(图6B)。在图6C中显示了代表性点图。数据显示，抗-CD19-CAR T细胞和抗-CD79b-CAR T细胞对于Daudi伯基特淋巴瘤细胞都是高度有细胞毒性的。
抗-CD79b CAR T细胞展示出针对Daudi淋巴瘤异种移植物的体内功效：为了测试抗-CD79b CAR T细胞(克隆T26)的体内功效，将表达萤火虫萤光素酶基因的Daudi伯基特淋巴瘤细胞系通过IV途径以2×104个肿瘤细胞/小鼠注射到NSG小鼠中。在10天后，对小鼠不进行治疗，或者经由尾静脉注射以3×106个CAR+T细胞/小鼠用抗-CD19-CAR T细胞或克隆T26抗-CD79b-CAR T细胞进行治疗。使用生物发光成像来评估肿瘤负荷(图6D)。结果显示在未治疗的小鼠中的进行性的肿瘤生长。相反地，在用抗-CD19-和抗-CD79b CAR T细胞进行治疗的小鼠中都观察到良好的肿瘤控制和明显地经改善的存活(p＝0.01)(图6E)。这些结果证明，抗-CD79b CAR T细胞具有强的体内抗肿瘤活性。
实施例3–CD79b抗体和CAR的进一步开发和探究
抗-CD79b抗体与人CD79b的结合：将从杂交瘤上清液中分离出的全长抗-CD79b单克隆抗体(克隆5B和28B)用于通过ELISA来测试与在小鼠成纤维细胞L细胞上表达的人CD79b的结合(图7)。
CAR构建体的生成：使用源自克隆28B的VH和VL的可变区单链片段(scFv)的特定序列(显示在图7中)，通过使用CD8α或CD28铰链/跨膜结构域生成了几个抗-CD79b CAR的构建体。为了检测在经转导的T细胞中的CAR表达，使用CAR-增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合物构建体或截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)(图8A)。使用抗-CD19-CAR构建体作为对照。后者也可以充当安全开关以在严重毒性的情况下消除CAR T细胞。掺入CD3-ζ(CD3ζ)链以提供关于激活T细胞的信号1，并且掺入共刺激结构域CD28或4-1BB或OX40以提供信号2(图8A)。将这些构建体克隆到具有EF1α启动子的慢病毒载体pLVEG中(图8B)，然后将其用于转导T细胞，并且在下面所描述的各种体外和体内测定法中进行测试。
抗-CD79b CAR特异性地识别人CD79b：为了测定抗-CD79b CAR的信号传导能力，使用慢病毒将所述CAR(对于CD79b CAR使用克隆28B)转导入Jurkat-LuciaTM NFAT报道细胞中(图9A)。在该细胞系中，编码分泌型腔肠素(coelenterazine)利用性萤光素酶的Lucia基因由与六个拷贝的NFAT共有转录应答元件相融合的ISG54最小启动子驱动。这些经转导的Jurkat细胞与抗-CD3/抗-CD28抗体或者Daudi伯基特淋巴瘤细胞一起培养24小时诱导了相比于未处理的细胞而言强的萤光素酶活性(图9B)。为了建立所述CAR分子对于CD79b的识别特异性，使用CRISPR/Cas9来生成SUDHL6(其为表达CD19和CD79b的弥漫型大B-细胞淋巴瘤细胞系)的等基因形式：亲本或野生型(WT)、CD19敲除(CD19KO)、CD79bKO和CD19/CD79b双KO(CD19KO CD79bKO)(图9C)。经CAR转导的Jurkat-LuciaTM NFAT报道细胞与SUDHL6等基因细胞系的共培养显示，CD79b CAR识别亲本和CD19KO细胞两者，但是用CD79bKO或CD19KOCD79bKO细胞的反应性显著地降低。相反地，CD19 CAR识别亲本和CD79bKO细胞两者，但是不识别CD19KO或CD19KOCD79bKO细胞(图9D)。
将CAR转导入原代人T细胞中：在图10A中显示了使用上面所描述的CAR构建体(图8A)通过eGFP表达和/或重组人CD79b-Fc蛋白染色而测定的代表性转导效率。使用抗-CD19-CAR T细胞作为对照。对抗-CD79b CAR T细胞不进行处理，或者用抗-CD3/CD28抗体或重组人CD79b-Fc蛋白进行刺激。在15分钟后，通过流式细胞术来评估CD3ζ和ERK1/2的磷酸化。结果显示，在CAR+和CAR-T细胞之间不存在基线磷酸化的显著差异，这暗示了强壮的信号传导的不存在。用抗-CD3/CD28抗体进行刺激在CAR+而非CAR-T细胞中诱导了CD3ζ的磷酸化。相反地，用重组人CD79b-Fc蛋白进行刺激在CAR+而非CAR-T细胞中诱导了CD3ζ和ERK1/2的磷酸化，这暗示所述CAR可以响应于CD79b蛋白的识别而在原代T细胞中诱导信号传导(图10B)。
抗-CD79b CAR T细胞的增殖活性：用CellTrace Far Red标记来自健康供者T细胞的使用上述CAR构建体(图8A)生成的抗-CD79b CAR T细胞，并且将其与表达CD79b的Daudi伯基特淋巴瘤肿瘤细胞一起以1:1的效应子:靶标(E:T)比率进行共培养。在4天后，用染料稀释法通过流式细胞术来评估CAR T细胞的增殖。结果显示，相比于未转导的T细胞而言，CD4+和CD8+抗-CD79b CAR T细胞均响应于Daudi肿瘤细胞而显著地增殖。抗-CD79b CAR T细胞的增殖与抗-CD19 CAR T细胞是相当的(图11A和11B)。
通过抗-CD79b CAR T细胞的细胞因子产生：将通过使用上述CAR构建体(图8A)从健康供者T细胞生成的抗-CD79b CAR T细胞与Daudi伯基特淋巴瘤肿瘤细胞一起以1:1的E:T比率进行共培养。在24小时后，通过多重细胞因子测定法来评估在上清液中的细胞因子水平。结果显示，相比于未转导的T细胞而言，抗-CD79b CAR T细胞响应于Daudi肿瘤细胞而产生重大量的IL-2、GM-CSF、IFN-γ和IL-17A。通过抗-CD79b CAR T细胞的细胞因子产生与抗-CD19 CAR T细胞是相当的(图12)。
抗-CD79b CAR T细胞响应于淋巴瘤细胞而脱粒：将通过使用上述CAR构建体(图8A)从健康供者T细胞生成的抗-CD79b CAR T细胞与Daudi伯基特淋巴瘤肿瘤细胞一起以1:1的E:T比率进行共培养。在6小时后，在就CD107 a/b进行染色后通过流式细胞术评估脱粒。结果显示，相比于未转导的T细胞而言，CD4+和CD8+抗-CD79b CAR T细胞都响应于Daudi肿瘤细胞而大量地脱粒。通过抗-CD79b CAR T细胞的脱粒与抗-CD19 CAR T细胞是相当的。相比于包含CD28铰链/跨膜结构域的抗-CD79b CAR T细胞而言，用包含CD8α铰链/跨膜结构域的抗-CD79b CAR T细胞，脱粒在数字上是更高的(图13A和13B)。
抗-CD79b CAR T细胞对于淋巴瘤细胞是有细胞毒性的：将通过使用上述CAR构建体(图8A)从健康供者T细胞生成并且用CellTrace Far Red进行标记的抗-CD79b CAR T细胞与用CellTrace Violet进行标记的Daudi伯基特淋巴瘤肿瘤细胞或SUDHL6等基因细胞系(亲本、CD19KO、CD79bKO和CD19/CD79b双KO)一起以1:1的E:T比率进行共培养。在4天后，用流式细胞术通过测定残留的活肿瘤细胞的绝对数目并且计算裂解百分比来评估细胞毒性。结果显示，相比于未转导的T细胞而言，抗-CD79b CAR T细胞诱导显著的对于Daudi肿瘤细胞的细胞毒性。抗-CD79b CAR T细胞的细胞毒性活性与抗-CD19 CAR T细胞是相当的。相比于包含CD28铰链/跨膜结构域的抗-CD79b CAR T细胞而言，用包含CD8α铰链/跨膜结构域的抗-CD79b CAR T细胞，细胞毒性活性是更高的(图14A)。此外，抗-CD79b CAR T细胞诱导亲本和CD19KO SUDHL6细胞两者的显著裂解，但是用CD79bKO或CD19KOCD79bKO细胞，裂解显著地减少。相反地，抗-CD19 CAR T细胞诱导亲本和CD79bKO细胞两者的显著裂解，但是用CD19KO或CD19KOCD79bKO细胞，裂解显著地减少(图14B)。
抗-CD79b CAR T细胞发挥体内抗肿瘤效应：为了检查抗-CD79b-CAR T细胞的体内功效，将表达萤火虫萤光素酶基因的Daudi伯基特淋巴瘤细胞通过IV途径以2×104个肿瘤细胞/小鼠注射到NSG小鼠中。在11天后，经由尾静脉注射以5×106个CAR+T细胞/小鼠用未转导的T细胞或抗-CD19-CAR T细胞或通过使用上述CAR构建体(图8A)而生成的抗-CD79b-CAR T细胞对小鼠进行治疗。使用生物发光成像来评估肿瘤负荷(图15A)。结果显示出在用未转导的T细胞进行治疗的小鼠中的快速的肿瘤生长。相反地，在用抗-CD19 CAR和抗-CD79b CAR T细胞进行治疗的小鼠中都看见良好的肿瘤控制和明显地经改善的存活。相比于包含CD28铰链/跨膜结构域的抗-CD79b CAR T细胞而言，用包含CD8α铰链/跨膜结构域的抗-CD79b CAR T细胞，肿瘤控制和存活是更高的，其中用包含CD8α铰链/跨膜结构域和OX40共刺激结构域的抗-CD79b CAR T细胞观察到最好的存活(图15B)。
***
所有在本文中所公开的和所要求保护的方法都可以根据本公开内容来进行制作和施行，而无需过度的实验。虽然已经按照优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说将会明显的是，可以对于在本文中所描述的方法和在本文中所描述的方法的步骤中或步骤顺序中施加变化，而不背离本发明的构思、精神和范围。更特别地，将会明显的是，某些在化学上和在生理学上都相关的试剂可以替代在本文中所描述的试剂，而将会取得相同或相似的结果。所有此类对于本领域技术人员来说明显的相似的替代或修饰都被认为在本发明的精神、范围和构思之内，如由所附的权利要求书所定义的。
参考文献
下面的参考文献通过提及而特别地合并入本文，达到它们提供示例性的对于在本文中所阐述的那些来说补充性的程序或其他细节的程度。
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Wu等人,2012

Claims (92)

1.分离的单克隆抗体，其中所述抗体与CD79b特异性地结合并且包含：
(I)：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR；
(II)：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR；或者
(III)：
(a)包含SEQ ID NO:21的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:7的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。
4.权利要求2的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:7的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域相同的VL结构域。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:17的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:19的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。
7.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:17的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:19的VL结构域相同的VL结构域。
8.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含为SEQ ID NO:21的序列的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
9.权利要求8的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:27的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:29的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。
10.权利要求8的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:27的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:29的VL结构域相同的VL结构域。
11.权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述抗体是重组的。
12.权利要求1的抗体，其中所述抗体为IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。
13.权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述抗体为Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。
14.权利要求1-12中任一项的抗体，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。
15.权利要求1-14中任一项的抗体，其中所述抗体与显像剂、化学治疗试剂、毒素或放射性核素相缀合。
16.组合物，其在药学上可接受的承载体中包含权利要求1-15中任一项的抗体。
17.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求1-14中任一项的抗体的核酸序列。
18.重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含克隆T26的VH结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:1、2和3)；和克隆T26的VL结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:4、5和6)。
19.重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含克隆5B的VH结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:11、12和13)；和克隆5B的VL结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:14、15和16)。
20.重组多肽，其包含抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含克隆28B的VH结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:21、22和23)；和克隆28B的VL结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:24、25和26)。
21.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求18-20中任一项的多肽的核酸序列。
22.宿主细胞，其包含一种或多种编码权利要求1-14中任一项的抗体或者权利要求18-20中任一项的重组多肽的多核苷酸分子。
23.权利要求22的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。
24.用于治疗具有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-13中任一项的抗体。
25.权利要求24的方法，其中所述癌症为B细胞恶性肿瘤。
26.权利要求24的方法，其中所述抗体处于在药学上可接受的组合物中。
27.权利要求24的方法，其中所述抗体全身地进行施用。
28.权利要求24的方法，其中所述抗体以静脉内方式、以真皮内方式、以肿瘤内方式、以肌内方式、以腹膜内方式、以皮下方式或局部地进行施用。
29.权利要求24的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少第二种抗癌疗法。
30.权利要求29的方法，其中所述第二种抗癌疗法为外科手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
31.权利要求29的方法，其中所述第二种抗癌疗法包括过继T-细胞疗法。
32.经改造的CD79b CAR或TCR，其具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(I)：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR；
(II)：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR；或者
(III)：
(a)包含SEQ ID NO:21的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
33.权利要求32的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含：
(a)包含SEQ ID NO:1的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:2的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:3的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:4的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:5的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:6的第三VL CDR。
34.权利要求33的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:7的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。
35.权利要求33的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域与SEQ ID NO:7的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:9的VL结构域相同的VL结构域。
36.权利要求32的CAR或TCR，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:11的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:12的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:13的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:14的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:15的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:16的第三VL CDR。
37.权利要求36的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:17的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:19的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。
38.权利要求36的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:17的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:19的VL结构域相同的VL结构域。
39.权利要求32的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含：
(a)包含SEQ ID NO:21的第一VH CDR；
(b)包含SEQ ID NO:22的第二VH CDR；
(c)包含SEQ ID NO:23的第三VH CDR；
(d)包含SEQ ID NO:24的第一VL CDR；
(e)包含SEQ ID NO:25的第二VL CDR；和
(f)包含SEQ ID NO:26的第三VL CDR。
40.权利要求39的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:27的VH结构域至少大约80％同一的VH结构域和与SEQ ID NO:29的VL结构域至少大约80％同一的VL结构域。
41.权利要求39的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:27的VH结构域相同的VH结构域和与SEQ ID NO:29的VL结构域相同的VL结构域。
42.权利要求32的CAR或TCR，其中所述CAR包含一个或多个从由下列各项组成的组中选择的信号传导结构域：CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137及其组合。
43.权利要求32的CAR或TCR，其中所述CAR包含CD3ζ和CD28信号传导结构域。
44.权利要求32的CAR或TCR，其中所述CAR包含CD3ζ和4-1BB信号传导结构域。
45.权利要求32的CAR或TCR，其中所述CAR包含CD3ζ和OX-40信号传导结构域。
46.权利要求32的CAR或TCR，其中所述CAR或TCR由病毒载体编码。
47.权利要求46的CAR或TCR，其中所述病毒载体为慢病毒载体。
48.权利要求32-80中任一项的CAR或TCR，其中所述抗原结合结构域包含通过连接体与VL结构域相连接的VH结构域。
49.权利要求48的CAR或TCR，其中所述连接体包括连接体1(SEQ ID NO:45)或由SEQ IDNO:44的多核苷酸编码的连接体，连接体2(SEQ ID NO:47)或由SEQ ID NO:46的多核苷酸编码的连接体，连接体3(SEQ ID NO:49)或由SEQ ID NO:48的多核苷酸编码的连接体，或者连接体4(SEQ ID NO:51)或由SEQ ID NO:50的多核苷酸编码的连接体。
50.权利要求32-49中任一项的CAR或TCR，其中所述CAR包含VL-连接体1-VH、VL-连接体2-VH、VL-连接体3-VH、VL-连接体4-VH、VH-连接体1-VL、VH-连接体2-VL、VH-连接体3-VL或VH-连接体4-VL。
51.权利要求32-50中任一项的CAR或TCR，其中所述CAR或TCR包含铰链。
52.权利要求51的CAR或TCR，其中所述铰链为CD8铰链1(SEQ ID NO:53)或由SEQ IDNO:52的多核苷酸编码的铰链，CD8铰链2(SEQ ID NO:55)或由SEQ ID NO:54的多核苷酸编码的铰链，CD8铰链3(SEQ ID NO:57)或由SEQ ID NO:56的多核苷酸编码的铰链，CD28铰链(SEQ ID NO:59)或由SEQ ID NO:58的多核苷酸编码的铰链，IgG4铰链(SEQ ID NO:60或61)，IgG4 CH2(SEQ ID NO:63)或由SEQ ID NO:62的多核苷酸编码的铰链，IgG4CH2CH3(SEQID NO:65)或由SEQ ID NO:64的多核苷酸编码的铰链，或者IgG4 CH1CH2CH3(SEQ ID NO:67)或由SEQ ID NO:66的多核苷酸编码的铰链。
53.权利要求32-52中任一项的CAR或TCR，其中所述CAR包含跨膜结构域。
54.权利要求53的CAR或TCR，其中所述跨膜结构域为CD8TM1(SEQ ID NO:69)或由SEQID NO:68的多核苷酸编码的跨膜结构域，CD8 TM2(SEQ ID NO:71)或由SEQ ID NO:70的多核苷酸编码的跨膜结构域，CD28 TM(SEQ ID NO:73)或由SEQ ID NO:72的多核苷酸编码的跨膜结构域，或者CD8αTM(SEQ ID No:87)或由SEQ ID NO:86的多核苷酸编码的跨膜结构域。
55.权利要求32的CAR或TCR，其进一步包含转导标记和/或安全开关。
56.权利要求55的CAR或TCR，其中所述转导标记为增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。
57.权利要求56的CAR或TCR，其中所述eGFP具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
58.权利要求55的CAR或TCR，其中所述转导标记和/或安全开关为截短的表皮生长因子(EGFR)。
59.权利要求58的CAR或TCR，其中所述EGFR具有SEQ IDNO:41的氨基酸序列。
60.权利要求55的CAR或TCR，其中所述转导标记和/或安全开关通过切割肽与所述CAR相连接。
61.权利要求60的CAR或TCR，其中所述切割肽为2A肽。
62.权利要求61的CAR或TCR，其中所述2A肽为T2A肽。
63.权利要求62的CAR或TCR，其中所述T2A肽具有SEQ IDNO:85的氨基酸序列。
64.权利要求32的CAR或TCR，其中所述CAR进一步包含第二抗原结合结构域。
65.权利要求64的CAR或TCR，其中所述第二抗原结合结构域为CD19、CD20或CD22抗原结合结构域。
66.权利要求32-65中任一项的CAR或TCR，其中所述CAR或TCR包含：CD8α铰链和包含SEQID NO:87的跨膜结构域或由SEQ ID NO:86的多肽编码的跨膜结构域，包含SEQ ID NO:79的人OX-40信号传导结构域或由SEQ ID NO:78的多肽编码的信号传导结构域，和包含SEQ IDNO:81的CD3ζ结构域或由SEQ ID NO:81的多肽编码的结构域。
67.表达载体，其编码权利要求32-66中任一项的CAR或TCR。
68.经改造以表达CD79b CAR或CD79b TCR的宿主细胞。
69.权利要求68的细胞，其中所述细胞经改造以表达权利要求30-65中任一项的CAR。
70.权利要求68的细胞，其中所述宿主细胞为免疫细胞。
71.权利要求70的细胞，其中所述免疫细胞为T细胞。
72.权利要求71的细胞，其中所述T细胞为原代人T细胞或TIL。
73.权利要求71的细胞，其中所述T细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。
74.权利要求72的细胞，其中所述原代人T细胞是从健康供者获得的。
75.权利要求71的细胞，其中所述T细胞是自体的。
76.权利要求71的细胞，其中所述T细胞是同种异体的。
77.权利要求68的细胞，其中所述细胞通过使用CRISPR或转座酶系统来进行改造。
78.包含CD79b靶向型T细胞和药学承载体的药学组合物，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达权利要求32-66中任一项的CAR或TCR。
79.用于在受试者中治疗癌症的包含有效量的CD79b靶向型T细胞的组合物，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达权利要求32-66中任一项的CAR或TCR。
80.包含有效量的CD79b靶向型T细胞的组合物用于在受试者中治疗癌症的用途，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达权利要求32-66中任一项的CAR或TCR。
81.用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的CD79b靶向型T细胞，其中所述CD79b靶向型T细胞经改造以表达权利要求32-66中任一项的CAR或TCR。
82.权利要求81的方法，其中所述癌症为B细胞恶性肿瘤。
83.权利要求82的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤为B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。
84.权利要求81的方法，其中所述受试者事先已经被施用了CD19 CAR疗法。
85.权利要求84的方法，其中所述受试者是对CD19 CAR疗法有抵抗性的。
86.权利要求85的方法，其中所述受试者具有CD19抗原丢失。
87.权利要求86的方法，其中所述受试者复发有CD19-阴性肿瘤。
88.权利要求81的方法，其中所述CD79b靶向型T细胞以静脉内方式、以真皮内方式、以肿瘤内方式、以肌内方式、以腹膜内方式、以皮下方式或局部地进行施用。
89.权利要求81的方法，其中所述CD79b靶向型T细胞以静脉内方式进行施用。
90.权利要求81的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少第二种抗癌疗法。
91.权利要求90的方法，其中所述第二种抗癌疗法为外科手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
92.权利要求81的方法，其中所述癌症为表达CD79b的癌症。
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