CN114929262A - 用于过继细胞疗法的免疫细胞 - Google Patents

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Abstract

提供了用于通过改造无限免疫细胞以表达BCL6和促进细胞存活的基因来产生具有增加的寿命和高的增殖速率的无限免疫细胞的方法。在此进一步提供了用于产生和使用所述无限免疫细胞以治疗疾病例如癌症的方法。

Description

用于过继细胞疗法的免疫细胞
本申请要求2019年8月21日提交的美国临时专利申请系列号62/889,662的优先权，其通过提及而以其整体合并入本文。
发明背景
1.发明领域
总体而言，本公开内容涉及至少分子生物学、细胞生物学、免疫学和医学的领域。更特别地，它涉及产生无限免疫细胞的方法以及其使用方法。
2.相关技术描述
NK细胞和T细胞是两种类型的在过继细胞疗法研究中经常使用的细胞毒性淋巴细胞。特异于微生物或肿瘤抗原的从NK细胞和T细胞衍生的CAR-NK细胞、CAR T细胞、TCR-转导的T细胞和具有内源性T-细胞受体的T细胞是非常有希望的用于治疗血液学恶性肿瘤和实体瘤两者的方法。三种靶向CD19的CAR-T细胞产品最近已被FDA批准用于B细胞恶性肿瘤，并且更多的产品在开发中。目前，TCR-T细胞和CAR-T细胞疗法产品的生成是一个多步骤过程，其需要首先从健康供者或患者中分离T细胞，随后使用病毒或非病毒载体将TCR或CAR引入到那些T细胞中，并且在输注到患者中之前在体外扩增经遗传修饰的T细胞。类似地，微生物和肿瘤抗原特异性T细胞的生成也是一个多步骤过程，其需要首先从健康供者或患者中收集T细胞，随后用微生物或肿瘤抗原性肽或蛋白质在体外进行分离和/或刺激，并且在输注入到患者中之前在体外扩增所述T细胞。
这使得为每名患者制备产品是昂贵的、麻烦的和耗时的。进一步地，这种方式产生的T细胞在它们变得衰老之前仅能在体外扩增几周，因此限制了可以从每名患者或健康供者产生的微生物和肿瘤抗原特异性T细胞、TCR-T细胞或CAR-T细胞的数目。
近期的报道暗示，通过基因改造来促进CAR-T细胞的存活的因子与更好的治疗效果正相关(Hurton等人,2016)。因此，增加正常的和/或经遗传改变的T细胞的寿命并且保持其增殖、细胞因子产生和细胞毒性功能的策略将会显著地降低产生它们的时间以及过继T细胞疗法方法的成本，同时潜在地增加其效力。虽然细胞毒性T细胞系，TALL-104(美国专利号US5272082)，和NK细胞系，NK-92(美国专利公开号US20020068044)，可以无限期地增殖并且具有细胞毒性活性，但是它们是分别从T细胞和NK细胞白血病建立的。因此，这些细胞系包含突变和其他基因改变，并且对于在人中的治疗性用途来说是不安全的。因此，存在尚未满足的对于实现这些目标以增加正常T细胞寿命的策略的需要。
发明概述
在一个实施方案中，本公开内容提供了组合物，其包含经改造以具有相比于未如此改造的免疫细胞而言增加的寿命的免疫细胞，包括至少T细胞或NK细胞。此类细胞在本文中可以被称为无限细胞。在特别的实施方案中，方法和组合物涉及这样的免疫细胞，其具有B-细胞淋巴瘤6(BCL6)和促存活基因或抗凋亡基因或促进细胞存活的基因的表达，包括异源表达。如在本文中所使用的，促存活基因是指能够发挥抗凋亡功能或通过任何机制促进存活的核酸聚合物。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以为Bcl2家族基因中的一种或多种，例如BCL-xL(也称为BCL2L1基因)、BCL-2、MCL1、BCL2L2(Bcl-w)、BCL2A1(Bfl-1)、BCL2L10(BCL-B)等。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以为凋亡抑制剂(IAP)家族基因中的一种或多种，例如XIAP、BIRC2(C-IAPl)、BIRC3(C-IAP2)、NAIP、BIRC5(存活蛋白)等。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以能够抑制或敲除一种或多种在凋亡中发挥作用的胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶-12、胱天蛋白酶-13、胱天蛋白酶-14)的表达。用于敲低或敲除的核酸聚合物可以为shRNA表达盒，或者这些胱天蛋白酶基因也可以通过基因编辑方法(CRISPR、TALEN、锌指方法等)来敲除。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以能够抑制或敲除一种或多种促凋亡基因(例如，BCL2L11(BIM)、BBC3(PUMA)、PMAIP1(NOXA)、BIK、BMF、BAD、HRK、BID、BAX、BAK1、BOK等)的表达。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以具有抗凋亡效应，例如IGF1、HSPA4(Hsp70)、HSPB1(Hsp27)、CLAR(cFLIP)、BNIP3、FADD、AKT和NF-κB、RAF1、MAP2K1(MEK1)、RPS6KA1(p90Rsk)、JUN、C-Jun、BNIP2、BAG1、HSPA9、HSP90B1、miRNA21、miR-106b-25、miR-206、miR-221/222、miR-17-92、miR-133、miR-143、miR-145、miR-155、miR-330等。
在特别的实施方案中，在本文中所涵盖的细胞能够在外部刺激不存在下组成性地产生大量的IL-4(例如，在体外培养物中大于1000pg/mL，当以10,000个细胞/mL的细胞浓度进行温育时)，并且此类细胞可以用于临床应用，例如用于治疗各种炎性病症，包括自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、某些类型的与细胞因子释放综合征相关联的感染、与CAR T-细胞和其他过继T-细胞疗法相关联的毒性、炎性肠病、与各种免疫疗法相关联的免疫相关不良事件、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、周期热综合征等，因为IL-4可以抑制由T细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞所诱导的炎症。
在一些方面，所述促进细胞存活的基因为抗凋亡的B-细胞淋巴瘤2(BCL-2)家族基因。在某些方面，所述抗凋亡的BCL-2家族基因为BCL2L1(Bcl-xL)、BCL-2、MCL1、BCL2L2(Bcl-w)、BCL2A1(Bfl-1)、BCL2L10(BCL-B)或其组合。在特别的方面，所述抗凋亡的BCL-2家族基因为Bcl-xL。
在进一步的方面，所述T细胞或NK细胞进一步进行改造以表达IL-2和/或IL-15。
在某些方面，所述T细胞或NK细胞源自健康供者(例如，未被诊断为具有癌症的供者)。在另一些方面，所述T细胞或NK细胞源自患者。在特别的方面，所述供者为人。
在特别的方面，所述T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞、调节T细胞、先天淋巴样细胞或其组合。在一些方面，所述T细胞包括CD8和/或γδT细胞。所述T细胞为幼稚T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、终末分化T细胞或其组合。在某些方面，所述T细胞为TCRαβ细胞或TCRγδT细胞。在一些方面，所述组合物没有或基本上不含滤泡辅助(Tfh)T细胞。在一些方面，所述免疫细胞的组成为T细胞，其为Th1/Tc1、Th2/Tc2、Th9/Tc9、Th17/Tc17、Tfh、Th22、Tc22或其组合。在特别的方面，所述T细胞表达IFNγ、粒酶B、穿孔蛋白或其组合。
在某些方面，所述T细胞或NK细胞是病毒特异性的或肿瘤抗原特异性的。在一些方面，所述T细胞或NK细胞进一步进行改造以表达一种或多种CAR和/或一种或多种TCR。在一些方面，所述CAR或TCR包含CD4、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD79a、CD79b、SLAM-F7、CD123、CD70、CD72、CD33、CD38、CD80、CD86、CD138、CLL-1、FLT3、ROR-1、TACI、TRBC1、MUC1、PD-L1、CD117、FRα、LeY、HER2、IL13Rα2、DLL3、DR5、FAP、LMP1、MAGE-A1、MAGE-A4、MG7、MUC16、PMEL、ROR2、VEGFR2、AFP、EphA2、PSCA、EPCAM、EGFR、PSMA、EGFRvIII、GPC3、CEA、GD2、NY-ESO-1、TCL1、间皮素(mesothelin)或BAFF-R抗原结合区。在特别的方面，所述CAR包含CD19抗原结合区。
在某些方面，所述组合物包含至少5千万、1亿、2亿、5亿、7.5亿、10亿、20亿、30亿、40亿、50亿、60亿、70亿、80亿、90亿、或100亿个免疫细胞，包括T细胞、先天淋巴样细胞、NK细胞或其混合物。
在另外的方面，所述免疫细胞包含至少一种安全开关。在一些方面，所述安全开关为截短的EGFR(例如，缺乏结构域1和2的EGFR)。在一些方面，所述免疫细胞(T细胞、先天淋巴样细胞和/或NK细胞)表达IL-2、IL-15、其他生长或分化因子或者其组合。
在一些方面，所述细胞保持增殖速率至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或其之间的任何范围。在某些方面，所述免疫细胞具有增强的抗肿瘤细胞毒性、体内增殖、体内持久性和/或经改善的功能。
在另一个实施方案中，提供了用于产生本发明实施方案的T细胞、先天淋巴样细胞或NK细胞的方法，其包括将编码BCL6和促进细胞存活的基因的载体引入至所述细胞。在一些方面，所述促进细胞存活的基因为抗凋亡的B-细胞淋巴瘤2(BCL-2)家族基因。在一些方面，所述抗凋亡的BCL-2家族基因为BCL2L1(Bcl-xL)、BCL-2、MCL1、BCL2L2(Bcl-w)、BCL2A1(Bfl-1)、BCL2L10(BCL-B)。在特别的方面，所述抗凋亡的BCL-2家族基因为Bcl-xL。在某些方面，所述载体将BCL6和Bcl-xL与2A序列相连接。在特别的方面，所述2A序列为T2A序列。
在一些方面，所述载体为慢病毒载体。在某些方面，引入包括在IL-2和/或其他生长因子存在下用慢病毒载体转导所述细胞。在某些方面，IL-2处于10IU/mL至1000IU/mL，例如10-50IU/mL、50-75IU/mL、75-100IU/mL、100-250IU/mL、250-500IU/mL、500-750IU/mL或750-1000IU/mL的浓度。在特别的方面，IL-2处于100、200、300、400或500IU/mL的浓度。
在另外的方面，所述方法进一步包括用CD3和CD28激活所述T细胞。在一些方面，所述方法进一步包括在IL-2和/或IL-15存在下培养所述细胞。在某些方面，所述IL-2和/或IL-15以10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、150ng/mL或200ng/mL的浓度存在。在一些方面，将所述细胞培养至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月(或其之间的任何范围)，而基本上没有增殖速率的下降。
在进一步的方面，所述方法进一步包括对T细胞亚类进行分选。在特别的方面，所述T细胞亚类包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和/或γδT细胞。
实施方案包括包含本发明实施方案的细胞群体(例如，经改造以表达B-细胞淋巴瘤6(BCL6)和促进细胞存活的基因的免疫细胞)的组合物，其用于治疗免疫相关病症、感染性疾病和/或癌症。
实施方案涉及在受试者中治疗疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明实施方案的免疫细胞(例如，经改造以表达B-细胞淋巴瘤6(BCL6)和促进细胞存活的基因的免疫细胞)。
在一些方面，所述疾病或病症为感染性疾病、癌症和/或免疫相关病症。在某些方面，所述免疫相关病症为自身免疫性病症、移植物抗宿主病、同种异体移植物排斥或其他炎性状况。在一些方面，所述免疫细胞是同种异体的。在特别的方面，所述免疫相关病症为癌症。例如，所述癌症为实体癌或血液学恶性肿瘤。
在另外的方面，所述方法进一步包括施用至少第二治疗性试剂。在一些方面，所述至少第二治疗性试剂包括化学疗法、免疫疗法、外科手术、放射疗法、药物疗法、激素疗法、生物疗法或其组合。
本发明的其他目标、特征和优点将会从下面的详细描述中变得明显。但是，应当理解，所述详细描述和具体的实施例(尽管指明了本发明的优选实施方案)仅以举例说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围之内的各种变化和修饰将会从该详细描述中对于本领域技术人员来说变得明显。
附图简述
下面的附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。可以通过参考这些附图中的一个或多个以及与之相组合的在本文中所呈现的特定实施方案的详细描述来更好地理解本发明。
图1A-1G：(图1A)包含由人PGK启动子驱动的BCL6-T2A-BCL-xL基因的慢病毒载体的图谱。(图1B)图解说明了无限T细胞系的增殖速率的图。左上图版显示了在第2个月时在400IU/mL的IL-2存在下In1-L4a(无限CD3T细胞)和Ie1-L4aJ3(无限CD8 CAR-T)的生长曲线。右上图版显示了在100ng/mL的IL-15、IL-7和IL-21存在下或者在没有细胞因子存在下无限CD8 CAR T细胞(Ie1-L4aJ3)的生长曲线。数据显示，无限T细胞在IL-15存在下生长，但是在IL-7、IL-21存在下或者在没有细胞因子存在下不生长。左下和右下图版显示，无限T细胞(包括CD4无限αβT细胞、CD8无限αβT细胞(Ie1-L4a)、CD8无限αβCAR-T细胞(Ie1-L4aJ3)、无限γδT细胞(Igd1-L4a)和无限γδCAR-T细胞(Igd1-L4aJ3))在第5个月时在IL-2存在下继续在体外增殖。(图1C)图解说明了通过CD3、CD4、CD8、CD16、CD56、TCRαβ和TCRγδ的表达所测定的无限T细胞系In1-L4a的表型的图。(图1D)图解说明了通过使用抗-TCRγδ抗体的经分选的γδT细胞的表型的图。显示了在这些细胞上TCRγδ、TCRαβ和CD16的表达。(图1E)图解说明了通过使用抗-TCRγ9和抗-TCRδ2抗体的经分选的γδT细胞的主要亚类的图。大多数的无限γδT细胞对于TCRγ9δ2来说是阳性的。(图1F)图解说明了在第4个月时无限T细胞的表型的图。它们中的大多数是效应和中枢记忆T细胞，其主要表达IFNγ、粒酶B和穿孔蛋白。(图1G)图解说明了在无限CAR-T细胞上的各种共抑制受体的表达的图。
图2A-2E：(图2A)包含抗-CD19 CAR和截短的人EGFR表达盒的慢病毒载体pJ3的图谱。(图2B)图示了通过慢病毒载体pJ3进行转导的Ie1-L4aJ3(无限CD8 CART)和In1-L4aJ3(无限CD3CART)的CAR阳性百分比的图。所述CAR阳性百分比在转导后10天使用标记有FITC的人CD19蛋白或抗-EGFR抗体通过流式细胞术来测定。(图2C)图解说明了In1-L4aJ3(无限CD3CART)的CAR阳性细胞的百分比的图。tEGFR用标记有AF647的西妥昔单抗进行染色，抗-CD19 CAR用标记有FITC的重组人CD19蛋白进行染色。(图2D)图解说明了在分选之前和之后In1-L4aJ3(无限CD3CART)的CAR阳性细胞的百分比的图。tEGFR用AF647-西妥昔单抗进行染色，抗-CD19 CAR用标记有FITC的重组人CD19蛋白进行染色。
图3：图解说明了在12-孔平板中以0.2:1和1:1比例的效应子:靶标(E:T)比例Ie1-L4aJ3(无限CD8 CART)针对Raji和Nalm6细胞的体外细胞毒性的图。将Ie1-L4aJ3(无限CD8CART)细胞或对照Ie1-L4a(没有CAR的无限CD8 T细胞)细胞与Raji或Nalm6细胞一起共培养5天。显示了在第0、1、3和5天在共培养物中肿瘤细胞的百分比。
图4：图解说明了在扩增4个月后无限T细胞的体外细胞毒性的图。在12-孔平板中在IL-15存在下以3:1的效应子:靶标(E:T)比例将Ie1-L4a(无限CD8 T细胞)、Ie1-L4aJ3(无限CD8 CART)、Igd1-L4a(无限γ/δT细胞)或Igd1-L4aJ3(无限γδCAR-T细胞，CAR-T百分比>90％)细胞与Daudi或Nalm6细胞一起共培养7天。显示了在第0、1、2、4和7天在共培养物中肿瘤细胞的百分比。这些结果暗示：1)CD8无限CAR-T和γδ无限CAR-T细胞甚至在长期体外培养和扩增后仍保持特异性的细胞毒性；和2)没有CAR但是具有内源性γ9δ2TCR或具有其他TCR的γδ无限T细胞可以诱导可能通过γδTCR介导的某些类型的肿瘤细胞的裂解。例如，Daudi细胞可以被没有CAR的γδ无限T细胞杀伤，而Nalm-6仅可以被用CAR进行转导的γδ无限T细胞杀伤。除了一些淋巴瘤肿瘤细胞外，还知道一些骨髓瘤细胞系和其他癌细胞系被γδT细胞杀伤。
图5A-5C：(图5A)在IL-2存在下具有或没有抗-CD19 CAR的无限T细胞(CD4+CD8或CD8)的生长速率。(图5B)无限T细胞具有CD4和CD8 T细胞的混合物(左图版)，并且可以被分选至高纯度，如对于CD8无限T细胞所显示的(右图版)。(图5C)然后，将培养6个月的无限T细胞在没有IL-2(显示)或IL-15(未显示)的情况下进行温育。细胞数目在6天内迅速下降，这暗示甚至在长期体外培养后也没有无限T细胞的自主生长或恶性转化的证据。
图6A-6B：(图6A)按照制造商的说明书，通过使用TRAPeze端粒酶活性检测试剂盒来在无限T细胞或外周血单核细胞(PBMC)中测定端粒酶活性。(图6B)通过RNAseq分析所测定的在无限T细胞或相应的PBMC样品中作为热图显示的与端粒酶活性相关的基因。这些结果暗示，无限T细胞具有非常高的端粒酶活性。
图7A-7D：(图7A)将具有或没有抗-CD19 CAR的无限T细胞或者通过常规方法从外周血T细胞生成的CAR T细胞用CellTrace FarRed进行标记，和将Daudi肿瘤细胞用CellTrace Violet进行标记，并且以1:1的效应子:靶标比例进行共培养。在3、5和7天后测定活肿瘤细胞百分比(右下门)。还经由流式细胞术通过使用CountBright Absolute计数珠粒(ThermoFisher Scientific)来计算活肿瘤细胞的绝对数目，并且所述结果与所显示的活肿瘤细胞的百分比相一致。(图7B)将具有或没有抗-CD19 CAR的无限T细胞与NALM-6B细胞白血病细胞一起以1:1进行共培养。在6小时后通过CD107a染色来测定脱粒。这些结果暗示，表达CAR的无限T细胞是高度细胞毒性的并且响应于B-细胞肿瘤而脱粒。(图7C和图7D)通过流式细胞术就所显示的标志物来测定抗-CD19无限CAR T细胞的表型。抗-CD19CAR表达通过用经荧光标记的重组人CD19-Fc蛋白进行染色来进行测定。结果显示，无限T细胞不表达高水平的常规的衰竭标志物，例如CTLA-4、PD-1、TIM-3、CD160或2B4(CD244)。
图8A-8D：通过RNAseq分析所测定的在无限T细胞或相应的PBMC样品中作为热图显示的与T细胞亚类(图8A)、衰竭标志物(图8B)、趋化因子受体(图8C)和衰老标志物(图8D)相关的基因或基因签名。
图9A-9C：通过RNAseq分析所测定的在无限T细胞或相应的PBMC样品中作为热图显示的与趋化因子表达(图9A)、细胞因子表达(图9B)和细胞因子受体(图9C)相关的基因。
图10A-10C：(图10A)将无限T细胞或经CAR转导的T细胞解冻，并且通过抗-EGFR抗体染色来测定抗-CD19 CAR的表达。(图10B)在解冻和与IL-2一起体外培养后抗-CD19无限CAR T细胞的生长速率。显示了在不同天数时在培养物中的细胞数目。(图10C)在4天的在无限T细胞和NALM-6肿瘤细胞之间的1:1共培养后，如在图7A下所描述那样测定在A中解冻的细胞的细胞毒性活性。门显示了活肿瘤细胞百分比。
图11：通过流式细胞术就所显示的标志物来测定无限γδT细胞(下图)的表型，并且将其与来自健康供者PBMC的相应的γδT细胞(上图)进行比较。结果显示，无限γδT细胞不表达高水平的常规的衰竭标志物。
图12：在第1和3天以腹膜内方式(i.p.)注射经萤光素酶标记的无限T细胞，具有或没有IL-15注射。通过生物发光成像(BLI)对T细胞数目进行成像。结果显示，IL-15促进体内无限T细胞的生长和扩增。
图13：连同具有或没有抗-CD19 CAR的无限T细胞一起将经萤光素酶标记的NALM-6细胞注射到NSG小鼠中，+/-IL-15。通过BLI(左)和存活(右)来测定抗肿瘤效力。结果显示，抗-CD19无限CAR T细胞具有体内抗肿瘤效力。
图14：抗原特异性无限T细胞。通过使用具有已知的CD8 T-细胞表位的HLA-A2四聚体，就针对感染性疾病和肿瘤相关抗原的特异性测试了来自HLA-A2+供者的无限T细胞。数据显示了在无限T细胞中存在抗原特异性T细胞，其经由它们的内源性TCR来识别微生物和肿瘤相关抗原。
图15：EBV特异性无限T细胞的生成。在第0天用关于HLA-A2-结合性EBV肽的汇集物来刺激来自HLA-A2+供者的健康供者外周血单核细胞，并且CD137阳性的T细胞在24小时后通过流式细胞术来进行分选并且用于如以前所描述的那样通过转导BCL6和Bcl-xL来生成无限T细胞。在培养7周后，通过磁珠来富集四聚体阳性的细胞，然后将经富集的细胞再培养6周并且关于CD8和BMLF1-HLA-A2四聚体(其针对源自EBV-BMLF1蛋白的HLA-A2-结合性肽(GLCTLVAML)来说是特异性的)来进行染色。这些结果暗示，经富集的微生物或肿瘤抗原特异性无限CD4或CD8 T细胞群体可以通过使用所描述的方法来生成。
图16：在Tet-off安全开关的控制之下用BCL6和BCL2L1基因生成无限αβ或γδT细胞。显示了在1μg/mL的多西环素(Dox)不存在(左)或存在(右)下具有IL-2的无限T细胞的生长速率。结果暗示，无限T细胞在多西环素不存在下保持其生长速率，但是在多西环素存在下停止增殖并且经历逐渐的细胞死亡。类似的tet-off安全开关也可以用于控制掺入到无限T细胞中的IL-2或IL-15细胞因子基因。
图17：在浓度渐增的多西环素(Dox)存在或不存在下与IL-2一起培养具有tet-off安全开关的无限T细胞，并且通过光学显微术来对培养物中的细胞进行成像。还在2周后对细胞进行染色以通过流式细胞术来评估CD25表达。通过光学显微术成像，发现无限T细胞随着浓度渐增的多西环素而出现大小逐渐减小，连同具有增殖簇的减小。另外，CD25表达在多西环素存在下明显降低。
图18：在1μg/mL的多西环素(Dox)存在或不存在下与IL-2一起培养具有tet-off安全开关的无限T细胞，并且在2周后对细胞进行染色以通过流式细胞术来对所示的表面标志物进行评估。PD-1表达在多西环素存在下明显增加。
图19：通过无限T细胞的细胞因子产生。以5:1的效应子:靶标比例与NALM-6肿瘤细胞一起共培养具有或没有抗-CD19 CAR表达的无限T细胞(CD8+)。在3天后，在上清液中测量细胞因子水平。数据代表了来自源于三名不同健康供者的无限T细胞的结果。结果显示，具有抗-CD19 CAR(而非没有抗-CD19 CAR)的无限T细胞响应于NALM-6肿瘤细胞而主要产生显著量的IL-2、GM-CSF、IFNγ、IL-5和IL-17。响应于肿瘤细胞由抗-CD19无限CAR T细胞进行的TNFα、IL-4、IL-6、IL-10或IL-13的产生是极小的，或者没有显著不同于没有CAR表达的无限T细胞。但是，我们观察到，具有或没有CAR表达的无限T细胞在肿瘤细胞存在或不存在下产生大量的IL-4，超过了10,000pg/mL(图19和未显示的数据)。
图20：经由依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的通过西妥昔单抗的无限CART细胞的裂解。表达抗-CD19 CAR和tEGFR的无限T细胞用CFSE进行标记，并且一式两份地在5μg/mL的西妥昔单抗或利妥昔单抗存在下以所示的效应子:靶标比例在具有或没有源自健康供者的NK细胞的情况下进行共培养。在5小时后，使用计数珠粒通过流式细胞术在每个孔中测定无限T细胞的绝对数目，并且计算相比于单独的T细胞而言无限T细胞数目的下降百分比并且显示在该图中。在NK细胞不存在下具有西妥昔单抗或利妥昔单抗的T细胞的下降百分比<5％。
图21A-21C：具有BCL6和BCL2L1基因或者BCL6和BIRC5(存活蛋白)基因和Tet-off安全开关和IL-15的无限T细胞的生成。(图21A)具有BCL6和BCL2L1基因或者BCL6和BIRC5基因、Tet-off安全开关和IL-15基因的慢病毒构建体的设计。(图21B)将人T细胞用在图版A中所显示的构建体以慢病毒方式进行转导，并且在IL-2存在下进行培养。在12周后测定在相似条件下的体外培养期间通过这两种方法生成的T细胞的生长速率。(图21C)用在在图版A中所显示的包含BCL6和BCL2L1基因的慢病毒构建体从两个供者生成无限T细胞，并且将其在1μg/mL的多西环素存在或不存在下与IL-2一起进行培养。所述细胞在多西环素不存在下以指数速率进行生长，但是在多西环素存在下停止增殖并且经历逐渐的细胞死亡。
图22：包含BCL6以及Bcl-xl的构建体的一个例子(L5x(MSCV-BCL6-P2A-BCL-xl-T2A-rtTA))。所述结构至少包括通过P2A元件与BCL-xL分隔开的野生型BCL-6，并且BCL-xL通过T2A元件与rtTA(Tet on反式激活物)分隔开。
图23：包括至少用于表达BCL6的构建体的特别实施方案的例子的图解说明。一些实施方案包括任何种类的shRNA，包括例如针对胱天蛋白酶9或BAK的shRNA。
举例说明性实施方案的描述
先前报道过人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的异位表达使正常T细胞永生化(Hooijberg等人,2000)。但是，已观察到，单独的hTERT的过表达对于T淋巴细胞永生化来说是不够的。事实上，通过这种方法生成的T细胞在一些时间后停止增殖(Migliaccio等人,2000)。本研究认为，在正常NK或T细胞中BCL6的表达可能停止其分化，并且促进细胞存活的基因(例如，抗凋亡的BCL-2家族基因，例如编码Bcl-xL蛋白的BCL2L1)的表达可能显著地延长其寿命，从而可能使它们永生化而同时保持其基本功能。
本公开内容的实施方案涉及具有相比于缺乏在本文中所涵盖的修饰的细胞而言显著地增加的寿命的细胞的组合物、产生和用途。在特别的实施方案中，所述细胞编码异源BCL6和一种或多种促存活基因(或抗凋亡基因或促进细胞存活的基因)，包括任何其基因产物具有抗凋亡功能的基因。作为例子，所述促存活基因可以为任何的BCL-2家族基因，包括BCL-xL、BCL-2、MCL-1或存活蛋白，仅作为例子。另外地或备选地，所述细胞具有一种或多种胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶-12、胱天蛋白酶-13、胱天蛋白酶-14或其组合)的表达抑制或表达敲除。在这样的例子中，用于敲低或敲除一种或多种胱天蛋白酶基因的DNA片段可以为shRNA表达盒。这些胱天蛋白酶基因也可以通过基因编辑方法(CRISPR、TALEN、锌指方法等)来敲除。因此，在特别的实施方案中，所述免疫细胞除了BCL6的过表达之外或者除了异源BCL6之外还包含胱天蛋白酶敲除以生成无限免疫细胞。所述细胞可以具有一种或多种促存活基因(或抗凋亡基因或促进细胞存活的基因)，并且还可以具有一种或多种胱天蛋白酶基因的敲低或敲除，在特别的情况下。
在某些实施方案中，本公开内容提供了用于产生不受限数目的无限免疫细胞的方法，所述无限免疫细胞具有显著地增加的寿命并且可以快速生长为大数目，例如用于过继免疫疗法。本方法提供了具有在至少一些情况下通过一次转导而无限期地扩增的能力的无限免疫细胞。本方法是非常便宜的并且可以在短的时间段(例如，一个月或更长)内生成不受限数目的免疫细胞。
在本文中所涵盖的这个平台和系统可以用于生成无限免疫细胞，例如无限T细胞，包括TCRαβ和TCRγδT细胞。该方法提供了人T细胞的不受限来源，所述人T细胞可以就这样进行使用或者可以进一步进行基因改造以产生所希望的细胞，包括现成的嵌合抗原受体(CAR)T细胞或经T细胞受体(TCR)转导的T细胞。在特别的实施方案中，将所述细胞用于治疗或预防癌症和其他疾病，包括感染性和炎性病症。作为例子，所述系统可以用于治疗癌症、感染性疾病和/或炎性疾病。特别的例子包括B-细胞淋巴瘤、CMV感染性疾病、EBV感染性疾病、自身免疫性病症、移植物抗宿主病或其组合。
作为一个例子，在本文中所涵盖的研究显示，将抗-CD19 CAR转导入无限T细胞中生成“抗-CD19无限CAR T细胞”(CD19 inCART)并且将其特异性更改至针对人B细胞肿瘤。所述CD19无限CAR T细胞可以充当用于在仅一次转导后生成不受限数目的经抗原受体修饰的T细胞(例如CAR T细胞)的来源，并且展现出显著的针对人B细胞淋巴瘤细胞系的细胞毒性。本公开内容提供了现成免疫细胞疗法平台和系统，其可以产生不受限数目的免疫细胞并且可以通过使制备过程合理化而大大减少过继免疫细胞疗法的成本和生产时间。特别的实施方案允许通过表达BCL6和一种或多种促存活基因(或抗凋亡基因或促进细胞存活的基因)来生成无限细胞，其作为现成细胞起作用以用于进一步操作从而用于过继细胞疗法，例如通过掺入经改造的目的抗原受体(例如，对于特定癌症而定制的)来进行的进一步操作。所述现成细胞也可以已经包括一种或多种安全开关(包括，例如可诱导系统以及消除基因，例如截短的EGFR(作为一个例子，缺乏结构域1和/或结构域2))和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子，或者这些中的任一种可以稍后在步骤中添加以使所述细胞适应调整为具有所希望的特性。
I.定义
如在本文中所使用的，关于指定组分，“基本上不含”在本文中用于意指，所述指定组分中没有一种被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由于组合物的任何无意污染而引起的所述指定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选地是这样的组合物，在其中用标准分析方法不能检测到所述指定组分的量。
如在本说明书中所使用的，“a”或“an”可以意指一个(种)或多个(种)。如在本权利要求书中所使用的，当与单词“包含(括)”联合使用时，单词“a”或“an”可以意指一个(种)或多于一个(种)。本公开内容的一些实施方案可以由或基本上由本公开内容的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。考虑了在本文中所描述的任何方法或组合物可以相关于在本文中所描述的任何其他方法或组合物来实施，并且不同的实施方案可以相组合。
在权利要求书中使用术语“或(者)”用于意指“和/或”，除非明确指出是指仅备选项或者备选项是相互排斥的，虽然本公开内容支持是指仅备选项和“和/或”的定义。例如，“x、y和/或z”可以是指单独的“x”，单独的“y”，单独的“z”，“x、y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)”，或者“x或y或z”。特别考虑了，将x、y或z可以特别地被从实施方案中排除。如在本文中所使用的，“另一个(种)”可以意指至少第二个(种)或更多个(种)。术语“大约”、“实质上”和“大致”通常意指所叙述的值±5％。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则单词“包含”、“包括”和“含有”将会被理解为暗示包括所叙述的步骤或要素或者步骤或要素的群组，但是不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的群组。“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”后面的无论什么。因此，短语“由...组成”表明，所列出的要素是必需的或强制性的，并且不可以存在其他要素。“基本上由...组成”意味着包括在该短语后列出的任何要素，并且限于不干扰或有贡献于在本公开内容中对于所列出的要素所详细说明的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由...组成”表明，所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是任选的并且可以存在或不存在，取决于它们是否影响所列出的要素的活性或作用。
在整个本说明书中提及“一个实施方案”、“(一个)实施方案”、“(一个)特别的实施方案”、“(一个)相关的实施方案”、“某一实施方案”、“(一个)另外的实施方案”或“(一个)进一步的实施方案”或其组合意指，与所述实施方案相联系地描述的特别的特点、结构或特征被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，前述短语在整个本说明书中的各种地方中的出现不必须都是指相同的实施方案。此外，可以将所述特别的特点、结构或特征以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。
“免疫病症”、“免疫相关病症”或“免疫介导的病症”是指其中免疫应答在所述疾病的发展或进展中发挥关键作用的病症。免疫介导的病症包括自身免疫性病症、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病以及炎性和变应性状况。
“免疫应答”是免疫系统的细胞(例如，B细胞，或T细胞，或先天免疫细胞)对于刺激的应答。在一个实施方案中，所述应答对于特定抗原来说是特异性的(“抗原特异性应答”)。
“自身免疫性疾病”是指这样的疾病，其中免疫系统针对作为正常宿主的一部分的抗原(即，自身抗原)产生免疫应答(例如，B细胞或T细胞应答)，结果是对组织的损伤。自身抗原可以源自宿主细胞，或者可以源自通常定殖于粘膜表面的共生生物例如微生物(称为共生生物)。
疾病或状况的“治疗”是指执行这样的计划方案，其可以包括向患者施用一种或多种药物，以努力减轻该疾病的征候或症状。可希望的治疗效果包括降低疾病进展的速率，改善或缓和疾病状态，和缓解或经改善的预后。减轻可以在该疾病或状况的征候或症状出现之前以及在其出现之后发生。因此，“治疗”可以包括“预防”疾病或不希望的状况。另外，“治疗”不要求征候或症状的完全减轻，不要求治愈，并且特别地包括对于患者仅具有边缘效应的计划方案。
如在整个本申请中所使用的，术语“治疗益处”或“在治疗上有效的”是指关于该状况的医学处理而言促进或增强受试者的康宁的任何事物。这包括但不限于疾病的征候或症状的频率或严重度的减小。例如，癌症的治疗可以涉及例如肿瘤大小的减小、肿瘤侵袭性的减小、癌症生长速率的减小或者移的防止。癌症的治疗也可以是指延长具有癌症的受试者的存活。
“受试者”和“患者”和“个体”可以是可互换的，并且可以是指人或非人，例如灵长类、哺乳动物和脊椎动物。在特别的实施方案中，所述受试者为人。所述受试者可以为作为方法或材料的目标的任何生物或动物受试者，包括哺乳动物，例如人、实验室动物(例如，灵长类、大鼠、小鼠、兔子)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家庭宠物(例如，狗、猫和啮齿类)、马和转基因非人动物。所述受试者可以为患者，其例如具有或被怀疑具有疾病(其可以被称为医学状况)，例如一种或多种感染性疾病、一种或多种遗传病症、一种或多种癌症或者其任何组合。如在本文中所使用的，“受试者”或“个体”可以住在或可以不住在医疗机构中，并且可以作为医疗机构的门诊患者来进行治疗。所述个体可以正经由互联网接受一种或多种医学组合物。个体可以包括任何年龄的人或非人动物，并且因此包括成体和幼体(例如，儿童)和婴儿并且包括子宫内个体。受试者可以或可以不具有对于医学处理的需要；个体可以自愿地或非自愿地是实验(无论是临床的，还是支持基础科学研究的)的一部分。
短语“药用的或在药理学上可接受的”是指这样的分子实体和组合物，其在当施用给动物例如人(适当时)时不产生不利的、变应性的或其他麻烦的反应。鉴于本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药用组合物的制备将会是本领域技术人员已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，将会理解的是，制备物应当符合由FDA生物标准局所要求的无菌度、致热性、一般安全和纯度标准。
如在本文中所使用的，“在药学上可接受的承载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水，醇性/水性溶液，盐水溶液，肠胃外载料，例如氯化钠、林格氏葡萄糖溶液等)、非水性溶剂(例如，丙二醇，聚乙二醇，植物油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌试剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗试剂、吸收延迟试剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解试剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、液体和营养物补充剂，此类相似材料及其组合，如本领域普通技术人员将会已知的。在药用组合物中各种组分的pH和精确浓度按照众所周知的参数来进行调整。
II.无限免疫细胞
本公开内容的某些实施方案涉及经改造以表达一种或多种基因的免疫细胞。所述一种或多种基因的表达直接地或间接地导致所述细胞的相比于缺乏所述一种或多种基因的表达的细胞而言增加的寿命。在特别的实施方案中，对所述细胞进行操作以表达所述一种或多种基因，包括一种或多种异源基因。在其他情况下，对所述细胞进行操作以具有对于所述细胞来说内源的所述一种或多种基因的表达的上调，例如通过操作所述一种或多种对于所述细胞来说内源的基因的一种或多种调控元件。
在特别的实施方案中，对免疫细胞进行操作以表达BCL6和一种或多种促存活基因或抗凋亡基因或促进细胞存活的基因(并且在被归类为促存活的或抗凋亡的或促进细胞存活的基因中可以存在或不存在重叠)。如在本文中所使用的，所述促存活基因是指能够发挥抗凋亡功能或通过任何机制促进存活的核酸聚合物。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以为Bcl2家族基因中的一种或多种，例如BCL-xL、BCL-2、MCL-1、Bcl-w、Bfl-1、BCL-B等。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以为凋亡抑制剂(IAP)家族基因中的一种或多种，例如XIAP、c-IAPl、C-IAP2、NAIP和存活蛋白等。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以能够抑制或敲除一种或多种在凋亡中发挥作用的胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶-12、胱天蛋白酶-13、胱天蛋白酶-14)的表达。用于敲低或敲除的核酸聚合物可以为shRNA表达盒，或者这些胱天蛋白酶基因也可以通过基因编辑方法(CRISPR、TALEN、锌指方法等)来敲除。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以能够抑制或敲除一种或多种促凋亡基因(例如，BIM、Puma、Noxa、Bik、Bmf、Bad、Hrk、Bid、BAX、BAK、BOK等)的表达。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以具有抗凋亡效应，例如胰岛素样生长因子(IGF-1)、Hsp70、Hsp27、cFLIP、BNIP3、FADD、Akt和NF-κB、Raf-1和MEK1、p90Rsk、C-Jun、BNIP2、BAG1、HSPA9、HSP90B1、miRNA21、miR-106b-25、miR-206、miR-221/222、miR-17-92、miR-133、miR-143、miR-145、miR-155、miR-330等。
无限T细胞可以用野生型或突变型BCL6来生成。发明人确定，无限T细胞可以用野生型BCL6或突变型BCL6(具有单个特定核苷酸差异–在野生型BCL6中的位置395处的氨基酸的密码子为CCT(编码脯氨酸/P)和在突变型BCL6中的位置395处的氨基酸的密码子为CTT(编码亮氨酸/L))来生成。关于这两个BCL6基因的核苷酸和氨基酸序列显示在下面(在野生型序列中的突变点加有下划线)。
野生型BCL6的aa序列：
MASPADSCIQFTRHASDVLLNLNRLRSRDILTDVVIVVSREQFRAHKTVLMACSGLFYSIFTDQLKCNLSVINLDPEINPEGFCILLDFMYTSRLNLREGNIMAVMATAMYLQMEHVVDTCRKFIKASEAEMVSAIKPPREEFLNSRMLMPQDIMAYRGREVVENNLPLRSAPGCESRAFAPSLYSGLSTPPASYSMYSHLPVSSLLFSDEEFRDVRMPVANPFPKERALPCDSARPVPGEYSRPTLEVSPNVCHSNIYSPKETIPEEARSDMHYSVAEGLKPAAPSARNAPYFPCDKASKEEERPSSEDEIALHFEPPNAPLNRKGLVSPQSPQKSDCQPNSPTESCSSKNACILQASGSPPAKSPTDPKACNWKKYKFIVLNSLNQNAKPEGPEQAELGRLSPRAYTAPPACQPPMEPENLDLQSPTKLSASGEDSTIPQASRLNNIVNRSMTGSPRSSSESHSPLYMHPPKCTSCGSQSPQHAEMCLHTAGPTFPEEMGETQSEYSDSSCENGAFFCNECDCRFSEEASLKRHTLQTHSDKPYKCDRCQASFRYKGNLASHKTVHTGEKPYRCNICGAQFNRPANLKTHTRIHSGEKPYKCETCGARFVQVAHLRAHVLIHTGEKPYPCEICGTRFRHLQTLKSHLRIHTGEKPYHCEKCNLHFRHKSQLRLHLRQKHGAITNTKVQYRVSATDLPPELPKAC(SEQ ID NO:1)。
野生型BCL6的核苷酸序列(关于在野生型序列中的突变点的密码子加有下划线)：
ATGgcctcgccggctgacagctgtatccagttcacccgccatgccagtgatgttcttctcaaccttaatcgtctccggagtcgagacatcttgactgatgttgtcattgttgtgagccgtgagcagtttagagcccataaaacggtcctcatggcctgcagtggcctgttctatagcatctttacagaccagttgaaatgcaaccttagtgtgatcaatctagatcctgagatcaaccctgagggattctgcatcctcctggacttcatgtacacatctcggctcaatttgcgggagggcaacatcatggctgtgatggccacggctatgtacctgcagatggagcatgttgtggacacttgccggaagtttattaaggccagtgaagcagagatggtttctgccatcaagcctcctcgtgaagagttcctcaacagccggatgctgatgccccaagacatcatggcctatcggggtcgtgaggtggtggagaacaacctgccactgaggagcgcccctgggtgtgagagcagagcctttgcccccagcctgtacagtggcctgtccacaccgccagcctcttattccatgtacagccacctccctgtcagcagcctcctcttctccgatgaggagtttcgggatgtccggatgcctgtggccaaccccttccccaaggagcgggcactcccatgtgatagtgccaggccagtccctggtgagtacagccggccgactttggaggtgtcccccaatgtgtgccacagcaatatctattcacccaaggaaacaatcccagaagaggcacgaagtgatatgcactacagtgtggctgagggcctcaaacctgctgccccctcagcccgaaatgccccctacttcccttgtgacaaggccagcaaagaagaagagagaccctcctcggaagatgagattgccctgcatttcgagccccccaatgcacccctgaaccggaagggtctggttagtccacagagcccccagaaatctgactgccagcccaactcgcccacagagtcctgcagcagtaagaatgcctgcatcctccaggcttctggctcccctccagccaagagccccactgaccccaaagcctgcaactggaagaaatacaagttcatcgtgctcaacagcctcaaccagaatgccaaaccagaggggcCtgagcaggctgagctgggccgcctttccccacgagcctacacggccccacctgcctgccagccacccatggagcctgagaaccttgacctccagtccccaaccaagctgagtgccagcggggaggactccaccatcccacaagccagccggctcaataacatcgttaacaggtccatgacgggctctccccgcagcagcagcgagagccactcaccactctacatgcaccccccgaagtgcacgtcctgcggctctcagtccccacagcatgcagagatgtgcctccacaccgctggccccacgttccctgaggagatgggagagacccagtctgagtactcagattctagctgtgagaacggggccttcttctgcaatgagtgtgactgccgcttctctgaggaggcctcactcaagaggcacacgctgcagacccacagtgacaaaccctacaagtgtgaccgctgccaggcctccttccgctacaagggcaacctcgccagccacaagaccgtccataccggtgagaaaccctatcgttgcaacatctgtggggcccagttcaaccggccagccaacctgaaaacccacactcgaattcactctggagagaagccctacaaatgcgaaacctgcggagccagatttgtacaggtggcccacctccgtgcccatgtgcttatccacactggtgagaagccctatccctgtgaaatctgtggcacccgtttccggcaccttcagactctgaagagccacctgcgaatccacacaggagagaaaccttaccattgtgagaagtgtaacctgcatttccgtcacaaaagccagctgcgacttcacttgcgccagaagcatggcgccatcaccaacaccaaggtgcaataccgcgtgtcagccactgacctgcctccggagctccccaaagcctgc(SEQ ID NO:2)。
突变型BCL6的aa序列(亮氨酸突变加有下划线)：
MASPADSCIQFTRHASDVLLNLNRLRSRDILTDVVIVVSREQFRAHKTVLMACSGLFYSIFTDQLKCNLSVINLDPEINPEGFCILLDFMYTSRLNLREGNIMAVMATAMYLQMEHVVDTCRKFIKASEAEMVSAIKPPREEFLNSRMLMPQDIMAYRGREVVENNLPLRSAPGCESRAFAPSLYSGLSTPPASYSMYSHLPVSSLLFSDEEFRDVRMPVANPFPKERALPCDSARPVPGEYSRPTLEVSPNVCHSNIYSPKETIPEEARSDMHYSVAEGLKPAAPSARNAPYFPCDKASKEEERPSSEDEIALHFEPPNAPLNRKGLVSPQSPQKSDCQPNSPTESCSSKNACILQASGSPPAKSPTDPKACNWKKYKFIVLNSLNQNAKPEGLEQAELGRLSPRAYTAPPACQPPMEPENLDLQSPTKLSASGEDSTIPQASRLNNIVNRSMTGSPRSSSESHSPLYMHPPKCTSCGSQSPQHAEMCLHTAGPTFPEEMGETQSEYSDSSCENGAFFCNECDCRFSEEASLKRHTLQTHSDKPYKCDRCQASFRYKGNLASHKTVHTGEKPYRCNICGAQFNRPANLKTHTRIHSGEKPYKCETCGARFVQVAHLRAHVLIHTGEKPYPCEICGTRFRHLQTLKSHLRIHTGEKPYHCEKCNLHFRHKSQLRLHLRQKHGAITNTKVQYRVSATDLPPELPKAC(SEQ ID NO:3)。
突变型BCL6的核苷酸序列(关于亮氨酸的密码子加有下划线)：
ATGgcctcgccggctgacagctgtatccagttcacccgccatgccagtgatgttcttctcaaccttaatcgtctccggagtcgagacatcttgactgatgttgtcattgttgtgagccgtgagcagtttagagcccataaaacggtcctcatggcctgcagtggcctgttctatagcatctttacagaccagttgaaatgcaaccttagtgtgatcaatctagatcctgagatcaaccctgagggattctgcatcctcctggacttcatgtacacatctcggctcaatttgcgggagggcaacatcatggctgtgatggccacggctatgtacctgcagatggagcatgttgtggacacttgccggaagtttattaaggccagtgaagcagagatggtttctgccatcaagcctcctcgtgaagagttcctcaacagccggatgctgatgccccaagacatcatggcctatcggggtcgtgaggtggtggagaacaacctgccactgaggagcgcccctgggtgtgagagcagagcctttgcccccagcctgtacagtggcctgtccacaccgccagcctcttattccatgtacagccacctccctgtcagcagcctcctcttctccgatgaggagtttcgggatgtccggatgcctgtggccaaccccttccccaaggagcgggcactcccatgtgatagtgccaggccagtccctggtgagtacagccggccgactttggaggtgtcccccaatgtgtgccacagcaatatctattcacccaaggaaacaatcccagaagaggcacgaagtgatatgcactacagtgtggctgagggcctcaaacctgctgccccctcagcccgaaatgccccctacttcccttgtgacaaggccagcaaagaagaagagagaccctcctcggaagatgagattgccctgcatttcgagccccccaatgcacccctgaaccggaagggtctggttagtccacagagcccccagaaatctgactgccagcccaactcgcccacagagtcctgcagcagtaagaatgcctgcatcctccaggcttctggctcccctccagccaagagccccactgaccccaaagcctgcaactggaagaaatacaagttcatcgtgctcaacagcctcaaccagaatgccaaaccagaggggcTtgagcaggctgagctgggccgcctttccccacgagcctacacggccccacctgcctgccagccacccatggagcctgagaaccttgacctccagtccccaaccaagctgagtgccagcggggaggactccaccatcccacaagccagccggctcaataacatcgttaacaggtccatgacgggctctccccgcagcagcagcgagagccactcaccactctacatgcaccccccgaagtgcacgtcctgcggctctcagtccccacagcatgcagagatgtgcctccacaccgctggccccacgttccctgaggagatgggagagacccagtctgagtactcagattctagctgtgagaacggggccttcttctgcaatgagtgtgactgccgcttctctgaggaggcctcactcaagaggcacacgctgcagacccacagtgacaaaccctacaagtgtgaccgctgccaggcctccttccgctacaagggcaacctcgccagccacaagaccgtccataccggtgagaaaccctatcgttgcaacatctgtggggcccagttcaaccggccagccaacctgaaaacccacactcgaattcactctggagagaagccctacaaatgcgaaacctgcggagccagatttgtacaggtggcccacctccgtgcccatgtgcttatccacactggtgagaagccctatccctgtgaaatctgtggcacccgtttccggcaccttcagactctgaagagccacctgcgaatccacacaggagagaaaccttaccattgtgagaagtgtaacctgcatttccgtcacaaaagccagctgcgacttcacttgcgccagaagcatggcgccatcaccaacaccaaggtgcaataccgcgtgtcagccactgacctgcctccggagctccccaaagcctgc(SEQ ID NO:4)
所述免疫细胞可以为任何种类的免疫细胞，包括T细胞(例如，调节T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、αβT细胞、γδT细胞或其混合物)、NK细胞、不变NKT细胞、NKT细胞、先天淋巴样细胞或其混合物。所述免疫细胞可以是病毒特异性的，表达CAR，和/或表达TCR。在一些实施方案中，所述细胞为单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞(DC)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在本文中也提供了产生和改造所述免疫细胞的方法，以及使用和施用所述细胞以用于过继细胞疗法的方法，在这种情况下所述细胞可以是自体的或同种异体的。因此，所述免疫细胞可以用作免疫疗法，例如用于靶向癌细胞。这些免疫细胞可以作为单一细胞类型或作为多种免疫细胞类型的组合用于治疗。在特别的实施方案中，所述免疫细胞为CD3+、CD4+、CD8+、CD16+或其混合物。
所述免疫细胞可以分离自受试者，特别是人受试者。所述免疫细胞可以获得自目的受试者，例如被怀疑具有特定疾病或状况的受试者，被怀疑具有对特定疾病或状况的倾向的受试者，或者正经历对于特定疾病或状况的疗法的受试者。免疫细胞可以收集自它们在所述受试者中所位于的任何位置，包括但不限于血液、脐带血、脾、胸腺、淋巴结和骨髓。分离出的免疫细胞可以直接进行使用，或者可以将它们储存一段时间，例如通过冷冻。
所述免疫细胞可以从它们所位于的任何组织(包括但不限于，血液(包括通过血库或脐带血库收集的血液)、脾、骨髓、在外科手术程序期间移除和/或暴露的组织和经由活组织检查程序获得的组织)中富集/纯化。从其之中富集、分离和/或纯化所述免疫细胞的组织/器官可以分离自活的和非活的受试者，其中所述非活的受试者为器官捐赠者。在特别的实施方案中，所述免疫细胞分离自血液，例如外周血或脐带血。在一些方面，分离自脐带血的免疫细胞具有增强的免疫调节能力，例如通过CD4-或CD8-阳性T细胞抑制所测量的。在特别的方面，所述免疫细胞分离自汇集的血液，特别是汇集的脐带血，用于增强的免疫调节能力。所述汇集的血液可以来自2个或更多个来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多个来源(例如，供者受试者)。
所述免疫细胞群体可以获得自需要疗法或者罹患与降低的免疫细胞活性相关联的疾病的受试者。因此，所述细胞将会对于需要疗法的受试者来说是自体的。备选地，所述免疫细胞群体可以获得自供者，例如组织相容性部分或完全匹配的供者或者组织相容性完全不匹配的供者。所述免疫细胞群体可以收获自外周血、脐带血、骨髓、脾或者免疫细胞在所述受试者或供者中所位于的任何其他器官/组织。所述免疫细胞可以分离自受试者和/或供者的汇集物，例如分离自汇集的脐带血。
当所述免疫细胞群体获得自不同于所述受试者的供者时，所述供者可以是同种异体的，条件是所获得的细胞是受试者相容的，因为它们可以被引入到所述受试者中。同种异体供者细胞可以是或可以不是人白细胞抗原(HLA)相容的。
A.T细胞
在一些实施方案中，所述免疫细胞为T细胞。在过去的二十年中已经描述了用于功能性抗肿瘤效应细胞的衍生、激活和扩增的几种基本方法。这些包括：自体细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；离体激活的T细胞，通过使用自体DC或PBMC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或包被有T细胞配体和激活抗体的珠粒，或者依靠捕获靶细胞膜而分离出的细胞；天然地表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和经遗传重编程或“更改”以表达称为“T-抗体(T-body)”的展示出抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子的非肿瘤特异性自体或同种异体细胞。这些方法已引起了许多用于T细胞制备和免疫接种的计划方案，其可以用在本文中所描述的方法之中。
在一些实施方案中，所述T细胞源自血液、骨髓、淋巴、脐带或淋巴器官。在一些方面，所述细胞为人细胞。所述细胞典型地为原代细胞，例如直接分离自受试者和/或分离自受试者并经冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括一个或多个T细胞亚类或者其他细胞类型，例如整个T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞和其亚群，例如通过下列方面所定义的那些：功能，激活状态，成熟度，对于分化的潜力，扩增，再循环，定位，和/或持久能力，抗原特异性，抗原受体的类型，在特定器官或区室中的存在，标志物或细胞因子分泌特性谱，和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，例如对于现成技术，所述细胞是多能的和/或专项多能的，例如干细胞，例如诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试者中分离细胞，制备、加工、培养和/或改造它们，如在本文中所描述的，并且在冷冻保存之前或之后将它们重新引入到相同的患者中。
在T细胞的亚型和亚群(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)中包括幼稚T(TN)细胞，效应T细胞(TEFF)，记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T细胞(TSCM)、中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)或终末分化效应记忆T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，未成熟T细胞，成熟T细胞，辅助T细胞，细胞毒性T细胞，粘膜相关不变T(MAIT)细胞，天然出现的和适应性的调节T(Treg)细胞，辅助T细胞，例如TH1细胞，TH2细胞，TH3细胞，TH17细胞，TH9细胞，TH22细胞，滤泡辅助T细胞，α/βT细胞，和γ/δT细胞。
在一些实施方案中，使所述T细胞群体中的一种或多种富集或耗竭对于特定标志物(例如表面标志物)来说阳性的或者对于特定标志物来说阴性的细胞。在一些情况下，此类标志物为在某些T细胞群体(例如，非记忆细胞)上不存在或以相对低的水平表达，但是在某些其他T细胞群体(例如，记忆细胞)上存在或以相对更高的水平表达的那些。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(例如，B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物(例如，CD14)的负选择来将T细胞与PBMC样品分开。在一些方面，使用CD4+或CD8+选择步骤来分开CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。可以通过对于在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或相对较高程度表达的标志物的正或负选择来将此类CD4+和CD8+群体进一步分选成亚群。
在一些实施方案中，使CD8+ T细胞进一步富集或耗竭幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与各自亚群相关联的表面抗原的正或负选择。在一些实施方案中，进行关于中枢记忆T(TCM)细胞或干细胞记忆细胞的富集以增加效力，例如以改善在施用后的长期存活、扩增和/或移入，这在一些方面在此类亚群中是特别稳固的。
在一些实施方案中，所述T细胞为自体T细胞。在该方法中，肿瘤样品获得自患者，并且获得了单细胞悬浮液。所述单细胞悬浮液可以以任何合适的方式来获得，例如以机械方式(使肿瘤解聚，例如使用gentleMACSTM Dissociator,Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.)或以酶促方式(例如，胶原酶或DNA酶)。将肿瘤酶促消化物的单细胞悬浮液在白介素-2(IL-2)或其他生长因子中进行培养。
可以将经培养的T细胞汇集并且快速地扩增。快速扩增在大约10天至大约14天的时间段内提供至少大约50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或者更大)的抗原特异性T-细胞数目的增加。更优选地，快速扩增在大约10天至大约14天的时间段内提供至少大约200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更大)的增加。
扩增可以通过本领域中已知的许多方法中的任一种来完成。例如，可以在饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)(其中IL-2是优选的)存在下通过使用非特异性T-细胞受体刺激来快速地扩增T细胞。所述非特异性T-细胞受体刺激可以包括大约30ng/ml的OKT3，一种小鼠单克隆抗-CD3抗体(从Ortho-
Figure BDA0003604711340000261
Raritan,N.J.可得)。备选地，可以通过下述方式来快速地扩增T细胞：用所述癌症的一种或多种抗原(包括其抗原性部分，例如表位，或细胞)(其可以任选地从载体表达)(例如，人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽或者与其他MHC I类或II类分子相结合的肽)在T-细胞生长因子例如300IU/ml IL-2或IL-15(其中IL-2是优选的)存在下在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)。通过用在表达HLA-A2的抗原呈递细胞或表达其他HLA分子的抗原呈递细胞上脉冲的所述癌症的相同抗原进行再刺激来快速地扩增经体外诱导的T-细胞。也可以在抗原呈递细胞不存在下扩增经体外诱导的T-细胞。
所述自体T细胞可以进行修饰以表达促进所述自体T细胞的生长、分化和激活的T细胞生长或分化因子。合适的T细胞生长因子包括例如白介素(IL)-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IL-12。合适的修饰方法是本领域中已知的，参见例如Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y.2001；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。在特别的方面，经修饰的T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列(例如，IL-12的编码序列)在本领域中是容易地可得的，正如启动子那样，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接促进高水平表达。
B.NK细胞
在一些实施方案中，所述免疫细胞为天然杀伤(NK)细胞。NK细胞是淋巴细胞的一个亚群，其具有自发的针对各种各样的肿瘤细胞、被病毒感染的细胞以及在骨髓和胸腺中的一些正常细胞的细胞毒性。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟。NK细胞可以通过特异性的表面标志物(例如，在人中的CD16、CD56和/或CD8)来检测。NK细胞不表达T细胞抗原受体、泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白B细胞受体。
在某些实施方案中，通过本领域众所周知的方法从人外周血单核细胞(PBMC)、未刺激的白细胞去除术产物(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导型多能干细胞(iPSC)、骨髓、组织或脐带血衍生出NK细胞。
C.NKT细胞
天然杀伤T(NKT)细胞为异质的一组T细胞，其共享T细胞和天然杀伤细胞的特性。这些细胞中的许多识别非多态性CD1d分子，一种结合自身和外来脂质和糖脂的抗原呈递分子。它们仅构成所有外周血T细胞的大致0.1％。NKT细胞为共表达αβT-细胞受体，但是也表达各种各样的典型地与NK细胞(例如NK1.1)相关联的分子标志物的T细胞亚类。不变天然杀伤T(iNKT)细胞表达高水平的转录调节剂早幼粒细胞白血病锌指并且依赖该转录调节剂以用于其发育。目前，存在有五种主要的不同iNKT细胞亚类。这些亚类细胞一旦被激活就产生不同的一组细胞因子。亚型iNKT1、iNKT2和iNKT17反映了在细胞因子产生中的Th细胞亚类。另外，存在有在T滤泡辅助样功能和IL-10依赖性调控功能方面特化的亚型。
D.先天淋巴样细胞
先天淋巴样细胞(ILC)是一组源自共同淋巴样祖细胞(CLP)并且属于淋巴谱系的先天免疫细胞。这些细胞通过因为缺乏重组激活基因(RAG)而不存在抗原特异性B或T细胞受体来定义。ILC不表达髓样细胞或树突细胞标志物。它们在保护性免疫以及内环境稳定和炎症的调节中发挥作用，因此其失调可以导致免疫病理学状态，例如变态反应、支气管哮喘和自身免疫性疾病。ILC可以基于它们能够产生的细胞因子以及调控其发育和功能的转录因子来进行划分。
III.无限免疫细胞的产生
在一些方面，本公开内容提供了用于通过过表达BCL6和一种或多种促存活基因或抗凋亡基因或促进细胞存活的基因(包括一种或多种抗凋亡的BCL-2家族基因，例如Bxl-xL)来增加免疫细胞的寿命的方法。所述基因表达可以通过常规分子生物学方法来实现，例如通过在一种或多种病毒或非病毒载体中将BCL6和所述抗凋亡的BCL-2家族基因的编码序列克隆到组成性或诱导型启动子的下游并且将所述载体递送到免疫细胞中。备选地，所述基因表达可以通过使用CRISPR或其他转座酶来在免疫细胞中特异性地转录BCL6和所述抗凋亡的BCL-2家族基因的mRNA(作为一个例子)来实现。BCL6和/或所述抗凋亡的BCL-2家族成员(例如Bcl-xL)的表达可以是可调控的，包括可以为组成性或诱导型手段。在一些情况下，BCL6和/或所述抗凋亡的BCL-2家族成员的表达可以具有第一种类型的表达调控(例如，组成性的)，和在所述系统中的一种或多种其他基因的表达(例如，在同一个或另一个(些)载体上)可以以相同的方式(例如，组成性的)或者不同地(例如，诱导型的)来进行调控。在特别的情况下，BCL6-BCL-xL通过tet-off可调控机制或tet-on可调控机制来进行调控。
在一个示例性方法中，BCL6和Bcl-xL基因(仅作为例子)的编码序列可以相连接，但是通过允许最终产生分开的BCL6和Bcl-xL分子的元件分隔开。例如，BCL6和Bcl-xL基因的编码序列可以相连接，但是通过T2A序列分隔开，以生成一个开放阅读框，其可以同时表达BCL6和Bcl-xL基因。可以将该BCL6-T2A-Bcl-xL开放阅读框克隆到载体例如慢病毒载体中。然后，可以通过该病毒载体来转导所述免疫细胞(例如，T细胞)，例如在IL-2和/或IL-15存在下。该方法可以从健康供者T细胞生成称为“无限T细胞”的T细胞系，其可以在重组人IL-2和/或IL-15存在下增殖。在一些情况下，所述细胞在IL-2和/或IL-15存在下产生，并且所述细胞本身也表达异源IL-2和/或IL-15，虽然在其他情况下，使用这些参数中的仅一个。
自切割序列的例子如下：
T2A(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:5)
P2A(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:6)
E2A(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:7)
F2A(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:8)。
在另一些情况下，使用IRES元件代替2A序列。
在一些实施方案中，所述细胞经改造以表达BCL6-2A-BCLxL序列(SEQ ID NO:9)，其包含人BCL6、2A自切割肽和BCL-xl编码序列。
ATGgcctcgccggctgacagctgtatccagttcacccgccatgccagtgatgttcttctcaaccttaatcgtctccggagtcgagacatcttgactgatgttgtcattgttgtgagccgtgagcagtttagagcccataaaacggtcctcatggcctgcagtggcctgttctatagcatctttacagaccagttgaaatgcaaccttagtgtgatcaatctagatcctgagatcaaccctgagggattctgcatcctcctggacttcatgtacacatctcggctcaatttgcgggagggcaacatcatggctgtgatggccacggctatgtacctgcagatggagcatgttgtggacacttgccggaagtttattaaggccagtgaagcagagatggtttctgccatcaagcctcctcgtgaagagttcctcaacagccggatgctgatgccccaagacatcatggcctatcggggtcgtgaggtggtggagaacaacctgccactgaggagcgcccctgggtgtgagagcagagcctttgcccccagcctgtacagtggcctgtccacaccgccagcctcttattccatgtacagccacctccctgtcagcagcctcctcttctccgatgaggagtttcgggatgtccggatgcctgtggccaaccccttccccaaggagcgggcactcccatgtgatagtgccaggccagtccctggtgagtacagccggccgactttggaggtgtcccccaatgtgtgccacagcaatatctattcacccaaggaaacaatcccagaagaggcacgaagtgatatgcactacagtgtggctgagggcctcaaacctgctgccccctcagcccgaaatgccccctacttcccttgtgacaaggccagcaaagaagaagagagaccctcctcggaagatgagattgccctgcatttcgagccccccaatgcacccctgaaccggaagggtctggttagtccacagagcccccagaaatctgactgccagcccaactcgcccacagagtcctgcagcagtaagaatgcctgcatcctccaggcttctggctcccctccagccaagagccccactgaccccaaagcctgcaactggaagaaatacaagttcatcgtgctcaacagcctcaaccagaatgccaaaccagaggggcctgagcaggctgagctgggccgcctttccccacgagcctacacggccccacctgcctgccagccacccatggagcctgagaaccttgacctccagtccccaaccaagctgagtgccagcggggaggactccaccatcccacaagccagccggctcaataacatcgttaacaggtccatgacgggctctccccgcagcagcagcgagagccactcaccactctacatgcaccccccgaagtgcacgtcctgcggctctcagtccccacagcatgcagagatgtgcctccacaccgctggccccacgttccctgaggagatgggagagacccagtctgagtactcagattctagctgtgagaacggggccttcttctgcaatgagtgtgactgccgcttctctgaggaggcctcactcaagaggcacacgctgcagacccacagtgacaaaccctacaagtgtgaccgctgccaggcctccttccgctacaagggcaacctcgccagccacaagaccgtccataccggtgagaaaccctatcgttgcaacatctgtggggcccagttcaaccggccagccaacctgaaaacccacactcgaattcactctggagagaagccctacaaatgcgaaacctgcggagccagatttgtacaggtggcccacctccgtgcccatgtgcttatccacactggtgagaagccctatccctgtgaaatctgtggcacccgtttccggcaccttcagactctgaagagccacctgcgaatccacacaggagagaaaccttaccattgtgagaagtgtaacctgcatttccgtcacaaaagccagctgcgacttcacttgcgccagaagcatggcgccatcaccaacaccaaggtgcaataccgcgtgtcagccactgacctgcctccggagctccccaaagcctgcGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTAGATCTGGAATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGTGGTTGACTTTCTCTCCTACAAGCTTTCCCAGAAAGGATACAGCTGGAGTCAGTTTAGTGATGTGGAAGAGAACAGGACTGAGGCCCCAGAAGGGACTGAATCGGAGATGGAGACCCCCAGTGCCATCAATGGCAACCCATCCTGGCACCTGGCAGACAGCCCCGCGGTGAATGGAGCCACTGGCCACAGCAGCAGTTTGGATGCCCGGGAGGTGATCCCCATGGCAGCAGTAAAGCAAGCGCTGAGGGAGGCAGGCGACGAGTTTGAACTGCGGTACCGGCGGGCATTCAGTGACCTGACATCCCAGCTCCACATCACCCCAGGGACAGCATATCAGAGCTTTGAACAGGTAGTGAATGAACTCTTCCGGGATGGGGTAAACTGGGGTCGCATTGTGGCCTTTTTCTCCTTCGGCGGGGCACTGTGCGTGGAAAGCGTAGACAAGGAGATGCAGGTATTGGTGAGTCGGATCGCAGCTTGGATGGCCACTTACCTGAATGACCACCTAGAGCCTTGGATCCAGGAGAACGGCGGCTGGGATACTTTTGTGGAACTCTATGGGAACAATGCAGCAGCCGAGAGCCGAAAGGGCCAGGAACGCTTCAACCGCTGGTTCCTGACGGGCATGACTGTGGCCGGCGTGGTTCTGCTGGGCTCACTCTTCAGTCGGAAAtgA-3(SEQ ID NO:9)。
包含BCL6和Bcl-xL的表达构建体的另一个例子在下面，其中加有单下划线的部分为BCL6，未加下划线的部分为P2A，加有双下划线的部分为BcL-xL：
Figure BDA0003604711340000301
Figure BDA0003604711340000311
包含BCL6与Bcl-xl的构建体的一个例子(L5x(MSCV-BCL6-P2A-BCL-xl-T2A-rtTA)；参见图21)在下面。总体结构如下：NNNN-CMV启动子NN-HIV-LTR-HIV1_psi pack-间隔子-RRE-间隔子-cPPT-MSCV启动子-BCL-6WT-P2A-BCL-xL-T2A-rtTA-WPRE-U3PPT-HIV-LTR-bGHpA-SV40复制起点-质粒复制起点-氨苄青霉素抗性基因-AmpR_启动子—NNNN。下面的(和在图21中的)构建体的特定结构域的具体序列在下面的SEQ ID NO:11之后紧接着进行描绘：
GTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATtCGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCGGCACTGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAATtaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggttaggaacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcctccgatagactgcgtcgcccgggtacccgtattcccaataaagcctcttgctgtttgcatccgaatcgtggactcgctgatccttgggagggtctcctcagattgattgactgcccacctcgggggtctttcatcctaGGCTAGCcaccATGgcctcgccggctgacagctgtatccagttcacccgccatgccagtgatgttcttctcaaccttaatcgtctccggagtcgagacatcttgactgatgttgtcattgttgtgagccgtgagcagtttagagcccataaaacggtcctcatggcctgcagtggcctgttctatagcatctttacagaccagttgaaatgcaaccttagtgtgatcaatctagatcctgagatcaaccctgagggattctgcatcctcctggacttcatgtacacatctcggctcaatttgcgggagggcaacatcatggctgtgatggccacggctatgtacctgcagatggagcatgttgtggacacttgccggaagtttattaaggccagtgaagcagagatggtttctgccatcaagcctcctcgtgaagagttcctcaacagccggatgctgatgccccaagacatcatggcctatcggggtcgtgaggtggtggagaacaacctgccactgaggagcgcccctgggtgtgagagcagagcctttgcccccagcctgtacagtggcctgtccacaccgccagcctcttattccatgtacagccacctccctgtcagcagcctcctcttctccgatgaggagtttcgggatgtccggatgcctgtggccaaccccttccccaaggagcgggcactcccatgtgatagtgccaggccagtccctggtgagtacagccggccgactttggaggtgtcccccaatgtgtgccacagcaatatctattcacccaaggaaacaatcccagaagaggcacgaagtgatatgcactacagtgtggctgagggcctcaaacctgctgccccctcagcccgaaatgccccctacttcccttgtgacaaggccagcaaagaagaagagagaccctcctcggaagatgagattgccctgcatttcgagccccccaatgcacccctgaaccggaagggtctggttagtccacagagcccccagaaatctgactgccagcccaactcgcccacagagtcctgcagcagtaagaatgcctgcatcctccaggcttctggctcccctccagccaagagccccactgaccccaaagcctgcaactggaagaaatacaagttcatcgtgctcaacagcctcaaccagaatgccaaaccagaggggcctgagcaggctgagctgggccgcctttccccacgagcctacacggccccacctgcctgccagccacccatggagcctgagaaccttgacctccagtccccaaccaagctgagtgccagcggggaggactccaccatcccacaagccagccggctcaataacatcgttaacaggtccatgacgggctctccccgcagcagcagcgagagccactcaccactctacatgcaccccccgaagtgcacgtcctgcggctctcagtccccacagcatgcagagatgtgcctccacaccgctggccccacgttccctgaggagatgggagagacccagtctgagtactcagattctagctgtgagaacggggccttcttctgcaatgagtgtgactgccgcttctctgaggaggcctcactcaagaggcacacgctgcagacccacagtgacaaaccctacaagtgtgaccgctgccaggcctccttccgctacaagggcaacctcgccagccacaagaccgtccataccggtgagaaaccctatcgttgcaacatctgtggggcccagttcaaccggccagccaacctgaaaacccacactcgaattcactctggagagaagccctacaaatgcgaaacctgcggagccagatttgtacaggtggcccacctccgtgcccatgtgcttatccacactggtgagaagccctatccctgtgaaatctgtggcacccgtttccggcaccttcagactctgaagagccacctgcgaatccacacaggagagaaaccttaccattgtgagaagtgtaacctgcatttccgtcacaaaagccagctgcgacttcacttgcgccagaagcatggcgccatcaccaacaccaaggtgcaataccgcgtgtcagccactgacctgcctccggagctccccaaagcctgcGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTAGATCTGGAATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGTGGTTGACTTTCTCTCCTACAAGCTTTCCCAGAAAGGATACAGCTGGAGTCAGTTTAGTGATGTGGAAGAGAACAGGACTGAGGCCCCAGAAGGGACTGAATCGGAGATGGAGACCCCCAGTGCCATCAATGGCAACCCATCCTGGCACCTGGCAGACAGCCCCGCGGTGAATGGAGCCACTGGCCACAGCAGCAGTTTGGATGCCCGGGAGGTGATCCCCATGGCAGCAGTAAAGCAAGCGCTGAGGGAGGCAGGCGACGAGTTTGAACTGCGGTACCGGCGGGCATTCAGTGACCTGACATCCCAGCTCCACATCACCCCAGGGACAGCATATCAGAGCTTTGAACAGGTAGTGAATGAACTCTTCCGGGATGGGGTAAACTGGGGTCGCATTGTGGCCTTTTTCTCCTTCGGCGGGGCACTGTGCGTGGAAAGCGTAGACAAGGAGATGCAGGTATTGGTGAGTCGGATCGCAGCTTGGATGGCCACTTACCTGAATGACCACCTAGAGCCTTGGATCCAGGAGAACGGCGGCTGGGATACTTTTGTGGAACTCTATGGGAACAATGCAGCAGCCGAGAGCCGAAAGGGCCAGGAACGCTTCAACCGCTGGTTCCTGACGGGCATGACTGTGGCCGGCGTGGTTCTGCTGGGCTCACTCTTCAGTCGGAAAACGCGTGGCAGTggcgagggtagaggttctctcctcacttgtggtgatgttgaagaaaaccctggtccaatgtctagactggacaagagcaaagtcataaacggagctctggaattactcaatggtgtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgccaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcataccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccgaccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaaGGTgACCGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCACTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGATCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCAAGAGAAGGTAGAAGAAGCCAATGAAGGAGAGAACACCCGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTATTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACATGGCCCGAGAGCTGCATCCGGACTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCATGTCTatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggccGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGAC(SEQ ID NO:11)。
CMV启动子
ACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGC(SEQ ID NO:61)。
HIV LTR
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA(SEQ ID NO:62)。
HIV1 psi pack
TGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG(SEQ ID NO:63)。
RRE
AGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCT(SEQ ID NO:64)。
cPPT
AAAAGAAAAGGGGGGA(SEQ ID NO:65)。
MSCV启动子
aatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggttaggaacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcctccgatagactgcgtcgcccgggtacccgtattcccaataaagcctcttgctgtttgcatccgaatcgtggactcgctgatccttgggagggtctcctcagattgattgactgcccacctcgggggtctttcat(SEQ IDNO:66)。
BCL-6 WT
ATGgcctcgccggctgacagctgtatccagttcacccgccatgccagtgatgttcttctcaaccttaatcgtctccggagtcgagacatcttgactgatgttgtcattgttgtgagccgtgagcagtttagagcccataaaacggtcctcatggcctgcagtggcctgttctatagcatctttacagaccagttgaaatgcaaccttagtgtgatcaatctagatcctgagatcaaccctgagggattctgcatcctcctggacttcatgtacacatctcggctcaatttgcgggagggcaacatcatggctgtgatggccacggctatgtacctgcagatggagcatgttgtggacacttgccggaagtttattaaggccagtgaagcagagatggtttctgccatcaagcctcctcgtgaagagttcctcaacagccggatgctgatgccccaagacatcatggcctatcggggtcgtgaggtggtggagaacaacctgccactgaggagcgcccctgggtgtgagagcagagcctttgcccccagcctgtacagtggcctgtccacaccgccagcctcttattccatgtacagccacctccctgtcagcagcctcctcttctccgatgaggagtttcgggatgtccggatgcctgtggccaaccccttccccaaggagcgggcactcccatgtgatagtgccaggccagtccctggtgagtacagccggccgactttggaggtgtcccccaatgtgtgccacagcaatatctattcacccaaggaaacaatcccagaagaggcacgaagtgatatgcactacagtgtggctgagggcctcaaacctgctgccccctcagcccgaaatgccccctacttcccttgtgacaaggccagcaaagaagaagagagaccctcctcggaagatgagattgccctgcatttcgagccccccaatgcacccctgaaccggaagggtctggttagtccacagagcccccagaaatctgactgccagcccaactcgcccacagagtcctgcagcagtaagaatgcctgcatcctccaggcttctggctcccctccagccaagagccccactgaccccaaagcctgcaactggaagaaatacaagttcatcgtgctcaacagcctcaaccagaatgccaaaccagaggggcctgagcaggctgagctgggccgcctttccccacgagcctacacggccccacctgcctgccagccacccatggagcctgagaaccttgacctccagtccccaaccaagctgagtgccagcggggaggactccaccatcccacaagccagccggctcaataacatcgttaacaggtccatgacgggctctccccgcagcagcagcgagagccactcaccactctacatgcaccccccgaagtgcacgtcctgcggctctcagtccccacagcatgcagagatgtgcctccacaccgctggccccacgttccctgaggagatgggagagacccagtctgagtactcagattctagctgtgagaacggggccttcttctgcaatgagtgtgactgccgcttctctgaggaggcctcactcaagaggcacacgctgcagacccacagtgacaaaccctacaagtgtgaccgctgccaggcctccttccgctacaagggcaacctcgccagccacaagaccgtccataccggtgagaaaccctatcgttgcaacatctgtggggcccagttcaaccggccagccaacctgaaaacccacactcgaattcactctggagagaagccctacaaatgcgaaacctgcggagccagatttgtacaggtggcccacctccgtgcccatgtgcttatccacactggtgagaagccctatccctgtgaaatctgtggcacccgtttccggcaccttcagactctgaagagccacctgcgaatccacacaggagagaaaccttaccattgtgagaagtgtaacctgcatttccgtcacaaaagccagctgcgacttcacttgcgccagaagcatggcgccatcaccaacaccaaggtgcaataccgcgtgtcagccactgacctgcctccggagctccccaaagcctgc(SEQ ID NO:67)。
P2A
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:68)。
BCL-xL
AGATCTGGAATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGTGGTTGACTTTCTCTCCTACAAGCTTTCCCAGAAAGGATACAGCTGGAGTCAGTTTAGTGATGTGGAAGAGAACAGGACTGAGGCCCCAGAAGGGACTGAATCGGAGATGGAGACCCCCAGTGCCATCAATGGCAACCCATCCTGGCACCTGGCAGACAGCCCCGCGGTGAATGGAGCCACTGGCCACAGCAGCAGTTTGGATGCCCGGGAGGTGATCCCCATGGCAGCAGTAAAGCAAGCGCTGAGGGAGGCAGGCGACGAGTTTGAACTGCGGTACCGGCGGGCATTCAGTGACCTGACATCCCAGCTCCACATCACCCCAGGGACAGCATATCAGAGCTTTGAACAGGTAGTGAATGAACTCTTCCGGGATGGGGTAAACTGGGGTCGCATTGTGGCCTTTTTCTCCTTCGGCGGGGCACTGTGCGTGGAAAGCGTAGACAAGGAGATGCAGGTATTGGTGAGTCGGATCGCAGCTTGGATGGCCACTTACCTGAATGACCACCTAGAGCCTTGGATCCAGGAGAACGGCGGCTGGGATACTTTTGTGGAACTCTATGGGAACAATGCAGCAGCCGAGAGCCGAAAGGGCCAGGAACGCTTCAACCGCTGGTTCCTGACGGGCATGACTGTGGCCGGCGTGGTTCTGCTGGGCTCACTCTTCAGTCGGAAA(SEQ ID NO:69)。
T2A
GGCAGTggcgagggtagaggttctctcctcacttgtggtgatgttgaagaaaaccctggtcca(SEQID NO:70)。
rtTA
atgtctagactggacaagagcaaagtcataaacggagctctggaattactcaatggtgtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgccaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcataccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccgaccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaaGGTgA(SEQ ID NO:71)。
WPRE
TCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCA(SEQ ID NO:72)。
U3PPT
AAAAGAAAAGGGGGGA(SEQ ID NO:73)。
-HIV-LTR
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA(SEQ ID NO:74)。
bGH pA
CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATG(SEQ ID NO:75)。
SV40复制起点
Atcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcc(SEQ IDNO:76)。
质粒复制起点
TTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA(SEQ ID NO:77)。
氨苄青霉素抗性基因
TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT(SEQ ID NO:78)。
AmpR_启动子
ATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAA(SEQ ID NO:79)。
在进一步的方面，本公开内容提供了无限免疫细胞，其可以进行遗传修饰以赋予有利于将所述无限免疫细胞靶向特定器官位点或肿瘤标志物的倾向。所述无限免疫细胞可以表达一种或多种自杀或消除基因，其可以用于在严重不良事件的情况下从患者中消除无限免疫细胞。所述无限免疫细胞可以表达一种或多种能够保持或增强无限T细胞的增殖的基因(包括编码IL-2和/或IL-15的基因)以用于体内应用。IL-2和/或IL-15的表达可以是组成性表达或者是可调控的，例如多西环素可调控的(Tet-on或Tet-off)。所述细胞可以进行改造以表达一种或多种其他细胞因子，例如IL-7、IL-12、IL-18、IL-21等；一种或多种趋化因子受体，例如CCR1、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR7(ACKR3)、CX3CR1、CCRL2(ACKR5)等；和/或一种或多种其他趋化因子，例如CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CX3CL1、CXCL4L1等。
无限免疫细胞可以进行修饰以表达抗原特异性CAR或TCR以靶向肿瘤或感染。另一个靶向肿瘤的策略可以是修饰无限T细胞以表达在细胞外结构域上具有Fc受体的CAR，从而然后它们可以与针对肿瘤标志物的单克隆抗体相联合地进行使用。另外，无限免疫细胞可以进行修饰以表达特异性趋化因子受体和/或粘附分子，包括整联蛋白、选择蛋白，属于免疫球蛋白超家族的粘附分子、钙粘着蛋白和CD44家族，以优先引导将这些分子运输至目的器官位点。
一个进一步的实施方案提供了具有一种或多种安全开关(例如，任何种类的自杀基因或消除基因)的无限免疫细胞。在一些实施方案中，所述系统可以使用截短的人表皮生长因子受体(hEGFRt)、HSV-TK、SR39突变型HSV-TK、酵母CD基因或其突变型CD20。在使用hEGFRt的情况下，该基因可以给予无限T细胞以由经FDA批准的单克隆抗体(例如，西妥昔单抗)所识别和消除的特性，当不需要它们时。例如，该基因可以充当安全开关，当在注射治疗性无限免疫细胞后出现严重不良事件时。除了充当安全开关外，hEGFRt还可以充当标志物以富集CAR阳性细胞并且在输注到患者中后追踪这些细胞。
截短的EGFR的一个例子如下，在这种情况下EGFR的结构域1和2已被删除：
DNA序列：
5-ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCACACCCTGCCTTCCTGAGGAAAGTGTGTAATGGCATCGGCATCGGCGAGTTTAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACAAATATCAAGCACTTCAAGAACTGTACCTCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCAGAGGCGATTCCTTTACACACACCCCACCACTGGACCCACAGGAGCTGGATATCCTGAAGACAGTGAAGGAGATCACCGGCTTCCTGCTGATCCAGGCATGGCCAGAGAACAGGACAGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCAGAGGCAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTCTGGCCGTGGTGAGCCTGAACATCACATCCCTGGGCCTGCGCTCTCTGAAGGAGATCAGCGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAATCTGTGCTATGCCAACACCATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACATCTGGCCAGAAGACCAAGATCATCAGCAACCGCGGCGAGAATTCCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGTAGCCCTGAGGGATGTTGGGGACCAGAGCCACGCGACTGCGTGTCCTGTAGGAACGTGTCTAGGGGAAGGGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGAGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACATGTACCGGCCGGGGCCCTGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTACATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACATGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACCCTGGTGTGGAAGTATGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGTCACCCCAATTGCACATACGGATGTACCGGACCAGGACTGGAGGGATGTCCTACAAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCAACCGGAATGGTGGGAGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCACTGGGAATCGGACTGTTCATGAGGCGGTGA-3(SEQ ID NO:12)。
缺乏结构域1和2的截短的EGFR的氨基酸序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRR(SEQ ID NO:13)。
在某些实施方案中，作为安全开关的融合蛋白为EGFR(结构域3)和HER2(结构域IV)融合蛋白融合物。在此类情况下，所述EGFR结构域3为抗体结合结构域，并且所述HER2结构域4包含细胞外间隔子和跨膜结构域。在特别的实施方案中，该融合蛋白为与CAR分开的分子。
在所述无限细胞中的任何一种或多种基因或表达构建体可以是或可以不是可调控的，例如以多西环素可调控的方式通过Tet-on或Tet-off系统。Tet-应答型启动子的序列的一个例子包括下面的Tet应答型启动子，其包含Tet应答元件的7个重复：
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttatccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcc(SEQ ID NO:14)。
对于所述tet系统，关于tTA(Tet off)的DNA序列的一个例子如下：
ATGAGCCGCCTGGATAAGTCCAAAGTGATCAACTCTGCCCTGGAGCTGCTGAATGAAGTGGGCATCGAGGGCCTGACCACACGGAAGCTGGCCCAGAAGCTGGGAGTGGAGCAGCCAACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGCGCCCTGCTGGACGCCCTGGCCATCGAGATGCTGGATCGGCACCACACACACTTCTGCCCCCTGGAGGGAGAGTCCTGGCAGGATTTCCTGCGGAACAATGCCAAGAGCTTTAGATGTGCACTGCTGTCCCACAGGGACGGAGCAAAGGTGCACCTGGGCACCAGGCCTACAGAGAAGCAGTACGAGACCCTGGAGAACCAGCTGGCCTTCCTGTGCCAGCAGGGCTTTTCTCTGGAGAATGCACTGTATGCACTGAGCGCCGTGGGACACTTCACCCTGGGATGCGTGCTGGAGGACCAGGAGCACCAGGTGGCCAAGGAGGAGAGAGAGACACCCACCACAGATTCCATGCCCCCTCTGCTGAGGCAGGCCATCGAGCTGTTTGACCACCAGGGAGCAGAGCCTGCCTTCCTGTTTGGCCTGGAGCTGATCATCTGCGGCCTGGAGAAGCAGCTGAAGTGTGAGTCTGGAGGACCAGCAGACGCCCTGGACGATTTCGACCTGGATATGCTGCCCGCCGATGCCCTGGACGATTTTGACCTGGATATGCTGCCTGCCGACGCCCTGGACGATCTGGACCTGGATATGCTGCCAGGCacc(SEQID NO:15)。
tTA(Tet off)的氨基酸序列的一个例子如下：
MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDLDLDMLPG(SEQ ID NO:16)。
rtTA(Tet on)的DNA序列的一个例子如下：
atgtctagactggacaagagcaaagtcataaacggagctctggaattactcaatggtgtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgccaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcataccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccgaccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaa(SEQID NO:17)。
rtTA(Tet on)的氨基酸序列的一个例子如下：
MSRLDKSKVINGALELLNGVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALPIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSYRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEEQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDRQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG(SEQ ID NO:18)。
在一些方面，所述无限免疫细胞可以进行改造以表达一种或多种细胞因子，包括IL-2和/或IL-15，例如可诱导的IL-2和/或IL-15，例如以便保持或增强增殖。但是，在特别的情况下，在所述系统中的任何细胞因子可以组成性地进行调控。例如，无限免疫细胞可以在诱导试剂(例如，多西环素)存在下产生IL-15和/或IL-2，以支持其自身的增殖。通过调节多西环素的剂量，可以在体内保持或调节无限免疫细胞的存活和增殖。
可以使用特定的IL-2序列。在至少一些情况下，IL-2具有两个DNA序列例子，并且它们都编码相同的IL-2氨基酸序列。
IL-2DNA序列1：
ATGTATCGGATGCAACTCCTCAGCTGCATTGCGTTGTCACTCGCACTCGTCACGAACTCTGCACCGACATCTAGTAGTACTAAGAAAACACAGTTGCAACTGGAGCACCTGCTGTTGGATTTGCAAATGATCCTTAACGGGATCAACAACTACAAAAACCCTAAGCTCACACGAATGCTTACTTTCAAGTTTTACATGCCGAAAAAAGCCACAGAGCTGAAGCATCTTCAGTGCCTTGAAGAGGAGCTTAAACCCCTCGAGGAGGTACTGAATCTCGCGCAAAGCAAGAATTTTCATTTGCGGCCCCGGGACCTTATATCAAACATTAACGTGATCGTGTTGGAACTCAAGGGATCAGAGACGACATTTATGTGCGAGTACGCTGACGAGACCGCTACAATCGTAGAGTTTCTCAATAGGTGGATCACGTTTTGCCAAAGCATCATCTCAACGCTC(SEQ ID NO:19)。
IL-2DNA序列2：
ATGTATAGGATGCAGCTGCTGTCCTGCATCGCCTTGTCCCTGGCCCTTGTGACCAACAGCGCCCCAACCTCCTCCTCTACCAAAAAAACCCAACTTCAGCTTGAGCATCTCCTCTTGGACCTGCAGATGATCCTGAATGGTATAAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTTACATTCAAATTCTATATGCCTAAAAAGGCTACAGAGCTGAAGCACCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAGCTGAAGCCACTGGAAGAGGTCCTGAACTTGGCCCAGAGCAAGAACTTTCACCTCAGGCCCAGGGACTTGATAAGCAACATAAATGTAATCGTCCTGGAGCTGAAGGGGTCTGAAACAACCTTCATGTGTGAGTATGCAGATGAGACCGCTACCATCGTGGAGTTCCTCAACAGATGGATTACATTTTGTCAATCCATCATCAGCACCCTGACATCT(SEQ ID NO:20)。
在某些实施方案中，在所述细胞中使用特别的IL-2氨基酸序列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTL(SEQ ID NO:21)。
在某些实施方案中，在所述细胞中使用特别的IL-15核酸聚合物序列：
ATGGGCCTGACCTCTCAGCTGCTGCCACCCCTGTTCTTTCTGCTGGCCTGTGCCGGCAATTTCGTGCACGGCGCCAACTGGGTGAATGTGATCTCTGACCTGAAGAAGATCGAGGATCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTATACAGAGTCCGATGTGCACCCTTCTTGCAAGGTGACAGCCATGAAGTGTTTTCTGCTGGAGCTGCAGGTCATCTCTCTGGAGAGCGGCGACGCCAGCATCCACGATACCGTGGAGAATCTGATCATCCTGGCCAACAATAGCCTGAGCTCCAACGGCAATGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGTGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGTCCTTTGTGCACATCGTGCAGATGTTTATCAATACCTCTTGA(SEQ ID NO:22)。
在某些实施方案中，在所述细胞中使用特别的IL-15氨基酸序列：
MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHGANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQID NO:23)。
在特别的情况下，所述免疫细胞包含与IL-15受体的部分或全部相融合的IL-15。在特别的情况下，所述免疫细胞包含与IL-15受体α单元的sushi结构域相融合的IL-15，并且其序列的一个例子如下：
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:24)。
与IL-15受体α单元的sushi结构域相融合的IL-15的DNA序列：
ATGGCACCTAGAAGAGCCAGAGGATGTAGAACACTGGGACTGCCAGCGCTCCTTCTTTTGTTGCTGCTGAGACCACCTGCAACTCGCGGAATCACTTGTCCTCCTCCTATGAGTGTGGAACACGCTGACATTTGGGTCAAGTCCTACTCTCTGTATTCCCGGGAGAGATATATATGTAACTCTGGTTTCAAACGCAAGGCAGGCACCAGCAGCCTTACCGAGTGTGTGCTTAACAAGGCAACAAATGTGGCTCACTGGACAACACCTTCTCTGAAGTGCATTAGAGATGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGAGGTTCTGGTGGGGGTGGATCAAATTGGGTGAACGTAATTTCCGACCTGAAAAAGATCGAAGATCTCATTCAAAGCATGCATATCGATGCCACCCTCTATACCGAGAGCGATGTCCACCCATCCTGCAAAGTTACGGCGATGAAATGCTTCCTGCTCGAGCTCCAGGTTATTTCTCTGGAGAGCGGGGATGCCTCCATCCACGATACTGTCGAGAACCTCATTATTCTGGCCAATAACTCCCTGTCTAGCAATGGCAATGTGACTGAATCAGGTTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTCGAAGAGAAAAACATAAAAGAATTCCTGCAATCCTTTGTCCATATCGTACAGATGTTTATCAACACCAGC(SEQ ID NO:25)。
所述无限免疫细胞可以通过下述方式来进行基因改造以便给予无限细胞以靶标选择性：引入一种或多种可以识别特异性肿瘤标志物例如CD19、CD20、CD22和/或间皮素的嵌合抗原受体(CAR)，和/或T细胞受体(TCR)，例如针对EBV、CMV或NY-ESO-1的TCR。一个例子是在本文中在别处提及的“抗-CD19无限CAR T细胞”(CD19 inCART)。CD19在几乎所有种类的B细胞淋巴瘤或B细胞白血病和正常B细胞中表达。CD19 inCART通过将表达抗-CD19 CAR的慢病毒或非病毒载体递送到所选择的无限细胞中来产生。
所述无限免疫细胞还可以进行基因改造以赋予额外的特性，例如i)对于T细胞衰竭的抗性，通过敲除或敲低抑制性受体或配体PD-1、LAG-3、TIM-3、PD-L1等；ii)对于免疫抑制机制的抗性，例如通过敲除或敲低TGF-β受体；iii)防止移植物抗宿主病，通过敲除TCR；iv)经改善的效力，通过表达表面或细胞内分子例如细胞因子或细胞毒性分子；和v)经改善的体内持久性，通过使它们抵抗由宿主免疫细胞(包括T细胞和NK细胞)进行的消除。这可以通过下述方式来实现：敲除或敲低MHC分子；或者在无限免疫细胞中表达表面配体或其他表面或细胞内分子以便抑制或减小宿主免疫细胞的功能。
可以通过特别的方法或在特别的条件下产生所述无限免疫细胞。例如，在特别的实施方案中，在产生所述无限免疫细胞期间，在产生的同时可以使所述细胞经历一种或多种特殊试剂，所述特殊试剂在产生后增强其效力，至少相比于在没有暴露于所述一种或多种特殊试剂的情况下的其效力而言。例如，在一些情况下，使用IL-2来生成和扩增无限T细胞。在特别的实施方案中，细胞因子(IL-2、IL-7、IL-21、IL-15、IL-12、IL-18、IL-23、IFN-γ、TNF-α等)和/或趋化因子的一种或多种不同组合可以用于制备具有特定表型和特定功能的无限T细胞。
IV.经基因改造的抗原受体
本公开内容的免疫细胞可以或可以不进行基因改造以表达一种或多种抗原受体，例如一种或多种经改造的TCR和/或一种或多种CAR。例如，所述免疫细胞可以进行修饰以表达具有对于癌症抗原或微生物抗原(包括致病抗原)的抗原特异性的CAR和/或TCR。可以向所述免疫细胞添加多种CAR和/或TCR，例如针对不同抗原的。在一些方面，所述免疫细胞通过下述方式来进行改造以表达CAR或TCR：通过使用基因编辑方法例如CRISPR/Cas9来在抑制性基因座位处敲入CAR或TCR。
合适的修饰方法是本领域中已知的。参见例如Sambrook和Ausubel,见上。例如，可以通过使用Heemskerk等人,2008和Johnson等人,2009中所描述的转导技术来转导所述细胞以表达具有对于癌症抗原的抗原特异性的TCR。
编码全长TCRα和β(或者γ和δ)链的RNA的电穿孔可以用作备选方案以克服具有由经逆转录病毒转导的和内源的TCR链的配对所引起的自身反应性的长期问题。即使在瞬时转染策略中这样的备选配对发生，可能生成的自身反应性T细胞也将会在一些时间后失去该自身反应性，因为所引入的TCRα和β链仅是瞬时表达的。当所引入的TCRα和β表达减少时，仅留下正常的自体T细胞。当通过稳定的逆转录病毒转导来引入全长TCR链时，情况就不是这样，这永远不会失去所引入的TCR链，从而造成在患者中始终存在的自身反应性。
在一些实施方案中，所述细胞包含一种或多种经由基因改造而引入的核酸聚合物，其编码一种或多种抗原受体，和此类核酸聚合物的经基因改造的产物。在一些实施方案中，所述核酸聚合物是异源的，即通常不存在于细胞或从所述细胞获得的样品中，例如从另一生物或细胞获得的那种，其例如通常不被发现于正进行改造的细胞和/或此类细胞所源自的生物中。在一些实施方案中，所述核酸聚合物不是天然出现的，例如在自然界中未发现的核酸聚合物(例如，嵌合的)。
在一些实施方案中，所述CAR包含与一种或多种抗原特异性地结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述抗原为在细胞(包括特别的癌细胞)的表面上表达的蛋白质、脂质或碳水化合物。在一些实施方案中，所述CAR为TCR-样CAR，并且所述抗原为经加工的肽抗原，例如细胞内蛋白质的肽抗原，其像TCR一样，在主要组织相容性复合物(MHC)分子的情景下在细胞表面上被识别。
示例性的抗原受体(包括CAR和重组TCR)以及用于改造所述受体和将所述受体引入到细胞中的方法，包括例如：在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所描述的那些；和/或由Sadelain等人,2013；Davila等人,2013；Turtle等人,2012；Wu等人,2012所描述的那些。在一些方面，所述经基因改造的抗原受体包括在美国专利号7,446,190中所描述的CAR，和在国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所描述的那些。
A.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，所述CAR包含：a)细胞内信号传导结构域；b)跨膜结构域；c)包含抗原结合区的细胞外结构域；和任选地，d)一个或多个共刺激结构域。
在一些实施方案中，所述经改造的抗原受体包含CAR，包括激活性或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,2013)。所述CAR通常包含与一个或多个细胞内信号传导组分相连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域，在一些方面所述连接经由连接体和/或跨膜结构域。此类分子典型地模拟或接近于通过天然抗原受体的信号，通过此类受体以及与之相组合的共刺激受体的信号，和/或通过单独的共刺激受体的信号。
本公开内容的某些实施方案涉及核酸聚合物的用途，所述核酸聚合物包括编码下述多肽的核酸聚合物：抗原特异性CAR多肽，包括已被人源化以减小免疫原性的CAR(hCAR)，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域(包含一个或多个信号传导基元)。在某些实施方案中，所述CAR可以识别包含在一种或多种抗原之间的共享空间的表位。在某些实施方案中，所述结合区可以包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，那种特异性源自与受体相结合的肽(例如，细胞因子)。
考虑了所述人CAR核酸聚合物可以是用于增强对于人患者的细胞免疫疗法的人基因。在一个特别的实施方案中，本发明包括全长CAR cDNA或编码区。所述抗原结合区或结构域可以包含源自特定的人单克隆抗体(例如，在美国专利7,109,304中所描述的那些，该文献通过提及而合并入本文)的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段。所述片段也可以是任何数目的人抗原特异性抗体的不同抗原结合结构域。在一个更特别的实施方案中，所述片段为抗原特异性scFv，其由为了在人细胞中表达而就人密码子使用进行了优化的序列编码。
所述布置可以是多聚体的，例如双链抗体或多聚体。所述多聚体最可能地通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双链抗体来形成。所述构建体的铰链部分可以具有多个备选物，从被完全删除到保持第一个半胱氨酸，到脯氨酸而不是丝氨酸置换，到被截短直至第一个半胱氨酸。所述Fc部分可以被删除。任何稳定的和/或二聚化的蛋白质可以用于该目的。人们可以使用仅一个所述Fc结构域，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。人们也可以使用已进行了修饰以改善二聚化的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区。人们也可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。人们也可以使用CD8α的部分或合成分子。
在一些实施方案中，所述CAR核酸包含单独地或相组合地编码其他共刺激受体的部分或完整序列，例如特定分子(例如，CD28)的天然或经修饰的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。其他共刺激结构域包括但不限于下列中的一种或多种：CD28、CD27、OX-40(CD134)、ICOS、HVEM、GITR、LIGHT、CD40L、DR3、CD30、SLAM、CD2、CD226(DNAM-1)、MyD88、CD244、TMIGD2、BTNL3、NKG2D、DAP10、DAP12、4-1BB(CD137)或合成分子。除了由CD3ζ引发的初级信号外，由插入在CAR中的共刺激受体所提供的额外信号对于NK细胞的完全激活来说是重要的，并且可以帮助改善过继免疫疗法的体内持久性和治疗成功。
在一些实施方案中，构建具有对于特定抗原(或标志物或配体)的特异性的CAR，所述特定抗原为例如在待被过继疗法所靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如癌症标志物，和/或意欲诱导减缓性应答的抗原，例如在正常或非患病细胞类型上表达的抗原。因此，所述CAR典型地在其细胞外部分中包含一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，所述CAR包含抗体分子的抗原结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在嵌合抗原受体的某些实施方案中，所述受体的抗原特异性部分(其可以被称为包含抗原结合区的细胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结合结构域。抗原包括被模式识别受体(例如，Dectin-1)所识别的碳水化合物抗原。肿瘤相关抗原可以是任何种类的，只要它在肿瘤细胞的细胞表面上表达。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras等。在某些实施方案中，所述CAR可以与细胞因子一起共表达以改善持久性，当存在低量的肿瘤相关抗原时。例如，CAR可以与IL-15一起共表达。
编码所述嵌合受体的开放阅读框的序列可以获得自基因组DNA来源、cDNA来源，或者可以是合成的(例如，经由PCR)，或者其组合。取决于基因组DNA的大小和内含子的数目，可能希望的是使用cDNA或其组合，因为发现内含子使mRNA稳定。此外，可能进一步有利的是使用内源或外源的非编码区来使mRNA稳定。
考虑了可以将所述嵌合构建体作为裸DNA或在合适的载体中引入到免疫细胞中。使用裸DNA通过电穿孔来稳定地转染细胞的方法是本领域中已知的。参见例如美国专利号6,410,319。裸DNA通常是指这样的DNA，其编码以适当的方向被包含在质粒表达载体中以用于表达的嵌合受体。
备选地，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或慢病毒载体)来将所述嵌合构建体引入到免疫细胞中。合适的用于根据本公开内容的方法进行使用的载体在所述免疫细胞中是非复制性的。已知大量的基于病毒的载体，其中在所述细胞中病毒的拷贝数维持足够低以保持所述细胞的生存力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
在一些方面，将所述抗原特异性结合或识别组分与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域相连接。在一些实施方案中，所述CAR包含与所述CAR的细胞外结构域相融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与在所述CAR中的结构域之一天然地相关联的跨膜结构域。在一些情况下，选择跨膜结构域或者通过氨基酸置换进行修饰以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域相结合，以便使与该受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域源自任何膜结合型或跨膜蛋白质。跨膜区包括源自下列分子的那些(即，至少包含下列分子的跨膜区)：T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD2，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8(包括CD8α)，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，ICOS/CD278，GITR/CD357，NKG2D，PD-1，CTLA4，和DAP分子。备选地，在一些实施方案中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面，所述合成的跨膜结构域主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
所述CAR的铰链区可以位于所述跨膜结构域的N-末端，并且在一些实施方案中源自天然或合成来源。铰链序列也可以被称为间隔子或细胞外间隔子，并且通常为所述CAR的细胞外结构区，其将结合单元与跨膜结构域分隔开。在特别的实施方案中，所述CAR包含免疫球蛋白(Ig)-样结构域铰链。所述铰链通常为有效的CAR表达和活性提供稳定性。所述铰链可以来自任何合适的来源，但是在特别的实施方案中，数铰链来自CD8a，CD28，PD-1，CTLA4，T-细胞受体的α、β或ζ链，CD2，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8b，CD9，CD16，CD22，CD27，CD32，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，CD160，BTLA，LAIR1，TIGIT，TIM4，ICOS/CD278，GITR/CD357，NKG2D，LAG-3，PD-L1，PD-1，TIM-3，HVEM，LIGHT，DR3，CD30，CD224，CD244，SLAM，CD226，DAP，或其组合或其他。
在某些实施方案中，在本文中所公开的用于遗传修饰免疫细胞(例如，T或NK细胞)的平台技术包括：(i)使用电穿孔装置(例如，nucleofector)的非病毒基因转移；(ii)通过胞内结构域(例如，CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)进行信号传导的CAR；(iii)具有可变长度的细胞外结构域(其将抗原识别结构域连接至细胞表面)的CAR；和在一些情况下，(iv)源自K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)，以便能够稳固地和在数字上扩增CAR+免疫细胞(Singh等人,2008；Singh等人,2011)。
在某些实施方案中，所述细胞进行改造以表达CD19-CAR序列(SEQ ID NO:26)，其包含抗-CD19抗体的VH和VL，CD8铰链(任何铰链可以被称为间隔子或细胞外间隔子)和跨膜区的融合序列，以及CD3和CD28信号转导区。
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGATATACAGATGACGCAGACAACGTCAAGTCTTTCCGCCAGCTTGGGAGACCGAGTGACTATATCTTGTAGAGCAAGCCAGGATATTTCTAAGTATCTTAACTGGTACCAACAAAAGCCCGATGGAACGGTTAAGCTGCTTATATACCATACCAGTAGACTCCACTCCGGCGTACCATCACGGTTTTCTGGCAGTGGCTCCGGGACCGACTATTCTTTGACGATCTCTAATCTCGAACAAGAGGATATTGCAACATACTTTTGTCAGCAAGGCAATACCTTGCCATATACGTTTGGGGGCGGGACAAAACTTGAGATAACCGGCGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTTCCGGTGGTGGGGGATCAGAGGTTAAGCTTCAGGAATCCGGACCAGGTTTGGTTGCCCCCAGCCAATCTCTCAGCGTTACATGCACGGTTTCAGGCGTCAGTCTCCCCGATTACGGTGTAAGTTGGATTCGGCAACCTCCGCGAAAGGGTCTGGAATGGCTGGGGGTTATTTGGGGGAGTGAGACAACTTATTACAACTCTGCACTTAAGAGTCGGCTTACCATCATCAAGGATAATTCAAAATCACAAGTATTCCTGAAGATGAACTCATTGCAAACAGATGATACAGCTATATACTATTGTGCCAAGCATTACTATTATGGTGGTTCTTATGCAATGGATTACTGGGGGCAAGGCACGTCAGTGACAGTGAGTTCAACAACTACTCCAGCACCACGACCACCAACACCTGCTCCAACTATCGCATCTCAACCACTTTCTCTACGTCCAGAAGCATGCCGACCAGCTGCAGGAGGTGCAGTTCATACGAGAGGTCTAGATTTCGCATGTGATATCTACATCTGGGCACCATTGGCTGGGACTTGTGGTGTCCTTCTCCTATCACTGGTTATCACCCTTTACTGCTGGGTTAGAAGTAAAAGAAGTAGGCTACTTCATAGTGATTACATGAATATGACTCCTCGACGACCTGGTCCCACCCGTAAGCATTATCAGCCCTATGCACCACCACGAGATTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTTAAATTTAGCAGAAGTGCAGATGCTCCTGCGTATAAACAGGGTCAAAACCAACTATATAATGAACTAAATCTAGGACGAAGAGAAGAATATGATGTTTTAGATAAAAGACGTGGTCGAGATCCTGAAATGGGAGGAAAACCTAGAAGAAAAAATCCTCAAGAAGGCCTATATAATGAACTACAAAAAGATAAGATGGCAGAAGCTTATAGTGAAATTGGAATGAAAGGAGAACGTCGTAGAGGTAAAGGTCATGATGGTCTTTATCAAGGTCTTAGTACAGCAACAAAAGATACATATGATGCACTTCATATGCAAGCACTTCCACCTCGTTTCGAAGAGCAAAAACTTATC(SEQ ID NO:26)。
可以采用的CAR的特别例子(FMC63-CD8a铰链/TM-CD28-CD3z)如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:27)。
FMC63-CD8a铰链/TM-CD28-CD3z
抗-CD19 CAR的一个例子如下，其包含抗-CD19scFv FMC63，CD8a铰链和跨膜结构域，CD28共刺激结构域，和CD3ζ(FMC63-CD8a铰链/TM-CD28-CD3z)：
ATGGCCCTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCACTGGCACTGCTGCTGCACGCAGCAAGGCCAGACATCCAGATGACACAGACCACAAGCTCCCTGTCCGCCTCTCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGGGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCTGATGGCACAGTGAAGCTGCTGATCTATCACACCTCTAGACTGCACAGCGGCGTGCCATCCAGGTTTAGCGGCTCCGGCTCTGGCACAGACTACTCTCTGACCATCAGCAATCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACCGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGAGGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCACCCAGCCAGTCCCTGTCTGTGACATGTACCGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCAGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGACAGCCACCTAGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACCACATACTATAACTCCGCCCTGAAGTCTCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGTCCCAGGTGTTTCTGAAGATGAATTCCCTGCAGACAGACGATACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCTTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTAGCACCACAACCCCTGCACCAAGACCACCAACACCAGCACCTACCATCGCAAGCCAGCCTCTGTCCCTGAGGCCAGAGGCATGCAGGCCAGCAGCAGGAGGAGCAGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCACCACTGGCAGGAACATGTGGAGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACCCTGTATTGTTGGGTGAGAAGCAAGAGATCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACACCAAGGAGACCAGGACCAACCAGGAAGCACTATCAGCCTTACGCACCTCCAAGGGACTTCGCAGCATATAGGAGCAGGGTGAAGTTTTCTCGCAGCGCCGATGCCCCAGCCTATcAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGAGAGGAAGGGATCCAGAGATGGGAGGCAAGCCTAGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCTAGA(SEQ ID NO:28)。
在SEQ ID NO:28的例子中，所述CAR的下面的组分描绘如下：
CD8信号肽
ATGGCCCTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCACTGGCACTGCTGCTGCACGCAGCAAGGCCA(SEQID NO:29)
FMC63轻链
GACATCCAGATGACACAGACCACAAGCTCCCTGTCCGCCTCTCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGGGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCTGATGGCACAGTGAAGCTGCTGATCTATCACACCTCTAGACTGCACAGCGGCGTGCCATCCAGGTTTAGCGGCTCCGGCTCTGGCACAGACTACTCTCTGACCATCAGCAATCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACC(SEQ ID NO:30)
连接体
GGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCC(SEQ ID NO:31)
重链
GAGGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCACCCAGCCAGTCCCTGTCTGTGACATGTACCGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCAGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGACAGCCACCTAGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACCACATACTATAACTCCGCCCTGAAGTCTCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGTCCCAGGTGTTTCTGAAGATGAATTCCCTGCAGACAGACGATACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCTTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:32)
CD8a铰链
ACCACAACCCCTGCACCAAGACCACCAACACCAGCACCTACCATCGCAAGCCAGCCTCTGTCCCTGAGGCCAGAGGCATGCAGGCCAGCAGCAGGAGGAGCAGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAT(SEQ IDNO:33)
CD8TM
ATCTACATCTGGGCACCACTGGCAGGAACATGTGGAGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACCCTGTATTGTTGGGTG(SEQ ID NO:34)
CD28共刺激结构域
AGAAGCAAGAGATCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACACCAAGGAGACCAGGACCAACCAGGAAGCACTATCAGCCTTACGCACCTCCAAGGGACTTCGCAGCATATAGGAGC(SEQ ID NO:35)
CD3ζ
AGGGTGAAGTTTTCTCGCAGCGCCGATGCCCCAGCCTATcAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGAGAGGAAGGGATCCAGAGATGGGAGGCAAGCCTAGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCTAGA(SEQ ID NO:36)。
FMC63-CD8a铰链/TM-CD28-CD3z的相应的氨基酸序列如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:37)。
在SEQ ID NO:37的例子中，所述CAR的下面的组分描绘如下：
CD8信号肽
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:38)
FMC63轻链
Figure BDA0003604711340000551
Figure BDA0003604711340000561
连接体
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:40)
重链
Figure BDA0003604711340000562
CD8a铰链
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:42)
CD8TM
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWV(SEQ ID NO:43)
CD28共刺激结构域
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:44)
CD3ζ
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:45)。
FMC63-CD28铰链/TM-CD28-CD3z
抗-CD19 CAR的一个例子如下，其包含抗-CD19scFv FMC63，CD28铰链和跨膜结构域，CD28共刺激结构域，和CD3ζ(FMC63-CD28铰链/TM-CD28-CD3z)：
ATGCTGCTGCTCGTGACCTCCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCACACCCTGCCTTCCTGCTGATCCCTGACATCCAGATGACCCAGACCACAAGCTCCCTGTCCGCCTCTCTGGGCGACAGAGTGACAATCTCTTGTAGGGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGATGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTATCACACATCTAGGCTGCACAGCGGAGTGCCATCCCGGTTTAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTACTCTCTGACAATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTACACATTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACCGGCAGCACATCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACCAAGGGAGAGGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCACCCAGCCAGTCCCTGTCTGTGACCTGTACAGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCAGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCTAGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACCACATACTATAATAGCGCCCTGAAGTCCAGACTGACCATCATCAAGGATAACAGCAAGTCCCAGGTGTTCCTGAAGATGAATTCCCTGCAGACCGACGATACAGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCCTATGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCTCTGTGACAGTGTCTAGCGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTATCCACCCCCTTACCTGGATAACGAGAAGAGCAATGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCATCTCCCCTGTTCCCTGGCCCAAGCAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGAGGCGTGCTGGCCTGTTATTCTCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAGGAGCAAGCGGAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGACCCGGCCCTACAAGAAAGCACTATCAGCCTTACGCACCACCAAGGGACTTCGCAGCCTATAGAAGCAGGGTGAAGTTTTCTCGCAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGAGAGGAAGGGATCCTGAGATGGGAGGCAAGCCTAGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGTCTACCGCCACAAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCACGG(SEQ ID NO:46)。
FMC63-CD28铰链/TM-CD28-CD3z的氨基酸序列如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:47)。
关于FMC63-CD28铰链-TM CAR的核酸序列的另一个例子如下：
ATGCTGCTGCTCGTGACCTCCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCACACCCTGCCTTCCTGCTGATCCCTGACATCCAGATGACCCAGACCACAAGCTCCCTGTCCGCCTCTCTGGGCGACAGAGTGACAATCTCTTGTAGGGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGATGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTATCACACATCTAGGCTGCACAGCGGAGTGCCATCCCGGTTTAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTACTCTCTGACAATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTACACATTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACCGGCAGCACATCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACCAAGGGAGAGGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCACCCAGCCAGTCCCTGTCTGTGACCTGTACAGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCAGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCTAGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACCACATACTATAATAGCGCCCTGAAGTCCAGACTGACCATCATCAAGGATAACAGCAAGTCCCAGGTGTTCCTGAAGATGAATTCCCTGCAGACCGACGATACAGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCCTATGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCTCTGTGACAGTGTCTAGCATCGAAGTGATGTATCCACCCCCTTACCTGGATAACGAGAAGAGCAATGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCATCTCCCCTGTTCCCTGGCCCAAGCAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGAGGCGTGCTGGCCTGTTATTCTCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAGGAGCAAGCGGAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGACCCGGCCCTACAAGAAAGCACTATCAGCCTTACGCACCACCAAGGGACTTCGCAGCCTATAGAAGCAGGGTGAAGTTTTCTCGCAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGAGAGGAAGGGATCCTGAGATGGGAGGCAAGCCTAGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGTCTACCGCCACAAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCACGG(SEQ ID NO:48)。
CD28铰链：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:49)。
CD28铰链核酸序列：
ATCGAAGTGATGTATCCACCCCCTTACCTGGATAACGAGAAGAGCAATGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCATCTCCCCTGTTCCCTGGCCCAAGCAAGCCC(SEQ ID NO:50)。
CD28 TM结构域：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:51)。
FMC63-PD-1铰链-TM CAR
具有下列组分的CAR的一个例子为：CSF2RA信号肽-FMC63轻链-连接体-重链-PD1铰链-PD-1TM-CD28 Costim-CD3ζ，如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSQVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVIERSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:52)。
关于FMC63-PD-1铰链-TM CAR的核酸序列如下：
ATGCTACTGCTGGTGACCAGCCTCCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCGTTCCTGCTCATCCCCGACATCCAGATGACCCAGACGACCTCCTCGCTGAGTGCATCACTGGGAGACCGCGTCACCATCTCATGCCGAGCTTCCCAGGACATTTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGACGGCACCGTCAAGCTGCTTATCTACCACACTAGTCGCCTCCACTCTGGCGTGCCCTCTAGATTTAGTGGCTCCGGCTCGGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAACAGGAGGACATAGCCACTTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTATACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACGGGTTCGACCTCCGGATCTGGGAAGCCGGGGTCCGGAGAGGGCTCCACTAAGGGTGAGGTGAAGCTCCAGGAGAGCGGGCCTGGGCTGGTAGCGCCCAGCCAGAGCTTATCCGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTCTCGCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGCCAGCCGCCCCGCAAAGGCTTGGAATGGCTAGGTGTGATCTGGGGCTCCGAGACCACCTATTACAACTCCGCCCTGAAGTCCCGGCTTACGATCATCAAGGACAACTCCAAGTCTCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCTCTTCAAACAGATGACACCGCCATCTATTACTGTGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAAGGAACTTCTGTTACAGTTTCCTCTCAGGTCCCAACAGCGCATCCCTCTCCAAGCCCGCGTCCCGCTGGACAGTTCCAGACTCTGGTGGTGGGCGTGGTGGGCGGGCTGCTGGGTTCTTTGGTGCTGCTGGTGTGGGTCCTCGCTGTCATTGAGCGCAGCAAGCGCAGCCGCCTGTTGCACAGCGATTACATGAATATGACTCCGCGCCGGCCTGGCCCAACGCGTAAGCACTACCAGCCGTACGCGCCCCCGAGAGACTTCGCTGCATACAGGTCCCGCGTAAAATTTTCGCGCTCTGCGGACGCTCCTGCCTATCAGCAGGGTCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTGGGCCGTAGGGAGGAGTACGATGTGCTCGACAAACGCCGTGGTCGGGACCCGGAGATGGGCGGTAAACCTCGGCGCAAGAATCCTCAGGAGGGCCTTTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGTATGAAGGGGGAACGCCGTCGCGGCAAGGGCCACGATGGATTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCATATGCAGGCCTTGCCGCCCCGC(SEQ ID NO:53)。
PD-1铰链
QVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV(SEQ ID NO:54)。
PD-1 TM结构域
VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(SEQ ID NO:55)。
FMC63-CTLA4铰链-TM CAR：
CSF2RA信号肽-FMC63轻链-连接体-重链-CTLA4铰链–CTLA-4 TM-CD28 Cost-CD3ζ
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSvidpepcpdsdfllwilaavssglffysflltaRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:56)
ATGTTACTGCTCGTTACTTCGCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCACACCCCGCGTTCTTGCTGATTCCGGATATCCAGATGACCCAGACGACCTCCTCCCTCTCCGCTAGTCTGGGGGACCGCGTGACCATCTCATGCCGAGCTTCCCAGGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGATGGGACCGTGAAGTTGCTCATTTACCACACCTCTCGTCTACACAGTGGTGTCCCTTCTCGCTTCTCGGGATCCGGTTCTGGTACAGATTACTCCTTGACCATCTCAAATCTTGAACAGGAGGACATCGCCACTTATTTCTGTCAGCAGGGCAACACGCTTCCGTACACCTTCGGCGGCGGTACTAAGCTGGAGATCACCGGCTCGACCAGCGGCTCGGGCAAGCCCGGCTCCGGCGAAGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGAAGCTCCAGGAGAGCGGACCCGGACTGGTGGCGCCAAGCCAGAGCCTGTCTGTGACCTGCACCGTGTCCGGCGTATCTCTGCCCGACTACGGCGTTAGTTGGATCCGCCAGCCGCCCCGCAAAGGCCTGGAGTGGCTAGGGGTCATATGGGGCTCCGAGACCACATACTACAACAGCGCACTGAAATCCCGCTTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAATTCCTTGCAGACTGATGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTATTACTACGGTGGCAGCTACGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGAACTTCTGTGACGGTGTCCTCCGTGATTGACCCGGAGCCATGTCCTGACAGTGACTTCCTGCTTTGGATCCTGGCCGCTGTCTCTTCTGGCCTTTTCTTTTACTCCTTCCTGCTGACAGCCAGGAGCAAGCGCAGCCGCCTGTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCCGCCCCGGGCCAACCCGCAAGCACTACCAACCCTATGCTCCCCCGCGCGACTTTGCGGCCTACAGATCACGAGTCAAATTTAGCCGCTCGGCGGACGCTCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTTTACAACGAGCTCAACCTGGGCAGAAGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGTCGCGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGTAAGCCTCGGCGCAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAGGCTTATTCGGAAATCGGTATGAAGGGGGAGCGGCGTCGTGGCAAAGGTCATGACGGCCTCTACCAGGGGCTGTCCACCGCCACCAAAGATACCTACGACGCATTACATATGCAGGCCCTGCCGCCGAGG(SEQ ID NO:57)。
CSF2RA信号肽
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:58)。
CTLA4铰链
VIDPEPCPDSD(SEQ ID NO:59)。
CTLA4 TM结构域
FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(SEQ ID NO:60)。
B.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，所述经基因改造的抗原受体包括重组TCR和/或从天然出现的T细胞中克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指这样的分子，其包含可变的α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变的γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)并且能够与结合至MHC受体的抗原特异性地结合。在一些实施方案中，所述TCR以αβ形式。在备选的实施方案中，所述细胞缺乏经改造的TCR；例如，在所述细胞中的内源性TCR可以靶向癌症或感染性疾病(例如，具有内源性TCR的CMV或EBV-特异性T细胞)。
典型地，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上是相似的，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学定位或功能。TCR可以在细胞的表面上或者以可溶形式被发现。通常，TCR被发现于T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在那里它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。在一些实施方案中，TCR也可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短的胞质尾区(参见例如，Janeway等人,1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C-末端处的短的胞质尾区。在一些实施方案中，TCR与在介导信号转导中所牵涉的CD3复合物的不变蛋白质相关联。除非另有说明，术语“TCR”应当被理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语也涵盖完整的或全长的TCR，包括以αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，对于本文中的目的，提及TCR包括任何TCR或功能性片段，例如TCR的抗原结合部分，其与结合在MHC分子中的特异性抗原肽(即MHC-肽复合物)相结合。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(它们可以互换使用)是指这样的分子，其包含TCR的结构结构域的一部分，但是结合完全TCR所与之结合的抗原(例如，MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成用于结合至特异性MHC-肽复合物的结合位点，例如通常其中每条链包含三个互补性决定区。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域相缔合以形成与免疫球蛋白类似的环或互补性决定区(CDR)，其赋予抗原识别并且通过形成TCR分子的结合位点决定肽特异性。典型地，像免疫球蛋白一样，所述CDR通过构架区(FR)分隔开(参见例如，Jores等人,1990；Chothia等人,1988；Lefranc等人,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，虽然也已显示α链的CDR1与所述抗原肽的N-末端部分相互作用，而β链的CDR1与所述肽的C-末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可以包含进一步的高可变性(HV4)区。
在一些实施方案中，所述TCR链包含恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链(例如，α-链、β-链)的细胞外部分可以包含两个免疫球蛋白结构域，在N-末端处的可变结构域(例如，Va或Vp；典型地，基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)，和一个邻近细胞膜的恒定结构域(例如，α-链恒定结构域或Ca，典型地，基于Kabat的氨基酸117至259；β-链恒定结构域或Cp，典型地，基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，由所述两条链形成的TCR的细胞外部分包含两个膜近侧恒定结构域和两个包含CDR的膜远侧可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短的连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而构成所述两条链之间的连接。在一些实施方案中，TCR可以在α和β链中的每一个之中具有额外的半胱氨酸残基，从而所述TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，所述TCR链可以包含跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是带正电荷的。在一些情况下，所述TCR链包含胞质尾区。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子例如CD3相缔合。例如，包含具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以锚定在细胞膜中的蛋白质并且与CD3信号传导器或复合物的不变亚基相缔合。
通常，CD3为多蛋白质复合物，其可以具有三条不同的链(γ、δ和ε)(在哺乳动物中)和ζ-链。例如，在哺乳动物中，该复合物可以包含一条CD3γ链、一条CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。所述CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白质，其包含单个免疫球蛋白结构域。所述CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区是带负电荷的，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链相缔合的特征。所述CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾各自包含单个保守基元(称为基于免疫受体酪氨酸的激活基元或ITAM)，而每条CD3ζ链具有三个。通常，ITAM牵涉TCR复合物的信号传导能力。这些附属分子具有带负电荷的跨膜区并且在将信号从TCR传送入细胞中发挥作用。所述CD3-链和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在一些实施方案中，所述TCR可以为两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以为单链TCR构建体。在一些实施方案中，所述TCR为包含两条相连接的(例如通过二硫键)分开的链(α和β链或者γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴定了关于靶抗原(例如，癌症抗原)的TCR并且将其引入到细胞中。在一些实施方案中，编码所述TCR的核酸聚合物可以获得自各种各样的来源，例如通过公众可得的TCR DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，所述TCR获得自生物来源，例如细胞例如T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或者其他公众可得的来源。在一些实施方案中，所述T细胞可以获得自体内分离的细胞。在一些实施方案中，高亲和力T细胞克隆可以从患者中分离，并且分离TCR。在一些实施方案中，所述T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)进行改造的转基因小鼠中生成了关于靶抗原的TCR克隆。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等人,2009和Cohen等人,2005)。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等人,2008和Li,2005)。在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分可以从所述TCR的序列的知识以合成方式生成。
C.抗原呈递细胞
抗原呈递细胞(其包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞)通过其特定MHC分子的表达来区分。APC使抗原内化，并且在其外部细胞膜上与MHC分子一起重新表达该抗原的一部分。所述MHC是具有多个基因座的大的遗传复合物。所述MHC基因座编码两个主要类别的MHC膜分子，被称为I类和II类MHC。T辅助淋巴细胞通常识别与II类MHC分子相缔合的抗原，并且T细胞毒性淋巴细胞识别与I类MHC分子相缔合的抗原。在人中，所述MHC被称为HLA复合物，和在小鼠中被称为H-2复合物。
在一些情况下，APC在制备本实施方案的治疗性组合物和细胞疗法产品中是有用的。对于关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指南，参见例如美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开号2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开号WO2007/103009。
APC系统可以包含至少一种外源性辅助分子。可以采用任何合适数目和组合的辅助分子。所述辅助分子可以选自诸如共刺激分子和粘附分子的辅助分子。示例性的共刺激分子包括CD86、CD64(FcγRI)、41BB配体和IL-21。粘附分子可以包括碳水化合物结合糖蛋白例如选择蛋白，跨膜结合糖蛋白例如整联蛋白，钙依赖性蛋白质例如钙粘着蛋白，和单次通过跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白，例如细胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞-细胞或细胞-基质接触。示例性的粘附分子包括LFA-3和ICAM，例如ICAM-1。对于选择、克隆、制备和表达示例性的辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)来说有用的技术、方法和试剂例示在例如美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001中。
D.抗原
在被在无限免疫细胞上的经基因改造的抗原受体或天然表达的抗原受体(例如，TCR)所靶向的抗原之中包括在待经由过继细胞疗法所靶向的疾病、状况或细胞类型的情景下表达的那些。在所述疾病和状况中包括增殖性的、赘生性的和恶性的疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液学癌症，免疫系统的癌症，例如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，例如B、T和髓性白血病，淋巴瘤，和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述抗原在所述疾病或状况的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达，相比于正常或非靶向的细胞或组织而言。在另一些实施方案中，所述抗原在正常细胞上表达和/或在经改造的细胞上表达。
任何合适的抗原都可以在本发明方法中使用。示例性的抗原包括但不限于，来自感染因子的抗原性分子、自身/自体抗原、肿瘤/癌症相关抗原和肿瘤新生抗原(Linnemann等人,2015)。在特别的方面，所述抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD70、CD79a、CD79b、SLAM-F7NY-ESO、EGFRvIII、Muc-1、Her2、CA-125、WT-1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4、CEA。在特别的方面，对于所述一种或两种或更多种抗原受体的抗原包括但不限于，CD19、EBNA、WT1、CD123、NY-ESO、EGFRvIII、MUC1、HER2、CA-125、WT1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4和/或CEA。关于这些抗原的序列在本领域中是已知的，例如CD19(登录号NG_007275.1)、EBNA(登录号NG_002392.2)、WT1(登录号NG_009272.1)、CD123(登录号NC_000023.11)、NY-ESO(登录号NC_000023.11)、EGFRvIII(登录号NG_007726.3)、MUC1(登录号NG_029383.1)、HER2(登录号NG_007503.1)、CA-125(登录号NG_055257.1)、WT1(登录号NG_009272.1)、Mage-A3(登录号NG_013244.1)、Mage-A4(登录号NG_013245.1)、Mage-A10(登录号NC_000023.11)、TRAIL/DR4(登录号NC_000003.12)和/或CEA(登录号NC_000019.10)。
肿瘤相关抗原可以源自前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、间皮瘤、卵巢癌或黑素瘤。示例性的肿瘤相关抗原或肿瘤细胞衍生抗原包括MAGE 1、MAGE 3和MAGE 4(或其他MAGE抗原，例如在国际专利公开号WO99/40188中所公开的那些)；PRAME；BAGE；RAGE、Lage(也称为NY ESO 1)；SAGE；和HAGE或GAGE。肿瘤抗原的这些非限制性例子在宽范围的肿瘤类型(例如，黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌)中表达。参见例如，美国专利号6,544,518。前列腺癌肿瘤相关抗原包括，例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶、NKX3.1和前列腺六次跨膜上皮抗原(STEAP)。
其他肿瘤相关抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto和Criptin。另外，肿瘤抗原可能是自身肽激素，例如全长促性腺激素释放激素(GnRH)(一种短的长度为10个氨基酸的肽)，其在许多癌症的治疗中是有用的。
肿瘤抗原包括源自以肿瘤相关抗原表达(例如，HER-2/neu表达)为特征的癌症的肿瘤抗原。目的肿瘤相关抗原包括谱系特异性肿瘤抗原，例如黑素细胞-黑素瘤谱系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白。举例说明性的肿瘤相关抗原包括但不限于，源自或包含下列项目中的任一个或多个的肿瘤抗原：p53，Ras，c-Myc，细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，A-Raf，B-Raf，和C-Raf，细胞周期蛋白依赖性激酶)，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12，MART-1，BAGE，DAM-6，DAM-10，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-8，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7B，NA88-A，MART-1，MC1R，Gp100，PSA，PSM，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，ART-4，CAMEL，CEA，Cyp-B，hTERT，hTRT，iCE，MUC1，MUC2，磷酸肌醇3-激酶(PI3K)，TRK受体，PRAME，P15，RU1，RU2，SART-1，SART-3，维耳姆斯肿瘤抗原(WT1)，AFP，-联蛋白/m，胱天蛋白酶-8/m，CEA，CDK-4/m，ELF2M，GnT-V，G250，HSP70-2M，HST-2，KIAA0205，MUM-1，MUM-2，MUM-3，肌球蛋白/m，RAGE，SART-2，TRP-2/INT2，707-AP，膜联蛋白II，CDC27/m，TPI/mbcr-abl，BCR-ABL，干扰素调节因子4(IRF4)，ETV6/AML，LDLR/FUT，Pml/RAR，肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)，TACSTD2，受体酪氨酸激酶(例如，表皮生长因子受体(EGFR)(特别是EGFRvIII)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR))，细胞质酪氨酸激酶(例如，src-家族、syk-ZAP70家族)，整联蛋白偶联性激酶(ILK)，信号转导蛋白和转录激活物STAT3、STATS和STATE，低氧诱导因子(例如，HIF-1和HIF-2)，核因子-κB(NF-B)，Notch受体(例如，Notch1-4)，c-Met，雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)，WNT，细胞外信号调节激酶(ERK)，及其调节亚基，PMSA，PR-3，MDM2，间皮素，肾细胞癌-5T4，SM22-α，碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250)，STEAD，TEL/AML1，GD2，蛋白酶3，hTERT，肉瘤易位断点，EphA2，ML-IAP，EpCAM，ERG(TMPRSS2ETS融合基因)，NA17，PAX3，ALK，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，多聚唾液酸，MYCN，RhoC，GD3，岩藻糖基GM1，mesothelian，PSCA，sLe，PLAC1，GM3，BORIS，Tn，GLoboH，NY-BR-1，RGsS，SART3，STn，PAX5，OY-TES1，精子蛋白17，LCK，HMWMAA，AKAP-4，SSX2，XAGE 1，B7H3，legumain，TIE2，Page4，MAD-CT-1，FAP，MAD-CT-2，fos相关抗原1，CBX2，CLDN6，SPANX，TPTE，ACTL8，ANKRD30A，CDKN2A，MAD2L1，CTAG1B，SUNC1，LRRN1和独特型。
抗原可以包括源自在肿瘤细胞中突变的基因或者源自相比于正常细胞而言在肿瘤细胞中以不同水平进行转录的基因的表位区域或表位肽，例如端粒酶、存活蛋白、间皮素、突变型ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变型或野生型p53、细胞色素P450 1B1和异常表达的内含子序列例如N-乙酰葡糖胺转移酶-V；在骨髓瘤和B-细胞淋巴瘤中生成独特的独特型的免疫球蛋白基因的克隆重排；包含源自肿瘤病毒过程的表位区域或表位肽的肿瘤抗原，例如人乳头瘤病毒蛋白E6和E7；EB病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变型癌胚蛋白，例如癌胚抗原和甲胎蛋白。
在某些实施方案中，所述抗原可以是微生物的。在一些实施方案中，抗原获得自或源自致病微生物或者机会致病微生物(在本文中也称为感染性疾病微生物)，例如病毒、真菌、寄生虫和细菌。在某些实施方案中，源自此类微生物的抗原包括全长蛋白质。
其抗原被考虑用于在本文中所描述的方法之中使用的举例说明性的致病生物包括人免疫缺陷病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，巨细胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)，甲型、乙型和丙型流感，水泡性口膜炎病毒(VSV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，多瘤病毒(例如，BK病毒和JC病毒)，腺病毒，冠状病毒例如SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS，葡萄球菌属(Staphylococcus)物种，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)，和链球菌属(Streptococcus)物种，包括肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)。如技术人员将会理解的，用于用作在本文中所描述的抗原的源自这些和其他致病微生物的蛋白质以及编码所述蛋白质的核苷酸序列可以在出版物中和在公共数据库例如
Figure BDA0003604711340000681
SWISS-
Figure BDA0003604711340000682
和
Figure BDA0003604711340000683
中得到鉴定。
源自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原包括下列各项中的任一个：HIV病毒粒子结构蛋白(例如，gp120、gp41、p17、p24)，蛋白酶，逆转录酶，或者由tat、rev、nef、vif、vpr和vpu所编码的HIV蛋白质。
源自单纯疱疹病毒的抗原(例如，HSV 1和HSV2)包括但不限于，从HSV晚期基因表达的蛋白质。晚期基因组主要编码形成病毒粒子颗粒的蛋白质。此类蛋白质包括形成病毒衣壳的五种蛋白质(UL)：UL6，UL18，UL35，UL38，和主要衣壳蛋白UL19，UL45，和UL27，其各自可以用作在本文中所描述的抗原。被考虑用于用作在本文中的抗原的其他举例说明性的HSV蛋白质包括ICP27(H1、H2)、糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)这些蛋白质。HSV基因组包括至少74个基因，其各自编码可以潜在地用作抗原的蛋白质。
源自巨细胞病毒(CMV)的抗原包括CMV结构蛋白，在病毒复制的立即早期和早期期间表达的病毒抗原，糖蛋白I和III，衣壳蛋白，外壳蛋白，下基质蛋白pp65(ppUL83)，p52(ppUL44)，IE1和1E2(UL123和UL122)，来自UL128-UL150的基因簇的蛋白质产物(Rykman等人,2006)，包膜糖蛋白B(gB)，gH，gN，和pp150。如技术人员将会理解的，用于用作在本文中所描述的抗原的CMV蛋白质可以在公共数据库例如
Figure BDA0003604711340000691
SWISS-
Figure BDA0003604711340000692
和
Figure BDA0003604711340000693
中得到鉴定(参见例如，Bennekov等人,2004；Loewendorf等人,2010；Marschall等人,2009)。
被考虑用于在某些实施方案中使用的源自EB病毒(EBV)的抗原包括：EBV裂解蛋白gp350和gp110，在潜伏周期感染期间产生的EBV蛋白质，包括EB核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)和潜伏膜蛋白(LMP)-1、LMP-2A和LMP-2B(参见例如，Lockey等人,2008)。
被考虑用于在本文中使用的源自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原包括由RSV基因组所编码的十一种蛋白质或者其抗原性片段中的任一种：NS1，NS2，N(核衣壳蛋白)，M(基质蛋白)，SH、G和F(病毒外壳蛋白)，M2(第二基质蛋白)，M2-1(延伸因子)，M2-2(转录调控)，RNA聚合酶，和磷蛋白P。
被考虑用于进行使用的源自水泡性口膜炎病毒(VSV)的抗原包括由VSV基因组所编码的五种主要蛋白质及其抗原性片段中的任一种：大蛋白(L)、糖蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M)(参见例如，Rieder等人,1999)。
被考虑用于在某些实施方案中使用的源自流感病毒的抗原包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白M1和M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和PB2。
示例性的病毒抗原还包括但不限于，腺病毒多肽、甲病毒多肽、杯状病毒多肽(例如，杯状病毒衣壳抗原)、冠状病毒多肽、温热病毒多肽、埃博拉病毒多肽、肠道病毒多肽、黄病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(乙型肝炎核心或表面抗原，丙型肝炎病毒E1或E2糖蛋白、核心或非结构蛋白)、疱疹病毒多肽(包括单纯疱疹病毒或水痘-带状疱疹病毒糖蛋白)、传染性腹膜炎病毒多肽、白血病病毒多肽、马尔堡病毒多肽、正粘病毒多肽、乳头瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如，血凝素和神经氨酸酶多肽)、副粘病毒多肽、细小病毒多肽、瘟病毒多肽、小RNA病毒多肽(例如，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽)、痘病毒多肽(例如，痘苗病毒多肽)、狂犬病毒多肽(例如，狂犬病毒糖蛋白G)、呼肠孤病毒多肽、逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。
在某些实施方案中，所述抗原可以为细菌抗原。在某些实施方案中，目的细菌抗原可以为分泌的多肽。在其他某些实施方案中，细菌抗原包括具有暴露在细菌的外部细胞表面上的多肽的部分的抗原。
被考虑用于进行使用的源自葡萄球菌属物种(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))的抗原包括：毒力调节物，例如Agr系统，Sar和Sae，Arl系统，Sar同源物(Rot、MgrA、SarS、SarR、SarT、SarU、SarV、SarX、SarZ和TcaR)，Srr系统，和TRAP。可以充当抗原的其他葡萄球菌属蛋白质：包括Clp蛋白、HtrA、MsrR、顺乌头酸酶、CcpA、SvrA、Msa、CfvA和CfvB(参见例如，Staphylococcus:Molecular Genetics,2008 Caister Academic Press,编者JodiLindsay)。关于金黄色葡萄球菌的两个种类(N315和Mu50)的基因组已经进行了测序并且是公众可得的，例如在PATRIC(PATRIC:The VBI PathoSystems Resource IntegrationCenter,Snyder等人,2007)。如技术人员将会理解的，用于用作抗原的葡萄球菌属蛋白质也可以在其他公共数据库例如
Figure BDA0003604711340000701
Swiss-
Figure BDA0003604711340000702
和
Figure BDA0003604711340000703
中得到鉴定。
被考虑用于在本文中所描述的某些实施方案之中使用的源自肺炎链球菌的抗原包括：肺炎链球菌溶血素、PspA、胆碱结合蛋白A(CbpA)、NanA、NanB、SpnHL、PavA、LytA、Pht和菌毛蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎链球菌的抗原性蛋白质也是本领域中已知的，并且可以在一些实施方案中用作抗原(参见例如，Zysk等人,2000)。肺炎链球菌的强毒株的完整基因组序列已经进行了测序，并且如技术人员将会理解的，用于在本文中使用的肺炎链球菌也可以在其他公共数据库例如
Figure BDA0003604711340000711
和
Figure BDA0003604711340000712
中得到鉴定。用于根据本公开内容的抗原的特别感兴趣的蛋白质包括毒力因子和被预测暴露在肺炎球菌表面上的蛋白质(参见例如，Frolet等人,2010)。
可以用作抗原的细菌抗原的例子包括但不限于：放线菌属(Actinomyces)多肽、芽孢杆菌属(Bacillus)多肽、拟杆菌属(Bacteroides)多肽、博德特氏菌属(Bordetella)多肽、巴尔通氏体属(Bartonella)多肽、疏螺旋体属(Borrelia)多肽(例如，布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)OspA)、布鲁氏菌属(Brucella)多肽、弯曲杆菌属(Campylobacter)多肽、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)多肽、衣原体属(Chlamydia)多肽、棒杆菌属(Corynebacterium)多肽、考克斯氏体属(Coxiella)多肽、嗜皮菌属(Dermatophilus)多肽、肠球菌属(Enterococcus)多肽、埃里希氏体属(Ehrlichia)多肽、埃希氏菌属(Escherichia)多肽、佛朗西丝氏菌属(Francisella)多肽、梭杆菌属(Fusobacterium)多肽、血巴通氏体属(Haemobartonella)多肽、嗜血菌属(Haemophilus)多肽(例如，流感嗜血菌(H.influenzae)b型外膜蛋白)、螺杆菌属(Helicobacter)多肽、克雷伯氏菌属(Klebsiella)多肽、L-型细菌多肽、钩端螺旋体属(Leptospira)多肽、利斯特氏菌属(Listeria)多肽、分枝杆菌属(Mycobacteria)多肽、枝原体属(Mycoplasma)多肽、奈瑟氏球菌属(Neisseria)多肽、新立克次氏体属(Neorickettsia)多肽、诺卡氏菌属(Nocardia)多肽、巴斯德氏菌属(Pasteurella)多肽、消化球菌属(Peptococcus)多肽、消化链球菌属(Peptostreptococcus)多肽、肺炎球菌属(Pneumococcus)多肽(即肺炎链球菌(S.pneumoniae)多肽)(参见在本文中的描述)、变形菌属(Proteus)多肽、假单胞菌属(Pseudomonas)多肽、立克次氏体属(Rickettsia)多肽、罗卡利马氏体属(Rochalimaea)多肽、沙门氏菌属(Salmonella)多肽、志贺氏菌属(Shigella)多肽、葡萄球菌属(Staphylococcus)多肽、A族链球菌多肽(例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)M蛋白)、B族链球菌(无乳链球菌(S.agalactiae))多肽、密螺旋体属(Treponema)多肽和耶尔森氏菌属(Yersinia)多肽(例如，鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)F1和V抗原)。
真菌抗原的例子包括但不限于：犁头霉属(Absidia)多肽、枝顶孢属(Acremonium)多肽、链格孢属(Alternaria)多肽、曲霉属(Aspergillus)多肽、蛙粪霉属(Basidiobolus)多肽、离蠕孢霉属(Bipolaris)多肽、芽酵母属(Blastomyces)多肽、假丝酵母属(Candida)多肽、球孢子菌属(Coccidioides)多肽、耳霉属(Conidiobolus)多肽、隐球酵母属(Cryptococcus)多肽、弯孢霉属(Curvalaria)多肽、表皮癣菌属(Epidermophyton)多肽、外瓶霉属(Exophiala)多肽、地霉属(Geotrichum)多肽、组织孢浆菌属(Histoplasma)多肽、马杜拉分支菌属(Madurella)多肽、马拉色霉菌属(Malassezia)多肽、小孢霉属(Microsporum)多肽、小丛梗孢属(Moniliella)多肽、被孢霉属(Mortierella)多肽、毛霉属(Mucor)多肽、拟青霉素(Paecilomyces)多肽、青霉属(Penicillium)多肽、单胞瓶霉属(Phialemonium)多肽、瓶霉属(Phialophora)多肽、原藻属(Prototheca)多肽、假性阿利什利菌属(Pseudallescheria)多肽、假小托菌属(Pseudomicrodochium)多肽、腐霉属(Pythium)多肽、鼻孢子菌属(Rhinosporidium)多肽、根霉属(Rhizopus)多肽、线状担子菌属(Scolecobasidium)多肽、孢子丝菌属(Sporothrix)多肽、匍柄霉属(Stemphylium)多肽、发癣菌属(Trichophyton)多肽、丝孢酵母属(Trichosporon)多肽和木丝霉属(Xylohypha)多肽。
原生动物寄生虫抗原的例子包括但不限于：巴贝虫属(Babesia)多肽、肠袋虫属(Balantidium)多肽、贝西诺原虫属(Besnoitia)多肽、隐孢子虫属(Cryptosporidium)多肽、艾美虫属(Eimeria)多肽、脑胞内原虫属(Encephalitozoon)多肽、内阿米巴属(Entamoeba)多肽、贾第虫属(Giardia)多肽、哈蒙德虫属(Hammondia)多肽、肝簇虫属(Hepatozoon)多肽、等孢子球虫属(Isospora)多肽、利什曼原虫属(Leishmania)多肽、微孢子目(Microsporidia)多肽、新孢子虫属(Neospora)多肽、小孢子虫属(Nosema)多肽、五鞭毛滴虫属(Pentatrichomonas)多肽、疟原虫属(Plasmodium)多肽。蠕虫寄生虫抗原的例子包括但不限于：棘唇线虫属(Acanthocheilonema)多肽、猫圆线虫属(Aelurostrongylus)多肽、钩口线虫属(Ancylostoma)多肽、管圆线虫属(Angiostrongylus)多肽、蛔虫属(Ascaris)多肽、布鲁丝虫属(Brugia)多肽、仰口线虫属(Bunostomum)多肽、毛细线虫属(Capillaria)多肽、夏氏线虫属(Chabertia)多肽、库珀线虫属(Cooperia)多肽、环体线虫属(Crenosoma)多肽、网尾线虫属(Dictyocaulus)多肽、膨结线虫属(Dioctophyme)多肽、棘唇线虫属(Dipetalonema)多肽、裂头绦虫属(Diphyllobothrium)多肽、复孔绦虫属(Dipylidium)多肽、恶丝虫属(Dirofilaria)多肽、龙线虫属(Dracunculus)多肽、蛲虫属(Enterobius)多肽、丝虫属(Filaroides)多肽、血矛线虫属(Haemonchus)多肽、兔唇蛔虫属(Lagochilascaris)多肽、罗阿丝虫属(Loa)多肽、曼森线虫属(Mansonella)多肽、缪勒线虫属(Muellerius)多肽、隐孔侏形吸虫属(Nanophyetus)多肽、板口线虫属(Necator)多肽、细颈线虫属(Nematodirus)多肽、结节线虫属(Oesophagostomum)多肽、盘尾丝虫属(Onchocerca)多肽、后睾吸虫属(Opisthorchis)多肽、胃线虫属(Ostertagia)多肽、副丝虫属(Parafilaria)多肽、并殖吸虫属(Paragonimus)多肽、副蛔虫属(Parascaris)多肽、泡翼线虫属(Physaloptera)多肽、原圆线虫属(Protostrongylus)多肽、鬃丝虫属(Setaria)多肽、旋尾线虫属(Spirocerca)多肽、迭宫绦虫属(Spirometra)多肽、冠丝虫属(Stephanofilaria)多肽、类圆线虫属(Strongyloides)多肽、圆线虫属(Strongylus)多肽、吸吮线虫属(Thelazia)多肽、弓蛔线虫属(Toxascaris)多肽、弓蛔虫属(Toxocara)多肽、毛线虫属(Trichinella)多肽、毛圆线虫属(Trichostrongylus)多肽、鞭虫属(Trichuris)多肽、钩虫属(Uncinaria)多肽和吴策线虫属(Wuchereria)多肽。(例如，恶性疟原虫(P.falciparum)环子孢子(PfCSP)、子孢子表面蛋白2(PfSSP2)、肝期抗原1的羧基末端(PfLSA1c-term)和输出蛋白1(PfExp-1))、肺囊虫属(Pneumocystis)多肽、肉孢子虫属(Sarcocystis)多肽、裂体吸虫属(Schistosoma)多肽、泰勒虫属(Theileria)多肽、弓形虫属(Toxoplasma)多肽和锥虫属(Trypanosoma)多肽。
外寄生物的例子包括但不限于来自下列各项的多肽(包括抗原以及变应原)：跳蚤类；蜱类，包括硬蜱和软蜱；蝇类，例如蠓、蚊、白蛉、黑蝇、马蝇、角蝇、斑虻、采采蝇、厩蝇、引起蝇蛆病的蝇类和咬蚋；蚂蚁类；蜘蛛类；虱；螨类；和蝽类，例如臭虫和猎蝽。
E.自杀基因
本公开内容的无限免疫细胞(包括可以表达一种或多种CAR和/或一种或多种经改造的TCR的那些)可以包含一种或多种自杀基因。如在本文中所使用的，术语“自杀基因”被定义为这样的基因，其在施用前体药物后实现基因产物向杀伤其宿主细胞的化合物的转变。可以使用的自杀基因/前体药物组合的例子为截短的EGFR和西妥昔单抗；单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶和环己米特；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)和AZT；和脱氧胞苷激酶和阿糖胞苷。
V.递送至细胞的方法
本领域技术人员将会有能力通过标准重组技术(参见例如，Sambrook等人,2001和Ausubel等人,1996，两者都通过提及而引入本文)来构建载体以用于本公开内容的抗原受体的表达。载体包括但不限于：质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)，例如逆转录病毒载体(例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如，源自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括其有复制能力的、复制缺陷的和无内容的形式)、腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、EB病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、Harvey鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体、细小病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、水泡性口膜炎病毒载体、maraba病毒载体和B组腺病毒enadenotucirev载体。
A.病毒载体
在本公开内容的某些方面可以提供编码BCL6和细胞存活促进基因和/或抗原受体的病毒载体。在生成重组病毒载体中，非必需基因典型地被关于异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列替代。病毒载体是表达构建体的一个种类，其利用病毒序列来将核酸聚合物和可能地蛋白质引入到细胞中。某些病毒经由受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞并且整合到宿主细胞基因组中并且稳定地且有效地表达病毒基因的能力使得它们成为用于将外来核酸聚合物转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。可以用于递送本公开内容的某些方面的核酸聚合物的病毒载体的非限制性例子在下面进行了描述。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调控或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域中众所周知的(参见例如，美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒能够感染非分裂细胞，并且可以用于核酸聚合物序列的体内和离体基因转移和表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒—其中用两种或更多种携带包装功能，即gag、pol和env，以及rev和tat的载体转染合适的宿主细胞—描述在美国专利5,994,136(其通过提及而合并入本文)中。
B.调控元件
在本公开内容中有用的载体之中所包含的表达盒特别地包含(以5'-至-3'方向)与蛋白质编码序列可操作地连接的真核转录启动子、剪接信号(包括间插序列)和转录终止/多腺苷酸化序列。在真核细胞中控制蛋白质编码基因的转录的启动子和增强子由多个遗传元件组成。细胞机器能够收集并且整合由每个元件所传达的调控信息，从而允许不同的基因发展出不同的、常常复杂的转录调控模式。在本公开内容的情景下使用的启动子包括组成性的、诱导型的和组织特异性的启动子。
C.启动子/增强子
在本文中所提供的表达构建体包含启动子以驱动抗原受体的表达。启动子通常包含这样的序列，其发挥功能以放置关于RNA合成的起始位点。对此的最有名的例子是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的启动子中，例如关于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和关于SV40晚期基因的启动子，叠置在起始位点本身上的离散的元件有助于固定起始位置。另外的启动子元件调控转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30110bp的区域中，虽然许多启动子已显示出也包含在起始位点下游的功能元件。为了使编码序列处于启动子的“控制之下”，人们将转录阅读框的转录起始位点的5′末端放置于所选择的启动子的“下游”(即3′)。“上游”启动子刺激所述DNA的转录并且促进所编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔经常是灵活的，从而当元件相对于另一个元件被倒置或移动时，保留了启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加至相距50bp，之后活性开始下降。取决于启动子，看起来独个元件既可以协作地也可以独立地发挥功能以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”相联合地进行使用，所述增强子是指在核酸序列的转录激活中所牵涉的顺式作用调控序列。
启动子可以是与核酸序天然地相关联的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′-非编码序列来获得。这样的启动子可以称为是“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然地相关联的增强子，其位于那个序列的下游或上游。备选地，通过将编码核酸区段放置于重组或异源启动子(其是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的启动子)的控制之下将会获得某些优势。重组或异源增强子也是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，和从任何其他病毒或者原核或真核细胞中分离出的启动子或增强子，和不“天然地出现的”启动子或增强子，即其包含不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，在重组DNA构建中最经常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子系统。除了以合成方式产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以结合在本文中所公开的组合物通过使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)来产生序列。进一步地，考虑了也可以采用指导在非核细胞器(例如，线粒体、叶绿体等)之内的序列的转录和/或表达的控制序列。
自然，重要的将会是，采用这样的启动子和/或增强子，其有效地指导在被选择用于进行表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中DNA区段的表达。分子生物学领域的技术人员通常知晓用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用(参见例如，Sambrook等人,1989，其通过提及而合并入本文)。所采用的启动子可以是组成性的，组织特异性的，诱导型的，和/或在合适的条件下对于指导所引入的DNA区段的高水平表达来说有用，例如在重组蛋白质和/或肽的大规模产生中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。
另外，也可以使用任何启动子/增强子组合(按照例如真核启动子数据库EPDB，在epd.isb-sib.ch/处通过万维网)来驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。真核细胞可以支持从某些细菌启动子的细胞质转录，如果提供合适的细菌聚合酶，无论作为递送复合物的一部分还是作为另外的遗传表达构建体。
启动子的非限制性例子包括：早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；和连环应答元件启动子，例如环AMP应答元件启动子(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和在最小TATA盒附近的应答元件启动子(tre)。也可能的是使用人生长激素启动子序列(例如，在Genbank中所描述的人生长激素最小启动子，登录号X05244，核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(从ATCC可得，目录号ATCC 45007)。在某些实施方案中，所述启动子为CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、I类MHC或II类MHC启动子，但是对于驱动治疗性基因的表达来说有用的任何其他启动子也可适用于本公开内容的实践。
在某些方面，本公开内容的方法还涉及增强子序列，即增加启动子的活性并且具有顺式地并且无论其方向地，甚至在相对长的距离(直至远离靶启动子几千碱基)上起作用的潜力的核酸序列。但是，增强子功能不是必需限制于这样的长距离，因为它们也可以在与给定的启动子靠得很近处发挥功能。
D.起始信号和联动表达
在本公开内容中所提供的表达构建体之中也可以使用特定的起始信号以用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将会容易地能够决定这并且提供必需的信号。众所周知，起始密码子必须与所希望的编码序列的阅读框“符合读框”以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包括合适的转录增强子元件来增强表达的效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来创造多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕开5’甲基化的帽依赖性翻译的核糖体扫描模式并且在内部位点处开始翻译。已经描述了来自小RNA病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)的IRES元件，以及来自哺乳动物信息的IRES。可以将IRES元件与异源开放阅读框相连接。多个开放阅读框可以一起被转录，每个通过IRES分隔开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框对于核糖体来说是可接近的，以便于有效翻译。通过使用单个启动子/增强子来转录单个信息，可以有效地表达多个基因。
另外，某些2A序列元件可以用于产生在本公开内容中所提供的构建体之中的基因的联动表达或共表达。例如，切割序列可以用于通过连接开放阅读框以形成单个顺反子来共表达基因。一个示例性的切割序列为F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A-样”序列(例如，明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A；T2A).
E.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以包含一个或多个复制起点位点(通常称为“ori”)，例如，相应于在上面所描述的EBV的oriP的核酸序列或者具有相似或提高的在编程中的功能的经基因改造的oriP，其是复制在其处起始的特定核酸序列。备选地，可以采用在上面所描述的其他染色体外复制型病毒的复制起点或者自主复制序列(ARS)。
F.选择和可筛选标记物
在一些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标记物来在体外或在体内鉴定包含本公开内容的构建体的细胞。此类标记物将会赋予所述细胞以可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定包含所述表达载体的细胞。通常，选择标记物为赋予允许进行选择的特性的标记物。正选择标记物为其中该标记物的存在允许其选择的标记物，而负选择标记物为其中其存在阻止其选择的标记物。正选择标记物的一个例子为药物抗性标记物。
通常，包括药物选择标记物有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对于新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标记物。除了赋予允许基于条件的实施来区别转化体的表型的标记物外，还考虑了其他类型的标记物，包括可筛选标记物例如GFP，其基础是色度分析。备选地，可以使用可筛选酶作为负选择标记物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将会知道如何采用免疫标记物，可能地与FACS分析相联合地。不认为所使用的标记物是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择和可筛选标记物的进一步的例子是本领域技术人员熟知的。
G.核酸聚合物递送的方法
所述经改造的免疫细胞可以通过使用本领域技术人员已知的许多经充分建立的基因转移方法来进行构建。在某些实施方案中，所述经改造的细胞通过使用基于病毒载体的基因转移方法以引入核酸聚合物来进行构建。所述基于病毒载体的基因转移方法可以包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒或腺伴随病毒载体。在某些实施方案中，所述经改造的细胞通过使用基于非病毒载体的基因转移方法以引入核酸聚合物来进行构建。在某些实施方案中，所述基于非病毒载体的基因转移方法包括基因编辑方法，其选自由下列各项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats；CRISPR)/CRISPR-相关蛋白9(Cas9)核酸酶。在某些实施方案中，所述基于非病毒载体的基因编辑方法包括转染或转化方法，其选自由下列各项组成的组：脂质转染、nucleofection、病毒体、脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和DNA的试剂增强摄取。
所述细胞可以进行改造以通过随机插入或位点定向插入来表达目的基因和/或抗原受体，例如通过基因编辑方法，其包括但不限于兆碱基大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas系统。
除了编码目的基因和/或抗原受体的核酸聚合物的病毒递送外，下面的是另外的重组基因递送至给定宿主细胞的方法并且因此在本公开内容中加以考虑。核酸聚合物例如DNA或RNA向本公开内容的免疫细胞中的引入可以使用任何合适的用于核酸聚合物递送以转化细胞的方法，其是在本文中所描述的或者将会是本领域普通技术人员已知的。此类方法包括但不限于：DNA的直接递送，例如通过离体转染、通过注射(包括微量注射)；通过电穿孔；通过磷酸钙沉淀；通过使用DEAE-葡聚糖以及随后的聚乙二醇；通过直接声波加载；通过脂质体介导的转染和受体介导的转染；通过微粒轰击；通过与碳化硅纤维一起进行摇动；通过土壤杆菌(Agrobacterium)-介导的转化；通过干燥/抑制介导的DNA摄取，和此类方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，可以稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物。
VI.治疗方法
本发明的无限免疫细胞可以用于疗法和研究两者。本发明的无限免疫细胞(包括表达CAR和/或经改造的TCR的T细胞或NK细胞)可以用于治疗癌症、感染性疾病、免疫病症或炎性病症。
在一个方法中，靶向抗原(例如，CD19、CD20、CD22、CD79a、CD79b或BAFF-R)的同种异体的现成的CAR T细胞可以(单独地或相组合地)用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤。同种异体的现成的抗间皮素CAR T细胞可以用于治疗例如间皮瘤、胰腺腺癌或卵巢癌。靶向NY-ESO的TCR-T细胞可以用于治疗例如黑素瘤或多发性骨髓瘤。针对病毒例如EBV、CMV、BK病毒等的病毒特异性T细胞可以用于治疗各自的病毒感染。同种异体的抑制性或调节性T细胞可以用于治疗自身免疫性病症、GVHD和其他炎性病症。
在特别的实施方案中，γ/δT细胞和病毒特异性T细胞不可能引起GvHD，但是提供额外的抗肿瘤和/或抗病毒功能。在特别的实施方案中，病毒特异性无限T细胞可以用于至少两个目的。第一，病毒特异性无限T细胞可以用于治疗特定的病毒感染，例如CMV或EBV感染，或者某些癌症。第二个实施方案是将一种或多种CAR和/或经改造的TCR转导入病毒特异性T细胞中。这样的具有病毒特异性内源TCR的无限CAR T细胞可以具有潜在的优点，例如不可能引起GVHD。这样的携带病毒特异性内源TCR的细胞不需要基因编辑方法来敲除所述T细胞中的TCR。如果人们组合了基因编辑技术例如CRISPR/Cas9，那么就不是必然需要病毒特异性T细胞来产生CAR-T细胞。备选地，人们可以使用γ/δ无限CAR T细胞或者CAR-NK或CAR-NKT或CAR-先天淋巴样细胞、它们不引起GvHD并且被预期不需要TCR敲除。
当意欲用于在人中使用时，首先在动物模型(例如在癌症研究中经常使用的NSG小鼠模型)中就杀肿瘤活性和治疗效力来测试本发明的经修饰的细胞系。在小鼠中的此类研究是临床前研究，其可以在施行在患者中的治疗性使用之前进行。
所述无限免疫细胞可以用于治疗癌症，包括血液学和非血液学恶性肿瘤，例如通过向患者施用有效量的表达针对不同肿瘤靶标的不同CAR或TCR的经修饰的细胞毒性无限T细胞(单独地或相组合地)。例如，CD19 inCART(其之一是Ie1-L4aJ3细胞(用具有截短的人EFGR标记物的针对人CD19的CAR进行转导的来自健康供者1的CD8阳性细胞))可以与IL-2或IL-15一起进行施用以治疗具有B细胞白血病或淋巴瘤的患者。所述Ie1-L4aJ3细胞可以存在于常规药用赋形剂(例如，水或缓冲盐水)中。在向患者施用后，所述经修饰的细胞可以通过由CD19指导的杀伤来阻止肿瘤的生长。对于人患者，所述免疫细胞可以通过静脉内输注(i.v.)来给予。但是，可以使用其他施用方法，例如皮下(s.c.)注射。在成功地根除赘生性细胞后，可以通过撤除IL-2或IL-15或者通过输注抗-EGFR抗体来清除所述免疫细胞。
所述无限免疫细胞(以及一种或多种细胞因子，例如IL-2和/或IL-15，当使用时)的合适剂量取决于受者的年龄、健康、性别和体重，以及受者为了相关或非相关的状况正在经历的任何其他并行治疗而变化。本领域技术人员可以容易地确定待施用给所述患者的经修饰的细胞和药物的合适剂量，这取决于上面提及的因素。构成有效的杀肿瘤量的细胞数目可以通过使用动物模型来确定。这些参数可以由本领域技术人员容易地确定。
本疗法针对肿瘤的有效性可以通过检测在患者外周血或骨髓的样品中任何存活的肿瘤细胞或者通过其他诊断性成像研究例如CT、MRI或PET扫描来测定。类似地，可以通过使用诸如流式细胞术和聚合酶链式反应的方法来监测任何残留的、不想要的经修饰的无限T细胞。
相比于先前的细胞毒性细胞系例如TALL-104和NK-92细胞而言，无限免疫细胞从正常的免疫细胞生成。因此，相比于TALL-104和NK-92而言，用无限免疫细胞的致白血病风险是低的，因为预期无限免疫细胞不具有任何其他未知的致瘤遗传突变。此外，无限细胞的增殖可以通过中断IL-2或IL-15来停止。这是相对于白血病衍生细胞系TALL-104和NK-92而言的无可匹敌的安全优势。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于免疫疗法的方法，其包括施用有效量的本公开内容的免疫细胞。在本公开内容的某些实施方案中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群体来治疗癌症或感染。在本文中提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括向所述个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。本方法可以应用于治疗免疫病症、实体癌、血液学癌症和病毒感染。
本治疗方法对其来说有用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液学肿瘤中发现的那些。示例性的实体瘤可以包括但不限于从由下列各项组成的组中选择的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳腺。示例性的血液学肿瘤包括骨髓的肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用在本文中所提供的方法来进行治疗的癌症的进一步例子包括但不限于：肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、胃部或胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑素瘤。
所述癌症可以特别地是下列组织学类型的，虽然并不限于这些：赘生物，恶性的；癌；癌，未分化的；巨大和纺锤状细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；合并的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性的；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无被囊性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液囊腺癌；粘液囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺的；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性的；卵巢基质瘤，恶性的；泡膜细胞瘤，恶性的；粒层细胞瘤，恶性的；男性细胞瘤，恶性的；塞托利细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性的；脂质细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳房外副神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；恶性雀斑样痣黑素瘤；肢端雀斑样痣黑素瘤；结节性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性的；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合瘤，恶性的；米勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间充质瘤，恶性的；布伦纳瘤，恶性的；分叶状瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性的；卵巢甲状腺肿，恶性的；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性的；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性的；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性的；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性的；间质性软骨肉瘤；骨的巨大细胞瘤；尤因肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性的；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形胶质细胞瘤；原浆性星形胶质细胞瘤；纤维性星形胶质细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性的；粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞的；恶性淋巴瘤，大细胞的，弥漫性的；恶性淋巴瘤，滤泡性的；蕈样霉菌病；其他特化的非霍奇金淋巴瘤；B-细胞淋巴瘤；低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度淋巴母细胞NHL；高度小无裂细胞NHL；巨块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS-相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞白血病；嗜酸细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；多毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；和慢性原始粒细胞白血病。
在本公开内容的某些实施方案中，将免疫细胞递送给有此需要的个体，例如具有癌症或感染的个体。然后，所述细胞增强所述个体的免疫系统以攻击各自的癌症或致病细胞。在一些情况下，给所述个体提供一个或多个剂量的所述免疫细胞。在给所述个体提供两个或更多个剂量的所述免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应当足以允许用于在所述个体中进行繁殖的时间，并且在特别的实施方案中，剂量之间的持续时间为l、2、3、4、5、6、7或更多天。
本公开内容的某些实施方案提供了用于治疗或预防免疫介导的病症的方法。在一个实施方案中，所述受试者具有自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性例子包括：斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、贝赫切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、腹部爆发性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、丘-斯综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉-巴综合症、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、肾病综合征(例如微小病变疾病、局灶性肾小球硬化或膜性肾病)、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、赖特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎(例如，结节性多动脉炎，高安动脉炎，颞动脉炎/巨大细胞动脉炎，或疱疹样皮炎，脉管炎)、白斑和韦格纳肉芽肿病。因此，可以使用在本文中所公开的方法来进行治疗的自身免疫性疾病的一些例子包括但不限于多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、重症肌无力、肾小球肾炎、强直性脊椎炎、脉管炎或银屑病。所述受试者也可以具有变应性病症例如哮喘。
在另外一个实施方案中，所述受试者为所移植的器官或干细胞的受者，并且使用免疫细胞来预防或/或治疗排斥。在特别的实施方案中，受试者具有移植物抗宿主病或者处于发展出移植物抗宿主病的风险中。GVHD是使用或包含来自相关或不相关供者的干细胞的任何移植物的可能的并发症。存在两个种类的GVHD，即急性的和慢性的。急性GVHD在移植后的前三个月内出现。急性GVHD的征候包括手和足上的微红色皮疹，其可能扩展并且变得更严重，其中具有皮肤脱落和起泡。急性GVHD也可以影响胃和肠，在这种情况下存在痛性痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛发黄(黄疸)表明，急性GVHD已影响肝脏。慢性GVHD基于其严重度来进行分级：阶段/等级1是轻微的；阶段/等级4是严重的。慢性GVHD在移植后三个月或更晚发展。慢性GVHD的症状与急性GVHD的那些类似，但是另外，慢性GVHD还可能影响眼睛中的粘液腺、口中的唾液腺以及润滑胃壁和肠的腺体。可以使用在本文中所公开的免疫细胞群体中的任一种。所移植的器官的例子包括实体器官移植物，例如肾、肝脏、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或者细胞移植物，例如胰岛、肝细胞、成肌细胞、骨髓或者造血或其他干细胞。所述移植物可以是复合移植物，例如面部的组织。可以在移植之前、与移植同时地或在移植之后施用免疫细胞。在一些实施方案中，在移植之前，例如在移植之前至少1小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周或至少1个月，施用所述免疫细胞。在一个特别的非限制性例子中，治疗有效量的免疫细胞的施用在移植之前3-5天发生。
在一些实施方案中，可以在免疫细胞疗法之前给所述受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭性化学疗法。所述清髓性淋巴细胞耗竭性化学疗法可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径来进行施用。所述清髓性淋巴细胞耗竭性化学疗法可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别地如果所述癌症是黑素瘤，其可以是转移性的。施用环磷酰胺和氟达拉滨的一个示例性途径为静脉内。同样地，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特别的方面，施用大约60mg/kg的环磷酰胺两天，之后施用大约25mg/m2氟达拉滨五天。
在某些实施方案中，与所述免疫细胞相伴地或在所述免疫细胞之后，向所述受试者施用促进所述免疫细胞的生长、分化和激活的生长或分化因子。所述免疫细胞生长因子可以为任何合适的促进所述免疫细胞的生长和激活的生长因子。合适的免疫细胞生长或分化因子的例子包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12、其可以单独地或以各种组合来进行使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或者IL-12和IL2。
治疗有效量的免疫细胞可以通过许多途径来进行施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、心室内、鞘内或关节内注射或输注。
用于在过继细胞疗法中进行使用的免疫细胞的治疗有效量为在正在进行治疗的受试者中取得所希望的效应的量。例如，这可以是这样的免疫细胞的量，其对于抑制自身免疫性或同种异体免疫性疾病的进展或引起其消退来说是必需的，或者其能够缓解由自身免疫性疾病所引起的症状，例如疼痛和炎症。它可以是对于缓解与炎症相关联的症状例如疼痛、水肿和体温升高来说必需的量。它也可以是对于减小或防止所移植的器官的排斥来说必需的量。
所述免疫细胞群体可以以与所述疾病相一致的治疗制度方案来进行施用，例如在一至几天内单个或几个剂量以改善疾病状态，或者在延长的一段时间内定期剂量以抑制疾病进展和防止疾病复发。待在制剂中采用的精确剂量还将会取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应当根据开业医生的判断和每位患者的情况来决定。免疫细胞的治疗有效量将会取决于正在进行治疗的受试者、疾患的严重度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可以在人受试者的治疗中使用的剂量从至少3.8×104、至少3.8×105、至少3.8×106、至少3.8×107、至少3.8×108、至少3.8×109或至少3.8×1010个免疫细胞/m2进行变动。在某些实施方案中，在人受试者的治疗中使用的剂量从大约3.8×109至大约3.8×1010个免疫细胞/m2进行变动。在另外的实施方案中，免疫细胞的治疗有效量可以从大约5×106个细胞/kg体重至大约7.5×108个细胞/kg体重，例如大约2×107个细胞至大约5×108个细胞/kg体重，或大约5×107个细胞至大约2×108个细胞/kg体重进行变化。准确的免疫细胞的量由本领域技术人员基于所述受试者的年龄、体重、性别和生理学状况来容易地确定。有效量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线进行外推。
所述免疫细胞可以与一种或多种用于治疗免疫介导的病症的其他治疗性试剂相组合地进行施用。联合疗法可以包括但不限于：一种或多种抗微生物试剂(例如，抗生素、抗病毒试剂和抗真菌试剂)、抗肿瘤试剂(例如，单克隆抗体例如利妥昔单抗、曲妥珠单抗等，氟尿嘧啶，氨甲蝶呤，紫杉醇，氟达拉滨，依托泊苷，多柔比星，或长春新碱)、免疫耗竭性试剂(例如，氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星或长春新碱)、免疫抑制试剂(例如，硫唑嘌呤，或糖皮质激素，例如地塞米松或泼尼松)、抗炎试剂(例如，糖皮质激素例如氢化可的松、地塞米松或泼尼松，或者非类固醇抗炎试剂例如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)、细胞因子(例如，白介素-10或转化生长因子-β)、激素(例如，雌激素)或疫苗。另外，可以施用免疫抑制或致耐受试剂，其包括但不限于：钙依赖磷酸酶抑制剂(例如，环孢菌素和他克莫司)；mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素)；麦考酚酸酯，抗体(例如，其识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化学治疗试剂(例如，氨甲蝶呤、曲奥舒凡、白消安)；辐射；或者趋化因子、白介素或其抑制剂(例如，BAFF、IL-2、抗-IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制剂)。此类另外的药学试剂可以在施用所述免疫细胞之前、期间或之后进行施用，这取决于所希望的效应。所述细胞和所述试剂的该施用可以通过相同的途径或通过不同的途径，和在相同的位点或在不同的位点。
A.药用组合物
在本文中还提供了药用组合物和制剂，其包含无限免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)和在药学上可接受的承载体。
在本文中所描述的药用组合物和制剂可以通过混合具有所希望的纯度的活性成分(例如，抗体或多肽)与一种或多种任选的在药学上可接受的承载体(Remington'sPharmaceutical Sciences,第22版,2012)来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。在药学上可接受的承载体通常在所采用的剂量和浓度下对于受者来说是无毒性的，并且包括但不限于：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如，氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；雷琐酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。示例性的在本文中的在药学上可接受的承载体进一步包括间隙药物分散试剂，例如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003604711340000901
Baxter International,Inc.)。某些示例性的sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)描述在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶相组合。
B.联合疗法
在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法相组合的免疫细胞群体。所述另外的疗法可以是放射疗法、外科手术(例如，肿块切除术和乳房切除术)、化学疗法、靶向疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法(nanotherapy)、单克隆抗体疗法或上述的组合。所述另外的疗法可以以辅助或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，所述另外的疗法为施用小分子酶抑制剂或抗转移试剂。在一些实施方案中，所述另外的疗法为施用副作用限制试剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重度的试剂，例如抗恶心试剂等)。在一些实施方案中，所述另外的疗法为放射疗法。在一些实施方案中，所述另外的疗法为外科手术。在一些实施方案中，所述另外的疗法为放射疗法和外科手术的组合。在一些实施方案中，所述另外的疗法为γ辐射。在一些实施方案中，所述另外的疗法为靶向PBK/AKT/mTOR途径的疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防试剂。所述另外的疗法可以为本领域中已知的化学治疗试剂中的一种或多种。
免疫细胞疗法可以相对于另外的癌症疗法(例如，免疫检查点疗法)而言之前、期间、之后或以各种组合进行施用。所述施用可以以从同时至数分钟至数天或数周变动的间隔。在其中与另外的治疗性试剂相分开地向患者提供免疫细胞疗法的实施方案中，人们通常将会确保在每次递送的时间之间没有显著的时间段到期，从而所述两种化合物将会仍然能够对于患者发挥有利地组合的效应。在这样的情况下，考虑了人们可以在相互的大约12至24或72小时内，和更特别地在相互的大约6-12小时内提供患者以抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可以希望的是显著地延长用于治疗的时间段，当各个施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以采用各种组合。对于下面的例子，免疫细胞疗法为“A”，而抗癌治疗为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。
向患者施用本实施方案的任何化合物或疗法将会遵循关于此类化合物的施用的一般计划方案，其中考虑了所述试剂的毒性，如果有。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本实施方案可以使用各种各样的化学治疗试剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。使用“化学治疗试剂”来意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂和药物通过它们在细胞内的活性模式(例如，是否和在什么阶段它们影响细胞周期)来进行归类。备选地，可以基于其直接交联DNA、嵌入DNA中或者通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征试剂。
化学治疗试剂的例子包括：烷基化试剂，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；氮杂环丙烷类和甲基三聚氰胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；乙酰精宁类(acetogenins)(尤其是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑制素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；烯二炔蒽环类抗生素，包括烯二炔蒽环抗生素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；5-氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦生类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；利索新；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族化合物(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类，例如维甲酸；卡培他滨；卡铂；丙卡巴肼；普卡霉素；吉西他滨；诺维本；法呢基-蛋白质转移酶抑制剂；反铂；以及上述中任一个的在药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
引起DNA损伤并且已被广泛使用的其他因素包括通常所称的γ-射线、X-射线和/或放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐射和UV-辐射。最可能的是，所有这些因素都对DNA、对DNA的前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持造成宽范围的损伤。关于X-射线的剂量范围的变动为50至200伦琴的日剂量持续延长的时间段(3至4周)到2000至6000伦琴的单一剂量。关于放射性同位素的剂量范围广泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型以及赘生性细胞进行的摄取。
3.免疫疗法
技术人员将会理解，可以与本公开内容的方法和组合物相组合地或相联合地使用另外的免疫疗法。在癌症治疗的情景下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
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就是这样一个例子。免疫效应子可以例如为对于在肿瘤细胞表面上的一些标志物来说特异性的抗体。单独的所述抗体可以充当疗法的效应子，或者它可以募集其他细胞去实际地影响细胞杀伤。也可以将所述抗体缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且充当靶向试剂。备选地，所述效应子可以是携带与肿瘤细胞靶标直接地或间接地相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞、NKT细胞、先天淋巴样细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)，并且可以在联合疗法中进行使用。该方法组合了针对其抗原靶标的MAb的高特异性与高度强有力的细胞毒性药物，从而导致“经武装的”MAb，其将有效负荷(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞。药物的靶向递送也使得其在正常组织中的暴露最小化，从而导致降低的毒性和经改善的治疗指数。示例性的ADC药物包括
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(brentuximabvedotin)和
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(trastuzumab emtansine或T-DM1)。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向，即不存在于大多数其他细胞上的标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任一种可以适合于在本实施方案的情景下进行靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酰路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个备选的方面是组合抗癌效应与免疫刺激效应。也存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8；和生长因子，例如FLT3配体。
免疫疗法的例子包括：免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，IL-1，GM-CSF，和TNF；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53；和单克隆抗体，例如抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-p185。考虑了可以将一种或多种抗癌疗法与在本文中所描述的抗体疗法一起进行使用。
在一些实施方案中，所述免疫疗法可以为免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)要么调低信号。可以被免疫检查点阻断所靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制因子(VISTA)。特别地，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
所述免疫检查点抑制剂可以为药物例如小分子，重组形式的配体或受体，或者特别地为抗体，例如人抗体。可以使用免疫检查点蛋白质的已知的抑制剂或者其类似物，特别地可以使用抗体的嵌合、人源化或人形式。如技术人员将会知道的，对于在本公开内容中所提及的某些抗体可以使用备选和/或等价的名称。此类备选和/或等价的名称在本公开内容的情景下是可互换的。例如，已知兰洛利珠单抗(lambrolizumab)也以备选和等价的名称MK-3475和帕博利珠单抗(pembrolizumab)而为人所知。
在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与其配体结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，所述PD-1配体结合伙伴为PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂为抑制PDL1与其结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，PDL1结合伙伴为PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，所述PDL2结合拮抗剂为抑制PDL2与其结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，PDL2结合伙伴为PD-1。所述拮抗剂可以为抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白质或寡肽。
在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抗-PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，所述抗-PD-1抗体选自由下列各项组成的组：纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗和CT-011。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)相融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
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)是一种可以使用的抗-PD-1抗体。帕博利珠单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、兰洛利珠单抗、
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和SCH-900475)是一种示例性的抗-PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)也是一种抗-PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是一种PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文中所提供的方法之中靶向的另一个免疫检查点为细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4被发现于T细胞的表面上，并且当与在抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时作为“关”开关起作用。CTLA4是在辅助T细胞表面上表达的免疫球蛋白超家族的成员，并且向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T-细胞共刺激蛋白CD28相似，并且这两种分子都与在抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)相结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也被发现于调节T细胞中，并且可能对于其功能来说是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞激活导致增加的CTLA-4(关于B7分子的抑制性受体)的表达。
在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白质或寡肽。
适合于在本方法中进行使用的抗人CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)可以通过使用本领域中众所周知的方法来生成。备选地，可以使用本领域认可的抗-CTLA-4抗体。一种示例性的抗-CTLA-4抗体为伊匹木单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
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)或者其抗原结合片段和变体。在另一些实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹木单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体竞争与CTLA-4的结合和/或与上面提及的抗体结合相同的在CTLA-4上的表位。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体具有至少大约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗具有至少大约90％、95％或99％可变区同一性)。
4.外科手术
大约60％的具有癌症的人将会经历一些类型的外科手术，其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性外科手术。治愈性外科手术包括其中所有或部分癌性组织被物理移除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其他疗法(例如，本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或备选的疗法)相联合地进行使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的物理移除。除了肿瘤切除术外，通过外科手术进行的治疗包括激光外科手术、低温外科手术、电外科手术和显微控制的外科手术(莫斯外科手术)。
在切除部分或所有癌性细胞、组织或肿瘤后，在身体中可能形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或对该区域局部应用另外的抗癌疗法来完成。这样的治疗可以重复，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有变化的剂量。
5.其他试剂
考虑了可以与本实施方案的某些方面相组合地使用其他试剂以改善治疗的治疗效力。这些另外的试剂包括：影响细胞表面受体和GAP连接的上调的试剂，细胞抑制和分化试剂，细胞粘附的抑制剂，增加高增殖性细胞对于凋亡诱导剂的敏感性的试剂，或其他生物学试剂。通过提高GAP连接的数目而导致的细胞间信号传导的增加将会增加对于相邻的高增殖性细胞群体的抗高增殖效应。在另一些实施方案中，可以与本实施方案的某些方面相组合地使用细胞抑制或分化试剂以改善治疗的抗高增殖效力。细胞粘附的抑制剂被考虑用于改善本实施方案的效力。细胞粘附抑制剂的例子为局部粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑了可以与本实施方案的某些方面相组合地使用其他增加高增殖性细胞对于凋亡的敏感性的试剂，例如抗体c225，以改善治疗效力。
VII.制造品或试剂盒
在本文中还提供了包含无限免疫细胞的制造品或试剂盒。所述制造品或试剂盒可以进一步包含包装插页，其包含关于使用所述免疫细胞来在个体中治疗癌症或延迟癌症进展或者增强具有癌症的个体的免疫功能的说明书。可以在所述制造品或试剂盒中包括任何在本文中所描述的抗原特异性免疫细胞。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。所述容器可以由各种各样的材料例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈斯特洛伊耐蚀镍基合金)形成。在一些实施方案中，所述容器容纳所述制剂和在该容器上或与该容器相连的标签(其可以指明使用说明)。所述制造品或试剂盒可以进一步包括从商业或用户立场所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，所述制造品进一步包括一种或多种另外的试剂(例如，化学治疗试剂和抗肿瘤试剂)。合适的用于所述一种或多种试剂的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
IV.实施例
包括了下面的实施例以示范本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应当意识到，在下面的在实施例中所公开的技术代表了由发明人发现在本发明的实践中很好地发挥功能的技术，并且因此可以被认为构成了关于本发明的实践的优选但是。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应当意识到，在所公开的特别的实施方案中可以进行许多变化，并且其仍然获得同样或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1–用于过继疗法的无限免疫细胞
将293T细胞在T75瓶中在具有10％FBS和1％Pen/Strep的10mL高葡萄糖DMEM培养基中进行培养和传代。一旦293T细胞达到90％汇合，就将它们用于次日转染，以进行慢病毒载体生成和质粒的包装。可以将BCL6和Bcl-xL基因的编码序列与T2A序列连接在一起以生成一个开放阅读框，其可以同时表达BCL6和Bcl-xL基因。可以通过遵循由NEB所提供的实验方案使用Gibson装配来将该BCL6-T2A-Bcl-xL开放阅读框克隆到慢病毒载体中。最终的载体被命名为pLV4a质粒(图1A)。将该pLV4a质粒与来自abm公司的慢病毒载体包装混合物一起共转染到293T细胞中。使用来自Clontech的Lenti-X浓缩器来浓缩病毒上清液。
为了从健康供者发展出无限细胞系，使用RosetteSepTM人T细胞富集混合物和SepMateTM-50管(来自STEMCELL Technologies)从健康供者中分离出正常T细胞。然后，将分离出的T细胞用补充有10％FBS、2％HEPES、1％丙酮酸钠和0.01％2-巯基乙醇以及50-1000IU/mL IL-2(Genscript)和25μL/mL ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2T细胞激活物(STEMCELL Technologies)的RPMI-1640培养基(Gibco)进行培养。在36-48小时培养后，在RetroNectin(Clontech)存在下用浓缩的pLV4a慢病毒载体(图1A)转导一百万个经培养的T细胞，然后将T细胞在50-1000IU/mL的IL-2存在下在RPMI1640培养基中进行培养，进行传代培养，并且分开(当需要时)。一些经转导的T细胞继续无限地增殖。该方法从健康供者T细胞生成了被称为“无限T细胞”的T细胞系，其在重组人IL-2或IL-15存在下增殖。
接下来，通过上面的方法生成了几个新的无限T细胞系。它们被命名为In1-L4a T细胞，其由多个亚类的T细胞组成。使用In1-L4a T细胞，通过细胞分选或基因工程分离和生成了一系列的T细胞，包括Ie1-L4a、If1-L4a、In1-L4aJ3、Ie1-L4aJ3、Igd1-L4a、Igd1-L4aJ3等。这些IL-2或IL-15依赖性无限T细胞系的详细描述概括在表1中。
表1.可得的无限T细胞
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将In1-L4a和衍生细胞在常规培养基，例如具有GlutaMaxTM补充物、丙酮酸钠和10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中，容易地进行维持。另外，对于长期生长，添加50-1000IU/mL的重组人IL-2(图1B)。IL-15也支持增殖，但是IL7或IL-21不支持增殖(图1B)。当用培养基的半周更换来维持悬浮培养物时，细胞能够以指数模式非常快速地增殖和扩增，其中加倍时间为大约24小时。将这些无限T细胞保持在培养物中并且继续增殖超过3个月，其中在IL-2存在下增殖速率没有变化(图1B)。
所述细胞高度依赖于IL-2来存活和增殖，并且在从培养基中撤除IL-2后停止增殖并且很快死亡(图1B)。所述无限T细胞是CD3阳性的，而其他表面标志物例如CD4或CD8、TCRαβ或TCRgδ或CD16表达在一些亚类的无限T细胞上，甚至在体外长期培养和扩增后(图1C)。那些标志物表明，所述无限T细胞是不同亚类的T细胞的混合群体(图1C)，因此，可能通过使用特定的T细胞标志物的细胞分选来分离出特定的T细胞群体。例如，通过使用抗-CD8抗体的细胞分选来分离出CD8+无限T细胞。另一个特定的T细胞群体，γδT细胞群体，也可以通过使用抗-TCRgδ抗体的细胞分选来分离。在分选后，生成相对纯的γδT细胞系(图1D)。
成熟T细胞可以在淋巴组织中进一步分化为不同的功能亚类例如Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh。分化为这些功能亚类由独特的主转录因子驱动。例如，Th1分化由Tbet驱动，Th2由GATA-3驱动，Th17由RORgt驱动，Treg由Foxp3驱动，和Tfh由BCL6驱动。因此，基于现有文献，在成熟T细胞中表达高水平的BCL6将会被预期导致Tfh-样表型。但是，在无限T细胞中未看见该分化类型，这是料想不到的。
所述细胞进一步进行修饰以表达抗-CD19 CAR，从而产生一系列“抗-CD19无限CART细胞”(CD19 inCART)。所述CD3无限T细胞和CD8无限T细胞，In1-L4a和Ie1-L4a，进行修饰以在其表面上表达靶向人CD19的嵌合抗原受体(CAR)，其中使用命名为pJ3质粒的载体(图2A)，其导致In1-L4aJ3和Ie1-L4aJ3无限T细胞系。In1-L4aJ3和Ie1-L4aJ3T细胞都表达抗-CD19 CAR并且可以与重组人CD19蛋白相结合(图2B和2C)。In1-L4aJ3和Ie1-L4aJ3无限T细胞被成功地生成并且在体外扩增，具有与其亲本细胞相似的增殖速率。以0.2:1和1:1的效应子:靶标比例，Ie1-L4aJ3显现出在IL-2存在下裂解CD19阳性Raji淋巴瘤细胞系和Nalm6白血病细胞系的能力(图3)。
实施例2–修饰In1-L4a衍生T细胞系以生成CD19 in CART细胞
下面的实施例描述了修饰In1-L4a衍生无限T细胞系以生成CD19 in CAR T细胞。这些程序可以在其他无限T细胞上类似地使用；但是，为了简单起见，仅关于In1-L4a和Ie1-L4a细胞系详细描述了所述程序。本领域技术人员可以改编所述方法以将抗-CD19 CAR基因插入到其他无限细胞系中，或者插入靶向不同肿瘤标志物的其他CAR或TCR，以为了针对各种各样的不同肿瘤的治疗目的。
通过Gibson装配方法(NEB)来生成表达由MSCV启动子驱动的抗-CD19 CAR和hEGFRt的重组慢病毒载体。该载体被命名为pJ3(LV-MSCV-优化的C19-CD28z-T2A-tEGFR)(图2A)。将所述pJ3质粒和慢病毒载体包装混合物(ABM)共转染到293T细胞中以产生感染性pJ3病毒。用pJ3慢病毒载体转导一百万个在实施例1中所描述的In1-L4a和Ie1-L4a细胞。在转导后10天，使用标记有AF647的抗-EGFR抗体(R&D)和标记有FITC的重组人CD19蛋白(ACROBiosystems)通过流式细胞术来测试CAR阳性细胞。在经pJ3转导的Ie1-L4a和In1-L4a组中CAR阳性细胞的百分比为大约20％和46.5％(图2B)。
通过用标记有FITC的重组人CD19蛋白和标记有AF647的西妥昔单抗的双重染色进一步确证了CAR阳性百分比(图2C)。使用细胞分选仪(BD)通过细胞分选来富集CAR阳性细胞。在分选后，收集相对纯的抗-CD19 CAR细胞并且进行体外扩增(图2D)。将表达针对人CD19的CAR的In1-L4a和Ie1-L4a细胞命名为In1-L4aJ3和Ie1-L4aJ3。它们展现出与其亲本In1-L4a和Ie1-L4a无限T细胞相似的指数增殖速率(图1B)。
CD19 in CAR T细胞针对CD19阳性淋巴瘤和白血病细胞的体外细胞毒性：Raji细胞是源自伯基特淋巴瘤患者的CD19+B-细胞淋巴瘤细胞系，其被广泛用于淋巴瘤的临床前研究，而Nalm6是源自急性成淋巴细胞白血病患者的CD19+B-细胞白血病细胞系。因此，它们两者均可以用于通过以0.2:1和1:1的比例在IL-2存在下共培养效应细胞和靶细胞来测试无限抗-CD19 CART细胞系的细胞毒性活性。所述测试在12-孔平板中进行。简而言之，在2mL的上面提及的培养基中，将每孔10万个Raji或Nalm6细胞与2万或10万个Ie1-L4aJ3(抗-CD19 CART)或Ie1-L4a(无抗-CD19 CAR)细胞一起进行培养。在共培养5天后，将每个孔中的细胞用缀合有APC的抗-CD8抗体(BD)进行染色，并且通过使用BD Fotessa分析仪(BD)来获取细胞以测定活的T细胞和肿瘤细胞的百分比。通过使用FlowJo软件来分析流式细胞术数据。数据证明，所述两种Ie1-L4aJ3无限T细胞都可以有效地在体外裂解Raji和Nalm6肿瘤细胞(图3)。相反地，用Ie1-L4a细胞未观察到Raji或Nalm6肿瘤细胞的显著裂解，因为它们缺乏抗-CD19 CAR。
实施例3–用于现成的过继T细胞疗法的无限T细胞
无限T细胞具有快速和长期增殖的能力。迄今为止，我们已从8名健康供者中通过BCL6和BCL2L1的慢病毒转导生成了无限T细胞，并且已观察到它们可以在IL-2或IL-15存在下快速地并且持续地生长>12个月。通过慢病毒将抗-CD19 CAR掺入到这些细胞中不影响其生长速率。这些T细胞中的倍数增加为在10天中～100-倍和在30天中～1百万倍，并且其增殖能力在12个月的连续体外培养中是不变的(图5A)。在表型上，所述无限T细胞由CD4+和CD8+ T细胞的混合物组成，其可以通过磁珠分选至高纯度(图5B)。在CD4+ T细胞内Foxp3+细胞<5％(数据未显示)。在任何点撤除细胞因子导致细胞在一周内快速死亡，这暗示这些T细胞还未转化为恶性表型并且没有发展出自主生长的能力(图5C)。
无限T细胞展现出高的端粒酶活性。由于在30-40次群体加倍后T细胞的增殖导致端粒的逐渐缩短和复制衰老(Barsov等人,2011)，发明人通过使用TRAPeze端粒酶活性检测试剂盒(Sigma)来测定在这些细胞中的端粒酶活性。在所述无限T细胞中hTERT活性相对于来自外周血单核细胞(PBMC)的相应的T细胞而言是非常高的(图6A)。这些细胞的RNAseq分析与该观察结果相一致，在无限CD4+、无限CD8+和无限CD8+CAR+ T细胞中(图6B)。这些结果暗示，经转导的基因可能导致在无限T细胞中的高的端粒酶活性，这导致端粒长度的稳定化，防止复制衰老，并且赋予长期增殖能力的特性。
抗-CD19 CAR的掺入更改无限T细胞针对B-细胞恶性肿瘤的特异性。将抗-CD19CAR(基于克隆FMC63，抗-CD19scFv，其具有CD8α铰链/跨膜结构域，CD3ζ和CD28信号传导结构域，和tEGFR，作为转导标志物和安全开关(Wang等人,2011))通过慢病毒转导到无限T细胞中使得它们能够有效地和特异性地脱粒，并且杀伤Daudi伯基特淋巴瘤和NALM-6急性B-细胞成淋巴细胞白血病细胞系(图7A-7B)。没有CAR的无限T细胞未显示出任何显著的细胞毒性或脱粒。相比于从健康供者中新鲜分离的T细胞生成的常规CAR T细胞而言，无限T细胞在杀伤肿瘤细胞中是更慢的，但是到第7天几乎完全消除了它们(图7A)。该较慢的杀伤在临床中可能是潜在的优势，因为它可能引起较少的毒性，例如细胞因子释放综合征和神经毒性。这些抗-CD19无限CAR T细胞具有中枢和效应记忆表型(图7C)，并且表达非常低的或不表达与T-细胞衰竭相关联的标志物(图7D)。
无限T细胞的转录特性谱。相比于分离自PBMC样品的相应的CD4+或CD8+ T细胞而言的具有或没有抗-CD19 CAR的无限CD4+和/或CD8+ T细胞的RNAseq分析与流式细胞术和功能数据是相一致的，即这些细胞具有记忆和细胞毒性表型并且不表达与经典的T细胞衰竭相关联的标志物(图8A-8B)。虽然它们是通过过表达BCL6(关于幼稚T细胞分化为滤泡辅助T细胞(TFH)的主转录因子3)来生成的，但是这些细胞不展现出TFH签名(图8A)并且不表达高水平的CXCR5(图8C)，其是TFH细胞的标志(Nurieva等人,2009；Rawal等人,2013)。但是，它们保持趋化因子受体(对于将T细胞运输至淋巴结来说重要的CCR4和CCR7，和对于运输至骨髓来说重要的CXCR4)的表达(图8C)(Viola等人,2006)；这两个位点都经常牵涉淋巴瘤。所述无限T细胞不表达衰老标志物，例如B3GAT1(CD57)、CD160或KLRG1(图8D)(Xu等人,2017)。趋化因子(图9A)和细胞因子(图9B)基因表达特性谱在无限T细胞和源自外周血的相应的CD4或CD8T细胞之间在很大程度上是相似的。细胞因子受体基因表达显示出一些差异，并且包括但不限于相比于源自外周血的相应的CD4或CD8 T细胞而言在无限T细胞中IL2RA、IL15RA和IL21R水平的增加以及IL4R、IL7R、IL10RA、IL17RA、IL18R1和IFNGR1水平的下降(图9C)。
无限CAR T细胞在冷冻-解冻后保持增殖和细胞毒性功能。将具有和没有CAR的无限T细胞冷藏并且在6个月后解冻。在解冻后，它们显示出CAR的强烈表达，其中使用抗-EGFR抗体(图10A)。在IL-2中培养这些细胞显示出在10天中～100-倍的细胞数目增加，并且确证所述无限CD8 CAR T细胞的增殖能力在冷冻-解冻后得到保持(图10B)。另外，这些细胞显示展现出针对恶性B细胞的高度显著的和特异性的细胞毒性活性(图10C)。
无限γδT细胞不表达衰竭标志物。无限γδT细胞不显著地表达经典的T细胞衰竭的标志物(图11)。
抗-CD19无限CAR T细胞在体内模型中展现出抗肿瘤效力。通过使用标记有萤光素酶的无限CAR T细胞，发明人观察到在腹膜内(i.p.)注射到NSG小鼠中后，当通过生物发光成像(BLI)来进行监测时所述T细胞在没有细胞因子支持的情况下在72小时内快速消失(图12，中间列)，这可能是因为小鼠细胞因子(IL-2和IL-15两者)不支持人T细胞的生长。相反地，在第1和3天注射重组人IL-15诱导了大量T细胞增殖，其中在停止IL-15后细胞持续1周(图12，右列)。这些结果暗示，IL-15促进体内增殖和持久性，但是低剂量可能就足够了。用IL-2也观察到相似的效应。
接下来，发明人将标记有萤光素酶的NALM-6肿瘤细胞连同3×106个无限T细胞/小鼠(具有或没有CAR)一起以静脉内方式(IV)注射到NSG小鼠中，并且在第0、4、7和11天注射IL-15。相对于没有CAR的无限T细胞，在用无限CAR T细胞进行处理的小鼠中存在显著的肿瘤控制以及存活延长(图13)。总而言之，这些结果提供了理论基础去改造无限T细胞以分泌IL-2或IL-15，从而增强其体内扩增和持久性。
微生物相关和肿瘤相关抗原特异性无限T细胞。通过使用四聚体对于从HLA-A2+供者生成的无限T细胞进行的测试揭示了微生物和肿瘤相关抗原特异性T细胞的混合物的存在(图14)。为了生成这些T细胞的富集群体，发明人用源自EBV蛋白质的肽汇集物刺激来自HLA-A2+供者的健康供者外周血单核细胞。在24小时后，分选出CD137阳性T细胞，并且用于生成无限T细胞，通过用表达BCL6和BCL2L1的慢病毒载体L5x转导它们(图22)。病毒生产和转导实验方案描述在实施例1中。在转导后两周，用CD3/CD28/CD2T细胞激活物再次刺激经转导的T细胞，然后继续培养它们，如在实施例1中所描述的那样。在IL-2存在下在体外进行培养和扩增7周后，使用3种标记有APC的四聚体(包括BMLF1-HLA-A2四聚体)来对经扩增的细胞进行染色并且通过APC富集磁珠进行富集，将经富集的无限T细胞继续进行培养，像所有其他无限T细胞那样。在第13周，用标记有APC的BMLF1-HLA-A2四聚体对经富集的无限T细胞进行染色，发现大约70％的所述T细胞是CD8阳性的并且是BMLF1-HLA-A2四聚体阳性的，这暗示它们是针对源自EBV-BMLF1蛋白的HLA-A2结合肽(GLCTLVAML)特异性的(图15)。相似的方法可以用于生成其他针对微生物和肿瘤相关抗原的抗原特异性T细胞。这样的抗原特异性T细胞可以反过来用于转导目的CAR或TCR以生成双重抗原特异性T细胞。
作为安全开关的Tet-off系统。发明人未观察到无限T细胞的任何恶性转化或在体外不依赖于细胞因子的生长，甚至在源自8名供者的无限T细胞的6至>12个月的培养物中(图4)。但是，为了确保关于临床转换的安全性，掺入了Tet-off安全开关，其允许我们通过使用多西环素来关闭经转导的BCL6和BCL2L1基因。在掺入该Tet-off安全开关后，无限T细胞在多西环素不存在下保持其生长速率，但是在1μg/mL(用在人中的多西环素的标准治疗剂量可取得的浓度(Agwuh等人,2006))的多西环素存在下停止增殖并且经历逐渐的细胞死亡(图16)。通过光学显微术成像，发现无限T细胞随着浓度渐增的多西环素而出现大小逐渐减小，连同具有增殖簇的减小(图17)。另外，CD25表达在多西环素存在下明显降低(图17)，而PD-1表达增加，这暗示BCL6和/或BCL2L1基因可能控制这些分子的表达。其他T-细胞共抑制受体的表达在多西环素存在下未显著地改变(图18)。相似的tet-off安全开关也可以用于控制掺入到无限T细胞中的IL-2或IL-15细胞因子基因。
抗-CD19无限CAR T细胞响应于B-细胞肿瘤细胞而产生效应细胞因子。为了测定响应于肿瘤细胞而产生的无限T细胞的细胞因子特性谱，发明人以5:1的效应子:靶标比例将NALM-6肿瘤细胞与转导有或没有抗-CD19 CAR的CD8+无限T细胞一起进行共培养。在3天后，在上清液中测量细胞因子水平。结果显示，具有抗-CD19 CAR(而非没有抗-CD19 CAR)的无限T细胞响应于NALM-6肿瘤细胞而主要产生显著量的IL-2、GM-CSF、IFNγ、IL-5和IL-17(图19)。响应于肿瘤细胞由抗-CD19无限CAR T细胞进行的TNFα、IL-4、IL-6、IL-10或IL-13的产生是极小的，或者没有显著不同于没有CAR表达的无限T细胞。但是，具有或没有CAR表达的无限T细胞在肿瘤细胞存在或不存在下产生大量的IL-4，超过了10,000pg/mL(图19和未显示的数据)。无限T细胞在外部刺激不存在下组成性地产生大量IL-4的该特性可以潜在地具有用于治疗各种炎性病症的临床应用，所述炎性病症例如为自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、某些类型的与细胞因子释放综合征相关联的感染、与CAR T-细胞和其他过继T-细胞疗法相关联的毒性、炎性肠病、与各种免疫疗法相关联的免疫相关不良事件、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、周期热综合征等，因为IL-4可以抑制由T细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞所诱导的炎症。
用于抗-CD19无限CAR T细胞的tEFGR安全开关。为了确定截短的EGFR(tEGFR)是否可以充当用于无限T细胞的安全开关，发明人将表达抗-CD19 CAR和tEGFR的无限T细胞在浓度为5μg/mL的西妥昔单抗存在下与或不与从健康供者外周血单核细胞中分离的天然杀伤(NK)细胞一起进行共培养。相比于用作对照的利妥昔单抗而言，西妥昔单抗通过依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)诱导了抗-CD19无限CAR T细胞的显著裂解(图20)。这些结果暗示，tEGFR可以充当安全开关以在不良事件的情况下消除体内的无限T细胞。
通过转导BCL6和BIRC5基因来生成无限T细胞。发明人观察到，无限T细胞可以通过将BCL6和BCL2L1基因转导或者通过将BCL6和BIRC5基因转导到人T细胞中来生成(图21A)。BCL2L1编码Bcl-xL，其是一种抗凋亡蛋白；而BIRC5编码存活蛋白，其是一种在细胞中促进增殖和阻断凋亡的凋亡抑制剂(IAP)家族蛋白。任一基因组合的转导导致生成具有相当的在IL-2存在下以指数生长速率的长期增殖潜力的无限T细胞(图21B)。此外，这些无限T细胞用允许我们通过使用多西环素来关闭经转导的BCL6和BCL2L1或者BCL6和BIRC5基因的Tet-off安全开关来生成。所述载体还掺入了IL-15基因，其被转导到这些细胞中。所述细胞在多西环素不存在下以指数速率进行生长，但是在1μg/mL的多西环素存在下停止增殖并且经历逐渐的细胞死亡，尽管转导了IL-15并且尽管向培养基添加了IL-2(图21C)。
包含BCL6以及Bcl-xl的构建体的一个例子为L5x(MSCV-BCL6-P2A-BCL-xl-T2A-rtTA)。所述结构至少包括通过P2A元件与BCL-xL分隔开的野生型BCL-6，并且BCL-xL通过T2A元件与rtTA(Tet on反式激活物)分隔开。
图23提供了包括至少BCL6的构建体的实施方案的多个实例；此类实例可以或可以不使用BCL-xL。仅作为例子，实例1使用MSCV启动子来调控BCL6和rtTA过表达，并且H1启动子调控靶向胱天蛋白酶9的shRNA以敲低胱天蛋白酶9表达。实例2使用MSCV启动子来调控BCL6和rtTA过表达，除了使用人U6启动子来调控靶向BAK基因的shRNA以敲低BAK表达之外。在实例3中，MSCV启动子调控BCL6和HSP27和rtTA过表达。在实例4中，MSCV启动子调控BCL6和rtTA表达，并且U6启动子调控miRNA21表达。
所有在本文中所公开的和所要求保护的方法都可以根据本公开内容来进行制作和施行，而无需过度的实验。虽然已经按照优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说将会明显的是，可以对于在本文中所描述的方法和在本文中所描述的方法的步骤中或步骤顺序中施加变化，而不背离本发明的构思、精神和范围。更特别地，将会明显的是，某些在化学上和生理学上都相关的试剂可以替代在本文中所描述的试剂，而将会取得相同或相似的结果。所有此类对于本领域技术人员来说明显的相似的替代或修饰都被认为在本发明的精神、范围和构思之内，如由所附的权利要求书所定义的。
参考文献
下面的参考文献通过提及而特别地合并入本文，达到它们提供示例性的对于在本文中所阐述的那些来说补充性的程序或其他细节的程度。
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欧洲专利申请号EP2537416

Claims (71)

1.组合物，其包含经改造以表达B-细胞淋巴瘤6(BCL6)和一种或多种促进细胞存活的基因的免疫细胞。
2.权利要求1的组合物，其中所述促进细胞存活的基因为促存活或抗凋亡基因。
3.权利要求1的组合物，其中免疫细胞为T细胞、NK细胞、先天淋巴样细胞或其混合物。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述促进细胞存活的基因为抗凋亡的B-细胞淋巴瘤2(BCL-2)家族基因。
5.权利要求4的组合物，其中所述抗凋亡的BCL-2家族基因为BCL2L1(Bcl-xL)、BCL-2、MCL1、BCL2L2(Bcl-w)、BCL2A1(Bfl-1)、BCL2L10(BCL-B)或其组合。
6.权利要求5的组合物，其中所述抗凋亡的BCL-2家族基因为BCL2L1(Bcl-xL)。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述促进细胞存活的基因为凋亡抑制剂家族基因。
8.权利要求7的组合物，其中所述凋亡抑制剂(IAP)家族基因为XIAP、BIRC2(C-IAPl)、BIRC3(C-IAP2)、NAIP、BIRC5(存活蛋白)或其组合。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述促进细胞存活的基因为抑制或敲除一种或多种胱天蛋白酶的表达的核酸聚合物。
10.权利要求9的组合物，其中所述胱天蛋白酶为胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶-12、胱天蛋白酶-13、胱天蛋白酶-14或其组合。
11.权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述促进细胞存活的基因为抑制或敲除一种或多种促凋亡基因的表达的核酸聚合物。
12.权利要求11的组合物，其中所述促凋亡基因为BCL2L11(BIM)、BBC3(PUMA)、PMAIP1(NOXA)、BIK、BMF、BAD、HRK、BID、BAX、BAK1、BOK或其组合。
13.权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述促进细胞存活的基因为具有抗凋亡效应的基因。
14.权利要求13的组合物，其中所述具有抗凋亡效应的基因为IGF1、HSPA4(Hsp70)、HSPB1(Hsp27)、CLAR(cFLIP)、BNIP3、FADD、AKT和NF-κB、RAF1、MAP2K1(MEK1)、RPS6KA1(p90Rsk)、JUN(C-Jun)、BNIP2、BAG1、HSPA9、HSP90B1、miRNA21、miR-106b-25、miR-206、miR-221/222、miR-17-92、miR-133、miR-143、miR-145、miR-155、miR-330或其组合。
15.权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述免疫细胞在外部刺激不存在下产生IL-4。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中所述免疫细胞经改造以表达一种或多种细胞因子。
17.权利要求16的组合物，其中所述细胞因子为IL-2和/或IL-15。
18.权利要求1-17中任一项的组合物，其中所述免疫细胞源自未被诊断为具有癌症的供者。
19.权利要求1-18中任一项的组合物，其中所述免疫细胞源自需要治疗的个体。
20.权利要求18或19的组合物，其中所述供者为人。
21.权利要求1-20中任一项的组合物，其中所述免疫细胞为T细胞，其为CD4+T细胞、CD8+T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞、调节T细胞、先天淋巴样细胞或其组合。
22.权利要求1-21中任一项的组合物，其中所述免疫细胞为T细胞，其包括CD4-阳性细胞、CD8-阳性细胞和/或γδT细胞。
23.权利要求1-22中任一项的组合物，其中所述免疫细胞为T细胞，其为幼稚T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、终末分化T细胞或其组合。
24.权利要求1-23中任一项的组合物，其中所述免疫细胞为T细胞，其为TCRαβ细胞、TCRγδT细胞或其组合。
25.权利要求1-24中任一项的组合物，其中所述免疫细胞为T细胞，其为Th1/Tc2、Th2/Tc2、Th9/Tc9、Th17/Tc17、Tfh、Th22、Tc22或其组合。
26.权利要求1-25中任一项的组合物，其中所述免疫细胞表达细胞因子和细胞毒性分子，其为IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、粒酶B、穿孔蛋白或其组合。
27.权利要求1-26中任一项的组合物，其中所述免疫细胞对于一种或多种微生物抗原、一种或多种自身抗原或者一种或多种肿瘤抗原来说是特异性的。
28.权利要求27的组合物，其中所述病毒为人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、甲型流感、乙型流感、丙型流感、水泡性口膜炎病毒(VSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、多瘤病毒、BK病毒、JC病毒、腺病毒、冠状病毒或其组合。
29.权利要求1-28中任一项的组合物，其中所述免疫细胞经改造以表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)和/或一种或多种T细胞受体(TCR)。
30.权利要求29的组合物，其中所述CAR和/或TCR靶向CD19、CD20、CD22、CD79a、CD79b、间皮素、MAGE-A1、MAGE-A4、TCL1、NY-ESO、WT1和/或BAFF-R抗原结合区。
31.权利要求29或30的组合物，其中所述CAR包含来自下列各项的部分或完整序列：CD8a的铰链，CD28，PD-1，CTLA4，T-细胞受体的α，β或ζ链，CD2，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8b，CD9，CD16，CD22，CD27，CD32，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，CD160，BTLA，LAIR1，TIGIT，TIM4，ICOS/CD278，GITR/CD357，NKG2D，LAG-3，PD-L1，PD-1，TIM-3，HVEM，LIGHT，DR3，CD30，CD224，CD244，SLAM，CD226，DAP，或其组合或合成分子。
32.权利要求29-31中任一项的组合物，其中所述CAR包含来自下列各项的部分或完整跨膜结构域：T-细胞受体的α链、T-细胞受体的β链、T-细胞受体的ζ链、CD28、CD2、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D、PD-1、CTLA4、DAP、合成分子或其组合。
33.权利要求29-32中任一项的组合物，其中所述CAR包含一个或多个来自下列各项的共刺激结构域：CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12、4-1BB或其组合。
34.权利要求1-33中任一项的组合物，其中所述组合物包含100,000至100亿个免疫细胞。
35.权利要求1-34中任一项的组合物，其中所述免疫细胞包含一种或多种安全开关。
36.权利要求27的组合物，其中所述安全开关为截短的EGFR或其融合蛋白。
37.权利要求1-36中任一项的组合物，其中所述免疫细胞表达IL-2、IL-15、一种或多种生长因子、一种或多种分化因子或者其组合。
38.权利要求1-37中任一项的组合物，其中所述细胞保持增殖速率至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月或者更长。
39.权利要求1-38中任一项的组合物，其中所述免疫细胞具有增强的抗肿瘤细胞毒性、细胞因子产生、体内增殖、体内持久性和/或经改善的功能。
40.用于产生权利要求1-39中任一项的免疫细胞的方法，所述方法包括将一种或多种编码BCL6和促进细胞存活的基因的载体引入至所述细胞。
41.权利要求40的方法，其中所述促进细胞存活的基因为抗凋亡的B-细胞淋巴瘤2(BCL-2)家族基因。
42.权利要求41的方法，其中所述抗凋亡的BCL-2家族基因为BCL2L1(Bcl-xL)、BCL-2、MCL1、BCL2L2(Bcl-w)、BCL2A1(Bfl-1)、BCL2L10(BCL-B)或其组合。
43.权利要求42的方法，其中所述抗凋亡的BCL-2家族基因为BCL2L1(Bcl-xL)。
44.权利要求40-43中任一项的方法，其中所述载体将BCL6和Bcl-xL与2A序列相连接。
45.权利要求40-44中任一项的方法，其中所述载体为慢病毒载体。
46.权利要求40-45中任一项的方法，其中引入包括在IL-2、IL-15和/或一种或多种其他生长因子存在下用慢病毒载体转导所述细胞。
47.权利要求46的方法，其中IL-2处于10IU/mL至1000IU/mL的浓度。
48.权利要求46或47的方法，其中IL-2处于400IU/mL的浓度。
49.权利要求40-48中任一项的方法，其进一步包括用CD3和CD28激活所述T细胞。
50.权利要求40-49中任一项的方法，其进一步包括在IL-2和/或IL-15存在下培养所述细胞。
51.权利要求50的方法，其中IL-2或IL-15以10-200ng/mL的浓度存在。
52.权利要求40-51中任一项的方法，其中将所述细胞培养至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月，而基本上没有增殖速率的下降。
53.权利要求40-52中任一项的方法，其进一步包括对T细胞亚类进行分选。
54.权利要求53的方法，其中所述T细胞亚类包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或γδT细胞。
55.权利要求40-54中任一项的方法，其进一步包括将一种或多种细胞因子和/或一种或多种安全开关引入至所述免疫细胞。
56.权利要求55的方法，其中所述一种或多种细胞因子和/或一种或多种安全开关在与所述BCL6和促进细胞存活的基因相同的载体上。
57.权利要求55的方法，其中所述一种或多种细胞因子和/或一种或多种安全开关在与所述BCL6和促进细胞存活的基因不同的载体上。
58.包含权利要求1-39中任一项的细胞群体的组合物，其用于治疗免疫相关病症、感染性疾病和/或癌症，其中所述免疫细胞靶向针对一种或多种分子。
59.在受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-39中任一项的免疫细胞。
60.权利要求59的方法，其中所述疾病或病症为感染性疾病、癌症或免疫相关病症。
61.权利要求60的方法，其中所述免疫相关病症为自身免疫性病症、移植物抗宿主病、同种异体移植物排斥或炎性状况。
62.权利要求59-61中任一项的方法，其中所述免疫细胞相关于所述受试者来说是同种异体的。
63.权利要求59-61中任一项的方法，其中所述免疫细胞相关于所述受试者来说是自体的。
64.权利要求60的方法，其中所述疾病为癌症。
65.权利要求64的方法，其中所述癌症为实体癌或血液学恶性肿瘤。
66.权利要求59的方法，其中所述疾病或病症为自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、与细胞因子释放综合征相关联的感染、与免疫疗法相关联的毒性、炎性肠病、与免疫疗法相关联的免疫相关不良事件、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、周期热综合征或其组合。
67.权利要求66的方法，其中所述与细胞因子释放综合征相关联的感染来自冠状病毒。
68.权利要求67的方法，其中所述冠状病毒为SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS。
69.权利要求59-68中任一项的方法，其中所述免疫细胞在抑制由T细胞、巨噬细胞和/或其他免疫细胞所诱导的炎症的条件下产生IL-4。
70.权利要求59-69中任一项的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少第二治疗性试剂。
71.权利要求70的方法，其中所述至少第二治疗性试剂包括化学疗法、免疫疗法、外科手术、放射疗法、药物疗法、靶向疗法、激素疗法、生物疗法或其组合。
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