CN113272427A - 免疫细胞的多重基因组编辑以增强功能性和对抑制环境的抵抗力 - Google Patents

免疫细胞的多重基因组编辑以增强功能性和对抑制环境的抵抗力 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于产生具有多个基因的破坏的免疫细胞的方法。进一步提供了用于在免疫细胞的基因座处插入嵌合抗原受体的方法。

Description

免疫细胞的多重基因组编辑以增强功能性和对抑制环境的抵 抗力
本申请要求于2018年11月28日提交的美国临时专利申请系列号62/772,406的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
1.技术领域
本发明一般涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。更具体地说，它涉及免疫细胞的多重编辑及其使用方法。
2.相关技术说明
对于癌症的治疗，细胞免疫疗法具有很大的前景。然而，当单独应用时，大多数免疫治疗方法对大多数恶性肿瘤，尤其是实体瘤的价值有限。这种有限成功的原因包括肿瘤细胞表面上减少的肿瘤抗原表达(这减少了免疫系统对它们的检测)，诱导免疫细胞失活的抑制性受体(例如PD1、NKG2A、TIGIT或CISH)的配体的表达；以及释放抑制免疫应答并促进肿瘤细胞增殖和存活的物质例如转化生长因子-β(TGFβ)和腺苷的细胞(例如，调节性T细胞或髓系来源抑制性细胞)在微环境中的诱导。因此，存在未得到满足的对改进的细胞免疫疗法方法的需求。
发明内容
本公开内容提供了与癌症免疫疗法相关的组合物和方法，特别是包括工程化免疫细胞。具体实施方案涉及经人工修饰以缺乏一个、两个或更多个基因的表达或具有一个、两个或更多个基因的降低的表达的某些免疫细胞，并且在特定情况下，具有此类修饰的细胞还表达一种或多种异源蛋白质，包括非天然蛋白质，例如抗原受体。还包括产生非天然免疫细胞的方法。在某些情况下，异源抗原受体的引入是在表达减少或消除的基因的基因组基因座处。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种用于破坏免疫细胞中的至少两个基因的体外方法，其中所述至少两个基因选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7及其组合。在特定方面，三个、四个、五个或六个或更多个基因被破坏。在特定方面，两个或更多个基因的破坏是同时发生的，例如在相同的方法步骤中发生。所述方法可以包括将针对每个基因的指导RNA(gRNA)引入免疫细胞。
所述方法可以包括基因的特定组合的敲低，例如以下基因组合：(a)NKG2A和CISH、(b)NKG2A和TGFBRII、(c)CISH和TGFBRII、(d)TIGIT和FOXO1、(e)TIGIT和TGFBRII、(f)CD96和FOXO1、(g)CD96和TGFBRII、(h)FOXO1和TGFBRII、(i)CD96和TIGIT、(j)CISH和TIGIT、(k)TIM3和CISH、(l)TIM3和TGFBRII、(m)FOXO1和TGFBRII、(n)TIM3和TIGIT、(o)SIGLEC7和CISH、(p)SIGLEC7和TGFBRII、(q)CD47和CISH、(r)CD47和TGFBRII、(s)SIRPA和CISH、(t)SIRPA和TGFBRII、(u)CD47和TIGIT、(v)CD47和SIRPA、(w)A2AR和CISH、(x)A2AR和TGFBRII、(y)ADAM17和CISH、(z)TGFBRII和ADAM17、(a)A2AR和TIGIT、(b)SHP1和CISH、(c)CISH和TGFBRII、(d)SHP1和TGFBRII、(e)SHP1和TIGIT或(f)SHP1和TIM3。所述方法可以包括敲低(1)NKG2A、CISH和TGFBRII，(2)TIGIT、FOXO1和TGFBRII，(3)TGFBRII、CD96和TIGIT，(4)TGFBR2、CISH和TIGIT，(5)TIM3、CISH和TGFBRII，(6)CD96、FOXO1和TGFBRII，(7)TGFBRII、TIM3和TIGIT，(8)SIGLEC7、CISH和TGFBRII，(9)CD47、CISH和TGFBRII，(10)SIRPA、CISH和TGFBRII，(11)TGFBRII、CD47和TIGIT，(12)TGFBRII、CD47和SIRPA，(13)A2AR、CISH和TGFBRII，(14)TGFBRII、CISH和ADAM17，(15)TGFBRII、TIM3和TIGIT，(16)TGFBRII、A2AR和TIGIT，(17)SHP1、CISH和TGFBRII，(18)TGFBRII、CISH和SHP1，(19)TGFBRII、SHP1和TIGIT，或(20)TGFBRII、SHP1和TIM3。任何上述亚组都可以与如上公开的第二亚组组合。例如，亚组a-j1中的任何一个可以与其他亚组a-j1中的任何一个或多个组合，亚组a-j1中的任何一个或多个可以与其他亚组1-23中的任何一个或多个组合，或亚组1-23中的任何一个或多个可以与其他亚组1-23中的任何一个或多个组合。
在一些方面，所述方法进一步包括向细胞引入RNA指导的核酸内切酶，例如Cas9。引入RNA指导的核酸内切酶可以包括将编码RNA指导的核酸内切酶的核酸(例如mRNA)引入免疫细胞。
在某些方面，免疫细胞是T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、NK T细胞或干细胞。在替代情况下，免疫细胞不是T细胞，包括不是CAR T细胞。在一些方面，免疫细胞被工程化以表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)和/或一种或多种T细胞受体(TCR)。免疫细胞可以是病毒特异性的，例如病毒特异性T细胞。T细胞可以是调节性T细胞。B细胞可以是调节性B细胞。在一些方面，干细胞是间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。在特定方面，T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞。免疫细胞可以从外周血、脐带血、骨髓或其混合物中分离。在一些方面，脐带血是从2个或更多个个体脐带血单元汇集而来的。
在一些方面，引入步骤包括转染或转导。例如，引入包括可以进行不止一次的电穿孔，例如两轮或三轮电穿孔。在一些方面，第一组CRISPR gRNA在第一次电穿孔中被引入并且第二组CRISPR gRNA在第二轮电穿孔中被引入。在特定情况下，第一组CRISPR gRNA不同于第二组CRISPR gRNA。在特定方面，第一组和/或第二组CRISPR gRNA包含1、2、3或4或更多种CRISPR gRNA。在一些方面，在第一次电穿孔中引入两种CRISPR gRNA，和在第二轮电穿孔中引入两种不同的CRISPR gRNA。在具体实施方案中，一组CRISPR gRNA包括一组gRNA，其中的至少两个靶向不同的基因；在特定实施方案中，gRNA组各自靶向不同的基因。
在特定方面，所述方法包括破坏NKG2A、CD47、TGFβR2和CISH；NKG2A、CISH、TGFβR2和ADORA2；NKG2A、TGFβR2和CISH；TIGIT、CD96、CISH和ADORA2；或ADAM17、TGFβR2、NKG2A和SHP1。
在一些方面，所述破坏导致免疫细胞的增强的抗肿瘤细胞毒性、体内增殖、体内持久性和/或改善的功能。在特定方面，与不存在一种或多种修饰的情况相比，免疫细胞具有IFN-γ、CD107和/或TNFα的增加的分泌。在一些方面，与不存在一种或多种修饰的情况相比，免疫细胞具有穿孔素和/或颗粒酶B的增加的产生。
在另外的方面，所述方法进一步包括将CAR和/或TCR引入免疫细胞，例如将编码CAR和/或TCR的核酸引入免疫细胞。在一些方面，核酸在表达载体中，例如逆转录病毒载体。在某些方面，载体是腺病毒相关载体，例如AAV6。在一些方面，载体进一步包含抑制性基因序列，例如选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7及其组合的抑制性基因序列。在特定方面，载体进一步包含针对抑制性基因的指导RNA。CAR的侧翼可以是针对抑制性基因的同源臂。在一些方面，引入包含CAR序列的载体导致CAR在免疫细胞中的抑制性基因座(例如抑制性基因的外显子)处的插入，使得CAR处于抑制性基因的内源性启动子的控制之下。在特定方面，引入载体进一步破坏抑制性基因的表达。
在另一个实施方案中，提供了一种免疫细胞，例如所公开的实施方案的免疫细胞，其中免疫细胞中的至少两个基因的表达被破坏，其至少通过包括将针对每个基因的CRISPR指导RNA(gRNA)引入所述免疫细胞中的步骤来产生，其中至少两个基因选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7及其组合。在一些方面，三个、四个、五个或六个或更多个基因被破坏。
在某些方面，免疫细胞是T细胞、NK细胞、B细胞或干细胞。在一些方面，免疫细胞被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。免疫细胞可以是病毒特异性的，例如病毒特异性T细胞。T细胞可以是调节性T细胞。B细胞可以是调节性B细胞。在一些方面，干细胞是间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。在特定方面，T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞。免疫细胞可以从外周血、脐带血或骨髓中分离。在一些方面，脐带血是从2个或更多个个体脐带血单元汇集而来的。
在特定方面，所述方法包括破坏特定的基因组，例如NKG2A、CD47、TGFβR2和CISH；NKG2A、CISH、TGFβR2和ADORA2；NKG2A、TGFβR2和CISH；TIGIT、CD96、CISH和ADORA2；或ADAM17、TGFβR2、NKG2A和SHP1。
在一些方面，所述破坏导致免疫细胞的增强的抗肿瘤细胞毒性、体内增殖、体内持久性和/或改善的功能。在特定方面，免疫细胞具有IFN-γ、CD107和/或TNFα的增加的分泌。在一些方面，免疫细胞具有穿孔素和/或颗粒酶B的增加的产生。
在一些方面，细胞被工程化以表达CAR和/或TCR。CAR可以插入细胞的内源抑制性基因座处，例如抑制性基因座选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7及其组合。在一些方面，CAR处于抑制性基因的内源启动子的控制下。在某些方面，通过CRISPR介导的基因编辑将CAR插入抑制性基因座处。
在一些方面，CAR包含选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv的抗原结合结构域。在某些方面，CAR靶向一种或多种肿瘤相关抗原，其选自CD19、CD319(CS1)、ROR1、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD5、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、TRAIL/DR4、VEGFR2、CD33、CD47、CLL-1、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、BCMA、CD99及其组合。在特定方面，CAR包含选自以下的至少一个信号传导结构域：CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP12、CD70、CD40及其组合。在一些方面，免疫细胞包含一种或多种异源细胞因子，例如IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18和IL-21中的一种或多种。在某些方面，CAR进一步包含自杀基因，例如膜结合的非分泌性TNF-α突变体或诱导型半胱天冬酶9。
本文进一步提供了编码至少一种CAR和/或TCR、至少一种抑制性基因序列和至少一种gRNA的表达载体。在一些方面，抑制性基因序列来自选自以下的抑制性基因：NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。在特定方面，gRNA对抑制性基因具有特异性。在一些方面，载体是病毒载体，例如AAV载体。CAR的侧翼可以是针对抑制性基因的同源臂。本文还提供了宿主细胞，例如实施方案的细胞，其被工程化以表达实施方案的载体。在一些方面，细胞是T细胞、NK细胞、B细胞或干细胞。
本文还提供了包含所公开的实施方案的免疫细胞的群体的药物组合物。另一个实施方案提供包含所公开的实施方案的细胞的群体的组合物，其用于治疗免疫相关病症、传染病和/或癌症。
在进一步的实施方案中，提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的所公开的实施方案的免疫细胞。在一些方面，疾病或病症是传染病、癌症，例如实体癌或血液系统恶性肿瘤，或免疫相关病症。例如，免疫相关病症可以是自身免疫病症、移植物抗宿主病、同种异体移植物排斥或炎性病况。在一些方面，免疫相关病症是炎性病况并且免疫细胞基本上没有糖皮质激素受体的表达。在某些方面，免疫细胞相对于接受者个体是自体的或同种异体的。
在另外的方面，所述方法进一步包括向接受免疫细胞的个体施用至少第二治疗剂。在一些方面，至少第二治疗剂包括化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法、激素疗法或生物疗法。在某些方面，免疫细胞和/或至少第二治疗剂通过静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内窥镜下、病灶内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注施用。
另一个实施方案提供了一种工程化免疫细胞以表达CAR的方法，其包括使用CRISPR gRNA将CAR插入免疫细胞的抑制性基因座处。在一些方面，CAR由表达载体编码，例如逆转录病毒载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体等。在某些方面，病毒载体是腺病毒相关载体，例如AAV6。
在一些方面，载体进一步包含抑制性基因序列，例如抑制性基因序列选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7及其组合。在一些方面，CRISPR gRNA针对抑制性基因。在某些方面，CAR的侧翼是针对抑制性基因的同源臂。在特定方面，CAR插入基因的任何部分的抑制性基因座(例如抑制性基因的外显子)处。CAR可以处于抑制性基因的内源启动子的控制之下。在特定方面，CAR破坏抑制性基因的表达。
在一些方面，CAR靶向一种或多种肿瘤相关抗原，其选自CD19、CD319(CS1)、ROR1、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD5、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、TRAIL/DR4、VEGFR2、CD33、CD47、CLL-1、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、BCMA、CD99及其组合。在特定方面，CAR包含选自以下的至少一个信号传导结构域：CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP12、CD70和CD40。在一些方面，编码CAR的载体还编码细胞因子，例如IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其组合。在替代情况下，细胞因子位于与编码CAR的载体分开的载体上。在某些方面，编码CAR的表达构建体进一步包含自杀基因，例如诱导型半胱天冬酶9或膜结合的、非分泌性TNF-α突变体。
本文进一步提供了在免疫细胞的抑制性基因处插入了至少一个CAR的免疫细胞，例如通过本发明的方法产生的免疫细胞。本文还提供了一种组合物，其包含本公开内容的实施方案的免疫细胞的群体，例如T细胞、B细胞、NK细胞、NK T细胞、巨噬细胞、干细胞、其混合物等的群体。
另一个实施方案提供了包含实施方案的细胞的群体的组合物，并且在某些实施方案中，所述群体用于治疗任何种类的医学病况，包括至少用于治疗免疫相关病症、传染病和/或癌症。
进一步的实施方案提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的实施方案的免疫细胞。在一些方面，疾病或病症是传染病；癌症，例如实体癌或血液系统恶性肿瘤；和/或免疫相关病症。在一些情况下，免疫相关病症可以是自身免疫病症、移植物抗宿主病、同种异体移植物排斥和/或炎性病况。在一些方面，免疫相关病症是炎性病况并且免疫细胞基本上没有糖皮质激素受体的表达。在某些方面，免疫细胞相对于接受者个体是自体的或同种异体的。
在另外的方面，所述方法进一步包括向个体施用至少第二治疗剂。在一些方面，至少第二治疗剂包括化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法、激素疗法或生物疗法。在某些方面，免疫细胞和/或至少第二治疗剂通过静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内窥镜下、病灶内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注施用。免疫细胞和至少第二治疗剂可以同时或在不同时间施用，并且当它们在不同时间或同时但不在同一制剂中施用时，它们可以或可以不通过相同的途径施用。
本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实施方案虽然指示了本公开内容的特定实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改根据此详细描述对于本领域技术人员来说将变得明显。
附图简要说明
以下附图构成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合在此呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1：CRISPR/Cas9在NK细胞中介导有效的多个基因(NKG2A、CD47、TGFBR2和CISH)的破坏。在这组基因中，NKG2A和CD47在第一轮电穿孔中被敲除，并且在第二轮电穿孔中靶向CISH和TGFBR2。使用PCR和流式细胞术成功验证了两轮电穿孔的敲除效率。流式图中的红色(右侧峰)和蓝色(左侧峰)直方图分别代表CRISPR KO前后蛋白质的表达。
图2：使用另一组基因(TIGIT(T)、CD96(C)、CISH(CH)、腺苷(A))验证NK细胞中的多重基因编辑。在这组基因中，TIGIT和CD96在第一轮电穿孔中被敲除，并且在第二轮电穿孔中靶向CISH和腺苷。使用PCR和流式细胞术成功验证了两轮电穿孔的敲除效率。流式图中的红色(右侧峰)和蓝色(左侧峰)直方图分别代表CRISPR KO前后蛋白质的表达。
图3：NK细胞中多个基因(NKG2A、CD47、TGFBR2和CISH)的破坏导致增强的针对靶肿瘤细胞的功能。用靶细胞系刺激后，IFN-γ、TNFα和CD107的分泌增强。用与靶细胞系在布雷菲德菌素A的存在下共刺激5小时的不同的NK细胞(经编辑的相对单独Cas9)进行IFN-γ、TNFα和CD107产生的流式细胞术分析。
图4A-4B：NK细胞中多个基因(NKG2A、CD47、TGFBR2和CISH)的破坏导致增强的抗肿瘤细胞毒性。(图4A)通过51Cr-释放测定法测量基因编辑的NK细胞相对仅Cas9的NK细胞的针对K562的细胞毒活性。(图4B)在重组TGF-B处理(50ng/ml)30分钟后，通过流式细胞术测量pSMAD活性。外源性TGF-β的添加未能诱导KO CAR-NK细胞中pSMAD的激活。
图5：在细胞因子刺激或靶标识别后NK细胞失去CD16和CD62L表达，如CyTOF分析所示的。
图6：NK细胞中ADAM17的敲除防止CD16和CD62L的去除。
图7：在NK细胞中敲除ADAM17改善针对K562靶标的ADCC和细胞毒性。
图8：在72h时NK细胞中SHP1敲除效率的基于FACS的筛选。
图9：NK细胞中SHP1的破坏导致增强的抗肿瘤功效。NK细胞与K562或Raji细胞以1:1的比例共培养4小时。孵育后，细胞用膜联蛋白V染色并分析活细胞和死细胞。K562细胞对NK细胞杀伤敏感，而Raji细胞对NK细胞杀伤具有抗性。
图10A-10B：NK细胞中SHP1的破坏导致增强的抗肿瘤功效(图10A)。NK细胞与K562或Raji细胞以2:1的比例共培养5小时(图10B)。显示了各种效应子:靶标比率的裂解百分比、IFNγ、TNFα和CD107a的百分比以及活细胞或死细胞的百分比。
图11：NK-CAR细胞中SHP1的破坏导致增强的抗肿瘤功效，如通过细胞凋亡测定所评估的。
图12A-12C：(图12A)第7天的基于FACS的NKG2A敲除效率。(图12B)扩增的NK细胞中NKG2A的破坏导致增强的抗肿瘤功效。(图12C)NK-CAR细胞中NKG2A的破坏导致针对Raji靶标的增强的抗肿瘤功效。
图13：所述方法用另一组基因(TIGIT(T)、CD96(C)、CISH(CH)和腺苷(ADORA2A)(A))验证。对于这组基因，在第一轮电穿孔过程中，一组NK细胞中的TIGIT和CD96被敲除。对于第二轮敲除在TIGIT和CD96 KO细胞中靶向CISH和腺苷(ADORA2A)。使用PCR和流式细胞术成功验证了两轮电穿孔的敲除效率。流式图中的红色(右侧峰)和蓝色(左侧峰)直方图分别代表CRISPR KO前后蛋白质的表达。
图14：NK细胞中的多个基因的破坏导致增强的抗肿瘤功效。为了评估这一点，多个基因(NKG2A、CISH、TGFBRII和腺苷(ADORA2A))敲除的细胞和仅用cas9电穿孔的细胞用作对照，对于K562(NK敏感)和Raji(NK抗性)细胞持续5小时。通过流式细胞术测量评估NK细胞功能，并观察到靶细胞系刺激后KO细胞中TNFα、IFNγ和CD107a的增加。
图15：NK细胞中多个基因的破坏导致增强的抗肿瘤功效。为了评估这一点，多个基因(NKG2A、CISH、TGFBRII)敲除的细胞和仅用cas9电穿孔的细胞用作对照。NKG2A表达通过流式细胞术确认。外源性TGF-β的添加未能诱导KO CAR-NK细胞中pSMAD的激活。
图16：NK-CAR细胞中多个基因(NKG2A、TGFβR2和CISH)的破坏导致增强的抗肿瘤功效。
图17：TGFβR2 KO保护NK-CAR细胞免受TGFβ的抑制作用。
图18：多重基因编辑可使用不同的NK-CAR构建体和针对不同的靶标重现。
图19：多个抑制性基因的多重基因编辑维持NK结构并保护NK细胞免受TFGβ诱导的耗竭。
举例说明性实施方案的描述
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种使用CRISPR-Cas9技术同时敲低(或敲除)两个或更多个基因(例如，在人类免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、CAR转导的T细胞或CAR转导的NK细胞)中的基因(例如表1中列出的那些，包括腺苷2a受体、TGFβR2、NKG2A、TIGIT和/或CISH))的新方法。免疫细胞可以来源于外周血或脐带血或其组合。
本研究证明，这些蛋白质的降低的表达与T细胞和NK细胞的改善的功能、体内增殖和持久性以及细胞毒性相关。这种策略还保护T细胞、NK细胞、NK T细胞和iNKT细胞免受免疫抑制性肿瘤微环境(其主要由TGFβ和腺苷驱动)的影响。因此，本发明的方法可用于改善各种过继细胞治疗产品(例如，NK细胞、T细胞，例如病毒特异性T细胞和调节性T细胞、B细胞，例如调节性B细胞、CAR转导的NK细胞、CAR-T细胞和TCR工程化的T和NK细胞、iNKT细胞、NK T细胞)的功效。过继细胞治疗产品可用于治疗各种疾病，包括例如癌症(例如血液系统或实体恶性肿瘤)到传染病和免疫病症。
在特定实施方案中，免疫细胞表达至少一种CAR，并且CAR工程化在过去几年中取得了多项进展。事实上，CAR-CD19在患有B细胞白血病和淋巴瘤的患者中显示出令人印象深刻的临床结果，导致去年FDA批准了两种CAR T产品。虽然过去几年CAR转导的T细胞一直处于领先地位，但申请人领导的一系列临床前研究以及I/II期CAR NK试验也显示了CAR-NK细胞抗癌的有效性。尽管CAR工程化取得了进展，但仍然主要使用病毒载体将CAR转导到T细胞或NK细胞中，这些病毒载体随机整合到细胞的DNA中，并可能导致克隆扩增、致癌转化、改变的转基因表达或转录沉默。因此，找到一种将CAR靶向插入特定DNA基因座中的方法将是有价值的。
因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了使用CRISPR/Cas9在特定基因座(例如在抑制性基因或检查点蛋白的基因座)处插入CAR的方法。CAR在基因座处的插入也可用于同时破坏基因的表达，同时在需要时任选地也将其置于该基因的启动子的控制之下。具体地，本方法可以在抑制性基因(例如表1中列出的那些，包括但不限于NKG2A、CISH、PD-1、TIGIT、TIM3、SHP1或TGFβR2)的基因座处直接插入CAR，例如使用AAV6载体和CRISPR/Cas9技术。在抑制性基因座处插入CAR可以破坏检查点分子(例如)的抑制作用，同时也允许CAR表达受检查点启动子的调控并在肿瘤微环境中上调。这对于CAR疗法在实体瘤中的应用很有用，其中检查点分子的上调可负面影响CAR疗法的成功。因此，提供了使用可具有增加的安全特征谱的CAR插入方法产生过继细胞治疗(例如T细胞、B细胞、NK、NK T或iNKT细胞)的进一步方法。
I.定义
如本文所用，就指定组分而言，“基本上不含”在本文中是指指定组分没有被故意地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中指定组分的量无法用标准分析方法检测到的组合物。
如本文中所使用的，说明书中的“一个”或“一种”可以表示一个或多个/一种或多种。如本文在权利要求中所使用的，当与词语“包括”结合使用时，词语“一个”或“一种”可以表示一个或多于一个/一种或多于一种。如本文所用，“另一个”可以是指至少第二个或更多个。更进一步，术语“具有”、“包括”、“包含”和“含有”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。在特定实施方案中，例如，本公开内容的方面可以“基本上由本公开内容的一个或多个序列组成”或“由本公开内容的一个或多个序列组成”。本发明的一些实施方案可以由本公开内容的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。预期本文描述的任何方法或组合物可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物实施。本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制品、物质组合物、手段、方法和步骤的特定实施方案。如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述相互组合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别考虑了可以从实施方案中特别地排除x、y或z。
除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互斥的，否则在权利要求中使用术语“或”来表示“和/或”，尽管本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。术语“约”、“基本上”和“大约”通常是指所述的值±5％。
在本说明书中对“实施方案”、“一个实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“额外的实施方案”或“另外的实施方案”或其组合的引用是指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一个实施方案中。因此，在本说明书中各处出现的前述短语不一定都指代相同的实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
“免疫病症”、“免疫相关病症”或“免疫介导的病症”是指其中免疫应答在疾病的发展或进展中起关键作用的病症。免疫介导的病症包括自身免疫病症、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病以及炎性和过敏性病况。
“免疫应答”是免疫系统的细胞(例如B细胞或T细胞或先天免疫细胞)对刺激的应答。在一个实施方案中，该应答对特定抗原是特异性的(“抗原特异性应答”)。
如本文所用，术语“抑制性基因”是指其基因产物对一种或多种类型的免疫细胞的活性、增殖和/或持久性直接或间接有害的基因。
“自身免疫疾病”是指其中免疫系统产生针对作为正常宿主的一部分的抗原(即自身抗原)的免疫应答(例如，B细胞或T细胞应答)的疾病，从而导致对组织的损害。自身抗原可以来源于宿主细胞，或者可以来源于共生生物，例如通常定殖在粘膜表面的微生物(称为共生生物)。
如本文所用，术语“工程化”是指人工产生的实体，包括细胞、核酸、多肽、载体等。在至少一些情况下，工程化实体是合成的，并且包含并非天然存在的或以在本公开内容中所利用的方式配置的元素。
疾病或病况的“治疗”或医治是指执行一种方案以减轻疾病的体征或症状，其可包括向患者施用一种或多种药物。期望的治疗效果包括降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。缓解可以发生在疾病或病况的体征或症状出现之前，也可以发生在其出现之后。因此，“治疗”或“医治”可包括“预防”或“防止”疾病或不期望的病况。另外，“治疗”或“医治”不需要完全缓解体征或症状，不需要治愈，并且特别包括仅对患者有轻微影响的方案。
在本申请全文中使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指就该病况的医学治疗而言促进或增强受试者的健康的任何事物。这包括但不限于减少疾病体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如肿瘤尺寸的减小、肿瘤的浸润性的减小、癌症生长速率的减小或转移的预防。癌症的治疗还可以指延长患有癌症的受试者的存活。
“受试者”和“患者”是指人类或非人类，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定的实施方案中，受试者是人类。
如本文所用，“哺乳动物”是本发明的方法的合适受试者。哺乳动物可以是高等脊椎动物类哺乳动物的任何成员，包括人类；其特征是活产、体毛和雌性的分泌乳汁用于喂养幼崽的乳腺。此外，哺乳动物的特征是它们在气候条件变化的情况下保持恒定的体温的能力。哺乳动物的示例是人、猫、狗、牛、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊和黑猩猩。哺乳动物可被称为“患者”或“受试者”或“个体”。
短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用至动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的。此外，对于动物(例如人)施用，应理解，制剂应符合FDA生物标准办公室要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的承载体”包括任何和所有水性溶剂(例如水，醇/水溶液，盐溶液，肠胃外媒介物，例如氯化钠，林格氏葡萄糖等)，非水性溶剂(例如丙二醇，聚乙二醇，植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)，分散介质，涂料，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，药物，药物稳定剂，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，染料，液体和营养补充剂，类似此类的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的。药物组合物中各种组分的pH和确切浓度根据众所周知的参数调节。
如本文所用，基因的“破坏”是指与不存在破坏的情况下基因产物的表达水平相比，细胞中由主题基因编码的一种或多种基因产物的表达的消除或减少。示例性基因产物包括基因编码的mRNA和蛋白质产物。在某些情况下，破坏是瞬时的或可逆的，而在其他情况下则是永久性的。在某些情况下，破坏是功能性或全长蛋白质或mRNA，尽管可能会产生截短或无功能的产物。在本文的一些实施方案中，与表达相反，基因活性或功能被破坏。基因破坏通常由人工方法诱导，即通过添加或引入化合物、分子、复合物或组合物，和/或通过破坏基因的或与基因相关的核酸，例如在DNA水平上。基因破坏的示例性方法包括基因沉默、敲低、敲除和/或基因破坏技术，例如基因编辑。示例包括反义技术，例如RNAi、siRNA、shRNA和/或核酶，其通常导致表达的瞬时减少，以及导致靶向的基因失活或破坏的基因编辑技术，例如通过诱导断裂和/或同源重组。示例包括插入、突变和删除。破坏通常导致基因编码的正常或“野生型”产物的表达的抑制和/或完全缺失。此类基因破坏的示例是基因或基因的一部分的插入、移码和错义突变、缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。这种破坏可发生在编码区，例如，在一个或多个外显子中，从而导致不能产生全长产物、功能性产物或任何产物，例如通过插入终止密码子。这种破坏也可以通过启动子或增强子或其他影响转录激活的区域的破坏以阻止基因的转录而发生。基因破坏包括基因靶向，包括通过同源重组使靶向的基因失活。
II.多重基因编辑
在某些实施方案中，本公开内容涉及任何类型免疫细胞的多重基因编辑。CRISPR是可用于破坏免疫细胞中两个或更多个基因(例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基因)的表达的一个示例。基因可以选自表1中列出的基因，例如NK细胞受体A(NKG2A)、唾液酸结合Ig-样凝集素7(SIGLEC-7、CD328)、淋巴细胞活化3(LAG3)、T-Cell免疫球蛋白黏蛋白家族成员3(TIM3、CD366、HAVCR2)、细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH、CIS-1、SOCS)、Forkhead BoxO1(FOXO1)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96、腺苷受体2A(ADORA2)、核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)、程序性细胞死亡1(PD1)、程序性细胞死亡1配体1(PDL-1)、程序性细胞死亡1配体2(PDL-2)、CD47、信号调节蛋白α(SIRPA)、含SH2结构域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP1)、ADAM金属肽酶结构域17(ADAM17)、核糖体蛋白S6(RPS6)、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、CD25、CD40、白介素21受体(IL21R)、细胞间粘附分子1(ICAM1)、CD95、CD80、CD86、白介素21受体(IL10R)、CD5、CD7或可能存在其他抑制性基因。基因编辑允许同时破坏多个基因的表达。
在一些实施方案中，通过在基因中实现破坏(例如敲除、插入、错义或移码突变，例如双等位基因移码突变、基因的全部或部分(例如，一个或多个外显子或其部分)缺失，和/或敲入)来进行基因破坏。例如，可以通过被专门设计用于被靶向至基因或其部分的序列的序列特异性或靶向核酸酶(包括DNA结合靶向核酸酶，例如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，以及RNA指导的核酸酶，例如CRISPR-相关核酸酶(Cas))来实现破坏。
在一些实施方案中，破坏是瞬时的或可逆的，使得基因的表达在以后恢复。在其他实施方案中，破坏不是可逆的或瞬时的，例如是永久性的。
在一些实施方案中，通常以靶向方式通过诱导基因中的一个或多个双链断裂和/或一个或多个单链断裂来进行基因破坏。在一些实施方案中，双链或单链断裂由核酸酶，例如核酸内切酶，例如基因靶向核酸酶产生。在一些方面，在基因的编码区，例如在外显子中诱导断裂。例如，在一些实施方案中，诱导发生在编码区的N-末端部分附近，例如在第一个外显子中、在第二个外显子中或在随后的外显子中。
可以将指导RNA和CRISPR酶，或编码CRISPR酶的mRNA引入免疫细胞。在一些方面，将1、2、3、4、5或更多个指导RNA同时引入细胞。例如，可以在第一次电穿孔期间将1、2或3个指导RNA引入细胞，然后在第二次电穿孔期间进一步引入1、2或3个额外的指导RNA，以此类推。
在一些实施方案中，使用反义技术实现基因破坏，例如通过RNA干扰(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)和/或核酶用于选择性抑制或阻抑基因的表达。siRNA技术是利用具有与从基因转录的mRNA的核苷酸序列同源的序列和与核苷酸序列互补的序列的双链RNA分子的RNAi。siRNA通常与从基因转录的mRNA的一个区域同源/互补，或者可以是包括多个与不同区域同源/互补的RNA分子的siRNA。在一些方面，siRNA包含在多顺反子构建体中。
在一些实施方案中，使用特异性结合或杂交到基因的DNA靶向分子实现破坏，例如DNA结合蛋白或DNA结合核酸或包含它们的复合物、化合物或组合物。在一些实施方案中，DNA靶向分子包含DNA结合结构域，例如锌指蛋白(ZFP)DNA结合结构域、转录激活子样蛋白(TAL)或TAL效应子(TALE)DNA结合结构域、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)DNA结合结构域或来自大范围核酸酶的DNA结合结构域。锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可以被工程化以结合预定的核苷酸序列，例如通过天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区域的工程化(改变一个或多个氨基酸)。工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。合理的设计标准包括应用替代规则和计算机化算法以处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。
对于CRISPR介导的破坏，可以通过本领域已知的允许在细胞或亚细胞区室内递送的任何方式将指导RNA和核酸内切酶引入免疫细胞，并且可以使用的试剂/化学品和/或分子(蛋白质和核酸)包括脂质体递送工具、聚合物承载体、化学承载体、脂质复合物、人工合成多聚物(polyplex)、树枝状聚合物、纳米颗粒、乳液、天然内吞作用或吞噬作用途径作为非限制性实例，以及物理方法(例如电穿孔)。在特定方面，电穿孔用于引入指导RNA和核酸内切酶，或编码核酸内切酶的核酸。
在一种示例性的特定方法中，用于多个基因的CRISPR敲除的方法可以包括从脐带血或外周血中分离免疫细胞，例如NK细胞。作为一个示例，NK细胞可以被分离并接种在具有经辐照的饲养细胞的培养板上，例如以1:2的比例。然后可以在IL-2的存在下，例如以200IU/mL的浓度，用gRNA和Cas9对细胞进行电穿孔。作为一个示例，培养基可以每隔一天更换一次。1-3天后，分离NK细胞以去除饲养细胞，然后可以用CAR构建体进行转导。然后可以对NK细胞进行针对额外的一个或多个基因的第二次CRISPR Cas9敲除。电穿孔后，NK细胞可以用饲养细胞接种，例如持续5-9天。
表1：用于多重编辑或CAR敲入的基因。指示了敲入的示例性位置。
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Figure BDA0003153152910000201
表2：用于基因敲除的示例性gRNA序列。
Figure BDA0003153152910000202
Figure BDA0003153152910000211
在一些实施方案中，本公开内容的免疫细胞被修饰以具有改变的两个或更多个基因的表达。在一些实施方案中，改变的基因表达通过影响基因的破坏(例如敲除、插入、错义或移码突变，例如双等位基因移码突变，基因的全部或部分(例如一个或多个外显子或其部分)缺失，和/或敲入)来进行。在具体实施方案中，改变的基因表达可以通过被专门设计用于被靶向至基因或其部分的序列的序列特异性或靶向核酸酶(包括DNA结合靶向核酸酶，例如RNA指导的核酸酶，例如CRISPR-相关核酸酶(Cas))来实现。
在一些实施方案中，基因的表达、活性和/或功能的改变是通过破坏基因来进行的。在一些方面，与在不存在基因修饰或不存在引入以实现修饰的组分的情况下的表达相比，基因被修饰以使其表达降低至少或约10、20、30或40％，通常至少或约50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
在一些实施方案中，如果需要，改变是瞬时的或可逆的，使得基因的表达在稍后的时间恢复。在其他实施方案中，改变不是可逆的或瞬时的，例如是永久的。
在一些实施方案中，通常通过靶向方式诱导基因中的一个或多个双链断裂和/或一个或多个单链断裂来进行基因改变。在一些实施方案中，双链或单链断裂是由核酸酶(例如核酸内切酶，例如基因靶向核酸酶)产生的。在一些方面，在基因的编码区(例如在外显子中)诱导断裂。例如，在一些实施方案中，诱导发生在编码区的N-末端部分附近，例如在第一个外显子、第二个外显子或随后的外显子中。
在一些方面，双链或单链断裂通过细胞修复过程进行修复，例如通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在一些方面，修复过程容易出错，并导致基因破坏，例如移码突变，例如双等位基因移码突变，其可以导致基因的完全敲除。例如，在一些方面，破坏包括诱导缺失、突变和/或插入。在一些实施方案中，破坏导致早期终止密码子的存在。在一些方面，插入、缺失、易位、移码突变和/或过早的终止密码子的存在导致基因的表达、活性和/或功能的破坏。
在一些实施方案中，使用一种或多种DNA结合核酸进行改变，例如通过RNA指导的核酸内切酶(RGEN)进行改变。例如，可以使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关的(Cas)蛋白进行改变。通常，“CRISPR系统”总体地指与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因的活性有关的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(在内源CRISPR系统的背景下包含“直接重复序列”和tracrRNA处理的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔子”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可包括非编码RNA分子(指导)RNA(其序列特异性结合DNA)和具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。CRISPR系统的一个或多个元件可以源自I型、II型或III型CRISPR系统，例如源自包含内源性CRISPR系统的特定生物，例如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
在一些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列特异的crRNA和固定的tracrRNA的融合体)引入细胞中。通常，使用互补碱基配对，在gRNA的5’末端的靶位点将Cas核酸酶靶向至靶位点，例如基因。靶位点可以基于其紧邻前间区序列邻近基序(PAM)序列的5'的位置(例如通常为NGG或NAG)进行选择。在这方面，通过修饰指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸以对应于靶DNA序列来将gRNA靶向至所需序列。通常，CRISPR系统的特征在于促进靶序列位点处的CRISPR复合物形成的元件。通常，“靶序列”通常是指指导序列被设计成与其具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成，则不一定需要完全互补。
CRISPR系统可以在靶位点诱导双链断裂(DSB)，随后引起如本文所讨论的破坏或改变。在其他实施方案中，被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点处对单链切口。可以使用成对的切口酶，例如以提高特异性，其各自由不同gRNA靶向序列对指导，使得在同时引入切口时，引入5’突出端。在其他实施方案中，将无催化活性的Cas9融合至异源效应子结构域，例如转录阻遏物或激活子，以影响基因表达。
靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可以位于细胞的细胞核或细胞质中，例如在细胞的细胞器内。通常，可用于重组为包含靶序列的靶基因座的序列或模板称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可以被称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。
通常，在内源性CRISPR系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在靶序列中(例如在靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)或其附近的一条或两条链的切割。tracr序列(其可以包含野生型tracr序列的全部或一部分或由其组成(例如，野生型tracr序列的约或大于约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)也可以形成CRISPR复合物的一部分，例如通过沿着tracr序列的至少一部分与可操作地连接至指导序列的tracr配对序列的全部或一部分杂交。tracr序列与tracr配对序列具有足够的互补性，以杂交并参与CRISPR复合物的形成，例如当最佳匹配时沿tracr配对序列的长度至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。
可以将驱动CRISPR系统的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入细胞，以使CRISPR系统的元件的表达直接在一个或多个靶位点形成CRISPR复合物。组分也可以作为蛋白质和/或RNA递送到细胞。例如，Cas酶、连接至tracr-配对序列的指导序列和tracr序列可各自可操作地连接至单独载体上的单独调控元件。可选择地，可以将从相同或不同调控元件表达的两个或更多个元件组合在单个载体中，而一个或多个附加载体提供不包含在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。载体可以包含一个或多个插入位点，例如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时，单个表达构建体可以用于将CRISPR活性靶向至细胞内的多个不同的相应靶序列。
载体可以包含与编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列可操作地连接的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式。这些酶是已知的。例如，化脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。
CRISPR酶可以是Cas9(例如来自化脓链球菌或肺炎链球菌)。CRISPR酶可以指导一条或两条链的在靶序列位置处的切割，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内。载体可以编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸置换(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可以与一个或多个指导序列例如两个指导序列(其分别靶向DNA靶的有义和反义链)组合使用。这种组合允许两条链都被切口并用于诱导NHEJ或HDR。
在一些实施方案中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞如真核细胞中表达。真核细胞可以是特定生物(例如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类)的真核细胞或衍生自该特定生物的真核细胞。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子同时保持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以在感兴趣的宿主细胞中增强表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，其进而被认为取决于(除其他以外)翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可以基于密码子优化针对在给定生物中的最佳基因表达定制基因。
一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的直接序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列及其对应的靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高。
可以使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，算法的非限制性示例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(NovocraftTechnologies、ELAND(Illumina，San Diego、Calif.)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)。
CRISPR酶可以是包含一个或多个异源蛋白结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何其他蛋白序列，以及任选地任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白结构域的实例包括但不限于表位标签，报告基因序列和具有以下一种或多种活性的蛋白结构域：甲基化酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽5转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和自发荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以与编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的其他结构域在US 20110059502中描述，其通过引用并入本文。
III.在抑制性基因座处插入CAR和/或TCR
在一些实施方案中，本公开内容涉及在免疫细胞的特定基因座处插入CAR和/或TCR。CAR和/或TCR可以插入抑制性基因座，例如选自NKG2A、Siglec 7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、腺苷受体2A、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPa、SHIP1、ADAM17、pS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7及其组合的基因。
在本文公开的任何方法中插入一个或多个CAR和/或TCR可以是位点特异性的。例如，可以在启动子附近或邻近插入一个或多个CAR和/或TCR。在另一个实例中，可以在基因(例如，抑制性基因)的外显子附近、邻近或之内插入一个或多个转基因。此类插入可用于敲入CAR和/或TCR，同时破坏基因的表达。在另一个示例中，可以在基因的内含子附近、邻近或之内插入一个或多个CAR和/或TCR。CAR和/或TCR可以通过腺相关病毒(AAV)病毒载体引入并整合到靶向的基因组位置中。在一些情况下，可以利用rAAV载体将转基因直接插入特定位置。例如，在一些情况下，CAR和/或TCR可以通过rAAV或AAV载体整合到以下基因的至少一部分中：NKG2A、Siglec 7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、腺苷受体2A、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPa、SHIP1、ADAM17、pS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5或CD7基因。
细胞的靶向的基因座的修饰可以通过将DNA引入细胞来产生，其中DNA与靶基因座具有同源性。DNA可以包括标志基因，从而允许选择包含整合的构建体的细胞。靶载体中的互补DNA可以与靶基因座处的染色体DNA重组。标志基因的侧翼可以是互补的DNA序列，即3’重组臂和5’重组臂。可以靶向细胞内的多个基因座。例如，可以一次引入具有对1个或多个靶基因座特异的重组臂的转基因，使得在一个步骤中发生多个基因组修饰。同源臂的长度可为约0.2kb至约5kb，例如，长度为约0.2kb、0.4kb、0.6kb、0.8kb、1.0kb、1.2kb、1.4kb、1.6kb、1.8kb、2.0kb、2.0kb、22.4kb、2.6kb、2.8kb、3.0kb、3.2kb、3.4kb、3.6kb、3.8kb、4.0kb、4.2kb、4.4kb、4.6kb、4.8kb至约5.0kb。
在一种方法中，可以设计指导RNA以靶向抑制性基因座的区域，例如与基因的启动子、外显子或内含子相邻的区域。指导RNA可以靶向抑制性基因的外显子的5’末端，例如第一个、第二个或第三个外显子。指导RNA可以包含在AAV载体修复基质中。AAV载体可以编码自切割2A肽，例如P2A肽，然后是CAR cDNA。CAR盒和指导RNA序列的侧翼可以是针对抑制性基因的同源臂。然后可以将AAV载体和Cas9(例如Cas9 mRNA)例如通过电穿孔引入免疫细胞。
IV.免疫细胞
本公开内容的某些实施方案涉及被工程化以具有多个基因的敲除和/或具有在抑制性基因座处CAR的敲入的免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、不变性NK细胞、NK T细胞、B细胞、干细胞(例如，间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPSC)细胞)。免疫细胞可以是病毒特异性的，表达CAR，和/或表达TCR。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。本文还提供了产生和工程化免疫细胞的方法以及使用和施用细胞用于过继细胞疗法的方法，在这种情况下，细胞可以是自体的或同种异体的。因此，免疫细胞可用作免疫疗法，例如靶向癌细胞。
免疫细胞可以从受试者，特别是人类受试者中分离。免疫细胞可以获自感兴趣的受试者，例如怀疑患有特定疾病或病况的受试者、怀疑具有特定疾病或病况的倾向的受试者或正在接受针对特定疾病或病况的治疗的受试者。免疫细胞可以从它们驻留在受试者中的任何位置(包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结和骨髓)收集。分离的免疫细胞可以直接使用，或它们可以保存一段时间，例如通过冷冻。
免疫细胞可以从它们驻留的任何组织(包括但不限于血液(包括由血库或脐带血库收集的血液)、脾脏、骨髓、在手术程序期间移除和/或暴露的组织以及通过活检程序获得的组织)富集/纯化。从中富集、分离和/或纯化免疫细胞的组织/器官可以从活的和非活的受试者中分离，其中非活的受试者是器官供体。在特定实施方案中，免疫细胞从血液例如外周血或脐带血或其混合物中分离。在一些方面，从脐带血分离的免疫细胞具有增强的免疫调节能力，例如通过CD4阳性或CD8阳性T细胞抑制来测量。在特定方面，免疫细胞从汇集血液，特别是汇集脐带血中分离，以增强免疫调节能力。汇集的血液可以来自2个或更多个来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。
免疫细胞的群体可以从需要治疗或患有与降低的免疫细胞活性相关的疾病的受试者获得。因此，这些细胞对于需要治疗的受试者来说可以是自体的。可选择地，免疫细胞的群体可以从供体，优选组织相容性匹配的供体获得。免疫细胞群体可以从外周血、脐带血、骨髓、脾脏或免疫细胞驻留在受试者或供体中的任何其他器官/组织中收获。免疫细胞可以从受试者和/或供体的汇集库中分离，例如从汇集的脐带血中分离。
当免疫细胞的群体从与受试者不同的供体获得时，供体优选是同种异体的，条件是获得的细胞在它们可以被引入的受试者中是受试者相容的。同种异体供体细胞可以或可以不与人类白细胞抗原(HLA)相容。
A.T细胞
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在过去的二十年中，已经描述了几种用于衍生、激活和扩增功能性抗肿瘤效应细胞的基本方法。这些包括：自体细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或包被有T细胞配体和激活抗体的珠子或通过捕获靶细胞膜分离的细胞离体激活T细胞；天然表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和被基因重编程或“重定向”以表达展示抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子(被称为“T体”)的非肿瘤特异性的自体或同种异体细胞。这些方法产生了可用于本文描述的方法的用于T细胞制备和免疫的许多方案。
在一些实施方案中，T细胞来源于血液、骨髓、淋巴、脐带或淋巴器官。在一些方面，细胞是人细胞。细胞通常是原代细胞，例如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，例如完整的T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，例如通过功能、激活状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌特征谱和/或分化程度定义的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，例如对于现成技术，细胞是多能性和/或多潜能的，例如干细胞，例如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括如本文所述从受试者分离细胞，对其进行制备、加工、培养和/或工程化，并且在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者。
T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞，辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变性T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，一种或多种T细胞群富集或耗尽对特定标志物例如表面标志物呈阳性或对特定标志物呈阴性的细胞。在一些情况下，此类标志物是在某些T细胞群(例如，非记忆细胞)上不存在或以相对低水平表达但在某些其他T细胞群(例如，记忆细胞)上存在或以相对较高水平表达的标志物。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物(例如CD14)来从PBMC样品分离T细胞。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可以通过阳性或阴性选择在一个或多个幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达的或表达至相对较高程度的标志物而进一步分选为亚群。
在一些实施方案中，例如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择，使CD8+T细胞进一步富集或耗尽幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞。在一些实施方案中，进行针对中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高功效，例如以改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。
在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞。在该方法中，从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬浮液。单细胞悬浮液可以以任何合适的方式获得，例如机械地(使用例如gentleMACSTM Dissociator,Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.分解肿瘤)或酶促地(例如，胶原酶或DNA酶)。肿瘤酶促消化物的单细胞悬浮液在白介素2(IL-2)中培养。
可以合并培养的T细胞并快速扩增。快速扩增使抗原特异性T细胞的数量在约10至约14天的时间内增加至少约50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或更多)。更优选地，快速扩增提供在约10至约14天的时间内至少约200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更多)的增加。
可以通过本领域已知的多种方法中的任一种来实现扩增。例如，在饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)(优选IL-2)的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激物可包括约30ng/ml的OKT3，其是一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Ortho-
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Raritan，N.J.获得)。可选择地，可以通过在T细胞生长因子(例如300IU/ml IL-2或IL-15，优选IL-2)的存在下用一种或多种癌症抗原(包括其抗原部分，例如表位或细胞)(其可以任选地从载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽)在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)来快速扩增T细胞。通过用负载在表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再次刺激来迅速扩增体外诱导的T细胞。可选择地，例如，可以用经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再次刺激T细胞。
可以修饰自体T细胞以表达促进自体T细胞的生长和活化的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括例如白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域已知的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。在特定方面，修饰的自体T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列(例如IL-12的)以及启动子(其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接促进高水平表达)在本领域是容易获得的。
B.NK细胞
在一些实施方案中，免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。NK细胞是淋巴细胞的一个亚群，其具有针对多种肿瘤细胞、病毒感染细胞以及骨髓和胸腺中的一些正常细胞的自发的细胞毒性。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟。NK细胞可以通过特定的表面标志物(例如人中的CD16、CD56和CD8)进行检测。NK细胞不表达T细胞抗原受体、泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白B细胞受体。
在某些实施方案中，NK细胞通过本领域众所周知的方法衍生自人外周血单核细胞(PBMC)、未受刺激的白细胞去除术产物(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、骨髓或脐带血。特别地，脐带CB用于衍生NK细胞。在某些方面，通过先前描述的NK细胞离体扩增方法(Spanholtz等人,2011；Shah等人,2013)分离和扩增NK细胞。在该方法中，CB单核细胞通过ficoll密度梯度离心分离，并在生物反应器中与IL-2和人工抗原呈递细胞(aAPC)一起培养。7天后，细胞培养物耗尽任何表达CD3的细胞，并再培养另外7天。细胞再次耗尽CD3并进行表征以确定CD56+/CD3-细胞或NK细胞的百分比。在其他方法中，脐带CB用于通过分离CD34+细胞并通过在含有SCF、IL-7、IL-15和IL-2的培养基中培养分化为CD56+/CD3-细胞来衍生NK细胞。
在具体的实施方案中，NK细胞在其制备过程中的某个时间点被扩增。在特定情况下，NK细胞的扩增包括：在抗原呈递细胞(APC)和IL-2的存在下刺激来自脐带血的单核细胞(MNC)；以及用APC再刺激细胞以产生扩增的NK细胞，其中至少在一些情况下，该方法在生物反应器中进行。刺激步骤可以指导MNC朝向NK细胞。再刺激步骤可以包含或可以不包含IL-2的存在。在特定方面，该方法不包括在刺激步骤期间去除或添加任何培养基成分。在特定方面，该方法在特定时间范围内(例如少于15天，例如14天)执行。
在某个实施方案中，NK细胞通过用于扩增的离体方法进行扩增，其包括：(a)从脐带血获得单核细胞(MNC)的起始群体；(b)在抗原呈递细胞(APC)和IL-2的存在下刺激MNC；和(c)用APC再刺激细胞以产生扩增的NK细胞，其中该方法在生物反应器中进行并且符合良好生产规范(GMP)。步骤(b)的刺激可以指导MNC朝向NK细胞。步骤(c)可以包含或可以不包含IL-2的存在。在特定方面，该方法不包括在步骤(b)期间去除或添加任何培养基成分。在特定方面，该方法在少于15天，例如在14天内进行。
在一些方面，例如，该方法进一步包括耗尽对一种或多种特定标志物(例如CD3)呈阳性的细胞。在某些方面，耗尽步骤在步骤(b)和(c)之间进行。在一些方面，从生物反应器中移出细胞以用于CD3耗尽并置于生物反应器中以用于步骤(c)。
在某些方面，从脐带血获得MNC的起始群体包括在葡聚糖、人血清白蛋白(HSA)、DNAse和/或氯化镁的存在下解冻脐带血。在特定方面，从脐带血获得MNC的起始群体包括在葡聚糖和/或DNase的存在下解冻脐带血。在特定方面，在5-20％，例如10％的葡聚糖的存在下洗涤脐带血。在某些方面，在氯化镁的存在下(例如以100-300mM，特别是200mM的浓度)悬浮脐带血。在一些方面，所述获得包括进行ficoll密度梯度离心以获得单核细胞(MNC)。
在某些方面，生物反应器是透气性生物反应器。在特定方面，透气性生物反应器是G-Rex100M或G-Rex100。在一些方面，步骤(b)的刺激在3-5L(例如3、3.5、4、4.5或5L)的培养基中进行。
在一些方面，APC是经γ辐照的。在某些方面，APC被工程化以表达膜结合IL-21(mbIL-21)。在特定方面，APC被工程化以表达IL-21、IL-15和/或IL-2。在一些方面，MNC和APC以1:2的比例培养。在一些方面，IL-2的浓度为50-200IU/mL，例如100IU/mL。在特定方面，IL-2每2-3天补充一次。
在特定方面，步骤(b)进行6-8天，例如7天。在一些方面，步骤(c)进行6-8天，例如7天。在一些方面，步骤(c)不包括细胞的分割。在特定方面，在步骤(c)期间用IL-2喂养细胞两次，并且在特定情况下，在步骤(c)期间不添加或去除其他培养基成分。
在一些方面，所述方法包括使用3、4、5或6个生物反应器。在特定方面，所述方法包括使用少于10个生物反应器。
在特定方面，NK细胞被扩增至少500倍、800倍、1000倍、1200倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍或5000倍。在特定方面，与静态液体培养相比，在生物反应器中培养NK细胞产生超过1000倍的NK细胞。
在某些方面，所述方法不包括人类白细胞抗原(HLA)匹配。在一些方面，NK细胞的起始群不是从单倍体相同的供体获得的。
在一些方面，扩增的NK细胞具有与从外周血扩增的NK细胞相比增强的抗肿瘤活性。在某些方面，与从外周血扩增的NK细胞相比，扩增的NK细胞具有一种或多种细胞周期基因、一种或多种细胞分裂基因和/或一种或多种DNA复制基因的更高的表达。在一些方面，扩增的NK细胞具有与从外周血扩增的NK细胞相比更高的增殖能力。在一些方面，扩增的NK细胞不表现出衰竭。在某些方面，通过测量穿孔素、颗粒酶、CD57、KLRG1和/或PD1的表达来检测衰竭。在一些方面，扩增的NK细胞具有穿孔素和/或颗粒酶的高表达。在某些方面，扩增的NK细胞具有低表达的或不表达CD57、KLRG1和/或PD1。
在一些方面，扩增的NK细胞包括临床相关剂量。在某些方面，脐带血是冷冻脐带血。在特定方面，冷冻脐带血已经针对一种或多种传染病(例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、克氏锥虫、HIV、人类T淋巴细胞病毒、梅毒、寨卡病毒等)进行了测试。在一些方面，脐带血是汇集的脐带血，例如来自3、4、5、6、7或8个个体脐带血单元。
在一些方面，NK细胞不是自体的，例如相对于接受者个体。在某些方面，NK细胞不是同种异体的，例如相对于接受者个体。
在一些方面，APC是通用抗原呈递细胞(uAPC)。在某些方面，uAPC被工程化以表达(1)CD48和/或CS1(CD319)，(2)膜结合白介素-21(mbIL-21)和(3)41BB配体(41BBL)。在一些方面，uAPC表达CD48。在某些方面，uAPC表达CS1。在特定方面，uAPC表达CD48和CS1。在一些方面，uAPC基本上不表达内源性I类、II类HLA和/或CD1d分子。在某些方面，uAPC表达ICAM-1(CD54)和/或LFA-3(CD58)。在特定方面，uAPC进一步定义为白血病细胞衍生的aAPC，例如K562细胞。
C.干细胞
在一些实施方案中，本公开内容的免疫细胞可以是干细胞，例如诱导多能干细胞(PSC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。
本文使用的多能干细胞可以是诱导多能干(iPS)细胞，通常缩写为iPS细胞或iPSC。除生殖细胞外，任何细胞可以用作iPSC的起点。例如，细胞类型可以是角质形成细胞、成纤维细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞或胃细胞。对细胞分化程度或从其收集细胞的动物的年龄没有限制；在本文公开的方法中，甚至未分化的祖细胞(包括体干细胞)和最终分化的成熟细胞也可以用作体细胞的来源。
可以使用本领域技术人员已知的方法重编程体细胞以产生iPS细胞。通常，核重编程因子用于从体细胞产生多能干细胞。在一些实施方案中，使用Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28中的至少三种或至少四种。在其他实施方案中，使用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4或Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28。
一旦衍生，iPSC可以在足以维持多能性的培养基中培养。在某些实施方案中，可以使用未确定的条件；例如，多能细胞可以在成纤维细胞饲养细胞或已暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上培养，以保持干细胞处于未分化状态。在一些实施方案中，在用辐射或抗生素处理以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞的共同存在下培养细胞。可选择地，多能细胞可以使用成分确定的、不依赖饲养层的培养系统(例如TESRTM培养基或E8TM/Essential 8TM培养基)培养并维持在基本上未分化的状态。
V.遗传工程改造的抗原受体
本公开内容的免疫细胞可以被遗传工程改造以表达抗原受体，例如工程化的TCR、CAR、嵌合细胞因子受体、趋化因子受体、其组合等。例如，免疫细胞被修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的CAR和/或TCR。可以将多种CAR和/或TCR(例如针对不同抗原)添加到免疫细胞中。在一些方面，通过使用CRISPR在抑制性基因座处敲入CAR或TCR，将免疫细胞工程化以表达CAR或TCR。
合适的修饰方法是本领域已知的。参见，例如上文的Sambrook and Ausubel。例如，可以使用Heemskerk等人,2008和Johnson等人,2009中描述的转导技术转导细胞以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。
编码全长TCRα和β(或γ和δ)链的RNA的电穿孔可以用作替代方案以克服由逆转录病毒转导的和内源的TCR链的配对引起的自身反应性的长期问题。即使这种替代配对发生在瞬时转染策略中，可能产生的自身反应性T细胞也会在一段时间后失去这种自身反应性，因为引入的TCRα和β链只是瞬时表达。当引入的TCRα和β链表达减少时，仅剩下正常的自体T细胞。当通过稳定的逆转录病毒转导引入全长TCR链时，情况并非如此，其永远不会丢失所引入的TCR链，从而在患者中不断引起自身反应性。
在一些实施方案中，细胞包含通过遗传工程改造引入的编码一种或多种抗原受体的一种或多种核酸，以及此类核酸的遗传工程改造产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即，通常不存在于从该细胞获得的细胞或样品中，例如从另一种生物或细胞获得的核酸，其例如通常不存在于被工程改造的细胞和/或衍生出此类细胞的生物中。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，例如自然界中不存在的核酸(例如，嵌合的)。
在一些实施方案中，CAR含有与抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，抗原是在细胞表面表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是经加工的肽抗原，例如细胞内蛋白的肽抗原，其像TCR一样，在主要组织相容性复合体(MHC)分子的背景下在细胞表面被识别。
示例性抗原受体(包括CAR和重组TCR)以及将所述受体工程化和引入细胞的方法包括例如描述于以下中的那些：国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416和/或Sadelain等人,2013；Davila等人,2013；Turtle等人,2012；Wu等人,2012描述的那些。在一些方面，遗传工程改造的抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。
A.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，CAR包含：a)一个或多个细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含抗原结合区的细胞外结构域。
在一些实施方案中，工程化的抗原受体包括CAR，包括激活或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,2013)。CAR通常包含与一种或多种细胞内信号传导组分连接(在一些方面通过接头和/或一个或多个跨膜结构域)的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这样的分子通常模拟或近似通过天然抗原受体引起的信号、通过与共刺激受体组合的这样的受体引起的信号和/或通过单独的共刺激受体引起的信号。
本公开内容的某些实施方案涉及核酸，包括编码抗原特异性CAR多肽(包括已被人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个信号传导基序的细胞外结构域)的核酸的使用。在某些实施方案中，CAR可以识别包含在一种或多种抗原之间的共享空间的表位。在某些实施方案中，结合区可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于与受体结合的肽(例如细胞因子)。
预期人类CAR核酸可以是用于增强人类患者的细胞免疫疗法的人类基因。在一个具体的实施方案中，本发明包括全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可以包含来源于特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，例如在美国专利7,109,304中描述的那些，该文献以引用方式并入本文。该片段也可以是人抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在一个更具体的实施方案中，该片段是由针对人类密码子使用优化以用于在人类细胞中表达的序列编码的抗原特异性scFv。
布置可以是多聚体，例如双抗体或多聚体。多聚体最有可能通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体而形成。构建体的铰链部分可以有多种替代选择，从完全缺失到保留第一个半胱氨酸，到脯氨酸而不是丝氨酸置换、被截短至第一个半胱氨酸。可以删除Fc部分。任何稳定和/或二聚化的蛋白质都可以达到这个目的。可以仅使用一个Fc结构域，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可以使用经过修饰以改善二聚化的人类免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区域。还可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。还可以使用CD8α的一部分。
在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其他共刺激受体(例如跨膜结构域和修饰的CD28细胞内信号传导结构域)的序列。其他共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)中的一种或多种。除了由CD3ζ引发的主要信号外，由插入人CAR中的人共刺激受体提供的其他信号对于NK细胞的完全活化也很重要，并且可以帮助改善体内持久性和过继免疫疗法的治疗成功。
在一些实施方案中，以对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性的方式构建CAR，所述特定抗原是例如在特定细胞类型中表达以通过过继疗法靶向的抗原，例如癌症标志物，和/或旨在诱导抑制反应的抗原，例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原。因此，CAR通常在其细胞外部分中包含一个或多个抗原结合分子，例如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包含抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可以被称为包含抗原结合区的细胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结合结构域。抗原包括被模式识别受体(例如Dectin-1)识别的碳水化合物抗原。肿瘤相关抗原可以是任何种类的，只要它在肿瘤细胞的细胞表面上表达。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras等。在某些实施方案中，当存在少量的肿瘤相关抗原时，CAR可以与细胞因子共表达以改善持久性。例如，CAR可以与一种或多种细胞因子(例如IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其组合)共表达。
编码嵌合受体的开放阅读框的序列可以获自基因组DNA来源、cDNA来源或可被合成(例如，通过PCR)或其组合。取决于基因组DNA的大小和内含子的数量，可能期望的是使用cDNA或其组合，因为发现内含子可以稳定mRNA。此外，使用内源性或外源性非编码区来稳定mRNA可能是进一步有利的。
预期可以将嵌合构建体作为裸DNA或在合适的载体中引入免疫细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号6,410,319。裸DNA通常是指以用于表达的合适取向包含在质粒表达载体中的编码嵌合受体的DNA。
可选择地，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫细胞。用于根据本公开内容的方法使用的合适的载体在免疫细胞中是非复制性的。已知许多基于病毒的载体，其中维持在细胞中的病毒的拷贝数足够低以维持细胞的存活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
在一些方面，抗原特异性结合或识别组分连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸置换来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些实施方案中，跨膜结构域来源于天然或合成来源。在来源是天然的情况下，则该结构域在某些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自以下(即至少包括其一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，ICOS/CD278，GITR/CD357，NKG2D和DAP分子。可选择地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成的跨膜结构域的每个末端将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在某些实施方案中，本文公开的用于遗传修饰免疫细胞例如NK细胞的平台技术包括(i)使用电穿孔装置(例如nucleofector)的非病毒基因转移，(ii)通过内结构域(例如CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)发送信号的CAR，(iii)具有可变长度的将抗原识别结构域连接到细胞表面的胞外结构域的CAR，和在某些情况下(iv)衍生自K562以能够稳健地和数字地扩增CAR+免疫细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)(Singh等人,2008；Singh等人,2011)。
B.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，遗传工程改造的抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指包含可变的α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变的γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)，和能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。
通常，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以存在于细胞表面上或以可溶形式存在。通常，TCR存在于T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见，例如，Janeway等人,1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白相关。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为包括其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，出于本文的目的，提及的TCR包括任何TCR或功能片段，例如TCR的抗原结合部分，其结合在MHC分子中结合的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(可以互换使用)是指包含TCR的结构性结构域的一部分但与全长TCR结合的抗原(例如MHC-肽复合物)结合的分子。在一些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成与特定MHC-肽复合物结合的结合位点，例如通常其中每条链包含三个互补决定区。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成环，或类似于免疫球蛋白的互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点和确定肽特异性而赋予抗原识别并确定肽特异性。通常，像免疫球蛋白一样，CDR由框架区(FR)分开(参见，例如Jores等人,1990；Chothia等人,1988；Lefranc等人,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示与抗原肽的N-末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C-末端部分相互作用。CDR2被认为可以识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可以包含附加的高变(HV4)区。
在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链(例如α链、β链)的细胞外部分可以包含两个免疫球蛋白结构域，分别是位于N末端的可变结构域(例如Va或Vp；通常是基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,5th ed.)，和与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，a链恒定结构域或Ca，通常是基于Kabat的氨基酸117至259，β链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分包含两个膜近端恒定结构域和两个包含CDR的膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR在α和β链的每条链中可具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链可包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链包含胞质尾部。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子(例如CD3)缔合。例如，含有恒定结构域和跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。
通常，CD3是一种多蛋白复合物，其在哺乳动物中可以具有三条不同的链(γ、δ和ε)以及ζ链。例如，在哺乳动物中，该复合物可含有CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾部各自包含一个保守的基序，称为基于酪氨酸的免疫受体活化基序或ITAM，而每个CD3ζ链具有三个。通常，ITAM参与TCR复合体的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区，并在将信号从TCR传播到细胞中发挥作用。CD3-和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是包含例如通过一个或多个二硫键连接的两条单独的链的异二聚体(α和β链或γ和δ链)。在一些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如，癌症抗原)的TCR并将其引入细胞。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，例如通过可公开获得的TCR DNA序列的聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物学来源，例如获自细胞，例如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他可公开获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以获自体内分离的细胞。在一些实施方案中，可以从患者中分离出高亲和力的T细胞克隆，并分离出TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人,2009和Cohen等人,2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人,2008和Li,2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以根据TCR序列的知识合成产生。
C.抗原呈递细胞
抗原呈递细胞(包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突状细胞)的特征在于它们表达特定的MHC分子。APC将抗原内在化并将该抗原的一部分与MHC分子一起重新表达在其外细胞膜上。MHC是具有多个基因座的大型遗传复合体。MHC基因座编码两大类MHC膜分子，称为I类和II类MHC。T辅助淋巴细胞通常识别与II类MHC分子相关的抗原，而T细胞毒性淋巴细胞识别与I类MHC分子相关的抗原。在人中，MHC被称为HLA复合物，在小鼠中被称为H-2复合物。
在一些情况下，aAPC可用于制备实施方案的治疗组合物和细胞治疗产品。对于有关抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见，例如，美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开号2009/0017000和2009/0004142；和国际公开号WO2007/103009。
aAPC系统可以包含至少一个外源性辅助分子。可以采用任何合适数量和组合的辅助分子。辅助分子可以选自诸如共刺激分子和粘附分子的辅助分子。示例性共刺激分子包括CD86、CD64(FcγRI)、41BB配体和IL-21。粘附分子可以包括碳水化合物结合糖蛋白(例如选择素)，跨膜结合糖蛋白(例如整合素)，钙依赖性蛋白(例如钙黏着蛋白)和单程跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白，例如细胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞间或细胞与基质间的接触。示例性的粘附分子包括LFA-3和ICAM，例如ICAM-1。可用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂在例如美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001中得到了例示。
D.抗原
由经遗传工程改造的抗原受体靶向的抗原包括在待通过过继细胞疗法靶向的疾病、病况或细胞类型的背景下表达的抗原。疾病和病况包括增生性、赘生性和恶性疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液系统癌症，免疫系统癌症，例如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，例如B、T和髓样白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病况的细胞例如肿瘤或病原性细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在经工程化的细胞上表达。
在本方法中可以靶向任何合适的抗原。在一些情况下，抗原可能与某些癌细胞有关，但与非癌细胞无关。示例性抗原包括但不限于来自感染原的抗原分子、自体/自身抗原、肿瘤/癌症相关抗原和肿瘤新抗原(Linnemann等人,2015)。在特定方面，抗原包括NY-ESO、EGFRvIII、Muc-1、Her2、CA-125、WT-1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4和CEA。在特定方面，用于两种或更多种抗原受体的抗原包括但不限于CD19、EBNA、WT1、CD123、NY-ESO、EGFRvIII、MUC1、HER2、CA-125、WT1、Mage-A3、Mage-A4、Mage-A10、TRAIL/DR4和/或CEA。这些抗原的序列是本领域已知的，例如在
Figure BDA0003153152910000461
数据库中：CD19(登录号NG_007275.1)、EBNA(登录号NG_002392.2)、WT1(登录号NG_009272.1)、CD123(登录号NC_000023.11)、NY-ESO(登录号NC_000023.11)、EGFRvIII(登录号NG_007726.3)、MUC1(登录号NG_029383.1)、HER2(登录号NG_007503.1)、CA-125(登录号NG_055257.1)、WT1(登录号NG_009272.1)、Mage-A3(登录号NG_013244.1)、Mage-A4(登录号NG_013245.1)、Mage-A10(登录号NC_000023.11)、TRAIL/DR4(登录号NC_000003.12)和/或CEA(登录号NC_000019.10)。
肿瘤相关抗原可源自例如前列腺、乳腺、结肠直肠、肺、胰腺、肾、间皮瘤、卵巢、肝、脑、骨、胃、脾、睾丸、宫颈、肛门、胆囊、甲状腺或黑色素瘤癌症。示例性的肿瘤相关抗原或肿瘤细胞衍生的抗原包括MAGE 1、3和MAGE 4(或其他MAGE抗原，例如国际专利公开号WO99/40188中所公开的那些)；PRAME；BAGE；RAGE，Lage(也称为NY ESO 1)；SAGE；和HAGE或GAGE。肿瘤抗原的这些非限制性实例在多种肿瘤类型(例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌)中表达。参见，例如，美国专利号6,544,518。前列腺癌肿瘤相关抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺酸性磷酸盐，NKX3.1和前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)。
其他肿瘤相关抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto和Criptin。另外，肿瘤抗原可以是自身肽激素，例如全长促性腺激素释放激素(GnRH)，其是一种短的10个氨基酸长的肽，可用于治疗许多癌症。
肿瘤抗原包括源自特征在于肿瘤相关抗原表达例如HER-2/neu表达的癌症的肿瘤抗原。感兴趣的肿瘤相关抗原包括谱系特异性肿瘤抗原，例如黑素细胞-黑素瘤谱系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白。举例说明性肿瘤相关抗原包括但不限于源自或包含以下中的任一种或多种的肿瘤抗原：p53、Ras、c-Myc、胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，A-Raf、B-Raf和C-Raf、细胞周期蛋白依赖性激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、TRK受体、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、Wilms肿瘤抗原(WT1)、AFP、-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RAR、肿瘤相关钙信号传导子1(TACSTD1)TACSTD2、受体酪氨酸激酶(例如表皮生长因子受体(EGFR)(特别是EGFRvIII)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR))、胞质酪氨酸激酶(例如src家族、syk-ZAP70家族)、整合素相关激酶(ILK)、转录STAT3、STATS和STATE的信号传导子和激活物、缺氧诱导因子(例如HIF-1和HIF-2)、核因子-κB(NF-B)、Notch受体(例如Notch1-4)、c-Met、雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERK)及其调节亚基、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、肾细胞癌-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250)、STEAD、TEL/AML1、GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤易位断点、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、mesothelian、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、RGsS、SART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2、fos相关抗原1、CBX2、CLDN6、SPANX、TPTE、ACTL8、ANKRD30A、CDKN2A、MAD2L1、CTAG1B、SUNC1、LRRN1和独特型。
抗原可以包括表位区或表位肽，其来源于肿瘤细胞中突变的基因或在肿瘤细胞中以与正常细胞相比不同的水平转录的基因，例如端粒酶、存活蛋白、间皮素、突变的ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变或野生型p53、细胞色素P450 1B1和异常表达的内含子序列，例如N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶-V；免疫球蛋白基因的克隆重排，其在骨髓瘤和B细胞淋巴瘤中产生独特的独特型；包括来源于癌病毒过程的表位区或表位肽的肿瘤抗原，例如人乳头瘤病毒蛋白E6和E7；Epstein bar病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变癌胚蛋白，例如癌胚抗原和甲胎蛋白。
在其他实施方案中，抗原是从病原性微生物或机会性病原性微生物(在本文中也称为传染病微生物)例如病毒、真菌、寄生虫和细菌获得或衍生的。在某些实施方案中，衍生自此类微生物的抗原包括全长蛋白。
其抗原预期用于本文描述的方法的示例性病原性生物包括人免疫缺陷病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，巨细胞病毒(CMV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，甲型、乙型和丙型流感，水疱性口炎病毒(VSV)，水疱性口腔炎病毒(VSV)，多瘤病毒(例如BK病毒和JC病毒)，腺病毒，葡萄球菌属(Staphylococcus)物种，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，和链球菌属物种，包括肺炎链球菌。如本领域技术人员将理解的，源自这些和其他病原性微生物的用作如本文所述的抗原的蛋白质可以在出版物和公共数据库如
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Figure BDA0003153152910000482
和
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中鉴定。
源自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原包括以下任一种：HIV病毒体结构蛋白(例如gp120、gp41、p17、p24)，蛋白酶，逆转录酶或由tat、rev、nef、vif、vpr和vpu编码的HIV蛋白。
源自单纯疱疹病毒(例如，HSV1和HSV2)的抗原包括但不限于从HSV晚期基因表达的蛋白质。后一组基因主要编码形成病毒体颗粒的蛋白质。这样的蛋白质包括来自形成病毒衣壳的(UL)的五种蛋白质：UL6、UL18、UL35、UL38和主要衣壳蛋白UL19、UL45和UL27，它们各自可以用作本文所述的抗原。预期在本文中用作抗原的其他示例性HSV蛋白包括ICP27(H1、H2)、糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)蛋白。HSV基因组包含至少74个基因，每个基因编码可能被用作抗原的蛋白质。
源自巨细胞病毒(CMV)的抗原包括CMV结构蛋白、在病毒复制的立即早期和早期阶段期间表达的病毒抗原、糖蛋白I和III、衣壳蛋白、外壳蛋白、低基质蛋白pp65(ppUL83)、p52(ppUL44)、IE1和1E2(UL123和UL122)、来自UL128-UL150的基因簇的蛋白质产物(Rykman等人,2006)、包膜糖蛋白B(gB)、gH、gN和pp150。如本领域技术人员将理解的，用作本文描述的抗原的CMV蛋白可在诸如
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Figure BDA0003153152910000492
和
Figure BDA0003153152910000493
的公共数据库中鉴定(参见，例如，Bennekov等人,2004；Loewendorf等人,2010；Marschall等人,2009)。
预期用于某些实施方案中的源自Epstein-Ban病毒(EBV)的抗原包括EBV裂解蛋白gp350和gp110，在潜伏期感染期间产生的EBV蛋白，包括Epstein-Ban核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)和潜伏膜蛋白(LMP)-1、LMP-2A和LMP-2B(参见，例如Lockey等人,2008)。
预期用于本文的源自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原包括由RSV基因组编码的11种蛋白质中的任何一种或其抗原片段：NS1、NS2、N(核衣壳蛋白)、M(基质蛋白)SH、G和F(病毒外壳蛋白)、M2(第二基质蛋白)、M2-1(延伸因子)、M2-2(转录调节)、RNA聚合酶和磷蛋白P。
预期使用的源自水疱性口炎病毒(VSV)的抗原包括VSV基因组编码的五种主要蛋白质中的任何一种及其抗原片段：大蛋白质(L)、糖蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M)(参见，例如Rieder等人,1999)。
预期在某些实施方案中使用的源自流感病毒的抗原包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白M1和M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和PB2。
示例性病毒抗原还包括但不限于腺病毒多肽、甲病毒多肽、杯状病毒多肽(例如杯状病毒衣壳抗原)、冠状病毒多肽、瘟热病毒多肽、埃博拉病毒多肽、肠病毒多肽、黄病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(乙型肝炎核心或表面抗原、丙型肝炎病毒E1或E2糖蛋白、核心或非结构蛋白)、疱疹病毒多肽(包括单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白)、传染性腹膜炎病毒多肽、白血病病毒多肽、马尔堡病毒多肽、正粘病毒多肽、乳头瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如血凝素和神经氨酸酶多肽)、副粘病毒多肽、细小病毒多肽、瘟病毒多肽、小核糖核酸病毒多肽(例如脊髓灰质炎病毒衣壳多肽)、痘病毒多肽(例如牛痘病毒多肽)、狂犬病病毒多肽(例如狂犬病病毒糖蛋白G)、呼肠孤病毒多肽、逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。
在某些实施方案中，抗原可以是细菌抗原。在某些实施方案中，感兴趣的细菌抗原可以是分泌的多肽。在其他某些实施方案中，细菌抗原包括具有暴露于细菌的外细胞表面上的多肽的一个或多个部分的抗原。
预期使用的源自葡萄球菌属物种(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))的抗原包括毒力调节剂，例如Agr系统、Sar和Sae、Arl系统、Sar同源物(Rot、MgrA、SarS、SarR、SarT、SarU、SarV、SarX、SarZ和TcaR)、Srr系统和TRAP。可以用作抗原的其他葡萄球菌蛋白包括Clp蛋白、HtrA、MsrR、乌头酸酶、CcpA、SvrA、Msa、CfvA和CfvB(参见，例如，Staphylococcus:Molecular Genetics,2008Caister Academic Press,Ed.JodiLindsay)。已经对金黄色葡萄球菌的两个种(N315和Mu50)的基因组进行了测序，并可公开获得，例如获自PATRIC(PATRIC:The VBI PathoSystems Resource Integration Center,Snyder等人,2007)。如本领域技术人员将理解的，还可以在其他公共数据库(例如
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Figure BDA0003153152910000512
和
Figure BDA0003153152910000513
)中鉴定用作抗原的葡萄球菌蛋白。
预期用于本文所述的某些实施方案中的源自肺炎链球菌的抗原包括肺炎球菌溶血素、PspA、胆碱结合蛋白A(CbpA)、NanA、NanB、SpnHL、PavA、LytA、Pht和菌毛蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎链球菌的抗原性蛋白在本领域中也是已知的，并且在一些实施方案中可用作抗原(参见，例如，Zysk等人,2000)。已经对肺炎链球菌的强毒株的完整基因组序列进行了测序，并且如本领域技术人员将理解的，用于本文的肺炎链球菌蛋白也可以在其他公共数据库(例如
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Figure BDA0003153152910000515
和
Figure BDA0003153152910000516
)中鉴定。根据本公开内容，抗原的特别感兴趣的蛋白质包括毒力因子和被预测在肺炎球菌表面暴露的蛋白质(参见，例如，Frolet等人,2010)。
可用作抗原的细菌抗原的实例包括但不限于放线菌(Actinomyces)多肽、芽孢杆菌(Bacillus)多肽、拟杆菌(Bacteroides)多肽、博德特氏菌(Bordetella)多肽、巴尔通氏体(Bartonella)多肽、疏螺旋体(Borrelia)多肽(例如伯氏疏螺旋体(B.BurgdorferiOspA)、布鲁氏菌(Brucella)多肽、弯曲杆菌(Campylobacter)多肽、二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga)多肽、衣原体(Chlamydia)多肽、棒状杆菌(Corynebacterium)多肽、柯克斯氏体(Coxiella)多肽、嗜皮菌(Dermatophilus)多肽、肠球菌(Enterococcus)多肽、埃里希氏体(Ehrlichia)多肽、埃希杆菌(Escherichia)多肽、弗朗西斯氏菌(Francisella)多肽、梭杆菌(Fusobacterium)多肽、血巴通氏体(Haemobartonella)多肽、嗜血杆菌(Haemophilus)多肽(例如b型流感嗜血杆菌外膜蛋白)、螺杆菌(Helicobacter)多肽、克雷伯菌(Klebsiella)多肽、L型细菌多肽、钩端螺旋体(Leptospira)多肽、李斯特菌(Listeria)多肽、分枝杆菌(Mycobacteria)多肽、支原体(Mycoplasma)多肽、奈瑟菌(Neisseria)多肽、新立克次体(Neorickettsia)多肽、诺卡氏菌(Nocardia)多肽、巴斯德氏菌(Pasteurella)多肽、消化球菌(Peptococcus)多肽、消化链球菌(Peptostreptococcus)多肽、肺炎球菌(Pneumococcus)多肽(即肺炎链球菌多肽)(参见本文的描述)、变形杆菌(Proteus)多肽、假单胞菌(Pseudomonas)多肽、立克次体(Rickettsia)多肽、罗沙利马体(Rochalimaea)多肽、沙门氏菌(Salmonella)多肽、志贺氏菌(Shigella)多肽、葡萄球菌多肽、A群链球菌多肽(例如化脓链球菌M蛋白)、B群链球菌(无乳链球菌(S.agalactiae))多肽、密螺旋体(Treponema)多肽和耶尔森氏菌(Yersinia)多肽(例如，鼠疫耶尔森氏菌(Ypestis)F1和V抗原)。
真菌抗原的实例包括但不限于：犁头霉属(Absidia)多肽、支顶孢属(Acremonium)多肽、链格孢属(Alternaria)多肽、曲霉属(Aspergillus)多肽、蛙粪霉属(Basidiobolus)多肽、双极霉属(Bipolaris)多肽、芽生菌属(Blastomyces)多肽、假丝酵母属(Candida)多肽、球孢子菌属(Coccidioides)多肽、耳霉属(Conidiobolus)多肽、隐球酵母属(Cryptococcus)多肽、弯孢霉属(Curvalaria)多肽、表皮癣菌属(Epidermophyton)多肽、外瓶霉属(Exophiala)多肽、地丝菌属(Geotrichum)多肽、组织胞浆菌属(Histoplasma)多肽、马杜拉分枝菌属(Madurella)多肽、马拉色氏霉菌属(Malassezia)多肽、小孢霉属(Microsporum)多肽、小丛梗孢属(Moniliella)多肽、被孢霉属(Mortierella)多肽、毛霉属(Mucor)多肽、拟青霉属(Paecilomyces)多肽、青霉菌属(Penicillium)多肽、单胞瓶霉属(Phialemonium)多肽、瓶霉属(Phialophora)多肽、原壁菌属(Prototheca)多肽、假霉样真菌属(Pseudallescheria)多肽、假小托菌属(Pseudomicrodochium)多肽、腐霉属(Pythium)多肽、鼻孢子虫属(Rhinosporidium)多肽、根霉属(Rhizopus)多肽、齿梗孢属(Scolecobasidium)多肽、孢子丝菌属(Sporothrix)多肽、匍柄霉属(Stemphylium)多肽、毛癣菌属(Trichophyton)多肽、毛孢子菌属(Trichosporon)多肽和木丝霉属(Xylohypha)多肽。
原生动物寄生虫抗原的实例包括但不限于巴贝西虫(Babesia)多肽、肠袋虫(Balantidium)多肽、贝诺孢子虫(Besnoitia)多肽、隐孢子虫(Cryptosporidium)多肽、艾美球虫(Eimeria)多肽、脑胞内原虫(Encephalitozoon)多肽、内变形虫(Entamoeba)多肽、贾第鞭毛虫(Giardia)多肽、哈蒙德虫(Hammondia)多肽、肝簇虫(Hepatozoon)多肽、等孢子球虫(Isospora)多肽、利什曼虫(Leishmania)多肽、微孢子虫(Microsporidia)多肽、新孢子虫(Neospora)多肽、小孢子虫(Nosema)多肽、五毛滴虫(Pentatrichomonas)多肽、疟原虫(Plasmodium)多肽。蠕虫寄生虫抗原的实例包括但不限于棘唇线虫(Acanthocheilonema)多肽、猫圆线虫(Aelurostrongylus)多肽、钩虫(Ancylostoma)多肽、管圆线虫(Angiostrongylus)多肽、蛔虫(Ascaris)多肽、布鲁格丝虫(Brugia)多肽、仰口线虫(Bunostomum)多肽、毛细线虫(Capillaria)多肽、夏伯特虫(Chabertia)多肽、古柏线虫(Cooperia)多肽、环体线虫(Crenosoma)多肽、网尾线虫(Dictyocaulus)多肽、膨结线虫(Dioctophyme)多肽、棘唇线虫(Dipetalonema)多肽、裂头绦虫(Diphyllobothrium)多肽、Diplydium多肽、恶丝虫(Dirofilaria)多肽、龙线虫(Dracunculus)多肽、蛲虫(Enterobius)多肽、丝状虫(Filaroides)多肽、血矛线虫(Haemonchus)多肽、兔唇蛔虫(Lagochilascaris)多肽、Loa多肽、曼森线虫(Mansonella)多肽、缪勒线虫(Muellerius)多肽、侏体吸虫(Nanophyetus)多肽、板口线虫(Necator)多肽、细颈线虫(Nematodirus)多肽、结节线虫(Oesophagostomum)多肽、盘尾丝虫(Onchocerca)多肽、后睾吸虫(Opisthorchis)多肽、奥斯特线虫(Ostertagia)多肽、副丝虫(Parafilaria)多肽、并殖吸虫(Paragonimus)多肽、副蛔虫(Parascaris)多肽、泡翼线虫(Physaloptera)多肽、原圆线虫(Protostrongylus)多肽、腹腔丝虫(Setaria)多肽、尾旋线虫(Spirocerca)多肽、迭宫绦虫(Spirometra)多肽、冠丝虫(Stephanofilaria)多肽、粪类圆线虫(Strongyloides)多肽、圆线虫(Strongylus)多肽、吸吮线虫(Thelazia)多肽、弓蛔虫(Toxascaris)多肽、弓蛔虫(Toxocara)多肽、旋毛虫(Trichinella)多肽、毛圆线虫(Trichostrongylus)多肽、鞭虫(Trichuris)多肽、钩虫(Uncinaria)多肽和吴策线虫(Wuchereria)多肽。(例如恶性疟原虫(P.falciparum)环子孢子(PfCSP))、子孢子表面蛋白2(PfSSP2)、肝状态抗原1的羧基末端(PfLSA1 c-term)和输出蛋白1(PfExp-1)、肺孢子虫(Pneumocystis)多肽、肉孢子虫(Sarcocystis)多肽、血吸虫(Schistosoma)多肽、泰勒虫(Theileria)多肽、弓形虫(Toxoplasma)多肽和锥虫(Trypanosoma)多肽。
体外寄生虫抗原的实例包括但不限于来自以下的多肽(包括抗原以及过敏原)：跳蚤；壁虱，包括硬壁虱和软壁虱；蝇类，例如蠓，蚊子，沙蝇，黑蝇，马蝇，角蝇，鹿蝇，采采蝇，螫蝇，引起蝇蛆病的蝇类和叮咬蚊；蚂蚁；蜘蛛，虱子；螨；和蝽象(true bug)，例如床虱和接吻虫。
E.自杀基因
在一些情况下，本公开内容的任何细胞被修饰以产生不同于异源细胞因子、工程化受体等的一种或多种药剂。在特定实施方案中，细胞，例如NK细胞，被工程化以包含一种或多种自杀基因，并且如本文所用的术语“自杀基因”被定义为在施用前药后实现基因产物向杀死其宿主细胞的化合物的过渡的基因。在一些情况下，当接受NK细胞疗法和/或已经接受NK细胞疗法的个体表现出一种或多种不良事件的一种或多种症状例如细胞因子释放综合征、神经毒性、过敏反应/变态反应和/或中靶/肿瘤外毒性(例如)，或被认为处于具有一种或多种症状的风险(包括即将出现)时，NK细胞疗法可能需要使用一种或多种任何种类的自杀基因。自杀基因的使用可能是计划的治疗方案的一部分，或可能仅在认为需要其使用时使用。在一些情况下，由于不再需要治疗，因此通过使用靶向自杀基因或其基因产物的一种或多种药剂终止细胞治疗。
自杀基因的示例包括工程化的不可分泌的(包括膜结合的)肿瘤坏死因子(TNF)-α突变多肽(参见PCT/US19/62009，其通过引用整体并入本文)，并且它们可以通过递送结合TNF-α突变体的抗体来进行靶向。可以使用的自杀基因/前药组合的示例是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶和环己酰亚胺；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(thymidine kinase thymidilate kinase)(Tdk::Tmk)和AZT；和脱氧胞苷激酶和胞嘧啶阿拉伯糖苷。可以利用大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶，即将前药6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷转化为毒性的嘌呤6-甲基嘌呤的所谓的自杀基因。其他自杀基因包括例如CD20、CD52、诱导型半胱天冬酶9、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸-α、γ-裂解酶(MET)和胸苷磷酸化酶(TP)。
F.递送方法
本领域技术人员将很好地胜任通过标准重组技术来构建用于本公开内容的抗原受体的表达的载体(参见，例如Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，两者均通过引用并入本文)。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体，动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)，例如逆转录病毒载体(例如来源于莫洛尼氏鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如来源于HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括其有复制能力、复制缺陷和无病毒基因(gutless)形式)、腺病毒相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、Rous肉瘤病毒载体、细小病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、水泡性口炎病毒载体、马拉巴病毒载体和B群腺病毒enadenotucirev载体。
在具体的实施方案中，载体是多顺反子载体，例如在PCT/US19/62014中描述的，其通过引用整体并入本文。在这种情况下，单个载体可以编码CAR或TCR(并且表达构建体可以以模块化形式配置以允许互换CAR或TCR的部分)、自杀基因和一种或多种细胞因子。
a.病毒载体
在本公开内容的某些方面可以提供编码抗原受体的病毒载体。在产生重组病毒载体时，通常用异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列替换非必需基因。病毒载体是一种利用病毒序列将核酸和可能地蛋白质引入细胞的表达构建体。某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞以及整合到宿主细胞基因组中并稳定有效地表达病毒基因的能力使它们成为将外来核酸转移到细胞(例如哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选者。下文描述了可用于递送本发明的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，其还含有其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见，例如美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，在美国专利5,994,136(通过引用并入本文)中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两种或更多种携带包装功能(即gag、pol和env以及rev和tat)的载体转染。
b.调节元件
包含在本公开内容中有用的载体中的表达盒特别包含(在5’到3’方向)与蛋白质编码序列可操作地连接的真核转录启动子、包含间插序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。在真核细胞中控制蛋白质编码基因的转录的启动子和增强子由多种遗传元件组成。细胞机制能够收集和整合每个元件传达的调节信息，从而允许不同的基因进化出转录调节的不同的、通常是复杂的模式。在本公开内容的上下文中使用的启动子包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。
(i)启动子/增强子
本文提供的表达构建体包含驱动抗原受体的表达的启动子。启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。对于此，最著名的实例是TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子(例如用于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和用于SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始的位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30110bp的区域中，尽管已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。为了使编码序列处于启动子的“控制之下”，将转录阅读框的转录起始位点的5’末端定位在所选启动子的“下游”(即3’)。“上游”启动子刺激DNA转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到相距50bp。取决于启动子，似乎各个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。启动子可以与或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
启动子可以是与核酸序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列而获得的。这种启动子可以被称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然缔合的增强子，位于该序列的下游或上游。可选择地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”的启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，重组DNA构建中最常用的启动子包括β内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以结合本文公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)产生序列。此外，预期还可以使用指导在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等内的序列的转录和/或表达的控制序列。
自然地，重要的是采用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用(参见，例如Sambrook等人,1989，通过引用并入本文)。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在合适的条件下可用于指导引入的DNA区段的高水平表达，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
此外，任何启动子/增强子组合(例如，根据真核启动子数据库EPDB，通过万维网在epd.isb-sib.ch/获得)也可用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或作为额外的基因表达构建体)，真核细胞可以支持从某些细菌启动子的细胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如，β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；和串联反应元件启动子，例如环AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最小TATA框附近的反应元件启动子(tre)。还可以使用人生长激素启动子序列(例如，在
Figure BDA0003153152910000581
登录号X05244，核苷酸283-341中描述的人生长激素最小启动子)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从ATCC目录号ATCC45007获得)。在某些实施方案中，启动子是CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、I类MHC或II类MHC启动子，但是可用于驱动治疗性基因的表达的任何其他启动子适用于本公开内容的实践。
在某些方面，本公开内容的方法还涉及增强子序列，即增加启动子的活性并且具有顺式地而无论其取向地起作用的潜能(即使在相对长的距离上(多至距靶标启动子几千个碱基)也如此)的核酸序列。然而，增强子功能不一定限于如此长的距离，因为它们也可以在非常接近给定启动子的地方发挥作用。
(ii)起始信号和连锁表达
特定的起始信号也可用于本公开内容提供的表达构建体中以用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“在读框内”，以确保整个插入序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适当的转录增强子元件可以增强表达效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译。来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件以及来自哺乳动物信使的IRES已被描述。IRES元件可以连接到异源的开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，每个阅读框由一个IRES分隔，从而创建多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框对于核糖体是可接近的以用于有效翻译。使用单个启动子/增强子来转录单个信使可以有效地表达多个基因。
此外，某些2A序列元件可用于在本公开内容提供的构建体中产生基因的连锁或共表达。例如，切割序列可用于通过连接开放阅读框以形成单个顺反子来共表达基因。示例性切割序列是F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thosea asigna病毒2A；T2A)。
(iii)复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以包含一个或多个复制起点(通常称为“ori”)，例如对应于如上文所述的EBV的oriP的核酸序列或在编程中具有类似或提升的功能的遗传改造的oriP，复制起点是在其上起始复制的特定核酸序列。可选择地，可以使用如上文所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
c.选择和可筛选标志物
在一些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标志物来体外或体内鉴别含有本公开内容的构建体的细胞。此类标志物将赋予细胞可鉴别的变化，从而允许容易地鉴别含有表达载体的细胞。通常，选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是该标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的一个实例是抗药性标志物。
通常药物选择标志物的包含有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标志物之外，还预期了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如以比色分析为基础的GFP。可选择地，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知道如何使用免疫标志物，可能与FACS分析结合使用。所使用的标志物被认为并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标志物的其他实例是本领域技术人员众所周知的。
d.核酸递送的其他方法
除了编码抗原受体的核酸的病毒递送之外，以下是将重组基因递送至给定宿主细胞的另外的方法，并因此在本公开内容中被考虑。
将核酸(例如DNA或RNA)引入本公开内容的免疫细胞中可使用用于核酸递送以转化细胞的任何合适的方法，如本文所述的或如本领域技术人员已知的。此类方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染，通过注射，包括显微注射；通过电穿孔；通过磷酸钙沉淀；通过使用DEAE-葡聚糖，然后使用聚乙二醇；通过直接声波加载；通过脂质体介导的转染和受体介导的转染；通过微粒轰击；通过与碳化硅纤维的搅拌；通过农杆菌介导的转化；通过干燥/抑制介导的DNA摄取，以及这些方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，可以稳定或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物体。
VI.治疗方法
本公开内容的实施方案包括治疗个体的癌症、任何类型的感染和任何免疫病症的方法。个体可以使用本公开内容的治疗方法作为初始治疗或在另一治疗之后或在另一治疗期间使用本公开内容的治疗方法。基于癌症的类型或阶段，免疫疗法方法可以根据患有癌症的个体的需要进行定制，并且在至少一些情况下，可以在个体的治疗过程中修改免疫疗法。
在特定情况下，治疗方法如下：1)使用T或NK细胞(离体扩增的或表达CAR或TCR)的过继细胞疗法以治疗患有任何类型血液系统恶性肿瘤的癌症患者，(2)使用T或NK细胞(体外扩增的或表达CAR或TCR)的过继细胞疗法以治疗患有任何类型实体癌的癌症患者，(3)使用Tregs和调节性B细胞(体外扩增的或表达CAR或TCR)的过继细胞疗法以治疗患有免疫病症的患者，(4)使用T或NK细胞(离体扩增的或表达CAR或TCR)的过继细胞疗法以治疗患有传染病的患者。本公开内容首次显示敲低/敲除人类NK细胞中的多个基因有助于提高细胞的功能性和对肿瘤微环境的抵抗力。在具体实施方案中，这对使用增强患者自身免疫细胞或过继转移的免疫细胞的功能的新型免疫治疗方法的患者护理具有直接影响。实施方案提供了一种产生用于免疫疗法的高功能性T、NK和B细胞(离体扩增的和CAR或TCR工程化的)的新方法。这些包括靶向癌症-血液系统肿瘤和实体瘤-(NK细胞和T细胞，以及CAR T细胞和CARNK细胞)、自身免疫和同种免疫病症(B细胞、调节性B细胞和调节性T细胞)和感染的治疗(对于病原体特异性T细胞)。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于免疫疗法的方法，所述方法包括施用有效量的本公开内容的免疫细胞。在一个实施方案中，通过转移引起免疫应答的免疫NK细胞群体来治疗医学疾病或病症。在本公开内容的某些实施方案中，通过转移引起免疫应答的免疫细胞群体来治疗癌症或感染。本文提供了用于治疗或延缓个体中的癌症进展的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。本发明的方法可以用于治疗免疫病症、实体癌、血液系统癌症和病毒感染。
本治疗方法可用于的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那些。示例性实体瘤可包括但不限于选自胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳房的器官的肿瘤。示例性血液肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑色素瘤。
癌症具体可以是以下组织学类型，但不限于这些：赘生物，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；组合的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；无包膜形成的硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属物癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；Sertoli细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性恶性黑素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；雀斑样痣恶性黑色素瘤；肢端雀斑样黑色素瘤；结节性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合性肿瘤，恶性；Muller混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥散性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小非裂解细胞NHL；巨大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓细胞性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞性白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；毛细胞性白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓细胞性白血病(AML)；和慢性成髓细胞性白血病。
特定实施方案涉及白血病的治疗方法。白血病是血液或骨髓的癌症，其特征在于血细胞(通常是白血球(白细胞))的异常增殖(通过繁殖产生)。它是被称为血液肿瘤的广泛疾病的一部分。白血病是涵盖多种疾病的广义术语。白血病在临床和病理上分为急性和慢性两种形式。
在本公开内容的某些实施方案中，将免疫细胞递送至需要其的个体，例如患有癌症或感染的个体。然后，这些细胞增强个体的免疫系统，以攻击相应的癌症或致病细胞。在某些情况下，向个体提供一个或多个剂量的免疫细胞。在为个体提供两个或更多个剂量的免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应足够以允许在个体中繁殖的时间，并且在特定的实施方案中，剂量之间的持续时间为1、2、3、4，5、6、7或更多天。
本公开内容的某些实施方案提供了用于治疗或预防免疫介导的病症的方法。在一个实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例包括：斑秃，强直性脊柱炎，抗磷脂综合征，自身免疫性艾迪生氏病，肾上腺自身免疫性疾病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，自身免疫性卵巢炎和睾丸炎，自身免疫性血小板减少症，白塞氏病，大疱性类天疱疮，心肌病，乳糜泻性皮炎(celiac spate-dermatitis)，慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)，慢性炎症性脱髓鞘性多神经病，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，CREST综合征，冷凝集素病，克罗恩病，盘状狼疮，本质性混合冷凝球蛋白血症，纤维肌痛-纤维肌炎；肾小球肾炎，格雷夫斯病，Guillain-Barre，桥本氏甲状腺炎，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA神经病，青少年关节炎，扁平苔藓，红斑狼疮，Meniere病，混合性结缔组织病，多发性硬化，1型或免疫介导的糖尿病，重症肌无力，肾病综合征(例如轻微变化疾病，局灶性肾小球硬化或膜性肾病)，寻常型天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多软骨炎，多腺综合征，风湿性多肌痛，多肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，牛皮癣，牛皮癣关节炎，雷诺现象，雷特综合征，类风湿性关节炎，结节病，硬皮病，干燥综合征，僵硬综合征，系统性红斑狼疮，红斑狼疮，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，脉管炎(例如结节性多动脉炎，高安动脉炎，颞动脉炎/巨细胞性动脉炎或疱疹样皮炎性血管炎)，白癜风和韦格纳肉芽肿病。因此，可以使用本文公开的方法治疗的自身免疫疾病的一些实例包括但不限于多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，I型糖尿病，克罗恩病；溃疡性结肠炎，重症肌无力，肾小球肾炎，强直性脊柱炎，血管炎或牛皮癣。受试者还可以患有过敏性病症，例如哮喘。
在另一个实施方案中，受试者是移植的器官或干细胞的接受者，并且免疫细胞用于预防和/或治疗排斥。在特定的实施方案中，受试者患有移植物抗宿主病或处于发展移植物抗宿主病的风险。GVHD是使用或包含来自相关或不相关供体的干细胞的任何移植物的可能并发症。有两种GVHD，急性的和慢性的。急性GVHD出现在移植后的前三个月内。急性GVHD的体征包括手和脚上出现红色的皮疹，该皮疹可能扩散并变得更严重，具有皮肤剥落或起泡。急性GVHD也可影响胃和肠，在这种情况下会出现痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛的发黄(黄疸)指示急性GVHD影响了肝脏。慢性GVHD根据其严重程度进行分级：阶段/等级1是轻度的；阶段/等级4是严重的。慢性GVHD在移植后三个月或之后发展。慢性GVHD的症状与急性GVHD的症状相似，但此外，慢性GVHD可能还会影响眼睛的粘液腺、口腔的唾液腺以及润滑胃粘膜和肠道的腺体。可以利用本文公开的任何免疫细胞群体。移植的器官的实例包括实体器官移植物，例如肾脏、肝脏、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或细胞移植物，例如胰岛、肝细胞、成肌细胞、骨髓或造血或其他干细胞。移植物可以是复合移植物，例如面部组织。免疫细胞可以在移植之前、移植同时或移植后施用。在一些实施方案中，免疫细胞在移植前施用，例如在移植前至少1小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周或至少1个月施用。在一个具体的非限制性实例中，治疗有效量的免疫细胞的施用在移植前3-5天进行。
在一些实施方案中，可以在免疫细胞治疗之前向受试者施用非清髓性淋巴细胞清除性化学疗法。非清髓性淋巴细胞清除性化学疗法可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径施用。非清髓性淋巴细胞清除性化学疗法可包括，例如，施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别是如果癌症是可转移的黑素瘤时。施用环磷酰胺和氟达拉滨的示例性途径是静脉内。此外，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面，施用约60mg/kg的环磷酰胺持续两天，此后施用约25mg/m2的氟达拉滨持续五天。
在某些实施方案中，将促进免疫细胞生长和活化的生长因子与免疫细胞同时或在免疫细胞后施用至受试者。免疫细胞生长因子可以是促进免疫细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21，它们可以单独使用或以多种组合使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15或IL-12和IL2。
治疗有效量的免疫细胞可以通过多种途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内或关节内注射或输注。
用于过继细胞疗法的免疫细胞的治疗有效量是在被治疗的受试者中达到期望效果的量。例如，这可以是抑制自身免疫或同种免疫疾病的进展或引起自身免疫或同种免疫疾病的消退所必需的或能够缓解由自身免疫疾病引起的症状(例如疼痛和炎症)的免疫细胞的量。它可能是缓解与炎症相关的症状(例如疼痛、水肿和体温升高)所必需的量。它也可以是减少或防止移植器官排斥所必需的量。
可以以与疾病一致的治疗方案来施用免疫细胞群，例如在一到几天内的单次或几次剂量以改善疾病状态，或在延长的时间内的定期剂量以抑制疾病进展并预防疾病复发。制剂中要使用的精确剂量还将取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。免疫细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、患病的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可用于治疗人受试者的剂量为至少3.8×104、至少3.8×105、至少3.8×106、至少3.8×107、至少3.8×108、至少3.8×109、或至少3.8×1010个免疫细胞/m2。在某些实施方案中，用于治疗人受试者的剂量范围为约3.8×109至约3.8×1010个免疫细胞/m2。在另外的实施方案中，免疫细胞的治疗有效量可以为约5×106个细胞/kg体重至约7.5×108个细胞/kg体重，例如约2×107个细胞至约5×108个细胞/kg体重，或约5×107个细胞至约2×108个细胞/kg体重。免疫细胞的确切数量由本领域技术人员根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况来容易地确定。可以根据从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线推断有效剂量。
可以将免疫细胞与一种或多种其他治疗剂组合施用以用于治疗免疫介导的病症。组合疗法可包括但不限于一种或多种抗微生物剂(例如抗生素，抗病毒剂和抗真菌剂)，抗肿瘤剂(例如氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，紫杉醇，氟达拉滨，依托泊苷，阿霉素或长春新碱)，免疫消耗剂(例如氟达拉滨，依托泊苷，阿霉素或长春新碱)，免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤或糖皮质激素，例如地塞米松或泼尼松)，抗炎剂(例如，糖皮质激素例如氢化可的松、地塞米松或泼尼松，或非类固醇抗炎剂例如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)，细胞因子(例如白介素-10或转化生长因子-β)，激素(用于例如雌激素)或疫苗。另外，可以施用免疫抑制剂或致耐受剂，包括但不限于钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素和他克莫司)；mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)；吗替麦考酚酯，抗体(例如识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化疗剂(例如甲氨蝶呤，苏消安，白消安)；辐照；或趋化因子，白介素或其抑制剂(例如BAFF，IL-2，抗IL-2R，IL-4，JAK激酶抑制剂)。取决于所需的效果，可以在施用免疫细胞之前、期间或之后施用此类另外的药剂。细胞和试剂的这种施用可以通过相同的途径或通过不同的途径，并且可以在相同的部位或在不同的部位。
A.药物组合物
本文还提供了包含免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)和药学上可接受的承载体的药物组合物和制剂。
本文所述的药物组合物和制剂可通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的承载体混合来制备(Remington'sPharmaceutical Sciences第22版，2012)，其呈冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的承载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的承载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003153152910000681
Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
B.组合疗法
在某些实施方案中，本发明的实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的免疫细胞群。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如肿块切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，另外的疗法是小分子酶抑制剂或抗转移剂的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是副作用限制剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重性的药剂，例如抗恶心剂等)的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐照。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。
可以相对于另外的癌症疗法(例如免疫检查点疗法)在之前、期间、之后或以各种组合施用免疫细胞疗法。施用间隔可以从同时至数分钟至数天至数周。在其中免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开地提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间没有显著的时间段到期，使得两种化合物将仍然能够发挥对患者有利的联合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至24或72小时内，更具体地在彼此约6-12小时内为患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可能期望将治疗时间显著延长，其中在各自施用之间流逝几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7、7或8)。
可以采用各种组合。对于下面的实例，免疫细胞疗法为“A”，和抗癌疗法为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到试剂的毒性(如果有的话)，本发明的实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本发明的实施方案，可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据它们在细胞内的活动方式(例如，它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期)进行分类。可选择地，药剂可以基于其直接交联DNA、插入DNA或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来进行表征。
化学治疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯并多巴，卡波醌(carboquone)，米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氧胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺，三乙烯三聚氰胺，三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)，三乙稀硫磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来(bizelesin)新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥，例如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯磷酰胺，雌氮芥，异环磷酰胺，甲氮芥，盐酸甲氧氮芥，美法仑，新恩比兴(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼氮芥，曲磷胺，和尿嘧啶氮芥；亚硝基尿素(nitrosureas)，例如卡莫司汀，氯脲霉素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团，aclacinomysin，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，卡拉比辛(carabicin)，洋红霉素，嗜癌菌素，色霉素，放线菌素D，道诺霉素，地托比星，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(包括吗啉基-多柔比星，氰基吗啉基-多柔比星，2-吡咯啉基-多柔比星，和deoxydoxorubicin)，表柔比星，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素例如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalarnycin)，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星，链黑菌素，链唑霉素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，和佐柔比星；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸(denopterin)，蝶罗呤，和三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨，6-巯嘌呤，硫咪嘌呤，和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮，丙酸甲雄烷酮，表硫雄醇，美雄烷，和睾内脂；抗肾上腺，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；得弗伐胺；地美可辛；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登醇，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼类；甲基苄肼；PSK多糖复合物；丙亚胺；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素，黏液霉素A，杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦；长春地辛；氮烯唑胺；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位复合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊利替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂，丙卡巴嗪，plicomycin，吉西他滨，那韦尔滨，法呢基蛋白转移酶抑制剂，跨铂(transplatinum)和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也可以考虑其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照和UV辐照。最有可能的是所有这些因素影响对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持的广泛损害。X射线的剂量范围从长时间(3-4周)的50至200伦琴的每日剂量到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐照的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
3.免疫疗法
本领域技术人员将理解，免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003153152910000721
是这样的实例。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者它可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化疗剂，放射性核素，蓖麻毒蛋白A链，霍乱毒素，百日咳毒素等)缀合，并用作靶向剂。可选择地，效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物(ADC)包含与杀细胞药物共价连接的单克隆抗体(MAb)并且可用于组合疗法。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物结合在一起，从而产生了“经武装的”MAb，其将有效载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，从而降低了毒性并改善了治疗指数。示例性ADC药物包括
Figure BDA0003153152910000731
(本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和
Figure BDA0003153152910000732
(曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)或T-DM1)。
在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标志物，即其在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标志物，并且在本发明的实施方案的背景下，这些肿瘤标志物中的任何一种都可能适于靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erbB、erb b2和p155。免疫疗法的可选择的方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF，γ-IFN，趋化因子，例如MIP-1，MCP-1，IL-8和生长因子，例如FLT3配体。
免疫疗法的实例包括免疫佐剂，例如牛分枝杆菌，恶性疟原虫，二硝基氯苯和芳香族化合物；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，IL-1，GM-CSF和TNF；基因疗法，例如TNF，IL-1，IL-2和p53；和单克隆抗体，例如抗CD20，抗神经节苷脂GM2和抗p185。预期可以将一种或多种抗癌疗法与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可能被免疫检查点阻断靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)，B7-H3(也称为CD276)，B和T淋巴细胞弱化剂(BTLA)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)，淋巴细胞激活基因3(LAG3)，程序性死亡1(PD-1)，T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域3(TIM-3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子，配体或受体的重组形式，或者特别是抗体，例如人抗体。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用抗体的嵌合、人源化或人形式。如本领域技术人员将知道的，替代和/或等同名称可以用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知lambrolizumab也已知为替代和等同名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合伴侣是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合伴侣结合的分子。在特定方面，PDL1结合伴侣是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合伴侣是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白或寡肽。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04，MDX-1106，ONO-4538，BMS-936558和
Figure BDA0003153152910000741
)是可以使用的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475，Merck 3475，lambrolizumab，
Figure BDA0003153152910000742
和SCH-900475)是示例性抗PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)也是抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4发现于T细胞的表面，并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助T细胞的表面表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，并且两种分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(分别也称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4将抑制信号传递给T细胞，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，并且可能对它们的功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制受体)的表达增加。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人-CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域众所周知的方法产生。可选择地，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1，MDX-010，MDX-101和
Figure BDA0003153152910000751
)或其抗原结合片段和变体。在其他实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体竞争与CTLA-4上与上述抗体相同的表位的结合和/或与CTLA-4上与上述抗体相同的表位结合。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
4.手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断或分期性、治愈性和姑息手术。治愈性手术包括切除(其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏)，并且可以与其他疗法(例如本发明的实施方案的治疗，化学疗法，放射疗法，激素疗法，基因疗法，免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术是指物理切除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫氏手术)。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。可以通过使用其他抗癌疗法对该区域进行灌注、直接注射或局部应用来完成治疗。例如，可以每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这种治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。
5.其他药剂
预期可以将其他药剂与本发明的实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体的上调和GAP连接的药剂，细胞生长抑制剂和分化剂，细胞粘附抑制剂，增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过增加GAP连接数增加细胞间信号传导将增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本发明的实施方案的某些方面结合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附抑制剂改善本发明的实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预期了增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他药剂例如抗体c225可以与本发明的实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。
VII.制品或试剂盒
本文还提供了包含免疫细胞的制品或试剂盒。制品或试剂盒还可包括包装插页，该插页包含使用免疫细胞治疗或延缓个体癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明。本文所述的任何抗原特异性免疫细胞可包括在制品或试剂盒中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。容器可由多种材料形成，例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金(hastelloy))。在一些实施方案中，容器保持制剂和容器上或与容器相关联的标签可指示使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度看需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另一种药剂(例如，化疗剂和抗肿瘤剂)。一种或多种药剂的合适容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
VIII.实施例
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍可获得类似或相似的结果。
实施例1–多重基因编辑
为了测试同时破坏免疫细胞(例如T细胞和NK细胞)中多个基因的表达的功效，进行了几项研究以使用CRISPR测试不同基因组合的破坏。在第一项研究中，CRISPR/Cas9用于破坏NK细胞中NKG2A、CD47、TGFBR2和CISH的表达。在这组基因中，NKG2A和CD47在第一轮电穿孔中被敲除，并且在第二轮电穿孔中靶向CISH和TGFBR2。对于两轮电穿孔，使用PCR和流式细胞术成功验证了敲除效率(图1)。
在包括TIGIT、CD96、CISH、腺苷(图2)和NKG2A、CD47、TGFBR2和CISH(图3)的其他基因组中验证了破坏多个基因的方法。发现多个基因的破坏导致针对靶肿瘤细胞的增强的功能性。用与靶细胞系在布雷菲德菌素A的存在下共刺激5小时的不同的NK细胞(经编辑的相对单独Cas9)进行IFN-γ、TNFα和CD107产生的流式细胞术分析。用靶细胞系刺激后，IFN-γ、TNFα和CD107的分泌增强(图3)。
这种增强的功能性通过NK细胞中NKG2A、CD47、TGFBR2和CISH的破坏得到证实，其表现出增强的针对K562细胞的抗肿瘤细胞毒性，如通过51Cr-释放测定法测量的(图4A)。此外，在重组TGF-B处理(50ng/ml)30分钟后，通过流式细胞术测量pSMAD活性(图4B)。还观察到在细胞因子刺激或靶标识别后NK细胞失去CD16和CD62L表达(图5)，和NK细胞中ADAM17的敲除防止CD16和CD62L的去除(图6)并改善针对K562靶标的ADCC和细胞毒性(图7)。
进一步的研究表明，NK细胞中SHP1的破坏导致增强的抗肿瘤功效(图9和10)。NK细胞与K562\Raji细胞以1:1的比例共培养4小时。孵育后，细胞用膜联蛋白V染色并分析活细胞和死细胞。K562细胞对NK细胞杀伤敏感，而Raji细胞对NK细胞杀伤具有抗性。此外，NK-CAR细胞中NKG2A的破坏导致针对Raji靶标的增强的抗肿瘤功效(图12)。
本方法用额外的基因组(TIGIT、CD96、CISH和腺苷以及NKG2A、CISH、TGFBRII和腺苷)进一步验证。通过流式细胞术测量评估NK细胞功能并且在靶细胞系刺激后观察到细胞中TNFα、IFNγ和CD107a的增加(图13-14)。
因此，本方法可用于同时破坏免疫细胞中的多个基因的表达以增加它们的功能性。
实施例2–方法
sgRNA-Cas9预复合和电穿孔：对于每个基因设计和使用跨越邻近区域的1或2个sgRNA。针对每个基因制备1ug cas9(PNA Bio)和500ng sgRNA(所有sgRNA的总和)反应物，并在冰上孵育20分钟。20分钟后，将250,000个NK细胞重新悬浮在T缓冲液*(包含在Neon电穿孔试剂盒(Invitrogen)中，包括RNP复合物和细胞的总体积应为14ul)中并使用Neon转染系统利用10ul电穿孔尖端进行电穿孔。NK细胞的电穿孔条件为1600V、10ms和3个脉冲*。然后将细胞与APC(1个NK:2个APC)、SCGM培养基(优选不含抗生素)、200IU/ml IL2一起加入培养板中，并允许在37℃培养箱中恢复。
crRNA预复合和电穿孔：用移液管和离心机混合crRNA和tracrRNA双链体。将混合物在热循环仪中在95℃下孵育5分钟，然后在工作台上冷却至室温。
表3.crNRA和tracrRNA双链体。
Figure BDA0003153152910000791
crRNA和tracrRNA的起始浓度为100uM。将它们以等摩尔浓度混合后的最终浓度为44uM。
表4.Cas9核酸酶。
Figure BDA0003153152910000792
表5.crRNA:tracrRNA和Cas9核酸酶混合物的组合。
Figure BDA0003153152910000793
用移液管将crRNA:tracrRNA双链体与Cas9核酸酶混合物组合，并在室温下孵育15分钟。然后将混合物与crRNA组合。
表6.crRNA#1和crRNA#2。
Figure BDA0003153152910000801
通过首先制备具有APC(1个NK:2个APC)、SCGM培养基(优选不含抗生素)和200IU/mL IL-2的培养板来进行电穿孔。准备每孔250,000个细胞，其在使用前重新悬浮在7.5ul T缓冲液中。电穿孔条件为1600V、10ms和3个脉冲*。然后将细胞添加到培养板中，并使其在37℃培养箱中恢复。
NK细胞扩增：使用来自Miltenyi(130-092-657)的NK细胞分离试剂盒从脐带血或外周血中分离NK细胞。在存在IL2(200IU\ml)的情况下，将NK细胞与饲养细胞以1:2的比例(1个NK细胞2个饲养细胞)放入SCGM培养基中。使用IL2每隔一天更换一次培养基。在第4天，使用NK细胞分离试剂盒重新选择NK细胞以去除饲养细胞或等待7天直到所有饲养细胞都消失。转导嵌合抗原受体或电穿孔Crispr-Cas9。
鉴于本公开内容，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言明显的是，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对所述方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，将明显的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
以下参考文献在提供示例性的程序或补充本文所示的那些的其他细节的程度上被特别地通过引用并入本文。
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Claims (148)

1.一种用于破坏免疫细胞中的至少两个基因的体外方法，其中所述至少两个基因选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。
2.权利要求1的方法，其中所述破坏包括将针对每个基因的指导RNA(gRNA)引入所述免疫细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中所述至少两个基因选自(a)NKG2A和CISH、(b)NKG2A和TGFBRII、(c)CISH和TGFBRII、(d)TIGIT和FOXO1、(e)TIGIT和TGFBRII、(f)CD96和FOXO1、(g)CD96和TGFBRII、(h)FOXO1和TGFBRII、(i)CD96和TIGIT、(j)CISH和TIGIT、(k)TIM3和CISH、(l)TIM3和TGFBRII、(m)FOXO1和TGFBRII、(n)TIM3和TIGIT、(o)SIGLEC7和CISH、(p)SIGLEC7和TGFBRII、(q)CD47和CISH、(r)CD47和TGFBRII、(s)SIRPA和CISH、(t)SIRPA和TGFBRII、(u)CD47和TIGIT、(v)CD47和SIRPA、(w)A2AR和CISH、(x)A2AR和TGFBRII、(y)ADAM17和CISH、(z)TGFBRII和ADAM17、(a1)A2AR和TIGIT、(b1)SHP1和CISH、(c1)CISH和TGFBRII、(d1)SHP1和TGFBRII、(e1)SHP1和TIGIT以及(f1)SHP1和TIM3。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中破坏至少3个基因。
5.权利要求4的方法，其中所述至少3个基因选自(1)NKG2A、CISH和TGFBRII，(2)TIGIT、FOXO1和TGFBRII，(3)TGFBRII、CD96和TIGIT，(4)TGFBR2、CISH和TIGIT，(5)TIM3、CISH和TGFBRII，(6)CD96、FOXO1和TGFBRII，(7)TGFBRII、TIM3和TIGIT，(8)SIGLEC7、CISH和TGFBRII，(9)CD47、CISH和TGFBRII，(10)SIRPA、CISH和TGFBRII，(11)TGFBRII、CD47和TIGIT，(12)TGFBRII、CD47和SIRPA，(13)A2AR、CISH和TGFBRII，(14)TGFBRII、CISH和ADAM17，(15)TGFBRII、TIM3和TIGIT，(16)TGFBRII、A2AR和TIGIT，(17)SHP1、CISH和TGFBRII，(18)TGFBRII、CISH和SHP1，(19)TGFBRII、SHP1和TIGIT以及(20)TGFBRII、SHP1和TIM3。
6.权利要求2的方法，其还包括引入RNA指导的核酸内切酶。
7.权利要求6的方法，其中所述RNA指导的核酸内切酶是Cas9。
8.权利要求6的方法，其中引入RNA指导的核酸内切酶包括将编码所述RNA指导的核酸内切酶的核酸引入所述免疫细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述核酸是mRNA。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中破坏三个、四个、五个或六个基因。
11.权利要求10的方法，其中所述基因包括(a)-(j1)亚组中的两个。
12.权利要求10的方法，其中所述基因包括(a)-(j1)中的一个亚组和1-23中的一个亚组。
13.权利要求10的方法，其中所述基因包括1-23亚组中的两个。
14.权利要求1的方法，其中所述破坏是同时的。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NK T细胞、B细胞或干细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述免疫细胞被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。
17.权利要求15的方法，其中所述免疫细胞被工程化以表达CAR。
18.权利要求15的方法，其中所述免疫细胞被工程化以表达TCR。
19.权利要求15的方法，其中所述免疫细胞被工程化以表达CAR和TCR。
20.权利要求15的方法，其中所述免疫细胞是病毒特异性的。
21.权利要求15的方法，其中所述T细胞是病毒特异性T细胞。
22.权利要求15的方法，其中所述T细胞是调节性T细胞。
23.权利要求15的方法，其中所述B细胞是调节性B细胞。
24.权利要求15的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。
25.权利要求15的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞或其混合物。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述免疫细胞是从外周血、脐带血、骨髓或其混合物中分离的。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述免疫细胞是从脐带血中分离的。
28.权利要求27的方法，其中所述脐带血是从2个或更多个个体脐带血单元汇集的。
29.权利要求2-28中任一项的方法，其中所述引入包括转染或转导。
30.权利要求2-28中任一项的方法，其中所述引入包括电穿孔。
31.权利要求30的方法，其中电穿孔进行不止一次。
32.权利要求31的方法，其中进行两轮电穿孔。
33.权利要求32的方法，其中在第一轮电穿孔中引入第一组CRISPR gRNA并且在第二轮电穿孔中引入第二组CRISPR gRNA。
34.权利要求33的方法，其中所述第一组和/或第二组CRISPR gRNA包含1、2、3或4种CRISPR gRNA。
35.权利要求32的方法，其中在第一轮电穿孔中引入两种CRISPR gRNA并且在第二轮电穿孔中引入两种CRISPR gRNA。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述方法包括破坏NKG2A、CD47、TGFβR2和CISH。
37.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述方法包括破坏NKG2A、CISH、TGFβR2和ADORA2。
38.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述方法包括破坏NKG2A、TGFβR2和CISH。
39.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述方法包括破坏TIGIT、CD96、CISH和ADORA2。
40.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述方法包括破坏ADAM17、TGFβR2、NKG2A和SHP1。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述破坏导致所述免疫细胞的增强的抗肿瘤细胞毒性、体内增殖、体内持久性和/或改善的功能。
42.权利要求41的方法，其中所述免疫细胞具有IFN-γ、CD107和/或TNFα的增加的分泌。
43.权利要求41的方法，其中所述免疫细胞具有穿孔素和/或颗粒酶B的增加的产生。
44.权利要求1-43中任一项的方法，其还包括将CAR或TCR引入所述免疫细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述引入包括将编码所述CAR或TCR的核酸引入所述免疫细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述核酸在表达载体中。
47.权利要求46的方法，其中所述表达载体是逆转录病毒载体。
48.权利要求47的方法，其中所述逆转录病毒载体是腺病毒相关载体。
49.权利要求48的方法，其中所述腺病毒相关载体是AAV6。
50.权利要求46的方法，其中所述载体还包含抑制性基因序列。
51.权利要求50的方法，其中所述抑制性基因序列选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。
52.权利要求50的方法，其中所述载体还包含针对所述抑制性基因的指导RNA。
53.权利要求52的方法，其中所述CAR的侧翼是针对所述抑制性基因的同源臂。
54.权利要求53的方法，其中引入包含CAR序列的载体导致在所述免疫细胞中的抑制性基因座处插入CAR。
55.权利要求54的方法，其中所述CAR插入所述抑制性基因的外显子处。
56.权利要求54的方法，其中所述CAR处于所述抑制性基因的内源启动子的控制下。
57.权利要求54的方法，其中引入所述载体进一步破坏所述抑制性基因的表达。
58.一种免疫细胞，其中所述免疫细胞中的至少两个基因的表达被破坏，其中所述至少两个基因选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。
59.权利要求58的细胞，其中所述细胞是根据权利要求1-57中任一项产生的。
60.权利要求58的细胞，其中三个、四个、五个或六个基因被破坏。
61.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NK T细胞、B细胞或干细胞。
62.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。
63.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞被工程化以表达CAR。
64.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞被工程化以表达TCR。
65.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞被工程化以表达CAR和TCR。
66.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞是病毒特异性的。
67.权利要求61的细胞，其中所述T细胞是病毒特异性T细胞。
68.权利要求61的细胞，其中所述T细胞是调节性T细胞。
69.权利要求61的细胞，其中所述B细胞是调节性B细胞。
70.权利要求61的细胞，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。
71.权利要求61的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或γ-δT细胞。
72.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞是从外周血、脐带血、骨髓或其混合物中分离的。
73.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞是从脐带血中分离的。
74.权利要求73的细胞，其中所述脐带血是从2个或更多个个体脐带血单元汇集的。
75.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有破坏的NKG2A、CD47、TGFβR2和CISH。
76.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有破坏的NKG2A、CISH、TGFβR2和ADORA2。
77.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有破坏的NKG2A、TGFβR2和CISH。
78.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有破坏的TIGIT、CD96、CISH和ADORA2。
79.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有破坏的ADAM17、TGFβR2、NKG2A和SHP1。
80.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有增强的抗肿瘤细胞毒性、体内增殖、体内持久性和/或改善的功能。
81.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有IFN-γ、CD107和/或TNFα的增加的分泌。
82.权利要求58的细胞，其中所述免疫细胞具有穿孔素和/或颗粒酶B的增加的产生。
83.权利要求58的细胞，其中所述细胞被工程化以表达CAR和/或TCR。
84.权利要求83的细胞，其中所述CAR插入所述细胞的内源抑制性基因座处。
85.权利要求84的细胞，其中所述抑制性基因座选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。
86.权利要求84的细胞，其中所述CAR处于所述抑制性基因的内源启动子的控制下。
87.权利要求84的细胞，其中通过CRISPR介导的基因编辑将所述CAR插入所述抑制性基因座处。
88.权利要求83-87中任一项的细胞，其中所述CAR包含选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv的抗原结合结构域。
89.权利要求83-88中任一项的细胞，其中所述CAR靶向选自以下的一种或多种肿瘤相关抗原：CD19、CD319(CS1)、ROR1、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD5、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、TRAIL/DR4、VEGFR2、CD33、CD47、CLL-1、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、BCMA和CD99。
90.权利要求83-90中任一项的细胞，其中所述CAR包含选自以下的至少一个信号传导结构域：CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP12、CD70和CD40。
91.权利要求58-90中任一项的细胞，其中所述细胞被工程化以表达选自IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21及其组合的异源细胞因子。
92.权利要求83的细胞，其中所述细胞还包含自杀基因。
93.权利要求92的细胞，其中所述自杀基因是膜结合肿瘤坏死因子(TNF)-α突变基因。
94.一种编码CAR、抑制性基因序列和gRNA的表达载体。
95.权利要求94的载体，其中所述抑制性基因序列来自选自以下的抑制性基因：NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。
96.权利要求94的载体，其中所述gRNA特异于所述抑制性基因。
97.权利要求94的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。
98.权利要求94的载体，其中所述逆转录病毒载体是AAV载体。
99.权利要求94的载体，其中所述CAR的侧翼是针对所述抑制性基因的同源臂。
100.一种宿主细胞，其被工程化以表达权利要求94-99中任一项的载体。
101.权利要求100的细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞、B细胞或干细胞。
102.权利要求100的细胞，其中所述细胞是权利要求58-83中任一项的细胞。
103.一种药物组合物，其包含权利要求58-93中任一项的免疫细胞的群体。
104.一种包含权利要求58-93中任一项的细胞的群体的组合物，其用于治疗免疫相关病症、传染病或癌症。
105.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求58-93中任一项的免疫细胞。
106.权利要求105的方法，其中所述疾病或病症是传染病、癌症或免疫相关病症。
107.权利要求106的方法，其中所述免疫相关病症是自身免疫病症、移植物抗宿主病、同种异体移植物排斥或炎性病况。
108.权利要求106的方法，其中所述免疫相关病症是炎性病况并且所述免疫细胞基本上不表达糖皮质激素受体。
109.权利要求105-108中任一项的方法，其中所述免疫细胞对于所述受试者是自体的。
110.权利要求105-108中任一项的方法，其中所述免疫细胞对于所述受试者是同种异体的。
111.权利要求106的方法，其中所述免疫相关病症是癌症。
112.权利要求111的方法，其中所述癌症是实体癌或血液系统恶性肿瘤。
113.权利要求105-112中任一项的方法，其还包括向所述受试者施用至少第二治疗剂。
114.权利要求113的方法，其中所述至少第二治疗剂包括化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法或生物疗法。
115.权利要求113或114的方法，其中所述免疫细胞和/或所述至少第二治疗剂通过静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内窥镜下、病灶内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注施用。
116.一种用于工程化免疫细胞以表达CAR的方法，所述方法包括使用CRISPR gRNA将CAR插入所述免疫细胞的抑制性基因座处。
117.权利要求116的方法，其中所述CAR由表达载体编码。
118.权利要求117的方法，其中所述表达载体是逆转录病毒载体。
119.权利要求118的方法，其中所述逆转录病毒载体是腺病毒相关载体。
120.权利要求119的方法，其中所述腺病毒相关载体是AAV6。
121.权利要求117的方法，其中所述载体还包含抑制性基因序列。
122.权利要求121的方法，其中所述抑制性基因序列来自选自以下的抑制性基因：NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5和CD7。
123.权利要求116-122中任一项的方法，其中所述CRISPR gRNA针对所述抑制性基因。
124.权利要求116-123中任一项的方法，其中所述CAR的侧翼是针对所述抑制性基因的同源臂。
125.权利要求116-124中任一项的方法，其中所述CAR插入所述抑制性基因的外显子处。
126.权利要求116-125中任一项的方法，其中所述CAR处于所述抑制性基因的内源启动子的控制之下。
127.权利要求116-126中任一项的方法，其中所述CAR破坏所述抑制性基因的表达。
128.权利要求116-127中任一项的方法，其中所述CAR靶向选自以下的一种或多种肿瘤相关抗原：CD19、CD319(CS1)、ROR1、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD5、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、TRAIL/DR4、VEGFR2、CD33、CD47、CLL-1、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、BCMA和CD99。
129.权利要求116-128中任一项的方法，其中所述CAR包含选自以下的至少一个信号传导结构域：CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP12、CD70和CD40及其组合。
130.权利要求116-129中任一项的方法，其中所述细胞被工程化以表达选自IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21及其组合的至少一种异源细胞因子。
131.权利要求116-130中任一项的方法，其中所述细胞还包含自杀基因。
132.权利要求131的方法，其中所述自杀基因是膜结合肿瘤坏死因子(TNF)-α突变基因。
133.一种免疫细胞，其具有在所述免疫细胞的抑制性基因处插入的CAR。
134.权利要求133的免疫细胞，其中所述细胞是通过权利要求116-132中任一项的方法产生的。
135.一种包含权利要求133或134的免疫细胞的群体的组合物。
136.权利要求135的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。
137.一种包含权利要求133-136中任一项的细胞的群体的组合物，其用于治疗免疫相关病症、传染病或癌症。
138.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求58-93、100或133-134中任一项的细胞。
139.权利要求138的方法，其中所述疾病或病症是传染病、癌症或免疫相关病症。
140.权利要求139的方法，其中所述免疫相关病症是自身免疫病症、移植物抗宿主病、同种异体移植物排斥或炎性病况。
141.权利要求139的方法，其中所述免疫相关病症是炎性病况并且所述免疫细胞基本上不表达糖皮质激素受体。
142.权利要求138-141中任一项的方法，其中所述细胞对于所述受试者是自体的。
143.权利要求138-141中任一项的方法，其中所述细胞是同种异体的。
144.权利要求138的方法，其中所述免疫相关病症是癌症。
145.权利要求144的方法，其中所述癌症是实体癌或血液系统恶性肿瘤。
146.权利要求138-145中任一项的方法，其还包括向所述受试者施用至少第二治疗剂。
147.权利要求146的方法，其中所述至少第二治疗剂包括化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法或生物疗法。
148.权利要求146或147的方法，其中所述免疫细胞和/或所述至少第二治疗剂通过静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌肉内、内窥镜下、病灶内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注施用。
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